JP5863162B2 - 標的核酸の検出方法 - Google Patents
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Description
G1SKF;5’CTGCCCGAATTYGTAAATGA 3’ 5’Alexa Fluor488標識(緑) 配列番号1
G1SKR;5’CCAACCCARCCATTRTACA 3’ 配列番号2
G1SKF_R;5’TCATTTACRAATTCGGGCAG 3’ 3’BHQ-1標識 配列番号3
G2SKF;5’CNTGGGAGGGCGATCGCAA 3’ 5’Alexa Fluor594標識(赤) 配列番号4
G2SKR;5’CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT 3’ 配列番号5
G2SKF_R;5’TTGCGATCGCCCTCCCANG 3’ 3’BHQ-2標識 配列番号6
SV-F21:5’ANTAGTGTTTGARATGGAGGG 3’ 5’Alexa Fluor532標識(黄) 配列番号7
SV-R2;5’GWGGGRTCAACMCCWGGTGG 3’ 配列番号8
SV-F21_R;5’CCCTCCATYTCAAACACTANT 3’ 3’BHQ-1標識 配列番号9
AC1’;5’ATGGCTAGCAAGTCTGACAAG 3’ 5’Alexa Fluor350標識(青) 配列番号10
AC230;5’GGTTTTGGTCCTGTGACACC 3’ 配列番号11
AC1’_R;5’CTTGTCAGACTTGCTAGCCAT 3’ 3’BHQ-0標識 配列番号12
G1F3;5’CCRGGNTGGCARGCNATGTT 3’ 配列番号13
G1B3(GISKR);5’CCAACCCARCCATTRTACA 3’ 配列番号14
G1FIP1;5’CATTTACGAATTCGGGCAGGTTTTCGCTGGATGCGNTTCCATGA 3’ 配列番号15
G1FIP2;5’CATTTACAAAATTCGGGCAGGTTTTCGCTGGATGCGNTTCCATGA 3’ 配列番号16
G1BIP1;5’GATGGCGTCTAAGGACGCTTTTAGCTGTRTTTGCCTCTGGWAC 3’ 配列番号17
G1BIP2;5’GATGGCGTCTAAGGACGCTTTTAGCWGTATTAACCTCCGGYAC 3’ 配列番号18
G1BIP3;5’GATGGCGTCTAAGGACGCTTTTAGCTGYAYTAACCTCTGGAAC 3’ 配列番号19
G1LF1;5’AGATYGCGATCYCCTGTCCA 3’ 5’Alexa Fluor 488標識(緑) 配列番号20
G1LF2;5’AGATTGCGATCTCCTGCCCA 3’ 5’ Alexa Fluor 488標識(緑) 配列番号21
G1LF3;5’AGCTCGCGGTCTCCTGTCCA 3’ 5’ Alexa Fluor 488標識(緑) 配列番号22
G1LF_R;5’TGGRCAGGRGAYCGCRAKCT 3’ 3’BHQ-1標識 配列番号23
G2F3;5’GGNMTGGANTTTTAYGTGCCMAG 3’ 配列番号24
G2B3(G2SKR);5’CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT 3’ 配列番号25
G2FIP1;5’GGGAGCMAGATTGCGATCGCTTTTGAGBCNATGTTYAGRTGGAT 3’ 配列番号26
G2FIP2;5’GGGAGCMAGATTGCGATCGCTTTTGAGCCCATGTTCAGRTGGAT 3’ 配列番号27
G2FIP3;5’GGGAGCGAGATTGCGATCGCTTTTGAGTCAATGTTYAGGTGGAT 3’ 配列番号28
G2FIP4;5’GGGAGCGAGATTGCGATCGCTTTTGAGCCYATGTTYAGGTGGAT 3’ 配列番号29
G2FIP5;5’GGGAGCMAGATTGCGATCGCTTTTGAACCWATGTTYAGGTGGAT 3’ 配列番号30
G2BIP1;5’TGTGAATGAAGATGGCGTCGTTTTCTCATTRTTRVTCTCTGGBACGAG 3’配列番号31
G2BIP2;5’TGTGAATGAAGATGGCGTCGTTTTCTCATTRTTGCYCTCTGGYACGAG 3’配列番号32
G2BIP3;5’TGTGAATGAAGATGGCGTCGTTTTCTCATTGTTGAYCTCTGGKACGAG 3’配列番号33
G2BIP4;5’TGTGAATGAAGATGGCGTCGTTTTCTCATTRTTACTTTCTGGCACGAG 3’配列番号34
G2LF1;5’GTGCTCARATCWGARAACCTC 3’ 5’Alexa Fluor 594標識(赤) 配列番号35
G2LF2;5’GTGCTGAGGTCWGARAATCTC 3’ 5’Alexa Fluor 594標識(赤) 配列番号36
G2LF3;5’GTGCTCAAATCTGAGAATCTC 3’ 5’Alexa Fluor 594標識(赤) 配列番号37
G2LF4;5’GTGCTCAAGTCTGAGAAYCTC 3’ 5’Alexa Fluor 594標識(赤) 配列番号38
G2LF_R;5’GAGRTTYTCWGAYYTSAGCAC 3’ 3’BHQ-2標識 配列番号39
2 (標的核酸Bに対する)プライマーb
3 オリゴヌクレオチドa
4 オリゴヌクレオチドb
5 蛍光物質a
6 蛍光物質b
7 クエンチャーa
8 クエンチャーb
9 DNA又はRNAから逆転写反応により生成したcDNA(標的核酸A又はB)
10 1本鎖化したDNA、又は逆転写反応により生成した1本鎖のcDNA
11 増幅した2本鎖DNA
15 照射機器
20 蛍光物質標識工程
21 増幅工程
22 反応工程
23 検出・識別工程
31 (標的核酸Aに対する)プライマーa
32 (標的核酸Bに対する)プライマーb
Claims (7)
- 検出しようとする少なくとも1種類の標的核酸の種類ごとに、添加する標的核酸増幅用のプライマーに対して、検出用の異なる蛍光物質を標識する蛍光物質標識工程と、
標的核酸の種類ごとに、標的核酸を増幅させる方法に応じた前記標的核酸増幅用の、前記蛍光標識されたプライマーを添加して、少なくとも1種類の標的核酸を同時に増幅させる増幅工程と、を備える標的核酸の検出方法において、
前記増幅させた標的核酸増幅液に、前記蛍光物質を標識したプライマーと相補配列を有するクエンチャーを標識したオリゴヌクレオチドを添加させて反応させる反応工程と、前記反応後の標的核酸増幅液にあらかじめ定められた波長域の光を照射し、前記照射により蛍光物質から発せられた蛍光から増幅した標的核酸を検出し、前記蛍光の色から標的核酸を識別する検出・識別工程と、を含む工程からなることを特徴とする標的核酸の検出方法。 - 前記プライマーに標識する蛍光物質が、前記プライマー配列の5’末端又は鎖内に標識されることを特徴とする請求項1に記載の標的核酸の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチドに標識されたクエンチャーが、前記オリゴヌクレオチドの配列の5’末端、3’末端又は鎖内に標識された、前記蛍光物質から発せられる蛍光を消光する消光物質であることを特徴とする請求項1又は2に記載の標的核酸の検出方法。
- 前記照射光の波長域が300〜800nmであることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。
- 少なくとも1種類の標的核酸を同時に増幅させる工程が、プライマーを用いて標的核酸を増幅させる方法であればいずれの増幅方法でもよいことを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。
- 標的核酸の種類ごとに対応させる上流側及び/又は下流側プライマーそれぞれの5’末端に、標的核酸の種類ごとに異なる蛍光物質を標識させた、同じ配列からなるオリゴヌクレオチドを連結させることを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。
- 複数の蛍光物質から発せられた蛍光によって目視で確認できる色が混色となっている場合に、カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンを添加することによって、混色を構成している複数の蛍光物質の中で一部の意図した蛍光物質からの緑色の蛍光色を消光させることを特徴とする請求項1乃至6のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。
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