DE29521620U1 - Fluoreszierende Marker und diese enthaltender Reagenzsatz - Google Patents

Fluoreszierende Marker und diese enthaltender Reagenzsatz

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Description

TER MEER - STEINMEISTER & PARTNER PATENTANWÄLTE - EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
Dr. Nicolaus ter Meer, Dipl.-Chem. Helmut Steinmeister, Dipl.-lng.
Peter Urner, Dipl.-Phys. Manfred Wiefausoh Gebhard Merkle, Dipl.-lng. (FH)
Mauerkircherstrasse 45 Artur-Ladebeck-Strasse 51
D-81679 MÜNCHEN D-33617 BIELEFELD
Case: FA-59784-DE/BIR Me/tM/mr
12.09.1997
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA
Office of Technology Licensing Suite 510, 2150 Shattuck Avenue Berkeley, CA 94720-1620, U.S.A.
Fluoreszierende Marker und diese enthaltender Reagenzsatz
Abzweigung aus DE 195 81 489.4
Internationaler Anmeldetag: 30. Januar 1995, PCT/US95/01205 Priorität: 01. Februar 1994, 08/189,924, USA
EINFÜHRUNG
Technisches Gebiet
Das Gebiet der Erfindung betrifft fluoreszierende Marker und einen Reagenzsatz, welcher mindestens zwei dieser Marker umfaßt.
Hintergrund
Es besteht ein wachsendes Bedürfnis dafür, in der Lage zu sein, Komponenten oder Bestandteile von Mischungen zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen. Je komplexer die Mischung ist, um so größer ist das Interesse, dazu in der Lage zu sein, gleichzeitig eine Vielzahl der vorhandenen Komponenten nachzuweisen. Ein Beispiel für diese Situation ist die Sequenzierung von DNA, wo es er-
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wünscht ist, mit einer Laserquelle bei einer einzigen Wellenlänge in wirksamer Weise eine bis vier Fluoreszenz-markierte Komponenten anzuregen und eine Fluoreszenzsignalemission bei einer Vielzahl von unterscheidbaren Wellenlängen zu erzeugen. Bei dieser Situation sollten die verschiedenen Marker (Sonden oder Labei) die elektrophoretische Beweglichkeit der Sequenzen, an welche sie gebunden sind, nicht beeinträchtigen.
Derzeit werden vier Methoden für die automatisierte DNA-Sequenzierung angewandt: (1) Die DNA-Fragmente werden mit einem Fluorphor markiert, wonach man die Fragmente in benachbarten Sequenzierungsbahnen laufen läßt (Ansorge et al.. Nucleic Acids Res. 15 (1987), 4593-4602); (2) die DNA-Fragmente werden mit vier verschiedenen Fluorophoren markiert und sämtliche Fragmente werden in einer einzigen Bahn elektrophoretisch getrennt und nachgewiesen (Smith et al.. Nature 321 (1986), 674-679); (3) jedes der Dideoxynucleoside bei der Terminationsreaktion wird mit einem unterschiedlichen Fluorophor markiert und die vier Gruppen von Fragmenten werden in der gleichen Bahn laufen gelassen (Prober et al., Science 238 (1987), 336-341); oder (4) die Gruppen von DNA-Fragmenten werden mit zwei verschiedenen Fluorophoren markiert und die DNA-Sequenzen mit den Farbstoffverhältnissen codiert (Huang et al.. Anal. Chem. 64 (1992), 2149-2154).
AU diese Methoden besitzen signifikante Nachteile. Die Methode 1 besitzt die möglichen Probleme von unterschiedlichen Beweglichkeiten in den verschiedenen Bahnen sowie einen geringen Durchsatz. Die Methoden 2 und 3 machen es erforderlich, daJ3 die vier Farbstoffe durch eine Laserquelle gut angeregt werden und daj3 sie deutlich unterschiedliche Emissionsspektren besitzen. In der Praxis ist essehr schwierig, zwei oder mehrere Farbstoffe zu finden, welche in wirksamer Weise mit einem einzigen Laser angeregt werden können und die gut getrennte Fluoreszenzsignale emittieren.
Wenn man Farbstoffe auswählt, die deutlich Rot-verschobene Emissionsspektren besitzen, werden deren Absorptionsmaxima ebenfalls in den roten Bereich bewegt, so daj3 sämtliche Farbstoffe nicht mehr in wirksamer Weise mit der gleichen Laserquelle angeregt werden können. Weiterhin wird es in dem MaJ3e, in dem mehr unterschiedliche Farbstoffe ausgewählt werden, schwieriger, alle Farbstoffe derart auszuwählen, daß sie die gleiche Beweglichkeitsverschiebung der mar-
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kierten Moleküle verursachen.
Es besteht daher ein wesentliches Interesse dafür, verbesserte Methoden zu schaffen, mit denen ein Multiplexing der Proben möglich wird, so daß eine Vielzahl der Bestanteile oder Komponenten in dem gleichen System und in einem einzigen Lauf bestimmt werden kann. Es ist weiterhin erwünscht, daJ3 jeder Marker eine starke Absorption bei einer gemeinsamen Wellenlänge besitzt, eine hohe Quantenausbeute der Fluoreszenz aufweist, eine starke Stokes-Verschiebung der Emission zeigt, daj3 die verschiedenen Emissionen unterscheidbar sind und daj3 die Marker die gleiche Mobilitätsverschiebung verursachen. Es ist schwierig, diese widersprüchlichen Ziele lediglich durch Markieren der Moleküle mit einem einzigen Farbstoff zu erreichen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung schafft Zusammensetzungen und Verfahren zur Analyse einer Mischung unter Verwendung einer Vielzahl von fluoreszierenden Markern (Sonden oder Label). Zur Erzeugung der Marker werden Paare oder Familien von Fluorophoren an ein Grundgerüst gebunden, insbesondere ein Nucleinsäure-Grundgerüst, wobei eines der Mitglieder der Familien bei etwa der gleichen Wellenlänge angeregt wird. Durch Ausnutzen des Phänomens der Energieübertragung wird erreicht, daß die anderen Mitglieder einer jeden Familie bei einer nachweisbar unterschiedlichen Wellenlänge emittieren. Der Bereich der Abstände zwischen den Donor- und Akzeptor-Chromophoren wird derart ausgewählt, daj3 eine wirksame Energieübertragung erreicht wird. Weiterhin werden gemeinsam verwendete Marker derart ausgewählt, daß sie in einem Trennsystem ungefähr die gleiche Mobilität besitzen. Dies wird dadurch erreicht, daJ3 man die Mobilität der markierten Einheit verändert, indem man den Abstand zwischen den zwei oder mehreren Mitgliedern der Familie der Fluorophore variiert und Marker mit der gleichen Mobilität auswählt. Die vorliegende Erfindung findet insbesondere Anwendung bei Sequenzieren, wo die Fluorophore an universale oder andere Primer gebunden werden und unterschiedliche Fluorophor-Kombinationen für die unterschiedlichen Dideoxynucleoside verwendet werden. Es werden auch Reagenssätze (Kits) von Marker-Kombinationen geschaffen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Fig. 1 verdeutlicht die Absorptions- und Emissionsspektren von FAM-3-TAM in
IxTBE;
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Fig. 2 zeigt ein CE-Elektropherogramm von FAM-3-TAM. Die Probe wurde durch typische Kapillarelektrophorese-DNA-Sequenzierungsbedingungen mit einer Anregung bei 488 nm analysiert. Die grüne Spur ist das in dem grünen Kanal (525 nm) nachgewiesene Fluoreszenzsignal, während die rote Spur das in dem roten Kanal (590 nm) nachgewiesene Fluoreszenzsignal darstellt. Beide Kanäle werden gleichzeitig nachgewiesen;
Fig. 3 zeigt die Darstellung des Absorptions- und Emissionsspektrums von
FAM-4-ROX in IxTBE;
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Fig. 4 zeigt ein CE-Elektropherogramm von FAM-4-ROX. Die Probe wurde unter typischen Kapillarelektrophorese-DNA-Sequenzierungsbedingungen mit einer Anregung bei 488 nm analysiert. Die grüne Spur ist das im grünen Kanal (525 nm) nachgewiesene Fluoreszenzsignal, während die rote Spur das in dem roten Kanal (590 nm) nachgewiesene Fluoreszenzsignal betrifft. Beide Kanäle werden gleichzeitig nachgewiesen;
Fig. 5 zeigt ein CE-Elektropherogramm von FAM-4-ROX und ROX-Primern. Die beiden Primer werden in gleichen Konzentrationen in 80 % Formamid vermischt und in die Kapillare injiziert. Die Fluoreszenzsignale werden bei einer Anregung bei 476 nm gleichzeitig in den grünen und roten Kanälen nachgewiesen;
Fig. 6 zeigt ein CE-Elektropherogramm einer Mischung aus FAM-3-ROX, FAM-4-ROX und FAM-10-ROX und verdeutlicht die Abhängigkeit der Mobilität vom Abstand zwischen Donor und Akzeptor. Die Probe wurde unter typischen Kapillarelektrophorese-DNA-Sequenzierungsbedingungen bei einer Anregung von 488 nm analysiert; und
Fig. 7 zeigt einen Vergleich der Mobilitätsverschiebung unterschiedlicher Farbstoffprimer an M13 mp 18 A-Fragment-DNA-Proben.
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BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFUHRUNGSFORMEN
Es werden neue fluoreszierende Marker, Kombinationen von fluoreszierenden Markern und deren Verwendung bei Trennungssystemen, welche die Trennung einer Vielzahl von Komponenten umfassen, bereitgestellt. Insbesondere umfassen die fluoreszierenden Marker Paare von Fluorophoren, welche, mit einer Ausnahme, gemäß der die Fluorophore die gleichen sind, unterschiedliche Fluorophore mit überlappenden Spektren umfassen, wobei die Donoremission die Akzeptorabsorption überlappt, so daß sich eine Energieübertragung von dem angeregten Fluorphor auf das andere Mitglied des Paares ergibt. Es ist nicht wesentlich, daß der angeregte Fluorophor tatsächlich fluoresziert, da es genügt, daß der angeregte Fluorophor dazu in der Lage ist, die Anregungsenergie in wirksamer Weise zu absorbieren und sie in wirksamer Weise auf den emittierenden Fluorophor zu übertragen.
Die Donor-Fluorophore der verschiedenen Familien von Fluorophoren können gleichartig oder verschieden sein, sind jedoch dazu in der Lage, in wirksamer Weise durch eine einzige Lichtquelle mit enger Bandbreite, insbesondere eine Laserquelle, angeregt zu werden. Die Donor-Fluorophore besitzen eine signifikante Absorption von im allgemeinen mindestens etwa 10 %, vorzugsweise mindestens etwa 20 % des Absorptionsmaximums innerhalb von 20 nm voneinander, im allgemeinen innerhalb 10 nm und noch allgemeiner innerhalb 5 nm voneinander. Die emittierenden oder Akzeptor-Fluorophore werden so ausgewählt, daß sie in der Lage sind, die Energie von den Donor-Fluorophoren aufzunehmen und Licht zu emittieren, welches unterscheidbar und nachweisbar unterschiedlich ist. Demzufolge ist man in der Lage, zwischen den Komponenten der Mischung, an die die verschiedenen Marker gebunden worden sind, zu unterscheiden. Im allgemeinen emittieren die Marker bei Emissionsmaxima, die um mindestens 10 nm, vorzugsweise mindestens 15 nm und noch bevorzugter mindestens 20 nm voneinander getrennt sind.
Im allgemeinen absorbieren die Donor-Fluorophore im Bereich von etwa 350 bis 800 nm und noch allgemeiner im Bereich von etwa 350 bis 600 nm oder 500 bis 750 nm, während die Akzeptor-Fluorophore Licht im Bereich von etwa 450 bis 1000 nm, im allgemeinen im Bereich von etwa 450 bis 800 nm emittieren. Wie nachfolgend noch erläutert werden wird, kann mehr als ein Paar von absorbieren-
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den Molekülen angewandt werden, so daß man drei oder mehr Moleküle einsetzen kann, wobei die Energie bei höheren Wellenlängen von einem Molekül zum nächsten übertragen wird, um in dieser Weise den Wellenlängenunterschied zwischen der Absorption und der beobachteten Emission im starkem Maße zu vergrößern. 5
Die beiden Fluorophore sind über ein Grundgerüst oder eine Kette, im allgemeinen eine Polymerkette, verbunden, wobei der Abstand zwischen den beiden Fluorophoren variiert werden kann. Die physikalischen Grundlagen der Auslegung der Marker sind so, daj3 die Übertragung der optischen Anregung von dem Donor auf den Akzeptor von der Beziehung 1 /R^ abhängt, worin R für den Abstand zwischen den beiden Fluorophoren steht. Somit muß der Abstand derart ausgewählt werden, daß sich eine wirksame Energieübertragung gemäß dem gut bekannten Foerster-Mechanismus von dem Donor zu dem Akzeptor ergibt. Somit kann der Abstand zwischen den beiden Fluorophoren, der durch die Anzahl der Atome in der die beiden Fluorophore trennenden Kette bestimmt wird, in Abhängigkeit von der Art der Kette variiert werden. Man kann unterschiedliche Ketten oder Grundgerüste verwenden, beispielsweise Nucleinsäuren, sowohl DNA als auch RNA, modifizierte Nucleinsäuren, beispielsweise solche, bei denen Sauerstoffatome durch Schwefel, Kohlenstoff oder Stickstoff, Phosphate durch Sulfat oder Carboxylat etc. ersetzt sind. Polypeptide, Polysaccharide, verschiedene Gruppen, die stufenweise angefügt werden können, wie difunktionelle Gruppen, beispielweise Halogenamine oder dergleichen. Die Fluorophore können durch geeignete Funktionalisierung der verschiedenen, den Marker bildenden Blöcke substituiert sein, wobei der Fluorophor je nachdem, auf dem zur Bildung des Markers verwendeten Block vorliegen oder später angefügt werden kann. Man kann unterschiedliche herkömmliche chemische Verfahren anwenden, um sicherzustellen, daß der geeignete Abstand zwischen den beiden Fluorophoren erreicht wird.
Die Molekulargewichte der Marker (Fluorophore plus Grundgerüst, an die siegebunden sind) betragen im allgemeinen mindestens etwa 250 Dalton und nicht mehr als etwa 5.000 Dalton, im allgemeinen nicht mehr als etwa 2.000 Dalton.
Das Molekulargewicht des Fluorophors liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 250 bis 1.000 Dalton, wobei die Molekulargewichte der Akzeptor-Donor-Paare auf unterschiedlichen Markern, die gemeinsam verwendet werden, im allgemeinen um nicht mehr als etwa 20 % differieren. Die Fluorophore können im Inneren der Kette, an den Enden oder einer an einem Ende und der andere an einer Innen-
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position gebunden sein. Die Fluorophore können derart ausgewählt werden, daJ3 sie aus einer ähnlichen chemischen Familie stammen, wie Cyaninfarbstoffe, Xanthene oder dergleichen. Somit kann man die Donoren aus der gleichen chemischen Familie, jedes Donor-Akzeptor-Paar aus der gleichen chemischen Familie oder jeden Akzeptor aus der gleichen Familie auswählen.
Die erfindungsgemäJ3en Marker finden insbesondere Anwendung bei verschiedenen Trennungsmethoden, wie der Elektrophorese, der Chromatographie oder dergleichen, bei denen man darauf abzielt, optimierte spektroskopische Eigenschäften, hohe Empfindlichkeit und einen vergleichbaren Einfluß der Marker auf das Wanderungsverhalten der zu analysierenden Komponenten vorliegen zu haben. Von besonderem Interesse ist die Elektrophorese, wie die Gelelektrophorese, die Kapillarelektrophorese etc. Beispiele für chromatographische Methoden sind die HPLC-Chromatographie, die Affinitätschromatographie, die Dünnschichtchromatographie, die Papierchromatographie und dergleichen.
Es hat sich gezeigt, daJ3 der Abstand zwischen den beiden Fluorophoren die Beweglichkeit des Markers beeinflußt. Demzufolge kann man unterschiedliche Farbstoffpaare verwenden und durch Variation des Abstands zwischen den verschiedenen Farbstoffpaaren, innerhalb eines Bereichs, der noch eine gute Energieübertragung ermöglicht, eine im wesentlichen konstante Beweglichkeit oder Mobilität der Marker sicherstellen. Die Mobilität steht zu dem spezifischen Abstand nicht in Beziehung, so daß die Wirkung des Abstands auf die Mobilität eines besonderen Markers empirisch bestimmt werden muj3. Jedoch kann man aufgrund der Flexibilität des Abstands der Fluorophore in den Markern durch Synthese einiger unterschiedlicher Marker mit unterschiedlichen Abständen und unterschiedlichen Farbstoffpaaren eine Familie von fluoreszierenden Markern schaffen, welche eine gemeinsame Anregung, eine starke und unterscheidbare Emission und im wesentlichen eine gemeinsame Mobilität besitzen. Im allgemeinen unterscheidet sich die Mobilität der Marker voneinander um nicht mehr als etwa 20 %, vorzugsweise nicht mehr als etwa 10 % und noch bevorzugter nicht mehr als etwa 5 %, wenn sie für eine besondere Trennung eingesetzt werden. Die Mobilität kann im allgemeinen dadurch bestimmt werden, daß man die Trennung der Marker als solche durchführt oder die Trennung der Marker, die an ein gemeinsames Molekül gebunden sind, welches für die besondere Trennung wesentlich ist, beispielsweise ein Nucleinsäuremolekül der geeigneten Größe, wenn die
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angestrebte Anwendung die Sequenzierung ist.
Man kann eine große Vielzahl von fluoreszierenden Farbstoffen verwenden. Diese Farbstoffe fallen in verschiedenartige Klassen, wobei Kombinationen von Farbstoffen, die der gleichen Klasse oder unterschiedlichen Klassen angehören, eingesetzt werden können. Eingeschlossen hierin sind Farbstoffe, wie die Xanthenfarbstoffe, beispielsweise Fluoresceine und Rhodamine, Cumarine, beispielsweise Umbelliferon, Benzimidfarbstoffe, beispielsweise Hoechst 33258, Phenanthridinfarbstoffe, beispielsweise Texas Red, und Ethidiumfarbstoffe, Acridinfarbstoffe, Cyaninfarbstoffe, wie Thiazolorange, Thiazolblau, Cy 5 und Cyfr, Carbazolfarbstoffe, Phenoxazinfarbstoffe, Porphyrinfarbstoffe, Chinolinfarbstoffe oder dergleichen. Somit können die Farbstoffe im ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Bereich absorbieren. In der Mehrzahl der Fälle besitzen die fluoreszierenden Moleküle ein Molekulargewicht von weniger als etwa 2 kDalton und im allgemeinen weniger als etwa 1,5 kDalton.
Der Energiedonor sollte einen starken molaren Absorptionskoeffizienten bei der angestrebten Anregungswellenlänge besitzen, der wünschenswerterweise größer als 10^, vorzugsweise größer als etwa 10^ cm" 1 M'l ist. Das Anregungsmaximum des Donors und das Emissionsmaximum des Akzeptors (Fluoreszor) sind um mindestens 15 nm oder mehr getrennt. Das spektrale Überlappungsintegral zwischen dem Emissionsspektrum des Donor-Chromophors und dem Absorptionsspektrum des Akzeptor-Chromophors und der Abstand zwichen den Chromophoren werden derart ausgewählt, daß die Wirksamkeit der Energieübertragung von dem Donor auf den Akzeptor sich von 20 bis 100 % erstreckt.
DieTrennung von Donor undAkzeptor auf der Grundlage der Anzahl der Atome in der Kette variiert in Abhängigkeit von der Art des Grundgerüsts, davon, ob es starr oder flexibel ist oder ob es Ringstrukturen oder nicht-cyclische Strukturen oder dergleichen umfaßt. Im allgemeinen liegt die Anzahl der Atome in der Kette (wobei die Atome in den Ringstrukturen als die niedrigste Zahl von Atomen der Seite des Rings, der in die Kette eingeschlossen ist, gerechnet wird) unterhalb etwa 200, im allgemeinen unterhalb etwa 150 Atomen, vorzugsweise unterhalb etwa 100 Atomen, wobei die Art des Grundgerüsts die Wirksamkeit der Energieübertragung zwischen Donor und Akzeptor beeinflußt.
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Wenngleich im allgemeinen Paare von Fluorophoren verwendet werden, können sich auch Situationen ergeben, bei denen bis zu vier unterschiedliche, im allgemeinen nicht mehr als drei unterschiedliche Fluorophore, die an das gleiche Grundgerüst gebunden sind, Anwendung finden. Durch die Verwendung mehrerer Fluorophore kann man die Stokes-Verschiebung in starkem MaJ3e vergrößern, so daJ3 man die Anregung im sichtbaren Wellenlängenbereich bewirken und die Emission im infraroten Wellenlängenbereich im allgemeinen unterhalb etwa 1.000 nm und allgemeiner unterhalb etwa 900 nm erreichen kann. Der Nachweis von Licht im infraroten Wellenlängenbereich besitzt viele Vorteile, da es keine Beeinflussung durch sich aus dem anregenden Licht ergebendem Raman- und Rayleigh-Licht unterliegt. Um die Mobilität konstant zu halten, kann man die gleiche Anzahl von Fluorophoren auf den Markern verwenden, die eine Vielzahl des gleichen Fluorophors aufweisen, welche der Anzahl der Fluorophore auf Markern mit unterschiedlichen Fluorophoren zur Erzeugung einer groj3en Stokes-Verschiebung entspricht.
Die vorliegende Erfindung findet insbesondere Anwendung bei Nucleinsäureketten, welche Nucleinsäureketten als Primer beim Sequenzieren, der Polymerasekettenreaktion, insbesondere für das Sizing, oder andere Systeme, bei denen Primer für die Nucleinsäureverlängerung verwendet werden und angestrebt wird, zwischen den verschiedenen Komponenten der Mischung in Abhängigkeit von den besonderen Markern zu unterscheiden. Beispielsweise kann man beim Sequenzieren universale Primer verwenden, wobei fürjedes der bei der Ausdehnung während des Sequenzierens verwendeten verschiedenen Dideoxynucleoside ein unterschiedliches Paar von Fluorophoren eingesetzt wird.
Es ist eine große Vielzahl von Nucleosiden erhältlich, welche funktionalisiert sind und bei der Synthese eines Polynucleotide verwendet werden können. Durch Synthese der vorliegenden Nucleinsäure-Marker kann man die spezifischen Stellen definieren, an denen die Fluorophore vorhanden sind. Man kann im Handel erhältliche Syntheseeinrichtungen unter Anwendung üblicher Verfahrensweisen anwenden, so daß man irgendeine Sequenz erhalten kann, bei der das Paar der Fluorophore den geeigneten Abstand aufweist.
Wenn unterschiedliche Primer bei der PCR verwendet werden, kann jeder der Primer erfindungsgemäß markiert werden, so daß es ohne weiteres möglich ist, die
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Anwesenheit derTarget-Sequenz, die für jeden der verschiedenen Primer komplementär ist, nachzuweisen. Weitere Anwendungen ergeben sich bei der Identifizierung von Isozymen unter Verwendung von spezifischen Antikörpern, bei der Identifizierung von Lectinen unter Verwendung unterschiedlicher Polysaccharide und dergleichen.
Wie bereits angegeben worden ist, finden die in Rede stehenden Marker insbesondere Anwendung beim Sequenzieren. Beispielsweise kann man universale Primer herstellen, wobei der Primer irgendeiner der universalen Primer ist, der durch Binden der beiden Fluorophore an den Primer modifiziert worden ist. So sind verschiedene handelsübliche Primer erhältlich, wie Primer aus pUC/M13, RgtlO, Rgt 11 und dergleichen. Siehe auch Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., CSHL (1989), Sektion 13. Die DNA-Sequenzen werden in einem geeigneten Vektor geklont, welcher eine Primer-Sequenz aufweist, die an die zu sequenzierende Sequenz gebunden ist. Es werden unterschiedliche 2',3'-ddNTP verwendet, so daj3 die Termination an unterschiedlichen Stellen erfolgt in Abhängigkeit von dem besonderen ddNTP, welches in der Kettenverlängerung vorhanden ist. Durch Verwendung der in Rede stehenden Primer wird jedes ddNTP mit einem bestimmten Marker assoziiert. Nach der Extension mit dem KIenow-Fragment können die sich ergebenden Fragmente dann in einer einzigen Bahn durch Elektrophorese oder in einer einzigen Kapillare durch Elektrophorese getrennt werden, wobei man das endständige Nucleotid durch die Fluoreszenz des Markers nachweisen kann.
Man kann die in Rede stehenden Marker auch mit Immunkomplexen verwenden, bei denen die Liganden oder Rezeptoren, beispielsweise Antikörper, markiert werden können, um die verschiedenen Komplexe oder Mitglieder der Komplexe nachzuweisen. Wenn die Liganden bei der Trennungsmethode die gleiche Wanderungsfähigkeit besitzen, kann man zur Bestimmung der Anwesenheit eines oder mehrerer solcher Liganden die verschiedenen Antikörper mit den unterschiedlichen Markern, die bei unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren, markieren, so daj3 sie auch dann nachweisbar sind, wenn sich eine Überlappung der Zusammensetzungen bei der Trennung ergibt.
Es werden Reagenssätze oder Kits geschaffen, welche Kombinationen von Markern, im allgemeinen mindestens zwei, umfassen. Jeder der Marker besitzt das
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Akzeptor-Donor-Paar, im allgemeinen mit vergleichbaren Grundgerüsten, wobei die Marker längs des Grundgerüsts in der Weise getrennt sind, daj3 sich eine vergleichbare Mobilität bei der anzuwendenden Trennungsmethode ergibt. Jeder der Marker in einer Gruppe, die gemeinsam verwendet werden sollen, absorbiert etwa die gleiche Wellenlänge und emittiert bei unterschiedlichen Wellenlängen. Jeder der Marker in der Gruppe besitzt etwa die gleiche Wirkung auf die Mobilität bei der Trennungsmethode als Ergebnis einer Variation der Anordnung der unterschiedlichen Fluorophore längs des Grundgerüsts.
Die Reagenssätze umfassen im allgemeinen bis zu etwa sechs, allgemein bis zu etwa vier unterschiedliche Marker, die zueinander passen, können jedoch auch zwei oder mehr Sätze von aufeinander angepaßten Markern mit zwei bis sechs unterschiedlichen Markern umfassen.
Von besonderem Interesse sind Marker mit einem Nucleinsäure-Grundgerüst, wobei die Marker im allgemeinen mindestens etwa 10 Nucleotide und nicht mehr als etwa 50 Nucleotide, im allgemeinen nicht mehr als etwa 30 Nucleotide aufweisen. Die Marker können auf den Nucleotiden vorliegen, welche zu der komplementären Sequenz hybridisieren, oder können von diesen Nucleotiden getrennt vorliegen. Die Fluorophore sind im allgemeinen über eine geeignete Verbindungskette von etwa 2 bis 20, allgemein 4 bis 16 Atomen in der Kette an das Nucleotid gebunden. Die Kette kann eine Vielzahl von funktionellen Gruppen aufweisen, insbesondere Non-oxocarbonylgruppen, insbesondere Ester- und Amid-, Amino-, Oxygruppen und dergleichen. Die Kette kann aliphatisch, alicyclisch, aromatisch, heterocyclisch oder eine Kombination davon sein und umfaßt im allgemeinen Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefelatome oder dergleichen in der Kette.
Die gesamte Nucleinsäuresequenz kann zu der 5'-Primersequenz komplementär sein oder kann lediglich zu dem 3'-Abschnitt der Sequenz komplementär sein. Im allgemeinen sind mindestens etwa 4 Nucleotide vorhanden, allgemeiner mindestens etwa 5 Nucleotide, welche bezüglich der zu kopierenden Sequenz komplementär sind. Die Primer werden mit der zu kopierenden Sequenz in dem geeigneten Plasmid kombiniert, welches die Primersequenz am 3'-Ende des zu kopierenden Strangs aufweist und zugesetztes dNTP mit einer geringen Menge des geeigneten ddntp. Nach der Extension kann die DNA isoliert und zur Trennung auf
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ein Gel oder eine Kapillare übertragen werden.
Die zu verwendenden Reagenssätze oder Kits umfassen mindestens zwei der in Rede stehenden Marker, welche derart aufeinander angepaßt sind, daj3 sie im wesentlichen die gleiche Absorption des Donor-Moleküls, unterschiedliche Emissionsspektren und im wesentlichen die gleiche Mobilität besitzen. Im allgemeinen beträgt bei einsträngigen Nucleinsäuren der Abstand zwischen den Fluorophorenetwa 1 bis 15, allgemeiner 1 bis 12 undvorzugsweiseetwa2bis 10 Nucleoside.
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Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.
Experimentelles
15
Auslegung und Synthese von mit Energie-Übertraguns-Fluoreszenzfarbstoffen markierten Oligonucleotid-Markern für die Genanalyse
Man synthetisiert Deoxyoligonucleotide (mit einer Länge von 12 Basen) mit der Sequenz S^GTnTCCCAGTC-S1, welche aus dem universalen Primer M13 ausgewählt ist, mit Donor-Akzaptor-Fluorophor-Paaren, die mit unterschiedlichen Abständen voneinander getrennt sind. Insbesondere enthält das 12-mer eine modifizierte Base, welche durch die Verwendung von 5'-Dmiethoxytrityl-5-[N-(trifluoracetylaminohexyl)-3-acrylimido3-2'-deoxyuridin,3'-[{2-Cyanoethyl)-(N,N-diisopropyDI-phosphoramidit (Amino-Modifizierungsmittel C6 dT) (Struktur 1) eingeführt worden ist, welche in der C-5-Position eine Verbindungskette (Linker) mit primärem Amin aufweist.
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Case: FA-59784-DE/BIR
DMTO-^1
0-P-N(JPr)2 0-CH2CH2CN
Struktur 1. Amino-Modifizierungsmittel C6 dT
Der Donor-Farbstoff wird an das 5'-Ende des Oligomers gebunden und der Akzeptor-Farbstoff wird an die primäre Aminogruppe an dem modifizierten Tgebunden. Die Abstände zwischen Donor und Akzeptor werden durch Variieren der Position des modifizierten T in dem Oligomer geändert. Die Primer werden als D-N-A bezeichnet, worin D für den Donor, A für den Akzeptor und N für die Anzahl der Basen zwischen D und A stehen. In sämtlichen hergestellten Primern handelt es sich bei D um den Farbstoff FAM, ein Fluorescein-Derivat, der Firma Applied Biosystems Inc. ("ABI"), während als A die Farbstoffe TAM oder ROX der Firma ABI eingesetzt werden, welches beide Rhodamin-Derivate sind. Als repräsentatives Beispiel ist im folgenden die Struktur von FAM-3-TAM dargestellt (Struktur 2).
HO.
Farn: abs, 495 &tgr;&igr;&tgr;&eegr;; em, 525 mn
&Zgr;— NH—(CH^i— NH-C=O Struktur 2. FAM-3-TAM
Die Vorteile des hierin beschriebenen Ansatzes der Energieübertragung sind darin zu sehen, daj3 (1) mit einer Anregung bei 488 nm eine große Stokes-Verschiebung und wesentlich stärkere Fluoreszenzsignale erzeugt werden können und daJ3 (2) die Mobilität der Primer durch Variation der Abstände zwischen dem Do-
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nor und dem Akzeptor derart eingestellt werden können, daJ3 die gleiche Mobilität erreicht wird. Das sichtbare Spektrum von FAM-3-TAM besitzt sowohl die Absorption von FAM (495 nm) und von TAM (560 nm), wobei jedoch mit einer Anregung bei 488 nm annähernd die gesamte Emission von T ausgeht mit einem Maximum bei 579 nm (Fig. 1). Dies verdeutlicht die wirksame Fluoreszenzenergieübertragung von FAM auf TAM. Dies kann auch dadurch verdeutlicht werden, daj3 man den Primer durch eine Kapillarelektrophorese (CE)-Säule führt und den Nachweis in roten und grünen Kanälen bewirkt. Mit einem FAM- und TAM-markierten Primer tritt annähernd die gesamte Emission in dem roten Kanal (590 nm) auf (Fig. 2), was daraufhinweist, daß die Energie von dem Donor FAM annähernd vollständig auf den Akzeptor TAM übertragen worden ist, wodurch sich eine Stokes-Verschiebung von 91 nm ergibt. Die Beobachtung eines einzigen Peaks weist daraufhin, daJ3 der Primer rein ist. Das gleiche Ergebnis ergibt sich mit FAM-4-ROX, welcher eine noch größere Stokes-Verschiebung von 114 nm erzeugt (Fig. 3 und 4). Man beobachtet eine Verstärkung der Fluoreszenzsignale bei den Energieübertragungs-Primern im Vergleich zu Primern, die mit einem einzigen Farbstoff markiert worden sind, wobei in diesem Fall ein ABI ROX-Primer in dergleichen Konzentration wie FAM-4-ROX (durch UV gemessen) in die gleiche Kapillare injiziert worden ist. Es ist ersichtlich, daJ3 das sich ergebende Fluoreszenzsignal von FAM-4-ROX mehr als 10-mal größer ist als das des ROX-Primers (Fig. 5).
Für die erfolgreiche Anwendung der mit Donor-Akzeptor-Fluorophoren markierten Primer beim DNA-Sequenzieren ist es wesentlich, daß die Primer die gleiche Mobilitäts-Verschiebung der DNA-Fragmente ergeben und unterschiedliche FIuoreszenzsignale zeigen. Es hat sich gezeigt, daß die Mobilität der Primer von dem Abstand zwischen Donor und Akzeptor abhängt (Fig. 6). FAM-4-ROX, FAM-3-ROX und FAM-IO-ROX wurden auf einer Kapillare getrennt und in den roten und grünen Kanälen nachgewiesen. Im Fall von FAM-IO-ROX verringert der vergrößerte Abstand zwischen den Farbstoffen die Menge der Energieübertragung, was zu annähernd gleichen Signalen in beiden Kanälen führt. In dem Maß, in dem der trennende Abstand verringert wird, nimmt das Ausmaß der Energieübertragung zu, was durch das verringerte relative grüne Signal verdeutlicht wird. FAM-3-ROX und FAM-4-ROXzeigenjeweils eine ausgezeichnete Energieübertragung, jedoch sind ihre Mobilitäten deutlich verschieden, was die Möglichkeit eröffnet, die Mobilitätsverschiebung durch Variieren des Abstands gezielt einzustellen. Um eine genaue Anpassung der Mobilität zweier Primer mit unterschiedlichen Emis-
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sionsspektren zu erreichen, wurden auch FAM-3-FAM, FAM-4-FAM und FAM-10-FAM hergestellt. In einer Bibliothek von hergestellten Primern (FAM-N-FAM, FAM-N-TAM, FAM-N-ROX) hat sich gezeigt, daß A-Endgruppen aufweisende sequenzierende Fragmente, die mit FAM-IO-FAM und FAM-3-R0X unter Verwendung von Sequenase 2 hergestellt worden sind, sehr ähnliche Mobilitätsverschiebungen zeigen (Fig. 7), was ihr Potential für die DNA-Sequenzanalyse verdeutlicht. Die Emissionen von FAM-10-FAM bzw. FAM-3-ROX liegen bei 525 nm bzw. 605 nm. Die Raman-Signale von Wasser sind bei diesen beiden Wellenlängen zu vernachlässigen. Somit ergibt sich ein dramatisch gesteigertes Signal/Untergrund-Verhältnis.
I. Herstellung von 12-mer Oligonucleotiden, weiche ein modifiziertes T und einen FAM-Marker an der 5'-Stellung besitzen
Die folgenden drei Primer wurden mit einer DNA-Synthetisiereinrichtung Modell 394 der Firma ABI im 0,2 &mgr;&Mgr;&ogr;&Igr;-Ma.ßstab hergestellt:
1 FAM-5'-GTn*TCCCAGTC-3'
(CH)2(CO)-NH-(CH2)O-NH2
2 FAM-5'-GTTTT*CCCAGTC-3'
(CH)2(CO)-NH-(CH2)O-NH2
3 FAM-5'-GTTrTCCCAG1*C-3'
" (CHMCO)-NH- (CH2)^NH2
Die modifizierte Base T*, die eine Amino-Verbindungskette aufweist, wird unter Verwendung des Amino-Modifizierungsmittels C6 dT Phosphoramidite (Glen Research) an der definierten Position eingeführt und FAM wird unter Verwendung von 6-FAM-Amidite (ABI) in der letzten Stufe der Synthese eingeführt. Nachdem die Basensequenzen vollständig sind, werden die Oligonucleotide mit 1 ml konzentrierter NH4OH von dem festen Träger (CPG) abgespalten. Die Aminoschutzgruppen an den Basen (A, G, C und T*) werden durch Erhitzen der NH^OH-Lösung während 4 Stunden auf ö5°C entfernt. Die Analyse durch Kapillarelektrophorese zeigt, daß die Oligomere zu etwa 80 % rein waren und sie wurden direkt in dem nächsten Farbstoff-Kupplungsschritt eingesetzt.
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II. Befestigung des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs an die Amino-Verbindungskette der Oligomeren 1. 2 und 3
Als repräsentatives Beispiel ist das Reaktionsschema zur Kupplung des zweiten Farbstoffs (TAM) an das Oligomer im folgenden dargestellt:
^f0 /TAM
1 + N-O-C
(CH)2(CO)-NH-(CH2)S-NH2 k^ H
Na2CO3ZNaHCO3 pH-9
DMSO
FAM-5M3TITTCCCAGTC-3'
(CH)2(CO)-NH-(CH2)^NH-C-TAM
FAM-3-TAM
Die mit FAM markierten Oligonucleotide (1, 2 und 3) werden über Nacht bei Raumtemperatur in 40 &mgr;&idiagr; 0,5 M eines Na2CO3/NaHCO3-Puffers mit dem etwa 150-fachen Überschuß von entweder TAM-NHS-Ester, ROX-NHS-Ester oder FAM-NHS-Ester in 12 &mgr;&idiagr; DMSO inkubiert. Der nicht umgesetzte Farbstoff wird durch Grö.ßenausschlu.ß-Chromatographie auf einer Sephadex G-25-Säule entfernt. Die mit den beiden Farbstoffen markierten Oligonucleotide wurden dann durch 6 M Harnstoff-TBE, 20 % Acrylamidgel-Elektrophorese (40 cmx 0,8 cm) gereinigt. Die reinen Primer wurden von dem Gel gewonnen und mit einer Oligonucleotid-Purification Cartridge entsalzt. Die Kapillargelelektrophorese zeigt, daj3 die Reinheit der Primer >99 % beträgt.
III. Herstellung von DNA-Sequenzierungsfragmenten mit FAM-3-ROX und FAM-1Q-FAM
Unter Verwendung von Sequenase 2.0 (USB) wurden M13mpl8 DNA-Sequenzierungsfragmente mit A-Endgruppen hergestellt. Es wurden zwei Bindungslösungen in 600 &mgr;&Igr;-Fläschchen hergestellt: (1) 10 &mgr;&idiagr; Reaktionspuffer, 40 &mgr;&idiagr; einsträngiger M 13mp 18-DNA und 6 &mgr;&idiagr; FAM-3-R0X; (2) 6 &mgr;&idiagr; Reaktionspuffer, 20 &mgr;&idiagr; einsträngiger M 13mp 18-DNA und 3 &mgr;&idiagr; FAM-IO-FAM. Jedes Fläschchen wurde während 5 Minuten auf 65°C erhitzt und dann während 30 Minuten auf Raumtemperatur ab-
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kühlen gelassen und anschließend während 20 Minuten auf Eis gestellt, um sicherzustellen, daj3 die kürzeren Primer vollständig zu der Matrize hybridisiert worden sind. Dann gibt man zu jedem auf Eis stehenden Fläschchen 3 &mgr;&idiagr; DTT, 20 &mgr;&idiagr; der ddA-Terminationsmischung und 12 &mgr;&idiagr; verdünnte Sequenase 2.0. Man inkubiert die Reaktionsmischungen anfänglich während 20 Minuten bei 200C und dann während weiterer 20 Minuten bei 37°C. Man unterbricht die Reaktion durch Zugabe von 50 &mgr;&idiagr; 50 mM EDTA, 40 &mgr;&idiagr; 4 M NH4OH und 300 &mgr;&idiagr; 95 % EtOH. Man vermischt die Lösungen gut und stellt während 20 Minuten auf Eis. Man entsalzt die Fragmente zweimal mit 75 %-iger kalter EtOH, trocknet im Vakuum und löst in 4 &mgr;&idiagr; 95 %-igem (V/V) Formamid und 50 mM EDTA. Man erhitzt die Probe während 3 Minuten zur Denaturierung der DNA und stellt dann bis zur Injektion der Probe in das Kapillarelektrophoresegerät auf Eis. Die elektrokinetische Injektion wird während 30 Sekunden bei 10 kV durchgeführt.
Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, daJ3 man verwandte Zusammensetzungen, beispielsweise mit zwei Fluorophoren funktionalisierte Polynucleotide derart einstellen kann, daß sich unterschiedliche Emissionswellenlängen bei hohen Emissionsquantenausbeuten ergeben bei im wesentlichen der gleichen Anregungs-Lichtabsorption und Mobilität. In dieser Weise können Mischungen von Komponenten unabhängig voneinander analysiert werden, wenn die unterschiedlichen Komponenten mit Markern, welche unterschiedliche Fluoreszenz-Emissionsbanden aufweisen, unterschiedlich markiert werden können. Weiterhin können die Zusammensetzungen ohne weiteres hergestellt und für eine Vielzahl von Anwendungszwecken eingesetzt werden und zeigen eine gute Stabilität und verbesserte Fluoreszenzeigenschaften.
Sämtliche in diese Beschreibung genannten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin so als Referenz eingefügt, als wenn jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als Referenz anzufügen angegeben worden wäre.
Wenngleich die obige Erfindung aus Gründen der Klarheit und des Verständnisses im Detail durch Erläuterung und mit Beispielen beschrieben worden ist, ist für den Fachmann ersichtlich, daß im Lichte der Lehre der vorliegenden Erfindung bestimmte Änderungen und Modifizierungen gemacht werden können, ohne daß der Geist oder der Umfang der beigefügten Ansprüche verlassen wird.

Claims (10)

TER MEER - STEINMEISTER & PARTNER -18 - THE REGENTS OF THE UNIVERSITY Case: FA-S9784-DE/BIR 12.09.1997 SCHUTZ AN SPRUCHE
1. Fluoreszierender Marker gekennzeichnet durch mindestens zwei an ein polymeres Grundgerüst gebundene Fluorophore, wobei mindestens ein Fluorophor an die endständige End-Grundeinheit des polymeren Grundgerüsts gebunden ist und der (die) andere(n) Fluorophor(e) an eine nicht-endständige Monomereneinheit des polymeren Grundgerüsts gebunden ist (sind) und der endständig gebundene Fluorophor mit dem (den) anderen Fluorophor(en) in Energieübertragungsbeziehung steht.
2. Marker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluorophore einen Donor- und einen Akzeptor-Fluorophor umfassen, wobei der Donor Licht im Wellenlängenbereich von 350 bis 800 nm absorbiert und der Akzeptor Licht im Wellenlängenbereich von 450 bis 1000 nm emittiert.
3. Marker nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daj3 der Unterschied zwischen den Emissionsmaxima der Donor- und Akzeptor-Fluorophore 100 nm nicht übersteigt.
4. Marker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daJ3 der Abstand zwischen dem Paar der Fluorophoren etwa 2 bis 20 Monomereinheiten des polymeren Grundgerüsts beträgt.
5. Marker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daj3 die Monomereneinheiten des polymeren Grundgerüsts eine aus der Purine, Pyrimidine und hybridisierende Analoge davon umfassenden Gruppe ausgewählte Base umfassen.
6. Marker nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daJ3 das polymere Grundgerüst ein Oligonucleotid ist.
7. Marker nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daJ3 das polymere Grundgerüst eine Peptid-nucleinsäure ist.
8. Marker nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daj3 die Fluorophore einen Donor- und Akzeptor-Fluorophor umfassen und der Donor-Fluorophor an
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THE REGENTS OF THE UNIVERSITY Case: FA-59784-DE/BIR 12.09.1997
1 das 5'-Ende des Oligonucleotids gebunden ist.
9. Marker nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daJ3 die Fluorophore einen Donor- und einen Akzeptor-Fluorophor umfassen und der 5 Akzeptor-Fluorophor an das 5'-Ende des Oligonucleotids gebunden ist.
10. Reagenzsatz, dadurch gekennzeichnet, daJ3 er mindestens zwei fluoreszierende Marker gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 10 umfaj3t.
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WO (1) WO1995021266A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999047700A1 (de) * 1998-03-18 1999-09-23 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Verfahren und vorrichtung zum nachweis einer nukleotidsequenz

Families Citing this family (284)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7273749B1 (en) 1990-06-04 2007-09-25 University Of Utah Research Foundation Container for carrying out and monitoring biological processes
US5935522A (en) * 1990-06-04 1999-08-10 University Of Utah Research Foundation On-line DNA analysis system with rapid thermal cycling
US7081226B1 (en) 1996-06-04 2006-07-25 University Of Utah Research Foundation System and method for fluorescence monitoring
US6238931B1 (en) * 1993-09-24 2001-05-29 Biosite Diagnostics, Inc. Fluorescence energy transfer in particles
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US6821727B1 (en) 1993-11-15 2004-11-23 Applera Corporation Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe
US5654419A (en) * 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations
US6028190A (en) 1994-02-01 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Probes labeled with energy transfer coupled dyes
US6426190B1 (en) * 1995-04-20 2002-07-30 Carnegie Mellon University Difference detection methods using matched multiple dyes
US6127134A (en) * 1995-04-20 2000-10-03 Carnegie Mellon University Difference gel electrophoresis using matched multiple dyes
US6008373A (en) 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
US5861287A (en) * 1995-06-23 1999-01-19 Baylor College Of Medicine Alternative dye-labeled primers for automated DNA sequencing
US5994063A (en) * 1995-06-23 1999-11-30 Metzker; Michael L. Substituted 4,4-difluoro-4-bora-3A,4A-diaza-s-indacene compounds for homogenous amplification/detection assays
US5728528A (en) * 1995-09-20 1998-03-17 The Regents Of The University Of California Universal spacer/energy transfer dyes
US6214555B1 (en) * 1996-05-01 2001-04-10 Visible Genetics Inc. Method compositions and kit for detection
US5863727A (en) * 1996-05-03 1999-01-26 The Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US5800996A (en) * 1996-05-03 1998-09-01 The Perkin Elmer Corporation Energy transfer dyes with enchanced fluorescence
US5945526A (en) * 1996-05-03 1999-08-31 Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US7388092B2 (en) * 1996-05-03 2008-06-17 Applera Corporation Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes
US7825237B2 (en) * 1996-05-03 2010-11-02 Applied Biosystems, Llc Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes
US5736333A (en) * 1996-06-04 1998-04-07 The Perkin-Elmer Corporation Passive internal references for the detection of nucleic acid amplification products
CA2257109C (en) 1996-06-04 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during pcr
DE69735563T2 (de) * 1996-06-04 2007-05-16 University Of Utah Research Foundation, Salt Lake City Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung und Überprüfung von biologischen Prozessen
US6117635A (en) * 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US5853992A (en) * 1996-10-04 1998-12-29 The Regents Of The University Of California Cyanine dyes with high-absorbance cross section as donor chromophores in energy transfer labels
US5840879A (en) * 1996-12-06 1998-11-24 Wang; Edge R. Reagents and solid supports for improved synthesis and labeling of polynucleotides
US5804386A (en) * 1997-01-15 1998-09-08 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Sets of labeled energy transfer fluorescent primers and their use in multi component analysis
US6403311B1 (en) 1997-02-12 2002-06-11 Us Genomics Methods of analyzing polymers using ordered label strategies
ATE273381T1 (de) 1997-02-12 2004-08-15 Eugene Y Chan Verfahren zur analyse von polymeren
WO1999013109A1 (en) * 1997-09-11 1999-03-18 Seq, Ltd. Method for dna sequencing analysis
US7632651B2 (en) * 1997-09-15 2009-12-15 Mds Analytical Technologies (Us) Inc. Molecular modification assays
US7745142B2 (en) * 1997-09-15 2010-06-29 Molecular Devices Corporation Molecular modification assays
US20050227294A1 (en) * 1997-09-15 2005-10-13 Molecular Devices Corporation Molecular modification assays involving lipids
JPH1189598A (ja) * 1997-09-18 1999-04-06 Hitachi Software Eng Co Ltd 蛍光標識プローブ及びハイブリダイゼーション検出方法
US6008379A (en) * 1997-10-01 1999-12-28 The Perkin-Elmer Corporation Aromatic-substituted xanthene dyes
AU1366299A (en) 1997-10-27 1999-05-17 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
US6583168B1 (en) 1997-11-25 2003-06-24 Applera Corporation Sulfonated diarylrhodamine dyes
US5936087A (en) 1997-11-25 1999-08-10 The Perkin-Elmer Corporation Dibenzorhodamine dyes
US6080868A (en) 1998-01-23 2000-06-27 The Perkin-Elmer Corporation Nitro-substituted non-fluorescent asymmetric cyanine dye compounds
AU2571899A (en) * 1998-02-03 1999-08-16 Amersham Pharmacia Biotech Inc. Energy transfer dyes
EP1057020A2 (de) * 1998-02-14 2000-12-06 GMD Forschungszentrum Informationstechnik GmbH Fluoreszenz-energie-transfer für die aufklärung der 3d-struktur von biomakromolekülen
DE19811730A1 (de) * 1998-03-18 1999-09-23 November Ag Molekulare Medizin Verfahren und Vorrichtung zum Identifizieren einer Markierung
WO1999049293A2 (en) * 1998-03-24 1999-09-30 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to detection complexes
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6037130A (en) * 1998-07-28 2000-03-14 The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits
US6210896B1 (en) 1998-08-13 2001-04-03 Us Genomics Molecular motors
US6967250B1 (en) * 1998-08-31 2005-11-22 Amersham Biosciences Corp Energy transfer dyes
AU1724000A (en) 1998-11-12 2000-05-29 Nyxis, Inc. Diagnostic assay for cancer
GB9827908D0 (en) * 1998-12-19 1999-02-10 Univ Manchester Nucleic acid sequencing method
US7033753B1 (en) 1999-01-15 2006-04-25 University Of Rochester Compositions and methods for nonenzymatic ligation of oligonucleotides and detection of genetic polymorphisms
US20040111219A1 (en) * 1999-02-22 2004-06-10 Sandeep Gulati Active interferometric signal analysis in software
US6136541A (en) * 1999-02-22 2000-10-24 Vialogy Corporation Method and apparatus for analyzing hybridized biochip patterns using resonance interactions employing quantum expressor functions
US6245511B1 (en) 1999-02-22 2001-06-12 Vialogy Corp Method and apparatus for exponentially convergent therapy effectiveness monitoring using DNA microarray based viral load measurements
US6573047B1 (en) 1999-04-13 2003-06-03 Dna Sciences, Inc. Detection of nucleotide sequence variation through fluorescence resonance energy transfer label generation
US7655443B1 (en) * 1999-05-07 2010-02-02 Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Nucleic acid sequencing with simultaneous quantitation
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6472141B2 (en) 1999-05-21 2002-10-29 Caliper Technologies Corp. Kinase assays using polycations
US6287774B1 (en) * 1999-05-21 2001-09-11 Caliper Technologies Corp. Assay methods and system
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
AU7627100A (en) * 1999-07-27 2001-02-13 University Of Utah Research Foundation Homogeneous fluorescence method for assaying structural modifications of biomolecules
US7138254B2 (en) 1999-08-02 2006-11-21 Ge Healthcare (Sv) Corp. Methods and apparatus for performing submicroliter reactions with nucleic acids or proteins
US6358684B1 (en) 1999-08-27 2002-03-19 Pe Corporation UV excitable fluorescent energy transfer dyes
US6218124B1 (en) 1999-08-27 2001-04-17 Pe Corporation Method for detecting oligonucleotides using UV light source
WO2001016375A2 (en) * 1999-08-30 2001-03-08 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
US6982146B1 (en) * 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
US6221600B1 (en) 1999-10-08 2001-04-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial oligonucleotide PCR: a method for rapid, global expression analysis
EP1305412A2 (de) 1999-10-14 2003-05-02 Clontech Laboratories Inc. Chromo/fluoroproteine aus anthozoa und verwendung der gleichen
ATE356828T1 (de) * 1999-11-02 2007-04-15 Drk Blutspendedienst Bw Molekularstruktur des rhd-negativ genortes
US6372907B1 (en) 1999-11-03 2002-04-16 Apptera Corporation Water-soluble rhodamine dye peptide conjugates
US6191278B1 (en) 1999-11-03 2001-02-20 Pe Corporation Water-soluble rhodamine dyes and conjugates thereof
WO2001040520A1 (en) 1999-12-02 2001-06-07 Dna Sciences, Inc. Methods for determining single nucleotide variations and genotyping
US6221604B1 (en) 2000-02-07 2001-04-24 Pe Corporation Electron-deficient nitrogen heterocycle-substituted fluorescein dyes
US6436641B1 (en) * 2000-04-17 2002-08-20 Visible Genetics Inc. Method and apparatus for DNA sequencing
US6465644B1 (en) 2000-05-02 2002-10-15 Applera Corporation Sulfonated [8,9] benzophenoxazine dyes and the use of their labelled conjugates
US6355433B1 (en) 2000-06-02 2002-03-12 Dna Sciences, Inc. Determination of nucleotide sequence variations through limited primer extension
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US20070172866A1 (en) * 2000-07-07 2007-07-26 Susan Hardin Methods for sequence determination using depolymerizing agent
EP2100971A3 (de) * 2000-07-07 2009-11-25 Visigen Biotechnologies, Inc. Echtzeit-Sequenzbestimmung
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US6627748B1 (en) 2000-09-11 2003-09-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combinatorial fluorescence energy transfer tags and their applications for multiplex genetic analyses
EP1322785A4 (de) * 2000-09-11 2005-11-09 Univ Columbia Kombinatorische fluoreszenzenergietransfer-tags und deren verwendungen
US20060057565A1 (en) * 2000-09-11 2006-03-16 Jingyue Ju Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof
ATE490346T1 (de) * 2000-09-18 2010-12-15 Medimmune Llc In vitro testverfahren zur bestimmung der immunogenizität eines impfstoffes
US9708358B2 (en) 2000-10-06 2017-07-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
EP1337541B1 (de) 2000-10-06 2007-03-07 The Trustees of Columbia University in the City of New York Massives Parallelverfahren zur Dekodierung von DNA und RNA
JP2004537257A (ja) 2000-10-06 2004-12-16 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 核酸配列の検出および／または定量のための、方法およびプローブ
US6448407B1 (en) 2000-11-01 2002-09-10 Pe Corporation (Ny) Atropisomers of asymmetric xanthene fluorescent dyes and methods of DNA sequencing and fragment analysis
US20020115092A1 (en) * 2000-11-08 2002-08-22 The Scripps Research Institute Energy transfer labels with mechanically linked fluorophores
US7211414B2 (en) * 2000-12-01 2007-05-01 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US20020072053A1 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Mcnally Alan J. Immunoassay based on DNA replication using labeled primer
EP1427847B1 (de) * 2000-12-13 2010-07-28 Nugen Technologies, Inc. Methoden und zusammensetzungen zur generierung einer vielzahl von kopien von nukleinsäuresequenzen und methoden zur detektion derselben
IL153504A0 (en) 2001-03-09 2003-07-06 Nugen Technologies Inc Methods and compositions for amplification of rna sequences
WO2002072892A1 (en) 2001-03-12 2002-09-19 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences by asynchronous base extension
WO2002095057A2 (en) * 2001-05-24 2002-11-28 Genospectra, Inc. Pairs of nucleic acid probes with interactive signaling moieties and nucleic acid probes with enhanced hybridization efficiency and specificity
US9261460B2 (en) 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
US7668697B2 (en) 2006-02-06 2010-02-23 Andrei Volkov Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level
US20030087309A1 (en) * 2001-08-27 2003-05-08 Shiping Chen Desktop drug screening system
US7238477B2 (en) * 2001-09-24 2007-07-03 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by Raman scattering
US6972173B2 (en) * 2002-03-14 2005-12-06 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by raman scattering
US6982165B2 (en) 2001-09-24 2006-01-03 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of molecular deconstruction
US6852492B2 (en) 2001-09-24 2005-02-08 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of uptake of precursors during molecular replication
US20030124599A1 (en) * 2001-11-14 2003-07-03 Shiping Chen Biochemical analysis system with combinatorial chemistry applications
JP4700281B2 (ja) * 2001-12-19 2011-06-15 ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴ 急速に成熟する蛍光タンパク質およびその使用法
US9353405B2 (en) 2002-03-12 2016-05-31 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes
CA2482767A1 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 Joseph F. Lawler, Jr. Reagents for monitoring nuclei acid amplification and methods of using same
EP1546380A4 (de) * 2002-05-28 2007-02-14 Us Genomics Inc Verfahren und vorrichtungen mit einzelpolymeranalyse
JP4457001B2 (ja) * 2002-05-31 2010-04-28 セクレタリー・デパートメント・オブ・アトミック・エナジー ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法
US7115370B2 (en) 2002-06-05 2006-10-03 Capital Genomix, Inc. Combinatorial oligonucleotide PCR
CA2490961A1 (en) * 2002-07-01 2004-01-08 Guava Technologies, Inc. Fluorescent dyes, energy transfer couples and methods
US7074597B2 (en) * 2002-07-12 2006-07-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplex genotyping using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
EP1389638A1 (de) * 2002-08-06 2004-02-18 Roche Diagnostics GmbH Verbesserte Proben für FRET
US20070184453A1 (en) * 2002-10-02 2007-08-09 Roche Molecular Systems, Inc Fret process
US7226414B2 (en) * 2002-10-09 2007-06-05 Biotex, Inc. Method and apparatus for analyte sensing
EP1565559B1 (de) 2002-11-12 2011-05-18 Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo " Evrogen" Fluoreszenzproteine und chromoproteine aus nicht-aequorea-hydrozoa-spezies sowie verfahren zur verwendung davon
US20050032081A1 (en) * 2002-12-13 2005-02-10 Jingyue Ju Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry
AU2003287115A1 (en) 2002-12-26 2004-07-22 Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo "Evrogen" Fluorescent proteins from copepoda species and methods for using same
US7166458B2 (en) * 2003-01-07 2007-01-23 Bio Tex, Inc. Assay and method for analyte sensing by detecting efficiency of radiation conversion
US8137616B2 (en) 2003-04-04 2012-03-20 Roche Molecular Systems, Inc. System for multi color real time PCR
AU2004230494A1 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
WO2004101709A1 (en) 2003-05-09 2004-11-25 Applera Corporation Phenyl xanthene dyes
EP1627025B1 (de) 2003-05-09 2016-10-12 Applied Biosystems, LLC Fluoreszierende kunststoffe mit gehalt an lipidlöslichen rhodaminfarbstoffen
US7236812B1 (en) 2003-09-02 2007-06-26 Biotex, Inc. System, device and method for determining the concentration of an analyte
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
EP1689764B1 (de) * 2003-11-19 2013-01-02 AlleLogic Biosciences Corporation Mit mehreren fluorophoren markierte oligonukleotide
AU2004311882A1 (en) 2003-12-29 2005-07-21 Nugen Technologies, Inc. Methods for analysis of nucleic acid methylation status and methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids
EP1704256A4 (de) 2004-01-13 2008-01-16 Us Genomics Inc Nachweis und quantifizierung von analyten in lösung unter verwendung von polymeren
US10337054B2 (en) 2004-02-02 2019-07-02 Quantum-Si Incorporated Enrichment of nucleic acid targets
JP2007525217A (ja) 2004-02-19 2007-09-06 ザ ガバナーズ オブ ザ ユニバーシティー オブ アルバータ レプチンプロモーター多型及びその使用
US7981604B2 (en) 2004-02-19 2011-07-19 California Institute Of Technology Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
WO2005084367A2 (en) * 2004-03-03 2005-09-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry
WO2005089524A2 (en) * 2004-03-19 2005-09-29 U.S. Genomics, Inc. Compositions and methods for detection of single molecules
EP1732944B1 (de) * 2004-04-07 2012-09-05 The University of Chicago Monomere, rotfluoreszierende proteine
WO2006073436A2 (en) * 2004-04-29 2006-07-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mass tag pcr for multiplex diagnostics
US8883486B2 (en) 2004-05-04 2014-11-11 Universite De Montreal Arrestin biosensor
US7635562B2 (en) 2004-05-25 2009-12-22 Helicos Biosciences Corporation Methods and devices for nucleic acid sequence determination
US7476734B2 (en) 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
CA2577741A1 (en) * 2004-08-18 2006-03-02 Abbott Molecular, Inc. Determining data quality and/or segmental aneusomy using a computer system
US20090087848A1 (en) * 2004-08-18 2009-04-02 Abbott Molecular, Inc. Determining segmental aneusomy in large target arrays using a computer system
US8484000B2 (en) * 2004-09-02 2013-07-09 Vialogy Llc Detecting events of interest using quantum resonance interferometry
CN101914620B (zh) * 2004-09-17 2014-02-12 加利福尼亚太平洋生命科学公司 核酸测序的方法
US7170050B2 (en) 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
WO2006053259A2 (en) * 2004-11-12 2006-05-18 Transgenomic, Inc. Fluorescent mutation detection with mismatch cutting dna endonucleases
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US7482120B2 (en) 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US20060263767A1 (en) * 2005-04-20 2006-11-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Ultrasensitive detection of prions by automated protein misfolding cyclic amplification
DK1907583T4 (da) 2005-06-15 2020-01-27 Complete Genomics Inc Enkeltmolekyle-arrays til genetisk og kemisk analyse
WO2007002204A2 (en) 2005-06-21 2007-01-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compostions
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
WO2007030521A1 (en) * 2005-09-06 2007-03-15 Invitrogen Corporation Control of chemical modification
EP1929046B1 (de) 2005-09-07 2012-07-11 Nugen Technologies, Inc. Verbessertes nukleinsäureamplifikationsverfahren
US7405281B2 (en) * 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
US7741467B2 (en) * 2005-10-05 2010-06-22 Roche Molecular Systems, Inc. Non-fluorescent energy transfer
EP2546360A1 (de) 2005-10-07 2013-01-16 Callida Genomics, Inc. Selbstangeordnete einzelne Molekülarrays und Verwendungen davon
WO2007052102A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Evrogen, Jsc Modified green fluorescent proteins and methods for using same
WO2007056250A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-18 U.S. Genomics, Inc. Heterogeneous assay of analytes in solution using polymers
CA2630544A1 (en) * 2005-11-21 2007-05-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplex digital immuno-sensing using a library of photocleavable mass tags
US8703734B2 (en) 2005-12-12 2014-04-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nanoprobes for detection or modification of molecules
EP1960550B1 (de) * 2005-12-12 2010-09-15 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Sonde zum sequenzieren von nukleinsäure und verwendungsverfahren
RU2395581C2 (ru) 2006-01-25 2010-07-27 Закрытое Акционерное Общество "Евроген Айпи" Новые флуоресцентные белки из entacmaea quadricolor и способ их получения
US8563703B2 (en) 2006-01-25 2013-10-22 Evrogen IP Joint Stock Company Fluorescent proteins and methods for using same
EP1994180A4 (de) 2006-02-24 2009-11-25 Callida Genomics Inc Genomsequenzierung auf dna-arrays mit hohem durchsatz
SG10201405158QA (en) 2006-02-24 2014-10-30 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
US7397546B2 (en) 2006-03-08 2008-07-08 Helicos Biosciences Corporation Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam
ES2641272T3 (es) 2006-04-28 2017-11-08 Children's Hospital Medical Center Composiciones que comprenden proteínas o polipéptidos fusogénicos derivados de la prosaposina para aplicación en sistemas de suministro de fármacos transmembrana
WO2008030973A2 (en) * 2006-09-06 2008-03-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of protein folding disorders
WO2008094316A2 (en) * 2006-09-22 2008-08-07 Stowers Institute Of Medical Research Novel branchiostoma derived fluorescent proteins
WO2008070352A2 (en) 2006-10-27 2008-06-12 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090111706A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by amplification
WO2008069973A2 (en) 2006-12-01 2008-06-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Four-color dna sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US7881933B2 (en) * 2007-03-23 2011-02-01 Verizon Patent And Licensing Inc. Age determination using speech
US7816135B2 (en) 2007-07-05 2010-10-19 Becton, Dickinson And Company Method of analyzing lymphocytes
EP4310194A2 (de) 2007-10-19 2024-01-24 The Trustees of Columbia University in the City of New York Entwurf und synthese von spaltbaren fluoreszierenden nukleotiden als reversible terminatoren zur dna-sequenzierung durch synthese
EP3431615A3 (de) 2007-10-19 2019-02-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna-sequenzierung mit nichtfluoreszierenden, reversiblen nukleotidterminatoren und spaltbaren, etikettmodifizierten nukleotidterminatoren
WO2009059305A2 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 The University Of Chicago Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
US8034568B2 (en) 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
US7846666B2 (en) 2008-03-21 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods of RNA amplification in the presence of DNA
US7973146B2 (en) * 2008-03-26 2011-07-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Engineered fluorescent dye labeled nucleotide analogs for DNA sequencing
MX2010010600A (es) 2008-03-28 2011-03-30 Pacific Biosciences California Inc Composiciones y metodos para secuenciacion de acidos nucleicos.
WO2010011944A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Wagner Richard W Protein screeing methods
WO2010059206A2 (en) 2008-11-19 2010-05-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Modular nucleotide compositions and uses therefor
US20100261185A1 (en) 2009-03-27 2010-10-14 Life Technologies Corporation Labeled enzyme compositions, methods and systems
WO2010117420A2 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fret-labeled compounds and uses therefor
WO2010141390A2 (en) 2009-06-05 2010-12-09 Life Technologies Corporation Nucleotide transient binding for sequencing methods
US9566335B1 (en) 2009-09-25 2017-02-14 The Governing Council Of The University Of Toronto Protein sequencing method and reagents
US8518643B2 (en) * 2010-02-04 2013-08-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Method to improve single molecule analyses
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US8993737B2 (en) 2010-08-25 2015-03-31 Pacific Biosciences, Inc. Phospholinked dye analogs with an amino acid linker
WO2012083235A1 (en) * 2010-12-16 2012-06-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Universal reference dye for quantitative amplification
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
US20120190021A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
WO2012118745A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Arnold Oliphant Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination
US20140287931A1 (en) 2011-04-04 2014-09-25 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut - Antoni Van Leeuwenhoek Ziekenhuis Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
AU2012240240A1 (en) 2011-04-04 2013-05-09 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
CA2834288A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Advanced Bioscience Laboratories, Inc. Truncated hiv envelope proteins (env), methods and compositions related thereto
EP2705159B1 (de) * 2011-05-06 2018-03-21 Qiagen GmbH Verfahren zur sequenzierung, amplifikation und nachweis von nukleinsäuren mit intern markiertem primer
WO2012162429A2 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection
AU2012309824A1 (en) 2011-09-12 2013-04-18 Abbvie Biotherapeutics Inc. Artificial NK cells and uses thereof
EP2766498B1 (de) 2011-10-14 2019-06-19 President and Fellows of Harvard College Sequenzierung durch strukturanordnung
US9206418B2 (en) 2011-10-19 2015-12-08 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
WO2013056841A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Inra (Institut National De La Recherche Agronomique) A method for diagnosing tse
CN105861487B (zh) 2012-01-26 2020-05-05 纽亘技术公司 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法
EP3222627B1 (de) 2012-02-15 2019-08-07 Pacific Biosciences of California, Inc. Polymeraseenzymsubstrate mit proteinabschirmung
EP2850086B1 (de) 2012-05-18 2023-07-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Heteroarylcyaninfarbstoffe
US9315864B2 (en) 2012-05-18 2016-04-19 Pacific Biosciences Of California, Inc. Heteroarylcyanine dyes with sulfonic acid substituents
AU2013266394B2 (en) 2012-05-21 2019-03-14 The Scripps Research Institute Methods of sample preparation
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
SG11201408478QA (en) 2012-06-18 2015-02-27 Nugen Technologies Inc Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
DK2820418T3 (en) 2012-07-20 2018-02-12 Harvard College Cell-based quality control bioassays for nutraceutical and medical products
US9476089B2 (en) 2012-10-18 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of making oligonucleotide probes
CA2901513C (en) 2013-03-12 2020-12-29 Ventana Medical Systems, Inc. Proximity assay for in situ detection of targets
WO2014139979A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Ventana Medical Systems, Inc. Quantum dot in situ hybridization
US9822408B2 (en) 2013-03-15 2017-11-21 Nugen Technologies, Inc. Sequential sequencing
US10648026B2 (en) 2013-03-15 2020-05-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
US9540685B2 (en) 2013-03-15 2017-01-10 President And Fellows Of Harvard College Methods of identifying homologous genes using FISH
US9849198B2 (en) 2013-07-02 2017-12-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Discrete imaging of hepatic oxidative and nitrosative stress with two-channel nanoparticles for in vivo drug safety screening
EP3030683B1 (de) 2013-08-05 2022-03-02 Pacific Biosciences of California, Inc. Geschützte fluoreszierende reagenzverbindungen
CA2929596C (en) 2013-11-13 2022-07-05 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
US9745614B2 (en) 2014-02-28 2017-08-29 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
CN107075546B (zh) 2014-08-19 2021-08-31 哈佛学院董事及会员团体 用于对核酸探测并作图的rna-引导的系统
CA2960821A1 (en) 2014-09-09 2016-03-17 Igenomx International Genomics Corporation Methods and compositions for rapid nucleic acid library preparation
ES2770055T3 (es) 2014-11-21 2020-06-30 Nanostring Technologies Inc Secuenciación sin enzima ni amplificación
WO2016083364A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Ventana Medical Systems, Inc. Proximity assays using chemical ligation and hapten transfer
US10302972B2 (en) 2015-01-23 2019-05-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Waveguide transmission
WO2016126941A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Multimeric protected fluorescent reagents
US10174363B2 (en) 2015-05-20 2019-01-08 Quantum-Si Incorporated Methods for nucleic acid sequencing
WO2016185284A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Boreal Genomics, Inc. Method for isolating target nucleic acid using heteroduplex binding proteins
US10781483B2 (en) 2015-11-20 2020-09-22 Pacific Biosciences Of California, Inc. Labeled nucleotide analogs, reaction mixtures, and methods and systems for sequencing
CN108472121A (zh) 2015-11-20 2018-08-31 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 受保护的染料标记的试剂
US10676788B2 (en) 2015-11-20 2020-06-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Modified nucleotide reagents
CA3023566A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Nanostring Technologies, Inc. Methods for detecting target nucleic acids in a sample
EP3475446A1 (de) 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics, Inc. Verfahren zur identifizierung von peptidepitopen, moleküle zur bindung derartiger epitope und verwendungen davon
MA45491A (fr) 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics Inc Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés
WO2018057648A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptide regulators of mitochondrial fusion and methods of use
JP6730525B2 (ja) 2016-11-21 2020-07-29 ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド 化学組成物とそれを利用する方法
JP2020501573A (ja) 2016-12-19 2020-01-23 クアンタム−エスアイ インコーポレイテッドＱｕａｎｔｕｍ−Ｓｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ シークエンシング反応用の重合酵素
WO2018200323A1 (en) 2017-04-23 2018-11-01 Washington University Small molecule regulators of mitochondrial fusion and methods of use thereof
MX2019013111A (es) 2017-05-05 2019-12-16 Quantum Si Inc Sustratos que tienen reactividad de superficie modificada y propiedades antiincrustantes en reacciones biologicas.
WO2018223055A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
US11441174B2 (en) 2017-06-02 2022-09-13 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
CN111148850A (zh) 2017-07-24 2020-05-12 宽腾矽公司 高强度经标记的反应物组合物及用于测序的方法
GB201715684D0 (en) 2017-09-28 2017-11-15 Univ Gent Means and methods for single molecule peptide sequencing
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
WO2019089982A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
WO2019104070A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Nanostring Technologies, Inc. O-nitrobenzyl photocleavable bifunctional linker
JP2021523723A (ja) 2018-05-14 2021-09-09 ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド 化学的組成物とそれを利用する方法
CA3117889A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Quantum-Si Incorporated Methods and compositions for protein sequencing
US11613772B2 (en) 2019-01-23 2023-03-28 Quantum-Si Incorporated High intensity labeled reactant compositions and methods for sequencing
EP3976771A1 (de) 2019-06-28 2022-04-06 Quantum-si Incorporated Polymerisationsenzyme für sequenzierungsreaktionen
EP4028570A1 (de) 2019-10-11 2022-07-20 Quantum-Si Incorporated Oberflächenmodifizierung in der dampfphase
JP2022552013A (ja) 2019-10-18 2022-12-14 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 臨床規模および工業規模の無傷の組織の配列決定
CA3159566A1 (en) 2019-10-29 2021-05-06 Quantum-Si Incorporated Peristaltic pumping of fluids and associated methods, systems, and devices
US11358981B2 (en) 2020-01-21 2022-06-14 Quantum-Si Incorporated Compounds and methods for selective c-terminal labeling
EP4114978A2 (de) 2020-03-06 2023-01-11 Singular Genomics Systems, Inc. Sequenzierung verknüpfter gepaarter stränge
WO2022015600A2 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of sequencing complementary polynucleotides
US20230366012A1 (en) 2020-09-16 2023-11-16 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using the same
US20220228200A1 (en) 2021-01-19 2022-07-21 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for internally controlled in situ assays
WO2022170212A1 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Singular Genomics Systems, Inc. Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides
EP4263868A1 (de) 2021-03-12 2023-10-25 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays und verfahren zur verwendung davon
US11884977B2 (en) 2021-03-12 2024-01-30 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
EP4294920A1 (de) 2021-04-27 2023-12-27 Singular Genomics Systems, Inc. Hochdichte sequenzierung und multiplex-priming
US20220380838A1 (en) 2021-06-01 2022-12-01 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyte detection and probe resolution
CN117751197A (zh) 2021-06-02 2024-03-22 10X基因组学有限公司 使用不对称可环化探针的样品分析
WO2023288225A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for preparing polymerized matrix with controllable thickness
US20230057571A1 (en) 2021-08-03 2023-02-23 10X Genomics, Inc. Nucleic acid concatemers and methods for stabilizing and/or compacting the same
WO2023023484A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 10X Genomics, Inc. Probes comprising a split barcode region and methods of use
US20230242974A1 (en) 2021-12-27 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for rolling circle amplification
US20230279475A1 (en) 2022-01-21 2023-09-07 10X Genomics, Inc. Multiple readout signals for analyzing a sample
WO2023164570A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Insitro, Inc. Pooled optical screening and transcriptional measurements of cells comprising barcoded genetic perturbations
WO2023172665A2 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleic acid delivery scaffolds
WO2023192616A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence
US20240026427A1 (en) 2022-05-06 2024-01-25 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for in situ analysis of v(d)j sequences
US20240002902A1 (en) 2022-05-06 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
WO2023220300A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for in situ sequencing
WO2023245190A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 10X Genomics, Inc. Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis
WO2024036304A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 10X Genomics, Inc. Puma1 polymerases and uses thereof
US20240084373A1 (en) 2022-08-16 2024-03-14 10X Genomics, Inc. Ap50 polymerases and uses thereof
WO2024081869A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 10X Genomics, Inc. Methods for analysis of biological samples
WO2024102736A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 10X Genomics, Inc. Immobilization methods and compositions for in situ detection
US20240158852A1 (en) 2022-11-16 2024-05-16 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for assessing performance of in situ assays

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4996143A (en) * 1985-12-23 1991-02-26 Syngene, Inc. Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization
CA1273552A (en) * 1985-12-23 1990-09-04 Michael J. Heller Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays
US4855225A (en) * 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
US4868103A (en) * 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
JP2901004B2 (ja) * 1989-04-12 1999-06-02 株式会社日立製作所 Ｄｎａの塩基配列決定法
US5188934A (en) * 1989-11-14 1993-02-23 Applied Biosystems, Inc. 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
US5342789A (en) * 1989-12-14 1994-08-30 Sensor Technologies, Inc. Method and device for detecting and quantifying glucose in body fluids
CA2033692A1 (en) * 1990-01-25 1991-07-26 Wilhelm Bannwarth Energy transfer systems
US5401847A (en) * 1990-03-14 1995-03-28 Regents Of The University Of California DNA complexes with dyes designed for energy transfer as fluorescent markers
US5326692B1 (en) * 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
WO1992014845A1 (en) * 1991-02-26 1992-09-03 Worcester Foundation For Experimental Biology Diagnosing cystic fibrosis and other genetic diseases using fluorescence resonance energy transfer (fret)
JP3097205B2 (ja) * 1991-09-05 2000-10-10 株式会社日立製作所 電気泳動分離検出方法
DK0620822T3 (da) * 1991-11-07 2001-08-27 Nanotronics Inc Hybridisering af polynukleotider konjugeret med kromoforer og fluoroforer til dannelse af et donor-til-donor energioverførselssystem
US5654419A (en) * 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999047700A1 (de) * 1998-03-18 1999-09-23 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Verfahren und vorrichtung zum nachweis einer nukleotidsequenz

Also Published As

Publication number Publication date
ES2197193T3 (es) 2004-01-01
DE19581489B4 (de) 2004-07-15
ATE236994T1 (de) 2003-04-15
AU692230B2 (en) 1998-06-04
DE69530286D1 (de) 2003-05-15
US5707804A (en) 1998-01-13
JP2007000151A (ja) 2007-01-11
DE69530286T2 (de) 2004-04-01
CA2182516C (en) 2003-11-25
EP0743987B1 (de) 2003-04-09
EP0743987A4 (de) 1998-04-15
CA2182516A1 (en) 1995-08-10
JP3895369B2 (ja) 2007-03-22
WO1995021266A1 (en) 1995-08-10
AU1736795A (en) 1995-08-21
US5688648A (en) 1997-11-18
US5654419A (en) 1997-08-05
DE19581489T1 (de) 1997-01-02
JPH09508525A (ja) 1997-09-02
JP4602956B2 (ja) 2010-12-22
EP0743987A1 (de) 1996-11-27

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