JP4602956B2 - エネルギー転移連結の色素によりラベルされたプローブ - Google Patents

エネルギー転移連結の色素によりラベルされたプローブ Download PDF

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Description

本発明の分野は螢光標識及びそれらの使用に関する。
混合物の構成成分を同定し、そして定量するための需要が増々増大している。混合物の複雑性が高まるほど、存在する多くの成分を同時に検出できる興味が高まる。この情況の例として、DNA配列決定が存在し、この場合、多くの個別の波長で螢光シグナル発光を提供しながら、単一の波長でレーザー源により１〜４種の蛍光標識された成分を効果的に励起することが望ましい。この情況においては、異なったラベルは、それらが結合される配列の電気泳動移動性に悪影響を及ぼすべきではない。
現在、自動化された DNA配列決定のために使用される次の４種の方法が存在する：（１）DNAフラグメントが１つの蛍光団によりラベルされ、そして次に、そのフラグメントが隣接する配列決定レーンで実験され（Ansorge et al.，Nucleic Acids Ros．15，4593-4602(1987)；（２）DNAフラグメントが４種の異なった螢光団によりラベルされ、そしてすべてのフラグメントが電気泳動的に分離され、そして単一のレーンで検出され（Smith et al.，Nature 321，674-679(1986)；（３）終結反応における個々のジデオキシヌクレオシドが異なった蛍光団によりラベルされ、そして４組のフラグメントが同じレーンにおいて実験され（Prober et al.，Science 238，336-341(1987)；あるいは（４）DNAフラグメントの組が２種の異なった蛍光団によりラベルされ、そして DNA配列が色素比を伴ってコードされる（Huang et al.，Anal．Chem．64，2149-2154(1992)）。
そられの技法のすべてはかなりの欠点を有する。方法１は、移動性におけるレーンからレーンの変動及び低い処理量の潜在的な問題を有する。方法２及び３は、４種の色素が１つのレーザー源により十分に励起され、そしてそれらが明確に異なった発光スペクトルを有することを必要とする。実際、単一のレーザーにより効果的に励起され得、そして十分に分離された螢光シグナルを発光する複数の色素を見出すことはひじょうに困難である。
特有の赤色シフトされた発光スペクトルを有する色素を選択できるので、それらの吸光最大値もまた、赤色に移動し、そしてすべての色素は同じレーザー源によりもはや効果的に励起され得ない。
また、より異なった色素が選択されるので、色素がラベルされた分子の同じ移動性シフトを引き起こすようなすべての色素を選択することはより困難になる。
従って、多くの構成成分が同じシステム及び一回の実施で決定され得るように、サンプルの多重化を可能にする改良された方法を提供することが実質的な興味の対象である。また、個々のラベルが、共通する波長で強い吸光性を有し、螢光のために高い収量を有し、発光の大きなストークスシフトを有し、種々の発光が個別であり、そしてラベルが同じ移動性シフトを導びくことが望まれる。単一色素により分子を単純にラベルすることによってそれらの矛盾する目的を達成することは困難である。
本発明は、多くの蛍光ラベルを用いて混合物を分析するための組成物及び方法を提供する。蛍光ラベルを生ぜしめるためには、蛍光団の対が主鎖、特に核酸主鎖に結合され、ここで前記対のメンバーの１つがほぼ同じ波長で励起される。エネルギー転移の現象によって、前記個々の対の他のメンバーが検出的に異なった波長で発光することが見出された。ドナー蛍光団及び受容体蛍光団との間の距離の範囲が、効果的なエネルギー転移を確保するために選択される。さらに、結合して使用される蛍光ラベルが別のシステムにおいてほぼ同じ移動性を有するように選択される。これは、蛍光団の対の複数のメンバー間の距離を変えることによりラベルされた存在物の移動性を変え、そして同じ移動性を有するラベルを選択することによって達成される。本発明は特に配列決定に適用され、ここで蛍光団がユニバーサルプライマー又は他のプライマー及び異なったジデオキシヌクレオシドのために使用される異なった蛍光団の組合せに結合され得る。蛍光ラベル（蛍光化合物）の組合せのキットもまた提供される。
新規蛍光ラベル、その蛍光ラベルの組合せ、及び多くの構成成分の分離を包含する分離システムへのそれらの使用が提供される。特に、蛍光ラベルは、複数対の蛍光団を含んで成り、その１種を除いて、蛍光団は同じであり、オーバーラップするスペクトルを有する異なる蛍光団を含み、ここでドナー蛍光団の発光が受容体蛍光団の吸光とオーバーラップし、その結果、励起された蛍光団から他の蛍光団へのエネルギー転移が存在する。励起された蛍光団が実際に蛍光を発することは必須ではなく、励起された蛍光団がその励起エネルギーを効果的に吸収でき、そしてそれを発光のための螢光団に効果的に転移することで十分である。
蛍光団の異なる対におけるドナー蛍光団は、同じであっても又は異なっていても良いが、しかし狭いバンド幅の単一光源、特にレーザー源により効果的に励起され得るべきである。ドナー蛍光団は、有意な吸光性、すなわち、お互い20nm以内、普通10nm以内、より普通には５nm以内で、吸収最大値(absorption moxima)の少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約20％の吸光性を有するであろう。発光のための性又は受容体蛍光団は、ドナー蛍光団からのエネルギーを受け、そして光を発することができるように選択され、それらは明確且つ検出できるほど異るであろう。従って、異なる蛍光ラベルが結合されている混合物中の構成成分間を区別することができるであろう。通常、蛍光ラベルは、少なくとも10nm、好ましくは少なくとも15nm及びより好ましくは少なくとも20nmだけ分離された発光最大値（emissionmoxima）で発光するであろう。
通常、ドナー蛍光団は、約 350〜 800nmの範囲で、より通常には約 350〜 600nm又は 500〜 750nmの範囲で吸光し、そして受容体蛍光団は、約 450〜1000nmの範囲で、通常約 450〜 800nmの範囲で光を発するであろう。続いて論ずるように、一対よりも多くの吸光性蛍光団を有することができ、その結果、３種又はそれ以上の蛍光団を有することができ、ここで、吸光と観察される発光との間での波長の差異を高度に増加させるために、エネルギーはより高い波長で１つの蛍光団から次の蛍光団に転移される。
２種の蛍光団が、主鎖、通常重合体鎖、により連結され、ここで前記２種の蛍光団間の距離は変えられ得る。蛍光ラベルの設計の背後にある物理学は、ドナー蛍光団から受容体蛍光団への光学的励起の転移は１／Ｒ6（ここでＲは２種の蛍光団間の距離である）に依存するということである。従って、前記距離は、良く知られたFoerster機構を通してドナーから受容体への効果的なエネルギー転移を提供するように選択されるべきである。従って、２種の蛍光団を分離する主鎖における原子の数により決定されるような、２種の蛍光団間の距離は、主鎖の性質に従って変えられ得る。
種々の主鎖、たとえば核酸、DNA及び RNAの両者、修飾された核酸、たとえば酸素が硫黄、炭素又は窒素により置換されているもの、ホスフェートがスルフェート又はカルボキシレート等により置換されていのもの、ポリペプチド、多糖類、段階的に付加され得る種々の基、たとえば二官能基、たとえばハロアミン、又は同様のものが使用され得る。螢光団は、適当であれば種々の構築ブロックの適切な官能価により置換され得、ここで螢光団はラベルの形成の間、その構築ブロック上に存在し、又は適切であれば、続いて付加され得る。種々の従来の化学が、２種の蛍光団間に適切な空間が得られることを確保するために使用され得る。
蛍光ラベル（蛍光団＋それらが結合される主鎖）の分子量は一般的に、少なくとも約250Dal（ドルトン）でありそして約5,000Dalよりも高くなく、通常、約2,000Dalよりも高くないであろう。螢光団の分子量は一般的に約 250〜1,000Dalの範囲であり、ここで一緒に使用されるべき異なったラベル上の受容体−ドナー対の分子量は通常、約20％以上、異ならないであろう。蛍光団は、中央部で主鎖に、両末端で主鎖に、又は一端で主鎖に及び内部部位で他の主鎖に結合され得る。蛍光団は、類似する化学物質の種類、たとえばシアニン色素、キサンテン又は同様のものからであるように選択される。従って、同じ化学物質の種類からのドナー、同じ化学物質の種類からの個々のドナー蛍光団−受容体蛍光団対又は同じ化学物質の種類からの個々の受容体蛍光団を有することができる。
本発明のラベルは、種々の分離技法、たとえば電気泳動、クロマトグラフィー又は同様のものに特に適用され得、ここで最適化された分光特性、高い感受性及び分析される成分の移動性向に対してのラベルの比較できる影響を有することが望まれる。特に、電気泳動、たとえばゲル、細管、等の電気泳動が興味の対象である。クロマトグラフィー技法の中には、HPLC、アフィニティークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、紙クロマトグラフィー及び同様のものがある。
２種の蛍光団間の距離はラベルの移動性に影響を及ぼすであろうことが見出された。従って、異なる蛍光団素対を使用することができ、そして良好なエネルギー転移を可能にする範囲内で、異なる蛍光団間の距離を変えることによって、蛍光ラベルのために実質的に一定した移動性を提供することができる。その移動性は特定の空間に関係されず、その結果、特定のラベルの移動性に対するその空間の効果を経験的に決定できるであろう。
しかしながら、ラベルにおける蛍光団の空間の柔軟性のために、異なった空間及び異なった蛍光団対を有する数種類の異なった蛍光ラベルを合成することによって、強く且つ明確な発光及び実質的に共通する移動性を有する、通常の励起を共有する螢光ラベルの種類を提供することができる。通常、移動性は、特別な分離に使用される場合、お互い約20％以下、好ましくはお互い約10％以下、及びより好ましくは、お互い約５％以内で異なるであろう。移動性は通常、単独でラベルの分離を、又は特定の分離に関連する共通の分子、たとえば配列決定に興味ある場合、適切な大きさの核酸分子に結合されるラベルの分離を実施することによって決定され得る。
蛍光団として、広範囲の種類の蛍光色素が使用れ得る。それらの色素は、種々のクラスに分けられ、ここで色素の組合せが同じクラス内に又は異なったクラス間に使用され得る。それらのクラス内には、色素、たとえばキサンテン色素、たとえばフルオレセイン及びローダミン、クマリン、たとえばウンベリフェロン、ベンズイミド色素、たとえばHuechest 33258、フェナントリジン色素、たとえば Texas Red、及びエチジウム色素、アクリジン色素、シアニン色素、たとえばチアゾールオレンジ、チアゾールブルー、Cy５及びCyfr、カルバゾニル色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、キノリン色素、又は同様のものが包含される。従って、色素は紫外線、可視又は赤外線範囲で吸収することができる。多くの場合、蛍光分子は、約２KDal以下、一般的には約 1.5KDal以下の分子量を有するであろう。
エネルギードナー蛍光団は、所望する励起波長で強い吸光度係数、望ましくは約104以上、好ましくは約105cm 1Ｍ-1以上の吸光度係数を有すべきである。ドナー蛍光団の励起最大値及び受容体蛍光団の発光最大値は、少なくとも15nm又はそれ以上分離されるであろう。ドナー蛍光団の発光スペクトルと受容体蛍光団の吸光性スペクトルとの間のスペクトルオーバーラップ全体及び発色団間の距離は、ドナーから受容体へのエネルギー転移の効率が20％〜 100％の範囲になるように存在するであろう。
主鎖中の原子の数に基づいてのドナー蛍光団及び受容体蛍光団の距離は、主鎖の性質、硬質か又は柔軟か、たとえば環構造か又は非環状構造か、又は同様の性質に依存して変化するであろう。一般的に、主鎖中の原子の数（環構造中の原子は主鎖に包含される環の片側のまわりの原子の最低数として計数されるであろう）は、約 200以下、通常約 150以下、好ましくは約 100以下であり、ここで主鎖の性質がドナーと受容体との間のエネルギー転移の効率に影響を及ぼすであろう。
ほとんどの場合、蛍光団の対が使用されるが、４種までの異なる、通常、３種よりも多くない異なる、同じ主鎖に結合される蛍光団が使用され得る情況が存在する。多くの蛍光団を用いることによって、ストークスシフトを非常に拡張することができ、その結果、可視波長範囲で励起することができ、そして通常、約1000nm以下、より通常には約 900nm以下の赤外線波長範囲で発光することができる。赤外線波長範囲での光の検出は多くの利点を有する。なぜならば、励起光に起因するラマン及びレイリー光からの障害を受けやすくないであろうからである。移動性の恒常性を維持するためには、大きなストークスシフトのために異なった螢光団を有するラベル上の螢光団の数を調和するために多数の同じ螢光団を有するラベル上に同じ数の螢光団を用いることができる。
本発明は、核酸鎖に特に適用でき、ここで前記核酸鎖は配列決定、特にサイジングのためのポリメラーゼ鎖反応、又はプライマーが核酸伸長のために使用され、そして特定のラベルに関する混合物の種々の成分間を区別したい場合の他のシステムにおいて、プライマーとして使用される。たとえば、配列決定の間ユニバーサルプライマーが使用され、この場合、配列決定の間伸長にために使用される異なるジデオキシヌクレオシドのそれぞれのために蛍光団の異なる対が使用される。
官能化された多数のヌクレオシドが利用でき、そしてポリヌクレオチドの合成に使用され得る。対象の核酸ラベルを合成することによって、蛍光団が存在する特定部位を定義できる。市販の合成機が従来の手法に従って使用され得、その結果、適切な空間を有する螢光団の対を有するいづれかの配列が達成され得る。
異なる複数のプライマーが PCRに使用される場合、個々のプライマーが本発明に従ってラベルされ、その結果、異なるプライマーの個々に対して相補的な標的配列の存在を容易に検出することができる。使用される他の用途は、特定の抗体を用いてのアイソザイムの同定、異なった多糖類を用いてのレクチンの同定、及び同様の同定を包含する。
すでに指摘されたように、本発明の蛍光ラベルは特に配列決定に使用される。たとえば、プライマーへの２種の蛍光団の結合により修飾されている、ユニバーサルプライマーのいづれかの１種であり得るユニバーサルプライマーが調製され得る。従って、種々の商業的プライマー、たとえば pUC／M13，λgt10，λgt11，及び同様のものからのプライマーが利用できる。Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd ed.，CSHL，1989，Section13を参照のこと。DNA配列が、配列決定されるべき配列に連結されるプライマー配列を有する適切なベクターでクローン化される。異なった２′，３′ddNTP が使用され、その結果、終結が、鎖拡張に存在する特定の ddNTPに依存して、異なった部位で生じる。本発明のプライマーを用いることによって、個々の ddNTPは特定のラベルに関連するであろう。クレノウフラグメントによる拡張の後、その得られるフラグメントは、電気泳動による単一のレーンにおいて、又は電気泳動による単一の細管において分離され、ここでラベルの螢光により終結ヌクレオチドを検出することができる。
本発明の蛍光ラベルを免疫複合体と共に使用することもでき、ここでリガンド又は受容体、たとえば抗体が異なった複合体又は複合体のメンバーを検出するためにラベルされ得る。リガンドが分離方法において同じ移動性向を有する場合、１又は複数のそのようなリガンドの存在を検出するために、分離における組成のオーバーラップが存在する場合でさえ、検出できるように、異なった抗体が異なった波長で螢光を発する異なったラベルによりラベルされ得る。
ラベルの組合せ、通常少なくとも２種のラベルを有するキットが提供される。個々のラベルは、通常比較しうる主鎖と共にドナー蛍光団−受容体蛍光団対を有し、ここで蛍光ラベルは使用される分離方法において比較しうる移動性を与えるために主鎖にそって分離される。一緒に使用されるグループにおける個々のラベルは、ほぼ同じ波長で吸光し、そして異なった波長で発光する。グループにおける個々のラベルは、主鎖にそっての異なる蛍光団の配置の変動の結果として、分離方法における移動性に対してほぼ同じ効果を有するであろう。
キットは、マッチする約６種までの、通常約４種までの異なったラベルを有するが、しかし２〜６種の異なったラベルを有する、複数組のマッチするラベルを有することができる。
核酸主鎖を含んで成る蛍光ラベルが特に興味の対象であり、ここで前記蛍光ラベルは一般的に、少なくとも約10個のヌクレオチドそして約50個よりも多くないヌクレオチド、通常約30個よりも多くないヌクレオチドを有するであろう。ラベルは、相補的配列にハイブリダイズするヌクレオチド上に存在し、又はそれらのヌクレオチドから分離され得る。螢光団は通常、鎖に約２〜20個、通常４〜16個の原子を有する便利な結合アームによりヌクレオチドに連結されるであろう。前記鎖は多くの官能基、特に非−オキソカルボニル、より特定にはエステル及びアミド、アミノ、オキソ及び同様のものを有する。鎖は、通常、炭素、窒素、酸素、硫黄又は同様のものを鎖に含んで成る、脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式炭化水素、又はそれらの組合せであり得る。
完全な核酸配列は、５′プライマー配列に対して相補的であり、又はその配列の３′部分に対してのみ相補的であり得る。通常、コピーされるべき配列に対して相補的である、少なくとも約４個のヌクレオチド、より通常には少なくとも約５個のヌクレオチドが存在するであろう。プライマーは、コピーされるべき鎖の３′端でプライマー配列を有する適切なプラスミドにおいてコピーされるべき配列、及び少量の適切な ddNTPと共に添加されるdNTPと共に組合される。伸長の後、DNAは単離され、そして分離のためにゲル又は細管に移される。
使用されるキットは少なくとも２種の蛍光ラベルを有し、これはドナー蛍光団のために実質的に同じ吸光度、別個の発光スペクトル及び実質的に同じ移動性を有することによってマッチするであろう。一般的に、一本鎖核酸のためには、分離は螢光団間で約１〜15個、より通常には１〜12個、好ましくは約２〜10個のヌクレオシドからであろう。
次の例は例示的であって、本願発明を限定するものではない。
実験
遺伝子分析のための、エネルギー転移蛍光団により標識されたオリゴヌクレオチドラベルの設計及び合成
Ｍ13ユニバーサルプライマーから選択された、配列５′−GTTTTCCCAGTC−３′を有するデオキシオリゴヌクレオチド（12塩基の長さ）を、異なった距離により分離されたドナー−受容体螢光団対により合成した。特に、前記12ーマーは、Ｃ−５位置で第一アミンリンカーアームを有する、下記の５′ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキシ）−３−アクリルイミド〕−２′−デオキシウリジン、３′−〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）〕−ホスホラミジット（Amino-Modifier C6dT）（構造体１）の使用により導入される修飾された塩基を含む：
Figure 0004602956
ドナー蛍光団はオリゴマーの５′側に結合され、そして受容体蛍光団は修飾されたＴ上の第１アミン基に結合される。ドナー蛍光団と受容体蛍光団との間の距離は、オリゴマー上の修飾されたＴの位置を変えることによって変えられた。プライマーはＤ−Ｎ−Ａ（ここでＤはドナー蛍光団であり、Ａは受容体蛍光団であり、そしてＮはＤとＡとの間の塩基の数である）とに示される。調製されるすべてのプライマーにおいては、ＤはApplied Biosystems Inc.（“ABI”）製の色素 FAM、すなわちフルオレセイン誘導体であり、Ａは ABI色素 TAM又は ROX（両者ともロダミン誘導体である）である。代表的な例として、FAM-3-TAMの構造体が下記に示される（構造体２）：
Figure 0004602956
本明細書に記載されるエネルギー転移アプローチの利点は、（１）488nmで励起する場合、大きなストークスシフト及びより強い螢光シグナルが生成され得、そして（２）プライマーの移動性が同じ移動性を達成するためにドナーと受容体との間の距離を変えることにより調整され得ることである。FAM-3-TAMの可視スペクトルはFAM(495nm)及びTAM(560nm)の両者の吸光性を有するが、しかしながら、488nmでの励起に関しては、ほぼすべての発光は 579nmで最大であるＴから発生する（図１）。これは FAMから TAMへの効果的な螢光エネルギー転移を示す。これはまた、細管電気泳動（CE）カラム下にプライマーを負荷し、そして赤及び緑色のチャネルに検出することによっても見られ得る。
FAM-及びTAM-ラベルされたプライマーにより、ほぼすべての発光が赤色のチャネル(590nm)に見られる（図２）、これはドナー FAMからのエネルギーが受容体 TAMにほとんど完全に転移され、91nmのストークスシフトを生成することを示唆する。単一のピークの観察は、プライマーが純粋であることを示す。同じ結果が、114nmの大きなストークスシフトを付与する FAM-4-ROXに関して見られる（図３及び４）。単一の色素によりラベルされたプライマーに比較してエネルギー転移プライマーの螢光シグナルの増強が見られ、ここでは FAM-4-ROXの濃度と同じ濃度（UVにより測定される）での ABI ROXプライマーが同じ細管に注入されている。FAM-4-ROXのその得られる螢光シグナルは、ROXプライマーのシグナルよりも10倍以上高いことが見出された（図５）。
DNA配列決定へのドナー受容体螢光団によりラベルされたプライマーの好結果をもたらす適用のためには、プライマーは DNAフラグメントの同じ移動性シフトを生成し、そして明確な螢光シグナルを示すことが不可欠である。プライマーの移動性はドナーと受容体との間の距離に依存することが見出された（図６）。FAM-4-ROX，FAM-3-ROX及びFAM-10-ROXが細管から分離され、そして赤及び緑色のチャネルに検出された。FAM-10-ROXに関しては、色素間の距離の増加がエネルギー転移の量を減じ、２つのチャネルにほとんど等しいシグナルをもたらす。低下した相対的な緑色のシグナルにより示されるように、分離距離が減じられるにつれて、エネルギー転移の量は増加する。FAM-3-ROX及び FAM-4-ROXの両者は卓越したエネルギー転移を示すが、しかしそれらの移動性は明白に異なっており、すなわち距離を変えることにより移動性シフトを調整する可能性を提供する。
明確に異なった発光スペクトルを有する２種のプライマーの移動性の正確な整合を得るために、FAM-3-FAM，FAM-4-FAM及びFAM-10-FAMもまた調製された。調製されたプライマー（FAM-N-FAM，FAM-N-TAM，FAM-N-ROX）のライブラリー間で、Sequenase２を用いてFAM-10-FAM及び FAM-3-ROXにより生成される、Ａで終結する配列決定フラグメントがひじょうに類似する移動性シフトを有する（図７）ことが見出されており、これは DNA配列の分析のための可能性を示す。FAM-10-FAM及びFAM-3-ROXの発光は、それぞれ 525nm及び 605nmに存在する。水のラマンシグナルは、それらの２種の波長において、とるにたらない。従って、シグナル：ノイズの比は劇的に高められる。
Ｉ．修飾されたＴ及び５′位での FAMラベルを含む12ーマーのオリゴヌクレオチドの調製
次の３種のプライマーを、0.2μモル規模でABI Model394 DNA合成機上で調製した：
Figure 0004602956
アミノリンカーアームを含む修飾された塩基Ｔ*が、Amino-Modifier C6 dTホスホラミジット（Glen Research）を用いることにより、定義された位置に導入され、そして FAMが合成の最後の段階で6-FAM アミジット(ABI)を用いて導入された。塩基配列が完結された後、オリゴヌクレオチドを、１mlの濃NH4OH により固体支持体(CPG)から切断した。塩基上のアミノ保護基（Ａ，Ｇ，Ｃ及びＴ*）を、55℃で４時間、NH4OH 溶液を加熱することによって除去した。細管電気泳動分析は、オリゴマーが約80％の純度であり、そしてそれらが次の色素カップリング段階に直接使用されることを示唆した。
II．オリゴマー１，２及び３のアミノリンカーアームへの第２蛍光団の結合
代表的な例として、オリゴマー１に第２色素(TAM)を結合せしめる反応スキームが下記に示される：
Figure 0004602956
0.5ＭのNa4CO3／NaHCO3緩衝液40μｌ中、FAM-ラベルのオリゴヌクレオチド（１，２及び３）を、12μｌのDMSO中、約 150倍過剰量の TAM-NHSエステル又は ROX-NHSエステル又は FAM-NHSエステルと共に室温で一晩インキュベートした。反応しなかった色素を、Sephadex G-25カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。次に、２種の色素ラベルのオリゴヌクレオチドを、６Ｍ尿素−TBE，20 ％アクリルアミドゲル電気泳動(40cm×0.8cm)により精製した。純粋なプライマーをゲルから除去し、そしてOligonucleotide Purification Cartridge により脱塩した。プライマーの純度は、細管ゲルクロマトグラフィーにより99％以上であることが示された。
III． FAM-3-ROX及びFAM-10-FAMによる DNA配列決定フラグメントの調製
Ａで終結されるＭ13mp18の DNA配列決定フラグメントを、Sequenase2.0(USB)を用いて製造した。次の２種のアニーリング溶液を 600μｌのバイアルに調製した：（１）10μｌの反応緩衝液、40μｌのＭ13mp18一本鎖 DNA及び６μｌの FAM-3-ROX；（２）６μｌの反応緩衝液、20μｌのM13mp18一本鎖 DNA及び３μｌのFAM-10-FAM。個々のバイアルを65℃で５分間加熱し、そして室温に30分間冷却し、そして次に、20分間、氷上に置き、短いプライマーが鋳型に完全にハイブリダイズしたことを確認した。３μLの DTT，20μｌの ddA終結混合物及び12μLの希釈されたSequenase2.0を、氷上の個々のバイアルに添加した。
その反応混合物を20℃で20分間、及び次に、37℃でさらに20分間インキュベートした。反応を、50mMのEDTA 10 μL，４ＭのNH4OH 40μL及び95％EtOH 300μLの添加により停止した。前記溶液を十分に混合し、そして次に、氷上に20分間、置いた。フラグメントを75％冷EtOHにより２度脱塩し、真空下で乾燥せしめ、そして95％（ｖ／ｖ）ホルムアミド４μｌ及び50mMのEDTAに溶解した。サンプルを３分間、加熱し、DNAを変性し、そして次に、細管電気泳動装置上へのサンプルの注入まで、氷上に置いた。電気運動学的注入は、10KVで30秒間実施された。
実質的に同じ励起−吸光性及び移動性を有すると共に、異なった発光波長及び高い発光量子量を付与するために、関連する組成物、たとえば２種の螢光団により官能化されたポリヌクレオチドを調製できることは、上記結果から明らかである。この手段においては、組成物の混合物は独立して分析され、ここで異なった成分が異なった螢光発光バンドを有するラベルにより特異的にラベルされ得る。さらに、前記組成物は容易に調製され得、広範囲の種類の内容物に使用され得、そして増強された螢光性質及び良好な安定性を有する。
引用されるすべての出版物及び特許出願は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が引用により組込まれていることを特異的且つ個々に示されているかのように、引用により本明細書に組込まれている。
前述の発明は一層の理解のために例示的且つ例的にいくらか詳細に記載されて来たけれども、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは明らかである。
要約書
ドナー蛍光団及び受容体蛍光団の対を担持する蛍光ラベルの組を含んで成る組成物が提供されており、前記組成物は、単一の波長でドナー蛍光団の効果的な励起及び異なった波長で前記個々の対における受容体蛍光団からの発光のために企画されている。異なったドナー蛍光団−受容体蛍光団対を有する異なった分子は、与えられた対におけるドナーと受容体との間の距離を変えることによって、分離条件下で実質的に同じ移動性を有するように変性され得る。特に、蛍光組成物は、核酸の配列決定においてラベルとして使用される。
図１は、１×TBE における FAM-3-TAMの吸光及び発光スペクトルのグラフである。 図２は、FAM-3-TAMのCEエレクトロフェログラムである。サンプルは 488nmの励起を有する典型的な細管電気泳動 DNA配列決定条件により分析された。緑の痕跡は緑のチャネルに検出される螢光シグナルであり（525nm）、そして赤の痕跡は赤のチャネルに検出される螢光シグナルである（590nm）。両チャネルは同時に検出される。 図３は、１×TBE における FAM-4-ROXの吸光及び発光スペクトルのグラフである。 図４は、FAM-4-ROXのCEエレクトロフェログラムである。サンプルは、488nmの励起を有する典型的な細管電気泳動 DNA配列決定条件により分析される。緑の痕跡は緑のチャネルに検出される螢光シグナルであり（525nm）、そして赤の痕跡は赤のチャネルに検出される螢光シグナルである（590nm）。両チャネルは同時に検出される。 図５は、FAM-4-ROX及び ROXプライマーのCEエレクトロフェログラムである。同じ濃度での２種のプライマーが80％ホルムアミドにおいて一緒に混合され、そして細管中に注入された。螢光シグナルが 476nmでの励起を伴って緑及び赤のチャネルにおいて同時に検出された。 図６は、ドナーと受容体との間の距離に対しての移動性の依存性を示す、FAM-3-ROX，FAM-4-ROX及びFAM-10-ROX混合物のCEエレクトロフェログラムである。サンプルは、488nmの励起を有する典型的な細管電気泳動 DNA配列決定条件により分析される。 図７は、Ｍ13mp18Ａ フラグメント DNAサンプルに対しての異なった色素プライマーの移動シフトの比較である。

Claims (1)

  1. 核酸の配列決定方法であった、当該方法においては、一本鎖核酸をコピーするためのプライマー、及び前記コピーすることに起因する鎖を特定のヌクレオチドにおいて終結するためのジデオキシヌクレオシドを用い、当該方法は、
    配列決定されるべき核酸フラグメントを、プライマーを結合させるための配列を含んで成るベクターで、当該プライマーを結合させるための配列の３’−末端に前記配列決定されるべき核酸フラグメントの５’−末端を連結することにより、クローンニングし；
    前記プライマー、dNTP、及び少量の異なる複数種のジデオキシヌクレオチドの内の１種の存在下で、当該ジデオキシヌクレオチド毎に異なる反応容器において、 当該DNAポリメラーゼにより前記フラグメントをコピーし；そして
    前記コピーすることにより得られたDNAを変性して一本鎖DNAフラグメントを生成せしめ、当該一本鎖 DNAフラグメントの混合物をゲル上で分離し、そして当該ゲル上に存在するバンドにより配列を決定することを含んで成り、
    下記の点で改良されている配列決定方法：
    前記ジデオキシヌクレオシドが、
    （１）ドナー蛍光団−受容体蛍光団対を含み、ここで、当該ドナー蛍光団は、当該受容体蛍光団が蛍光を発するように、前記受容体蛍光団への効果的なエネルギーの転移を生じさせるものであり、
    （２）前記個々のジデオキシヌクレオシドが実質的に同じ波長で吸光し、そして異なった波長で発光し；そして
    （３）前記個々のジデオキシヌクレオシドが、前記分離において実質的に同じ移動性を有する、
    ことを特徴とする。
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