DE69910026T2

DE69910026T2 - Mehrfach fluoreszierende und energie übertragende hairpin-oligonukleotide

Info

Publication number: DE69910026T2
Application number: DE69910026T
Authority: DE
Inventors: Glenn Nardone
Original assignee: Intergen Co
Current assignee: Intergen Co
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2019-06-12
Also published as: EP1086245A2; CA2335026A1; WO1999064432A3; PT1086245E; DK1086245T3; JP2002517506A; DE69910026D1; WO1999064432A2; ES2205841T3; EP1086245B1; ATE246256T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen eine Oligonucleotidsonde, die für den Nachweis multipler Zielnucleinsäuresequenzen in einer Probe von Nutzen ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Oligonucleotidsonde, die mit einem molekularen Energietransfer-(MET)-Trio markiert ist, einschließlich eines Energiespenders (Donator) und zweier Energieempfänger (Akzeptor), die den Nachweis mehrerer Ziele unter Verwendung von nur einer Anregungswellenlänge des Lichts ermöglichen.
2. Beschreibung der verwandten Technik
Das MET-Phänomen ist ein Verfahren, bei dem Energie zwischen einem Donatormolekül und einem Akzeptormolekül übertragen wird. Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET), der wenigstens einen Fluorophor beinhaltet, ist eine Form des MET. Ein Fluorophor ist eine Verbindung, die Licht bei einer Wellenlänge absorbiert und bei einer anderen Wellenlänge emittiert. Ein Spektrofluorometer wird zum simultanen Emittieren von Licht, das den Fluorophor anregt, und Nachweisen des von dem Fluorophor emittierten Lichts verwendet. Beim FRET ist der Fluorophor ein Donatormolekül, das Photonen absorbiert und diese Energie anschließend zu einem Akzeptormolekül überträgt. Donator- und Akzeptormoleküle, die am MET oder FRET beteiligt sind, werden, jeweils als MET-Paare oder FRET-Paare bezeichnet (Förster, 1949, Z. Naturforsch A4: 321–327; Clegg, 1992, Methods in Enzymology 211: 353–388).
Wenn sich zwei Fluorophore in unmittelbarer Nähe zueinander befinden und das Emissionsspektrum des ersten Fluorophors das Anregungsspektrum des zweiten Fluorophors überlappt, dann führt die Anregung des ersten Fluorophors dazu, dass er Licht emittiert, das von dem zweiten Fluorophor absorbiert wird, was wiederum zur Folge hat, dass der zweite Fluorophor Licht emittiert. Folglich wird die Fluoreszenz des ersten Fluorophors gelöscht, wohingegen die Fluoreszenz des zweiten Fluorophor verstärkt wird. Wird die Energie des ersten Fluorophors zu einer Verbindung übertragen, die kein Fluorophor ist, dann wird die Fluoreszenz des ersten Fluorophors jedoch ohne anschließende Emission von Licht durch den Nicht-Fluorophor gelöscht.
Das FRET-Phänomen wurde in Verfahren für den Nachweis von Nucleinsäuren genutzt. Eines dieser Verfahren wird im U. S. Patent Nr. 5,866,366 offenbart. Das Patent '366 offenbart ein FRET-markiertes Haarnadel-Oligonucleotid, das in Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Verfahren als eine Sonde für den Nachweis von Zielnucleinsäureseguenzen verwendet wird. Dieses Oligonucleotid enthält einen Energiespender und einen Energieempfänger, die ein FRET-Paar bilden. Spender und Empfänger befinden sich jeweils auf ersten und zweiten Nucleotidsequenzen des Oligonucleotids. Diese beiden Nucleotidsequenzen ergänzen einander und können daher eine Haarnadel im Oligonucleotid bilden.
Sind die erste und die zweite Nucleotidsequenz aneinander angelagert, dann befinden sich Spender und Empfänger in unmittelbarer Nähe zueinander. In dieser räumlichen Anordnung absorbiert der Empfänger die Emission von dem Spender und löscht somit das Signal des Spenders. Sind die Nucleotidsequenzen jedoch nicht aneinander angelagert, dann werden Spender und Empfänger getrennt, der Empfänger kann die Emission vom Spender nicht mehr absorbieren und das Signal vom Spender wird nicht gelöscht.
Wird das Oligonucleotid während der PCR in ein Amplifikationsprodukt eingebaut, dann entfaltet sich folglich die Haarnadel, was zur Trennung des Spenders vom Empfänger und folglich zur Emission eines erkennbaren Signals führt. Wird das Oligonucleotid jedoch nicht in ein PCR-Amplifikationsprodukt eingebaut, dann bleibt die Haarnadel und die Emission von dem Spender wird durch den Empfänger gelöscht. Der Nachweis eines Signals nach der PCR lässt daher auf die Anwesenheit des Ziels schließen.
Das oben beschriebene FRET-markierte Haarnadel-Oligonucleotid kann ferner als ein "Molecular Beacon" für den Nachweis einer Zielnucleinsäuresequenz verwendet werden, ohne dass es in ein DNA-Molekül eingebaut wird. Die Molecular-Beacon-Technologie wird in Tyagi et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 303–308 beschrieben, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Hybridisiert das Oligonucleotid mit einem Ziel, dann entfaltet sich die Haarnadel und es wird ein nachweisbares Signal erzeugt. Hybridisiert das Oligonucleotid nicht mit dem Ziel, dann bleibt die Haarnadel und das Signal wird gelöscht. Der Nachweis eines Signals nach der Hybridisierung lässt daher auf die Anwesenheit des Ziels schließen.
Der Nachweis von mehr als einem Zielnucleinsäuremolekül in einer einzelnen Probe unter Anwendung der im Patent '336 und Tyagi et al. offenbarten Verfahren setzt ein FRETmarkiertes Haarnadel-Oligonucleotid voraus, das für jedes Zielmolekül spezifisch ist, worin jeder Spender ein charakteristisches Signal abgibt. Da jeder Spender typischerweise durch eine andere Wellenlänge des Lichts angeregt werden muss, ist eine Bestrahlung der Probe mit mehreren Wellenlängen des Lichts notwendig. Ein bedeutender Nachteil dieses Ansatzes besteht jedoch darin, dass ein Spektrofluorometer erforderlich ist, das ein breites Lichtspektrum emittiert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Den zuvor genannten Nachteil vermeidend, betrifft die vorliegende Erfindung ein MET-markiertes Oligonucleotid sowie die Verwendung dieses Oligonucleotids für den Nachweis multipler Zielnucleinsäuresequenzen in einer einzelnen Probe. Gemäß der vorliegenden Erfindung können mehrere Ziele nachgewiesen werden, indem eine Probe, die die Ziele enthält, mit einer einzelnen Anregungswellenlänge von Licht bestrahlt wird.
Ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid enthält drei Nucleotidsequenzen: eine erste Nucleotidsequenz, eine zweite Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz und eine dritte Nucleotidsequenz am 5'-Ende der zweiten Nucleotidsequenz. Darüber hinaus enthält das Oligonucleotid ein MET-Trio, z. B. ein FRET-Trio, das einen Energiespenderanteil und einen ersten und einen zweiten Energieempfängeranteil beinhaltet, wobei (i) der Energiespenderanteil ein Energiequantum abgeben kann und (ii) der erste und der zweite Empfängeranteil jeweils in der Lage sind, eine wesentliche Menge des Energiequantums zu absörbieren. Vorzugsweise kann der erste Empfängeranteil auch ein Energiequantum abgeben.
Der Spenderanteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt, oder, alternativ, der Spenderanteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt.
Das Oligonucleotid kann eine Haarnadel bilden, die ein Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz enthält. Gibt der Spenderanteil das Energiequantum ab, dann absorbiert der erste Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die Haarnadel nicht gebildet wird, und der zweite Empfängeranteil absorbiert eine wesentliche Menge des abgegebenen Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die Haarnadel gebildet wird.
Ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid umfasst vorzugsweise eine vierte Nucleotidsequenz am 3'-Ende der ersten Nucleotidsequenz. Im Idealfall ist die dritte Nucleotidsequenz nicht komplementär zur vierten Nucleotidsequenz und die vierte Nucleotidsequenz ist komplementär zu einer Nucleotidsequenz, die eine Zielnucleotidsequenz flankiert, z. B. eine DNA-Sequenz. Das Oligonucleotid kann in einem Kit aufgenommen werden, der eine Polymerase enthält. Das Oligonucleotid umfasst vorzugsweise ein Desoxyribonucleotid.
Vorzugsweise sind sowohl der Spenderanteil als auch der erste Empfängeranteil Fluorophore, wohingegen der zweite Empfängeranteil ein Quencher von Licht ist, das von dem Spenderanteil abgegeben wird. Der bevorzugte Spenderanteil, der erste Empfängeranteil und der zweite Empfängeranteil sind jeweils Fluorescein, 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX) und 4-(4'-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure (DABSYL).
Vorzugsweise gibt es 0 bis 50 Nucleotide zwischen dem Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, und dem Nucleotid, an dem der erste Empfängeranteil angefügt ist, und 0 bis 50 Nucleotide zwischen dem Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, und dem Nucleotid, an dem der zweite Empfängeranteil angefügt ist. Bevorzugter gibt es 5 bis 10 Nucleotide zwischen dem Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, und dem Nucleotid, an dem der erste Empfängeranteil angefügt ist, und 5 bis 10 Nucleotide zwischen dem Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, und dem Nucleotid, an dem der zweite Empfängeranteil angefügt ist.
Wird die Haarnadel gebildet, dann ist das Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, vorteilhafterweise das Komplement des Nucleotids, an dem der zweite Empfängeranteil angefügt ist, oder es gibt 0 bis 5 Nucleotide zwischen dem Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist und dem Komplement des Nucleotids, an dem der zweite Empfängeranteil angefügt ist.
Ein bevorzugtes Oligonucleotid umfasst oder besteht aus der Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, worin Fluorescein am Nucleotid an Position 1 der SEQ ID Nr. 1 angefügt ist, ROX am Nucleotid an Position 21 der SEQ ID Nr. 1 angefügt ist, und DABSYL am Nucleotid an Position 5 oder 10 der SEQ ID Nr. 1 angefügt ist.
Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine Zielnucleotidsequenz in einer Probe vorliegt, umfassend die folgenden Schritte.
Im Schritt (a) wird eine Probe mit einem Oligonucleotid in Kontakt gebracht, das eine erste Nucleotidsequenz, eine zweite Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz und eine dritte Nucleotidsequenz am 5'-Ende der zweiten Nucleotidsequenz enthält. Das Oligonucleotid enthält außerdem ein MET-Trio, einschließlich eines Energiespenderanteils und eines ersten und zweiten Energieempfängeranteils, wobei der Spenderanteil ein erstes Energiequantum abgeben kann, der erste und der zweite Empfängeranteil jeweils in der Lage sind, eine wesentliche Menge des ersten Energiequantums zu absorbieren, und der erste Empfängeranteil ein zweites Energiequantum abgeben kann. Der bevorzugte Spenderanteil, der erste Empfängeranteil und der zweite Empfängeranteil sind jeweils Fluorescein, ROX und DABSYL.
Der Spenderanteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt oder, alternativ, der erste Spenderanteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt.
Das Oligonucleotid kann eine Haarnadel bilden, die ein Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz enthält. Gibt der Spenderanteil das erste Energiequantum ab, dann absorbiert der erste Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die Haarnadel nicht gebildet wird, und der zweite Empfängeranteil absorbiert eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die Haarnadel gebildet wird.
Im Schritt (b) wird, wenn das zweite Energiequantum nachgewiesen wird, bestimmt, ob die Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, oder, wenn das zweite Energiequantum nicht nachgewiesen wird, bestimmt, ob die Zielnucleotidsequenz nicht in der Probe vorliegt.
Ein zweites Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine Zielnucleotidsequenz in einer Probe vorliegt, umfassend die folgenden Schritte.
In Schritt (a) wird eine Probe mit einem Oligonucleotid in Kontakt gebracht, das eine erste Nucleotidsequenz, eine zweite Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz und eine dritte Nucleotidsequenz am 5'-Ende der zweiten Nucleotidsequenz enthält. Das Oligonucleotid enthält außerdem ein MET-Trio, das einen Energiespenderanteil und einen ersten und zweiten Energiespenderanteil beinhaltet, wobei der Spenderanteil ein erstes Energiequantum abgeben kann, der erste und der zweite Empfängeranteil jeweils in der Lage sind, eine wesentliche Menge des ersten Energiequantums zu absorbieren, und der erste Empfängeranteil ein zweites Energiequantum abgeben kann. Der bevorzugte Spenderanteil, der erste Empfängeranteil und der zweite Empfängeranteil sind jeweils Fluorescein, ROX und DABSYL.
Der Spenderanteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt oder, alternativ, der erste Spenderanteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt.
Das Oligonucleotid kann eine Haarnadel bilden, die ein Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz enthält. Gibt der Spenderanteil das erste Energiequantum ab, dann absorbiert der erste Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die Haarnadel nicht gebildet wird, und der zweite Empfängeranteil absorbiert eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die Haarnadel gebildet wird.
In Schritt (b) wird das Oligonucleotid vorzugsweise unter Verwendung einer Polymerase in eine doppelsträngige Nucleinsäure eingebaut, wenn die Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, so dass verhindert wird, dass sich die Haarnadel bildet.
In Schritt (c) wird bei Bedarf eine Amplifikationsreaktion durchgeführt, die im Einbau des Oligonucleotids in ein Amplifikationsprodukt resultiert, wenn die Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt.
In Schritt (d) wird, wenn das zweite Energiequantum nachgewiesen wird, bestimmt, ob die Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, oder, wenn das zweite Energiequantum nicht nachgewiesen wird, bestimmt, ob die Zielnucleotidsequenz nicht in der Probe vorliegt.
Ein drittes Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für den Nachweis einer Zielnucleotidsequenz, umfassend die folgenden Schritte.
In Schritt (a) wird ein erstes Oligonucleotid an einer Nucleotidsequenz angelagert, die eine Zielnucleotidsequenz flankiert, wobei das erste Oligonucleotid eine erste Nucleotidsequenz, eine zweite Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz und eine dritte Nucleotidsequenz am 5-Ende der zweiten Nucleotidsequenz enthält. Das erste Oligonucleotid enthält außerdem ein MET-Trio, einschließlich eines Energiespenderanteils und eines ersten und zweiten Energieempfängeranteils, wobei der Spenderanteil ein erstes Energiequantum abgeben kann und der erste und der zweite Empfängeranteil jeweils in der Lage sind, eine wesentliche Menge des ersten Energiequantums zu absorbieren. Der bevorzugte Spenderanteil, der erste Empfängeranteil und der zweite Empfängeranteil sind jeweils Fluorescein, ROX und DABSYL.
Der Spenderanteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt, oder, alternativ, der Spenderanteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt.
Das erste Oligonucleotid kann eine Haarnadel bilden, die ein Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz enthält. Gibt der Spenderanteil das erste Energiequantum ab, dann absorbiert der erste Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die Haarnadel nicht gebildet wird, und der zweite Empfängeranteil absorbiert eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die Haarnadel gebildet wird.
Das Oligonucleotid umfasst vorteilhafterweise eine vierte Nucleotidsequenz am 3'-Ende der ersten Nucleotidsequenz. Im Idealfall ist die dritte Nucleotidsequenz nicht komplementär zur vierten Nucleotidsequenz und die vierte Nucleotidsequenz ist komplementär zu einer Nucleotidsequenz, die eine Zielnucleotidsequenz flankiert.
In Schritt (b) wird das 3'-Ende des ersten Oligonucleotids unter Verwendung der Zielnucleotidsequenz als Matrize verlängert, um einen verlängerten ersten Strang zu bilden, wobei die Zielnucleotidsequenz an den verlängerten ersten Strang angelagert wird.
In Schritt (c) wird die Zielnucleotidsequenz von dem verlängerten ersten Strang getrennt.
In Schritt (d) wird das zweite Oligonucleotid an den verlängerten ersten Strang angelagert.
In Schritt (e) wird das 3'-Ende des zweiten Oligonucleotids unter Verwendung des verlängerten ersten Strangs als Matrize verlängert, um einen verlängerten zweiten Strang zu bilden, wobei der verlängerte erste Strang an den verlängerten zweiten Strang angelagert wird.
In Schritt (f) werden der verlängerte erste und zweite Strang bei Bedarf amplifiziert.
In Schritt (g) wird ein zweites Energiequantum, das von dem ersten Empfängeranteil abgegeben wird, nachgewiesen, um die Zielnucleotidsequenz nachzuweisen.
In Schritt (f) kann eine Vielfalt von Amplifikationsverfahren angewendet werden, um den verlängerten ersten und zweiten Strang zu amplifizieren (z. B. PCR-Amplifikation, Strangverdrängungsamplifikation und kaskadenartige Rolling-Circle-Amplifikation). Das bevorzugte Amplifikationsverfahren ist die PCR-Amplifikation, die die folgenden vier Schritte umfasst:
In Schritt (1) wird der verlängerte erste Strang von dem verlängerten zweiten Strang getrennt.
In Schritt (2) wird das erste Oligonucleotid an den verlängerten zweiten Strang angelagert, und das zweite Oligonucleotid wird an den verlängerten ersten Strang angelagert.
In Schritt (3) wird das 3'-Ende des ersten Oligonucleotids mit dem verlängerten zweiten Strang als Matrize verlängert, um einen weiteren verlängerten ersten Strang zu bilden, wobei der verlängerte zweite Strang an den anderen verlängerten ersten Strang angelagert wird. Darüber hinaus wird das 3'-Ende des zweiten Oligonucleotids mit dem verlängerten ersten Strang als Matrize verlängert, um einen weiteren verlängerten zweiten Strang zu bilden, wobei der verlängerte erste Strang an den anderen verlängerten zweiten Strang angelagert wird.
In Schritt (4) werden die Schritte (1), (2) und (3) mit einer begrenzten Häufigkeit wiederholt, wobei der verlängerte erste und zweite Strang in Schritt (1) jeweils der verlängerte erste Strang und der andere verlängerte zweite Strang aus Schritt (3) sind oder jeweils der andere verlängerte erste Strang und der verlängerte zweite Strang aus Schritt (3) sind.
Ein viertes Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für den Nachweis einer Zielnucleotidsequenz, umfassend die folgenden Schritte:
In Schritt (a) wird ein erstes Oligonucleotid an einer Nucleotidsequenz angelagert, die eine Zielnucleotidsequenz flankiert, wobei das erste Oligonucleotid eine erste Nucleotidsequenz, die komplementär zur Nucleotidsequenz ist, die die Zielnucleotidsequenz flankiert, und eine zweite Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz enthält.
In Schritt (b) wird das 3'-Ende des ersten Oligonucleotids unter Verwendung der Zielnucleotidsequenz als Matrize verlängert, um einen verlängerten ersten Strang zu bilden, wobei die Zielnucleotidsequenz an den verlängerten ersten Strang angelagert wird.
In Schritt (c) wird die Zielnucleotidsequenz von dem, verlängerten ersten Strang getrennt.
In Schritt (d) wird ein zweites Oligonucleotid an den verlängerten ersten Strang angelagert.
In Schritt (e) wird das 3'-Ende des zweiten Oligonucleotids unter Verwendung des verlängerten ersten Strangs als Matrize verlängert, um einen verlängerten zweiten Strang zu bilden, wobei der verlängerte erste Strang an den verlängerten zweiten Strang angelagert wird.
In Schritt (f) wird der verlängerte erste Strang von dem verlängerten zweiten Strang getrennt.
In Schritt (g) wird ein drittes Oligonucleotid an den verlängerten zweiten Strang angelagert, wobei das dritte Oligonucleotid eine erste Nucleotidsequenz, eine zweite Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz, eine dritte Nucleotidsequenz am 5'-Ende der zweiten Nucleotidsequenz und eine vierte Nucleotidsequenz am 3'-Ende der ersten Nucleotidsequenz enthält. Das dritte Oligonucleotid enthält außerdem ein MET-Trio, das einen Energiespenderanteil und einen ersten und zweiten Energieempfängeranteil enthält. Der Spenderanteil kann ein Energiequantum abgeben und der erste und der zweite Empfängeranteil sind jeweils in der Lage, eine wesentliche Menge des Energiequantums zu absorbieren. Der bevorzugte Spenderanteil, der erste Empfängeranteil und der zweite Empfängeranteil sind jeweils Fluorescein, ROX und DABSYL.
Der Spenderanteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt oder, alternativ, der Spenderanteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt.
Das dritte Oligonucleotid kann eine Haarnadel bilden, die ein Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz enthält, und, wenn der Spenderanteil das Energiequantum abgibt, absorbiert der erste Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die Haarnadel nicht gebildet wird, und der zweite Empfängeranteil absorbiert eine wesentliche Menge des abgegebenen Energiequantums, falls, vorzugsweise nur. falls, die Haarnadel gebildet wird.
Die vierte Nucleotidsequenz ist komplementär zum Komplement der zweiten Sequenz des ersten Oligonucleotids. Im Idealfall ist die dritte Nucleotidsequenz nicht komplementär zur vierten Nucleotidsequenz und die vierte Nucleotidsequenz ist komplementär zu einer Nucleotidsequenz, die eine Zielnucleotidsequenz flankiert.
In Schritt (h) wird das 3'-Ende des dritten Oligonucleotids unter Verwendung des verlängerten zweiten Strangs als Matrize verlängert, um einen doppelt verlängerten ersten Strang zu bilden, wobei der doppelt verlängerte erste Strang an den verlängerten zweiten Strang angelagert wird.
In Schritt (i) wird der doppelt verlängerte erste Strang von dem verlängerten markierten zweiten Strang getrennt.
In Schritt (j) wird das zweite Oligonucleotid an den doppelt verlängerten ersten Strang angelagert.
In Schritt (k) wird das 3'-Ende des zweiten Oligonucleotids unter Verwendung des doppelt verlängerten ersten Strangs als Matrize verlängert, um einen doppelt verlängerten zweiten Strang zu bilden, wobei der doppelt verlängerte erste Strang an den doppelt verlängerten zweiten Strang angelagert wird.
In Schritt (l) werden der doppelt verlängerte erste und zweite Strang bei Bedarf amplifiziert.
In Schritt (m) wird ein zweites Energiequantum nachgewiesen, das von dem ersten Empfängeranteil abgegeben wird, um die Zielnucleotidsequenz nachzuweisen.
Es kann eine Vielfalt von Amplifikationsverfahren in Schritt (l) angewendet werden, um den verlängerten ersten und zweiten Strang zu amplifizieren (z. B. PCR-Amplifikation, Strangverdrängungsamplifikation und kaskadenartige Rolling-Circle-Amplifikation). Das bevorzugte Amplifikationsverfahren ist die PCR-Amplifikation, umfassend die folgenden vier Schritte:
In Schritt (1) wird der doppelt verlängerte erste Strang von dem doppelt verlängerten zweiten Strang getrennt.
In Schritt (2) wird das zweite Oligonucleotid an den doppelt verlängerten ersten Strang angelagert und das dritte Oligonucleotid wird an den doppelt verlängerten zweiten Strang angelagert.
In Schritt (3) wird das 3'-Ende des zweiten Oligonucleotids unter Verwendung des doppelt verlängerten ersten Strangs als Matrize zur Bildung eines weiteren doppelt verlängerten zweiten Strangs verlängert, wobei der doppelt verlängerte erste Strang an den anderen doppelt verlängerten zweiten Strang angelagert wird. Darüber hinaus wird das 3'-Ende des dritten Oligonucleotids unter Verwendung des doppelt verlängerten zweiten Strangs als Matrize zur Bildung eines weiteren doppelt verlängerten ersten Strangs verlängert, wobei der doppelt verlängerte zweite Strang an den anderen doppelt verlängerten ersten Strang angelagert wird.
In Schritt (4) werden die Schritte (1), (2) und (3) mit einer begrenzten Häufigkeit wiederholt, wobei in Schritt (1) der doppelt verlängerte erste und zweite Strang jeweils der doppelt verlängerte erste Strang und der andere doppelt verlängerte zweite Strang aus Schritt (3) sind, oder jeweils der andere doppelt verlängerte erste Strang und der doppelt verlängerte zweite Strang aus Schritt (3) sind.
Ein fünftes Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine erste oder zweite Zielnucleotidsequenz in einer Probe vorliegt, umfassend die folgenden Schritte:
In Schritt (a) wird die Probe mit einem ersten und einem zweiten Oligonucleotid in Kontakt gebracht. Das erste Oligonucleotid enthält eine erste Nucleotidsequenz, eine zweite Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz und eine dritte Nucleotidsequenz am 5'-Ende der zweiten Nucleotidsequenz. Das erste Oligonucleotid enthält außerdem ein MET-Trio, einschließlich eines ersten Energiespenderanteils und eines ersten und zweiten Energieempfängeranteils, wobei der erste Spenderanteil ein erstes Energiequantum abgeben kann und der erste und der zweite Empfängeranteil jeweils in der Lage sind, eine wesentliche Menge des Energiequantums zu absorbieren.
Der erste Spenderanteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt oder, alternativ, der erste Spenderanteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt, der erste Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt und der zweite Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt.
Das erste Oligonucleotid kann eine erste Haarnadel bilden, die ein Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz enthält. Wenn der erste Spenderanteil das erste Energiequantum abgibt, dann absorbiert der erste Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die erste Haarnadel nicht gebildet wird, und der zweite Empfängeranteil absorbiert eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die erste Haarnadel gebildet wird.
Das zweite Oligonucleotid enthält eine vierte Nucleotidsequenz, eine fünfte Nucleotidsequenz am 5'-Ende der vierten Nucleotidsequenz, eine sechste Nucleotidsequenz am 5'-Ende der fünften Nucleotidsequenz. Das zweite Oligonucleotid enthält auch ein MET-Paar, einschließlich eines zweiten Energiespenderanteils und eines dritten Energieempfängeranteils, wobei der zweite Spenderanteil ein zweites Energiequantum abgeben kann und der dritte Empfängeranteil eine wesentliche Menge des zweiten Energiequantums absorbieren kann.
Der zweite Spenderanteil ist an einem Nucleotid der vierten Nucleotidsequenz angefügt und der dritte Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der sechsten Nucleotidsequenz angefügt oder, alternativ, der zweite Spenderanteil ist an einem Nucleotid der sechsten Nucleotidsequenz angefügt und der dritte Empfängeranteil ist an einem Nucleotid der vierten Nucleotidsequenz angefügt.
Das zweite Oligonucleotid kann eine zweite Haarnadel bilden, die ein Nucleotid der vierten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der sechsten Nucleotidsequenz enthält. Wenn der zweite Spenderanteil das zweite Energiequantum abgibt, dann absorbiert der dritte Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen zweiten Energiequantums, falls, vorzugsweise nur falls, die zweite Haarnadel gebildet wird.
Der bevorzugte erste und zweite Spenderanteil sind jeweils Fluorescein, der bevorzugte erste Empfängeranteil ist ROX und der bevorzugte zweite und dritte Empfängeranteil sind jeweils DABSYL. Im Idealfall umfasst das erste Oligonucleotid eine siebte Nucleotidsequenz am 3'-Ende der ersten Nucleotidsequenz, die dritte Nucleotidsequenz ist nicht komplementär zur siebten Nucleotidsequenz, die siebte Nucleotidsequenz ist komplementär zu einer Nucleotidsequenz, die die erste Zielnucleotidsequenz flankiert, das zweite Oligonucleotid umfasst ferner eine achte Nucleotidsequenz am 3'-Ende der vierten Nucleotidsequenz, die sechste Nucleotidsequenz ist nicht komplementär zur achten Nucleotidsequenz und die achte Nucleotidsequenz ist komplementär zu einer Nucleotidsequenz, die die zweite Zielnucleotidsequenz flankiert.
In Schritt (b) wird das erste Oligonucleotid vorzugsweise unter Verwendung einer Polymerase in eine erste doppelsträngige Nucleinsäure eingebaut, wenn die erste Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, so dass verhindert wird, dass sich die erste Haarnadel bildet. Darüber hinaus wird das zweite Oligonucleotid vorzugsweise unter Verwendung einer Polymerase in eine zweite doppelsträngige Nucleinsäure eingebaut, wenn die zweite Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, so dass verhindert wird, dass sich die Haarnadel bildet.
In Schritt (c) wird bei Bedarf eine erste Amplifikationsreaktion durchgeführt, wodurch das erste Oligonucleotid in ein erstes Amplifikationsprodukt eingebaut wird, wenn die erste Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt. Darüber hinaus wird eine zweite Amplifikationsreaktion durchgeführt, wodurch das zweite Oligonucleotid in ein zweites Amplifikationsprodukt eingebaut wird, wenn die zweite Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt.
In Schritt (d) wird bestimmt, ob die erste Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, wenn ein von dem ersten Empfängeranteil abgegebenes drittes Energiequantum nachgewiesen wird, oder es wird bestimmt, ob die erste Zielnucleotidsequenz nicht in der Probe vorliegt, wenn das dritte Energiequantum nicht nachgewiesen wird. Darüber hinaus wird bestimmt, ob die zweite Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, wenn ein von dem dritten Empfängeranteil abgegebenes Energiequantum nachgewiesen wird, oder es wird bestimmt, ob die zweite Zielnucleotidsequenz nicht in der Probe vorliegt, wenn das vierte Energiequantum nicht nachgewiesen wird.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorzüge der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung offensichtlich. Es ist jedoch zu verstehen, dass die Beschreibung und die spezifischen Beispiele, die sich auf bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung beziehen, lediglich der Veranschaulichung dienen, da der fachkundigen Person anhand dieser ausführlichen Beschreibung verschiedene Veränderungen und Modifikationen im Rahmen des Wesens und des Umfangs der Erfindung klar sein werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSGESTALTUNG
Wie zuvor erläutert, enthält das erfindungsgemäße Oligonucleotid zwei Nucleotidsequenzen, die zur Bildung einer Haarnadel miteinander hybridisiert werden können. Eine Nucleotidsequenz enthält einen Energiespender und einen ersten Energieempfänger, wohingegen die andere Nucleotidsequenz einen zweiten Energieempfänger enthält, der das vom Spender erzeugte Signal löschen kann. Folglich enthält das vorliegende Oligonucleotid ein MET-Trio. In einer bevorzugten Ausgestaltung sind der Spender und der erste Empfänger Fluorophore, das Emissionsspektrum des Spenderfluorophors überlappt das Anregungsspektrum des Empfängerfluorophors (d. h. erster Empfänger) und der zweite Empfänger ist ein Quencher des vom Spenderfluorophor abgegebenen Signals.
Gemäß der vorliegenden Erfindung befinden sich der Spenderfluorophor und der Quencher so auf dem Oligonucleotid, dass, wenn die Haarnadel gebildet wird, der Spenderfluorophor sich in unmittelbarer Nähe zum Quencher befindet und vom Spenderfluorophor abgegebene Energie vom Quencher absorbiert wird, so dass das Signal von dem Spenderfluorophor gelöscht wird. Wird die Haarnadel jedoch nicht gebildet und der Quencher absorbiert folglich nicht die vom Spender abgegebene Energie, dann wird die abgegebene Energie vom Empfängerfluorophor absorbiert und anschließend vom Empfängerfluorophor als nachweisbares Signal abgegeben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt der Nachweis einer Zielnucleinsäuresequenz in einer Probe auf eine von wenigstens zwei Weisen. Zunächst kann das Oligonucleotid in ein Amplifikationsprodukt eingebaut werden, das die Zielsequenz enthält. Zweitens kann das Oligonucleotid mit der Zielsequenz hybridisiert werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung bewirkt eine Bestrahlung der Probe mit einem Spektrofluorometer nach einem solchen Einbau oder einer solchen Hybridisierung, dass der Empfängerfluorophor ein Signal abgibt, das vom Spektrofluorometer nachgewiesen wird. Somit lässt der Signalnachweis darauf schließen, dass das Ziel vorliegt, wohingegen die Abwesenheit eines Signals darauf schließen lässt, dass das Ziel nicht vorliegt.
Eine Probe wird unter Verwendung des oben beschriebenen Oligonucleotids in Verbindung mit einem anderen Oligonucleotid auf Anwesenheit von zwei Zielen untersucht. Das andere Oligonucleotid enthält ebenfalls zwei Nucleotidsequenzen, die eine Haarnadel bilden können, sowie einen Spenderfluorophor und einen Quencher, die mit Bezug auf die Haarnadel wie im vorliegenden Oligonucleotid positioniert sind. Die Spender des vorliegenden Oligonucleotids und des anderen Oligonucleotids werden mit der gleichen oder in etwa der gleichen Wellenlänge des Lichts angeregt. Das andere Oligonucleotid enthält jedoch nicht den Empfängerfluorophor und enthält daher eher ein MET-Paar als ein MET-Trio. Das vorliegende Oligonucleotid und das andere Oligonucleotid sind jeweils für das erste und das zweite Ziel spezifisch.
Enthält die Probe sowohl das erste als auch das zweite Ziel, dann wird verhindert, dass sich die Haarnadel im vorliegenden Oligonucleotid und in dem anderen Oligonucleotid bildet, nachdem die Amplifikations- oder Hybridisierungsreaktionen durchgeführt wurden. Eine anschließende Bestrahlung der Probe mit einer einzelnen Wellenlänge des Lichts, die den Spenderfluorophor des vorliegenden Oligonucleotids und des anderen Oligonucleotids anregt, aber nicht den Empfängerfluorophor des vorliegenden Oligonucleotids, bewirkt die Erzeugung von zwei charakteristischen Signalen. Das erste Signal wird von dem Empfängeranteil des vorliegenden Oligonucleotids abgegeben, wohingegen das zweite Signal von dem Spenderfluorophor des anderen Oligonucleotids abgegeben wird. Folglich wird das erste Ziel durch Beobachten des ersten Signals nachgewiesen, wohingegen das zweite Ziel durch Beobachten des zweiten Signals nachgewiesen wird. Somit können zwei Ziele durch Bestrahlen der Probe mit nur einer Wellenlänge des Lichts nachgewiesen werden.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben, die lediglich der Veranschaulichung dienen.
1. Beispiel
Spektroskopische Analyse von FRET-markierten Modell- Haarnadeloligonucleotiden, die jeweils einen Spenderfluorophor, einen Empfängerfluorphor und einen Quencher enthalten
Es wurden insgesamt sieben Oligonucleotide synthetisiert. Alle diese Oligonucleotide haben die folgende Nucleotidsequenz: 5'-ACCGATGCGTTGAGCATCGGTGAAGGTC-GGAGTCAACGGRTT-3'(SEQ ID Nr. 1). Alle Oligonucleotide enthalten einen Fluoresceinanteil (d. h. den ersten Fluorophor), der am Nucleotid an Position 1 angefügt ist, und einen DABSYL-Anteil, der am Nucleotid an Position 21 angefügt ist. Die Oligonucleotide 1 bis 4 enthalten jeweils einen zweiten Fluorophor, der am Nucleotid an Position 5 angefügt ist, wohingegen die Oligonucleotide 5 bis 7 jeweils einen zweiten Fluorophor enthalten, der am Nucleotid an Position 10 angefügt ist. Der zweite Fluorophor in den Oligonucleotiden 1 und 5 ist N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), in den Oligonucleotiden 3 und 6 ROX, in den Oligonucleotiden 4 und 7 Texas Red und im Oligonucleotid 2 Bodipy 564/570.
Die Fluorescein- und DABSYL-Anteile wurden im Laufe ihrer Synthese unter Verwendung von jeweils einem dA-Fluorescein-Phosphoramidit und einem dU-DABSYL-Phosphoroamidit in die einzelnen Oligonucleotide eingebaut. Darüber hinaus wurde ein Hexylaminanteil an das Kohlenstoffatom an Position 5 des Basenanteils der Nucleotide an Position 5 der Oligonucleotide 1 bis 4 und an Position 10 der Oligonucleotide 5 bis 7 angefügt. Dieser Hexylaminanteil wurde in die jeweiligen Oligonucleotide im Laufe ihrer Synthese unter Verwendung eines dU-Hexylamin-Phosphoramidits eingebaut.
Nachdem die Olignucleotide wie oben beschrieben synthetisiert waren, wurde jedes Oligonucleotid entschützt, entsalzt und durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit C18 Siliciumdioxid- und Triethylaminacetat-Acetonitril-Gradienten gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden anschließend gepoolt, mit Aceton präzipitiert, unter Vakuum getrocknet, gelöst und entsalzt.
Der Hexylaminrest jedes Oligonucleotids wurde dann mit dem entsprechenden Fluorophor, der einen N-Succinimidylester- oder einen Isothiocyanat-Anteil in einer Lösung aus Natriumbicarbonatpuffer, pH 9, 20% Dimethylsulfoxid enthielt, bei Raumtemperatur etwa 20 Stunden lang markiert. Jedes Oligonucleotid wurde anschließend mit Aceton präzipitiert, unter Vakuum getrocknet, gelöst und entsalzt.
Für eine spektroskopische Analyse der jeweiligen Oligonucleotide wurden vier bis fünf Picomol Oligonucleotid in einem Volumen von 0,6 ml gelöst. Jede Oligonucleotidlösung wurde mit einem analytischen Spektrofluorometer Shimadzu RFU 5000 analysiert. Zur Induzierung der geschlossenen Konformation, bei der das Oligonucleotid eine Haarnadel enthält, wurde das Oligonucleotid in einem Annealingpuffer mit 10 mM Tris-HCl, pH 8, 3 mM MgCl₂ und 50 mM NaCl gelöst. Die offene Konformation, bei der die Haarnadel nicht vorliegt, wurde durch Zugabe eines molaren Überschusses eines komplementären, unmarkierten Oligonucleotids zu jedem Oligonucleotid im Annealingpuffer induziert, wobei die Lösung drei Minuten lang auf 90°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur gekühlt wurde.
Der Fluoresceinanteil jedes Oligonucleotids in der offenen und der geschlossenen Konformation wurde durch Bestrahlung angeregt. In der folgenden Tabelle 1 wird dargestellt, dass eine solche Bestrahlung in einer wesentlichen Lichtemission von dem zweiten Fluorophor jedes Oligonucleotids in der offenen Konformation resultiert. In der geschlossenen Konformation weist jedoch jedes Oligonucleotid eine geringe Emission vom zweiten Fluorophor bei Fluorescein-Anregungswellenlängen auf.
Tabelle 1
2. Beispiel
Nachweis von zwei Zielnucleinsäuresequenzen in der PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Haarnadel-Oligonucleotids, das ein FRET-Trio enthält und eines Haarnadel-Oliaonucleotids, das ein FRET-Paar enthält
Eine Probe wird auf Anwesenheit von mRNA untersucht, die durch ein Prostata-spezifisches Antigen-(PSA)-Gen kodiert wird. Als Kontrolle zur Gewährleistung, dass eine PCR-Reaktion in der Probe stattfinden kann, wird eine cDNA-Menge zur Probe gegeben, die für das Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-(gapDH)-Gen spezifisch ist.
Die Haarnadel-Oligonucleotiden werden im Laufe der PCR als Vorwärtsprimer verwendet. Die Nucleotidsequenz des Vorwärtsprimers, der für die gapDH cDNA spezifisch ist, ist 5'-AGCGATGCGTTCGAGCATCGCTGAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'(SEQ ID Nr. 2), in der die Nucleotide an den Positionen 1 und 22 jeweils mit Fluorescein und DABSYL markiert sind und die Nucleotide an Position 5 oder 10 mit TAMRA markiert sind. Die Nucleotidsequenz des Haarnadel-Primers, der für die PSA mRNA spezifisch ist, lautet 5'-AGCGATGCGTTCGAGCATCGCTGAAGGTGACCAAGTTCAT-3'(SEQ ID Nr. 3), in der die Nucleotide an den Positionen 1 und 22 jeweils mit Fluorescein und DRBSYL markiert sind. Die Nucleotidsequenzen der Rückwärtsprimer, die für die gapDH cDNA und die PSA mRNA spezifisch sind, sind jeweils 5'-GGATCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3'(SEG ID Nr. 4) und 5'-GGTGTACAGGGAAGGCCTTTCGGGAC-3'(SEQ ID Nr. 5).
Jede PCR-Reaktionsprobe enthält in einer 0,2 ml PCR-Reaktionröhre 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 250 μm dNTPs, 0,25 μm von jedem Vorwärtsprimer, 0,25 μm von jedem Rückwärtsprimer, gapDH cDNA und 2 Einheiten Taq-Polymerase in 50 μl. Eine Vergleichsprobe enthält zusätzlich PSA mRNA, die zum Beispiel mit LNCaP Gewebekulturzellen produziert wird, die von der Amerikanischen Typus-Kultursammlung, Manassas, VA, erhältlich sind.
Jede Reaktionsröhre wird in einen Thermocycler wie z. B. ein ABI 7700 Echtzeitinstrument oder ein Perkin-Elmer 9600 oder 9700 gegeben. Das Zyklusprogramm ist wie folgt: [94°C, 4 min.] – [94°C, 15 sec.; 55°C, 30 sec.; 72°C, 1 min] 35 Zyklen - [72°C, 5 min] - [4°C, Halten]. Der Fortschritt der gapDH cDNA Amplifikation wird direkt verfolgt, indem die Emission von Licht mit einer Wellenlänge von 580 nm beobachtet wird (d. h. die Emission von TAMRA), während der Fortschritt der PSA mRNA Amplifikation direkt verfolgt wird, indem die Emission von Licht mit einer Wellenlänge von 530 nm beobachtet wird (die Emission von Fluorescein). Eine Endpunktanalyse erfolgt mit einem Fluoreszenzplattenleser, wie einem Wallac Victor, der mit Filtern ausgestattet ist, der den Nachweis von 530-nm- und 580-nm-Licht ermöglicht.

Claims

Oligonucleotid mit: (a) einer ersten Nucleotidsequenz; (b) einer zweiten Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz; (c) einer dritten Nucleotidsequenz am 5'-Ende der zweiten Nucleotidsequenz; und (d) einem molekularen Energietransfertrio, einschließlich eines Energiespenderanteils und eines ersten und zweiten Energieempfängeranteils, wobei der Energiespenderanteil ein Energiequantum abgeben kann und der erste und der zweite Empfängeranteil jeweils in der Lage sind, eine wesentliche Menge des Energiequantums zu absorbieren, der Spenderanteil an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt ist, der erste Empfängeranteil an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt ist, und der zweite Empfängeranteil an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt ist; oder der Spenderanteil an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt ist, der erste Empfängeranteil an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt ist, und der zweite Empfängeranteil an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt ist, das Oligonucleotid eine Haarnadel bilden kann, die ein Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz enthält, und, wenn der Spenderanteil das Energiequantum abgibt: (1) der erste Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen Energiequantums absorbiert, wenn die Haarnadel nicht gebildet wird, und (2) der zweite Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen Energiequantums absorbiert, wenn die Haarnadel gebildet wird.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei der erste Empfängeranteil die wesentliche Menge des abgegebenen Energiequantums nur dann absorbiert, wenn die Haarnadel nicht gebildet wird.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei der zweite Empfängeranteil die wesentliche Menge des abgegebenen Energiequantums nur dann absorbiert, wenn die Haarnadel gebildet wird.
Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend ein Desoxyribonucleotid.
Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend eine vierte Nucleotidsequenz am 3'-Ende der ersten Nucleotidsequenz.
Oligonucleotid nach Anspruch 5, wobei die dritte Nucleotidsequenz nicht komplementär zur vierten Nucleotidsequenz ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 5, wobei die vierte Nucleotidsequenz komplementär zur Nucleotidsequenz ist, die eine Zielnucleotidsequenz flankiert.
Oligonucleotid nach Anspruch 7, wobei die Zielnucleotidsequenz DNA ist.
Oligonucleotid nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Spenderanteil ein Fluorophor ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 9, wobei der zweite Empfängeranteil ein Quencher von Licht ist, das von dem Fluorophor abgegeben wird.
Oligonucleotid nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der erste Empfängeranteil noch ein zweites Energiequantum abgeben kann.
Oligonucleotid nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der erste Empfängeranteil ein Fluorophor ist.
Oligonucleotid nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Spenderanteil Fluorescein ist.
Oligonucleotid nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der erste Empfängeranteil ROX ist.
Oligonucleotid nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der zweite Empfängeranteil DABSYL ist.
Oligonucleotid nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei 0 bis 50 Nucleotide zwischen dem Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, und dem Nucleotid, an dem der erste Empfängeranteil angefügt ist, vorhanden sind.
Oligonucleotid nach Anspruch 16, wobei 5 bis 10 Nucleotide zwischen dem Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, und dem Nucleotid, an dem der erste Empfängeranteil angefügt ist, vorhanden sind.
Oligonucleotid nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei 0 bis 50 Nucleotide zwischen dem Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, und dem Nucleotid, an dem der zweite Empfängeranteil angefügt ist, vorhanden sind.
Oligonucleotid nach Anspruch 18, wobei 5 bis 10 Nucleotide zwischen dem Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, und dem Nucleotid, an dem der zweite Empfängeranteil angefügt ist, vorhanden sind.
Oligonucleotid nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei, wenn die Haarnadel gebildet wird, das Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, das Komplement des Nucleotid ist, an dem der zweite Empfängeranteil angefügt ist.
Oligonucleotid nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei, wenn die Haarnadel gebildet wird, 0 bis 5 Nucleotide zwischen dem Nucleotid, an dem der Spenderanteil angefügt ist, und dem Komplement des Nucleotids, an dem der zweite Empfängeranteil angefügt ist, vorhanden sind.
Oligonucleotid, umfassend die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, wobei Fluorescein an dem Nucleotid an Position 1 der SEQ ID Nr. 1 angefügt ist, ROX an dem Nucleotid an Position 21 der SEQ ID Nr. 1. angefügt ist, und DABSYL an dem Nucleotid an Position 5 oder 10 der SEQ ID Nr. 1 angefügt ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 22, bestehend aus der Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1.
Kit, umfassend das Oligonucleotid nach einem der vorherigenden Ansprüche und eine Polymerase.
Kit nach Anspruch 24, wobei die Polymerase eine DNA-Polymerase ist.
Verfahren zum Bestimmen, ob eine Zielnucleotidsequenz in einer Probe vorliegt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 11 bis 21 (in Rbhängigkeit von Anspruch 11), 22 oder 23; und (b) wenn das zweite Energiequantum nachgewiesen wird, Bestimmen, ob die Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt; oder, wenn das zweite Energiequantum nicht nachgewiesen wird, Bestimmen, ob die Zielnucleotidsequenz nicht in der Probe vorliegt.
Verfahren zum Bestimmen, ob eine Zielnucleotidsequenz in einer Probe vorliegt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 11 bis 21 (in Abhängigkeit von Anspruch 11), 22 oder 23; (b) Einbauen des Oligonucleotids in eine doppelsträngige Nucleinsäure, wenn die Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, so dass verhindert wird, dass die Haarnadel gebildet wird; (c) bei Bedarf Durchführen einer Amplifikationsreaktion, so dass das Oligonucleotid in ein Amplifikationsprodukt eingebaut wird, wenn die Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt; und (d) wenn das zweite Energiequantum nachgewiesen wird, Bestimmen, ob die Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt; oder, wenn das zweite Energiequantum nicht nachgewiesen wird, Bestimmen, ob die Zielnucleotidsequenz nicht in der Probe vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei in Schritt (b) das Oligonucleotid in die doppelsträngige Nucleinsäure unter Verwendung einer Polymerase eingebaut wird.
Verfahren für den Nachweis einer Zielnucleotidsequenz, umfassend die folgenden Schritte: (a) Anlagern eines ersten Oligonucleotids an eine Nucleotidsequenz, die eine Zielnucleotidsequenz flankiert, wobei das erste Oligonucleotid eines gemäß einem der Ansprüche 11 bis 23 ist; (b) Verlängern des 3'-Endes des ersten Oligonucleotids unter Verwendung der Zielnucleotidsequenz als Matrize, um einen verlängerten ersten Strang zu bilden, wobei die Zielnucleotidsequenz an den verlängerten ersten Strang angelagert wird; (c) Trennender Zielnucleotidsequenz von dem verlängerten ersten Strang; (d) Anlagern eines zweiten Oligonucleotids an den verlängerten ersten Strang; (e) Verlängern des 3'-Endes des zweiten Oligonucleotids unter Verwendung des verlängerten ersten Strangs als Matrize, um einen verlängerten zweiten Strang zu bilden, wobei der verlängerte erste Strang an den verlängerten zweiten Strang angelagert wird; (f) bei Bedarf Amplifizieren des verlängerten ersten und zweiten Strangs; und (g) Nachweisen eines zweiten Energiequantums, das von dem ersten Empfängeranteil abgegeben wird, um die Zielnucleotidsequenz nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei Schritt (f) Folgendes umfasst (1) Trennen des verlängerten ersten Strangs von dem verlängerten zweiten Strang; (2) Anlagern des ersten Oligonucleotids an den verlängerten zweiten Strang und Anlagern des zweiten Oligonucleotids an den verlängerten ersten Strang; (3) Verlängern des 3'-Endes des ersten Oligonucleotids unter Verwendung des verlängerten zweiten Strangs als Matrize, um einen weiteren, verlängerten ersten Strang zu bilden, wobei der verlängerte zweite Strang an den anderen verlängerten ersten Strang angelagert wird; und Verlängern des 3'-Endes des zweiten Oligonucleotids unter Verwendung des verlängerten ersten Strangs als Matrize, um einen weiteren verlängerten zweiten Strang zu bilden, wobei der verlängerte erste Strang an den anderen verlängerten zweiten Strang angelagert wird; und (4) Wiederholen der Schritte (1), (2) und (3) mit einer begrenzten Häufigkeit, wobei in Schritt (1) der verlängerte erste und zweite Strang jeweils der verlängerte erste Strang und der andere verlängerte zweite Strang aus Schritt (3) sind, oder jeweils der andere verlängerte erste Strang und der verlängerte zweite Strang aus Schritt (3) sind.
Verfahren für den Nachweis einer Zielnucleotidsequenz, umfassend die folgenden Schritte: (a) Anlagern eines ersten Nucleotids an eine Nucleotidsequenz, die eine Zielnucleotidsequenz flankiert, wobei das erste Oligonucleotid Folgendes enthält: (1) eine erste Nucleotidsequenz, die komplementär zu der Nucleotidsequenz ist, die die Zielnucleotidsequenz flankiert, und (2) eine zweite Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz; (b) Verlängern des 3'-Endes des ersten Oligonucleotids unter Verwendung der Zielnucleotidsequenz als Matrize zur Bildung eines verlängerten ersten Strangs, wobei die Zielnucleotidsequenz an den verlängerten ersten Strang angelagert wird; (c) Trennen der Zielnucleotidsequenz von dem verlängerten ersten Strang; (d) Anlagern eines zweiten Oligonucleotids an den verlängerten ersten Strang; (e) Verlängern des 3'-Endes des zweiten Oligonucleotids unter Verwendung des verlängerten ersten Strangs als Matrize zur Bildung eines verlängerten zweiten Strangs, wobei der verlängerte erste Strang an den verlängerten zweiten Strang angelagert wird; (f) Trennen des verlängerten ersten Strangs von dem verlängerten zweiten Strang; (g) Anlagern eines dritten Oligonucleotids an den verlängerten zweiten Strang, wobei das dritte Oligonucleotid Folgendes enthält: (1) eine erste Nucleotidsequenz, (2) eine zweite Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz, (3) eine dritte Nucleotidsequenz am 5'-Ende der zweiten Nucleotidsequenz, (4) eine vierte Nucleotidsequenz am 3'-Ende der ersten Nucleotidsequenz, und (5) ein molekulares Energietransfertrio, umfassend einen Energiespenderanteil und einen ersten und zweiten Energieempfängeranteil, wobei: die vierte Nucleotidsequenz komplementär zum Komplement der zweiten Nucleotidsequenz des ersten Oligonucleotids ist, der Spenderanteil ein erstes Energiequantum abgeben kann, der erste und der zweite Empfängeranteil jeweils in der Lage sind, eine wesentliche Menge des ersten Energiequantums zu absorbieren, der erste Empfängeranteil ein zweites Energiequantum abgeben kann, der Spenderanteil an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt ist, der erste Empfängeranteil an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt ist, und der zweite Empfängeranteil an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt ist; oder der Spenderanteil an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt ist, der erste Empfängeranteil an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt ist, und der zweite Empfängeranteil an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt ist, das dritte Oligonucleotid eine Haarnadel bilden kann, die ein Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz enthält, und, wenn der Spenderanteil das erste Energiequantum abgibt, der erste Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums absorbiert, wenn die Haarnadel nicht gebildet wird; und der zweite Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums absorbiert, wenn die Haarnadel gebildet wird; (h) Verlängern des 3'-Endes des dritten Oligonucleotids unter Verwendung des verlängerten zweiten Strangs als Matrize, um einen doppelt verlängerten ersten Strang zu bilden, wobei der doppelt verlängerte erste Strang analen verlängerten zweiten Strang angelagert wird; (i) Trennen des doppelt verlängerten ersten Strangs von dem verlängerten markierten zweiten Strang; (j) Anlagern des zweiten Oligonucleotids an den doppelt verlängerten ersten Strang; (k) Verlängern des 3'-Endes des zweiten Oligonucleotids unter Verwendung des doppelt verlängerten ersten Strangs als Matrize, um einen doppelt verlängerten zweiten Strang zu bilden, wobei der doppelt verlängerte erste Strang an den doppelt verlängerten zweiten Strang angelagert wird; (l) bei Bedarf Amplifizieren des doppelt verlängerten ersten und zweiten Strangs; und (m) Nachweisen eines zweiten Energiequantums, das von dem ersten Empfängeranteil abgegeben wird, um die Zielnucleotidsequenz nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei der erste Empfängeranteil die wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums nur dann absorbiert, wenn die Haarnadel nicht gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei der zweite Empfängeranteil die wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums nur dann absorbiert, wenn die Haarnadel gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei Schritt (1) Folgendes umfasst: (1) Trennen des doppelt verlängerten ersten Strangs von dem doppelt verlängerten zweiten Strang; (2) Anlagern des zweiten Oligonucleotids am doppelt verlängerten ersten Strang und Anlagern des dritten Oligonucleotids am doppelt verlängerten zweiten Strang; (3) Verlängern des 3'-Endes des zweiten Oligonucleotids unter Verwendung des doppelt verlängerten ersten Strangs als Matrize zur Bildung eines weiteren doppelt verlängerten zweiten Strangs, wobei der doppelt verlängerte erste Strang an den anderen doppelt verlängerten zweiten Strang angelagert wird; und Verlängern des 3'-Endes des dritten Oligonucleotids unter Verwendung des doppelt verlängerten zweiten Strangs als Matrize zur Bildung eines weiteren doppelt verlängerten ersten Strangs, wobei der doppelt verlängerte zweite Strang an dem anderen doppelt verlängerten ersten Strang angelagert wird; und (4) Wiederholen der Schritte (1), (2) und (3) mit einer begrenzten Häufigkeit, wobei in Schritt (1) der doppelt verlängerte erste und zweite Strang jeweils der doppelt verlängerte erste Strang und der andere doppelt verlängerte zweite Strang aus Schritt (3) sind, oder jeweils der andere doppelt verlängerte erste Strang und der doppelt verlängerte zweite Strang aus Schritt (3) sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31–34, wobei die dritte Nucleotidsequenz nicht komplementär zur vierten Nucleotidsequenz ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31–34, wobei die dritte Nucleotidsequenz komplementär zur Nucleotidsequenz ist, die die Zielnucleotidsequenz flankiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31–36, wobei der Spenderanteil Fluorescein ist.
Verfahren nach. einem der Ansprüche 31–37, wobei der erste Empfängeranteil ROX ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31–38, wobei der zweite Empfängeranteil DABSYL ist.
verfahren zum Bestimmen, ob eine erste oder zweite Zielnucleotidsequenz, in einer Probe vorliegt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkontaktbringen der Probe mit: (1) einem ersten Oligonucleotid, umfassend: (i) eine erste Nucleotidsequenz; (ii) eine zweite Nucleotidsequenz am 5'-Ende der ersten Nucleotidsequenz; (iii) eine dritte Nucleotidsequenz am 5'-Ende der zweiten Nucleotidsequenz; und (iv) ein molekulares Energietransfertrio, einschließlich eines ersten Energiespenderanteils und eines ersten und zweiten Energieempfängeranteils, wobei der erste Energiespenderanteil ein erstes Energiequantum abgeben kann, der erste und der zweite Empfängeranteil jeweils eine wesentliche Menge des Energiequantums absorbieren können, der erste Empfängeranteil ein drittes Energiequantum abgeben kann, der erste Spenderanteil an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt ist, der erste Empfängeranteil an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt ist, und der zweite Empfängeranteil an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt ist; oder der erste Spenderanteil an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt ist, der erste Empfängeranteil an einem Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz angefügt ist, und der zweite Empfängeranteil an einem Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz angefügt ist, das erste Oligonucleotid eine erste Haarnadel bilden kann, die ein Nucleotid der ersten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der dritten Nucleotidsequenz enthält, und, wenn der erste Spenderanteil das erste Energiequantum abgibt, der erste Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums absorbiert, wenn die erste Haarnadel nicht gebildet wird, und der zweite Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums absorbiert, wenn die erste Haarnadel gebildet wird, und (2) einem zweiten Oligonucleotid, umfassend; (i) eine vierte Nucleotidsequenz; (ii) eine fünfte Nucleotidsequenz am 5'-Ende der vierten Nucleotidsequenz; (iii) eine sechste Nucleotidsequenz am 5'-Ende der fünften Nucleotidsequenz; und (iv) ein molekulares Energietransferpaar; einschließlich eines zweiten Energiespenderanteils und eines dritten Energieempfängeranteils, wobei der zweite Energiespenderanteil ein zweites Energiequantum abgeben kann, der dritte Empfängeranteil eine wesentliche Menge des zweiten Energiequantums absorbieren kann, der dritte Empfängeranteil ein viertes Energiequantum abgeben kann, der zweite Spenderanteil an einem Nucleotid der vierten Nucleotidsequenz angefügt ist und der dritte Empfängeranteil an einem Nucleotid der sechsten Nucleotidsequenz angefügt ist; oder der zweite Spenderanteil an einem Nucleotid der sechsten Nucleotidsequenz angefügt ist und der dritte Empfängeranteil an einem Nucleotid der vierten Nucleotidsequenz angefügt ist, das zweite Oligonucleotid eine zweite Haarnadel bilden kann, die ein Nucleotid der vierten Nucleotidsequenz und ein Nucleotid der sechsten Nucleotidsequenz enthält, und, wenn der zweite Spenderanteil das zweite Energiequantum abgibt, der dritte Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen zweiten Energiequantums absorbiert, wenn die zweite Haarnadel gebildet wird, (b) Einbauen: (1) des ersten Oligonucleotids in eine erste doppelsträngige Nucleinsäure, wenn die erste Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, so dass verhindert wird, dass sich die Haarnadel des ersten Oligonucleotids bildet, und (2) des zweiten Oligonucleotids in eine zweite doppelsträngige Nucleinsäure, wenn die zweite Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, so dass verhindert wird, dass sich die Haarnadel des zweiten Oligonucleotids bildet, (c) bei Bedarf Durchführen: (1) einer ersten Amplifikationsreaktion, wodurch das erste Oligonucleotid in ein erstes Amplifikationsprodukt eingebaut wird, wenn die erste Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, und (2) einer zweiten Amplifikationsreaktion, wodurch das zweite Oligonucleotid in ein zweites Amplifikationsprodukt eingebaut wird, wenn die zweite Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt; und (d) Bestimmen, ob: (1) die erste Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, wenn ein von dem ersten Empfängeranteil abgegebenes drittes Energiequantum nachgewiesen wird, oder die erste Zielnucleotidsequenz nicht in der Probe vorliegt, wenn das dritte Energiequantum nicht nachgewiesen wird, und (2) die zweite Zielnucleotidsequenz in der Probe vorliegt, wenn ein von dem dritten Empfängeranteil abgegebenes viertes Energiequantum nachgewiesen wird, oder die zweite Zielnucleotidsequenz nicht in der Probe vorliegt, wenn das vierte Energiequantum nicht nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei der erste Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums nur dann absorbiert, wenn die erste Haarnadel nicht gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei der zweite Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen ersten Energiequantums nur dann absorbiert, wenn die erste Haarnadel gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 42, wobei der dritte Empfängeranteil eine wesentliche Menge des abgegebenen zweiten Energiequantums nur dann absorbiert, wenn die zweite Haarnadel gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 43, wobei das erste Oligonucleotid ferner eine siebte Nucleotidsequenz am 3'-Ende der ersten Nucleotidsequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die dritte Nucleotidsequenz nicht komplementär zur siebten Nucleotidsequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die siebte Nucleotidsequenz komplementär zu einer Nucleotidsequenz ist, die die erste Zielnucleotidsequenz flankiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 46, wobei das zweite Oligonucleotid ferner eine achte Nucleotidsequenz am 3'-Ende der vierten Nucleotidsequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei die sechste Nucleotidsequenz nicht komplementär zur achten Nucleotidsequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei die ächte Nucleotidsequenz komplementär zu einer Nucleotidsequenz ist, die die zweite Zielnucleotidsequenz flankiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40–49, wobei der erste und der zweite Spenderanteil jeweils Fluorescein sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40–50, wobei der erste Empfängeranteil ROX ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40–51, wobei der zweite und der dritte Empfängeranteil jeweils DABSYL sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40–52, wobei in Schritt (b) das erste Oligonucleotid in die ersten doppelsträngigen Nucleinsäuren unter Verwendung einer Polymerase eingebaut wird und das zweite Oligonucleotid in die zweite doppelsträngige Nucleinsäure unter Verwendung einer Polymerase eingebaut wird.