DE69530286T2

DE69530286T2 - Mit energieübertragungsvermittelnden verbindungen markierte proben

Info

Publication number: DE69530286T2
Application number: DE69530286T
Authority: DE
Inventors: Richard A. Mathies; Alexander Glazer; Jingyue Ju
Original assignee: University of California; University of California Berkeley
Current assignee: University of California; University of California Berkeley
Priority date: 1994-02-01
Filing date: 1995-01-30
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2015-01-31
Also published as: DE19581489B4; JPH09508525A; DE69530286D1; AU1736795A; JP2007000151A; WO1995021266A1; ATE236994T1; EP0743987A4; US5654419A; EP0743987A1; ES2197193T3; US5707804A; EP0743987B1; CA2182516C; DE29521620U1; CA2182516A1; JP3895369B2; AU692230B2; DE19581489T1; US5688648A

Description

Technisches Gebiet
Das Gebiet der vorliegenden Erfindung betrifft fluoreszierende Marker/Markierungen und deren Verwendung.
Hintergrund
Es besteht ein steigender Bedarf an der Fähigkeit, Komponenten von Mischungen zu identifizieren und zu quantifizieren. Je größer die Komplexität der Mischung ist, desto größer ist das Interesse daran, eine Vielzahl von Komponenten, welche darin vorliegen, gleichzeitig zu detektieren. Besonders deutlich wird diese Situation beim DNA-Sequenzenzieren, wobei es wünschenswert ist, ein bis vier fluoreszierend markierte Komponenten mit einer Laserquelle bei einer einzigen Wellenlänge wirksam anzuregen, während eine Fluoreszenssignalemission bei einer Vielzahl charakteristischer Wellenlängen erfolgt. In dieser Situation sollten die verschiedenen Marker die elektrophoretische Mobilität der Sequenzen, an die sie gebunden sind, nicht nachteilig beeinflussen.
Zur Zeit werden zum automatischen DNA-Sequenzieren vier Methoden verwendet: (1) die DNA-Fragmente werden mit einem Fluorophor markiert, und anschließend laufen die Fragmente in benachbarten Sequenzierungsreihen (Ansorge et al., Nucleic Acids Res. 15, 4593–4602 (1987); (2) die DNA-Fragmente werden mit vier verschiedenen Fluorophoren markiert, und alle Fragmente werden elektrophoretisch getrennt und in einer einzigen Reihe detektiert (Smith et al., Nature 321, 674–679 (1986); (3) jedes der Dideoxynukleoside in der Terminierungsreaktion wird mit einem unterschiedlichen Fluorophor markiert, und die vier Sätze der Fragmente werden in der selben Reihe laufen gelassen (Prober et al., Science 238, 336–341 (1987); oder (4) die Sätze der DNA-Fragmente werden mit zwei verschiedenen Fluorophoren markiert, und die DNA-Sequenzen werden mit den Farbstoffverhältnissen kodiert (Huang et al., Anal Chem. 64, 2149–2154, (1992).
All diese Techniken weisen unterschiedliche Nachteile auf. Das Verfahren 1 weist potentielle Probleme bezüglich der Reihe-zu-Reihe-Variationen der Mobilität sowie einen niedrigen Durchsatz auf. Die Verfahren 2 und 3 erfordern, dass vier Farbstoffe durch eine Laserquelle ausreichend angeregt werden und dass sie deutlich unterschiedliche Emissionsspektren aufweisen. In der Praxis ist es sehr schwierig, zwei oder mehrere Farbstoffe aufzufinden, welche mit einem einzigen Laser wirksam angeregt werden können und welche deutlich separierte Fluoreszenssignale emittieren.
Wenn man Farbstoffe mit deutlichen rot-verschobenen Emissionsspektren auswählt, bewegen sich deren Absorbtionsspektren ebenso ins Rote, und alle Farbstoffe können nicht mehr mittels derselben Laserquelle wirksam angeregt werden. Wenn ebenso unterschiedlichere Farbstoffe ausgewählt werden, wird es schwieriger, alle Farbstoffe derartig auszuwählen, dass sie denselben Mobilitätsshift der markierten Moleküle bedingen.
Es ist daher von äußerstem Interesse, verbesserte Verfahren vorzusehen, welche das Multiplexen von Proben derartig erlauben, dass eine Vielzahl von Komponenten in dem selben System in einem einzigen Durchgang bestimmt werden können. Es ist ebenso wünschenswert, dass ein jeder Marker eine starke Absorption bei einer gemeinsamen Wellenlänge aufweist, so dass eine hohe Quantenausbeute hinsichtlich der Fluoreszenz erreicht wird, dass sie einen großen Stokes-Shift der Emission zeigen, dass die verschiedenen Emissionen typisch beziehungsweise charakteristisch sind und dass die Marker den selben Mobilitätsshift einführen. Es ist schwierig, diese miteinander in Konflikt stehenden Ziele durch einfaches Markieren der Moleküle mit einem einzigen Farbstoff zu erreichen.
Das US-Patent Nr. 4,996,143 offenbart Polynukleotid-Proben, welche Donor- und Akzeptor-Fluorophore für den nicht-strahlenden Energietransfer enthalten, so dass weder die Donor- noch die Akzeptor-Einheiten an den 5'- oder 3'-Endeinheiten der Probe gebunden sind. Die Fluorophore sind mittels Linkerarmen an den Polynukleotid Proben befestigt. In einer Ausführungsform sind die Donor- und Akzeptor-Fuorophore an die Probe gebunden, wobei eine relative Trennung von zwischen zwei und sieben eingeschobenen Baseneinheiten erhalten wird.
Die WO 93/09128 beschreibt ein Polynukleotid mit mindestens zwei (mehrfachen) Donorchromophoren und einem fluoreszierenden Akzeptor-Fluorophor, positioniert in einem Donor-Akzeptor-Transfer-Abstand, so dass die mehrfachen Donoren das Anregungslicht sammeln und zu dem Akzeptor transferieren können. In einem Beispiel wird ein effizienter Energietransfer in einer Oligonukleotid-Sonde/Probe demonstriert, worin eine terminale Akzeptor-Fluores zenzgruppe (Texas Red) durch eine Nukleotid-Einheit von einer Donorgruppe (Fluorescein) getrennt ist.
Die EP 439036 A beschreibt ein Energietransfersystem, welches das Chromophor Lumazin sowie einen Komplex von Ruthenium, gebunden an eine Nukleotidkette, einschließt.
Die Japanische Anmeldung Nr. H5-60698 offenbart Nukleinsäure-Fragmente, z. B. Primer, markiert mit Fluoreszenzkörpern zur Verwendung in der Trennung und Detektion von Nukleinsäuren. Insbesondere werden Einzelstrang-DNA-Oligomere mit zwei Arten von Fluoreszenzkörpern in einer Energietransfer-Beziehung markiert.
Keine der oben genannten Offenbarungen beschreibt Kombinationen oder Familien von Fluoreszenzmarkern, welche Paare von Fluorophoren umfassen, und deren Verwendung in Trennungssystemen, welche eine Mehrzahl von Komponenten einschließen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum Analysieren einer Mischung unter Verwendung einer Mehrzahl von Fluoreszenzmarkern zur Verfügung. Um die Marker zu bilden, werden Paare oder Familien von Fluorophoren an ein Grundgerüst gebunden, insbesondere ein Nukleinsäure-Grundgerüst, worin eines der Mitglieder der Familien bei ungefähr derselben Wellenlänge angeregt wird. Unter Ausnutzung des Phänomens des Energietransfers emittieren die anderen Mitglieder einer jeden Familie bei detektierbar unterschiedlichen Wellenlängen. Der Bereich der Abstände zwischen Donor- und Akzeptor-Chromophoren wird derartig ausgewählt, dass ein effizienter Energietransfer sichergestellt ist. Darüberhinaus werden die gemeinsam verwendeten Marker derartig ausgewählt, so dass sie ungefähr dieselbe Mobilität in dem Trennsungssystem aufweisen. Dieses wird durch den Wechsel der Mobilität der markierten Einheit durch Variieren des Abstands zwischen den zwei oder mehreren der Familien an Fluorophoren und die Auswahl von Markern mit derselben Mobilität erreicht. Die vorliegende Erfindung findet insbesondere Anwendung im Sequenzieren, wobei die Fluorophore an universelle oder andere Primer und unterschiedliche Fluorophor-Kombinationen, welche für die verschiedenen Di deoxynukleoside verwendet werden, gebunden sein können. Kits von Kombinationen von Markern werden ebenso zur Verfügung gestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 stellt ein Diagramm der Absorptions- und Emissionsspektren von FAM-3-TAM in 1xTBE dar;
Die 2 is ein CE-Elektropherogramm vom FAM-3-TAM. Die Probe wurde unter typischen Kapillarelektrophorese-DNA-Sequenzierungsbedingungen bei 488 nm-Anregung analysiert. Die grüne Linie ist das Fuoreszenzsignal, detektiert in dem grünen Bereich/Kanal (525 nm), und die rote Linie ist das Fluoreszenzsignal, dedektiert in dem roten Bereich/Kanal (590 nm). Beide Bereiche werden simultan detektiert;
Die 3 stellt ein Diagramm der Absorptions- und Emissionsspektren von FAM-4-ROX in 1xTBE dar;
Die 4 is ein CE-Elektropherogramm vom FAM-4-ROX. Die Probe wurde unter typischen Kapillarelektrophorese-DNA-Sequenzierungsbedingungen bei 488 nm-Anregung analysiert. Die grüne Linie ist das Fuoreszenzsignal, detektiert in dem grünen Bereich/Kanal (525 nm), und die rote Linie ist das Fluoreszenzsignal, dedektiert in dem roten Bereich/Kanal (590 nm). Beide Bereiche werden simultan detektiert;
5 ist ein CE-Elektropherogramm vom FAM-4-ROX- und Rox-Primer. Die zwei Primer wurden bei der selben Konzentration in 80% Formamid zusammengemischt und in die Kapillare eingespritzt. Die Fluoreszenzsignale wurden in dem grünen und rotem Bereich simultan bei einer Anregung bei 476 nm detektiert;
6 ist ein CE-Elektropherogramm von einer FAM-3-ROX-, FAM-4-ROX- und FAM-IO-ROX-Mischung, welche die Abhängigkeit der Mobilität von dem Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor zeigt. Die Probe wurde unter typischen Kapillarelektrophorese-DNA-Sequenzierungsbedingungen bei 488 nm-Anregung analysiert; und
7 ist ein Vergleich des Mobilitätsshifts von unterschiedlichen Farbstoffprimern auf M13-mp-18-A-Fragment-DNA-Proben.
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
Es werden neue Fluoreszenzmarker, Kombinationen von Fluoreszenzmarkern und deren Verwendung in Trennungssystemen, einschließlich der Trennung einer Mehrzahl von Komponenten, zur Verfügung gestellt.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Kombination von Fluoreszenzmarkern zu Verfügung, wobei jeder Marker ein Donor-Akzeptor-Fluoreszenzpaar umfasst, wobei der Donor und der Akzeptor jeweils kovalent an verschiedene Atome einer Grundgerüstkette von Atomen mit effizienter Energieübertragung von dem Donor auf den Akzeptor gebunden sind, und wobei jeder der Marker eine einzelne Molekülspezies ist, und wobei jeder der Marker in der Kombination bei einer im wesentlichen gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer verschiedenen Wellenlänge emittiert.
Insbesondere umfassen die fluoreszierenden Marker Paare von Fluorophoren, welche mit einer Ausnahme, wo die Fluorophore dieselben sind, unterschiedliche Fluorophore mit überlappenden Spektren einschließen, wobei die Donoremission die Akzeptorabsorption überlappt, so dass ein Energietransfer von dem angeregten Fluorophor zu dem anderen Mitglied des Paars stattfindet. Es ist nicht wesentlich, dass das angeregte Fluorophor tatsächlich fluoresziert, vielmehr reicht es aus, dass das angeregte Fluorophor dazu in der Lage ist, die Anregungsenergie effizient zu absorbieren und wirksam an das emittierende Fluorophor zu transferieren.
Die Donor-Fluorophore in den unterschiedlichen Familien der Fluorophore können die selben oder unterschielich sein, allerdings sollten sie dazu in der Lage sein, mittels einer einzigen Lichtquelle mit einer schmalen Bandbreite wirksam angeregt zu werden, insbesondere mittels einer Laserquelle. Die Donor-Fluorophore weisen eine deutliche Absorption, gewöhnlich von mindestens ungefähr 10%, bevorzugt von mindestens 20% der Absorptionsmaxima innerhalb von 20 nm voneinander, gewöhnlich innerhalb von 10 nm; besonders bevorzugt innerhalb von 5 nm voneinander auf. Die emittierenden oder akzeptierenden Fluorophore sind dermaßen ausgewählt, dass sie dazu in der Lage sind, die Energie von Donor-Fluorophoren aufzunehmen und Licht zu emittieren, welches ckarakteristisch und detektierbar unterschiedlich ist. Daher wird es möglich sein, zwischen den Komponenten der Mischung, an die die unterschiedlichen Marker gebunden wurden, zu unterscheiden. Gewöhnlich emittieren die Marker bei Emissionsmaxima, getrennt durch mindestens 10 nm, bevorzugt durch mindestens 15 nm und besonders bevorzugt durch mindestens 20 nm.
Gewöhnlich absorbieren die Donor-Fluorophore in dem Bereich von ungefähr 350–800 nm, besonders bevorzugt in dem Bereich von 350–600 nm oder 500–750 nm, während die Akzeptor-Fluorophore Licht in dem Bereich von ungefähr 450– 1000 nm, bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 450–800 nm, emittieren. Wie nachstehend diskutiert werden wird, kann mehr als ein Paar von absorbierenden Molekülen eingesetzt werden, so dass man drei oder mehr Moleküle hat, wobei die Energie von einem Molekül zu dem nächsten bei höheren Wellenlängen transferiert wird, so dass der Unterschied in der Wellenlänge zwischen Absorption und beobachteter Emission stark steigt.
Die zwei Fluorophore werden durch ein Grundgerüst oder eine Kette, gewöhnlich eine polymere Kette, verbunden, wobei der Abstand zwischen den zwei Fluorophoren variiert werden kann. Die Physik hinter dem Design der Marker liegt darin, dass der Transfer der optischen Anregung von dem Donor zu dem Akzeptor von l/R⁶ abhängt, wobei R der Abstand zwischen den zwei Fluorophoren darstellt. Auf diese Weise muss der Abstsand derartig ausgewählt werden, dass ein effizienter Energietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor durch den alt bekannten Förster-Mechanismus bereit gestellt wird. Daher kann der Abstand zwischen den zwei Fluorophoren, bestimmt durch die Anzahl von Atomen in der Kette, welche die zwei Fluorophore trennen, gemäß der Natur der Kette variiert werden. Verschiedene Ketten oder Grundgerüste können eingesetzt werden, wie Nukleinsäuren, sowohl DNA als auch RNA, modifizierte Nukleinsäuren, z. B. worin Sauerstoffatome durch Schwefel, Kohlenstoff oder Stickstoff substituiert sind, Phosphate, substituiert durch Sulfat oder Carboxlat, etc., Polypeptide, Polysaccharide, verschiedene Gruppen, welche stufenweise hinzugefügt werden können, wie difunktionale Gruppen, z. B. Haloamine oder ähnliches.
Die Fluorophore können, wenn dieses erforderlich ist, durch geeigente Funktionalisierung der verschiedenen Aufbaublöcke substituiert sein, wobei das Fluorophor auf dem Aufbaublock während der Bildung des Markers vorliegen kann, oder welches, wenn dieses geeignet ist, nachträglich hinzugefügt werden kann. Die verschiedenste konventionelle Chemie kann eingesetzt werden, um sicher zu stellen, dass ein geeignter Abstand zwischen den zwei Fluorophoren erhalten wird.
Die Molekulargewichte der Marker (Fluorophore plus das Grundgerüst, an das sie gebunden sind) beträgt im Allgemeinen mindestens ungefähr 250 Dal und nicht mehr als ungefähr 5000 Dal, gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 2000 Dal. Das Molekulargewicht des Fluorophors liegt im Allgemeinen in dem Bereich von ungefähr 250 bis 1000 Dal, wobei die Molekulargewichte der Akzeptor-Donor-Paare auf unterschiedlichen Markern, welche zusammen verwendet werden sol len, gewöhnlich um mehr als ungefähr 20% differieren. Die Fluorophore können an den Ketten intern, an den Enden oder eines an einem Ende und das andere an einer internen Stelle gebunden sein. Die Fluorophore können derartig ausgewählt sein, dass sie aus einer ähnlichen chemischen Familie, wie Cyanin-Farbstoffen, Xanthenen oder ähnlichem, entstammen. Daher kann man die Donoren aus der- selben chemischen Familie, ein jedes Donor-Akzeptor-Paar aus derselben chemischen Familie oder jeden Akzeptor aus derselben Familie erhalten.
Die vorliegenden Marker finden insbesondere Anwendung in verschiedenen Trennungsverfarhren, wie der Elektrophorese, Chromatographie oder ähnlichem, wobei man optimierte spektroskopische Eigenschaften, eine hohe Empfindlichkeit und einen vergleichbaren Einfluss der Marker auf das Wanderverhalten der Komponenten, welche analysiert werden sollen, erhalten möchte. Von besonderem Interesse ist die Elektophorese, wie die Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese etc. Unter den Chromatographietechniken ist die HPLC-, Affinitätschromatographie, Dünnschichtchromatographie, Papierchromatographie und ähnliches zu erwähnen.
Es wurde gefunden, dass der Abstand zwischen den zwei Fluorophoren die Mobilität des Markers beeinflusst. Daher können unterschiedliche Farbstoffpaare verwendet werden, und durch das Variieren des Abstands zwischen den unterschiedlichen Farbstoffpaaren innerhalb eines Bereichs, welcher weiterhin einen guten Energietransfer erlaubt, können im wesentlichen konstante Mobilitäten für die Marker erhalten werden. Die Mobilität hängt nicht von dem spezifischen Abstand ab, so dass man die Wirkung des Abstands auf die Mobilität eines speziellen Markers empirisch bestimmen muss. Wegen der Flexibilität in dem Abstand der Fluorophore in den Markern können nun durch das Synthetisieren einiger unterschiedlicher Marker mit unterschiedlichen Abständen und unterschiedlichen Farbstoffpaaren jedoch eine Familie von fluoreszierenden Markern zur Verfügung gestellt werden, welche eine gängige Anregung teilen, die eine starke und charakteristische Emission und eine im wesentlichen gemeinsame Mobilität aufweisen. Gewöhnlich unterscheidet sich die Mobilität um nicht mehr als ungefähr 20% voneinander, bevorzugt um nicht mehr als ungefähr 10% voneinander und ganz besonders bevorzugt innerhalb von ungefähr 5% voneinander, wenn sie in einer/einem bestimmten Trennung/Abstand verwendet werden. Die Mobilität kann gewöhnlich durch Ausführen der Trennung der Marker selbst oder der Marker, gebunden an ein gemeinsames Molekül, welches zur besonderen Tren nung relevant ist, bestimmt werden, z. B. ein Nukleinsäure-Molekül einer geeigneten Größe, welches sequenziert werden soll.
Eine breite Vielfalt an Fluoreszenzfarbstoffen kann Anwendung finden. Diese Farbstoffe fallen in verschiedene Klassen, wobei Kombinationen von Farbstoffen innerhalb der selben Klasse oder zwischen verschiedenen Klassen verwendet werden können. Eingeschlossen unter diesen Klassen sind Farbstoffe, wie die Xanthen-Farbstoffe z. B. Fluoresceine und Rhodamine, Coumarine, z. B. Umbelliferone, Benzimid-Farbstoffe, z. B. Hoechst 33258, Phenanthridin-Farbstoffe, z. B. Texas Red, und Ethidium-Farbstoffe, Acridin-Farbstoffe, Cyanin-Farbstoffe, wie Thiazol-Orange, Thiazol-Blau, Cy 5 und Cyfr, Carbazol-Farbstoffe, Phenoxazin-Farbstoffe, Porphyrin-Farbstoffe, Chinolin-Farbstoffe, oder ähnliches. Somit können die Farbstoffe in dem ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Bereich absorbieren. Für die meisten Fälle weisen die fluoreszierenden Moleküle ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 2 kDal, im Allgemeinen von weniger als ungefähr 1, 5 kDal auf.
Der Energiedonor sollte einen starken molaren Absorptionskoeffizienten bei der gewünschten Anregungswellenlänge aufweisen, wünschenswerterweise größer als ungefähr 10⁴, bevorzugt größer als ungefähr 10⁵ cm^–1M^–1. Das Anregungsmaximum des Donors und das Emissionsmaximum des Akzeptors (fluoreszierender Stoff) ist um mindestens 15 nm oder mehr getrennt. Das spektrale Überlappungsintegral zwischen dem Emissionsspektrum des Donor-Chromophors und dem Absorptionsspektrum des Akzeptor-Chromophors und der Abstand zwischen den Chomophoren ist derartig, dass die Effizienz des Energietransfers von dem Donor zu dem Akzeptor im Bereich von 20% bis 100% liegt.
Der Abstand beziehungsweise die Trennung des Donors und des Akzeptors auf der Basis der Anzahl der Atome in der Kette variiert in Abhängigkeit von der Natur des Rückgrats beziehungsweise des Grundgerüsts, je nachdem, ob starr oder flexibel, wobei Ringstrukturen oder nicht-cyclische Strukturen oder ähnliches eingeschlossen sind. Im Allgemeinen liegt die Anzahl der Atome in der Kette (die Atome in den Ringstrukturen werden als die niedrigste Anzahl von Atomen entlang einer Seite des Rings zum Anschluss an die Kette gezählt) unterhalb von ungefähr 200, gewöhnlich unterhalb von ungefähr 150 Atomen, bevorzugt unterhalb von ungefähr 100, wobei die Natur des Grundgerüsts die Effizienz des Energietransfers zwischen Donor und Akzeptor beeinflusst.
Während in den meisten Fällen Paare von Fluorophoren verwendet werden, können Situationen auftreten, wo bis zu vier verschiedene, gewöhnlich nicht mehr als drei verschiedene Fluorophore, gebunden an das selbe Grundgerüst, Verwendung finden können. Durch Verwendung von mehreren Fluorophoren kann man den Stokes-Shift außerordentlich ausdehnen, so dass eine Anregung in dem sichtbaren Wellenlängenbereich und eine Emission in dem Infrarotwellenlängenbereich, gewöhnlich unterhalb von ungefähr 1000 nm, besonders bevorzugt unterhalb von ungefähr 900 nm, auftreten kann. Die Detektierung des Lichts in dem Infrarotwellenlängenbereich hat viele Vorteile, da sie keiner Interferenz von Raman- und Rayleigh-Licht unterliegt, welche aus dem Anregungslicht resultiert. Um die Mobilität konstant zu halten, kann man die selbe Anzahl von Fluorophoren auf den Markern verwenden mit einer Multiplizität des selben Fluorophors, so dass sie zu der Anzahl der Fluorophoren auf den Markern mit unterschiedlichen Fluorophoren für den großen Stokes-Shift paßt.
Die Marker der vorliegenden Erfindung können in Anwendungen verwendet werden, welche die Detektierung und die Unterscheidung zwischen verschiedenen Komponenten in einer Mischung einschließen. Das Verfahren umfasst das Binden von verschiedenen Markern an verschiedenen Komponenten von Interesse der Multikomponentenmischung und das Detektieren eines jeden der markierten Komponenten durch Bestrahlen mit der Absorptionswellenlänge des Donors und das Detektieren der Fluoreszenz eines jeden der Marker.
Die vorliegende Erfindung findet insbesondere Anwendung bei Nukleinsäureketten, worin die Nukleinsäureketten Verwendung als Primer beim Sequenzieren finden, der Polymerasekettenreaktion, insbesondere zum Klassieren beziehungsweise Sortieren, oder in anderen Systemen, worin Primer zur Nukleinsäureverlängerung eingesetzt werden und es erwünscht ist, zwischen verschiedenen Komponenten der Mischung hinsichtlich der speziellen Marker zu unterscheiden. Beispielsweise können beim Sequenzieren universelle Primer eingesetzt werden, wobei ein unterschiedliches Paar von Fluorophoren verwendet wird für jedes der verschiedenen Dideoxynukleoside, welche für die Verlängerung beziehungsweise Ausdehnung während des Sequenzierens verwendet werden.
Eine große Anzahl an Nukleosiden ist erhältlich, welche funktionalisiert sind und welche in der Synthese von Polynukleotiden zum Einsatz kommen. Durch das Synthetisieren der vorliegenden Nukleinsäuremarker können die spezifischen Stellen definiert werden, an denen die Fluorophore vorliegen. Es können kom merziell erhältliche Synthetisier-Vorrichtungen in Übereinstimmung mit koventionellen Methoden eingesetzt werden, so dass eine jede Sequenz erhalten werden kann, wobei das Paar der Fluorophore den geeigneten Abstand aufweist.
Wo unterschiedliche Primer in der PCR verwendet worden sind, kann ein jeder der Primer gemäß der vorliegenden Erfindung markiert sein, so dass man die Anwesenheit der Zielsequenz, welche zu einem jeden der verschiedenen Primer komplementär ist, leicht detektieren kann. Andere Anwendungen, welche Verwendung finden können, umschließen die Identifizierung von Isozymen, wobei spezifische Antikörper verwendet werden können, die Identifizierung von Lektinen unter Verwendung unterschiedlicher Polysaccharide und ähnliches.
Die Fluoreszenzmarker der vorliegenden Erfindung können ebenso in Verfahren verwendet werden, welche das Trennen von Nukleinsäurekomponenten in einer Multikomponentenmischung einschließen, worin eine jede der verschiedenen Komponenten von Interesse mit unterschiedlichen Markern markiert ist, worin ein jeder Marker ein Donor-Akzeptor-Fluoreszenzpaar umfasst, welches an unterschiedliche Atome einer Oligonukleotid-Kette mit einem effizienten Energietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor kovalent gebunden ist; eine jede der Markierungen eine einzelne Molekülspezies darstellt und eine jede bei im wesentlichen der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer verschiedenen Wellenlänge emittiert; und ein jeder der verschiedenen Marker im wesentlichen die selbe Mobilität in der Trennung als ein Ergebnis der Variation des Abstands des Donor-Akzeptor-Paars entlang der Oligonukleotid-Kette aufweist. Das Verfahren umfasst das Binden unterschiedlicher Marker an unterschiedliche Komponenten der Multikomponentenmischung, das Trennen der Komponenten in einzelne Fraktionen und das Detektieren der markierten Komponenten durch Bestrahlen bei der Absorptionswellenlänge des Donors und des Detektieren der Fluoreszenz eines jeden Markers.
Wie bereits angegeben finden die vorliegenden Marker insbesondere Anwendung beim Sequenzieren. Beispeilsweise können universelle Primer hergestellt werden, worin der Primer ein jeder der universellen Primer sein kann, welcher durch Binden der zwei Fluorophore an den Primer modifiziert worden ist. Somit sind verschiedene kommerzielle Primer erhältlich, wie die Primer von pUC/M13, γgt10, γ gt11 und ähnliche. Siehe dazu Sambrook et all., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage, CSHL, 1989, Section 13. Die DNA-Sequenzen werden in einem geeigneten Vektor mit einer Primer=Sequenz, gebunden an die Sequenz, welche sequenziert werden soll, geklont. Es werden unterschiedliche 2',3'-ddNTPs eingesetzt, so dass die Termination an verschiedenen Stellen erfolgt, in Abhängigkeit von den speziellen ddNTP, welche in der Kettenverlängerung vorliegen. Durch Einsatz der vorliegenden Primer kann ein jedes ddNTP mit einem speziellen Marker verbunden werden. Nach der Verlängerung mit dem Klenow-Fragment können die resultierenden Fragmente anschließend in einer einzelnen Reihe durch Elektrophorese oder in einer einzigen Kapillare durch Elektrophorese getrennt werden, wobei man das terminierende Nukleotid mittels der Fluoreszenz des Markers detektieren kann.
Die vorliegenden Marker können ebenso mit Immunkomplexen verwendet werden, worin die Liganden oder Rezeptoren, z. B. Antikörper, zur Detektierung der verschiedenen Komplexe oder Mitglieder der Komplexe markiert sein können. Wenn die Liganden das selbe Wanderverhalten in dem Trennungsverfahren aufweisen, können die verschiedenen Antikörper mit den verschiedenen Markern, welche bei unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren, markiert sein zur Bestimmung der Anwesenheit eines oder mehrere solcher Liganden, so dass sie detektierbar sind, auch wenn ein Überlappen der Zusammensetzungen in der Trennung vorliegt.
Es werden Kits mit einer Kombination von Markern, gewöhnlich mindestens zwei, zur Verfügung gestellt. Ein jeder der Marker weist ein Akzeptor-Donor-Paar auf, gewöhnlich mit vergleichbaren Grundgerüsten, worin die Marker entlang des Grundgerüsts unter Erhalt einer vergleichbaren Mobilität in den zu verwendenden Trennungsverfahren getrennt werden. Ein jeder der Marker in einer zusammen zu verwendenen Gruppe absorbiert bei ungefähr der selben Wellenlänge und emittiert bei verschiedenen Wellenlängen. Ein jeder der Marker in der Gruppe hat ungefähr die selbe Wirkung auf die Mobilität in dem Trennungsverfahren als ein Ergebnis der Variation der Stellung der verschiedenen Fluorophore entlang des Grundgerüsts.
Die Kits haben im Allgemeinen bis zu ungefähr sechs, gewöhnlich bis zu ungefähr vier unterschiedliche Marker, welche zusammenpassen, allerdings können sie zwei oder mehrere. Sätze von zusammenpassenden Markern aufweisen, mit 2– 6 unterschiedlichen Markern.
Von besonderem Interesse sind Marker, welche ein Nukleinsäure-Grundgerüst aufweisen, worin die Marker im Allgemeinen mindestens ungefähr 10 Nukleotide und nicht mehr als ungefähr 50 Nukleotide aufweisen, gewöhnlich nicht mehr als 30 Nukleotide. Die Marker können auf den Nukleotiden vorliegen, welche zu der komplementären Sequenz hybridisieren, oder können getrennt von jenen Nukleotiden sein. Die Fluorophore sind gewöhnlich an das Nukleotid durch einen passenden Verbindungsarm von ungefähr 2 bis 20, gewöhnlich 4 bis 16 Atomen in der Kette gebunden. Die Kette kann eine Vielzahl von Funktionalitäten aufweisen, insbesondere nicht-Oxocarbonyl, insbesondere Ester und Amid, Amino, Oxy und ähnliches. Die Kette kann aliphatisch, alizyklisch, aromatisch, heterozyklisch oder Kombinationen davon sein, gewöhnlich umfassend Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel oder ähnliches in der Kette.
Die gesamte Nukleinsäure-Sequenz kann zu der 5'-Primersequenz komplementär sein oder kann nur zu dem 3'-Teil der Sequenz komplementär sein. Gewöhnlich liegen mindestens ungefähr vier Nukleotide, besonders bevorzugt mindestens fünf Nukleotide vor, welche zu der zu kopierenden Sequenz komplementär sind. Die Primer werden mit der Sequenz, welche kopiert werden soll, in einem geeigneten Plasmid mit der Primersequenz an dem 3'-Ende des Strangs, welcher kopiert werden soll, kombiniert, und dNTPs werden zugesetzt mit einer geringen Menge an geeignetem ddntp. Nach der Verlängerung kann die DNA isoliert und in ein Gel oder eine Kapillare zur Trennung transferiert werden.
Die Kits, welche eingesetzt werden, weisen mindestens zwei der vorliegenden Marker auf, welche dadurch zusammenpassen, dass sie im wesentlichen die selbe Absorption für das Donor Molekül, bestimmte Emissionsspektren und im wesentlichen die selbe Mobilität aufweisen. Im Allgemeinen beträgt für Einzelstrang-Nukleinsäuren die Trennung beziehungsweise der Abstand ungefähr 1–15, besonders bevorzugt von 1–12, ganz besonders bevorzugt 2–10 Nukleoside zwischen den Fluorophoren.
Die folgenden Beispiele werden zum Wege der Verdeutlichung bereitgestellt und nicht zu Zwecken der Begrenzung.
Experimentelles
Design und Synthese von Energietransfer-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Polynukleotidmarkern für die genetische Analyse
Es wurden Deoxyoligonukleotide (12 Basen lang) mit der Sequenz 5'-GTTTTCCCAGTC-3', gewählt aus dem M13-Universal-Primer, mit Doner-Akzeptor-Fluorophorpaaren synthetisiert, getrennt durch verschiedene Abstände. Insbesondere das 12-mer enthält eine modifizierte Base, eingeführt durch die Verwendung von 5'-Dimethoxytrityl-5-[N-(trifluoracethylaminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deoxyuridin- 3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-düsopropyl)]phosphoramidit (Amino-Modifizierer C6 dT) (Struktur 1), welcher einen primären Aminlinkerarm in der C-5-Position aufweist.
Struktur 1: Amino-Modifizierer C6 dT
Der Donor-Farbstoff wurde an die 5'-Seite des Oligomers angehängt, und der Akzeptor-Farbstoff wurde an die primäre Amingruppe des modifizierten T gehängt. -Der Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor wurde durch Variieren der Position des modifizierten T auf dem Oligomer geändert. Die Primer wurden als D-N-A bezeichnet, worin D der Donor ist, A der Akzeptor ist und N die Anzahl der Basen zwischen D und A darstellt. In allen hergestellten Primern ist D der "Applied-Biosystems-Inc." ("ABI") Farbstoff FAM, ein Fluoroescein-Derivat, A ist der ABI-Farbstoff TAM oder ROX, welche beide Rhodamin-Derivate darstellen. Als ein repräsentatives Beispiel ist die Struktur von FAM-3-TAM unten gezeigt (Struktur 2).
Struktur 2: FAM-3-TAM
Die Vorteile des Energietransferansatzes, der hierin beschrieben ist, sind (1) dass ein großer Stokes-Shift und viel stärkere Fluoroeszenzsignale gebildet werden können, wenn bei 488 nm angeregt wird, und (2) dass die Mobilität der Primer durch Variieren der Abstände zwischen dem Donor und dem Akzeptor unter Erhalt der selben Mobilität getuned werden kann. Das sichtbare Spektrum vom FAM-3-TAM zeigt sowohl die Absorption von FAM (495 nm) als auch von TAM . (560 nm); jedoch entstammt bei Anregung bei 488 nm annähernd die gesamte Emission von T mit einem Maximum bei 579 nm (1). Dieses zeigt einen effizienten Fluoreszenz-Energietransfer von FAM zu TAM. Dieses kann ebenso beobachtet werden, wenn man den Primer eine Kapillarelektrophorese-Säule (CE) – entlang laufen läßt und bei roten und grünen Kanälen/Bereichen detektiert. Bei einem FAM- und TAM-markierten Primer wird annähernd die gesamte Emission in dem roten Kanal/Bereich (590 nm) beobachtet (2), was anzeigt, dass die Energie von dem Donor FAM fast vollständig zu dem Akzeptor des TAM transferiert wurde, wodurch ein Stokes-Shift von 91 nm gebildet wurde. Das Auftreten eines einzelnen Peaks zeigt an, das der Primer rein ist. Das selbe Ergebnis wird für FAM-4-ROX beobachtet, welches sogar einen größeren Stokes-Shift von 114 nm ergibt (3 und 4). Die Verstärkung der Fluoreszenzsignale der Energietransfer-Primer im Vergleich zu einfachen Farbstoff-markierten Primern wird beobachtet, wo ein ABI-ROX-Primer in der selben Konzentration wie die von FAM-4-ROX (gemessen durch UV in die selbe Kapillare injiziert wurde. Das resultierende Fluoreszenzsignal von FAM-4-ROX wird als mehr als 10 mal höher als das des ROX-Primers (5) beobachtet.
Für eine erfolgreiche Anwendung der Donor-Akzeptor-Fluorophox-markierten Primer in der DNA-Sequenzierung ist es erforderlich, dass die Primer die selben Mobilitätsshifts der DNA-Fragmente bilden und charakteristische Fluoreszenzsignale zeigen. Es wurde gefunden, dass die Mobilität der Primer von dem Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor abhängt (6). FAM-4-ROX, FAM-3-ROX und FAM-10-ROX wurden auf einer Kapillare getrennt und in roten und grünen Kanälen/Bereichen detektiert. Für FAM-10-ROX reduzierte der vergrößerte Abstand zwischen den Farbstoffen den Anteil an Energietransfer, was in annähernd gleichen Signalen in beiden Kanälen resultierte. Wenn der Trennabstand vermindert wurde, nahm der Anteil an Energietransfer zu, wie durch das reduzierte relative grüne Signal belegt wurde. FAM-3-ROX und FAM-4-ROX zeigten beide einen ausgezeichneten Energietransfer, allerdings waren deren Mobilitäten deutlich unterschiedlich, was das Potential des Tunings des Mobilitätsshifts durch Variation des Abstands nahelegt. Um ein exaktes Anpassen der Mobilität der zwei Primer zu erhalten, welche deutlich unterschiedliche Emissionsspektren aufweisen, wurden ebenso FAM-3-FAM, FAM-4-FAM und FAM-10-FAM hergestellt. In einer Bibliothek von hergestellten Primern (FAM-N-FAM, FAM-N-TAM, FAM-N-ROX) wurde gefunden, dass das Sequenzieren von Fragmenten, welche in A enden, gebildet bei FAM-10-FAM und FAM-3-ROX unter Verwendung von Sequenase 2, sehr ähnliche Mobilitätsshift aufweisen (7), was das Potential für die DNA-Sequenzanalyse demonstriert. Die Emission von FAM-10-FAM und FAM-3-ROX liegt bei jeweils 525 nm und 605 nm. Die Wasser-Raman-Signale sind bei diesen zwei Wellenlängen trivial. Somit wurde das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis drastisch erhöht.
I. Herstellung von 12-mer-Oligonukleotiden, enthaltend einen modifizierten T-und einen FAM-Marker in der 5'-Position.
Die folgenden drei Primer wurden auf einer ABI-Modell-394-DNA-Synthetisier-Vorrichtung in einem 0,2 μmol Maßstab hergestellt:
Die modifizierte Base T*, enthaltend einen Aminolinker Arm, wurde in der definierten Position durch Verwendung eines Amino-Modifizierers C6 bT-Phosphoramidit (Glen Research) eingeführt, und FAM wurde unter Verwendung von 6-FAM-Amidit (ABI) in dem letzten Schritt der Synthese eingefügt. Nachdem die Basensequenz vollständig war, wurden die Oligonukleotide von dem festen Träger (CPG) mit 1 ml konzentriertem NH₄OH abgespalten. Die Amino-Schutzgruppen an den Basen (A, G, C und T*) wurden durch Erwärmen der NH₄OH-Lösung innerhalb von 4 Stunden bei 55°C entfernt. Die Kapillarelektrophoreseanalyse zeigte, dass die Oligomere ungefähr 80% rein waren, und sie wurden direkt in dem nächsten Farbstoffkupplungsschritt verwendet.
II. Anhängen des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs an den Aminolinkerarm der Oligomere 1 2 und 3
Als ein repräsentatives Beispiel wird das Reaktionsschema zur Kupplung des sekundären Farbstoffs (TAM) an das Oligomer 1 nachstehend gezeigt:
FAM-3-TAM
Die FAM-markierten Oligonukleotide (1, 2 und 3) in 40 μL 0,5 M Na₂CO₃/ NaHCO-Puffer wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit ungefähr 150-fachem Überschuss von entweder TAM-NHS-Ester, ROX-NHS-Ester oder FAM-NHS-Ester in 12 μL DMSO inkubiert. Unumgesetzter Farbstoff wurde mittels Größenausschluss-Chromatographie auf einer Sephadex-G-25-Säule entfernt. Die zwei Farbstoff-markierten Oligonukleotide wurden anschließend durch 6 M Harnstoff-TBE, 20% Acrylamid-Gelelektrophorese (40 cm × 0,8 cm) gereinigt. Die reinen Primer wurden aus dem Gel isoliert und mit einer Oligonucleotid-Purification-Cartridge entsalzt. Die Reinheit der Primer zeigte sich als > 99% durch Kapillargelelektrophorese.
III. Herstellung von DNA Sequenzfragmenten mit FAM-3-ROX und FAM-10-FAM
M13mp18-DNA-Sequenzfragmente, terminiert in A, wurden unter Verwendung von Sequenase 2.0 (USB) hergestellt. Zwei Kühllösungen (annealing solutions) wurden in 600 μL Fläschchen hergestellt: (1) 10 μL Reaktionspuffer, 40 μL M13mp18-Einzelstrang-DNA und 6 μL FAM-3-ROX; (2) 6 μL Reaktionspuffer, 20 μL M13mp18-Einzelstrang-DNA und 3 μL FAM-10-FAM. Ein jedes Fläschchen wurde auf 65°C fünf Minuten lang erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur innerhalb von 30 Minuten abgekühlt und auf Eis 20 Minuten lang gestellt, um sicher zu stellen, dass die kürzeren Primer vollständig mit dem Templat hybridisiert waren. 3 μL DTT, 20 μL ddA-Terminationsmischung und 12 μL verdünnte Sequenase 2.0 wurden zu jedem Fläschchen auf Eis zugesetzt. Die Reaktionsmischungen wurden anfänglich bei 20°C 20 Minuten lang und anschließend bei 37°C weitere 20 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wurden durch Zugabe von 10 μL 50mM EDTA, 40 μL 4 M NH₄OH und 300 μL 95% EtOH gestoppt. Die Lösungen wurden intensiv gemischt und anschließend 20 Minuten lang auf Eis gestellt. Die Fragmente wurden zweimal mit 75% kaltem EtOH entsalzt, unter Vakuum getrocknet und in 4 μL 95% (v/v) Formamid und 50 mM EDTA gelöst. Die Probe wurde 3 Minuten lang zum Denaturieren der DNA erwärmt und anschließend auf Eis gestellt, bis die Probe in das Kapillarelektrophoreseinstrument injiziert wurde. Die elektrokinetische Injektion wurde durchgeführt bei 10 kV innerhalb von 30 Sekunden.
Aus den oben genannten Ergebnissen wird deutlich, dass man in Bezug zueinander stehende Zusammensetzungen tunen kann, z. B. Polynukleotide, funktionalisiert mit zwei Fluorophoren, so dass unterschiedliche Emissionswellenlängen und hohe Emissionsquantenausbeuten zur Verfügung gestellt werden, während sie im wesentlichen die gleiche Anregungslichtabsorptionsfähigkeit und Mobilität aufweisen. Auf diese Weise können Mischungen von Zusammensetzungen unabhängig voneinander analysiert werden, wobei die verschiedenen Zusammensetzungen unterschiedlich markiert sein können mit Markern mit verschiedenen Fluoreszenzemissionsbanden. Darüber hinaus können die Zusammensetzungen leicht hergestellt werden, können in einer breiten Vielfalt von Zusammenhängen eingesetzt werden und weisen eine gute Stabilität und verbesserte Fluoreszenzeigenschaften auf.

Claims

Kombination aus fluoreszierenden Markern, wobei jeder Marker ein Donor-Akzeptor-Fluoreszenzpaar umfaßt, wobei der Donor und der Akzeptor jeweils kovalent an verschiedene Atome einer Grundgerüstkette von Atomen mit effizienter Energieübertragung von dem Donor auf den Akzeptor gebunden sind, und wobei jeder der Marker eine einzelne Molekülspezies ist, und wobei jeder der Marker in der Kombination bei im wesentlichen der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer verschiedenen Wellenlänge emittiert.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Donor-Fluorophore die gleichen sind.
Kombination nach Anspruch 1 oder 2, wobei jedes der Donor-Fluorophore Licht im Wellenlängenbereich von 350–800 nm absorbiert, und jeder der Akzeptoren Licht im Wellenlängenbereich von 450–1000 nm emittiert.
Kombination nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Molekulargewicht der Marker (Fluorophore plus die Grundgerüstkette von Atomen, an welche sie gebunden sind) nicht mehr als 5000 Daltons beträgt.
Kombination nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die Donor-Akzeptor-Paare Xanthen-Farbstoffe sind.
Kombination nach Anspruch 5, wobei die Xanthen-Farbstoffe Fluoresceinderivate und Rhodaminderivate umfassen.
Kombination nach den Ansprüchen .1 bis 6, wobei die Grundgerüstkette von Atomen ein polymeres Grundgerüst ist.
Kombination nach Anspruch 7, wobei das polymere Grundgerüst ein Oligonukleotid ist.
Kombination nach den Ansprüchen 1–8, wobei einer oder mehrere der fluoreszierenden Marker weiterhin ein drittes Fluorophor umfaßt, so dass Energie von einem Molekül zu dem nächsten bei höherer Wellenlänge übertragen wird und die Anregung des ersten Fluorophors Fluoreszenz von dem dritten Fluorophor produziert.
Verfahren zum Identifizieren und Detektieren von Komponenten in einer Mehrkomponentenmischung unter Verwendung von fluoreszierenden Markern, um mindestens zwei Komponenten von Interesse zu detektieren, wobei: i) jeder der Marker ein Donor-Akzeptor-Fluoreszenzpaar umfaßt, das kovalent an verschiedene Atome einer Grundgerüstkette von Atomen mit effizienter Energieübertragung von dem Donor auf den Akzeptor gebunden ist; und ii) jeder der Marker eine einzelne Molekülspezies ist und jeder bei im wesentlichen der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer verschiedenen Wellenlänge emittiert; wobei das Verfahren umfaßt: Binden verschiedener Marker an verschiedene Komponenten von Interesse der Mehrkomponentenmischung und Detektieren jeder der markierten Komponenten durch Bestrahlen bei der Absorptionswellenlänge des Donors und Detektieren der Fluoreszenz jedes der Marker.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Donor-Fluorophore die gleichen sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei jeder der Donoren Licht im Wellenlängenbereich von 350–800 nm absorbiert und jeder der Akzeptoren Licht im Wellenlängenbereich von 450–1000 nm emittiert.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Donor-Akzeptor-Paar Xanthen-Farbstoffe sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Xanthen-Farbstoffe Fluoresceinderivate und Rhodaminderivate umfassen.
Verfahren zum Trennen von Komponenten in einer Mehrkomponentenmischung, wobei jede der Komponenten von Interesse mit verschiedenen Markern markiert wird, wobei die Marker dadurch gekennzeichnet sind, dass i) jeder Marker ein Donor-Akzeptor-Fluoreszenzpaar umfaßt, das kovalent an verschiedene Atome einer Oligonukleotidkette mit effizienter Energieübertragung von dem Donor auf den Akzeptor gebunden ist; ii) jeder der Marker eine einzelne Molekülspezies ist und jeder bei im wesentlichen der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer verschiedenen Wellenlänge emittiert; und iii) jeder der verschiedenen Marker im wesentlichen die gleiche Mobilität bei der Trennung besitzt, als ein Ergebnis der Variation des räumlichen Abstandes des Donor-Akzeptor-Paars entlang der Oligonukleotidkette; wobei das Verfahren umfaßt: Binden verschiedener Marker an verschiedene Komponenten der Mehrkomponentenmischung; Trennen der Komponenten in einzelne Fraktionen; und Detektieren jeder der markierten Komponenten durch Bestrahlen bei der Absorptionswellenlänge der Donoren und Detektieren der Fluoreszenz jedes der Marker.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Trennung durch Elektrophorese erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Donor-Fluorophore die gleichen sind.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Donor Licht im Wellenlängenbereich von 350–800 nm absorbiert und der Akzeptor Licht im Wellenlängenbereich von 450–1000 nm emittiert.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Donor-Akzeptor-Paar Xanthen-Farbstoffe sind.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Xanthen-Farbstoffe Fluoresceinderivate und Rhodaminderivate umfassen.
Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure, bei dem Primer zum Kopieren einer einsträngigen Nukleinsäure und Didesoxynukleotide für die Termination der Kette an einem bestimmten Nukleotid, das aus dem Kopieren resultiert, eingesetzt werden, wobei das Verfahren umfasst: i) Klonen eines zu sequenzierenden Nukleinsäurefragments in einen Vektor, umfassend eine Primer-Bindesequenz 5' zu dem Fragment, welches zu einem Primer komplementär ist; ii) Kopieren des Fragments mit einer DNA-Polyermerase in Gegenwart des Primers, dNTPs und jeweils einer Vielzahl von Didesoxynukleotiden in separaten Reaktionsbehältern, um einsträngige DNA-Sequenzierungsfragmente zu erzeugen; iii) Trennen der resultierenden Mischung aus einsträngigen DNA-Sequenzierungsfragmenten und Bestimmen der Sequenz mittels der auf dem Gel vorhandenen Banden; wobei die DNA-Sequenzierungsfragmente Primer umfassen, welche ein Donor-Akzeptor-Fluoreszenzpaar kovalent an verschiedene Atome einer Grundgerüstkette von Atomen mit effizienter Engergieübertragung von dem Donor auf den Akzeptor gebunden haben, wobei jeder der Primer eine einzelne Molekülspezies ist, und jeder bei im wesentlichen der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer verschiedenen Wellenlänge emittiert, und wobei jeder der Primer im wesentlichen die gleiche Mobilität bei der Trennung besitzt, resultierend aus der Variation des räumlichen Abstandes und der Fluorophore des Donor-Akzeptor-Paars entlang der Nukleinsäurekette.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei eines der Mitglieder des Donor-Akzeptor-Fluoreszenzpaares an das 5'-Ende des Primers gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei vier Primer mit verschiedenen Donor-Akzeptor-Paaren vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Donor-Akzeptor-Fluorescenzpaar durch nicht mehr als 30 Nukleotide getrennt ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei mindestens zwei Donor-Akzeptor-Fluoreszenzpaare Xanthen-Farbstoffe sind.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Xanthen-Farbstoffe Fluoreszeinderivate und Rhodaminderivate umfassen.
Kit zur Verwendung in irgendeinem der Verfahren nach den Ansprüchen 10–26, umfassend eine Kombination aus verschiedenen fluoreszierenden Markern gemäß mindestens einem der Ansprüche 1–9.