DE102004026494A1

DE102004026494A1 - Hochselektiver Nachweis von DNA-Molekülen mit gemischten PNA-DNA-Systemen

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Publication number: DE102004026494A1
Application number: DE200410026494
Authority: DE
Inventors: Markus Prof. Dr. Sauer; Nicole Dr. Marmé; Jens-Peter Dr. Knemeyer; Jürgen Prof. Dr. Wolfrum
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2004-05-27
Publication date: 2005-12-22

Abstract

Zum Nachweis eines Nukleinsäure-Moleküls (108) vorgegebener Sequenz wird ein komplementäres PNA-Oligomer (100) synthetisiert, das mit einem Farbstoff (102) angefärbt ist. Ferner wird ein gegenüber dem nachzuweisenden Nukleinsäure-Molekül (108) punktmutiertes DNA-Oligonukleotid (104) synthesiert. An dieses ist ein Quencher (106) gekoppelt, der den Farbstoff (102) löscht, wenn das PNA- und das DNA-Oligonukleotid eine Doppelhelix bilden. Wird das nachzuweisende Nukleinsäure-Molekül (108) mit der Doppelhelix in Lösung gemischt, verdrängt sie das DNA-Oligonukleotid (104) aus der Doppelhelix. Der Farbstoff (102) wird dann nicht mehr durch den Quencher (106) gelöscht. Der Anstieg des Fluoreszenz-Signals ist ein Hinweis auf die Menge des nachzuweisenden Nukleinsäure-Moleküls.

Description

Gebiet der Erfindung
Der Nachweis von DNA-Molekülen spielt eine zentrale Rolle in der Molekularbiologie, Biotechnologie und medizinischen Diagnostik. Zu speziellen Anwendungen gehören unter anderem die medizinische Früherkennung einer bakteriellen oder viralen Infektion, die Forensik, die Frühdiagnose eines genetischen Fehlers sowie die Diskriminierung zwischen ähnlichen Organismen und Allelen.

In den letztgenannten Anwendungsfeldern kommt es häufig auf den Nachweis von Punktmutationen an, also auf den Nachweis der Veränderung einer einzigen Nukleobase. Dies spielt auch eine große Rolle bei der Diagnostik von Antibiotika-Resistenzen und tumorassoziierten Translokationen.

Das nachzuweisende DNA-, RNA- oder Nukleinsäure-Molekül wird dabei häufig als Target bezeichnet, die zum Nachweis verwendeten Moleküle als Sonden.

Bisherige DNA-Nachweisverfahren, die zwischen Punktmutationen unterscheiden können, lassen sich grob unterteilen in Verfahren, die PCR (Polymerase Chain Reaction) verwenden und in solche, die ohne die PCR auskommen.

Nachweisverfahren, die PCR verwenden:

(1) TDI-assay (template directed dye terminator incorporation) [X Chen, YP Kwork; Nucleic Acids Res., 25, 137–353, 1997]: Bei diesem Verfahren werden Punktmutationen durch den Einbau eines Farbstoff-markierten Triphosphates angezeigt. Zusammen mit einem Farbstoff an einem markierten Primer der PCR-Reaktion kommt es zu FRET (Fluoreszenz Resonanz Energie-Transfer), was einen Fluoreszenznachweis ermöglicht.
(2) TagMan assay [PM Holland, DR Abramos, R watson, HD Gelfand; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7276-7280, 1991]: Hier wird eine zweifach markierte Sonde, die FRET ermöglicht, eingesetzt. Die Sonde wird während der PCR durch die Polymerase zerschnitten und der FRET wird aufgehoben. Aus der Abnahme der Fluoreszenz lässt sich auf die DNA schließen.
(3) LDR (ligase detection reaction) [X Chen, KJ Livak, YP Kwok; Genome Res. 8, 549–556, 1998]: Beim LDR-Verfahren wird die PCR mit dem Einsatz eines weiteren Enzyms, einer Ligase, kombiniert. Die Ligase kann zwei Oligonukleotide miteinander verknüpfen, wenn diese direkt nebeneinander auf einem DNA-Strang hybridisiert sind. Es werden zwei Oligonukleotide verwendet, die mit zwei Farbstoffen markiert sind, so dass durch die Verknüpfung die Möglichkeit des FRET eröffnet wird.

Nachweisverfahren, die die DNA-Sequenz direkt nachweisen, ohne PCR zu verwenden:

(4) Eine Ligase kann auch zum Trennen eines DNA-Stranges verwendet werden, wenn dieser an die entsprechende Gegensequenz hybridisiert wird und eine Fehlpaarung aufweist. Uber das Zerschneiden einer doppelt markierten Sonde kann somit eine Fehlpaarung nachgewiesen werden [MB wabuyele, H Farquar, W Stryjewski, RP Hammer, SA Soper, YW Cheng and F Barany; JACS 125, 6937–6945, 2003].
(5) Ferner gibt es ein Verfahren, welches auf der enzymatischen Zersetzung einer fehlerhaften PNA-DNA Doppelhelix beruht [M Komiyama, S Ye, X Liang, Y Yamamoto, T Tomita, JM Zhou and H Aburatani; JACS 125, 3758–3762, 2003]. Hierzu wird eine PNA-Probe an die entsprechende Target-Sequenz hybridisiert und mit einem Interkalationsfarbstoff (DiSC₂(5)) versetzt. Interkaliert der Farbstoff, ändert er seine Farbe. Durch Zugabe eines Enzyms wird die Doppelhelix zerstört, falls sie eine Fehlpaarung aufgrund einer Punktmutation enthält. Hierdurch wird die Färbung wieder rückgängig gemacht.
(6) Molecular Beacons (MB) [S Tyagi, DP Bratu, FR Kramer; Nat. Biotechnol. 16, 49–53, 1998]: Bei den Molecular Beacons handelt es sich um Oligonukleotid-Sonden, die mit einem Farbstoff und einem Quencher markiert sind. Die MBs sind in der Lage, direkt die Anwesenheit einer bestimmten DNA-Sequenz anzuzeigen, ohne dass ein Enzym benötigt wird. Die MBs können allerdings nur zwischen einzelnen Fehlpaarungen (Punktmutationen) unterscheiden, wenn der Nachweistest in einem bestimmten Temperaturbereich (meistens bei ca. 50°C) ausgeführt wird.

Die oben unter (1)–(5) erwähnten Verfahren benötigen Enzyme.

Diese sind teuer und oft schwierig in der Handhabung. Die Verfahren gemäß (1)–(3) verwenden PCR, welche ebenfalls relativ teuer ist. Die Verfahren gemäß (1)–(4) und (6) werden bei hohen Temperaturen von über 50°C ausgeführt und sind somit in ihrem Einsatzgebiet eingeschränkt. Sie können z.B. nicht in lebenden Zellen eingesetzt werden. Das oben unter (5) erwähnte Verfahren ist sehr unempfindlich; die Nachweisgrenze liegt bei etwa 10^–6 Mol/l.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachweismöglichkeiten von DNA-Molekülen zu verbessern, insbesondere auch den Nachweis von kurzen DNA-Oligonukleotiden mit einer exakt vorgegebenen Sequenz oder einer Punktmutation.

Lösung Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Im folgenden werden einzelne Verfahrensschritte eines Verfahrens näher beschrieben. Die Schritte müssen nicht notwendigerweise in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden, und das Verfahren kann auch weitere, nicht genannte Schritte aufweisen.

Zum Nachweis eines Nukleinsäure-Moleküls mit einer vorgegebenen Sequenz wird wie folgt vorgegangen: Zunächst wird ein PNA-Oligomer bereitgestellt. PNA-Oligomere werden seit einigen Jahren intensiv untersucht [siehe z. B. Ray, A., Nroden, B.: Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future. FASEB J. 14, 1041–1060, 2000]. PNA steht für "peptide nucleic acid", ein Nukleinsäure-Analog, bei dem das Zucker-Phosphat-Rückgrat der natürlichen DNA durch ein synthetisches Peptid-Rückgrat ersetzt wurde. PNA-Moleküle sind ungeladen. Sie binden spezifisch an DNA oder RNA-Moleküle einer bestimmten Sequenz und bilden dabei sehr stabile Doppelhelix-Hybride.

Die Sequenz des PNA-Oligomers wird komplementär zur vorgegebenen Sequenz des nachzuweisenden Nukleinsäure-Moleküls gewählt, so dass das PNA-Oligomer und das nachzuweisende Nukleinsäure-Molekül hybridisieren können.

Zusätzlich wird ein DNA-Oligonukleotid bereitgestellt. Die Sequenz des DNA-Oligonukleotids wird derart gewählt, dass das DNA-Oligonukleotid mit dem PNA-Oligomer hybridisieren kann. Dies wird z. B. dadurch erreicht, dass die Sequenz des DNA-Oligonukleotids identisch zur Sequenz des nachzuweisenden Nukleinsäure-Moleküls gewählt wird. Aber auch Sequenzen, die gegenüber letzterem eine oder mehrere Punktmutationen aufweisen sind geeignet.

Sodann werden ein Fluorophor und ein Quencher-Molekül derart gewählt, dass das Quencher-Molekül die Lumineszenz des Fluorophors bei hinreichender räumlicher Nähe messbar verändern kann.

Mit Lumineszenz werden allgemein alle Arten der Lichtstreuung durch Moleküle bzw. Partikel bezeichnet, seien sie spontan, wie bei der Raman-Streuung, oder verzögert, wie bei der Fluoreszenz oder Phosphoreszenz. Im Folgenden wird ohne Beschränkung der Allgemeinheit lediglich die bevorzugte Ausführungsform, die Fluoreszenz, näher erläutert.

Typischerweise ist der Fluorophor ein Fluoreszenzfarbstoff, dessen Fluoreszenzintensität oder Fluoreszenzlebensdauer durch das Quencher-Molekül verringert wird.

Der Fluorophor wird in oder an das DNA-Oligonukleotid gebunden und das Quencher-Molekül in oder an das PNA-Oligomer oder umgekehrt.

Die Lage des Fluorophors bzw. des Quencher-Moleküls im jeweiligen Oligonukleotid und die Art der Bindung des Fluorophors bzw. des Quencher-Moleküls an das jeweilige Oligonukleotid werden derart gewählt, dass das Quencher-Molekül die Fluoreszenz des Fluorophors messbar verändert, wenn das derart präparierte DNA-Oligonukleotid und das derart präparierte PNA-Oligomer aneinander hybridisieren. Typischerweise werden Quencher und Molekül endständig an die Oligonukleotide gebunden, einer an das 3'-Ende des einen Oligonukleotids, der andere an das 5'-Ende des anderen Oligonukleotids, so dass sich Quencher und Fluorophor im hybridisierten Zustand beider Oligonukleotide in unmittelbarer räumlicher Nähe befinden. Aber auch nicht-endständige Lagen sind denkbar.

Nach diesen Vorbereitungsschritten werden das derart präparierte DNA-Oligonukleotid und das derart präparierte PNA-Oligomer in einer solchen Weise miteinander gemischt, dass sie aneinander hybridisieren, wodurch ein Doppelstrang gebildet wird und die Fluoreszenz verändert wird.

Anschließend wird der Doppelstrang mit dem nachzuweisenden Nukleinsäure-Molekül in einer Lösung gemischt. Als nachzuweisende Nukleinsäure-Moleküle kommen insbesondere DNA-Moleküle in be tracht, aber auch RNA- und PNA-Moleküle. Im Folgenden wird vorzugsweise von DNA-Molekülen gesprochen.

Die Bedingungen in der Lösung werden derart eingestellt, dass das nachzuweisende DNA-Molekül das DNA-Oligonukleotid kinetisch aus dem Doppelstrang verdrängt und einen neuen, zweiten Doppelstrang mit dem PNA-Oligomer bildet. Dies erfolgt u. a. schon allein durch die Einstellung eines Gleichgewichts zwischen dem Hybrid bestehend aus PNA und markierter DNA und dem Hybrid bestehend aus PNA und nachzuweisendem Nukleinsäure-Molekül.

Durch den Austausch des z. B. mit dem Quencher-Molekül markierten DNA-Oligonukleotids gegen das unmarkierte, nachzuweisende Nukleinsäure-Molekül kommt es zu einem Fluoreszenzanstieg bzw. einer Verlängerung der Fluoreszenzlebensdauer des Fluorophors. Das Vorhandensein des nachzuweisenden DNA-Moleküls kann daher über eine Änderung der Fluoreszenz des Fluorophors nachgewiesen werden.

Das Verfahren schafft einen schnellen und hochempfindlichen Nachweis von Punktmutationen im Wege eines kompetitiven Tests. Besonders vorteilhaft ist, dass das Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt werden kann. Es werden keine Enzyme oder PCR benötigt. In Verbindung mit der konfokalen Einzelmolekülspektroskopie wird eine hohe Nachweisempfindlichkeit (bis 10^–13 Mol/l) erreicht.

Das Nachweissystem kann auf Oberflächen (Chips) übertragen werden, auf denen die PNA- oder DNA-Oligomere immobilisiert werden.

Das geschilderte Verfahren beruht auf einer besonderen Eigenschaft von PNA-DNA-Doppelhelizes. Im Gegensatz zur DNA-DNA-Doppelhelix kann hier der DNA-Strang reversibel gegen einen an deren äquivalenten DNA-Strang innerhalb von Sekunden ausgetauscht werden. Dieser Austausch ist nur möglich bei einem PNA/DNA-Doppelstrang. DNA-Moleküle sind negativ geladen. Ein DNA-Doppelstrang ist daher stark negativ geladen. Der erste notwendige Schritt zum Austausch, die Annäherung eines weiteren DNA-Strangs, wird durch elektrostatische Abstoßungskräfte erschwert. Die PNA, hingegen, ist elektrisch neutral. Dadurch wird die elektrostatische Abstoßung vermindert.

Es kommt daher zu einem Austausch der DNA-Moleküle selbst dann, wenn das nachzuweisende DNA-Molekül und das präparierte DNA-Oligonukleotid identische Sequenzen haben.

Damit es zu einem noch effektiveren Austausch kommt, sollte die Doppelhelix aus PNA und nachzuweisender DNA thermodynamisch etwas stabiler sein als die Doppelhelix aus PNA und DNA-Oligonukleotid. Dies kann zum Beispiel durch den Einbau einer oder mehrerer Fehlpaarungen erreicht werden. Da Doppelhelizes aus PNA und DNA thermodynamisch sehr stabil sind, können sehr kurze Sequenzen bzw. Doppelhelizes für den Nachweis verwendet werden. Der PNA-Strang sollte mindestens eine Länge von 5 Basen besitzen. Vorzugsweise wird mit einer Länge von 8 bis 12 Basen gearbeitet.

Bei kurzen Sequenzen fällt eine einzelne Fehlpaarung relativ stark ins Gewicht. Gibt es eine Fehlpaarung zwischen dem PNA-Oligomer und dem DNA-Oligonukleotid, so tauscht die nachzuweisende Target-DNA, die bezogen auf das PNA-Oligomer keine Fehlpaarung zeigt, das DNA-Oligonukleotid innerhalb von Sekunden aus. Daher ist das geschilderte Verfahren besonders gut geeignet, hochempfindlich Punktmutationen nachzuweisen.

In der US 2002/0177136 A1 wird ebenfalls ein Nachweisverfahren für DNA-Moleküle basierend auf einer PNA-DNA-Doppelhelix be schrieben, bei dem das nachzuweisende DNA-Target allerdings nicht ein DNA-Oligonukleotid sondern ein PNA-Oligomer aus einer PNA-DNA-Doppelhelix austauscht, um eine DNA-DNA-Doppelhelix zu bilden. Der Nachweis der Bindung erfolgt dabei durch das relativ unempfindliche teilweise Verringern eines Fluoreszenz-Signals aufgrund von Fluoreszenz-Löschung, nicht durch das Einschalten der Fluoreszenz. Aufgrund der geringeren Stabilität der während des Nachweises zu bildenden DNA-DNA-Doppelhelix werden relativ lange Oligonukleotide eingesetzt (17–25 DNA-Basen), um die nötige erhöhte Stabilität im Vergleich zur aufzulösenden PNA-DNA-Doppelhelix zu erreichen. Dadurch ist die Eignung für den Nachweis von Punktmutationen verringert.

Als klassische Quencher können beispielsweise DABCYL (4,4-Dimethylaminoazobenzol-4'-Carbonsäure) oder Black Hole Quencher (BHQ) dienen. Die Strukturformel der beiden geläufigsten BHQs, BHQ-3 (1A) und BHQ-2 (1B), ist in 1 gezeigt. Gezeigt sind jeweils die Aktivester, die zur Kopplung eingesetzt werden können.

Als Fluorophor eignen sich zahlreiche Farbstoffe, z. B. Carbocyanine (z. B. Cy5), Oxazine (z. B. MR121 [M. Sauer, J. Arden-Jacob, K. H. Drexhage, F. Göbel, U. Lieberwirth, K. Mühlegger, R. Müller, J. Wolfrum, C. Zander (1998) Time-resolved identification of individual mononucleotide molecules in aqueous solution with pulsed semiconductor lasers, Bioimaging 6, 14–24.] [M. Sauer, K. H. Drexhage, U. Lieberwirth, R. Müller, S. Nord, C. Zander (1998) Dynamics of electron-transfer reactions between xanthene dyes and DNA nucleotides monitored on the single molecule level, Chem. Phys. Lett. 284, 153–163.]) oder Rhodamine (z. B. Tetramethyl-Rhodamin).

Es können auch zwei Farbstoffe unter Ausnutzung von FRET (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) oder Dimerbildung als Quencher und Fluorophor verwendet werden.

Da es auch Fluoreszenzfarbstoffe gibt, die durch die Nukleobase Guanosin gelöscht werden (siehe z. B. WO 01/36668 A1), kann auch die DNA oder PNA selbst bzw. darin enthaltenes Guanosin als Quencher dienen. Als Fluorophor eignen sich dann z. B. Rhodamin- und Phenoxazin-Farbstoffe. Letztere sind gut koppelbar und photostabil. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes von Rhodamin- oder Phenoxazin-Farbstoffen besteht darin, dass als Anregungslichtquelle für eine Fluoreszenzdetektion kleine und billige Diodenlaser eingesetzt werden können.

Wird Guanosin als Quencher verwendet, so ergeben sich zwei Varianten:
In der ersten Variante ist der Farbstoff an das PNA-Oligomer gekoppelt. Dieses hat kein Guanosin in der Nähe des Farbstoffs. Dafür enthält das DNA-Oligonukleotid Guanosin an einem Ort, der in der Nähe des Farbstoffs ist, wenn das DNA-Oligonukleotid an das PNA-Oligomer hybridisiert ist. Die Sequenz der nachzuweisenden DNA muss derart sein, dass sie kein Guanosin an der entsprechenden Stelle wie beim DNA-Oligonukleotid hat. Es bietet sich daher an, dass das Guanosin gerade die Punktmutation des DNA-Oligonukleotids ggü. dem nachzuweisenden DNA-Molekül ist.

In der zweiten, bevorzugten Variante ist der Farbstoff an das DNA-Oligonukleotid gekoppelt. In diesem Fall hat das PNA-Oligomer ein Guanosin in der Nähe des Farbstoffs, wenn PNA- und DNA-Oligonukleotid aneinander hybridisiert sind. Das DNA-Oligonukleotid hat kein Guanosin in der Nähe des Farbstoffs. Wird das DNA-Oligonukleotid durch Austausch gegen die nachzuweisende DNA freigesetzt, so wird der Farbstoff am DNA-Oligonukleotid nicht mehr durch das Guanosin in der PNA gelöscht.

Eine weitere Möglichkeit, das Gleichgewicht zwischen dem Hybrid aus PNA-Oligomer und DNA-Oligonukleotid einerseits und PNA-Oligomer und nachzuweisendem Nukleinsäure-Molekül andererseits zugunsten des nachzuweisenden Nukleinsäure-Moleküls und damit des Austausches zu verbessern, besteht darin, dass das PNA-Oligomer zwei Bereiche aufweist: einen ersten Bereich (306) dessen Sequenz komplementär zur vorgegebenen Sequenz des nachzuweisenden Nukleinsäure-Moleküls (108, 214, 314) gewählt wird, und einen zweiten Bereich (302), an den das DNA-Oligonukleotid (204, 310) hybridisieren kann. Die Sequenz des zweiten Bereichs wird dazu derart gewählt, dass die durch die Hybridisierung des DNA-Oligonukleotids und des zweiten Bereichs des PNA-Oligomers gebildete Doppelhelix weniger stabil ist als die durch die Hybridisierung des DNA-Oligonukleotids und des ersten Bereichs des PNA-Oligomers gebildete Doppelhelix. Wenn das DNA-Oligonukleotid im ersten Bereich hybridisiert ist die Fluoreszenz gelöscht oder verringert, wenn es im zweiten Bereich hybridisiert dagegen nicht.

Auf diese Weise wird für das DNA-Oligonukleotid eine zweite Hybridisierungsmöglichkeit geschaffen, die das Gleichgewicht zugunsten des Austausches verschiebt und damit die Nachweisgeschwindigkeit erhöht.

Durch den zweiten Bereich des PNA-Oligomers wird dem auszutauschenden DNA-Stück vorzugsweise eine etwas instabilere Hybridisierungsmöglichkeit geschaffen, so dass auf Fehlpaarungen im ersten Bereich verzichtet werden kann.

Eine Vereinfachung des Nachweisverfahrens wird dadurch erreicht, dass das PNA-Oligomer und das DNA-Oligonukleotid über ein weiteres Molekül (Verbindungsstück) aneinander gekoppelt werden. Sie bilden damit eine einheitliche Sonde, d. h. zu jedem PNA-Stück befindet sich immer genau ein DNA-Stück in dessen Nähe. Das Verbindungsstück kann durch einen gemischten PNA-DNA-Strang gebildet werden, wobei das Verbindungsstück sowohl aus DNA als auch aus PNA bestehen kann. Die beiden einzelnen Stränge können aber auch durch andere Linker miteinander verbunden werden. Durch die Verbindung zwischen beiden Strängen erhöht sich je nach Länge des Verbindungsstücks die Stabilität der Doppelhelix aus PNA- und DNA-Oligonukleotid erheblich. Aus diesem Grunde muss die Stabilität durch mehrere Fehlpaarungen soweit herabgesetzt werden, dass es zu einem effektiven Austausch durch das nachzuweisende Nukleinsäure-Molekül kommen kann.

Um auch DNA-Targets nachweisen zu können, die in einen Doppelstrang eingebunden sind, werden vorteilhafterweise als Lösung, in der der Doppelstrang mit dem nachzuweisenden DNA-Molekül gemischt wird, denaturierende Puffer eingesetzt. In derartigen Puffern sind DNA-DNA-Doppelhelizes nicht stabil, wohl aber PNA-DNA-Doppelhelizes. Durch die denaturierenden Puffer wird das DNA-Target ohne Erhitzen aus der Doppelhelix befreit und kann dann an die PNA hybridisieren.

Geeignete Denaturierungsmittel sind z. B. Detergenzien wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Natriumdiisobutylsulfosuccinat (SDIBSS) oder Natriumtetradecylsulfat (STDS). Besonders vorteilhaft sind Glycerin-haltige Puffer, in denen PNA und DNA besonders gut aneinander hybridisieren, nicht jedoch DNA-Doppelstränge.

Ferner wird die Aufgabe durch eine Nukleinsäure-Sonde – sowie deren Verwendung – und einen zugehörigen Kit gelöst, mit deren Hilfe das geschilderte Nachweis-Verfahren durchgeführt werden kann. Die Merkmale der Nukleinsäure-Sonde finden sich in den auf die Nukleinsäure-Sonde gerichteten Ansprüchen. Entsprechendes gilt für den Kit.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Beispiele beschränkt. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche oder funktionsgleiche bzw. hinsichtlich ihrer Funktionen einander entsprechende Elemente. Im Einzelnen zeigt:
1A die Strukturformel von BHQ-3;
1B die Strukturformel von BHQ-2;
2 eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform des Nachweisverfahrens;
3 eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform des Nachweisverfahrens;
4 eine schematische Darstellung der bevorzugten Ausführungsform des Nachweisverfahrens; und
5 beispielhaft eine Messung mit den in 2 gezeigten Molekülen.
In den Figuren bezeichnen die Buchstaben A, C, G und T die Nukleoside Adenosin, Cytidin, Guanosin und Thymidin. Die unterstrichenen Nukleoside gehören zu den PNA-Oligomeren.
Die für das Nachweisverfahren benötigten Oligonukleotide und Nukleinsäure-Sonden können mit üblichen Verfahren synthetisiert werden. Die Synthese von PNA-Olionukleotiden ist beispielsweise in [Ray, A., Nroden, B.: Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future. FASEB J. 14, 1041–1060 (2000)] beschrieben.
Die Synthese von DNA-Oligonukleotiden ist weit verbreitet. Sie kann auf entsprechenden Synthesizern durchgeführt werden.
Die Farbstoffe und Quencher-Moleküle können prinzipiell sowohl an das 3'-Ende als auch an das 5'-Ende des Oligonukleotids gekoppelt werden. Hierzu stehen u. a. die folgenden Möglichkeiten zur Verfügung:

(a) Modifikation eines Endes des Oligonukleotids mit einer Aminfunktion, z. B. durch einen C6-Aminolinker, und anschließende Ankopplung des Farbstoffs an das modifizierte Ende über eine aktivierte Carboxylfunktion [Greg T. Hermanson: "Bioconjugate techniques", Academic Press, 1996].
(b) Synthetischer Einbau eines aminomodifizierten Nukleotids beim Aufbau des Oligonukleotids, z. B. in einem Synthesizer, und anschließende Ankopplung des Farbstoffs an das aminomodifizierte Nukleotid über eine aktivierte Carboxylfunktion [Greg T. Hermanson: "Bioconjugate techniques", Academic Press, 1996].
(c) Synthetischer Einbau des Farbstoffs als Phosphoramidit während der Oligonukleotid-Synthese [Greg T. Hermanson: "Bioconjugate techniques", Academic Press, 1996].

PNA kann standardmäßig mit Lysin- oder Cystein-Resten käuflich erworben werden und ist somit der Standard-Kopplungschemie zugänglich [siehe z. B. Greg T. Hermanson: "Bioconjugate techniques", Academic Press, 1996].
2 zeigt das PNA-Oligomer 100, an dessen einem Ende das Farbstoffmolekül (Dye) 102 gekoppelt ist. An dem PNA-Oligomer 100 hybridisiert ein DNA-Oligonukleotid 104. An dem DNA-Oligonukleotid 104 ist ein Quencher (Q) 106 gekoppelt. Im hybridisierten Zustand des PNA-Oligomers 100 und des DNA-Oligonukleotids 104 liegen der Farbstoff 102 und der Quencher 106 in unmittelbarer Nachbarschaft. Der Quencher 106 löscht in dieser Konstellation die Fluoreszenz des Farbstoffs 102.
Der aus dem PNA-Oligomer 100 und dem DNA-Oligonukleotid 104 gebildete Doppelstrang weist an dem Nukleosid Cytidin 107 eine Fehlpaarung auf.
Um zu gewährleisten, dass möglichst viele PNA-Oligomere 100 mit einem Quencher-markierten DNA-Oligonukleotid 104 besetzt sind, müssen die DNA-Oligonukleotide 104 im Überschuss vorliegen. Es muss also stets der Quencher 106 im Überschuss vorliegen.
Der solcherart vorbereitete Doppelstrang wird in einer Glycerin-haltigen Lösung gelöst. Diese Lösung wird in eine Küvette gefüllt und im Strahlengang eines Fluoreszenz-Spektrometers platziert.
Anschließend wird die Lösung mit der Probe gemischt, die möglicherweise das nachzuweisende DNA-Molekül 108 enthält. Dieses ist gegenüber dem DNA-Oligonukleotid 104 an dem Nukleosid Guanosin 110 punktmutiert.
Da das nachzuweisende DNA-Molekül 108 mit dem PNA-Oligomer 100 ein stabileres Hybrid bildet, als das DNA-Oligonukleotid 104, wird letzteres durch das nachzuweisende DNA-Molekül 108 aus der Doppelhelix mit dem PNA-Oligomer 100 verdrängt bzw. ausgetauscht. Es ergibt sich eine Doppelhelix aus PNA-Oligomer 100 und nachzuweisendem DNA-Molekül 108. In in dieser Doppelhelix ist der Farbstoff 102 nicht mehr in unmittelbarer Nachbarschaft zum Quencher 106. Der Farbstoff 102 wird daher in seiner Fluo reszenz nicht mehr durch den Quencher 106 gelöscht. Dies lässt sich durch einen Anstieg der Fluoreszenz mit dem Fluoreszenz-Spektrometer nachweisen.
Der Quencher 106 kann auch an das PNA-Oligomer 100 gekoppelt sein. In einem solchen Fall fängt jedoch das PNA-Oligomer 100 die nachzuweisende DNA 108 ab, ohne dass es zu einem nennenswerten Fluoreszenzanstieg kommt. Daher wird vorteilhafterweise der Quencher 106 an das DNA-Oligonukleotid 104 gekoppelt und dieses im Überschuss zugesetzt. Das DNA-Oligonukleotid 104 fängt dann weitestgehend alle PNA-Oligomere 100 ab. Jeder Austausch eines DNA-Oligonukleotids 104 durch ein nachzuweisendes Nukleinsäure-Molekül 108 führt dann zu einem Fluoreszenzanstieg. Daher wird vorzugsweise der Farbstoff 102 an das PNA-Oligomer 100 gekoppelt.
3 zeigt eine Nukleinsäure-Sonde 200 mit einem PNA-Abschnitt 202, einem DNA-Abschnitt 204 und einem aus DNA-Nukleotiden gebildeten Schleifenabschnitt 206. An den PNA-Abschnitt ist ein Farbstoff-Molekül (Dye) 208 gekoppelt und an den DNA-Abschnitt 204 ein Quencher-Molekül 210. Die Nukleinsäure-Sonde 200 ist in sich selbst zurückgefaltet. Der PNA-Abschnitt 202 und der DNA-Abschnitt 204 hybridisieren aneinander. Sie weisen dabei eine Fehlpaarung bei dem Nukleosid Cytidin 212 auf.
Wie im Zusammenhang mit 2 geschildert, wird die Nukleinsäure-Sonde 200 mit dem nachzuweisenden DNA-Molekül 214 gemischt. Letzteres tauscht den DNA-Abschnitt 204 in der PNA-DNA-Doppelhelix aus. Dies beendet die Fluoreszenzlöschung des Farbstoffs 208, was nachgewiesen werden kann.
4 zeigt eine Nukleinsäure-Sonde 300 ähnlich der Nukleinsäure-Sonde 200 gemäß 3. Die in 4 gezeigte Nuklein säure-Sonde weist jedoch zusätzlich einen zweiten PNA-Abschnitt 302 auf, der sich über einen Spacer 304 an der ersten PNA-Abschnitt 306 anschließt. Der erste PNA-Abschnitt 306 entspricht dem PNA-Abschnitt 202 gemäß 3. Der zweite PNA-Abschnitt 302 weist gegenüber dem ersten PNA-Abschnitt 306 eine Punktmutation 308 auf.
Ferner hat die Nukleinsäure-Sonde 300 einen DNA-Abschnitt 310, der an dem ersten PNA-Abschnitt 306 – bei einer Fehlpaarung 312 – hybridisiert.
Wird das nachzuweisende DNA-Molekül 314 mit der Nukleinsäure-Sonde in einer Glycerin-haltigen Lösung gemischt, so hybridisiert es ohne Fehlpaarung an dem ersten PNA-Abschnitt 306. Der DNA-Abschnitt 310 hybridisiert mit zwei Fehlpaarungen 308 und 312 am zweiten PNA-Abschnitt 302.
Dadurch ist die unmittelbare Nachbarschaft zwischen dem Quencher 210 und dem Farbstoff 208 aufgehoben. Der daraus resultierende Fluoreszenzanstieg kann nachgewiesen werden.
5 zeigt beispielhaft eine Messung mit den in 2 gezeigten Molekülen.
Das PNA-Oligomer 100, das als Farbstoff 102 das Carbocyanine Cy5 trägt, und das DNA-Oligonukleotid 104, an das als Quencher BHQ-3 (siehe 1A) gekoppelt ist, werden miteinander gemischt. Die Konzentration des PNA-Oligomers 100 beträgt 1 × 10^–7 Mol/l, die Konzentration des DNA-Oligonukleotids 104 beträgt 3 × 10^–7 Mol/l. Die Abbildung zeigt die gemessene Fluoreszenzintensität dieses Systems bei einer Emissionswellenlänge von 690 nm in Abhängigkeit von der Zeit. Die Anregungswellenlänge beträgt 640 nm.
Nach 6,5 Minuten wird das nachzuweisende Nukleinsäure-Molekül 108 in einer Konzentration von 2 × 10^–7 Mol/l zugegeben. Innerhalb von 2 Minuten steigt die gemessene Fluoreszenzintensität um das 10-fache an (schwarze Linie, 510).
Die graue Linie 520 zeigt ein Kontrollexperiment, bei dem ein Nukleinsäure-Molekül mit einer Fehlpaarung gegenüber dem PNA-Oligomer 100 zugegeben wurde. Hier kommt es zu keinem signifikanten Fluoreszenzanstieg.

100: PNA-Oligomer
102: Farbstoff
104: DNA-Oligonukleotid
106: Quencher
107: punktmutierte Nukleobase
108: nachzuweisendes DNA-Molekül
110: der punktmutierten Nukleobase 107 entsprechende Nukleobase
200: Nukleinsäure-Sonde
202: PNA-Abschnitt
204: DNA-Abschnitt
206: Schleifenabschnitt
208: Farbstoff-Molekül
210: Quencher-Molekül
212: Nukleosid Cytidin
214: nachzuweisendes DNA-Molekül
300: Nukleinsäure-Sonde
302: zweiten PNA-Abschnitt
304: Spacer
306: erste PNA-Abschnitt
308: Punktmutation
310: DNA-Abschnitt
312: Fehlpaarung
314: nachzuweisendes DNA-Molekül
510: Fluoreszenzsignal des Tests
520: Kontrollexperiment

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Nukleinsäure-Moleküls (108, 214, 314) mit einer vorgegebenen Sequenz mit folgenden Schritten: a) ein PNA-Oligomer (100, 202, 306) wird bereitgestellt; b) die Sequenz des PNA-Oligomers (100, 202, 306) wird komplementär zur vorgegebenen Sequenz des nachzuweisenden Nukleinsäure-Moleküls (108, 214, 314) gewählt, so dass das PNA-Oligomer und das nachzuweisende Nukleinsäure-Molekül hybridisieren können; c) ein DNA-Oligonukleotid (104, 204, 310) wird bereitgestellt; d) die Sequenz des DNA-Oligonukleotids (104, 204, 310) wird derart gewählt, dass das DNA-Oligonukleotid mit dem PNA-Oligomer (100, 202, 306) hybridisieren kann; e) es werden ein Fluorophor (102, 208) und ein Quencher-Molekül (106, 210) derart gewählt, dass das Quencher-Molekül die Lumineszenz des Fluorophors bei hinreichender räumlicher Nähe messbar verändern kann; f) der Fluorophor (102, 208) wird in oder an das DNA-Oligonukleotid (104, 204, 310) gebunden und das Quencher-Molekül (106, 210) in oder an das PNA-Oligomer (100, 202, 306) oder umgekehrt; g) die Lage des Fluorophors (102, 208) bzw. des Quencher-Moleküls (106, 210) im jeweiligen Oligonukleotid und die Art der Bindung des Fluorophors bzw. des Quencher-Moleküls an das jeweilige Oligonukleotid werden derart gewählt, dass das Quencher-Molekül die Lumineszenz des Fluorophors messbar verändert, wenn das derart präparierte DNA-Oligonukleotid und das derart präparierte PNA-Oligomer aneinander hybridisieren; h) das derart präparierte DNA-Oligonukleotid und das derart präparierte PNA-Oligomer werden in einer solchen Weise miteinander gemischt, dass sie aneinander hybridisieren, wodurch ein Doppelstrang gebildet wird; i) der Doppelstrang wird mit dem nachzuweisenden DNA-Molekül in einer Lösung gemischt; j) die Bedingungen in der Lösung werden derart eingestellt, dass das nachzuweisende DNA-Molekül (108, 214, 314) das DNA-Oligonukleotid (104, 204, 310) kinetisch aus dem Doppelstrang verdrängt und einen neuen, zweiten Doppelstrang mit dem PNA-Oligomer (100, 202, 306) bildet; und k) das Vorhandensein des nachzuweisenden DNA-Moleküls (108, 214, 314) wird über eine Änderung der Lumineszenz des Fluorophors (102, 208) nachgewiesen.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz des DNA-Oligonukleotids (104, 204, 310) derart gewählt wird, dass sie sich in mindestens einem Nukleosid (107, 212, 312) von der vorgegebenen Sequenz des nachzuweisenden Nukleinsäure-Moleküls (108, 214, 314) unterscheidet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Quencher-Molekül (106, 210) Guanosin gewählt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das PNA-Oligomer zwei Bereiche aufweist: einen ersten Bereich (306) dessen Sequenz komplementär zur vorgegebenen Sequenz des nachzuweisenden Nukleinsäure-Moleküls (108, 214, 314) gewählt wird; und einen zweiten Bereich (302), an den das DNA-Oligonukleotid (204, 310) hybridisieren kann; wobei die Sequenz des zweiten Bereichs (302) derart gewählt wird, dass die durch die Hybridisierung des DNA-Oligonukleotids (204, 310) und des zweiten Bereichs des PNA-Oligomers gebildete Doppelhelix weniger stabil ist als die durch die Hybridisierung des DNA-Oligonukleotids und des ersten Bereichs (306) des PNA-Oligomers gebildete Doppelhelix.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das PNA-Oligomer (100, 202, 306) und das DNA-Oligonukleotid (104, 204, 310) über ein weiteres Molekül aneinander gekoppelt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung, in der der Doppelstrang mit dem nachzuweisenden DNA-Molekül (108, 214, 314) in Schritt i) gemischt wird, ein Denaturierungsmittel enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung Glycerin enthält.
Nukleinsäure-Sonde (200) zum Nachweis eines Nukleinsäure-Moleküls (108, 214, 314) mit einer vorgegebenen Sequenz, mit: a) einem PNA-Abschnitt (202, 306); b) wobei die Sequenz des PNA-Abschnitts (202, 306) komplementär zur vorgegebenen Sequenz des nachzuweisenden Nukleinsäure-Moleküls (108, 214, 314) ist, so dass der PNA-Abschnitt und das nachzuweisende Nukleinsäure-Molekül hybridisieren können; c) einem DNA-Abschnitt (204, 310); d) wobei die Sequenz des DNA-Abschnitts (204, 310) derart ausgebildet ist, dass der DNA-Abschnitt mit dem PNA-Abschnitt (202, 306) hybridisieren kann; e) mit einem Fluorophor (102, 208) und einem Quencher-Molekül (106, 210), die derart ausgebildet sind, dass das Quencher-Molekül die Lumineszenz des Fluorophors bei hinreichender räumlicher Nähe messbar verändern kann; f) wobei der Fluorophor (102, 208) in oder an den DNA-Abschnitt (204, 310) gebunden ist und das Quencher-Molekül (106, 210) in oder an den PNA-Abschnitt (202, 306) oder umgekehrt; g) wobei der Fluorophor (102, 208) bzw. das Quencher-Molekül (106, 210) im jeweiligen Abschnitt in einer Lage angeordnet sind und die Art der Bindung des Fluorophors bzw. des Quencher-Moleküls an den jeweiligen Abschnitt derart ausgebildet ist, dass das Quencher-Molekül die Lumineszenz des Fluorophors messbar verändert, wenn die derart präparierten DNA- und PNA-Abschnitte aneinander hybridisieren; und h) mit einem weiteren Abschnitt (206), durch welchen der PNA-Abschnitt (202, 306) und der DNA-Abschnitt (204, 310) aneinander gekoppelt sind.
Nukleinsäure-Sonde nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz des DNA-Abschnitts (204, 310) sich in mindestens einem Nukleosid (107, 212, 312) von der vorgegebenen Sequenz des nachzuweisenden Nukleinsäure-Moleküls (108, 214, 314) unterscheidet.
Nukleinsäure-Sonde nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Quencher-Molekül (106, 210) Guanosin ist.
Nukleinsäure-Sonde nach einem der vorhergehenden, auf eine Nukleinsäure-Sonde gerichteten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Sonde (200) einen zweiten PNA-Abschnitt (302) aufweist, an den der DNA-Abschnitt (204, 310) hybridisieren kann; wobei die Sequenz des zweiten PNA-Abschnitts (302) derart gewählt wird, dass die durch die Hybridisierung des DNA-Abschnitts (204, 310) und des zweiten PNA-Abschnitts gebildete Doppelhelix kinetisch weniger stabil ist als die durch die Hybridisierung des DNA-Abschnitts und des ersten PNA-Abschnitts (306) gebildete Doppelhelix.
Kit zum Nachweis eines Nukleinsäure-Moleküls (108, 214, 314) mit einer vorgegebenen Sequenz, mit einer Nukleinsäure-Sonde nach einem der vorhergehenden, auf eine Nukleinsäure-Sonde gerichteten Ansprüche.
Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, gekennzeichnet durch ein Denaturierungsmittel.
Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Glycerin.
Verwendung der Nukleinsäure-Sonde nach einem der vorhergehenden, auf eine Nukleinsäure-Sonde gerichteten Ansprüche zum Nachweis eines Nukleinsäure-Moleküls (108, 214, 314) mit einer vorgegebenen Sequenz.