CN106062538A - 多路靶标检测测定法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于在单管、单色测定法中检测多靶标序列的试剂和试剂盒以及其使用方法。具体而言，提供用于检测复杂结核分枝杆菌靶标序列(例如katG、rpoB、inhA启动子、pncA等)的多路测定法。

Description

多路靶标检测测定法
发明领域
本文提供用于在单管、多探针测定法中分析核酸靶标序列的试剂和试剂盒以及其使用方法。在具体的实施方案中，提供用于检测复杂结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)靶标序列(例如，katG、rpoB、inhA启动子、pncA等)的多路测定法。
发明背景
核酸序列的单相检测是众所周知的。检测可包括染料，例如在双链扩增反应产物或荧光标记的寡核苷酸杂交探针的存在下发荧光的SYBR Green。对于杂交探针，"单相检测"意思是不需要分离结合的(与靶标杂交的)探针与未结合的探针的检测。适合于单相检测的探针尤其为：双重-标记的探针(例如，在5’和3’端上均包含标记部分(例如，荧光团和/或猝灭剂)的单链探针)，其由具有在一端上共价连接的荧光团和在另一端上共价连接的猝灭剂的单链寡核苷酸组成(例如，猝灭的探针或自猝灭探针)，当探针未结合至靶标时，其吸收光谱基本上与用于FRET猝灭的荧光团的发射光谱重叠(5'外切核酸酶探针，描述于例如Livak等(1995) PCR Methods Appl. 4:357-362；通过引用以其整体结合到本文中)；在一端上用荧光团标记和在另一端上用猝灭剂标记的发夹探针(分子信标探针，描述于例如Tyagi等(1996) Nature Biotechnology 14:303-308；通过引用以其整体结合到本文中)。在合适的温度下，当未结合至靶标时发夹探针具有茎/环结构，并且在该结构中荧光团和猝灭剂紧密相互作用以致它们以接触-猝灭而非FRET猝灭的方式接合。双链探针也可用于单相反应。这些探针具有在一条链上共价连接的荧光团和在另一条链的互补末端上共价连接的猝灭剂(阴阳探针，描述于例如Li等(2002) Nucl. Acids Res. 30, No. 2 e5；通过引用以其整体结合到本文中)；还有具有荧光团的线性探针，所述荧光团吸收来自荧光团的发射并以更长波长再发射(描述于例如美国公布的专利申请US2002/0110450的探针；通过引用以其整体结合到本文中)；和线性探针对，一个用供体荧光团标记和一个用受体荧光团标记，它们在靶标链上彼此靠近杂交以致它们的标记物通过FRET相互作用(FRET探针对，描述于例如美国专利号6,140,054；通过引用以其整体结合到本文中)。检测方法包括用于检测与单链核酸序列(包括不同的靶标序列)、包括由不完全互补链组成的异型双链的双链靶标或两者结合的探针的方法。
在一些实例中，适合于探测的核酸靶标序列可通过分离和纯化样品中的核酸而直接获得。在其它实例中，需要进行核酸扩增。用于单相检测的扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)，其包括对称PCR、不对称PCR和LATE-PCR，其任一种可与反转录组合用于扩增RNA序列；NASBA、SDA和滚环扩增。由于探针杂交，扩增-检测方法可依赖于荧光，或它们可依赖于在扩增期间杂交的探针的消化，例如5'核酸酶扩增-检测方法。如果样品包含或经扩增而包含双链靶标，例如对称PCR反应的扩增产物，而需要单链靶标的话，可通过已知方法进行正链和负链的分离，例如通过用生物素标记一个引物和通过俘获到包含抗生物素的表面来分离包含生物素的产物链与其它链，然后洗涤所述表面。
用于单相检测的某些荧光探针包含荧光团-标记的链，当其杂交至它在样品中的靶标序列时，其发射可检测信号。例如，分子信标探针是单链的和在杂交时发射可检测荧光信号。ResonSense ®探针也是单链的和仅在杂交时发信号，条件是样品包含染料，通常为SYBR染料，当染料受激时其通过FRET刺激杂交的探针。阴阳探针是猝灭的双链探针，其包括当它杂交至其靶标时发射可检测信号的荧光团-标记的链。另一方面，FRET探针对是当该对的两个探针杂交至它们的靶标序列时发射可检测荧光信号的探针对。一些扩增测定法，特别是5'核酸酶测定法，包括由探针切割以产生荧光探针片段而不是单纯的探针杂交引起的信号发生。
可构建在杂交时产生信号的某些探针，以致于是"等位基因特异性的"，即是说，仅杂交至完美互补的靶标序列，或者是错配耐受的，即是说，杂交至与探针序列完美互补的靶标序列或在稍微较低的温度下杂交至通常互补但包含一个或多个错配的靶标序列。等位基因特异性的分子信标探针具有相对短的探针序列，通常是不超过25个核苷酸长的单链环，具有4-6个核苷酸长的发夹茎，和可用于检测例如单核苷酸多态性。Marras等(1999)Genetic Analysis Biomolecular Engineering 14: 151-156 (通过引用以其整体结合到本文中)公开了实时对称PCR测定法，其在反应混合物中包括具有16个核苷酸长的探针序列和5个核苷酸的茎的四种分子信标，其中各探针为不同的颜色，即是说，包括通过其发射波长而检测上可区分的荧光团，且是由于单个核苷酸而不同于其他探针序列的探针序列。在每个PCR循环后分析样品以检测产生什么颜色，从而鉴定与探针之一完美互补的四个可能的靶标序列中的哪一个存在于样品中。错配耐受的分子信标探针具有更长的探针序列，通常为多达50或甚至60个核苷酸的单链环，其中发夹茎保持在4-7个核苷酸。Tyagi等欧洲专利号1230387 (通过引用以其整体结合到本文中)公开了使用一组具有40-45个核苷酸长的不同探针序列和5-7个核苷酸长的茎的四个不同颜色的错配耐受分子信标探针的对称PCR扩增和单相检测测定法，以竞争杂交和从而问询分枝杆菌16S rRNA基因的42个核苷酸长的高变序列，来确定八个分枝杆菌物种中的哪一个存在于样品中。通过在一个或多个温度下测定荧光团强度的比率分析样品，以鉴定存在的物种。El-Hajj等(2009) J. Clin.Microbiology 47:1190-1198 (通过引用以其整体结合到本文中)公开了同样使用具有36-39核苷酸长的不同探针序列和5个核苷酸长的茎的四个不同颜色的错配耐受分子信标探针的LATE-PCR扩增和单相检测测定法，以竞争杂交和从而问询分枝杆菌16S rRNA基因的39个核苷酸长的高变序列，来确定27个分枝杆菌物种中的哪一个存在于样品中。四个探针各自是"共有探针"，即是说，它具有与多个物种互补但与它们每一个都不完美互补的单链环。来自一些27个不同物种的基因组DNA被分别扩增，各探针的Tm通过扩增后解链分析确定，和将数据制表。为分析包含未知物种的样品，按上文将样品扩增和分析。比较所有四个探针的Tm与列表的结果，以鉴定存在于样品中的物种。
多种探针，错配耐受和等位基因特异性的，已经用于问询多个靶标序列。El-Hajj等(2001) J. Clin. Microbiology 39:4131-4137 (通过引用以其整体结合到本文中)公开了进行单个、多路、实时、对称PCR测定法，其包含五个不同颜色的等位基因特异性分子信标，三个与一条扩增子链互补，和两个与另一条扩增子链互补，其以重叠方式一起跨越了结核分枝杆菌(M . tuberculosis)的rpoB基因核心区的81个核苷酸长的区域。获得探针荧光强度，和获取未能杂交和发信号的任一个探针作为耐药性的指示。Wittwer等美国专利号6,140,054 (通过引用以其整体结合到本文中)公开了多路对称PCR测定法，用于检测在人HFE基因的两个序列(C282Y和H63D位点)中单个和两个碱基对错配，使用各位点的引物对、各位点的FRET探针对和快速热循环。各探针对包括：20-30个核苷酸长的错配耐受荧光供体探针，其经定位以杂交至具有可能变化的靶标位点；和35-45个核苷酸长的Cy5受体探针，称为"锚定"探针，因为当其伴侣荧光探针在解链温度下(依赖于其互补程度)从靶标序列上解链时，它仍然杂交。
使用单色指示物提供多个靶标序列的详细表征的可用的单管测定法将减少成本和复杂性分析。
发明简述
本文提供了在单管、多-探针测定法中用于分析核酸靶标序列的试剂和试剂盒以及其使用方法。在具体的实施方案中，提供多路测定法用于检测复杂结核分枝杆菌的靶标序列(例如，katG、rpoB、inhA启动子、pncA等)。
在具体的实施方案中，提供单管、单色、多路(例如，四路)测定法，用于检测复杂结核分枝杆菌的靶标序列(例如，katG、rpoB、inhA启动子等)，例如与第一(可扩增的)内部对照靶标序列一起。这样的多路(例如，四路)的多个(例如，四个)单链产物使用用一种颜色的荧光团标记的探针组检测。反应组分还可包括第二(不可扩增的)对照，其也用相同颜色标记(或者用不同颜色标记)。本文提供了这样的试剂和方法与其它检测和表征测定法(例如，用另外的颜色检测分枝杆菌pncA基因)一起使用。
在其它实施方案中，本文提供了多路、多颜色测定法，用于检测和/或表征例如分枝杆菌pncA基因。在一些实施方案中，这些多颜色测定法利用用单色标记的多个探针，其在不同的温度范围结合至两个或更多个不同的靶标(例如，不同的靶标扩增子)。此外，在一些这样的实施方案中，单靶标通过用多个不同颜色的标记物标记的探针结合。
在一些实施方案中，本文提供了用于分析样品中的多个单链核酸靶标序列的单相测定方法，包括：(a) 提供(i) 包含单链形式的多个核酸靶标序列的样品，和(ii) 对于各核酸靶标序列，至少一组可检测区分的两个相互作用杂交探针，其各自杂交至所述至少一个靶标，所述相互作用杂交探针包含：(A) 用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，和(B) 在不存在猝灭剂探针的情况下在杂交至样品中的所述至少一个靶标序列时发射高于背景的信号的发信号探针，其中如果两个探针均杂交至所述至少一个靶标序列，则猝灭剂探针的非荧光猝灭剂通过接触-猝灭来猝灭来自发信号探针的信号；和(b) 作为温度的函数，分析发信号探针和猝灭探针与所述至少一个靶标序列的杂交，所述分析包括由于其结合的猝灭剂探针导致的对各发信号探针的影响，以致有可能在不存在接触猝灭的情况下检测温度-依赖性增加、降低或两者或皆无，自发信号探针的荧光团发射的信号的变化(参见例如，美国专利公布号2012/0282611; 通过引用以其整体结合到本文中)。
在一些实施方案中，本发明提供用于分析样品中的多个单链核酸靶标序列的方法，包括：(a) 使包含单链核酸靶标序列(例如，两个或更多个)的样品与检测试剂接触，所述检测试剂包含针对各靶标序列的多组探针对，所述探针对的每一个包含：(i) 用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，和(ii) 用荧光团标记的发信号探针，其中当发信号探针未结合至靶标序列时从发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时从发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；其中各探针组的发信号探针用相同的荧光团标记；和(b) 作为温度的函数分析来自发信号探针的信号。在某些实施方案中，分析包括检测由于结合的猝灭剂探针导致的对各发信号探针的影响，使得有可能在不存在接触猝灭的情况下检测温度-依赖性增加、降低或两者或皆无，自发信号探针的荧光团发射的信号的变化(参见例如，美国专利公布号2012/0282611; 通过引用以其整体结合到本文中)。
在一些实施方案中，单链核酸靶标序列通过使用扩增试剂自样品核酸(例如，自生物学、临床或环境样品)扩增产生。在一些实施方案中，样品核酸包括复杂结核分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M. bovis)等)基因组核酸。在一些实施方案中，样品核酸自包含复杂结核分枝杆菌细菌(例如，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌等)的生物学、临床或环境样品获得。在一些实施方案中，样品核酸包含katG、rpoB、inhA启动子和/或pncA基因的一个或多个(例如，全部)。在一些实施方案中，样品核酸包含katG、rpoB、inhA 启动子、pncA、mabA、embB、rpsL、rss、gyrA、gyrB、eis、tlyA 16s rDNA基因的一个或多个。
在一些实施方案中，本发明提供用于分析单链核酸靶标序列的试剂盒或试剂混合物，包含：(a) 包含对各靶标序列特异性的引物对的扩增试剂，所述引物对包含过量的引物和有限的引物；和(b) 包含对各靶标序列的多组探针对的检测试剂，所述探针对的每一个包含：(i) 用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，和(ii) 用荧光团标记的发信号探针，其中当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列中的邻近序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭，其中各探针中的发信号探针用相同的荧光团标记，和其中对于各个靶标序列，靶标-特异性引物与靶标序列的解链温度高于发信号探针和猝灭探针的解链温度。
在一些实施方案中，靶标序列是复杂结核分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌等)核酸序列。在一些实施方案中，靶标序列包含katG、rpoB、inhA启动子或pncA基因的全部或部分。在一些实施方案中，靶标序列包含katG、rpoB、inhA启动子、pncA、mabA、embB、rpsL、rss、gyrA、gyrB、eis、tlyA、16s rDNA基因的全部或部分。在一些实施方案中，提供用于检测/表征2个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)靶标序列(例如，选自前述基因的一部分)的方法或试剂盒。
在一些实施方案中，在不同的温度范围下各发信号探针杂交至它们各自的靶标序列(例如，较低Tm探针自靶标的解链在大约第一温度(例如，15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或其中的温度)开始和较高Tm探针自靶标的解链在大约第二温度(例如，25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或其中的温度)完成)。在一些实施方案中，各个探针组的不同的温度范围是不重叠的。在一些实施方案中，各个探针组的不同的温度范围中的两个或更多个部分地重叠。在一些实施方案中，各个探针组的不同的温度范围中的两个或更多个重叠。在一些实施方案中，两个探针组的发信号探针的峰信号分开少于40℃ (例如，<35℃、<20℃、<25℃、<20℃、<15℃、<10℃、<5℃)。在一些实施方案中，两个探针组的发信号探针的峰信号分开超过5℃ (例如，>10℃、>15℃、>20℃、>25℃、>30℃)。在一些实施方案中，发信号探针与靶标序列的杂交的解链温度高于猝灭剂探针与靶标序列的杂交的温度(例如，在一个或多个探针组中，在全部探针组中)。在一些实施方案中，发信号探针与靶标序列的杂交的解链温度低于猝灭剂探针与靶标序列的杂交的温度(例如，在一个或多个探针组中，在全部探针组中)。在一些实施方案中，发信号探针是包含非荧光猝灭剂的猝灭探针，当发信号探针未杂交至靶标时其减少来自荧光团的信号。在一些实施方案中，发信号探针是双重-标记的探针(例如，3'和5'标记)，由包含具有非荧光猝灭剂部分的DNA的单链寡核苷酸组成，当所述探针未杂交至靶标时所述非荧光猝灭剂部分减少来自荧光部分的信号(例如，自猝灭)。在一些实施方案中，发信号探针是分子信标探针。在一些实施方案中，发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光染料之间包含靶标结合区和非结合区。
在一些实施方案中，作为温度的函数分析来自发信号探针的信号包括产生解链曲线或退火曲线。在一些实施方案中，作为温度的函数分析来自发信号探针的信号包括在多个离散温度下监测信号。在一些实施方案中，解链曲线、退火曲线或单一温度信号与已知曲线、对照曲线或已知或对照值比较。在一些实施方案中，分析来自发信号探针的信号检测靶标序列的存在。在一些实施方案中，分析来自发信号探针的信号检测靶标序列内的序列变化的存在(例如，突变)。在一些实施方案中，靶标序列的特定变化(例如，SNP)是可鉴定的。
在一些实施方案中，第一探针组的发信号探针和猝灭剂探针具有范围为10-75℃(例如，35-55℃)的与第一靶标序列杂交的解链温度。在一些实施方案中，第一靶标序列是结核分枝杆菌inhA启动子基因的一部分。在一些实施方案中，第一探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 19具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)，和第一探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 20具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。在一些实施方案中，第二探针组的发信号探针和猝灭剂探针具有范围为10-75℃ (例如，45-60℃)的与第二靶标序列杂交的解链温度。在一些实施方案中，第二靶标序列是结核分枝杆菌katG基因的一部分。在一些实施方案中，第二探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 17具有至少70%同一性和第二探针组的猝灭剂探针与SEQ IDNO: 18具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。在一些实施方案中，第三探针组的发信号探针和猝灭剂探针具有范围为10-75℃ (例如，55-75℃)的与第三靶标序列杂交的解链温度。在一些实施方案中，第三靶标序列是结核分枝杆菌rpoB基因的一部分。在一些实施方案中，第三探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 12、14或15之一具有至少70%同一性和第三探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 11、13或16之一具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。在一些实施方案中，rpoB发信号探针4和/或5和/或猝灭剂探针1可替换为发信号探针4a、5a或猝灭剂探针1a，其具有略微不同的序列以在特定密码子上实现更大的等位基因区分。在一些实施方案中，第四靶标序列是结核分枝杆菌pncA基因的一部分。在一些实施方案中，第四探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、42、44、46、48或50之一具有至少70%同一性，和第三探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、43、45、47、49、50或51之一具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。在一些实施方案中，多个探针组用于在单一测定法(例如，单色、单管)中鉴定/表征pncA基因(例如，与相同的单链靶标杂交)。
在一些实施方案中，提供两个或更多个探针组用于检测/表征单一单链靶标序列的不同的部分。
在一些实施方案中，检测试剂还包含一个或多个对照序列、探针等。在一些实施方案中，检测试剂还包含第一单链或双链内部对照序列和第一对照信号探针，其中第一对照序列的信号探针用与至少一个靶标序列的发信号探针相同的荧光团标记。在一些实施方案中，检测试剂还包含第一单链内部对照序列和包含相应的猝灭剂探针和信号探针的第一对照探针组，其中第一对照序列的信号探针用与至少一个靶标序列的发信号探针相同的荧光团标记。在一些实施方案中，第一对照探针组的发信号探针和猝灭剂探针具有低于35℃(例如，<30℃、25℃、20℃、15℃)的与内部对照序列杂交的解链温度。在一些实施方案中，第一对照探针组的发信号探针和猝灭剂探针具有范围为5-15℃、10-20℃、15-25℃、20-30℃、25-35℃等的与内部对照序列杂交的解链温度。在一些实施方案中，内部对照序列是内部对照质粒的一部分(例如，在反应混合物中提供)。在一些实施方案中，第一对照探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 52具有至少70%同一性或互补性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)和第一对照探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 53具有至少70%同一性或互补性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
在一些实施方案中，检测试剂还包含第二单链内部对照序列和包含相应的猝灭剂探针和信号探针的第二对照探针组，其中第二对照序列的信号探针用与至少一个靶标序列的发信号探针相同的荧光团标记。在一些实施方案中，猝灭剂探针共价连接至内部对照序列，以致猝灭剂可猝灭互补探针链上的荧光团。在一些实施方案中，第二对照探针组的发信号探针和猝灭剂探针具有范围为70-80℃、75-80℃、80-90℃等的与内部对照序列杂交的解链温度。在一些实施方案中，第二对照探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 54具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)和对照探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 55具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
在一些实施方案中，扩增试剂包含引物对(例如，经设计以杂交至基因的特定区的靶标-特异性或错配耐受引物)。在一些实施方案中，引物对包含过量引物和有限引物(美国专利号7,198,897; 通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中，靶标-特异性引物与靶标序列的解链温度高于各个靶标序列的发信号探针和猝灭探针的解链温度。在一些实施方案中，扩增是不对称扩增，以产生单链核酸靶标序列。在一些实施方案中，扩增通过LATE-PCR进行。在一些实施方案中，第一靶标特异性引物对包含与SEQ ID NO: 6至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 5至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物。在一些实施方案中，第二靶标特异性引物对包含与SEQ IDNO: 4至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 3至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物。在一些实施方案中，第三靶标特异性引物对包含与SEQ ID NO: 2至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 1至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物。在一些实施方案中，第四靶标特异性引物对包含与SEQ ID NO: 7至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 8至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物。
在一些实施方案中，扩增试剂包含寡核苷酸试剂以：抑制引发错误，增加针对3'末端错配的聚合酶选择性，增加针对富含AT的3'端的聚合酶选择性，减少复制分散，抑制聚合酶5'外切核酸酶活性和/或抑制聚合酶活性(这样的试剂可称为Primesafe或Primesafe I或Primersafe II试剂；参见例如，美国公开号2012/0088275; 美国公开号2009/0226973;美国公开号2006/0177842；通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中，寡核苷酸试剂包含一对互补的寡核苷酸，其杂交的解链温度为约70℃，所述寡核苷酸的每一个被3’和5’端-标记。在一些实施方案中，互补的寡核苷酸末端被dabcyl基团标记。在一些实施方案中，互补的寡核苷酸与SEQ ID NO: 56和57具有大于70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
在一些实施方案中，本发明提供用于分析单链核酸靶标序列的试剂盒和/或试剂混合物。在一些实施方案中，这样的试剂盒和/或试剂混合物用于鉴定/检测/表征本文所述的靶标序列的方法。在一些实施方案中，这样的试剂盒和/或试剂混合物包含本文所述的引物、探针和/或对照序列。在一些实施方案中，试剂盒和/或试剂混合物还包含合适的缓冲液、盐、酶等。
在一些实施方案中，本发明提供用于分析样品中的四个或更多个核酸靶标序列的方法，包括：(a) 使包含四个或更多个核酸靶标序列的样品与扩增试剂接触，其中扩增试剂包含对四个或更多个核酸靶标序列的每一个有特异性的多组引物对；(b) 在产生各靶标序列的单链扩增子的条件下扩增核酸靶标序列；(c) 使样品与检测试剂接触，所述检测试剂包含对各靶标序列的多组探针对，所述探针对的每一个包含：(i) 用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，和(ii) 用荧光染料标记的发信号探针，其中当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭，其中各探针组的发信号探针用相同的荧光染料标记；和(d) 作为温度的函数分析来自发信号探针的信号。在一些实施方案中，发信号探针是具有荧光团和非荧光猝灭剂的自-猝灭探针。
在一些实施方案中，本发明提供试剂盒，包含：(a) 内部对照核酸，(b) 检测试剂，所述检测试剂包含：(i) 对各靶标序列有特异性的探针组和内部对照核酸，所述探针组的每一个包含：(A) 用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，和(B) 用荧光染料标记的发信号探针；其中当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭，其中靶标序列的各探针组的发信号探针用相同的荧光染料标记，和其中对内部对照核酸有特异性的猝灭剂探针和发信号探针具有低于35℃的与内部对照核酸的单链部分的解链温度；和(c) 扩增试剂，所述扩增试剂包含：对各靶标序列有特异性的引物对和内部对照核酸，所述引物对包含过量引物和有限引物，和其中靶标-特异性引物与靶标序列的解链温度高于各个靶标序列或内部对照核酸的发信号探针和猝灭探针的解链温度。在一些实施方案中，发信号探针是具有荧光团和非荧光猝灭剂的自-猝灭探针。
在一些实施方案中，提供用于分析样品中的两个或更多个核酸靶标序列的方法，包括：(a) 将样品与上述的内部对照核酸、检测试剂和扩增试剂接触；(b) 用扩增试剂扩增内部对照核酸的一部分和两个或更多个核酸靶标序列的每一个的一部分，以产生单链扩增子；和(c) 检测在一定温度范围下来自发信号探针的信号。
在一些实施方案中，本发明提供用于检测和/或表征样品中的分枝杆菌的试剂盒或试剂混合物，包含：(a) 对inhA启动子、katG和rpoB基因内的靶标序列有特异性的引物对，所述引物对包含过量引物和有限引物；和(b) 对inhA启动子、katG和rpoB基因内的靶标序列的探针组，所述探针组的每一个包含：(i) 用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，和(ii) 具有荧光团加非荧光猝灭剂的自-猝灭发信号探针，其中当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭，其中各探针组的发信号探针用相同的荧光染料标记，和其中引物对与靶标序列的解链温度高于各个靶标序列的发信号探针和猝灭探针的解链温度。在一些实施方案中，本文提供了用于检测和/或表征样品中的分枝杆菌的方法，包括：(a) 使样品与上述试剂盒或试剂混合物接触；(b) 用引物对扩增靶标序列，以产生单链扩增子；和(c) 检测在一定的温度范围下来自发信号探针的信号。
在一些实施方案中，本发明提供试剂盒或反应混合物，包含：(a) 第一内部对照，包含：(i) 第一对照序列，(ii) 包含过量引物和有限引物的引物对，用于扩增第一对照序列的全部或部分的单链，以产生第一对照扩增子，(iii) 用非荧光猝灭剂标记和与第一对照扩增子的第一部分互补的猝灭剂探针，和(iv) 用荧光团标记和与第一对照扩增子的第二部分互补的发信号探针；和(b) 第二内部对照，包含：(i) 第二对照序列，(ii) 用非荧光猝灭剂标记和与第二对照序列的第一部分互补的猝灭剂探针，和(iii) 具有荧光团加非荧光猝灭剂和与第二对照序列的第二部分互补的自-猝灭发信号探针；其中当发信号探针未结合至对照序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至对照序列但猝灭剂探针未结合至对照序列时自发信号探针发射高于背景的信号，和其中当发信号探针和猝灭剂探针结合至对照序列时来自发信号探针的信号被猝灭剂探针的非荧光猝灭剂猝灭。在一些实施方案中，第一内部对照的发信号探针和第二内部对照的发信号探针用相同的荧光染料标记。在一些实施方案中，第一内部对照的发信号探针和猝灭剂探针的Tm和第二内部对照的发信号探针和猝灭剂探针的Tm的差异大于30℃。在一些实施方案中，第二内部对照是不可扩增的对照，和不需要扩增引物。在一些实施方案中，第一内部对照的发信号探针和猝灭剂探针的Tm低于第二内部对照的发信号探针和猝灭剂探针的Tm至少30℃ (例如，>35℃、>40℃、>45℃、>50℃、>55℃、>60℃)。在一些实施方案中，第二内部对照的发信号探针和猝灭剂探针的Tm低于第一内部对照的发信号探针和猝灭剂探针的Tm至少30℃ (例如，>35℃、>40℃、>45℃、>50℃、>55℃、>60℃)。在一些实施方案中，试剂盒或反应混合物还包含：(c) 第三内部对照，包含：(i) 第三对照序列，(ii) 用非荧光猝灭剂标记和与第三对照序列的第一部分互补的猝灭剂探针，和(iii) 用荧光团标记和与第三对照序列的第二部分互补的发信号探针。在一些实施方案中，试剂盒或反应混合物还包含：(iv) 包含过量引物和有限引物的引物对，用于扩增第三对照序列的全部或一部分的单链以产生第三对照扩增子。在一些实施方案中，发信号探针是具有荧光团和非荧光猝灭剂的自-猝灭探针。
在一些实施方案中，本发明提供校准或控制仪器或反应的方法，包括：(a) 在单一反应容器中提供前述试剂盒或反应混合物之一；(b) 将反应容器暴露于足以允许单链扩增的条件；(c) 作为温度的函数分析来自发信号探针的信号。在一些实施方案中，步骤(a)-(c)在多个反应容器中同时或序贯进行。
在一些实施方案中，本文提供了反应混合物，其包含：(a) 靶标核酸；和(b) 杂交探针组，由三个或更多个有色探针对组构成，各探针对包含：(i) 用荧光部分标记和与所述靶标核酸内的具体序列互补的发信号探针，和(ii) 用非荧光猝灭剂部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的猝灭探针；其中各发信号探针和其毗连的猝灭探针包含解链温度不同于其它探针对的解链温度的探针对；和其中发信号探针以相同的发信号颜色发荧光的所有探针对包含有色探针对组，和其中：有色组内的所有探针对与所述靶标核酸内的序列杂交，和其中：有色组内的所有探针对不与所述靶标核酸内的连续序列杂交。在一些实施方案中，各发信号探针对于靶标序列的解链温度不同于三个或更多个探针组的其它发信号探针；其中各猝灭探针对于靶标序列的解链温度不同于三个或更多个探针组的其它猝灭探针。在一些实施方案中，根据解链温度的递增或递减幅度，发信号探针的杂交序列并非在靶标核酸内线性排列，和/或根据解链温度的递增或递减幅度，猝灭探针的杂交序列并非在所述靶标核酸内线性排列。
在一些实施方案中，有色探针组的一个或多个发信号探针当未与靶标序列结合时发射背景信号，其中当探针对的发信号探针结合至靶标序列但探针对的猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自探针对的发信号探针的信号被探针对的非荧光猝灭剂猝灭。在一些实施方案中，发信号探针和猝灭探针与它们的靶标核酸序列充分互补，以在如某一温度的测定条件下杂交。
在一些实施方案中，对于各有色组，各探针对中的发信号探针对靶标核酸的解链温度高于相同的探针对中的猝灭探针对其靶标序列的解链温度。
在一些实施方案中，发信号探针是自-猝灭探针，其包含非荧光猝灭剂，当发信号探针未与靶标杂交时减少来自荧光团的信号。在一些实施方案中，发信号探针是分子信标探针。在一些实施方案中，发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光荧光团之间包含靶标结合区和非结合区。
在一些实施方案中，靶标核酸是单链。在一些实施方案中，靶标核酸包含结核分枝杆菌核酸序列。在一些实施方案中，靶标核酸包含pncA基因的一部分。
在一些实施方案中，本文提供了用于分析样品中的至少一个单链核酸靶标序列的单相测定方法，包括：(a) 根据前述段落形成反应混合物，其中对于各探针组的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但相同的探针对的猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当探针对的发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；(b) 在一定范围的温度下检测来自所述发信号探针的所述荧光部分的荧光信号；和(c) 作为温度的函数，分析所述探针组与所述至少一个靶标序列的杂交。
在一些实施方案中，本文提供了试剂盒或反应混合物，包含：(a) 用于自样品核酸扩增靶标核酸的引物；和(b) 杂交探针组，由三个或更多个有色探针对组构成，各探针对包含：(i) 用荧光部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii)用非荧光猝灭剂部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的猝灭探针；其中各发信号探针对靶标序列的解链温度不同于相同的有色组的其它发信号探针；其中各猝灭探针对靶标序列的解链温度不同于相同的有色组的其它猝灭探针；和其中：(A) 发信号探针以相同的发信号颜色发荧光的所有探针对包含有色探针对组，和其中：有色组内的所有探针对与所述靶标核酸内的序列杂交，和其中：(B) 有色组内的所有探针对不与所述靶标核酸内的连续序列杂交。在一些实施方案中，根据解链温度的递增或递减幅度，发信号探针的杂交序列并非在所述靶标核酸内线性排列，和/或根据解链温度的递增或递减幅度，猝灭探针的杂交序列并非在所述靶标核酸内线性排列。
在一些实施方案中，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但相同的探针对的猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当相同的探针对的发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭。在一些实施方案中，发信号探针和猝灭探针与它们的具体核酸靶标序列充分互补，以致允许在测定条件下杂交。在一些实施方案中，靶标核酸是单链的。
在一些实施方案中，靶标核酸包含结核分枝杆菌核酸序列。在一些实施方案中，靶标核酸包含pncA基因的一部分。在一些实施方案中，对于各探针对，发信号探针与靶标核酸的解链温度高于猝灭探针与靶标序列的解链温度。在一些实施方案中，发信号探针是自-猝灭探针，其包含非荧光猝灭剂，当发信号探针未与靶标杂交时减少来自荧光团的信号。在一些实施方案中，发信号探针是分子信标探针。在一些实施方案中，发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光团之间包含靶标结合区和非结合区。
在一些实施方案中，引物包含有限引物和过量引物，其具有不对称PCR扩增所需要的性质。在一些实施方案中，引物包含有限引物和过量引物，其具有LATE-PCR扩增所需要的性质。在一些实施方案中，引物包含有限引物和过量引物，其具有LEL-PCR (Linear-Expo-Linear)扩增所需要的性质。在一些实施方案中，试剂盒或反应混合物进一步包含靶标核酸。在一些实施方案中，引物与所述靶标核酸的保守区互补和侧连所述靶标核酸的可变区。
在一些实施方案中，本文提供了用于分析样品靶标核酸的单相测定方法，包括：(a) 根据前述段落形成反应混合物，其中对于各探针对的发信号探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但相同的探针对的猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被相同的探针对的非荧光猝灭剂猝灭；(b) 用所述引物扩增所述样品核酸，以产生靶标核酸；(c) 在一定范围的温度下检测来自所述发信号探针的所述荧光部分的荧光信号；和(d) 作为温度的函数，分析所述探针组与所述至少一个靶标序列的杂交。在一些实施方案中，产生靶标核酸序列依赖的荧光信号。
在一些实施方案中，靶标核酸是单链的。在一些实施方案中，引物包含过量引物和有限引物，和所述扩增通过LATE-PCR进行。
在一些实施方案中，本文提供了反应混合物，包含：(a) 靶标核酸；和(b) 三个或更多个探针对，各探针对包含：(i) 用荧光部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 用非荧光猝灭剂部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的猝灭探针；其中探针对的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上相邻(例如，没有间插入的空位，连续的等)；其中在所述三个或更多个探针对内的至少两个发信号探针用第一荧光部分标记，和在所述三个或更多个探针对内的至少一个发信号探针用第二荧光部分标记；和其中包含用第二荧光部分标记的发信号探针的至少一个探针对的杂交序列在靶标核酸上与包含用第一荧光部分标记的发信号探针的两个探针对的杂交序列是连续的。在一些实施方案中，各发信号探针对靶标序列的解链温度不同于反应混合物中的用相同的荧光部分标记的所有其它发信号探针。
在一些实施方案中，对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭。在一些实施方案中，发信号探针和猝灭探针与它们的特定杂交序列充分互补，以允许在测定条件下杂交。在一些实施方案中，靶标核酸是单链的。
在一些实施方案中，靶标核酸包含结核分枝杆菌核酸序列。在一些实施方案中，靶标核酸包含pncA基因的一部分。在一些实施方案中，对于各探针组，发信号探针与靶标核酸的解链温度高于猝灭探针与靶标序列的解链温度。在一些实施方案中，发信号探针是自-猝灭探针，其包含非荧光猝灭剂，当发信号探针未与靶标杂交时减少来自荧光团的信号。在一些实施方案中，发信号探针是分子信标探针。在一些实施方案中，发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光染料之间包含靶标结合区和非结合区。
在一些实施方案中，本文提供了用于分析样品中的至少一个单链核酸靶标序列的单相测定方法，包括：(a) 形成前述段落的反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；(b) 在一定范围的温度下检测来自所述发信号探针的所述荧光部分的荧光信号；和(c) 作为温度的函数，分析所述探针组与所述至少一个靶标序列的杂交。
在一些实施方案中，本文提供了试剂盒或反应混合物，其包含：(a) 用于自样品核酸扩增靶标核酸的引物；和(b) 三个或更多个探针对，各探针对包含：(i) 用荧光部分标记和与所述靶标核酸内的独特的杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 用非荧光猝灭剂部分标记和与所述靶标核酸内的独特的杂交序列互补的猝灭探针；其中探针对的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上是连续的(例如，无核苷酸空位)；其中在所述三个或更多个探针对内的至少两个发信号探针用第一荧光部分标记，和在所述三个或更多个探针对内的至少一个发信号探针用第二荧光部分标记；和其中包含用第二荧光部分标记的发信号探针的至少一个探针对的杂交序列在靶标核酸上间插入包含用第一荧光部分标记的发信号探针的两个探针对的杂交序列，并与其连续。在一些实施方案中，各发信号探针对靶标序列的解链温度不同于反应混合物中用相同的荧光部分标记的所有其它发信号探针(例如，在相同的有色组中)。
在一些实施方案中，本文提供了用于分析至少一个样品核酸的单相测定方法，包括：(a) 根据前述段落形成反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；(b) 用所述引物扩增所述样品核酸，产生靶标核酸；(c) 在一定范围的温度下检测来自所述发信号探针的所述荧光部分的荧光信号；和(d) 作为温度的函数，分析所述探针对与所述至少一个靶标序列的杂交。
在一些实施方案中，本文提供了反应混合物，其包含：(a) 靶标核酸；(b) 第一有色组，包含多个探针对，第一有色组的各探针对包含：(i) 包含第一荧光部分和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 包含猝灭剂部分和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的猝灭探针；其中探针对的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上毗邻；和(c) 第二有色组，包含多个探针对，第二有色组的各探针对包含：(i)包含具有来自第一荧光部分的激发/发射光谱的第二荧光部分和与所述靶标核酸内的独特杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 包含猝灭剂部分和与所述靶标核酸内的独特杂交序列互补的猝灭探针；其中第一多个探针组的各探针组的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上毗邻；其中各探针对的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上毗邻；其中来自所述第一有色组的第一探针对的杂交序列和来自所述第一有色组的第二探针对的杂交序列间插有来自第二有色组的至少一个探针对的杂交序列，并与其连续。在一些实施方案中，对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭。在一些实施方案中，发信号探针和猝灭探针与它们的特定杂交序列充分互补，以允许在测定条件下杂交。在一些实施方案中，靶标核酸是单链的。在一些实施方案中，对于各探针对，发信号探针与靶标核酸的解链温度高于猝灭探针与靶标序列的解链温度。在一些实施方案中，发信号探针是自-猝灭探针，其包含非荧光猝灭剂，当发信号探针未与靶标杂交时减少来自荧光团的信号。在一些实施方案中，发信号探针是分子信标探针。在一些实施方案中，发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光染料之间包含靶标结合区和非结合区。在一些实施方案中，靶标核酸包含结核分枝杆菌核酸序列。在一些实施方案中，靶标核酸包含pncA基因的一部分。在一些实施方案中，探针的核酸序列选自与选自SEQ ID NO: 65-102的核酸具有至少70% (例如，<70%、<75%、<80%、<85%、<90%、<95%)序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含：(d) 第三有色组，其包含多个探针对，第三有色组的各探针对包含：(i) 包含具有与所述第一荧光部分和所述第二荧光部分不同的激发/发射光谱的第三荧光部分并且与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 包含猝灭剂部分和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的猝灭探针；其中第三有色组的各探针对的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上是连续的；其中来自所述第三有色组的第一探针对的杂交序列和来自所述第三有色组的第二探针对的杂交序列间插有来自第一或第二有色组的至少一个探针对和/或与其连续。在一些实施方案中，靶标核酸包含结核分枝杆菌核酸序列。在一些实施方案中，靶标核酸包含pncA基因的一部分。在一些实施方案中，探针的核酸序列包含与选自SEQ ID NO:65-102的核酸序列至少70% (例如，<70%、<75%、<80%、<85%、<90%、<95%)序列同一性。在一些实施方案中，探针选自SEQ ID NO: 65-102。
在一些实施方案中，本文提供了用于分析至少一个样品核酸的单相测定方法，包括：(a) 形成前述段落中描述的反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；(b) 在一定范围的温度下检测来自所述发信号探针的所述荧光部分的荧光信号；和(c) 作为温度的函数，分析所述探针对与所述至少一个靶标序列的杂交。
在一些实施方案中，本文提供了反应混合物，其包含：(a) 第一靶标核酸序列；(b)第二靶标核酸序列；(b) 第一有色组，包含多个探针对，各探针对包含：(i) 包含第一荧光部分和与所述第一靶标核酸序列或所述第二靶标核酸序列内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 包含猝灭剂部分和与特定杂交序列互补的猝灭探针，所述杂交序列与探针组的发信号探针的特定杂交序列连续；和(c) 第二有色组，包含多个探针对，各探针对包含：(i) 包含具有来自所述第一荧光部分的激发/发射光谱的第二荧光部分和与所述第一靶标核酸序列或所述第二靶标核酸序列内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 包含猝灭剂部分和与特定杂交序列互补的猝灭探针，所述杂交序列与探针对的发信号探针的独特杂交序列连续；其中来自所述第一有色组和所述第二有色组的每一个的至少一个探针对的杂交序列在所述第一靶标核酸序列内，和其中来自所述第一有色组和所述第二有色组的每一个的至少一个探针对的所述杂交序列在所述第二靶标核酸序列内。在一些实施方案中，所述有色组的每一个包含三个或更多个探针组。
在一些实施方案中，本文提供了反应混合物，其包含：(a) 靶标核酸；(b) 核酸探针的第一有色组，其中的探针与靶标核酸内的杂交序列互补；其中第一有色组包含三个或更多个探针对，其中各探针对包含用第一荧光团标记的发信号探针和用猝灭剂部分标记的猝灭探针；和其中各探针对的发信号探针和猝灭探针在靶标核酸上是连续的；和(c) 核酸探针的第二有色组，其中的探针与靶标核酸内的杂交序列互补；其中第二有色组包含三个或更多个探针对，其中各探针对包含用第二荧光团标记的发信号探针和用猝灭剂部分标记的猝灭探针；和其中各探针对的发信号探针和猝灭探针在靶标核酸上是连续的；其中来自第一有色组的至少一个探针对的杂交序列间插入来自第二有色组的两个探针对的特定杂交序列，并与其连续。在一些实施方案中，反应混合物还包含：(d) 核酸探针的第三有色组，其中的探针与靶标核酸内的杂交序列互补；其中第三有色组包含三个或更多个探针对，其中各探针对包含用第三荧光团标记的发信号探针和用猝灭剂部分标记的猝灭探针；和其中各探针对的发信号探针和猝灭探针在靶标核酸上是连续的；其中来自第三有色组的至少一个探针对的杂交序列间插入来自第二有色组或第一有色组的两个探针对的特定杂交序列，并与其连续。在一些实施方案中，反应混合物还包含第四有色组、第五有色组、第六有色组等。
附图简述
图1表明用于多重/广泛耐药性结核病(M/XDR-TB)的单管、单色、LATE PCR检测的示例性测定法设计。
图2表明以两种颜色的pncA基因突变检测测定法的示意图。
图3表明在三十倍范围浓度中获自牛分枝杆菌样品的荧光信号，具有无模板对照，使用100 nM pncA_探针406_427 ON_Bovis (SEQ ID NO: 44)和300 nM pncA_探针_428_448_OFF (SEQ ID NO: 45)探针。
图4表明在三十倍范围浓度中获自结核分枝杆菌样品的荧光信号，具有无模板对照，使用100 nM pncA_探针406_427 ON_Bovis (SEQ ID NO: 44)和300 nM pncA_探针_ 428_448_OFF (SEQ ID NO: 45)探针。
图5表明牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、无模板对照的荧光信号的比较，使用200 nMpncA_探针 406_427 ON_Bovis (SEQ ID NO: 44)和500 nM pncA_探针_ 428_448_OFF(SEQ ID NO: 45)探针。
图6表明inhA启动子、katG、rpoB的探针组与第一和第二内部对照探针或仅第二内部对照的荧光信号的比较。
图7表明包含inhA启动子、katG和rpoB的突变的各种组合的五种菌株(1、2、3、4和5)的荧光信号的比较。
图8表明包含inhA启动子、katG和rpoB的突变的各种组合的五种菌株(1、6、7、8和9)的荧光信号的比较。
图9表明包含inhA启动子、katG和rpoB的突变的各种组合的五种菌株(1、10、11、12和13)的荧光信号的比较。
图10表明包含inhA启动子、katG和rpoB的突变的各种组合的六种菌株(1、14、15、16、17和18)的荧光信号的比较。
图11表明包含inhA启动子、katG和rpoB的突变的各种组合的五种菌株(1、19、20、21和22)的荧光信号的比较。
图12表明对于不同的发信号(ON)探针4和4a、发信号(ON)探针5和5a、和猝灭剂OFF探针1和1a，与参考rpoB靶标序列结合的备选示例性探针。
图13表明与pncA靶标序列结合的示例性探针。相应的发信号(ON)和猝灭剂(OFF)探针按排分组。
图14表明荧光vs.温度曲线的示意图，和(1)杂交的发信号探针和猝灭剂探针，(2)杂交的发信号探针/溶液中的猝灭剂探针，和(3)溶液状态的发信号探针和猝灭剂探针，其产生曲线。发信号部分是空心圆和猝灭部分是实心圆。
图15表明在减少二级结构的修饰之前(左)和之后(右)，在25℃对照靶标的扩增区段的Visual OMP预测的最稳定的二级结构。几个C核苷酸被删除或改变为A或T核苷酸和G、A和T核苷酸被添加至修饰的序列。仅对引物或所示序列的每个末端的引物互补部分进行较小的改变。左侧的Tm结构，其在探针靶向的核苷酸中包括发夹结构，为37℃。对于右侧的修饰的序列的探测区域的发夹结构，预测的最高Tm为23℃。
图16表明样品的荧光的负导数曲线，具有估计的1,000个扩增的对照靶标(实线)或100个扩增的对照靶标(虚线)。27℃的峰谷是由于猝灭探针的解链导致。大约30℃的峰是由于发信号探针的解链导致。
图17表明示例性的单管、多色LATE-PCR测定法，用于检测/鉴定/表征复杂结核病，包括多重和广泛耐药性TB。各行靶标表示本文所述的单色测定法，其各自在单管中进行。
图18表明示例性的单管、多色LATE-PCR测定法，用于检测/鉴定/表征复杂结核病，包括多重和广泛耐药性TB。各行靶标表示本文所述的单色测定法，其各自在单管中进行。
图19表明来自单管、二色测定法的示例性的温度-依赖性荧光数据，其根据pncA基因的序列差异区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌。
图20表明对于示例性的二色、单管测定法(设计I测定法)，探针Tm vs. pncA序列的图，用于区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌。灰色盒表示Off探针，黑洞猝灭剂(Biosearch Technologies, Petaluma, California USA)；空心盒为On探针，含有荧光团Cal Orange 560 (Biosearch Technologies, Petaluma, California USA)；和黑色填充盒为荧光团Quasar 670 (Biosearch Technologies, Petaluma, California USA)。各盒下方是探针与结核分枝杆菌菌株H37Rv的Visual OMP预测的Tm。
图21表明对于没有指定的荧光颜色的示例性的单管测定法(设计II测定法)，探针Tm vs. pncA序列的图，用于区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌。灰色盒表示Off探针和空心盒为On探针。
图22表明对于示例性的三色、单管测定法(设计II测定法)，探针Tm的图，用于区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌，其中探针对在各有色组内被分组。各盒下方是探针与结核分枝杆菌菌株H37Rv的Visual OMP预测的Tm。
图23表明对于示例性的三色、单管测定法(设计II测定法)，探针Tm的图，用于区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌，其中各个探针的序列已被调整至在探针对内和各颜色的温度范围间的最大Tm差异，得到的探针对在各有色组内被分组。各盒下方是探针与结核分枝杆菌菌株H37Rv的Visual OMP预测的Tm。
图24表明来自单管、单色、四路LATE PCR测定法的示例性的温度-依赖性荧光数据；线190是对所有三个基因的药物敏感性菌株H37Rv和线191是仅对katG的抗性菌株(S315T，位于氨基酸位置315的丝氨酸被改变为酪氨酸)。
图25表明来自单管、单色、四路LATE PCR测定法的示例性的温度-依赖性荧光数据；敏感性菌株是线200，而仅inhA启动子抗性菌株，线201包含在启动子区的-8位置的单核苷酸改变(T/C)。
图26表明来自单管、单色、四路LATE PCR测定法的示例性的温度-依赖性荧光数据；线210是敏感性菌株，而线211仅包含rpoB突变(D516V，天冬氨酸至缬氨酸)。
图27表明来自单管、单色、四路LATE PCR测定法的示例性的温度-依赖性荧光数据；线220是敏感性菌株，而线221仅包含双重rpoB突变(D516A，天冬氨酸至丙氨酸和H526N，组氨酸至天冬酰胺)。
图28表明来自单管、二色pncA测定法的示例性的温度-依赖性荧光数据，子图(A)显示Cal Red 610和子图(B)显示Quasar 670。
图29表明来自单管、二色pncA测定法的示例性的温度-依赖性荧光数据，子图(A)显示Cal Red 610和子图(B)显示Quasar 670。
图30表明来自单管、二色设计I pncA测定法的示例性的温度-依赖性荧光数据，子图(A)显示Cal Red 610和子图(B)显示Quasar 670。
图31表明来自单管、三色设计II pncA测定法的示例性的温度-依赖性荧光数据，子图(A)显示Cal Orange 560，子图(B)显示Quasar 670和子图(C)显示Cal Red 610。
图32表明来自单管、三色设计II pncA测定法的示例性的温度-依赖性荧光数据，子图(A)显示Cal Orange 560，子图(B)显示Quasar 670和子图(C)显示Cal Red 610。
图33具有两个子图。子图(A)描述示例性的设计II杂交探针组的示意图。子图(B)描述通过改变靶标序列导致的探针杂交Tm的变化。
定义
如本文所用，术语“试剂盒”是指用于递送物质的任何递送系统。在反应测定法的背景中，这样的递送系统包括允许贮存、运输或从一个位置至另一位置递送反应试剂(例如，寡核苷酸、酶等，在合适的容器中)和/或支持物质(例如，缓冲液、用于进行测定法的书面说明书等)的系统。例如，试剂盒包括一个或多个附件(例如，盒)，其包含相关的反应试剂和/或支持物质。如本文所用，术语"分隔试剂盒"是指递送系统，其包含两个或更多个分开的容器，各自包含总试剂盒组分的子部分。术语“试剂盒”包括分隔和组合试剂盒两种。
如本文所用，术语“反应混合物(mix)”或“反应混合物(mixture)”是指在单一容器(例如，微量离心管、PCR管、孔、微通道等)中在溶液中的试剂(例如，核酸、酶、荧光团、缓冲液、盐等)的组合。
术语“样品”在本文中以其最广含义使用。其意指包括：样本或培养物(例如，微生物培养物)、配制的溶液或混合物、和生物学和环境样品两者。生物学样品可以是动物，包括人，或微生物。生物学样品可呈流体或固体的形式，和可获自任何合适的生物来源。环境样品包括环境材料，例如表面物质、土壤、植物和水。这些实例不将解释为限制可应用于本发明的样品类型。
如本文所用，术语"基因"是指核酸(例如，DNA)序列，其包含产生多肽或前体(例如，katG, rpoB, inhA启动子, pncA等)所需要的编码序列。术语"基因"包括基因的cDNA和基因组形式两者。
如本文所用，术语“靶标特异性”当涉及寡核苷酸试剂而使用时，例如在“靶标-特异性探针”或“靶标-特异性引物”中，是指经设计和产生用于与特异性靶标序列杂交(例如，用于检测、表征或扩增靶标序列)的试剂。靶标-特异性试剂可以是等位基因识别的或错配耐受的。
如本文所用，术语“内部对照”或“IC”是指核酸分子(例如，质粒、寡核苷酸等)，其在与一个或多个靶标序列相同的容器中共-扩增和/或共-检测。IC可以在反应混合物中混合以监测扩增和/或检测的性能，避免错误结果，和/或校正反应。IC可以用针对靶标的引物或用IC-特异性引物扩增。IC通常用IC-特异性探针检测。
如本文所用，术语“可扩增的内部对照”是指非-靶标核酸分子(例如，质粒、寡核苷酸等)，其可通过PCR或其它扩增方法(例如，等温扩增(例如，滚环)来扩增。通常，提供用于这样的对照的扩增引物和检测探针。
如本文所用，术语“非-可扩增的内部对照”是指非-靶标核酸分子(例如，质粒、寡核苷酸等)，提供其检测探针而非扩增引物。
如本文所用，术语“解链温度”或“Tm”是指杂交的核酸分子群体的一半解离成单链的温度。用于计算核酸的Tm的方程式是本领域众所周知的。例如，探针或引物与其靶标的“浓度调节的解链温度”可以使用例如Nearest Neighbor方法计算(参见SantaLucia(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1460-1465; Allawi, H. T.和SantaLucia(1997) Biochem. 36:10581-10594；通过引用以其整体结合到本文中)。在PCR缓冲液中更准确的寡核苷酸Tm估计可使用软件程序(例如Visual OMP，版本7.5.0.0，DNA SoftwareInc., Ann Arbor, MI)或在线程序(例如The DINAMelt Web Server) (其使用计算镁浓度对Tm的影响的Nearest Neighbor公式的改进)进行。优选地，Tm凭经验测量(美国专利公开号2004/0053254；通过引用以其整体结合到本文中)。
如本文所用，术语“重叠”应用于温度范围，此时通过在各自的温度范围内杂交的发信号探针产生的信号产生可检测的累加信号。
如本文所用，术语“靶标序列”或“靶标核酸序列”是指通过本文所述的方法待分析的核酸区域(例如，扩增子)。术语“杂交序列”是指靶标序列的一部分，其与探针(“探针杂交序列”)或引物(“引物杂交序列”)充分互补以允许在测定条件下探针或引物的杂交。杂交序列可包括未与引物或探针中相应的核苷酸互补的核苷酸，只要杂交能够在测定条件下发生。单一靶标序列可包含多个杂交序列，例如邻近对齐以涵盖靶标序列的每个核苷酸(尽管在一些实施方案中靶标序列可包含杂交序列之间的空位)。单一扩增子或其它核酸可包含单一靶标序列或可包含多个非邻近的靶标序列。
如本文所用，术语“荧光部分”是指可连接至寡核苷酸的化合物或其它部分，和其被电磁辐射激发和在响应时以足以在测定法中被检测的量发射电磁辐射。技术人员将理解，荧光部分在多个范围的波长下吸收和发射，被称为“吸收光谱”和“发射光谱”。荧光部分将显示比其峰吸收波长更长的波长的峰发射波长。术语“峰”是指在吸收或发射光谱中的最高点。
如本文所用，术语“猝灭剂”或“猝灭剂部分”是指从受激供体化合物或部分吸收能量的化合物或部分。例如，猝灭剂部分可通过吸收供体荧光团发射的荧光光子起作用，从而掩蔽供体的荧光。
如本文所用，术语“发信号探针”是指用荧光部分标记和与靶标核酸上的杂交序列具有足够的互补性，以便以在约30℃和约80℃之间的单独的解链温度杂交至杂交序列的寡核苷酸探针。在本文所述的实施方案中，荧光部分通常与发信号探针的5’或3’末端连接。除了荧光部分之外，发信号探针可还包含第二荧光部分或猝灭剂部分(例如，在第一荧光部分的相对末端)。
如本文所用，术语“猝灭探针”和“猝灭剂探针”是指用猝灭剂部分标记和与靶标核酸上的杂交序列具有足够互补性，以便以在约30℃和约80℃之间的单独的解链温度杂交至杂交序列的寡核苷酸探针。除了猝灭剂部分之外，猝灭剂探针可还包含第二荧光部分或猝灭剂部分(例如，在第一荧光部分的相对末端)。
如本文所用，术语“探针组”或“探针对”是指的一对标记的核酸寡核苷酸，其与靶标核酸上邻近的杂交序列具有足够的互补性，以便以在约30℃和约80℃之间的单独的解链温度杂交至杂交序列。探针对包含发信号探针和猝灭探针；尽管探针对中的一个或两个探针可以是共享探针(下文)。通常，当探针对的发信号探针杂交至其杂交序列和猝灭探针未杂交至其杂交序列时，探针对的发信号探针发射高于背景的荧光。当探针对的两个探针结合至它们的杂交序列时，猝灭探针的猝灭剂猝灭来自发信号探针的荧光团的荧光。
如本文所用，术语“共享探针”是指为两个邻近探针对的一部分的探针。当杂交至其杂交序列时，探针的5’末端上的标签(例如，荧光部分或猝灭剂部分)与第一探针对的探针的标签相互作用和探针的3’末端上的标签(例如，荧光部分或猝灭剂部分)与第二探针对的探针的标签相互作用。共享探针通常包含两个猝灭剂部分(其与邻近的发信号探针的荧光团相互作用)，或荧光部分(其与邻近的猝灭剂探针的猝灭剂部分相互作用)和猝灭剂部分(其与邻近的发信号探针的荧光部分相互作用)。共享探针被认为是两个探针对的一部分。共享探针可以是第一探针对的发信号探针和第二探针对的猝灭探针，或两个不同的探针对的猝灭探针。
如本文所用，“有色组”是指三个或更多个探针对，其具有相同的靶标核酸或靶标核酸组内的杂交序列，有色组的探针对的各自的发信号探针用相同的荧光部分和/或猝灭剂部分标记。
如本文所用，术语“杂交探针组”是指两个或更多个不同的有色组(例如，各有色组具有不同的荧光部分)，其中的探针组的杂交序列在相同的靶标核酸或靶标核酸组内。
本文涉及核酸序列和/或探针结合位点所使用的术语“连续的”和“邻近的”是指两个或更多个序列或核酸区段，在它们之间没有间插核苷酸(例如，空位) (即第一杂交序列的3’核苷酸通过磷酸二酯键与第二杂交序列的5’核苷酸连接)。例如，如果“序列X”和“序列Y”是连续的，则没有核苷酸分开这些序列。同样，如果“探针1”和“探针2”的杂交序列是连续的，则没有核苷酸间插入这些杂交序列。
本文涉及核酸序列和/或探针结合位点所使用的术语“间插”和其其它形式(例如，“间插有”)是指一个序列或核酸区段位于两个其它核酸区段之间。例如，如果“序列A”和“序列C”间插有“序列B”，则序列B在序列A和C之间。间插序列可以，但不必然与其两边的序列是连续的。
详述
本文提供了用于在单管、多-探针测定法中分析核酸靶标序列的试剂和试剂盒以及其使用方法。在具体的实施方案中，提供多路测定法，例如用于检测复杂结核分枝杆菌靶标序列(例如，katG, rpoB, inhA启动子, pncA等)。一个或多个靶标序列可使用用单一类型的荧光团(例如，单色)标记的多个探针或在多色测定法中进行分析。本文所述的探针描述(例如，长度、标签、解链温度等)、测定方案、对照和其它试剂、方法等适用于单-靶标和多-靶标，单色和多色，多路和单路，和/或设计I和设计II测定法。
在某些实施方案中，本文提供了用于在单管、单色测定法中检测多个靶标序列的试剂和试剂盒以及其使用方法。在具体的实施方案中，提供多路测定法用于检测复杂结核分枝杆菌靶标序列(例如，katG,rpoB,inhA启动子, pncA等)。例如，提供单管、单色、四路测定法用于检测复杂结核分枝杆菌靶标序列(例如，katG,rpoB,inhA启动子等)，例如连同第一(可扩增)内部对照靶标序列一起。该四路的四个单链产物使用用单色荧光团标记的探针组检测。这些反应组分还可包括第二(非-可扩增)对照，也用相同颜色标记(或者用不同颜色标记)。本文还提供了与其它检测和表征测定法(例如，用另外颜色检测分枝杆菌pncA基因)一起的这样的试剂和方法的用途。在一些实施方案中，本文提供了用于检测和/或表征例如分枝杆菌pncA基因的多路(例如，多颜色)测定法。
在一些实施方案中，本文提供了用于在单管、多色测定法中检测一个或多个靶标序列的试剂和试剂盒以及其使用方法。在具体的实施方案中提供单路和多路测定法用于检测复杂结核分枝杆菌靶标序列(例如，pncA等)或其它靶标序列(例如，需要多个探针组的长序列)。例如，提供单管、多色、单路测定法用于检测复杂结核分枝杆菌靶标序列pncA。单链靶标扩增子使用用多个荧光团标记的探针组检测(例如，分组(设计I)，或混合(设计II)探针组)。
在一些实施方案中，本文提供了在单反应容器中检测/鉴定/表征多个核酸靶标序列的测定法。在一些实施方案中，提供探针组和引物对用于在单容器中和使用单色荧光团扩增和检测3或更多个、4或更多个、5或更多个、6或更多个、7或更多个、8或更多个、9或更多个、10或更多个(例如，10、11、12、13、14、15或更多个)靶标。在一些实施方案中，靶标序列在样品中存在多个可能的靶标序列下鉴定(例如，非-靶标序列、近-靶标序列(例如，与靶标>90%同一性、与靶标>95%同一性、与靶标>98%同一性、与靶标>99%同一性)等)。在一些实施方案中，方法和试剂允许区别各种靶标变体，其中变体靶标序列包含侧连保守或至少相对保守序列的可变序列。在具体的实施方案中，单链形式的靶标序列和/或靶标序列变体通过产生单链扩增子的扩增方法产生，例如不对称聚合酶链反应(PCR)方法，例如Linear-Expo-Linear (LEL) -PCR或最优选Linear-After-the Exponential (LATE) -PCR。在一些实施方案中，仅几对引物、通常不超过三对、优选不超过两对和更优选仅一对引物用于任何一个靶标(例如，即使大量靶标变体可能存在)。靶标-特异性引物(例如，过量和有限)与侧连目标区(例如，物种、亚物种和/或抗性鉴定区)的序列杂交。在一些实施方案中，提供与扩增区杂交的探针对(例如，发信号探针和猝灭剂探针)。在具体的实施方案中，通过发信号探针和猝灭剂探针与靶标的温度-依赖性杂交产生的信号(例如，在一定的温度范围内)鉴定样品中存在的靶标序列和/或区别不同形式的靶标序列(例如，抗性突变)。在典型的实施方案中，提供引物对和探针组(例如，在单一试剂盒或反应体积中)，其各自对不同的靶标序列有特异性。这样的实施方案允许温度-依赖性检测和/或表征在单一样品内、在单容器和/或反应中的多个靶标。在一些实施方案中，反应或试剂盒中的所有探针组包含相同的可检测标签(例如，荧光团)，和本文所述的方法允许在单一容器和/或反应中单色检测/表征多个靶标。
在一些实施方案中，本文所述的单色测定法与其它测定法(例如，使用其它检测方法或使用一个或两个另外的颜色荧光团)组合用于检测TB和/或另外的病原体。在一些实施方案中，多个不同的单色(多-靶标)测定法组合在单一容器中(参见例如，图17和18)。在一些实施方案中，提供多色测定法(例如，设计I和设计II测定法)。
在具体的实施方案中，本发明提供用于检测、区分和/或表征复杂结核分枝杆菌的试剂和方法，包括但不限于结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、Mycobacterium caprae、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、Mycobacterium mungi、Mycobacterium orygis、Mycobacterium pinnipedii和 Mycobacterium canettii中的一个或多个。本文所述的方法和试剂允许鉴定所述物种、菌株和/或亚种，表征耐药性/易感性，和/或确定国家/区域或来源。在具体的实施方案中，提供引物和探针用于扩增、检测和表征katG、rpoB、inhA启动子、pncA、mabA、embB、rpsL、rss、gyrA、gyrB、eis、tlyA和/或16s rDNA基因的部分。在具体的实施方案中，提供引物和探针用于扩增、检测和表征katG、rpoB、inhA启动子和/或pncA基因的部分(例如，由本文的引物限定的部分)。在一些实施方案中，鉴定这些基因的变体，其赋予各种耐药性(例如，异烟肼抗性(katG/inhA启动子)、利福平抗性(rpoB)、乙硫异烟胺抗性(inhA启动子)、吡嗪酰胺抗性(pncA)等)。在一些实施方案中，提供引物和探针，其能够区分靶标的所有等位基因变体(例如，所有已知的变体、已知和未知的变体) (例如，rpoB密码子516、526、531和533的所有变体)。
在一些实施方案中，探针对(例如发信号探针和猝灭剂探针)经配置以杂交至靶标序列(例如，位于保守引物结合序列之间的可变序列)和区分多个靶标序列(例如在单样品或混合物中) (参见例如，图14)。在一些实施方案中，发信号探针和猝灭剂探针以不同的Tm杂交至靶标序列的附近或邻近部分。当其杂交至靶标时来自发信号探针的信号增加，然后当猝灭探针杂交至其邻近的靶标时信号被猝灭。或者，当其杂交至邻近已经结合的猝灭剂探针的靶标时来自背景水平的发信号探针的信号减少。在一些实施方案中，多个探针组经设计具有不同的杂交温度范围(参见例如，图1)，使得与多个靶标的杂交可在单管中以单色进行区分。在一些实施方案中，探针组的一个或两个探针(例如发信号探针和/或猝灭剂探针)包含与不同的靶标序列的可变区的不同的互补程度。在一些实施方案中，发信号探针和/或猝灭剂探针经配置以杂交至多个靶标序列的可变序列(例如重叠实际的序列差异)(例如与不同的靶标序列具有不同的Tm)。在一些实施方案中，发信号探针经配置以杂交至多个靶标序列的可变序列(例如，与不同的靶标序列具有不同的Tm)。在一些实施方案中，猝灭剂探针经配置以杂交至多个靶标序列的可变序列(例如，与不同的靶标序列具有不同的Tm)。
在某些实施方案中，本文提供了用于在单管、多色测定法中(例如，二色、三色、四色或更多)检测一个或多个靶标序列的试剂和试剂盒以及其使用方法。在一些实施方案中，由于一个或多个靶标的长度和/或用仅通过解链温度区分的探针组跨越靶标的困难性(例如，在单色测定法中)而使用多个颜色。为了克服解析涵盖一个或多个靶标所需要的探针组的数量的问题，使用两个或更多个探针组，各组具有不同标记的发信号探针(例如，各探针组由其本身的“颜色”定义)，和具有跨越可得的解链温度距离的探针。在相同的测定法中在PCR仪器中以合适的加热和冷却能力，通过使用两个、三个或更多个颜色，相同的温度距离(例如，靶标的探针解链温度在约10℃和约80℃之间)可2、3或更多次使用。在具体的实施方案中，提供测定法(例如，多路、单路等)用于检测复杂结核分枝杆菌靶标序列(例如，pncA等)。
在一些实施方案中，第一颜色的探针组被指定至一个靶标或靶标的一个部分(例如，靶标的第一连续部分)，第二颜色的探针组被指定至第二靶标或靶标的第二部分等(例如，对于探针组的第三颜色、探针组的第四颜色等)。在这样的实施方案中，第一颜色的荧光谱与第一靶标或靶标的一部分的序列相关；第一光谱的变化可被指定至所述序列的变化。同样，第二颜色的荧光谱与第二靶标或靶标的一部分的序列相关，和第二光谱的变化可被指定至所述序列的变化；对于第三颜色、第四颜色等以此类推。在一些实施方案中，除了通过颜色将探针组分组之外，以解链温度的递减或递增次序沿靶标或靶标的一部分安排各组。因此，当颜色的荧光谱从低向高移动时，其对应于通过相应的靶标序列或靶标序列的一部分从一端至另一端(例如，5’至3’或3’至5’)移动。在一些实施方案中，根据“设计I”设计方法(见下文)，设计根据标签颜色基于靶标序列分组和/或根据解链温度的幅度在颜色组内比对的探针和探针组。
在一些实施方案中，由具有第一颜色、第二颜色、第三颜色等的发信号探针加各发信号探针的猝灭探针构成的探针对，贯穿一个或多个靶标而成对结合(例如，颜色是分散的)。在这样的实施方案中，第一颜色的荧光谱与贯穿所述一个或多个靶标的各种位置的序列变化相关。同样，第二颜色的荧光谱与贯穿所述一个或多个靶标的各种位置的序列变化相关，对于另外的颜色以此类推。但是颜色内的具体探针靶标序列不沿靶标序列分组。然而，探针靶标序列按照颜色内的递增或递减的探针/靶标解链温度排列。因此，当颜色内的探针对的解链温度从低至高移动时，发现相应的具体靶标序列沿靶标序列或序列在不连续位置上。在一些实施方案中，荧光谱变化与序列变化的关联需要与一个或多个关键或对照光谱比较(例如，因为光谱的颜色和/或沿光谱的温度与靶标的特定区域不相关)。在一些实施方案中，根据“设计II”设计方法(见下文)，设计未根据标签颜色基于靶标序列分组和/或未根据解链温度的幅度在颜色组内比对的探针和探针对。
在一些实施方案中，本文提供的探测和分析方法适用于包含单链核酸靶标的样品。本发明的方法包括分析单序列，分析相同链中的两个或更多个序列，分析不同链中的序列，和前述的组合。单链核酸靶标序列可以是添加至样品的对照序列。核酸靶标序列可以是DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。其可来自任何来源。例如，其可天然存在，或靶标序列可以双链形式存在，在该情况下单链靶标序列通过链分离和纯化，或单链扩增方法(例如，LEL-PCR或LATE-PCR)获得。如果单链核酸靶标序列是cDNA序列，其通过反转录自RNA源获得。
在许多情况下，天然来源将不包含足够拷贝数的靶标序列用于探测和分析。在这样的情况下，单链靶标序列通过扩增(通常包括指数扩增的扩增方法)获得。可用的扩增方法包括等温扩增方法和热循环扩增方法。扩增反应可直接产生单链核酸靶标序列，或其可产生双链形式的靶标序列，在该事件中单链靶标序列通过链分离和纯化获得，如上文所述。可采用的可用的扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)，包括对称PCR、不对称PCR、LEL-PCR和LATE-PCR，其任何一种可与反转录组合用于扩增RNA序列；NASBA、SDA、TMA和滚环扩增。如果单链核酸靶标序列是cDNA序列，扩增方法将包括反转录，例如RT-PCR。在一些实施方案中，当使用不对称扩增时，在扩增之前的扩增反应混合物中包括探针组以避免污染。
可用于本文提供的方法的探针组包括发信号探针和相关的猝灭剂探针。发信号探针是当杂交至样品中的单链核酸靶标序列时发射可检测信号、优选荧光信号的杂交探针，其中信号可通过相关的猝灭剂探针的附近(例如，邻近)杂交被猝灭。猝灭剂探针不发射可见光能量。通常，发信号探针具有共价结合的荧光部分。发信号探针包括用荧光团或其它荧光部分标记的探针。在一些实施方案中，优选的发信号探针是双重-标记的探针；即是说，当在溶液中和未结合至靶标时即使受到刺激也发射很少或无信号的探针，但是，当它们杂交至单链核酸序列时(例如，在不存在邻近结合的猝灭剂时)，发射信号。例如，当探针在溶液中时，其假定呈某一构象(例如，随机卷曲等)，其中猝灭剂随机与荧光团相互作用，和探针发射低水平的荧光(例如，完全黑(例如，>90%被猝灭、>95%被猝灭、>98%被猝灭、>99%被猝灭或更多)或部分变黑(例如，<80%信号、<70%信号、<60%信号、<50%信号、<40%信号、<30%信号、<20%信号、<10%信号或更少))。然而，当探针杂交至其靶标时，其被迫成为其中荧光团与猝灭剂物理上分离和探针发出信号的构象(例如，开放构象、稳定构象等)。
在猝灭的发信号探针(例如，自-猝灭探针)中，猝灭可通过任何机制实现，通常通过在荧光团和非荧光猝灭部分之间的FRET (荧光共振能量转移)或通过接触猝灭实现。在一些实施方案中，优选的发信号探针在溶液中(例如，未杂交)是黑色或极接近黑色的，以使背景荧光最小化。在其它实施方案中，猝灭部分当在溶液中时仅部分地猝灭荧光团(例如，<95%, <90%, <80%, <70%, <60%, <50%, <40%, <30%, >10%, >20%, >30%, >40%, >50%,>60%, >70%, >80%等)。在一些实施方案中，猝灭通过接触猝灭或FRET猝灭实现。在一些实施方案中，猝灭部分和发信号部分之间的距离通过在探针内包括非结合区(例如，未与靶标互补的探针的一部分，例如多聚A线)而被延长。通过延长猝灭部分和发信号部分之间的序列，另外的序列减少溶液中猝灭的信号的量。
探针组的猝灭剂探针是或包括包含非荧光猝灭剂的核酸链。猝灭剂可以是例如非荧光发色团，例如dabcyl或黑洞猝灭剂(Black Hole猝灭剂，可获自BiosearchTechnologies，为一种猝灭剂套装，其中的一种或另一种由制造商推荐与特定的荧光团一起使用)。在一些实施方案中，优选的猝灭探针包括非荧光发色团。在一些实施方案中，猝灭剂是黑洞猝灭剂(例如，BHQ2)。探针组的猝灭剂探针杂交至邻近或靠近发信号探针的单链核酸靶标序列，使得当两者杂交时，猝灭剂探针猝灭或赋予发信号探针黑色(例如，>80%被猝灭、>85%被猝灭、>90%被猝灭、>95%被猝灭、>98%被猝灭、>99%被猝灭)。猝灭可通过荧光共振能量转移(FRET或FET)或通过接触(例如，“碰撞猝灭”或“接触猝灭”)进行。
在一些实施方案中，提供各种对照(例如，对照探针、对照引物、对照质粒等)。在一些实施方案中，提供内部对照(例如，与靶标在单一容器中共-扩增和/或共-检测)。在一些实施方案中，内部对照是样品核酸(例如，结核分枝杆菌基因组，靶标基因的非-靶标部分等)内的非-靶标序列(例如，高度保守的序列)，其用对照-特异性引物扩增，和用对照-特异性探针检测。在一些实施方案中，内部对照是核酸分子(例如，寡核苷酸、质粒等)，其作为试剂与引物和探针一起提供用于它们的扩增和检测。在一些实施方案中，内部对照是样品核酸(例如，结核分枝杆菌基因组、靶标基因的非-靶标部分等)内的非-靶标序列(例如，高度保守序列)，其不扩增(例如，未提供合适的引物)，但用对照-特异性探针检测。在一些实施方案中，内部对照是核酸分子(例如，寡核苷酸、质粒等)，其不扩增(例如，未提供合适的引物)，但用对照-特异性探针检测(例如，已知浓度)。在一些实施方案中，对照探针包含与靶标探针相同的荧光团。在其它实施方案中，对照探针包含与靶标探针不同的荧光团。
在一些实施方案中，对照包含一对寡核苷酸，其中的一个或两个的末端用荧光团和/或猝灭剂标记(参见例如，美国临时专利申请号61/755,872；通过引用以其整体结合到本文中)。在这样的实施方案中，在寡核苷酸解链分开时，来自对照寡核苷酸的荧光信号改变(例如，被猝灭或未被猝灭)。当Tm是准确已知的时来自这样的对照的信号是有用的，并且例如如果存在由于仪器使用或样品变化(例如，随样品引入高盐浓度)导致的变化，使解链曲线标准化。在一些实施方案中，在PCR期间双链试剂也与聚合酶相互作用和改进扩增特异性。
在一些实施方案中，提供具有不同的探针杂交温度的对照(例如，高温度对照和低温度对照)。在某些实施方案中，探针杂交温度比任何靶标杂交温度更极端。在某些实施方案中，两个对照可以相同的颜色或不同的颜色发信号。这样的对照允许校准温度标度和在温度跨度内的任何荧光信号。对照序列可以是单链寡核苷酸、双链寡核苷酸对、质粒等。
在一些实施方案中，与靶标探针相比，对照探针浓度是相对低的(例如，对于ON探针为50 nM，对于OFF探针为150 nM)。在这样的实施方案中，低对照-探针浓度在靶标-检测温度范围内减少来自对照试剂的背景荧光。在其它实施方案中，对照探针浓度等于或高于靶标浓度。在这样的实施方案中，对照峰的强度提供各样品中靶标序列回收和扩增的总体效率的度量。在一些实施方案中，对照峰的强度和对照谷的深度两者用作常数，用于与靶标峰的强度和其余信号的谷比较(例如，提供定量测量未知信号的量的方式)。在一些实施方案中，对照探针的浓度超过最终扩增子浓度(例如高于500 nM)，以定量测量扩增子，例如测试在样品制备和随后扩增期间靶标分子回收的效率。在一些实施方案中，对照探针为有限浓度(例如50 nM或100 nM)以在所有样品中提供一致的信号，不管在样品制备和随后扩增期间靶标回收的效率的变化如何。
在一些实施方案中，对照是低温度杂交对照。在一些实施方案中，合成核酸(例如，对照质粒、对照寡聚物等)经设计以允许检测在低温度下(<35℃, <30℃, <25℃, <20℃,<15℃, >5℃, >10℃, >15℃, >20℃，其中的范围)探针杂交(例如发信号和猝灭)。在一些实施方案中，对照的低温度杂交范围允许测量(例如，定量地测量)对照而不干扰在较高温度下发生的靶标检测。对照的低Tm在预定的低温度下提供信号。在某些实施方案中，不能假定热循环仪的每一个位置准确地同样工作，也不能假定高温度下的校准对于低温度也是准确的。因此，在一些实施方案中，低-Tm对照连同高Tm对照一起允许在各反应中双重温度校准。在缺少基因组靶标的情况下双重温度校准也可在样品分析之前或之后进行。这可用于机器的常规养护和得到的数据甚至可以远程分析(即世界上通过“云”连接的任何地方)。校准反映了装置的热循环仪和光学系统两者的功能。在不同的波长发射的荧光团可受实验和装备变化的不同影响，使得多个对照有用。此外，可能存在于样品或仪器中的某些杂质差异地吸收不同波长的光。因此，如果低-Tm和高-Tm内部对照经设计在不同的波长下发荧光，则可分析它们的信号强度(以及它们的实际温度)的比率。如果光学系统是脏的，则来自对杂质敏感的荧光团的信号将受到与对杂质不敏感(较低敏感性)的荧光团相比更多的影响，和比值将改变。
在一些实施方案中，本文所述的试剂和方法可用于校准仪器(例如，热循环仪、读板器、荧光计、高通量自动化平台等)，校准反应条件，或作为对照用于本文未描述的其它测定法。在一些实施方案中，提供校准或对照试剂盒，例如包含对照序列(例如，质粒、寡核苷酸等)、引物、探针和任何其它有用的试剂(例如，酶、缓冲液等)。在具体的实施方案中，提供高Tm对照(例如，探针与对照序列的杂交的Tm大于60℃ (例如，>65℃, >70℃, >75℃)的对照)和低Tm对照(例如，探针与对照序列杂交的Tm低于40℃ (例如，<35℃, <30℃, <25℃,<20℃, <15℃)的对照)。在一些实施方案中，一个或两个内部对照是不可扩增的(例如，提供探针而没有引物)。在一些实施方案中，一个或两个内部对照是可扩增的(例如，提供探针和引物)。在一些实施方案中，提供一个或多个另外的中间Tm对照(例如，可扩增或不可扩增的)。本发明范围内的校准试剂盒和方法不限于本文描述的对照的组合。本文描述的对照(例如，高Tm、低Tm、可扩增的、不可扩增的等)的任何合适的组合(例如，2个内部对照、3个内部对照、4个内部对照或更多)。在一些实施方案中，这样的对照的扩增和检测允许用户(包括远距离的用户)监测和校准仪器和/或随时间进行质量控制。
盐浓度的变化(例如，由于自样品制备而移转导致)以及试剂或仪器的其它变化可改变杂交探针的经验Tm，但可差异地影响探针。例如，与短的富含AT或部分互补的探针相比，长的富含GC或完全互补的探针可显示较大或较小的Tm变化。因此，具有用于检测的较高和较低范围二者的温度距离的对照是有用的。相对于标准条件，对照的荧光最大值(或最小值)的相对变化可测量和表示为温度的因数。然后，调整至中间温度的荧光可使用随温度改变的标准化因数进行，如对于本领域技术人员而言显而易见的。
质量低-Tm探针的设计(此处考虑具有不高于40℃的经验Tm和不高于30℃的优选形式)包括通常对于高-Tm探针不需要(或至少不考虑)的标准。探针所杂交的单链靶标应具有受限的二级结构(例如，在检测温度下形成发夹结构)。在温度降低时，发夹结构形成的可能性增加。如果具有高于探针/靶标杂交体几度的Tm的发夹结构存在，该核苷酸区域具有降低的探针杂交利用率，则将减慢杂交速度和探针信号可受限。在本发明的一些实施方案中，靶标区选自经预测不包含Tm高于探针/靶标杂交体的发夹结构的内源序列。在一些优选的实施方案中，预测的发夹结构Tm在预测的杂交体Tm之下不超过5度。这样的预测可使用软件程序例如Visual OMP，版本7.5.0.0 (DNA Software, Ann Arbor, Michigan, USA)进行。在扩增期间通过使用与靶标错配的引物，序列可改变至有限的程度，如本领域有经验的技术人员众所周知的。特定发夹结构形成的一些可能性可使用这样的错配引物降低，以产生修饰的序列。
在合成的靶标，例如用于对照的那些，包括内部扩增对照的情况下，序列可自天然存在的序列经特别设计或改变以高于给定温度下减少或消除在探针-靶向区域中发夹结构形成。图15表明随机产生的序列的一部分和其随后修饰的具有减少的二级结构的序列。原始序列中在发夹结构的杂交体部分中存在的一些核苷酸被修饰(通常修饰成A或T)或从序列中删除。Visual OMP软件再次用于预测发夹结构形成和在这些发夹结构中的核苷酸被取代或删除。该过程重复进行直至探针靶向区域中的发夹结构的Tm不高于探针/靶标杂交体的Tm。随后进行另外的变化以实现以下优选实施方案：预测的涉及探针-靶向的核苷酸的发夹结构的Tm在预测的杂交体Tm之下不超过5度。
在一些实施方案中，合成的靶标的低-Tm-探针-靶向区域和邻近区域由80%、90%或100%的2个非-互补的核苷酸(例如A和G)组成，以限制或防止Tm高于特定Tm的发夹结构。在优选的实施方案中，探针-靶向的核苷酸的任一侧上至少20、或至少30、或至少40或至少50个核苷酸全部由2个非-互补的核苷酸组成，和探针-靶向的核苷酸由至少80%的这些相同的核苷酸组成。
上述的探针-靶向区域可以是单一探针的靶标，或一对探针例如发信号探针和猝灭探针的靶标。一对探针之一的有效杂交可限制在该区域中发夹结构形成。因此，在一些实施方案中，靶标经选择或设计使得预测的发夹结构Tm不高于两个探针/靶标杂交体的最高Tm，优选在两个探针/靶标杂交体的最高Tm之下不超过5度。
在一些实施方案中，在并置的杂交探针对的荧光探针和猝灭剂探针之间的相互作用可使两个探针与靶标核苷酸稳定，和增加各自的Tm，特别是具有较低预测的Tm的那一个。在这样的情况下，涉及靶向的核苷酸的任何发夹结构的预测的Tm应该不高于至少一个探针/靶标杂交体的经验Tm，优选两个探针/靶标杂交体的Tm，和最优选在两个探针/靶标杂交体的经验Tm之下至少5度。
以下专利和出版物描述了可用于本文所述的各种实施方案的试剂和方法：美国专利号8,367,325；美国专利号7,972,786；美国专利号7,915,014; 美国专利号7,632,642;美国专利号7,517,977; 美国专利号7,465,562; 美国专利号7,198,897; 美国公开号2013/0210656; 美国公开号2013/0203626; 美国公开号2013/0095479; 美国公开号2012/0282611; 美国公开号2012/0208191; 美国公开号2012/0202203; 美国公开号2012/0198576; 美国公开号2012/0088275; 美国公开号2012/0040352; 美国公开号2011/0311971; 美国公开号2009/0226973; 美国公开号2009/0111170; 美国公开号2009/0081648; 美国公开号2008/0280292; 美国公开号2008/0193934; 美国公开号2006/0275773; 美国公开号2006/0177842; 美国公开号2006/0177841;和美国公开号2004/0053254; 通过引用以其整体结合到本文中。
本文描述的利用单一类型或颜色的荧光团的实施方案可利用本文列举的荧光团，或者可利用相关领域技术人员已知的其它荧光团。如本文所用，“荧光团”、“荧光染料”、“荧光标签”、“荧光剂”等同义使用。可用于本发明的实施方案的合适的荧光团包括但不限于：荧光镧系络合物(包括铕和铽的络合物)、荧光素、若丹明、四甲基若丹明、伊红、藻红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀绿、均二苯乙烯、萤光黄、瀑布蓝、德克萨斯红和描述于RichardP. Haugland的分子探针手册(Molecular Probes Handbook)的第6版的其它荧光团，在此通过引用以其整体明确结合到本文中用于所有目的和特别是对于其关于按照本发明使用的标签的教导。用于本发明的某些实施方案的市售可得的荧光染料包括但不限于：Cy3、Cy5(Amersham Biosciences, Piscataway, N.J., USA)、荧光素、四甲基若丹明、德克萨斯红、瀑布蓝、BODIPY FL-14、BODIPY R、BODIPY TR-14、若丹明绿、俄勒冈绿488、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR. 532、ALEXA FLUOR 568、ALEXAFLUOR 594、ALEXA FLUOR 546 (Molecular Probes, Inc. Eugene, Oreg., USA)、Quasar570、Quasar 670、Cal Red 610 (BioSearch Technologies, Novato, Ca)、ALEXA FLUOR350、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXAFLUOR 647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、CASCADE BLUE、CASCADE YELLOW、Dansyl、丽丝胺若丹明B、MARINA BLUE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿514、PACIFIC BLUE、若丹明6G、若丹明绿、若丹明红、四甲基若丹明、德克萨斯红(可获自Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg., USA)和Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7 (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J. USA和其它)。
尽管本文描述的许多实施方案可用于单色和/或单管测定法，但组合这样的测定法或其实施方案与其它荧光团(例如，用于检测其它靶标)或在其它反应容器中进行的其它测定法(例如，结核分枝杆菌的质谱检测)在本发明的范围内。
在一些实施方案中，提供通过多色、单管测定法(设计I或涉及II测定法)用于核酸分析的试剂和方法。
用于分析pncA基因的示例性的多色、单管测定法(设计I测定法)描述于例如图1-2和19-20。这样的测定法在本文中称为设计I测定法。pncA基因靶标是561个碱基对长度，对于探针的分布，其被分为大约相同长度的基因序列的两个部分。为了得到各物种自己的荧光信号，正确鉴定差别单一碱基对的牛分枝杆菌与结核分枝杆菌序列是探针设计的第一步骤。该对On/Off探针组设计包含与牛分枝杆菌序列互补和与结核分枝杆菌序列单一错配的高Tm On探针(75℃)。Off探针与两个序列互补。该设计确保牛分枝杆菌将在较高的温度下产生荧光信号和两个序列将通过在相同的温度下结合Off探针被关闭。由此产生不同的信号，其将明确鉴定牛分枝杆菌与结核分枝杆菌(图24)。用经设计以区分牛分枝杆菌的该对探针，结合基因本身内的实际位置来设计随后的探针对。配对探针设计的基本组成是对于On探针的25个碱基对的长度和对于Off探针的17个碱基对的长度。根据以下对探针进行随后的修饰：(1) 可能的二级结构形成，其将减少探针结合靶标的能力；和(2) 结合自身的相同的探针的分子间交叉杂交。这些类型的相互作用使用Visual OMP软件版本7.5.1.0(DNA Software Inc., Ann Arbor, Michigan USA)预测和探针通过改变探针的序列进行修饰，以减少或消除这些相互作用。用胞嘧啶(C)核苷酸来取代胸腺嘧啶(T)将导致在探针和其互补的靶标之间的碱基配对的最小阻断；因此，当面对可能的二级结构形成或分子间交叉杂交时，该取代是第一选择。图25表明二色方案的最终设计(设计I)。第一个两对On/Off探针显示Off探针Tm高于配对的On探针。尽管在大多数On/Off配对中Off探针以温度依赖性方式使On探针关闭，但并非所有配对以该方式设计。例如，在Quasar 670区域中，存在一对彼此邻接的On探针(Tm=58.7，Tm=61.1)，其中来自上游On探针的猝灭剂用于关闭另一个On探针的荧光。
在该情况下也用于分析pncA基因的另一个示例性的多色、单管测定法在本文中被称为设计II测定法。在这样的设计中，根据温度和/或颜色，探针未沿靶标序列连续排列。而是，在一些实施方案中，具体的序列根据它们的长度(核苷酸数)沿靶标序列进行选择，确定探针与这些具体序列的Tm，和然后将颜色指定至邻接的探针对，预期在颜色内以特定的次序将它们转化为On/Off探针对，这使各颜色的探针之间的Tm-间隔最大化。这样的设计的结果是邻接的探针对(On/Off对)可能不在任一颜色上(例如，不同的标签)也不在温度上(例如，不根据Tm幅度而序贯排列)彼此关联。探针设计II使用宽的温度间隔，其当探针和靶标均是单链DNA时，特别是在LATE-PCR反应、LEL-PCR或不对称PCR反应结束时提供。并非局限于探针与其互补的杂交序列对齐，On/Off探针对的排列基于它们各自的Tm。因此，On/Off对首先根据它们的序列进行设计和指定Tm值。然后，探针对根据它们的Tm值，而不是根据它们沿靶标序列的长度的位置被指定颜色，最后颜色内的探针的序列经调整以使它们的温度间隔在可用于探针靶标杂交的整个温度范围上最大化。结果是探针对在温度上变得连续，而不是必然沿靶标序列是连续的。
设计II方法开始于选择On (发信号)探针和Off (猝灭)探针的长度。在示例性的pncA设计II测定法中，用于On探针的20个碱基对杂交序列和用于Off探针的邻接的15个碱基对杂交序列在靶标序列上对齐。任选的第二步包括核苷酸取代，如上文对于设计I所描述的，以纠正任何可能的二级结构形成或分子间交叉杂交。按这些修饰产生的探针Tm显示在图26。在第三步中，探针对内的各发信号探针根据其Tm而不是位置被指定一个颜色，以使温度间隔最大化，而不管沿靶标序列的位置如何。图27表明根据温度的该重排的结果。在探针中进行Tm差异的另外精修，以使温度间隔的使用最大化。调整探针与其杂交序列的Tm的一个方法是在探针中引入C至G的改变，这导致在探针和靶标之间G与T的错配，因此减少探针的总体Tm。错配的任何引入将降低探针/靶标与其完美互补物杂交的Tm。为了增加在一些探针与互补的靶标(结核分枝杆菌H37Rv菌株)中的总体差异，引入错配至探针序列。得到的精修显示在图28。示例性的pncA基因(PZA抗性)测定法的各探针对描述于表2。
表2. 示例性的设计II, pncA探针
加下划线的核苷酸未与杂交序列互补。5’修饰QSR670是quasar 670，CO560是calorange 560和CR610是cal red 610。而3’修饰BHQ1和BHQ2是黑洞猝灭剂。
设计用于分析靶标序列的探针组的设计I和设计II方法不限于上述的pncA实例。具体而言，设计II方法因为至少以下原因而是有利的：(a) 其可应用于任何长度的靶标序列；(b) On探针和Off探针长度的指定是快速的，因为它们不必被调整以达到特定Tm；(c)在所需温度间隔上通过Tm排序探针对是快速的；(d) 颜色的指定是快速的；和(e) 通过引入特定类型的错配调整Tm在全探针组的情况下进行并被快速完成。
在一些实施方案中，设计II方法用于设计探针组，其用于单色、二色、三色、四色或其它多色测定法。在一些实施方案中，设计II方法用于设计探针组，其用于单靶标或多靶标测定法。
本文描述的测定法通常包括三个或更多个探针对(例如，各探针对包含On (发信号)探针和Off (猝灭)探针)。当使用设计II方法进行设计时，探针对的杂交序列的颜色和/或Tm的排列与它们沿靶标的线性次序无关。对于单色测定法，设计II方法可导致杂交序列的Tm沿靶标序列无递增或递减的线性次序。此外，因为具体的探针靶标序列最初沿靶标序列排列，而不管靶标序列的身份如何，因此得到的具体序列和探针具有不以任何特定次序排列(例如，递增或递减)的Tm，而是改为由它们沿靶标序列的具体碱基组成来规定。
实验
实施例1
设计具有减少的二级结构的合成的内部对照靶标，用LATE-PCR引物扩增，和使用发信号探针和猝灭探针检测
产生60% G和C核苷酸和40% A和T核苷酸的随机序列。
选择扩增对照靶标的82个核苷酸区段的LATE-PCR引物(图15，左)。为了确保具有极低Tm (20-40℃范围)的探针将有效杂交，在引物和引物互补序列之间的靶标部分经修饰以防止一些预测的发夹结构形成。在预测的发夹结构茎中的一些核苷酸，主要是C核苷酸，被缺失或改变。另外的G和A核苷酸以及一些T核苷酸被加入至该区域，使得第二探针的杂交成为可能，和进一步隔开探针–靶向的区段与引物区(图15，右)。为未来可能的引物和探针设计，高Tm发夹结构类似地从靶标的其它部分消除。修饰的内部对照靶标的序列为
具有400个碱基对修饰序列的合成的DNA被合成，插入至pIDTSMART-KAN质粒，克隆和通过Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, USA)纯化。将估算的100或1,000个拷贝的质粒加入至终体积25微升的包含终浓度50 nM有限引物(SEQ ID NO: 9)、1,000nM过量引物(SEQ ID NO: 10)、100 nM发信号探针(SEQ ID NO: 52)、300 nM猝灭探针(SEQID NO: 53)、0.3 mM dNTPs、3 mM镁、1X Platinum Taq PCR缓冲液和1.5单位Platinum TaqDNA聚合酶(Life Technologies)的反应混合物。Stratagene Mx3005P热循环仪用于进行以下程序：95oC 3分钟，然后95oC 10秒和75oC 40秒的50个循环，接着在25oC 10分钟，和以每30秒1oC步距从25o至95oC解链，在每步中检测Quasar 670荧光。
图16表明荧光值的负导数。在27oC的谷表示猝灭剂探针的近似Tm，因为它自扩增的靶标解链和允许杂交的发信号探针发射较高水平的荧光。在30oC的峰表示发信号探针与扩增的靶标的Tm。实线表示重复的样品，具有估算的初始1,000个靶标，和虚线表示重复的样品，具有估算的100个靶标。重叠的曲线表示扩增的靶标已经被发信号探针达到饱和水平(在所有情况下靶标是过量的)；对于对照信号一致性，这是理想的结果。
实施例2
在结核分枝杆菌菌株的三个不同基因中耐药性的多路检测
四路LATE PCR测定法用于在三个基因inhA启动子(启动子区)、katG和rpoB加上可扩增的第一内部对照和不可扩增的第二内部对照中检测耐药性。各靶标的位置(见表1)基于Genbank序列NC_000962.3。
表1. 靶标序列
rpoB靶标序列是191个碱基对长度和位于核苷酸761011至761201。用于该靶标的六个探针覆盖了靶标内在核苷酸761078至761178之间的101个碱基对。这覆盖了负责结核分枝杆菌中利福平抗性的称为RRDR的81个碱基对区。katG靶标序列是139个碱基对长度和位于核苷酸2155084至2155222。用于该靶标的两个探针覆盖了靶标内在核苷酸2155160至2155190之间的31个碱基对，其包括密码子309至317，特别是密码子315。inhA启动子靶标序列是139个碱基对长度和位于核苷酸1673371至1673509。用于该靶标的两个探针覆盖了靶标内在核苷酸1673419至1673449之间的31个碱基对。探针覆盖了启动子区的21个核苷酸，特别是突变位点-15和-8和inhA启动子基因的前三个密码子。
结果显示在图6-11。
对于inhA启动子区，所有菌株是药物敏感的，而包含在-15位置的单核苷酸变化(C/T)的菌株16和22和具有-8位置变化(T/C)的菌株21是耐药性的。对于katG基因，菌株1、5、11、14、21和22是药物敏感的，而所有其它菌株(S315T，位于氨基酸位置315的丝氨酸变为酪氨酸)是抗性的。对于rpoB基因，菌株1、19和22是药物敏感的，而包含各种突变的所有其它菌株是抗性的。
反应组分和条件如下：
对于inhA启动子基因(启动子区)
有限引物: 5’ TTCCGGTAACCAGGACTGAACGGGATACGAATGGGGGTTTGG (SEQ ID No.5)
过量引物: 5’ TCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATAC (SEQ ID No.6)
用于inhA启动子的探针
inhA启动子_ON
5’ BHQ2-AAAAAAAAAAAAAAAGGCAGTCATCCCGTT-QSR670 (SEQ ID No.19)
inhA启动子_OFF
5’ BHQ2-TTACAGCCTATCGCCTCGC-C3 Spacer(SEQ ID No.20)
对于katG基因
有限引物: 5’ AGCGCCCACTCGTAGCCGTACAGGATCTCGAGGAAAC (SEQ ID No.3)
过量引物: 5’ TCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCAC (SEQ ID No.4)
对于第一内部对照
内部对照有限引物
TTCGGCGCACAAAGTGTCTCTGGCTGTTGT (SEQ ID NO: 9)
内部对照过量引物
GGCACGATGCTCCCACATTGCGACTTC (SEQ ID NO: 10)
用于katG基因的探针
katG_ON
5’ QSR670-ACTCGCGTCCTTACCCAAAAAAAAAAAAAA-BHQ2 (SEQ ID No.17)
katG_OFF
5’ ATGTCGGTGGTGA-BHQ2 (SEQ ID No.18)
对于rpoB基因
有限引物: 5’ CTCCAGCCAGGCACGCTCACGTGACAGACCG (SEQ ID No.1)
过量引物: 5’ ACGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTT (SEQ ID No.2)
用于rpoB基因的探针
rpoB_探针1_OFF
BHQ2-CTGGTTGGTGCAGAAG-C3 Spacer (SEQ ID NO: 11)
rpoB_探针2_ON
BHQ2-TCAGGTCCATGAATTGGCTCAGA-QSR670 (SEQ ID NO: 12)
rpoB_探针3_OFF
BHQ2-CAGCGGGTTGTT-C3 Spacer (SEQ ID NO: 13)
rpoB_探针4_ON
BHQ2-ATGCGCTTGTGGATCAACCCCGAT-QSR670 (SEQ ID NO: 14)
rpoB_探针5_ON
QSR670-AAGCCCCAGCGCCGACAGTCGTT-BHQ2 (SEQ ID NO: 15)
rpoB_探针6_OFF
ACAGACCGCCGG-BHQ2 (SEQ ID NO: 16)
第一内部对照 ON
QSR670-ATTCTATTATTTATTTTCAT-BHQ2 (SEQ ID NO: 52)
内部对照OFF
ATCATTATTTACTA-BHQ2 (SEQ ID NO: 53)
第二内部对照
内部对照荧光链
QSR670-CAGCTGCACTGGGAAGGGTGCAGTCTGACC-C3 (SEQ ID NO: 54)
内部对照猝灭剂链
GGTCAGACTGCACCCTTCCCAGTGCAGCTG-BHQ2 (SEQ ID NO: 55)
Primesafe
Primesafe有义
Dabcyl-GGATCAGATTAGCACTGATGTA-Dabcyl (SEQ ID NO: 56)
Primesafe反义
Dabcyl-TACATCAGTGCTAATCTGATCC-Dabcyl (SEQ ID NO: 57)
LATE PCR扩增在由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl2、300 nMdNTP、各引物组的50 nM有限引物和1000 nM过量引物、2.0单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、所有探针的100 nM On探针和300 nM Off探针(除了第一内部对照探针组，其为50 nM On探针与150 nM Off探针)组成的25 µl体积中进行。各Primesafe II链以600 nM加入，而第二内部对照的荧光链为50 nM和猝灭剂链为150 nM。对于各测试的菌株，使用大约1000个基因组当量和扩增反应一式三份进行。
扩增反应的热概况如下：98℃/3min 1个循环，接着98℃/10s-75℃/40s 60个循环，接着在75oC 10 min。接着是在25oC开始以30s间隔1oC增量至98oC的解链。
在60个循环结束时，探针靶标杂交通过使用各荧光单独对25oC至95oC之间的温度的一阶导数的解链曲线分析进行分析。结果以下述方式提供在图6-11中：基因inhA启动子、katG、rpoB加第一内部对照和第二内部对照的所有探针的荧光信号(全部以相同颜色的荧光团Quasar 670)的一阶导数，其作为温度的函数。图6表明在不存在加入的结核分枝杆菌DNA的情况下的第一和第二内部对照的信号。图7-11反应以大约1000个拷贝的结核分枝杆菌的不同菌株的基因组DNA开始。
实施例3
在结核分枝杆菌菌株的三个不同基因中耐药性的多路检测
四路LATE PCR测定法用于检测在三个基因inhA启动子(启动子区)、katG和rpoB加上可扩增的第一内部对照和不可扩增的第二内部对照中的耐药性。结果显示在图24-27中。在图24中，线190是对所有三个基因的药物敏感性菌株H37Rv，而线191是仅对katG的抗性菌株(S315T，位于氨基酸位置315的丝氨酸变为酪氨酸)。对于图25，敏感性菌株是线200，而仅inhA启动子抗性菌株是线201，其包含在启动区的-8位置上的单核苷酸变化(T/C)。对于图26，线210是敏感性菌株，而线211包含仅rpoB突变(D516V，天冬氨酸至缬氨酸)。对于图27，线220是敏感性菌株，而线221包含仅双重rpoB突变(D516A，天冬氨酸至丙氨酸和H526N，组氨酸至天冬酰胺)。
LATE PCR扩增以25 µl体积在包含1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3mM MgCl2、300 nM dNTP、600 nM PrimeSafe 1、各引物组的50 nM有限引物和1000 nM过量引物、2.0单位Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、所有探针的50 nM On探针和150 nM Off探针(除了rpoB探针5 _On (25 nM)、rpoB探针5_On_G (75 nM))的反应混合物中进行。对于测试的各菌株，使用大约1000个基因组当量和扩增反应一式两份进行。扩增反应的热概况如下：97℃/5s-75℃/45s 60个循环，接着在75℃ 10 min。接着是在25℃开始以20s间隔1℃增量至98℃的解链。在60个循环结束时，探针靶标杂交通过使用各荧光团分别对在25℃至95℃之间的温度的一阶导数的解链曲线分析来进行分析。结果以下述方式提供在图24-27中：基因inhA启动子、katG、rpoB加上第一内部对照和第二内部对照的所有探针的荧光信号(全部以相同颜色的荧光团Quasar 670)的一阶导数，其作为温度的函数。
实施例3
在不同的结核分枝杆菌菌株中对异烟酰胺基因使用2种颜色的突变检测测定法
单路LATE PCR测定法(设计I)用于检测异烟酰胺基因中来自敏感性菌株的突变差异。561个碱基对的扩增子包括pncA基因的整个编码序列。其被31个两种荧光颜色的Lights-On探针和Lights-Off探针(Cal Red 610和Quasar 670)覆盖。单色的探针对线性地位于大约靶标序列的一半上，产生两个单独的荧光区段的靶标序列的分析。正常野生型(PZA敏感性)靶标和许多可能的非野生型(PZA抗性)序列中的几个的特征性荧光信号(一阶导数)显示在图28-29中。
图28A和28B分别显示Cal Red 610和Quasar 670荧光中的结果，其中线230和232是敏感性菌株H37Rv，而线231和233是包含异烟酰胺基因的位置3的鸟嘌呤(G)至胞嘧啶(C)的单碱基变化的突变菌株。在图28A中，两个信号是相同的，表明在该基因部分内没有突变。然而在图28B中的信号是明显不同的，表明存在突变。图29A和29B显示相同的敏感性菌株与包含在核苷酸位置321和322之间插入胸腺嘧啶(T)的不同的突变菌株比较的结果。图29A表明Cal Red 610中的结果，其中线240是敏感性菌株H37Rv，而线241是突变菌株，其明显与敏感性菌株的荧光信号不同，表明存在突变。Quasar 670结果显示在图29B中，线242是敏感性菌株，和线243是突变菌株，和在该基因部分中的荧光信号之间没有差异。
LATE PCR扩增在由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl2、300nM dNTP、600 nM Primesafe 1、50 nM有限引物和1000 nM过量引物、1.5单位Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、50 nM各On探针和150 nM各Off探针组成的25 ul体积中进行。对于测试的各菌株，使用大约1000个基因组当量和进行扩增反应。扩增反应的热概况如下：97℃/10s-75℃/45s 60个循环，接着在75℃ 10 min，接着在25℃ 10 min。接着是在25℃开始以20s间隔1℃增量至98℃的解链。在60个循环结束时，探针靶标杂交通过使用各荧光分别对25℃至95℃之间的温度的一阶导数的解链曲线分析来进行分析。结果以作为温度的函数的所有探针的荧光信号的一阶导数的方式提供在图28-29中。
实施例4
在不同的结核分枝杆菌菌株中对于异烟酰胺基因使用3种颜色的突变检测测定法
单路LATE PCR测定法用于检测在pncA基因和5’启动子区上游的一部分中来自敏感性菌株的突变差异。在该情况下，总靶标长度为685个核苷酸。扩增子用35个三种荧光颜色(Cal Orange 560、Cal Red 610和Quasar 670)的Lights-On和Lights-Off探针覆盖。结果显示在图30-32中，与二色测定法中获得的结果比较。图30A和30B显示二色测定法(见实施例3)的结果，其中突变菌株(核苷酸位置307上胸腺嘧啶(T)至胞嘧啶(C)的单碱基变化)未显示来自任一颜色的敏感性菌株的荧光信号的差异。对于敏感性菌株(线250和252)和突变菌株(线251和253)，图30A和30B分别表明Cal Red 610和Quasar 670的二色测定法的结果。因为二色测定法未能解析该突变差异，因此对这些相同的菌株使用三色测定法，结果显示在图31A-C。两种颜色的结果(Cal Orange 560, 图26A和Quasar 670, 图31B)显示相同的荧光信号，而第三种颜色(Cal Red 610, 图31C)具有两个不同的信号，由此表明存在突变。在表明Cal Orange 560结果的图31A中，线260是敏感性菌株，而线261是突变菌株。Quasar670的结果在图31B中，线262 (敏感性菌株)，线263 (突变菌株)。明显的信号差异显示在图31C Cal Red 610中，其中线264是敏感性菌株和线265是突变菌株，因此三色测定法能够区分该突变菌株，而二色测定法不能。来自该三色测定法的其它结果显示在图32A-C中。图32A-C比较了包含位置22的鸟嘌呤(G)核苷酸的单碱基对缺失的突变菌株与敏感性菌株的结果。图32A，Cal Orange 560，其中线271是突变菌株，表明与敏感性菌株(线270)相比荧光信号的强改变，指示存在突变。其它荧光Cal Red 610 (图32B)和Quasar 670 (图32C)的结果显示对于两个菌株(敏感性菌株，线272和274和突变菌株，线273和275)几乎相同的荧光信号。
LATE PCR扩增在由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl2、300nM dNTP、600 nM Primesafe 1、50 nM有限引物和1000 nM过量引物、1.5单位Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、50 nM各On探针和150 nM各Off探针和25 nM内部对照On链与75 nM内部Off链组成的25 µl体积中进行。对于测试的各菌株，使用大约1000个基因组当量，和进行扩增反应。扩增反应的热概况如下：97℃/7s-75℃/45s 60个循环，接着在75℃10 min，接着在25℃ 10 min。接着是在25℃开始以20s间隔1℃增量至98℃的解链。在60个循环结束时，探针靶标杂交通过使用各荧光分别对25℃至95℃之间的温度的一阶导数的解链曲线分析来进行分析。结果以作为温度的函数的全部探针加内部对照的荧光信号的一阶导数的方式提供在图30-32中。
序列
引物
rpoB有限引物
CTCCAGCCAGGCACGCTCACGTGACAGACCG (SEQ ID NO: 1)
rpoB过量引物
ACGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTT (SEQ ID NO: 2)
katG有限引物
AGCGCCCACTCGTAGCCGTACAGGATCTCGAGGAAAC (SEQ ID NO: 3)
katG过量引物
TCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCAC (SEQ ID NO: 4)
inhA启动子有限引物
TTCCGGTAACCAGGACTGAACGGGATACGAATGGGGGTTTGG (SEQ ID NO: 5)
inhA启动子过量引物
TCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATAC (SEQ ID NO: 6)
pncA有限引物
AACTGCCCGGCCAGTCGCCCGAACGTATGGTGGACGT (SEQ ID NO: 7)
pncA过量引物
GTTCATCCCGGTTCGGCGGTGCCA (SEQ ID NO: 8)
内部对照有限引物
TTCGGCGCACAAAGTGTCTCTGGCTGTTGT (SEQ ID NO: 9)
内部对照过量引物
GGCACGATGCTCCCACATTGCGACTTC (SEQ ID NO: 10)
探针
rpoB_探针1_OFF
BHQ2-CTGGTTGGTGCAGAAG-C3 Spacer (SEQ ID NO: 11)
rpoB_探针 1a_OFF
BHQ2- CTGGTTGGTGCTGAAG-C3 Spacer (SEQ ID NO: 100)
rpoB_探针2_ON
BHQ2-TCAGGTCCATGAATTGGCTCAGA-QSR670 (SEQ ID NO: 12)
rpoB_探针3_OFF
BHQ2-CAGCGGGTTGTT-C3 Spacer (SEQ ID NO: 13)
rpoB_探针4_ON
BHQ2-ATGCGCTTGTGGATCAACCCCGAT-QSR670 (SEQ ID NO: 14)
rpoB_探针4a_ON
BHQ2-ATGCGCTTGTTGGTCAACCCCGAT-QSR670 (SEQ ID NO: 101)
rpoB_探针5_ON
QSR670-AAGCCCCAGCGCCGACAGTCGTT-BHQ2 (SEQ ID NO: 15)
rpoB_探针5a_ON
QSR670- AAGCCCCAGCGCCGTCAGTCGTT-BHQ2 (SEQ ID NO: 102)
rpoB_探针6_OFF
ACAGACCGCCGG-BHQ2 (SEQ ID NO: 16)
katG_ON
QSR670-ACTCGCGTCCTTACCCAAAAAAAAAAAAAA-BHQ2 (SEQ ID NO: 17)
katG_OFF
ATGTCGGTGGTGA-BHQ2 (SEQ ID NO: 18)
inhA启动子_ON
BHQ2-AAAAAAAAAAAAAAAGGCAGTCATCCCGTT-QSR670 (SEQ ID NO: 19)
inhA启动子_OFF
BHQ2-TTACAGCCTATCGCCTCGC-C3 (SEQ ID NO: 20)
pncA_探针_025_040_ON
CR610‐TCGGTTTGCAGCTCCTGAGA‐BHQ2(SEQ ID NO: 21)
pncA_探针_041_054_OFF
GCCAGCGTCGAGTT‐BHQ2 (SEQ ID NO: 22)
pncA_探针_055_074_ON
CR610‐CGCTGGAGGAGATGTGCACCAAAAAAAAAAAAAAA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 23)
pncA_探针_075_100_OFF
TGTGTTGGTCGATACTACCGTCGCCG‐BHQ2 (SEQ ID NO: 24)
pncA_探针_101_118_ON
CR610‐AGGGTGGACTTGACAGCGGGCT‐BHQ2 (SEQ ID NO: 25)
pncA_探针_119_132_OFF
GCCACTAGGGTGCT‐BHQ2 (SEQ ID NO: 26)
pncA_探针_133_146_ON
CR610‐AATACGCAATGGCTTGTT‐BHQ2 (SEQ ID NO: 27)
pncA_探针_147_156_OFF
GAGGACGCGG‐BHQ2 (SEQ ID NO: 28)
pncA_探针_157_175_ON
CR610‐GTTTGTGTGCGCTAGATGGCCAC‐BHQ2 (SEQ ID NO: 29)
pncA_探针_176_188_OFF
TTGCCACCGATCA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 30)
pncA_探针_189_204_ON
CR610‐TCGTCGATGTGGTTGGTAGA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 31)
pncA_探针_205_215_OFF
GCGTCGATGAG‐BHQ2 (SEQ ID NO: 32)
pncA_探针_216_229_ON
CR610‐ATGCTGTGGCAATGCGAT‐BHQ2 (SEQ ID NO: 33)
pncA_探针_230_241_OFF
ACTGCTGAATTG‐BHQ2 (SEQ ID NO: 34)
pncA_探针_242_262_ON
CR610‐TAAGTCGATGAGAACGGTACGCCTA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 35)
pncA_探针_263_276_OFF
AGCGGCTTCGAAGG‐BHQ2 (SEQ ID NO: 36)
pncA_探针_277_293_ON
QSR670‐AACCTACACCGGAGCGTACTT‐BHQ2 (SEQ ID NO: 37)
pncA_探针_294_307_OFF
GTTCTACAAGGGTG‐BHQ2 (SEQ ID NO: 38)
pncA_探针_308_331_ON
QSR670‐TAGGACACGTTGGCAGTTGAGGCGGTTAAAAAAAA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 39)
pncA_探针_332_353_OFF
GCGCGGACTTCTATCCCAGTCT‐BHQ2 (SEQ ID NO: 40)
pncA_探针_354_372_ON
QSR670‐TGTGCGTCAGTGGTACTTCCGCAAAAAAAAAAAAA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 41)
pncA_探针_373_388_ON
QSR670‐GTGTCGTGGCTACCGCATAC‐BHQ2 (SEQ ID NO: 42)
pncA_探针_389_405_OFF
ACACCGGACTATTCTTCG‐BHQ2 (SEQ ID NO: 43)
pncA_探针_406_427_ON_Bovis
QSR670‐CCCGGGTGACGACTTCTCCGGC‐BHQ2 (SEQ ID NO: 44)
pncA_探针_428_448_OFF
AACCAAGGACTTCCACATCGA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 45)
pncA_探针_449_478_ON
QSR670‐AACGAAGCGGTGGACTATCGTTACGTTGTGGCTT‐BHQ2 (SEQ ID NO: 46)
pncA_探针_479_501_OFF_2
CGCGCTATCAGTGACTACCTGGC‐BHQ2 (SEQ ID NO: 47)
pncA_探针_502_521_ON
QSR670‐CCGGTGGTGTTGTGCTGGCCAAAAAAAAAAAAAAA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 48)
pncA_探针_522_546_OFF
TGTGAGGGTGGTTCGTTGGCGGTAA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 49)
pncA_探针_547_569_ON
QSR670‐TTTCGTTGACGTGCAGAACGACTTCAA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 50)
pncA_探针_570_585_OFF
ATGCGGGCGTTGATCA‐BHQ2 (SEQ ID NO: 51)
第一内部对照 ON
QSR670-ATTCTATTATTTATTTTCAT-BHQ2 (SEQ ID NO: 52)
第一内部对照 OFF
ATCATTATTTACTA-BHQ2 (SEQ ID NO: 53)
内部标志物
第二内部对照 ON
QSR670-CAGCTGCACTGGGAAGGGTGCAGTCTGACC-C3 (SEQ ID NO: 54)
第二内部对照 OFF
GGTCAGACTGCACCCTTCCCAGTGCAGCTG-BHQ2 (SEQ ID NO: 55)
Primesafe II
Primesafe有义
Dabcyl-GGATCAGATTAGCACTGATGTA-Dabcyl (SEQ ID NO: 56)
Primesafe反义
Dabcyl-TACATCAGTGCTAATCTGATCC-Dabcyl (SEQ ID NO: 57)
Primesafe PS1
Dabcyl-GAATAATATAGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTATATTATTC-Dabcyl (SEQ ID NO:60)
pncA设计II探针
pncA-设计II_196-215
QSR670-AACGCCGCGCTGGAGGAGATGCTT-BHQ2 (SEQ ID NO: 65)
pncA-设计II_216-230
GGCCGATACCACCGT-BHQ2 (SEQ ID NO: 66)
pncA-设计II_406-425
QSR670-ACCATCGGAGCGTACAGCGGCTGT-BHQ2(SEQ ID NO: 67)
pncA-设计II_426-440
CTACAAGGGTGCCTA-BHQ2 (SEQ ID NO: 68)
pncA-设计II_161-180
QSR670-ACAGTTGGTTTGCAGCTCCTGAGT-BHQ2 (SEQ ID NO: 69)
pncA-设计II_181-195
GCACTGCCGGCGTCG-BHQ2 (SEQ ID NO: 70)
pncA-设计II_546-565
QSR670-AAGACCCGGGTGATCACTTCTCTT-BHQ2 (SEQ ID NO: 71)
pncA-设计II_566-580
AAGGACTTCCACATC-BHQ2 (SEQ ID NO: 72)
pncA-设计II_616-635
QSR670-AACGCTATCAGTGACTACCTGGTT-BHQ2 (SEQ ID NO: 73)
pncA-设计II_636-650
CGCTGCGTTGGCTCG-BHQ2 (SEQ ID NO: 74)
pncA-设计II_441-460
QSR670-AATCGGCAATTGAGTCGGTGTTTT-BHQ2 (SEQ ID NO: 75)
pncA-设计II_461-475
CAGTCTGGACGCG-BHQ2(SEQ ID NO: 76)
pncA-设计II_266-285
CO560-TAGCGGTACGCAATGGCTTGGCCTA-BHQ1 (SEQ ID NO: 77)
pncA-设计II_286-300
AGACGGCCGAGGAC-BHQ1 (SEQ ID NO: 78)
pncA-设计II_581-600
CO560-ACACCATCACGTCGTGGCAACCGT-BHQ1 (SEQ ID NO: 79)
pncA-设计II_601-615
CCGGAGCGGCGGGCT-BHQ1 (SEQ ID NO: 80)
pncA-设计II_476-495
CO560-ACCTCTCGGCGTGGACTTCTATCCGT-BHQ1(SEQ ID NO: 81)
pncA-设计II_496-510
ATTGCGTTAGCGGTA-BHQ1 (SEQ ID NO: 82)
pncA-设计II_685-705
CO560-TTTCGTTGACGTGCAGAATGACAA-BHQ1 (SEQ ID NO: 83)
pncA-设计II_706-720
TGCGGGTGTTGGTCA-BHQ1 (SEQ ID NO: 84)
pncA-设计II_371-390
CO560-AAAGAATGGTACGTCACTGCTGTT-BHQ1 (SEQ ID NO: 85)
pncA-设计II_391-405
TCGGAGGAGTTGACG-BHQ1 (SEQ ID NO: 86)
pncA-设计II_511-530
CR610-ACTTCCTCGTCGTGGCCATCGCGT-BHQ2 (SEQ ID NO: 87)
pncA-设计II_531-345
CGGCACACTGGACTA-BHQ2 (SEQ ID NO: 88)
pncA-设计II_336-355
CR610-AGCGCGGCGTCGATGAGGTTGACT-BHQ2 (SEQ ID NO: 89)
pncA-设计II_356-370
AATTGGCTGCGGTAA-BHQ2 (SEQ ID NO: 90)
pncA-设计II_651-670
CR610-AATCGCTGGCGGTAACTGGTGGTT-BHQ2 (SEQ ID NO: 91)
pncA-设计II_671-685
TTCTGCGAGGGTGGC-BHQ2 (SEQ ID NO: 92)
pncA-设计II_301-320
CR610-AACATCGATCATTGTGTGCGCCTT-BHQ2 (SEQ ID NO: 93)
pncA-设计II_321-335
TGTGGTCGGTATTGC-BHQ2 (SEQ ID NO: 94)
pncA-设计II_231-250
CR610-AAGACTTGACAGCGGGTGTGTCTT-BHQ2(SEQ ID NO: 95)
pncA-设计II_251-265
ACTAGGGTGCTGGTG-BHQ2 (SEQ ID NO: 96)
pncA-设计II_721-740
CR610-TTCCGAACGTATGGTGGATGTAAA-BHQ2 (SEQ ID NO: 97)
pncA-设计II_741-755
TGCTTGGGCAGTTGC-BHQ2 (SEQ ID NO: 98)
pncA-设计II_356-370_B
AATTGGCTGTGGCGG-BHQ2 (SEQ ID NO: 99)
本文提供的所有出版物和专利通过引用以其整体结合到本文中。本发明所述的组合物和方法的各种修饰和改变在不脱离本发明的范围和精神的情况下对本领域技术人员而言是显而易见的。尽管本发明已经结合特别优选的实施方案进行了描述，但应该理解，所要求保护的本发明不应过度限于这些具体的实施方案。事实上，对相关领域的技术人员显而易见的实施本发明的上述方式的各种修饰旨在包括在本发明的范围内。

Claims (148)

1.用于分析样品中的单链核酸靶标序列的方法，包括：
(a) 使包含第一单链核酸靶标序列和至少第二单链核酸靶标序列的样品与检测试剂接触，所述检测试剂包含针对各靶标序列的多组探针对，所述探针对的每一个包含：
(i) 用非荧光猝灭剂标记的至少一个猝灭剂探针，和
(ii) 用荧光染料标记的至少一个发信号探针，
其中当发信号探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射背景信号，
其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，
其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；
其中各探针组的发信号探针用相同的荧光染料标记；
其中所述第一靶标的探针组结合至正常、未突变、非病原的序列的温度范围与所述第二靶标的探针组结合至所述第二靶标的正常、未突变、非病原的序列的温度范围重叠，
(b) 作为温度的函数分析来自发信号探针的信号。
2.权利要求1的方法，其中靶标序列是结核分枝杆菌核酸序列。
3.权利要求2的方法，其中靶标序列包含katG、rpoB、inhA启动子和/或pncA基因的部分。
4.权利要求1的方法，其中各发信号探针与其各自的靶标序列在不同的温度范围杂交。
5.权利要求4的方法，其中所述不同的温度范围是不重叠的。
6.权利要求4的方法，其中所述不同的温度范围中的两个或更多个部分地重叠。
7.权利要求1的方法，其中对于各探针组，发信号探针与靶标序列杂交的解链温度高于猝灭剂探针与靶标序列杂交的解链温度。
8.权利要求1的方法，其中所述发信号探针是自猝灭探针，其包含非荧光猝灭剂，当发信号探针未杂交至靶标时减少来自荧光团的信号。
9.权利要求8的方法，其中所述发信号探针是分子信标探针。
10.权利要求8的方法，其中所述发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光染料之间包含靶标结合区和非结合区。
11.权利要求1的方法，其中作为温度的函数分析来自发信号探针的信号包括生成解链曲线或退火曲线。
12.权利要求11的方法，其中解链曲线或退火曲线与已知的曲线或对照曲线相比较。
13.权利要求1的方法，其中分析来自发信号探针的信号检测靶标序列的存在。
14.权利要求1的方法，其中分析来自发信号探针的信号检测靶标序列中突变的存在。
15.权利要求1的方法，其中第一探针组的发信号探针和猝灭剂探针与第一靶标序列杂交的解链温度在10-75℃的范围内。
16.权利要求15的方法，其中第一靶标序列是结核分枝杆菌inhA启动子基因的一部分。
17. 权利要求16的方法，其中第一探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 19具有至少70%同一性和第一探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 20具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
18.权利要求1的方法，其中第二探针组的发信号探针和猝灭剂探针与第二靶标序列杂交的解链温度在10-75℃的范围内。
19.权利要求18的方法，其中第二靶标序列是结核分枝杆菌katG基因的一部分。
20. 权利要求19的方法，其中第二探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 17具有至少70%同一性和第二探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 18具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
21.权利要求1的方法，其中第三探针组的发信号探针和猝灭剂探针与第三靶标序列杂交的解链温度在55-75℃的范围内。
22.权利要求21的方法，其中第三靶标序列是结核分枝杆菌rpoB基因的一部分。
23. 权利要求22的方法，其中第三探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 12、14或15之一具有至少70%同一性和第三探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 11、13或16之一具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
24.权利要求1的方法，其中第一靶标序列是结核分枝杆菌inhA启动子基因的一部分，和第一探针组的发信号探针和猝灭剂探针与第一靶标序列杂交的解链温度在35-55℃的范围内，其中第二靶标序列是结核分枝杆菌katG基因的一部分，和第二探针组的发信号探针和猝灭剂探针与第二靶标序列杂交的解链温度在45-60℃的范围内，和其中第三靶标序列是结核分枝杆菌rpoB基因的一部分，和第三探针组的发信号探针和猝灭剂探针与第三靶标序列杂交的解链温度在55-75℃的范围内。
25.权利要求1的方法，其中第四探针组的发信号探针和猝灭剂探针具有与第三靶标序列杂交的解链温度，第三靶标序列是结核分枝杆菌pncA基因的一部分。
26. 权利要求25的方法，其中第四探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、42、44、46、48或50之一具有至少70%同一性，和第三探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、43、45、47、49、50或51之一具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
27.权利要求1的方法，其中检测试剂还包含第一单链内部对照序列和包含相应的信号探针的第一对照探针组，其中第一对照序列的信号探针用与各靶标序列的发信号探针相同的荧光团标记。
28.权利要求27的方法，其中第一对照探针组的发信号探针和猝灭剂探针与内部对照序列杂交的解链温度低于35℃。
29. 权利要求28的方法，其中第一对照探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 52具有至少70%同一性和第一对照探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 53具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
30.权利要求1的方法，其中检测试剂还包含第二单链内部对照序列和包含相应的猝灭剂探针和信号探针的第二对照探针组，其中第二对照序列的信号探针用与各靶标序列的发信号探针相同的荧光团标记。
31.权利要求30的方法，其中第二对照探针组的发信号探针和猝灭剂探针与内部对照序列杂交的解链温度在70-80℃的范围内。
32. 权利要求31的方法，其中第二对照探针组的发信号探针与SEQ ID NO: 54具有至少70%同一性和对照探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 55具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
33.权利要求1的方法，其中单链核酸靶标序列通过使用扩增试剂自样品核酸扩增来产生。
34.权利要求33的方法，其中样品核酸包含结核分枝杆菌基因组核酸。
35.权利要求34的方法，其中样品核酸获自包含结核分枝杆菌的生物学样品或环境样品。
36.权利要求34的方法，其中样品核酸包含katG、rpoB、inhA启动子和/或pncA基因。
37.权利要求33的方法，其中扩增试剂包含靶标-特异性引物对。
38.权利要求37的方法，其中各引物对包含过量引物和有限引物。
39.权利要求37的方法，其中靶标-特异性引物与靶标序列的解链温度高于发信号探针和猝灭探针对各自的靶标序列的解链温度。
40.权利要求33的方法，其中所述扩增是不对称扩增，以产生单链核酸靶标序列。
41.权利要求40的方法，其中所述扩增是LATE-PCR。
42. 权利要求39的方法，其中第一靶标特异性引物对包含与SEQ ID NO: 6至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 5至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物。
43. 权利要求36的方法，其中第二靶标特异性引物对包含与SEQ ID NO: 4至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 3至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物。
44. 权利要求39的方法，其中第三靶标特异性引物对包含与SEQ ID NO: 2至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 1至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物。
45. 权利要求39的方法，其中第四靶标特异性引物对包含与SEQ ID NO: 8至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 7至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物。
46.权利要求33的方法，其中所述扩增试剂包含寡核苷酸试剂以：抑制引发错误，增加针对3'末端错配的聚合酶选择性，增加针对富含AT的3'端的聚合酶选择性，减少复制分散，抑制聚合酶5'外切核酸酶活性和/或抑制聚合酶活性。
47. 权利要求46的方法，其中所述寡核苷酸试剂选自以下任一组：a) 双链寡核苷酸，由杂交的解链温度为约70℃的一对互补的寡核苷酸构成，所述寡核苷酸各自用共价连接部分进行3'和5'末端-标记；b) 单链寡核苷酸，具有一对互补的末端，其允许在约70℃形成闭合的茎-环结构，所述寡核苷酸的每个末端用共价连接部分进行3 '和5'末端-标记。
48.权利要求47的方法，其中所述共价连接部分是dabcyl基团。
49. 权利要求47的方法，其中所述互补的寡核苷酸与SEQ ID NO: 56和57或60具有大于70%同一性。
50. 用于分析单链核酸靶标序列的试剂盒或试剂混合物，包含：
(a) 扩增试剂，包含对各靶标序列有特异性的引物对，所述引物对包含过量引物和有限引物；和
(b) 检测试剂，包含针对各靶标序列的多组探针对，所述探针对各自包含：
(i) 用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，和
(ii) 用荧光染料标记的发信号探针，
其中当发信号探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射背景信号，
其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，
其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭，
其中各探针组的发信号探针用相同的荧光染料标记，和
其中靶标-特异性引物与靶标序列的解链温度高于发信号探针和猝灭探针对各自的靶标序列的解链温度。
51.权利要求50的试剂盒或反应混合物，其中靶标序列是结核分枝杆菌核酸序列。
52.权利要求51的试剂盒或反应混合物，其中靶标序列包含katG、rpoB、inhA启动子和/或pncA基因的部分。
53.权利要求50的试剂盒或反应混合物，其中各发信号探针在不同的温度范围下杂交至它们各自的靶标序列。
54.权利要求53的试剂盒或反应混合物，其中所述不同的温度范围是不重叠的。
55.权利要求53的试剂盒或反应混合物，其中所述不同的温度范围中的两个或更多个部分地重叠。
56.权利要求50的试剂盒或反应混合物，其中对于各探针组，发信号探针与靶标序列杂交的解链温度高于猝灭剂探针与靶标序列杂交的解链温度。
57.权利要求50的试剂盒或反应混合物，其中所述发信号探针是自猝灭探针，其包含非荧光猝灭剂，当发信号探针未杂交至靶标时减少来自荧光团的信号。
58.权利要求57的试剂盒或反应混合物，其中所述发信号探针是分子信标探针。
59.权利要求57的试剂盒或反应混合物，其中所述发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光染料之间包含靶标结合区和非结合区。
60.权利要求50的试剂盒或反应混合物，其中第一靶标序列是结核分枝杆菌inhA启动子基因的一部分，和第一探针组的发信号探针和猝灭剂探针与第一靶标序列杂交的解链温度在35-55℃的范围内，其中第二靶标序列是结核分枝杆菌katG基因的一部分，和第二探针组的发信号探针和猝灭剂探针与第二靶标序列杂交的解链温度在45-60℃的范围内，其中第三靶标序列是结核分枝杆菌rpoB基因的一部分，和第三探针组的发信号探针和猝灭剂探针与第三靶标序列杂交的解链温度在55-75℃的范围内，和其中第四靶标序列是结核分枝杆菌pncA基因的一部分。
61. 权利要求60的试剂盒或反应混合物，其中第一探针组包含与SEQ ID NO: 19至少70%同一性的发信号探针和与SEQ ID NO: 20至少70%同一性的猝灭剂探针；其中第二探针组包含与SEQ ID NO: 17至少70%同一性的发信号探针和与SEQ ID NO: 18至少70%同一性的猝灭剂探针；其中第三探针组包含与SEQ ID NO: 12、14和15之一至少70%同一性的发信号探针和与SEQ ID NO: 11、13和16之一至少70%同一性的猝灭剂探针；和其中第四探针组包含与SEQ ID NO: 之一至少70%同一性的发信号探针、与SEQ ID NO: 21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、42、44、46、48或50之一至少70%同一性的猝灭剂探针和与SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、43、45、47、49、50或51之一至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的猝灭剂探针。
62.权利要求50的试剂盒或反应混合物，其中检测试剂还包含第一单链内部对照序列和包含相应的猝灭剂探针和信号探针的第一对照探针组，其中第一对照序列的信号探针用与各靶标序列的发信号探针相同的荧光团标记，和其中第一对照探针组的发信号探针和猝灭剂探针与内部对照序列杂交的解链温度在25-35℃的范围内。
63. 权利要求62的试剂盒或反应混合物，其中第一对照探针组的发信号探针与SEQ IDNO: 52具有至少70%同一性和第一对照探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 53具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
64.权利要求50的试剂盒或反应混合物，其中检测试剂还包含第二单链内部对照序列和包含相应的猝灭剂探针和信号探针的第二对照探针组，其中第二对照序列的信号探针用与各靶标序列的发信号探针相同的荧光团标记，和其中第二对照探针组的发信号探针和猝灭剂探针与内部对照序列杂交的解链温度在79℃的范围内。
65. 权利要求64的试剂盒或反应混合物，其中第二对照探针组的发信号探针与SEQ IDNO: 54具有至少70%同一性和对照探针组的猝灭剂探针与SEQ ID NO: 55具有至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)。
66. 权利要求50的试剂盒或试剂混合物，其中第一靶标特异性引物对包含与SEQ IDNO: 6至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 5至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物，其中第二靶标特异性引物对包含与SEQ IDNO: 4至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 3至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物，和其中第三靶标特异性引物对包含与SEQ IDNO: 2至少70%同一性的过量引物和与SEQ ID NO: 1至少70%同一性(例如，>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、95%、>98%、>99%)的有限引物。
67. 权利要求50的试剂盒或试剂混合物，其中所述扩增试剂还包含寡核苷酸试剂以：抑制引发错误，增加针对3'末端错配的聚合酶选择性，增加针对富含AT的3'端的聚合酶选择性，减少复制分散，抑制聚合酶5'外切核酸酶活性和/或抑制聚合酶活性，其中所述寡核苷酸试剂选自以下任一组：a) 双链寡核苷酸，由杂交的解链温度为约70℃的一对互补的寡核苷酸构成，所述寡核苷酸各自用共价连接部分进行3'和5'末端-标记；b) 单链寡核苷酸，具有一对互补的末端，其允许在约70℃形成闭合的茎-环结构，所述寡核苷酸的每一末端用共价连接部分进行3 '和5'末端-标记。
68.权利要求67的方法，其中所述共价连接部分是dabcyl基团。
69. 权利要求67的方法，其中所述互补的寡核苷酸与SEQ ID NO: 56和57或60具有大于70%同一性。
70.用于分析样品中的四个或更多个核酸靶标序列的方法，包括：
(a) 使包含四个或更多个核酸靶标序列的样品与扩增试剂接触，其中扩增试剂包含对四个或更多个核酸靶标序列的每一个有特异性的多组引物对；
(b) 在产生各靶标序列的单链扩增子的条件下扩增核酸靶标序列；
(c) 使样品与检测试剂接触，所述检测试剂包含针对各靶标序列的多组探针对，所述探针对的每一个包含：
(i) 用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，和
(ii) 用荧光染料标记的发信号探针，
其中当发信号探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射背景信号，
其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，
其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；
其中各探针组的发信号探针用相同的荧光染料标记；和
(d) 作为温度的函数分析来自发信号探针的信号。
71.试剂盒，包含：
(a) 内部对照核酸，
(b) 检测试剂，所述检测试剂包含
(i) 对各靶标序列和内部对照核酸有特异性的探针组，所述探针组的每一个包含：
(A) 用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，和
(B) 用荧光染料标记的发信号探针；
其中当发信号探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射背景信号，
其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，
其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭，
其中靶标序列的各探针组的发信号探针用相同的荧光染料标记，和
其中对内部对照核酸有特异性的猝灭剂探针和发信号探针与内部对照核酸的单链部分的解链温度低于35℃；和
(c) 扩增试剂，所述扩增试剂包含：对各靶标序列和内部对照核酸有特异性的引物对，所述引物对包含过量引物和有限引物，和其中靶标-特异性引物与靶标序列的解链温度高于发信号探针和猝灭探针对各自的靶标序列或内部对照核酸的解链温度。
72.用于分析样品中的两个或更多个核酸靶标序列的方法，包括：
(a) 使样品与权利要求71的试剂盒接触；
(b) 用扩增试剂扩增内部对照核酸的一部分和两个或更多个核酸靶标序列的每一个的一部分，以产生单链扩增子；和
(c) 在一定的温度范围下检测来自发信号探针的信号。
73. 用于检测和/或表征样品中的分枝杆菌的试剂盒或试剂混合物，包含：
(a) 对在inhA启动子、katG和rpoB基因内的靶标序列有特异性的引物对，所述引物对包含过量引物和有限引物；和
(b) 在inhA启动子、katG和rpoB基因内的靶标序列的探针组，所述探针组的每一个包含：
(i) 用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，和
(ii) 用荧光染料标记的发信号探针，
其中当发信号探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射背景信号，
其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，
其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭，
其中各探针组的发信号探针用相同的荧光染料标记，和
其中引物对与靶标序列的解链温度高于发信号探针和猝灭探针对各自的靶标序列的解链温度。
74.用于检测和/或表征样品中的分枝杆菌的方法，包括：
(a) 使样品与权利要求73的试剂盒接触；
(b) 用引物对扩增靶标序列以产生单链扩增子；和
(c) 在一定的温度范围下检测来自发信号探针的信号。
75.试剂盒或反应混合物，包含：
(a) 第一内部对照，包含：
(i) 第一对照序列，
(ii) 包含过量引物和有限引物的引物对，用于扩增第一对照序列的全部或一部分的单链以产生第一对照扩增子，
(iii) 用非荧光猝灭剂标记和与第一对照扩增子的第一部分互补的猝灭剂探针，和
(iv) 用荧光团标记和与第一对照扩增子的第二部分互补的发信号探针，和
(b) 第二内部对照，包含：
(i) 第二对照序列，
(ii) 用非荧光猝灭剂标记和与第二对照序列的第一部分互补的猝灭剂探针，和
(iii) 用荧光团标记和与第二对照序列的第二部分互补的发信号探针，
其中当发信号探针未结合至对照序列时，自发信号探针发射背景信号，
其中当发信号探针结合至对照序列但猝灭剂探针未结合至对照序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，和
其中当发信号探针和猝灭剂探针结合至对照序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭。
76.权利要求75的试剂盒或反应混合物，其中第一内部对照的发信号探针和第二内部对照的发信号探针用相同的荧光染料标记。
77.权利要求75的试剂盒或反应混合物，其中第一内部对照的发信号探针和猝灭剂探针的Tm和第二内部对照的发信号探针和猝灭剂探针的Tm相差超过30℃。
78.权利要求75的试剂盒或反应混合物，其中第二内部对照是不可扩增对照和不包含扩增引物。
79.权利要求78的试剂盒或反应混合物，其中第一内部对照的发信号探针和猝灭剂探针的Tm低于第二内部对照的发信号探针和猝灭剂探针的Tm至少30℃。
80.权利要求75的试剂盒或反应混合物，进一步包含：
(c) 第三内部对照，包含：
(i) 第三对照序列，
(ii) 用非荧光猝灭剂标记和与第三对照序列的第一部分互补的猝灭剂探针，和
(iii) 用荧光团标记和与第三对照序列的第二部分互补的发信号探针。
81.权利要求80的试剂盒或反应混合物，进一步包含：
(iv) 包含过量引物和有限引物的引物对，用于扩增第三对照序列的全部或一部分的单链以产生第三对照扩增子。
82.校准或控制仪器或反应的方法，包括：
(a) 在单反应容器中提供权利要求75-81中任一项的试剂盒或反应混合物；
(b) 将反应容器暴露于足以允许单链扩增的条件；
(c) 作为温度的函数分析来自发信号探针的信号。
83.权利要求82的方法，其中步骤(a)-(c)同时或序贯在多个反应容器中进行。
84. 反应混合物，包含：
(a) 靶标核酸；和
(b) 三个或更多个探针对，各探针对包含：
(i) 用荧光部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的发信号探针，和
(ii) 用非荧光猝灭剂部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的猝灭探针；
其中各猝灭探针与靶标序列的解链温度不同于三个或更多个探针组中的其它猝灭探针；和
其中：
(A) 根据解链温度的递增或递减幅度，发信号探针的杂交序列并非在所述靶标核酸内线性排列，和/或
(B) 根据解链温度的递增或递减幅度，猝灭探针的杂交序列并非在所述靶标核酸内线性排列。
85.权利要求84的反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭。
86.权利要求84的反应混合物，其中发信号探针和猝灭探针与它们的特定杂交序列充分互补，以允许在测定条件下杂交。
87.权利要求84的反应混合物，其中靶标核酸是单链的。
88.权利要求84的反应混合物，其中靶标核酸包含结核分枝杆菌核酸序列。
89.权利要求88的反应混合物，其中靶标核酸包含pncA基因的一部分。
90.权利要求84的反应混合物，其中对于各探针对，发信号探针与靶标核酸的解链温度高于猝灭探针与靶标序列的解链温度。
91.权利要求84的反应混合物，其中所述发信号探针是自猝灭探针，其包含非荧光猝灭剂，当发信号探针未杂交至靶标时减少来自荧光团的信号。
92.权利要求91的反应混合物，其中所述发信号探针是分子信标探针。
93. 权利要求91的反应混合物，其中所述发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光染料之间包含靶标结合区和非结合区。
94.用于分析样品中的至少一个单链核酸靶标序列的单相测定方法，包括
(a) 形成权利要求84-93中任一项的反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；
(b) 在一定的温度范围下检测来自所述发信号探针的所述荧光部分的荧光信号；和
(c) 作为温度的函数分析所述探针对与所述至少一个靶标序列的杂交。
95. 试剂盒或反应混合物，包含：
(a) 用于自样品核酸扩增靶标核酸的引物；和
(b) 三个或更多个探针对的有色组，各探针对包含：
(i) 用荧光部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的发信号探针，和
(ii) 用非荧光猝灭剂部分标记和与特定杂交序列互补的猝灭探针；
其中各发信号探针对靶标序列的解链温度不同于三个或更多个探针组中的其它发信号探针；
其中各猝灭探针对靶标序列的解链温度不同于三个或更多个探针组中的其它猝灭探针；和
其中：
(A) 根据解链温度的递增或递减幅度，发信号探针的杂交序列并非在所述靶标核酸内线性排列，和/或
(B) 根据解链温度的递增或递减幅度，猝灭探针的杂交序列并非在所述靶标核酸内线性排列。
96.权利要求95的试剂盒或反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭。
97.权利要求95的试剂盒或反应混合物，其中发信号探针和猝灭探针与它们独特的杂交序列充分互补，以允许在测定条件下杂交。
98.权利要求95的试剂盒或反应混合物，其中靶标核酸是单链的。
99.权利要求95的试剂盒或反应混合物，其中靶标核酸包含结核分枝杆菌核酸序列。
100.权利要求99的试剂盒或反应混合物，其中靶标核酸包含pncA基因的一部分。
101.权利要求95的试剂盒或反应混合物，其中对于各探针对，发信号探针与靶标核酸的解链温度高于猝灭探针与靶标序列的解链温度。
102.权利要求95的试剂盒或反应混合物，其中所述发信号探针是自猝灭探针，其包含非荧光猝灭剂，当发信号探针未杂交至靶标时减少来自荧光团的信号。
103.权利要求102的试剂盒或反应混合物，其中所述发信号探针是分子信标探针。
104.权利要求102的试剂盒或反应混合物，其中所述发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光染料之间包含靶标结合区和非结合区。
105.权利要求95的试剂盒或反应混合物，其中所述引物包含有限引物和过量引物。
106.权利要求95的试剂盒或反应混合物，进一步包含样品核酸。
107.权利要求106的试剂盒或反应混合物，其中引物与所述样品核酸的保守区互补和侧连所述样品核酸的可变区。
108.用于分析样品核酸的单相测定方法，包括：
(a) 形成权利要求105-107中任一项的反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；
(b) 用所述引物扩增所述样品核酸以产生靶标核酸；
(c) 在一定的温度范围下检测来自所述发信号探针的所述荧光部分的荧光信号；和
(d) 作为温度的函数分析所述探针对与所述至少一个靶标序列的杂交。
109.权利要求108的方法，其中产生靶标-核酸-序列-依赖性荧光信号。
110.权利要求108的方法，其中所述引物包含过量引物和有限引物，和所述扩增通过LATE-PCR进行。
111.权利要求108的方法，其中所述靶标核酸是单链的。
112. 反应混合物，包含：
(a) 靶标核酸；和
(b) 三个或更多个探针对，各探针对包含：(i) 用荧光部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 用非荧光猝灭剂部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的猝灭探针；
其中探针组的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上是连续的；
其中至少两个所述探针对属于第一有色组，和至少一个所述探针对属于第二有色组；和
其中第二有色组的探针对间插入第一有色组的探针对和/或与其连续。
113.权利要求112的反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时，自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时，来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭。
114.权利要求112的反应混合物，其中发信号探针和猝灭探针与它们特定的杂交序列充分互补，以允许在测定条件下杂交。
115.权利要求112的反应混合物，其中靶标核酸是单链的。
116.权利要求112的反应混合物，其中靶标核酸包含结核分枝杆菌核酸序列。
117.权利要求116的反应混合物，其中靶标核酸包含pncA基因的一部分。
118.权利要求112的反应混合物，其中对于各探针对，发信号探针与靶标核酸的解链温度高于猝灭探针与靶标序列的解链温度。
119.权利要求112的反应混合物，其中所述发信号探针是自猝灭探针，其包含非荧光猝灭剂，当发信号探针未杂交至靶标时减少来自荧光团的信号。
120.权利要求119的反应混合物，其中所述发信号探针是分子信标探针。
121. 权利要求119的反应混合物，其中所述发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光染料之间包含靶标结合区和非结合区。
122.用于分析样品中的至少一个单链核酸靶标序列的单相测定方法，包括
(a) 形成权利要求112-121中任一项的反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；
(b) 在一定的温度范围下检测来自所述发信号探针的所述荧光部分的荧光信号；和
(c) 作为温度的函数分析所述探针对与所述至少一个靶标序列的杂交。
123. 试剂盒或反应混合物，包含：
(a) 用于扩增来自样品核酸的靶标核酸的引物；和
(b) 三个或更多个探针对，各探针组包含：(i) 用荧光部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 用非荧光猝灭剂部分标记和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的猝灭探针；
其中探针组的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上是连续的；
其中至少所述探针对属于第一有色组，和至少一个所述探针对属于第二有色组；和
其中第二有色组的探针对的杂交序列间插入第一有色组的两个探针对和/或与其连续。
124.用于分析至少一个样品核酸的单相测定方法，包括：
(a) 形成权利要求123的反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；
(b) 用所述引物扩增所述样品核酸以产生靶标核酸；
(c) 在一定的温度范围下检测来自所述发信号探针的所述荧光部分的荧光信号；和
(d) 作为温度的函数分析所述探针对与所述至少一个靶标序列的杂交。
125.反应混合物，包含：
(a) 靶标核酸；
(b) 多个探针对的第一有色组，各探针对包含：(i) 与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补和包含第一荧光部分的发信号探针，和(ii) 与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补和包含猝灭剂部分的猝灭探针；其中第一有色组的探针对的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上是连续的；和
(c) 多个探针对的第二有色组，各探针对包含：(i) 包含具有与所述第一荧光部分不同的激发/发射光谱的第二荧光部分和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 包含猝灭剂部分和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的猝灭探针；其中第一有色组的各探针对的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上是连续的；
其中来自所述第一有色组的第一探针对的杂交序列和来自所述第一有色组的第二探针对的杂交序列间插有来自第二有色组的至少一个探针对和/或同时与其连续。
126.权利要求125的反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭。
127.权利要求125的反应混合物，其中发信号探针和猝灭探针与它们特定的杂交序列充分互补以允许在测定条件下杂交。
128.权利要求125的反应混合物，其中靶标核酸是单链的。
129.权利要求125的反应混合物，其中对于各探针对，发信号探针与靶标核酸的解链温度高于猝灭探针与靶标序列的解链温度。
130.权利要求125的反应混合物，其中所述发信号探针是自猝灭探针，其包含非荧光猝灭剂，当发信号探针未杂交至靶标时减少来自荧光团的信号。
131.权利要求130的反应混合物，其中所述发信号探针是分子信标探针。
132.权利要求130的反应混合物，其中所述发信号探针在非荧光猝灭剂和荧光染料之间包含靶标结合区和非结合区。
133.权利要求125的反应混合物，其中靶标核酸包含结核分枝杆菌核酸序列。
134.权利要求133的反应混合物，其中靶标核酸包含pncA基因的一部分。
135. 权利要求134的反应混合物，其中探针核酸序列选自SEQ ID NO: 65-102。
136.权利要求125的反应混合物，进一步包含：
(d) 多个探针对的第三有色组，各探针对包含：(i) 包含具有与所述第一荧光部分和所述第二荧光部分不同的激发/发射光谱的第三荧光部分和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 包含猝灭剂部分和与所述靶标核酸内的特定杂交序列互补的猝灭探针；其中第三有色组的各探针对的发信号探针和猝灭剂探针的杂交序列在所述靶标核酸上是连续的；
其中来自所述第三有色组的第一探针对的杂交序列和来自所述第三有色组的第二探针对的杂交序列间插有来自第一或第二有色组的至少一个探针对和/或同时与其连续。
137.权利要求136的反应混合物，其中靶标核酸包含结核分枝杆菌核酸序列。
138.权利要求137的反应混合物，其中靶标核酸包含pncA基因的一部分。
139. 权利要求134的反应混合物，其中探针的核酸序列包含与选自SEQ ID NO: 65-102的核酸序列至少70%序列同一性。
140. 权利要求139的反应混合物，其中探针包含与由SEQ ID NO: 65-102组成的组至少70%序列同一性。
141. 权利要求140的反应混合物，其中探针选自SEQ ID NO: 65-102。
142.权利要求的反应混合物，进一步包含用于扩增来自样品核酸的所述靶标核酸的引物。
143.权利要求的反应混合物，其中所述引物包含适合于LATE-PCR的过量引物和有限引物。
144.用于分析至少一个样品核酸的单相测定方法，包括：
(a) 形成权利要求125-143中任一项的反应混合物，其中对于各探针对的探针，当发信号探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射背景信号，其中当发信号探针结合至靶标序列但猝灭剂探针未结合至靶标序列时自发信号探针发射高于背景的信号，其中当发信号探针和猝灭剂探针两者均结合至靶标序列时来自发信号探针的信号被非荧光猝灭剂猝灭；
(b) 在一定的温度范围下检测来自所述发信号探针的所述荧光部分的荧光信号；和
(c) 作为温度的函数分析所述探针对与所述至少一个靶标序列的杂交。
145.反应混合物，包含：
(a) 第一靶标核酸序列；
(b) 第二靶标核酸序列；
(b) 探针对的第一有色组，第一有色组的各探针对包含：(i) 包含第一荧光部分和与所述第一靶标核酸序列或所述第二靶标核酸序列内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 包含猝灭剂部分和与特定杂交序列互补的猝灭探针，所述杂交序列与探针对的发信号探针的特定杂交序列连续；和
(c) 探针对的第二有色组，第二有色组的各探针对包含：(i) 包含具有来自所述第一荧光部分的激发/发射光谱的第二荧光部分和与所述第一靶标核酸序列或所述第二靶标核酸序列内的特定杂交序列互补的发信号探针，和(ii) 包含猝灭剂部分和与特定杂交序列互补的猝灭探针，所述杂交序列与探针对的发信号探针的特定杂交序列连续；
其中来自所述第一有色组和所述第二有色组的每一个的至少一个探针对的杂交序列在所述第一个靶标核酸序列内，和其中来自所述第一有色组和所述第二有色组的每一个的至少一个探针对的杂交序列在所述第二靶标核酸序列内。
146.权利要求145的反应混合物，其中所述有色组的每一个包含三个或更多个探针对。
147.反应混合物，包含：
(a) 靶标核酸；
(b) 核酸探针的第一有色组，其中的探针与靶标核酸内的杂交序列互补；其中第一有色组包含三个或更多个探针对，其中各探针对包含用第一荧光团标记的发信号探针和用猝灭剂部分标记的猝灭探针；和其中各探针对的发信号探针和猝灭探针在靶标核酸上是连续的；和
(c) 核酸探针的第二有色组，其中的探针与靶标核酸内的杂交序列互补；其中第二有色组包含三个或更多个探针对，其中各探针对包含用第二荧光团标记的发信号探针和用猝灭剂部分标记的猝灭探针；和其中各探针对的发信号探针和猝灭探针在靶标核酸上是连续的；
其中来自第一有色组的至少一个探针对的杂交序列间插入来自第二有色组的两个探针对的特定杂交序列并与其连续。
148.权利要求147的反应混合物，进一步包含：
(d) 核酸探针的第三有色组，其中的探针与靶标核酸内的杂交序列互补；其中第三有色组包含三个或更多个探针对，其中各探针对包含用第三荧光团标记的发信号探针和用猝灭剂部分标记的猝灭探针；和其中各探针对的发信号探针和猝灭探针在靶标核酸上是连续的；
其中来自第三有色组的至少一个探针对的杂交序列间插入来自第二有色组或第一有色组的两个探针对的特定杂交序列并与其连续。
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