JP2004511227A - 核酸の同種内検出用の特異的二本鎖プローブおよびその適用方法 - Google Patents
核酸の同種内検出用の特異的二本鎖プローブおよびその適用方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、同種間での(homogeneous)特異的な核酸検出(リアルタイム検出を含む)のための新規プローブに関する。
【0002】
発明の背景
従来からある異種間での(heterogeneous)核酸検出法は、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしてないプローブとを分離することを要するが、新規同種間での方法は、この分離ステップがなく、より一層迅速、簡単かつ定量的である。種々の核酸増幅技術が開発され、かつ2−3時間のうちに核酸の特定の配列が数百万コピー増幅され得る。しかし、主なゲル電気泳動分析は、臨床診断における広範な適用には限界がある。最近、これらの増幅技術(特にPCR)と同種間での検出の組み合わせは、核酸に基づく診断を大いに進歩させた。その結果、定量的リアルタイムPCRアッセイが益々汎用されるようになった。
【0003】
現在のリアルタイム蛍光PCRアッセイは、プローブ式と非プローブ式とに分類することができる。プローブ式アッセイは、蛍光団プローブ(例えば、5’エキソヌクレアーゼ(TaqMan(商標))プローブ、分子ビーコン、蛍光エネルギー転移プローブ、スコーピオンプローブ、ライトアッププローブなど)を利用する。非プローブ式アッセイは、反応を示す蛍光色素(例えば、SYBR Green Iなど)を利用する。非プローブ式は、単純であるが、非特異的増幅を識別することができないため適用がかなり制限されることが知られている。比較すると、第2認識ステップを有するプローブ式は、信頼度がより一層高い。しかし、上述のような現存するプローブは全て、設計および合成が難しく、かつ高価である。また、特異性に限界があることも現存するプローブの不利な点である。分子ビーコンは、最も特異性のあるプローブであるといわれているが、それでも、1ヌクレオチドミスマッチを識別するためには修飾を要する場合がある。
【0004】
本発明は、核酸検出用の同種間での特異的な新規プローブに関する。このプローブは、現存するプローブとは異なる概念に基づいている。設計が単純で、調製が簡単で、低コストで、極めて特異性が高く、かつ最新の核酸増幅技法のいずれとも組合わせることができるものである。
【0005】
本発明の二本鎖プローブを用いたアッセイは、現存するプローブを用いた場合の直接ハイブリダイゼーションではなくオリゴヌクレオチド間での競合反応に基づく。この新規プローブは、現存するプローブよりかなり単純に得ることができるだけでなく、現存するプローブに対して多くの利点を有している。
【0006】
発明の概要
本発明は、核酸検出用の特別に設計されたプローブおよび適用に関する。該プローブは、同種間での形式で核酸を特異的に検出できる。プローブは、長さの異なる2つの相補的オリゴヌクレオチドからなっており、これらのうちの一方は蛍光団で、もう一方は消光団または蛍光受容体で標識されている。適切な条件下では、プローブは二本鎖を形成している。プローブの一方の鎖が標的にハイブリダイズすると、蛍光団が蛍光変化を生ずる。ある実施形態では、室温で完全にマッチする標的を特異的に認識することができるが、1塩基ミスマッチを含む「標的」とは反応し得ない。本発明のプローブをリアルタイム核酸増幅検出アッセイに用いることができる。
【0007】
本発明のプローブは、DNA、RNA、またはこれら2つの混合物を含み得る。これらは、非天然型ヌクレオチドおよび非天然型ヌクレオチド結合を含んでよい。3’末端は伸長を避けるためにブロックされていてもよい。プローブの「オリゴヌクレオチド」という用語は、上記のものを含むことを意味する。
【0008】
本発明は、二本鎖プローブを用いるアッセイにも関する。一本鎖標的のみが存在する本発明のハイブリダイゼーションアッセイは、上記プローブを含む。二本鎖標的が存在するアッセイ(典型的なPCR増幅など)は、長さの等しい相補的オリゴヌクレオチドを有する二本鎖プローブも含んでよい。
【0009】
発明の説明
二本鎖プローブの構成
本発明の二本鎖プローブは、長さの異なる相補的な2つのオリゴヌクレオチドからなる。1つの鎖は蛍光団で標識されており、他方の鎖は消光団で標識されている。あまり好ましくない実施形態ではあるが、蛍光消光団を蛍光団の蛍光受容体に置き換えてもよい。二本鎖プローブは、異なる条件下で異なる構造を有し得、かつこれは蛍光変化に反映される。安定な二本鎖構造で自己ハイブリダイズすると、蛍光団と消光団または蛍光エネルギー供与体と受容体は接近する。蛍光団またはエネルギー供与体は、消光団またはエネルギー受容体によって消光され、プローブは蛍光団またはエネルギー供与体の発光波長における蛍光を発しない。酸性、塩基性、または高温溶液中などの変性条件下では、プローブの長い方の鎖が標的に自発的に結合し、プローブの2本鎖は分離され、蛍光団(またはエネルギー供与体)が蛍光を発する。ハイブリダイゼーション溶液中に標的が存在すると、プローブの長い方の鎖が標的に自発的に結合し、二本鎖プローブは解離して、蛍光団(またはエネルギー供与体)が蛍光を発する。
【0010】
二本鎖プローブと標的との自発的な反応
各鎖の長さが異なる二本鎖プローブは、溶液中で一本鎖オリゴヌクレオチドと自発的に反応することができる。この反応では、二本鎖プローブの短い鎖は、標的オリゴヌクレオチド配列によって置換されて、熱力学的により安定な二重鎖を形成する。その結果、二本鎖プローブの解離が起こり、蛍光が増大する。この反応において、二本鎖プローブが簡単に設計される実施形態は、室温で1ヌクレオチドミスマッチ標的と完全にマッチする標的とを識別できる能力を有する。この極めて高い特異性は、プローブ自体の二本鎖の自己反応に比較すると、ミスマッチの認識はあまりよくないという事実にある。一本鎖プローブは熱力学的に不安定であり、かつミスマッチが存在しても他の一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るので、二本鎖プローブの方が一本鎖プローブより優れている。分子ビーコンは、より安定性の低いミスマッチ反応と競合し得ない(out−compete)、安定なステムループ構造のために、直線状のプローブより特異性が高い。しかし、分子ビーコンの認識部分であるループは一本鎖であり、ステムが十分に長くないかまたはループ配列が長すぎる場合、ミスマッチハイブリダイゼーションを起こす可能性がある。これは、分子ビーコンが、周知の等温核酸増幅技術であるNASBAと組合わせて1ヌクレオチドの識別に直接使用できないという最近の報告からも分かる。
【0011】
図1において、二本鎖プローブ1は、長さの異なる2つの相補的オリゴヌクレオチド2および3からなる。長い方の鎖、図1の場合プラス鎖2は、蛍光団4で標識されており、短い方のマイナス鎖3は消光団5で標識されている。蛍光団と消光団が近接しているためにプローブは蛍光を発しない。標的6が存在すると、マイナス鎖3は標的によって置換され、蛍光団4が離れて蛍光を発する。蛍光団4と消光団5が交換されても、蛍光が得られるであろう。
【0012】
二本鎖プローブと核酸増幅との組み合わせ
上述のように、本発明の二本鎖プローブは、一本鎖標的と自発的に反応し得る。本発明者らは、リアルタイム形式における新規に形成される一本鎖アンプリコンを用いて検出できることも発見した。高温変性、低温アニーリングおよび中間温度での伸長を含む典型的PCRサイクルの際、二本鎖プローブを、変性(または解離)ステップの際に変性させて、蛍光を生じさせる。アニーリングステップの際、標的の非存在下で、プローブの2本の鎖は二本鎖立体構造を取り、非蛍光性となるであろう。しかし、標的の存在下で、2つのプローブ鎖は標的とハイブリダイズする。結果として蛍光が生ずる。伸長ステップの際、プローブ鎖は標的を除去する。PCR反応の各アニーリングステップの際の蛍光を測定することにより、増幅をリアルタイム形式で追跡することができる。
【0013】
アニーリングの段階で、このプローブは、標的の非存在下で自己アニーリングを起こし、非蛍光性になることがあり得る。しかし、標的の存在下では、プローブの蛍光標識鎖(ここでは、プラス鎖という)は、マイナス鎖から解離して、標的に結合し、蛍光を生ずる。プライマーの伸長を可能にするために温度を上昇させると(72℃)、プローブの二本鎖は標的から解離して、鎖の伸長を干渉しない。サイクル毎のアニーリング段階での蛍光強度を測定することにより、リアルタイム形式でのPCRが追跡できる。
【0014】
図2において、二本鎖プローブ21および二本鎖アンプリコン30が示されているが、両方とも中間(intermediate)PCRサイクルの際にPCR増幅反応液内に存在する。プローブ21は、蛍光団24で標識された鎖22および消光団25で標識された相補鎖23を含む。標識は、鎖の平滑末端にお用いる。示しているように、鎖22および23は長さが同じであり、リアルタイムPCRに使用できるが必ず必要なわけではない。アンプリコン30は、相補鎖31、32を含む。高温での変性の際には、プローブの鎖22、23は、アンプリコンの鎖31、32と同様に分離する。(PCRプライマーのアニーリングのために)温度をアニーリング温度まで下げると、プローブ鎖22、23が、アンプリコンの相補的標的鎖31、32にアニールまたはハイブリダイズする。蛍光団24は、消光団25によって消光されないので、蛍光を発する。
【0015】
二本鎖プローブの設計
二本鎖の相対的長さ:多くの場合、プローブの二本鎖は、長さが異なり、通常は、長い方の鎖は、PCR用では短い方の鎖より1〜5塩基長く、対立遺伝子の等温識別用では2〜10、好ましくは2〜7塩基長い。本発明のアッセイにおけるある実施形態では、RNA検出に使用される二本鎖プローブまたはリアルタイムPCRに使用される二本鎖プローブのように、標的のプラス鎖およびマイナス鎖の両方が競合してプローブ鎖にハイブリダイズする。これらの鎖は、長さは等しくてよい。
【0016】
二本鎖プローブの標識の位置:蛍光団および消光団は末端または内部にある塩基上に存在してよい。好ましい実施形態では、これらは二本鎖の向き合った末端相補的塩基上に存在する。特に好ましい実施形態では、蛍光団と消光団の両方とも、プローブの平滑末端部に存在する。場合によっては、特にプローブが蛍光エネルギー転移供与体および受容体で標識されている場合には、標識の部位は、最適エネルギー転移によって調節するとよい。非限定的な好ましい実施形態では、蛍光エネルギー供与体と受容体は、両方の鎖の末端塩基上に標識されており、その一方は、通常、リン酸(phosphorate)基でブロックされている。
【0017】
二本鎖プローブの適切な装置:二本鎖プローブは、一般的な核酸増幅(特にPCR)と組合わせることができ、アンプリコンは、リアルタイム形式またはエンドポイント形式の両方の形式で測定できる。リアルタイム検出には、蛍光をアニーリング温度で測定する。現在利用可能な二本鎖プローブを用いるリアルタイム増幅/検出機器には、例えばModel7700およびModel5700(Applied Biosystems(ABI))、IQ Cycler(Bio−Rad)、LightCycler(Hoffmann−La Roche)、およびRotor−Gene 2000(Corbett Research)などがある。
【0018】
二本鎖プローブの利点
単純で簡単な設計:二本鎖プローブを設計するに際して、固有の反応系に対する追加的な要件がない。プローブ自体の設計は、現存する二重色素標識プローブまたは隣接ハイブリダイジングプローブに比べてかなり簡単である。本発明のプローブは、従来のプローブ設計を心得ている当業者であれば誰でも設計できる。
【0019】
経費効率のよい作成:二本鎖プローブの鎖の作成に含まれる標識方法は、1つの単一の色素修飾のみであり、いかなるDNA合成機でも達成でき他の技術は必要としない。精製は、1ステップだけでよい。この点は、複数の修飾ステップと精製ステップが必要とされ、最終的な収率が大幅に低下するために経費が嵩むプローブ鎖の他の二重色素修飾またはプローブ鎖の内部修飾より優れている。
【0020】
高い特異性:構造的に制限されたプローブは、従来の直鎖状プローブより特異性が高いことが分子ビーコンによってすでに証明されている。この点では、二本鎖プローブは、構造的に制限されたプローブの1種である。プローブは、生成される自由エネルギーが二本鎖プローブのものより大きいときにのみ、標的に結合することができる。標的に変異がある場合、二本鎖プローブは、熱力学的に好ましくない反応を起こさないで自体の二本鎖状態を維持する。
【0021】
実施例1
二本鎖プローブとその標的との自発的な反応
1.5mM MgCl2含有10mM Tris−HCl(pH8.0)に溶解した0.80μMの二本鎖プローブ50μLを25℃に保ち、蛍光をEclipseスペクトロフルオロメーター(Varian)で経時的にモニターした。蛍光強度は、25℃2分でまず測定した。2倍モル濃度(16μM溶液5μL)の標的オリゴヌクレオチドを加え、15秒感覚で蛍光レベルを記録した。2つのプローブ鎖のヌクレオチド配列は5’−FAM−ACGAACCTCAAACAGACACCAT−3’(長い方の鎖)および5’−TGTCTGTTTGAGGTTGCT−dabcyl−3’(短い方の鎖)である。長い方の鎖の相補的標的は、5’−CCATGGTGTCTGTTTgAGGTTGCT−3’であり、1ヌクレオチド置換を含む標的(ミスマッチ標的)は、5’−CCATGGTGTCTGTTTcAGGTTGCT−3’(小文字は、ヌクレオチド置換部分)であった。
【0022】
図3は、完全に相補的な標的(ライン41)およびミスマッチ標的(ライン42)の両方に対して経時的に観察した蛍光(F)を示す。20倍以上の蛍光が得られたことがわかる。標的内に1ヌクレオチドのミスマッチがあると、蛍光は観察されない。
【0023】
実施例2
ヒトβ − グロビンの二本鎖プローブとのリアルタイム PCR 検出
PCRアッセイでリアルタイムアンプリコン検出体としての二本鎖プローブの有用性を調べるために、段階希釈した標的を用いたPCR増幅を行った。反応溶液50μLは、テンプレートを順次希釈した希釈溶液5μL、0.2M二本鎖プローブ、各プライマー0.4μM、Taqポリメラーゼ2.0ユニット、各デオキシリボヌクレオシド三リン酸200μM、50mM KCl、2.0mM MgCl2および10mM Tris−HCl(pH8.3)を含む。密封反応管に入れて蛍光サーマルサイクラー(Rotor−Gene2000、Corbett Research)で94℃で5分変性させた後、増幅サイクル(95℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 1分)を40回行った。アニーリング段階での蛍光を記録した。元の抽出ヒトDNAを10倍ずつに段階希釈し、テンプレートとして用いた。コントロールサンプルはテンプレートの代わりに水にした。二本鎖プローブは、標的からなるアンプリコンに相補的な核酸配列を含む。簡略化のためにここでは「標的に相補的である」というが、増幅および検出に精通した当業者は、「標的」という用語が、元の一本鎖標的およびその相補鎖の両方、指数関数的なPCR増幅においてコピーされた両方の鎖を意味することが理解できよう。ヒトβ−グロビン遺伝子(GenBank コード番号HuMMB5E、−195〜+73)の268塩基対からなる断片を増幅した。フォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ5’−GAAGAGCCAAGGACAGGTAC−3’および5’−CAACTTCATCCACGTTCACC−3’とした。プローブの標的配列は、アンプリコンの真中部分に位置するようにした。プローブのプラス鎖およびマイナス鎖は、5’−FAM−AGCAACCTCAAACAGACACCATGG−PO4−3’および5’−GGTGTCTGTTTGAGGTTGCT−dabcyl−3’とした。
【0024】
40サイクル以上のPCR増幅で測定した蛍光(F)のリアルタイム検出の結果を図4に示す。標的が最高濃度であるライン51から最低濃度であるライン54へと最初の標的濃度を段階的に希釈していった。ライン55は、標的なし(水)のコントロールを示す。
【0025】
二本鎖プローブは、プライマーと同様の濃度で存在する場合、標的鎖は迅速に反応できる。標的に反応しなかったプローブの画分は、互いに迅速に会合して自らの蛍光を消す。したがって、これらはリアルタイム核酸増幅アッセイに利用できる。ヒトβ−グロビン遺伝子の検出のためのPCRアッセイでは、プライマーの解離温度(Tm)に近い解離温度を有する20ヌクレオチドのマイナス鎖を選び、約10℃高い温度で解離するプローブ標的ハイブリッドを得るために、24ヌクレオチドのプラス鎖を選んだ。本明細書中では、このプローブを「24/20プローブ」という。アニーリング段階では、このプローブは、標的が存在しないと、自己アニーリングを起こし、蛍光を発しない。しかし、標的が存在すると、プローブのプラス鎖は、マイナス鎖から解離して標的に結合し、蛍光を発する。プライマーの伸長が可能な温度(72℃)まで温度を上昇させると、プローブの2本の鎖は標的から解離して、鎖の伸長を干渉しない。
【0026】
異なる長さの二本鎖プローブ11種(22/22〜22/17、および20/20〜20/16)について調べたところ、両方の鎖の長さが等しい2つのプローブ両方ともを含む、全てがリアルタイムPCRアッセイで機能した。これらの知見は、リアルタイムPCRに対する二本鎖プローブの設計における柔軟性が大きいことを示す。
【0027】
実施例3
リアルタイム PCR における突然変異検出
リアルタイムPCRによる1ヌクレオチド変異の検出における本発明のプローブの有用性について示すために、ヒトβ−グロビン遺伝子から、互いに1ヌクレオチド置換により相違がある2つのDNAテンプレート(標的)を調製した。また、「野生型」標的に相補的な二本鎖プローブおよび「変異型」標的に相補的な二本鎖プローブを作成した。該プローブは、プローブ−標的ハイブリッドは、典型的なPCRアニーリング温度(約50℃)より約10℃高く、かつTaqDNAポリメラーゼ伸長反応に好適な温度(約72℃)より約10℃低い温度で解離するように設計した。プローブは24/20プローブ(24ヌクレオチド長のプラス鎖と、これより4ヌクレオチド長いマイナス鎖からなるもの)で行った。野生型標的に相補的なプローブをFAMで標識した;変異型標的に相補的なプローブはテキサスレッド(Texas Red)で標識した。双方とも、ダブシル(dabcyl)消光剤を有している。双方ともプローブの伸長を避けるためブロッキングしておいた。蛍光団それぞれは、発光スペクトルが異なるので、区別して検出することができる。両方の二本鎖プローブの存在下でPCR反応を4回実施した。これらの反応は、増幅可能は標的が異なるものであった:標的なし(ネガティブ)、野生型標的のみ(野生型)、変異型標的のみ(変異型)、および野生型および変異型標的(野生型+変異型)。
【0028】
ヒトβ−グロビン遺伝子の野生型配列に特異的なプローブのプラス鎖は、24merの配列:
FAM−5’−AGCAACCTcAAACAGACACCATGG−3’−PO3、および
プローブのマイナス鎖は、20merの配列:
5’−ATGGTGTCTGTTTgAGGTTGCT−3’−dabcylとした。
【0029】
β−グロビンの変異型に特異的なプローブの2つの鎖は、
Texas Red−5’−AGCAACCTgAAACAGACACCATGG−3’−PO3 、および
5’−ATGGTGTCTGTTTcAGGTTGCT−3’−dabcylとした。各プローブの2本の鎖を、反応混合液に添加する前に、互いにアニーリングさせた。野生型および変異型のβ−グロビン遺伝子に対応するDNAテンプレートはin vitro突然変異誘発法により調製した。リアルタイムPCRのプライマーは:
5’−GAAGAGCCAAGGACAGGTAC−3’、および
5’−CAACTTCATCCACGTTCACC−3’とした。反応液50μlはそれぞれ、テンプレート5000コピー、プライマー0.4μM、各プローブのプラス鎖0.2μMおよびマイナス鎖0.24μM、MgCl2 4.0mM、ならびにPCRに必要な他の一般的な成分を含むものとした。反応混合物を94℃で5分インキュベートした後、95℃30秒、50℃60秒、および72℃1分の熱サイクルプロファイルを、蛍光サーマルサイクラーにて実施した。アニーリングステップの際の蛍光をモニターした。PCRサイクル数に対するのリアルタイムの蛍光の結果を図5に示す。野生型標的に対するプローブからの蛍光を黒丸(黒点)で示す。変異型標的に対する蛍光を白丸で示す。
【0030】
陰性サンプルでは、野生型プローブ(曲線71)または変異型プローブ(曲線72)のいずれからも蛍光は得られなかった。その結果から、テンプレートが反応液中に含まれている場合のみ、蛍光が増大することが示された。サンプル中に両方の標的が存在すると、野生型プローブ(曲線73)および変異型プローブ(曲線74)の両方から顕著に蛍光が増大していた。しかし、野生型標的では、野生型プローブ(曲線75)から顕著に蛍光が増大したが変異型プローブ(曲線76)からの増大はなかった。そして、逆に、変異型標的では、変異型プローブ(曲線78)から顕著に蛍光が増大したが野生型プローブ(曲線77)からの増大はなかった。この結果は、マッチプローブのみが正しいシグナルを生成することを示している。野生型テンプレートと変異型テンプレートとの識別は完全(すなわち、100%)であった。このことは、本発明のプローブは、単一ヌクレオチド相違する標的間の識別が可能であることを証明している。テンプレートがない場合シグナルが全く認められず、2つのテンプレートが存在する場合は、2つのシグナルが認められた。
【0031】
二本鎖プローブが単一ヌクレオチド変異を識別できる温度「範囲(window)」を調べた。分子ビーコンは温度範囲が、直鎖条プローブより大きいので、より識別には優れていると文献には記されている。にもかかわらず、分子ビーコンの温度範囲は低温での識別を可能とするには十分ではないことが判っていた。このことは、分子ビーコンが等温での対立遺伝子を識別はできなかったとの報告を説明するものである。本発明の二本鎖プローブはより広い温度範囲を有しているので、等温増幅反応における識別にこれらが適切であることは確実であることが本発明者らにより見出された。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、二本鎖プローブとその作用原理の模式図である。
【図2】
図2は、変性およびアニーリング段階でのPCR検出における二本鎖プローブの作用原理の模式図である。
【図3】
図3は、完全にマッチする標的および1ヌクレオチドミスマッチ標的と二本鎖プローブとの反応キネティクスを示す。
【図4】
図4は、二本鎖プローブを用いたリアルタイムPCR検出を示す。上から下に、テンプレートは10倍ずつの希釈系列であり、最後は水である。
【図5】
図5は、同一の反応容器内で野生型標的に相補的な二本鎖プローブと変異を有する標的に相補的な二本鎖プローブを用いたリアルタイムPCRでの二本鎖プローブによる1ヌクレオチド変異の検出を示す。
Claims (15)
- 所定の核酸標的配列に対する二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブであって、
標的核酸に完全に相補的な第1配列を含む第1オリゴヌクレオチド、
第1配列に相補的であって第1配列より短くその差が10ヌクレオチド長以下である第2配列を含む、第2オリゴヌクレオチド、
第1および第2オリゴヌクレオチドのうちの一方に結合した蛍光団標識、ならびに
消光団および蛍光受容体からなる群より選択される第2標識であって、上記第1および第2オリゴヌクレオチドのうちのもう一方に結合している、オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズすると上記蛍光団標識と相互作用するもの、
を含む、上記二本鎖プローブ。 - 第1および第2オリゴヌクレオチドがハイブリダイズして二本鎖平滑末端を形成し、、蛍光団標識と上記第2標識が該平滑末端に結合していることを特徴とする、請求項1記載の二本鎖プローブ。
- 第1および第2オリゴヌクレオチドの3’末端が、ポリメラーゼによる伸長がブロックされていることを特徴とする、請求項1または2記載の二本鎖プローブ。
- 第1および第2オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が少なくとも1つの非天然型ヌクレオチドまたは少なくとも1つの非天然型ヌクレオチド結合を含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の二本鎖プローブ。
- 標的配列に対する二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイゼーションプローブとして用いることを含み、該二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブが、
標的配列に完全に相補的な第1配列を含む第1オリゴヌクレオチド、
第1配列に相補的な第2配列を含む第2オリゴヌクレオチド、
第1および第2オリゴヌクレオチドのうち一方に結合した蛍光団標識、ならびに、
該第1および第2オリゴヌクレオチドのうちの他方に結合した消光団および蛍光受容体からなる群から選択される第2標識であって、オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズすると上記蛍光団標識と相互作用するもの、
を含むものであることを特徴とする、蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブによって標的アンプリコンが検出されるリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。 - 上記第1および第2オリゴヌクレオチドがハイブリダイズして二本鎖平滑末端を形成し、蛍光団標識と第2標識が該平滑末端に結合していることを特徴とする、請求項5記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
- 上記第1および第2オリゴヌクレオチドの3’末端が、ポリメラーゼによる伸長がブロックされていることを特徴とする、請求項5または6記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
- 上記第1および第2オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、少なくとも1つの非天然型ヌクレオチドまたは少なくとも1つの非天然型ヌクレオチド結合を含む、請求項5〜7のいずれか1項記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
- 上記第2配列が上記第1配列より短く、その差が10ヌクレオチド長以下である、請求項5〜8のいずれか1項記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
- 対立遺伝子標的配列それぞれに対するアンプリコンがこれに相補的な蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブによって検出されるリアルタイム核酸標的配列増幅検出法であって、標的配列の少なくとも2つは少なくとも1ヌクレオチド異なる対立遺伝子であり、かつ、各ハイブリダイゼーションプローブがその対立遺伝子標的配列に対する二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブであり、該二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブが、
対立標的配列に完全に相補的な第1配列を含む第1オリゴヌクレオチド、
第1配列に相補的な第2配列を含む第2オリゴヌクレオチド、
第1および第2オリゴヌクレオチドのうちの一方に結合した蛍光団標識、
該第1および第2オリゴヌクレオチドのうちのもう一方に結合した消光団であって、オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズすると上記蛍光団と該消光団とで消光する関係にあるもの、
を含むものであり、
二本鎖プローブの各蛍光団標識が区別して検出されることを特徴とする、リアルタイム核酸標的配列増幅検出法。 - 各二本鎖プローブの第2配列が、該プローブの第1配列より短く、その差が10ヌクレオチド長以下である、請求項10記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
- 各プローブの第1および第2ヌクレオチドがハイブリダイズして二本鎖平滑末端を形成し、該平滑末端に蛍光団標識および消光団標識が結合しているものである、請求項10または11記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
- 該プローブの第1オリゴヌクレオチドおよび第2オリゴヌクレオチドの3’末端が、ポリメラーゼによる伸長がブロックされていることを特徴とする、請求項10〜12のいずれか1項記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
- 少なくとも1つのプローブの第1および第2のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、少なくとも1つの非天然型ヌクレオチドまたは少なくとも1つの非天然型ヌクレオチド結合を含むものである、請求項10〜13のいずれか1項記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
- 標的配列を含むと考えられるサンプルに請求項1〜4のいずれか1項記載のプローブを添加して蛍光の変化を測定することを特徴とする、核酸標的配列を検出するアッセイ方法。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008501679A (ja) * | 2004-06-02 | 2008-01-24 | エーエスエム サイエンティフィック, インコーポレイテッド | 2’−ニトロベンジル改変型リボヌクレオチド |
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JP2015524670A (ja) * | 2012-08-16 | 2015-08-27 | エヌブイエス テクノロジーズ,インコーポレイティド | アッセイ方法及び系 |
WO2017138484A1 (ja) | 2016-02-09 | 2017-08-17 | 栄研化学株式会社 | 標的核酸を検出する方法およびそれに用いる核酸プローブ |
WO2020095657A1 (ja) * | 2018-11-09 | 2020-05-14 | 横河電機株式会社 | 核酸配列計測用デバイス |
Families Citing this family (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1348096A (zh) * | 2000-10-10 | 2002-05-08 | 栾国彦 | 一种均相特异性检测核酸的探针及应用方法 |
US9261460B2 (en) * | 2002-03-12 | 2016-02-16 | Enzo Life Sciences, Inc. | Real-time nucleic acid detection processes and compositions |
CN1294276C (zh) * | 2003-07-22 | 2007-01-10 | 厦门大学 | 检测核酸的等长双链特异性探针 |
US20070111207A1 (en) * | 2003-07-30 | 2007-05-17 | Interite Inc. | Partially double stranded nucleic acid molecules |
ATE557100T1 (de) | 2003-12-03 | 2012-05-15 | Abbott Lab | Doppelsträngige lineare nukleinsäuresonde und deren verwendung |
AU2005218507A1 (en) * | 2004-02-28 | 2005-09-15 | Chang-Ning J. Wang | Nucleic acid complexes |
DE102004026494A1 (de) * | 2004-05-27 | 2005-12-22 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Hochselektiver Nachweis von DNA-Molekülen mit gemischten PNA-DNA-Systemen |
GB0419325D0 (en) * | 2004-09-01 | 2004-09-29 | Perkinelmer Ltd | A method of analysing a sample including fluorescent labels and apparatus therefor |
GB0510979D0 (en) | 2005-05-28 | 2005-07-06 | Kbiosciences Ltd | Detection system for PCR assay |
US11001881B2 (en) | 2006-08-24 | 2021-05-11 | California Institute Of Technology | Methods for detecting analytes |
WO2007143669A2 (en) | 2006-06-05 | 2007-12-13 | California Institute Of Technology | Real time micro arrays |
US7972786B2 (en) * | 2006-07-07 | 2011-07-05 | Brandeis University | Detection and analysis of influenza virus |
US8048626B2 (en) | 2006-07-28 | 2011-11-01 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
US11525156B2 (en) | 2006-07-28 | 2022-12-13 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
US11560588B2 (en) | 2006-08-24 | 2023-01-24 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
EP1911852B1 (en) * | 2006-10-12 | 2009-07-29 | Bio-Rad Pasteur | Double-stranded probes for the fluorescent detection of nucleic acids |
JP5013604B2 (ja) * | 2007-07-24 | 2012-08-29 | 株式会社スギヨ | 海藻ペーストの製造方法及びその方法によって得られた海藻ペースト |
WO2010130877A2 (en) * | 2009-05-12 | 2010-11-18 | Abacus Diagnostica Oy | Method for detecting nucleic acids |
CN101845498B (zh) * | 2010-04-29 | 2013-05-08 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 一种用于核酸特异识别检测的探针 |
DE102010025161A1 (de) * | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Qiagen Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Ribonukleinsäuren |
US20120052502A1 (en) * | 2010-08-30 | 2012-03-01 | Samsung Techwin Co., Ltd. | Real-time pcr detection using stabilized probes |
EP3144396B1 (en) | 2010-10-27 | 2020-01-01 | President and Fellows of Harvard College | Methods of use of toehold hairpin primer |
US9796748B2 (en) | 2011-05-02 | 2017-10-24 | President And Fellows Of Harvard College | Spatial sequestration of dynamic nucleic acid circuits |
US9644231B2 (en) | 2011-05-09 | 2017-05-09 | Fluidigm Corporation | Nucleic acid detection using probes |
WO2012154876A1 (en) | 2011-05-09 | 2012-11-15 | Fluidigm Corporation | Probe based nucleic acid detection |
DE102011078342A1 (de) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | Aj Innuscreen Gmbh | Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit |
WO2015023677A1 (en) * | 2013-08-12 | 2015-02-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Amplification reporter with base-pairing oligomers |
JP5928906B2 (ja) * | 2013-08-27 | 2016-06-01 | 横河電機株式会社 | 核酸配列計測方法、核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測用デバイスの製造方法および核酸配列計測装置 |
CN106103818A (zh) * | 2013-12-16 | 2016-11-09 | 威廉马歇莱思大学 | 精细调节的超特异性核酸杂交探针 |
CN108026580A (zh) * | 2015-03-19 | 2018-05-11 | 康代思锐公司 | 用于核酸检测的被编码的双链探针及其用途 |
US9708647B2 (en) | 2015-03-23 | 2017-07-18 | Insilixa, Inc. | Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays |
US9499861B1 (en) | 2015-09-10 | 2016-11-22 | Insilixa, Inc. | Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification |
CN105506126B (zh) * | 2016-01-12 | 2019-02-26 | 重庆大学 | 具有较大张力的小环形核苷酸探针及其制备方法和应用 |
WO2017155858A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Insilixa, Inc. | Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension |
JP6584986B2 (ja) * | 2016-03-18 | 2019-10-02 | 株式会社東芝 | 核酸検出方法 |
CN109415772A (zh) | 2016-06-16 | 2019-03-01 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 检测鼠伤寒沙门氏菌的方法 |
GB201617491D0 (en) * | 2016-10-14 | 2016-11-30 | Moorlodge Biotech Ventures Limited | Amplification of nucleic acids |
CN107236815A (zh) * | 2017-07-18 | 2017-10-10 | 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 | 用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法 |
KR101899371B1 (ko) * | 2017-07-25 | 2018-10-29 | (주)엔바이오텍 | 핵산 복합체 페어, 핵산 복합체 페어를 포함하는 pcr용 키트, 및 핵산 복합체 페어를 이용한 타겟 검출 방법 |
CN109652516A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-19 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种双链寡核苷酸核酸探针的结构和用途 |
EP3937780A4 (en) | 2019-03-14 | 2022-12-07 | InSilixa, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR TIMED FLUORESCENCE-BASED DETECTION |
WO2022132955A2 (en) * | 2020-12-16 | 2022-06-23 | Proof Diagnostics, Inc. | Coronavirus rapid diagnostics |
WO2023023673A2 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Kasa Bio, L.L.C. | Compositions and methods for multiplex detection of mirna and other polynucelotides |
EP4148143A1 (en) * | 2021-09-13 | 2023-03-15 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (CSIC) | Polypurine reverse hoogsteen hairpins and parallel clamps and their use as biosensors |
WO2023164252A1 (en) * | 2022-02-28 | 2023-08-31 | Trustees Of Boston University | Isothermal nucleic acid detection assays and uses thereof |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1190838A (en) | 1981-07-17 | 1985-07-23 | Cavit Akin | Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer |
US4766062A (en) | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor |
DE3688965T2 (de) | 1985-05-02 | 1994-03-24 | Genetics Inst | Verfahren und aufbau einer nukleinsäure zur erzeugung von reagenzienkomplexen zur verwendung bei der bestimmung von zielnukleotidsequenzen. |
CA1273552A (en) | 1985-12-23 | 1990-09-04 | Michael J. Heller | Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays |
ATE88761T1 (de) | 1986-01-10 | 1993-05-15 | Amoco Corp | Kompetitiver homogener test. |
EP0601889A2 (en) | 1992-12-10 | 1994-06-15 | Maine Medical Center Research Institute | Nucleic acid probes |
US5925517A (en) * | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
JP4071277B2 (ja) * | 1993-11-12 | 2008-04-02 | ピーエイチアールアイ・プロパティーズ・インコーポレーテッド | 核酸検出用ハイブリダイゼーションプローブ、共通ステム、方法およびキット |
WO1996034983A1 (en) * | 1995-05-05 | 1996-11-07 | The Perkin-Elmer Corporation | Methods and reagents for combined pcr amplification and hybridization probing assay |
US5716784A (en) | 1996-02-05 | 1998-02-10 | The Perkin-Elmer Corporation | Fluorescence detection assay for homogeneous PCR hybridization systems |
ATE309387T1 (de) * | 1996-03-01 | 2005-11-15 | Du Pont | Methode zur vervielfältigung und zum nachweis eines gewünschten nukleinsäurefragments |
EP0892808B1 (en) | 1996-04-12 | 2008-05-14 | PHRI Properties, Inc. | Detection probes, kits and assays |
US7803528B1 (en) * | 1997-02-28 | 2010-09-28 | Quest Diagnostics Incorporated | Fluorescence energy transfer by competitive hybridization |
US6361942B1 (en) * | 1998-03-24 | 2002-03-26 | Boston Probes, Inc. | Method, kits and compositions pertaining to detection complexes |
GB9819417D0 (en) * | 1998-09-07 | 1998-10-28 | Secr Defence | Reaction method |
US6277607B1 (en) | 1999-05-24 | 2001-08-21 | Sanjay Tyagi | High specificity primers, amplification methods and kits |
CN1348096A (zh) | 2000-10-10 | 2002-05-08 | 栾国彦 | 一种均相特异性检测核酸的探针及应用方法 |
US6593091B2 (en) * | 2001-09-24 | 2003-07-15 | Beckman Coulter, Inc. | Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer |
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Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008501679A (ja) * | 2004-06-02 | 2008-01-24 | エーエスエム サイエンティフィック, インコーポレイテッド | 2’−ニトロベンジル改変型リボヌクレオチド |
JP2012095665A (ja) * | 2004-06-02 | 2012-05-24 | Twistdx Inc | 2’−ニトロベンジル改変型リボヌクレオチド |
WO2013065574A1 (ja) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | 栄研化学株式会社 | 標的核酸の検出法 |
KR20140091562A (ko) | 2011-10-31 | 2014-07-21 | 에이껜 가가꾸 가부시끼가이샤 | 표적 핵산의 검출법 |
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JP2015524670A (ja) * | 2012-08-16 | 2015-08-27 | エヌブイエス テクノロジーズ,インコーポレイティド | アッセイ方法及び系 |
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---|---|---|
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