PT912766E - Monitorização da hibridização durante a pcr - Google Patents

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PT912766E
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fluorescence
temperature
amplified
amplification
hybridization
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PT97931089T
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Carl T Wittwer
Kirk M Ririe
Randy P Rasmussen
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Univ Utah Res Found
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Description

1
DESCRIÇÃO "MONITORIZAÇÃO DA HIBRIDIZAÇÃO DURANTE A PCR"
ESTADO DOS CONHECIMENTOS ANTERIOR À INVENÇÃO
Esta invenção diz respeito em geral a observar os sinais de fluorescência resultantes da hibridização em conjunto com a reacção da polimerase em cadeia. Mais especificamente, a invenção presente diz respeito a observar-se a hibridização com fluorescência durante e/ou imediatamente depois da PCR e utilizar-se esta informação para a identificação de produtos, a detecção de alteração de sequências, e a quantificação. A reacção da polimerase em cadeia (PCR) é fundamental para a biologia molecular e é a primeira técnica molecular prática para o laboratório clinico. Apesar da sua utilidade e da sua popularidade, a compreensão actual da PCR não é muito pormenorizada. As condições adequadas para se obterem amplificações com sucesso têm que ser encontradas por tentativas e a optimização é empirica. Mesmo os especialistas da técnica precisam de utilizar uma técnica poderosa como esta sem terem uma teoria completa ou capaz de prever, em relação ao processo.
Consegue-se a PCR fazendo variar ciclicamente a temperatura da amostra, provocando a desnaturação do ADN (separado), iniciadores específicos para se ligarem (hibridizarem), e a ocorrência da replicação (extensão). Um 2 ciclo de PCR é em geral levado a cabo em 2 a 8 minutos, necessitando-se de 1 a 4 horas para uma amplificação de 30 ciclos. A resposta da temperatura da amostra na maior parte da instrumentação de PCR é muito lenta em comparação com os períodos de tempo necessários para a desnaturação, a hibridização e a extensão. As alterações físicas (desnaturação e hibridização) e as enzimáticas (extensão) ocorrem muito depressa na PCR. Os períodos de amplificação para a PCR podem ser diminuídos de horas para menos de 15 minutos. Incorpora-se integralmente neste documento por referência o Pedido U.S. com o N°. de Série 08/537.612, entrado a 2 de Outubro de 1995, que descreve um tal sistema rápido de ciclos. As técnicas com ciclos rápidos são tornadas possíveis atenta uma resposta rápida da temperatura e a homogeneidade dessa temperatura que é possível para amostras contidas em contentores com valores muito elevados de área superficial por unidade de volume, tais como os tubos capilares. Para informação mais pormenorizada, veja-se também: C.T. Wittwer, G.B. Reed, e K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification, em K.B. Mullis, F. Ferre, e R. A. Gibbs, The polymerase chain reaction. Birkhauser, Boston. 174-181. (1994). Uma melhor homogeneidade de temperatura permite que as necessidades de tempo e de temperatura para a PCR sejam mais bem definidas e entendidas. Uma melhor homogeneidade da temperatura também aumenta a precisão de qualquer técnica analítica utilizada para monitorizar a PCR durante a amplificação. A fluorimetria é uma técnica sensível e versátil com muitas aplicações em biologia molecular. O brometo de 3 etídio já é utilizado há muitos anos para visualizar a distribuição de tamanhos dos ácidos nucleicos separados por electroforese sobre gel. 0 gel é habitualmente iluminado com luz ultravioleta que o atravessa e observa-se a fluorescência vermelha do ácido nucleico de dupla cadeia. De uma forma especifica, o brometo de etidio é habitualmente utilizado para se analisarem os produtos de PCR depois de uma amplificação se haver completado. Para além disto, o pedido de EPA 0 640.828 AI de Higuchi & Watson, que desta forma se incorpora neste documento por citação, descreve a utilização do brometo de etidio durante a amplificação para monitorizar a quantidade de ADN de dupla cadeia pela medição da fluorescência de cada ciclo. Verificou-se que a fluorescência aumentava e diminuia inversamente com a temperatura, era máxima à temperatura de hibridização/extensão (50°C), e minima à temperatura de desnaturação (94°C). Em cada ciclo anotou-se a fluorescência máxima como medida da quantidade de ADN. O pedido de Higuchi & Watson não ensina utilizar-se a fluorescência para monitorizar os eventos de hibridização, nem sugere que se adquiram valores da fluorescência a diversas temperaturas para se seguir a extensão da hibridização. Para além disso, Higuchi & Watson nem ensinam nem sugerem que se utilize a dependência da hibridização do produto por PCR consoante a temperatura para se identificarem ou quantificarem os produtos de PCR. O pedido de Higuchi & Watson, no entanto, menciona utilizarem-se outros fluoróforos, incluindo sistemas sonda com dois marcadores que geram fluorescência quando são 4 hidrolisados pela actividade de 5'-exonuclease de determinadas polimerases do ADN, tal como se descreveu na Patente US No. 5.210,015 de Gelfand et al. A fluorescência observada proveniente destas sondas depende sobretudo de uma hidrólise da sonda entre os seus dois fluoróforos. Estima-se a quantidade de produto de PCR adquirindo na fluorescência uma vez em cada ciclo. Embora a hibridização destas sondas pareça necessária para que ocorra a hidrólise, o sinal de fluorescência resulta sobretudo da hidrólise das sondas, e não da hibridização, em que uma sonda oligonucleotídica com corantes fluorescentes nas suas extremidades opostas proporciona um sistema de sonda gasta que é útil para se detectar o produto de PCR e a hibridização dos ácidos nucleicos, K.J. Livak et ai., 4th PCR Meth. Appl. 357-362 (1995). Não há nenhuma sugestão de que se siga a dependência da hibridização da sonda em com a temperatura em relação à hibridização com fluorescência para se identificarem as alterações da sequência nos produtos de PCR. A hibridização especifica de um ácido nucleico a uma cadeia complementar para identificação tem sido explorada sob diversos formatos diferentes. Por exemplo, depois de uma digestão com um enzima de restrição, pode fraccionar-se o ADN genómico por tamanhos e hibridizar-se a sondas de ADN por transferência Southern A titulo de outro exemplo, podem detectar-se mutações de uma única base pelas "transferências de pontos" com oligonucleótidos específicos para alelos. A hibridização é habitualmente levada a cabo durante entre minutos e horas a uma única temperatura para 5 se conseguir a discriminação adequada. Em alternativa, pode monitorizar-se dinamicamente a extensão da hibridização enquanto a temperatura vai mudando, utilizando técnicas de fluorescência. Por exemplo, têm sido utilizadas curvas de fluorescência à fusão para monitorizar a hibridização. (L.E. Morrison & L.M. Stols, Sensitive fluorescence-based thermodynamic and kinetic measurements of DNA hybridization in solution, 32 Biochemistry 3095-3104, 1993). As velocidades de varrimento da temperatura são habitualmente de 10°C/hora ou menos, em parte por causa da inércia térmica elevada da cuvette do fluorimetro.
Os métodos actuais de monitorizar a hibridização consomem muito tempo. Se fosse possível seguir a hibridização em segundos em vez de horas, poderia monitorizar-se a hibridização durante a amplificação por PCR, mesmo em PCR de ciclos rápidos. Incluem-se nas muitas utilizações da monitorização da hibridização durante a PCR, tal como serão completamente descritas neste documento, a identificação e a quantificação do produto, a detecção da alteração de sequências, e o controlo automático dos parâmetros dos ciclos de temperatura através da informação obtida da fluorescência
Na técnica anterior, tal como se explicou acima, leva-se a cabo a variação cíclica da temperatura devagar e empiricamente. Quando for necessária uma análise dos produtos de PCR por hibridização, são necessários passos adicionais demorados. Deste modo, seria um grande avanço na técnica proporcionarem-se métodos para monitorizar a 6 hibridização durante a PCR e para analisar a reacção enquanto ela está a decorrer, isto é, durante ou imediatamente a seguir á ciclização de temperatura sem ser necessário manipular a amostra. Ao monitorizar a hibridização durante a PCR, podem seguir-se os princípios fundamentais que permitem que a PCR funcione, e eles podem ser utilizados para analisar e para optimizar a reacção durante a amplificação. 0 EP 0640.828 A descreve um aparelho para monitorizar múltiplas amplificações de ácidos nucleicos em simultâneo, recorrendo a um ciclizador térmico e a um sensor para detectar a luz proveniente de reentrâncias existentes num membro condutor do calor. São descritos métodos e aparelhos para levar a PCR a cabo no EP 0686.699 A. O EP 0643.140 A descreve métodos de utilização de corantes fluorescentes em PCR.
BREVE RESUMO DA INVENÇÃO A invenção é definida pelas reivindicações apensas. É um objecto da invenção proporcionar um sistema para identificar produtos amplificados por PCR pelas suas curvas de fusão com fluorescência. É também um objecto da invenção proporcionar um método para se melhorar a sensibilidade da quantificação por PCR com corantes específicos para duplas cadeias de ADN. 7 É ainda um outro objecto da invenção a determinação da quantidade de um determinado produto amplificado por PCR através de curvas de fusão para corrigir a amplificação não especifica detectada o corante especifico para ADN de dupla cadeia. É ainda um outro objecto da invenção proporcionar um método para a quantificação relativa de diferentes produtos de PCR com corantes específicos para duplas cadeias. É ainda um outro objecto da invenção proporcionar um método de quantificação de produto pela rehibridização, cinética de aparecimento do produto na presença de um corante especifico para ADN de dupla cadeia. É um outro objecto adicional da invenção proporcionar um sistema para a quantificação relativa de diferentes produtos de PCR por curvas de fusão de sondas. É ainda um outro objecto da invenção proporcionar métodos para determinar o número de cópias iniciais do perfil por ajuste de uma curva à representação gráfica da fluorescência em relação ao número de ciclos. É ainda um outro objecto da invenção proporcionar um sistema e um método para levar a cabo a PCR rapidamente e também para monitorizar em continuo a reacção e para ajustar os parâmetros da reacção enquanto a reacção decorre.
Estes e outros objectos e vantagens da invenção tornar-se-ão mais completamente aparentes a partir da descrição e das reivindicações que se seguem, ou podem ser aprendidos praticando a invenção. A invenção presente diminui em especial o tempo total necessário para uma amplificação e análise por PCR em relação ao da técnica anterior enquanto ao mesmo tempo permite a opção de se aumentar de forma significativa a qualidade da reacção através da optimização das condições de amplificação. A invenção presente proporciona métodos para se analisar um ADN alvo, com base na análise da curva de
fusão, tal como se definem nas reivindicações. A instrumentação preferida combina componentes ópticas com estruturas para proporcionar uma ciclização rápida da temperatura de modo a monitorizar em continuo a amplificação do ADN por uma série de técnicas de fluorescência diferentes. Num exemplo ilustrativo, adquire-se em continuo a fluorescência a partir de uma única amostra ou em alternativa a partir de diversas amostras num suporte que roda sendo todas as amostra submetidas em simultâneo a ciclos térmicos rápidos.
Descreve-se neste documento um método segundo o qual a fluorescência durante a amplificação do ADN foi monitorizada através do corante especifico para duplas cadeias SYBR Verde. Os dados de fluorescência adquiridos 9 uma vez por ciclo permitem a quantificação do número de cópias iniciais do perfil.
Para além disto, em contraste com a medição da fluorescência uma vez em cada ciclo, descrevem-se exemplos nos quais se monitoriza a temperatura, o tempo e a fluorescência em continuo ao longo de todo o ciclo e de cada ciclo obtendo-se desta forma uma espiral tridimensional. Pode reduzir-se esta espiral tridimensional a gráficos de temperatura vs. tempo, fluorescência vs. tempo, e fluorescência vs. temperatura. As representações de fluorescência vs. temperatura obtidas a partir da fluorescência de sondas de hibridização podem ser utilizadas para detectar aliterações de sequência no produto. Estas alterações de sequência podem ser naturais, tal como nas mutações ou nos polimorfismos, ou artificiais, tais como num perfil alternativo quimérico para PCR quantitativo.
Nos métodos da invenção, utiliza-se a monitorização da fluorescência para se adquirirem curvas de fusão dos produtos durante a PCR por monitorização da fluorescência com corantes específicos para ADN de dupla cadeia. Representando a fluorescência em função da temperatura à medida que o ciclizador térmico aquece, ao passar a temperatura de dissociação do produto permite obter-se uma curva de fusão do produto de PCR. A forma e a posição desta curva de fusão do ADN é uma função da razão entre GC/AT, do comprimento, e da sequência, e pode ser utilizada para diferenciar produtos de amplificação separados por menos de 10 2°C em termos de temperaturas de fusão. Podem distinguir-se os produtos pretendidos de produtos não pretendidos, incluindo dimeros de iniciadores. Pode utilizar-se uma análise das curvas de fusão para prolongar a gama dinâmica da PCR quantitativa e para diferenciar entre produtos diferentes em amplificação multiplex. Utilizando corantes específicos para duplas cadeias, podem seguir-se a desnaturação de produtos, a rehibridização e a extensão, para cada ciclo. A monitorização continua da fluorescência permite a aquisição de curvas de fusão e de curvas de rehibridização de produtos durante a variação ciclica de temperatura. A invenção inclui um método para de determinar a concentração de um produto amplificada numa mistura seleccionada de reacção de polimerase em cadeia e inclui: (a) determinar-se uma constante de velocidade de segunda ordem para o produto amplificado a uma temperatura e sob condições reaccionais seleccionadas pela monitorização da velocidade de hibridização de uma concentração conhecida do produto amplificado; (b) determinar-se a velocidade de hibridização para uma concentração desconhecida do produto amplificado; e (c) calcular-se a concentração do produto amplificado a partir da velocidade de 11 hibridização e da constante de velocidade de segunda ordem. A velocidade de hibridização é preferivelmente determinada após diversos ciclos de amplificação. Um método ilustrativo para a determinação de constantes de velocidade de segunda ordem inclui os passos de se aumentar a temperatura de uma primeira mistura em reacção de polimerase em cadeia que inclua uma concentração conhecida do produto amplificado e uma quantidade eficaz de um corante fluorescente especifico para duplas cadeias, acima da temperatura de desnaturação do produto amplificado, para se obter um produto desnaturado amplificado; se diminuir-se rapidamente a temperatura da primeira mistura em reacção de polimerase em cadeia que inclui uma quantidade conhecida de produto amplificado desnaturado até a uma temperatura seleccionada inferior à temperatura de desnaturação do produto amplificado enquanto se vai monitorizando continuamente a fluorescência da mistura contendo a primeira reacção de polimerase em cadeia, em função do tempo; se representar a fluorescência em função do tempo para se determinar a fluorescência 12 máxima, a fluorescência minima, o tempo na altura da fluorescência minima, e uma constante de velocidade de segunda ordem para a concentração conhecida de produto amplificado, a partir da equação: na qual F é a fluorescência, Fmax é a fluorescência máxima, Fmin é a fluorescência mínima, k é a constante de velocidade de sequnda ordem, to é o tempo a Fmin, e [DNA] é a concentração conhecida do produto amplificado.
Um aspecto preferido da invenção proporciona um método para se determinar uma concentração de um determinado perfil de ácido nucleico numa reacção de polimerase em cadeia e inclui os passos de: (a) numa mistura reaccional que inclua: (i) quantidades eficazes de um primeiro par de oligonucleótidos iniciadores configurados para amplificar, numa reacção de polimerase em cadeia, um primeiro segmento seleccionado do perfil seleccionado para se obter um primeiro produto amplificado da mistura reaccional, 13 (ii) quantidades eficazes de um segundo par de oligonucleótidos iniciadores configurados para amplificar, numa reacção de polimerase em cadeia, um segundo segmento seleccionado do perfil de referência seleccionado para se obter um segundo produto amplificado da mistura reaccional, (iii) uma quantidade eficaz de um corante fluorescente que se liga a um ácido nucleico, amplificando-se, por reacção de polimerase em cadeia, uma quantidade desconhecida do perfil seleccionado para se obter o primeiro produto amplificado e uma quantidade conhecida do perfil de referência que constitui o segundo produto amplificado da mistura reaccional, (b) se iluminar a mistura reaccional com luz de um comprimento de onda seleccionado para originar fluorescência por parte do corante ligado a ácido nucleico e monitorizar continuamente a fluorescência emitida em função da temperatura para se obter uma curva de fusão dos produtos amplificados na qual o primeiro produto e o segundo produto fundem a temperaturas diferentes, (c) se transformarem as curvas de fusão em picos de fusão e se determinarem quantidades 14 relativas do perfil seleccionado a partir desses picos de fusão; e (d) se calcular a concentração do perfil seleccionado com base na quantidade conhecida do perfil de referência e nas quantidades relativas do perfil seleccionado e do perfil de referência. A invenção proporciona preferivelmente um método de se monitorizar a amplificação de um perfil seleccionado numa reacção de polimerase em cadeia que também inclui perfil de um controlo positivo e inclui os passos de: (a) numa mistura reaccional que inclua: (i) quantidades eficazes de um primeiro par de oligonucleótidos iniciadores configurados para amplificar, numa reacção de polimerase em cadeia, um primeiro segmento seleccionado do perfil seleccionado para se obter um primeiro produto amplificado da mistura reaccional, (ii) quantidades eficazes de um segundo par de oligonucleótidos iniciadores configurados para amplificar, numa reacção de polimerase em cadeia, um segundo segmento seleccionado do perfil de referência seleccionado para se 15 obter um segundo produto amplificado da mistura reaccional, (iii) uma quantidade eficaz de um corante fluorescente que se liga a um ácido nucleico; submetendo-se o perfil seleccionado e o perfil do controlo positivo a condições para se amplificarem, por reacção de polimerase em cadeia, e (b) se iluminar a mistura reaccional com luz de um comprimento de onda seleccionado para originar fluorescência emitida pelo corante ligado a ácido nucleico e monitorizar continuamente a fluorescência emitida em função da temperatura durante um ciclo de amplificação da reacção de polimerase em cadeia para se obter um primeiro pico de fusão do primeiro produto amplificado, e um segundo pico de fusão do segundo produto amplificado, caso o perfil de controlo positivo seja amplificado,
Em que obter-se a segunda curva de fusão indica que a reacção de polimerase em cadeia estava operacional, obter-se a primeira curva de fusão indica que o primeiro segmento seleccionado era amplificável, e a ausência da primeira curva de fusão indica que o primeiro segmento seleccionado não era amplificável. A entidade fluorescente que se liga a ácido nucleico conterá de preferência um corante fluorescente que se ligue a uma dupla cadeia de ácido 16 nucleico, tal como o SYBR™ Verde I. A fluorescência dependente da temperatura pode ser utilizada para identificar os produtos amplificados, preferivelmente por análise das curvas de fusão. Pode determinar-se a razão entre as quantidades de dois ou mais produtos amplificados por análise das curvas de fusão. Por exemplo, as áreas sob as curves de fusão são determinadas por análise de regressão não linear de minimos quadrados da soma de múltiplas gaussianas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS APRESENTAÇÕES DAS FIGURAS
As Figuras 1A&B são gráficos representando um exemplo de uma PCR em equilíbrio (A) e um exemplo de uma PCR cinética (B). A Figura 2 ilustra segmentos úteis de temperatura vs. tempo, para monitorizar a hibridização por fluorescência. A Figura 3 é um gráfico de temperatura vs. que exemplifica ciclos de variação rápida da temperatura para a PCR. A Figura 4 mostra os Resultados de quarto perfis de temperatura/tempo diferentes (A-D) e os produtos de amplificação resultantes ao fim de trinta ciclos (inserção).
As Figuras 5A, B & C ilustram o mecanismo do aparecimento da fluorescência para três métodos diferentes 17 de monitorização da fluorescência na PCR: (A) corante fluorescente em ADN de dupla cadeia, (B) sonda de hidrólise, e (C) e (D) sondas de hibridização. A Figura 6 mostra a estrutura Quimica do éster de N-hidroxissuccinimida monovalente de Cy5™. A Figura 7 s mostra a estrutura Quimica do éster de N-hidroxissuccinimida monovalente de Cy5.5™. A Figura 8 mostra o espectro de emissão da fluoresceina (linha a cheio) e o espectro de excitação de Cy5 (linha a tracejado). A Figura 9 mostra a transferência de energia em ressonância que ocorre entre sondas de hibridização adjacentes marcadas com fluoresceina e com Cy5, em cada ciclo durante a PCR. A Figura 10 mostra o efeito de se variar a razão entre a sonda de Cy5 e a sonda de fluoresceina, sobre o sinal de transferência de energia em ressonância que é gerado durante a PCR. A Figura 11 mostra o efeito de se variar a concentração de sonda, a uma dada razão de concentração de sonda, sobre o sinal de transferência de energia em ressonância que é gerado durante a PCR. 18 A Figura 12 mostra o efeito de se alterar o espaçamento entre os oligonucleótidos marcados sobre o sinal da transferência de energia em ressonância que é gerado durante a PCR. A Figura 13 mostra o decurso ao longo do tempo da hibridização de uma sonda adjacente, por transferência de energia de fluorescência, imediatamente ao fim de 30 ciclos de amplificação com polimerase de ADN Taq (exo“; linha a cheio) e com o fragmento de Stoffel de polimerase de ADN Taq (exo"; linha a ponteado) , da alteração cíclica da temperatura e do tipo de polimerase sobre o desenvolvimento da fluorescência durante a PCR com sondas de hibridização adjacentes: a temperatura é denotada por uma linha a cheio. A Figura 14 é um gráf ico da variação da razão de fluorescência em relação ao número de ciclos de amplificação com polimerase de AND Taq (exo”; linha a cheio), com fragmento de Stoffel de polimerase de ADN Taq (exo”; linha a tracejado), e com polimerase de ADN KlenTaq (exo”; linha a ponteado) : painel de cima - a ciclização ocorre entre 94 °C e 60 °C com manutenção da temperatura de 60°C durante 20 segundos; painel do meio - a ciclização ocorre entre 94 °C e 60 °C mantendo a temperatura a 60 °C durante 120 segundos; painel de baixo - a ciclização ocorre entre 94°C e 60°C com um aumento lento de 60°C até 75°C. A Figura 15 é uma representação da fluorescência vs. número de ciclos para reacções partindo de diferentes números de cópias iniciais do perfil, monitorizada com 19
Sybr™ Verde 1: Ο, (Δ) ; 1, () ; 10, (-) ; 102, (-) ; IO3, ( + ) ; 104, (·); IO5, (0); ΙΟ6, (x); 107, (A); 108, (□) ; 109, ( ). A Figura 16 é uma representação da fluorescência vs. número de ciclos para reacções partindo de diferentes números de cópias iniciais do perfil, monitorizada com uma sonda de hidrólise com dois marcadores: 0, (-); 1, (A); 10, (o); 102, (*)); 103 (·) , 104, (□) ; 105, ( + ) ; 106, () ; 107, (0) ; 108, (x) ; 109, ( ) . A Figura 17 é uma representação da fluorescência vs. número de ciclos para reacções partindo de diferentes números de cópias iniciais do perfil, monitorizada com sondas de hibridização adjacentes: 0, (-) ; 1, (A); 10, (o); 102, (*)); 103, (·); 104, (□) ; 105, ( + ) ; 106, () , 107, (0) ; 108, (x) , 109, ( ) . A Figura 18 é uma representação da fluorescência vs. número de ciclos que distingue entre duas concepções de sondas de hibridização, monitorizada por transferência de energia de ressonância: (0) duas sondas de hibridização marcadas respectivamente com fluoresceina e com Cry5; e ( ) um iniciador marcado com Cy5 e uma sonda marcada com fluoresceina.
As Figuras 19A-C proporcionam uma comparação entre três técnicas de monitorização da fluorescência para a PCR, incluindo o corante especifico para ADN de dupla cadeia SYBR Verde 1 (A), uma sonda de hidrólise duplamente marcada com fluoresceina/rodamina (B), e uma sonda de hibridização 20 marcada com fluoresceína com um iniciador marcado com Cy5 (C); A Figura 19D mostra o coeficiente de variação para as três técnicas de monitorização representadas nas Figuras 19A-C. A Figura 20 mostra uma representação tipica do logaritmo da fluorescência vs. número de ciclos para uma amplificação padrão monitorizada com SYBR Verde I. A Figura 21 mostra uma curva de ajuste exponencial aos ciclos 20-27 dos dados da Figura 20.
Figura 22 mostra uma curva de ajuste exponencial a uma incógnita para se determinar o número inicial de cópias através dos dados da amplificação. A Figura 23 mostra uma representação tipica da fluorescência vs. número de ciclos de cinco padrões, monitorizando cada ciclo com sondas de hibridização adjacentes, em que os números iniciais de cópias são representados como se segue: 103, (·) ; 104, (0); 105, (Á) ; 106, (□); 107, ( ). A Figura 24 mostra o ajuste de uma curva aos dados padrão da Figura 23. A Figura 25 mostra uma representação tipica da fluorescência vs. número de ciclos de cinco padrões, monitorizando cada ciclo com sondas de hidrólise, em que os 21 números iniciais de cópias são representados como se segue: 1.5, (·); 15, (0); 150, (A); 1.500, (□) ; 15.000, ( ) A Figura 26 mostra o ajuste de uma curva aos dados padrão da Figura 25. A Figura 27 mostra uma representação tipica da fluorescência vs. número de ciclos de três amplificações padrão monitorizadas com SYBR Verde I, em que: () ; (·) ; (A) . A Figura 28 mostra ajustes por diferentes curves aos dados padrão da Figura 27.
As Figuras 29A&B mostram representações de (A) tempo vs. fluorescência e de (B) tempo vs. temperatura que demonstram a relação inversa entre a temperatura e a fluorescência. A Figura 30 é um conjunto de gráficos denotando representações bidimensionais das variações de temperatura vs. tempo, fluorescência vs. tempo, e fluorescência vs. temperatura, também apresentadas sob a forma de uma representação tridimensional, para a amplificação de um fragmento com 180 pares de bases, do genoma da hepatite B, na presença de SYBR Verde I. A Figura 31 é uma representação da projecção da variação de fluorescência v. temperatura para a 22 amplificação de um fragmento de 536 pares de bases do gene da beta-globina humana, na presença de SYBR Verde I.
As Figuras 32A&B proporcionam representações de gráficos de (A) uma alteração linear da razão de fluorescência com a temperatura para as sondas de hidrólise, e (B) uma alteração brutal com a temperatura para sondas de hibridização. A Figura 33 mostra a representação da razão de fluorescência vs. temperatura para a amplificação com uma polimerase exo" na presença de sondas de hibridização adj acentes. A Figura 34 representa o gráfico de variação da razão de fluorescência vs. temperatura para a amplificação com uma polimerase exo' na presença de sondas de hibridização adj acentes. A Figura 35 mostra uma representação tridimensional da temperatura, do tempo e da fluorescência durante a amplificação com uma polimerase exo" na presença de sondas de hibridização adjacentes. A Figura 36 mostra uma representação tridimensional da temperatura, do tempo e da fluorescência durante a amplificação com uma polimerase exo” na presença de sondas de hibridização adjacentes. 23 A Figura 37 mostra curvas de fusão para produtos amplificados por PCR, do virus da hepatite B (·; 50 % por CG, 180 pb) ; da beta-globina (A; 53,2 % por CG, 536 pb) ; e do antigénio especifico da próstata (X; 60,3 % por CG, 292 pb) . A Figura 38 mostra curvas de fusão para um produto amplificado por PCR, do virus da hepatite B, a taxas de aquecimento de entre 0,1°C e 5,0°C. A Figura 39 mostra curvas de fusão para um produto amplificado por PCR, do virus da hepatite B, a diversas concentrações de SYBR Verde I.
As Figuras 40A&B mostram (A) curves de fusão e (B) bandas fraccionadas por electroforese, de produtos de um fragmento de beta-globina amplificado com (a) nenhum perfil adicionado, (b) 106 cópias adicionadas, de um perfil, em condições de pouca exigência, e (c) 106 cópias adicionadas, de um perfil, em condições de muita exigência.
As Figuras 41A&B mostram (A) curves de fusão e (B) picos de fusão, do fragmento do virus da hepatite B (HBV), de β-globina, e de uma mistura de ambos.
As Figuras 42A-D mostram (A) uma representação da fluorescência relativa vs. Número de ciclos, para produtos amplificados por PCR, a partir de diversas quantidades do perfil da β-globina, (B) picos de fusão e (C) bandas de 24 electroforese, dos diversos produtos, e (D) a fluorescência corrigida dos dados de (A).
As Figuras 43A&B mostram (A) curvas de fusão e (B) picos de fusão de produtos amplificados por PCR, de uma mistura do gene da fibrose quistica e do oncogene c-erbB-2. A Figura 44 mostra os picos de fusão a diversos números de ciclos para o gene da fibrose quistica (CFTR) e para o c-erbB-2 (neu). A Figura 45 mostra um gráfico dos picos de fusão integrados para os produtos de PCR do CFTR e para os do neu.
As Figuras 46A&B mostram (A) curves de fusão e (B) picos de fusão para produtos de PCR de uma pessoa heterozigótica para a mutação do factor V de Leiden (linha a cheio), homozigótica para a mutação do factor V de Leiden (linha a ponteado), homozigótica de tipo selvagem (linha tracejada), e o controlo sem ADN (linha a negrito). A Figura 47 mostra uma representação da variação da razão de fluorescência vs. temperatura proveniente da monitorização contínua durante o ciclo 40, de produtos da PCR de uma amostra homozigótica para a mutação do factor V de Leiden (linha a cheio), para uma heterozigótica para a mutação do factor V de Leiden (linha a tracejado), e para uma homozigótica de tipo selvagem (linha a ponteado). 25 A Figura 48 mostra os picos de um mutante homozigótico para o gene do tetrahidrofolato a mutação do factor V de Leiden (linha a cheio), para um heterozigótico (linha a tracejado curto), para um homozigótico de tipo selvagem (linha a tracejado longo), e para o controlo sem ADN (linha a ponto traço). A Figura 49 mostra a forma de curves de rehibridização de produtos de β-globina amplificados por PCR, provenientes de diversas quantidades iniciais de perfil. A Figura 50 mostra a determinação de uma constante de velocidade de segunda ordem para determinar a concentração inicial de perfil. A Figura 51 mostra um diagrama de blocos para controlar a ciclização térmica a partir de dados de fluorescência.
As Figuras 52A&B mostram (A) a representação da variação da temperatura vs. tempo adquirida ao fim de 20 ciclos e (B) a representação da variação da fluorescência vs. tempo adquirida ao fim de 25 ciclos na qual a ciclização térmica foi controlada a partir de dados de fluorescência
As Figuras 53-105 são diagramas de programação utilizados nos exemplos. 26
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA
Antes de enumerar e de descrever os métodos presentes para a monitorização da hibridização durante a PCR, deve entender-se que esta invenção não se limita à configurações especificas, nem aos passos processuais, nem aos materiais que se descrevem neste documento, uma vez que as configurações, os passos de processo, e os materiais podem exibir uma certa variação. Também deve ser entendido que a terminologia empregue neste documento é utilizada com o propósito de descrever apenas concretizações especificas e não se pretende que ela seja limitativa uma vez que o âmbito da invenção presente apenas será delimitados pelas reivindicações anexas.
Deve registar-se que, tal como se utilizam nesta especificação e nas reivindicações, as formas singulares "um/uma" e "o/a" incluem referência a formas plurais a não ser quando o contexto ditar claramente algo em contrário.
Na descrição e ao reivindicar a invenção presente, utilizar-se-á a terminologia seguinte, de acordo com as definições que se enumeram adiante.
Tal como se utilizam neste documento, "ácido nucleico", "ADN", e termos semelhantes, também incluem análogos de ácido nucleico, isto é, análogos com um esqueleto que não seja o de um fosfodiéster. Por exemplo, os assim denominados "ácido nucleicos peptidicos" que são conhecidos na técnica e que apresentam ligações peptidicas 27 em vez de ligações por fosfodiéster nos seus esqueletos, são considerados como estando abrangidos pelo âmbito da invenção presente.
Tal como se utiliza neste documento, "monitorização continuo" e os termos semelhantes, referem-se a monitorizar-se diversas vezes ao longo de um ciclo de PCR, preferivelmente durante as transições de temperatura, e mais preferivelmente obtendo-se pelo menos um ponto de dados a cada transição de temperatura.
Tal como se utiliza neste documento, a monitorização "ciclo a ciclo" significa monitorizar-se a reacção de PCR uma vez em cada ciclo, preferivelmente durante a fase de hibridização por PCR
Tal como se utiliza neste documento, "relação de transferência de energia de ressonância de fluorescência" e termos semelhantes referem-se a uma hibridização adjacente com um oligonucleótido marcado com um fluoróforo doador e com outro oligonucleótido marcado com um fluoróforo aceitador, a um ácido nucleico alvo de tal forma que o fluoróforo doador pode transferir energia de ressonância de transferência para o fluoróforo aceitador, de tal forma que o fluoróforo aceitador produz uma emissão de fluorescência que podia ser medida. Caso o fluoróforo doador e o fluoróforo aceitador sejam espaçados de uma distância grande demais, então o fluoróforo doador não pode transferir energia de ressonância ao fluoróforo aceitador de tal modo que o fluoróforo aceitador emita fluorescência 28 mensurável, e portanto o fluoróforo doador e o fluoróforo aceitador não estão envolvidos numa relação de transferência de energia de ressonância. Preferivelmente, quando dois oligonucleótidos marcados são ambos sondas e nenhum deles funciona como iniciador de PCR ("sonda-sonda"), então os fluoróforos doador e aceitador estarão a uma distância de 0-25 nucleótidos, mais preferivelmente de 0-5 nucleótidos, e de preferência de entre 0-2 nucleótidos. Um espaçamento especialmente preferido é de 1 nucleótido. Quando um dos oligonucleótidos marcados também funciona como iniciador de PCR ("sonda-iniciador"), então os fluoróforos doador e aceitador estão preferivelmente a cerca de 0-15 nucleótidos um do outro, e de preferência de cerca de 4-6 nucleótidos.
Tal como se utiliza neste documento, "quantidade eficaz" significa uma quantidade suficiente para se produzir um efeito seleccionado. Por exemplo, uma quantidade eficaz de iniciadores de PCR é uma quantidade suficiente para amplificar um segmento de ácido nucleico por PCR desde que também se proporcione uma polimerase de ADN, um tampão, um perfil, e outras condições, incluindo condições de temperatura, conhecidos na técnica como sendo necessários para se praticar a PCR. A PCR necessita de uma desnaturação repetitiva do perfil e a hibridização do iniciador. Estas transições de hibridização dependem da temperatura. Os ciclos de temperatura da PCR que levam à amplificação desnaturam alternativamente o produto que vai acumulando a uma 29 temperatura elevada e hibridizam iniciadores ao produto a uma temperatura inferior. As temperaturas de transição da desnaturação do produto e da hibridização do iniciador dependem, em primeira-mão, do conteúdo por CG e do comprimento. Caso uma sonda seja concebida para se hibridizar internamente ao produto de PCR, a temperatura de fusão da sonda também depende do conteúdo por CG, do comprimento, e do grau de complementaridade em relação ao alvo. As sondas de fluorescência compatíveis com a PCR podem monitorizar a hibridização durante a amplificação.
De acordo com a invenção presente, que é preferivelmente utilizada em conjunto com uma ciclização rápida (completamente descrita no pedido de patente dos U.S. acima mencionado com o N°. de série 08/658.993, que entrou a 4 de Junho de 1996, cujo título é de "System And Method For Monitoring PCR Processes", e no pedido de patente dos U.S. com o N° 08/537.612, que entrou a 2 de Outubro de 1995, intitulado "Method For Rapid Thermal Cycling of Biological Samples"), é apropriado um exemplo cinético para a PCR. Em vez de se pensar acerca da PCR como sendo três reacções (desnaturação, hibridização, extensão) ocorrendo a três temperaturas diferentes durante três períodos de tempo (Figura IA), um exemplo cinético da PCR é mais útil (Figura 1B). Com um exemplo cinético, a curva de temperatura vs. tempo é constituída por transições entre reacções em sobreposição. A desnaturação e a hibridização são tão rápidas que não é necessário nenhum tempo de manutenção a uma temperatura específica. A extensão ocorre ao longo de uma gama de temperaturas a diversas - 30 - velocidades. Uma análise completa necessitaria do conhecimento de todas as constantes de velocidade relevantes para quaisquer temperaturas. Se as constantes de velocidade de todas as reacções fossem conhecidas, poderia desenvolver-se uma "descrição fisico-quimica da PCR". A determinação destas velocidades necessitaria de controlo da temperatura da amostra e é muito simplificada por monitorização da reacção durante a ciclização da temperatura. A Figura 2 ilustra os segmentos úteis de temperatura vs. tempo para monitorizar a fluorescência da hibridização. Obtêm-se curvas de fusão de produtos durante um aumento lento da temperatura até à desnaturação. Ao diminuir rapidamente a temperatura após a desnaturação, até um valor constante de temperatura, podem seguir-se opcionalmente a hibridização do produto, da sonda, ou do iniciador. Obtêm-se as curvas de fusão das sondas aquecendo lentamente através de temperaturas em trono da Tm da sonda. A cristalização representada na Figura 2 proporciona todas as análises durante a ciclização da temperatura com a exibição do tempo real imediato. As sondas fluorescentes estão incluídas como parte da solução de amplificação para monitorização em continuo da hibridização do iniciador, da sonda, ou do produto, durante a ciclização da temperatura.
As técnicas de fluorescência à hibridização contidas neste documento são baseadas numa ciclização rápida, com as suas vantagens de rapidez e especificidade. 31
Uma amostra de perfil de temperatura durante PCR de ciclo rápido está ilustrada na Figura 3. A desnaturação e a hibridização aparecem como "picos" de temperatura nestas figuras, por oposição com os planalto largos que aparecem na ciclização convencional de temperatura para a PCR, por exemplo na Figura IA. A ciclização rápida da temperatura contrasta com a ciclização convencional de temperatura na Figura 4, na qual s mostra que se podem completar 30 ciclos de amplificação em 15 minutos e que os produtos de PCR resultantes contêm muito menos produtos secundários. Assim, com uma ciclização rápida, os periodos necessários para uma amplificação são cerca de 10 vezes menores, e a especificidade é melhor.
Exemplo 1 (Exemplo de referência) A Figura 4 mostra os resultados de quatro perfis de temperatura/tempo diferentes (A-D) e os produtos de amplificação resultantes que lhes correspondem ao fim de trinta ciclos (A-D) . Os perfis A e B na Figura 4 foram obtidos recorrendo a um dispositivo de aquecimento da técnica anterior e um tubo de microcentrifugação da técnica anterior. Tal como se pode ver na Figura 4, as transições entre as temperaturas são lentas e estão presentes muitas bandas não especificas nos perfis A e B. O perfil B mostra uma melhoria na eliminação de algumas das bandas não especificas (em contraste com o perfil A) ao limitar o tempo durante o qual cada amostra permanece a cada temperatura, o que indica portanto que periodos mais curtos permitem obter resultados mais desejáveis. 32
Obtiveram-se os perfis C e D utilizando um dispositivo rápido para a ciclização da temperatura. Tal como se pode ver na Figura 4, a amplificação é especifica e, ainda que o rendimento seja máximo com periodos de elongação de 60 segundos (C) , ele é também inteiramente adequado recorrendo a periodos de elongação de 10 segundos (D) .
Os periodos e temperaturas óptimos para a amplificação de um fragmento com 536 pb de ADN genómico humano de beta-globina. Os rendimentos da amplificação e a especificidade do produto foram óptimos quando a desnaturação (93°C) e a hibridização (55°C) levaram menos do que 1 segundo. Não existia qualquer vantagem em prolongar os periodos, quer de desnaturação quer de hibridização. O rendimento aumentava para periodos de elongação mais longos a 77 °C, mas não mudava muito para periodos de elongação mais longos que 10-20 segundos. Estes resultados inesperados indicam que os dispositivos previamente utilizados para a amplificação do ADN não utilizavam as condições necessárias para optimizar as necessidades fisicas e enzimáticas da reacção.
Pode obter-se informação suplementar em C. T Wittwer et ai., "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis delta F(508) Locus", 39 Clinicai Chemistry 804 (1993) e em C. T. Wittwer et al., Rapid DNA Amplification, THE POLYMERASE CHAIN REACTION, 174 (1994). A instrumentação utilizada para a aquisição da fluorescência 33 e para a ciclização rápida da temperatura está completamente descrita no pedido de patente U.S: cm o N°. de Série 08/537.612, supra.
Tal como se indicou acima, pode levar-se a cabo rapidamente a reacção de polimerase em cadeia. Para além de facilitar uma transferência rápida de energia, a utilização de tubos capilares opticamente transparentes permite uma monitorização continua da fluorescência na amplificação do ADN, de acordo com a invenção presente.
Podem utilizar-se sondas fluorescentes para detectar e monitorizar a amplificação do ADN. Incluem-se nas sondas úteis corantes específicos para o ADN de dupla cadeia a titulo de exemplos de comparação, e sondas especificas de determinadas sequências. Comparam-se na Figura 5 três técnicas diferentes de fluorescência para seguir a amplificação de ADN. Na Figura 5A, a fluorescência depende da hibridização do produto de PCR tal como se detecta com um corante fluorescente especifico para ADN de dupla cadeia. Na figura 5B, a fluorescência depende da hidrólise de uma sonda de terminação de 5'-exonuclease, que é bem conhecida na técnica tal como se descreveu acima. A Figura 5C apresenta um diagrama do esquema da hibridização com base na transferência de energia de ressonância entre fluoróforos em duas sondas adjacentes. O método da Figura 5A não é especifico da sequência, embora se possa determinar uma especificidade em relação ao produto por curvas de fusão, o que constitui um aspecto da invenção em apreço. Tanto a Figura 5B como a 5C são específica para a 34 sequência. No entanto, o método de hibridização também permite uma análise sem as curvas de fusão, o que constitui outro aspecto da invenção em apreço.
Na monitorização da fluorescência a partir de reacções envolvendo sondas de hidrólise tal como na Figura 5B, e a partir de reacções envolvendo sondas de hibridização tal como na Figura 5C, é vantajoso medir a fluorescência emitida tanto pelo fluoróforo doador como pelo fluoróforo aceitador. Na prática, a maior parte da fluorescência emitida pelas sondas de hidrólise provém do fluoróforo doador, e a maior parte da fluorescência emitida pelas sondas de hibridização provém do fluoróforo aceitador.
Selecção do corante especifico para ADN de dupla cadeia. Os especialistas da técnica conhecerão a utilização do brometo de etidio em técnicas de fluorescência. Quando está presente um corante especifico para uma dupla cadeia durante a amplificação, a fluorescência aumenta em geral à medida que é produzido mais produto com dupla cadeia, veja-se R. Higuchi et al., Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences, 10 Bio/Technology 413-417 (1992) . Também é conhecido na técnica um teste de PCR por fluorescência para o C ARN da hepatite utilizando um intercalador Y0-PR0-1. Veja-se T. Ishiguro et al., Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalator, 229 Anal. Biochem. 207-213 (1995). Prefere-se que seja utilizado o SYBR™ Verde 1, que é bem conhecido na 35 técnica e se encontra disponível junto da Molecular Probes de Eugene, Oregon, a título de corante específico para duplas cadeias de ADN. A estrutura molecular deste corante é um segredo comercial, mas o fabricante recomenda-o a título de ele ser mais sensível como detector de ADN com duplas cadeias em geles. 0 SYBR™ Verde I é sensível ao calor, no entanto, e portanto não é útil para monitorização da fluorescência da PCR de acordo com os métodos convencionais nos quais a temperatura da mistura reaccional é mantida aos valores das temperaturas de fusão durante períodos longos de tempo. Por causa desta sua instabilidade ao calor, foi inesperado verificar que o SYBR™ Verde I pode ser utilizado para monitorizar as reacções por PCR quando não se mantêm as temperaturas de fusão durante períodos longos, isto é quando se leva a cabo a PCR usando ciclos rápidos de acordo com o exemplo cinético que se descreveu acima.
Exemplo 2
Compararam-se diversos corantes específicos para AND de dupla cadeia monitorizando a amplificação de um fragmento com 110 pares de bases proveniente do par de iniciadores PC03/PC04 para o gene da beta-globina humana a partir de 10.000 cópias do perfil. Sintetizaram-se estes iniciadores usando Química de fosforamidite padrão tal como é conhecida na técnica, nomeadamente, utilizando o
Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey). Os iniciadores do gene de beta-globina humana PC03/PC04 (110 pares bases) são descritos em C.T. Wittwer 36 et al., Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989) .
Levou-se a cabo a amplificação do ADN em Tris 50 mM, pH 8,5 (25°C), com MgCl2 3 mM, 500 pg/mL de albumina de soro bovino, 0,5 μΜ em cada iniciador, 0,2 mM em cada trifosfato de desoxinucleótido e contendo 0,2 U de polimerase Taq em 5 pL de amostra a não ser aonde se especificar algo em contra rio nos exemplos seguintes. Utilizou-se o produto de amplificação purificado a titulo de perfil de AND, e ele foi obtido por extracção com fenol/clorofórmio e por precipitação com etanol, veja-se D. M. Wallace, Large- and small-scale phenol extractions and precipitation of nucleic acids, 152 Methods in Enzymology 33-48 (1987), seguindo-se a remoção dos iniciadores por lavagem repetida num micro-concentrador Centricon 30 (Amicon, Danvers, Massachusetts). Determinaram-se as concentrações de perfil pela absorvância a 260 nm. As razões A (260) : A (280) para os perfis eram maiores do que 1,7.
Utilizou-se SYBR™ Verde I (Molecular Probes, Eugene, Oregon) a uma diluição de 1:10.000, o brometo de etidio a 5 pg/mL, e o cor-de-laranja de acridina a 3 pg/mL. Determinaram-se estas concentrações como sendo as concentrações óptimas para maximizar o sinal de fluorescência observado durante a amplificação para cada corante. A excitação foi feita através de um filtro de interferência de 450-490 nm proveniente de uma fonte de arco de xénon, excepto o para o brometo de etidio, para o
TM qual se utilizou uma excitação a 520-550 nm. Para o SYBR Verde I, monitorizou-se a emissão a 520-550 nm. Observou-se 37
a fluorescência do brometo de etídio através de um selector da banda de 580-620 nm. Tomou-se o sinal proveniente do cor-de-laranja de acridina como sendo a razão entre o verde (520-550 nm) e o vermelho (>610 nm) , na radiação de fluorescência. Comparou-se a fluorescência da amostra antes da amplificação com a sua fluorescência após 35 ciclos (máximo de 94°C, 60°C durante 20 segundos), a 60°C. O aumento da fluorescência foi de 5,3 vezes para o caso do SYBR™ Verde I, 1,7 vezes para o brometo de etidio, e 1,2 vezes para o cor-de-laranja de acridina. Em experiências em separado, a fluorescência do SYBR™ Verde I era estável durante mais do que 30 minutos a 70°C. Ela também era excitável de forma conveniente usando luz visivel, e alega-se que é menos mutagénica do que o brometo de etidio. A fluorescência da linha de base provinha em todos os casos sobretudo dos iniciadores. O SYBR™ Verde I é um corante especifico para duplas cadeias preferido para se moitorizar a fluorescência da PCR, sobretudo porque tem uma sensibilidade superior, proveniente de uma discriminação mais pronunciada entre ácido nucleico de cadeia única e de dupla cadeia. Pode utilizar-se o SYBR™ Verde I em qualquer amplificação e é barato. Para além disto, pode obter-se especificidade em relação ao produto por análise das curvas de fusão, tal como se descreverá adiante.
Exemplos de Comparação - Selecção de corantes para transferência de energia de ressonância para sondas de hibridização. 38
Pode ocorrer transferência de energia de ressonância em fluorescência entre 2 fluoróforos quando eles se encontrarem fisicamente próximos e o espectro de emissão de um fluoróforo se sobrepuser ao espectro de excitação do outro. Pode encontrar-se uma introdução à teoria da fluorescência transferência de energia de ressonância em fluorescência em muitos artigos de revisão recentes. A velocidade de transferência de energia de ressonância é: (SJSSEóX^X^Xn^XqnXR^XJD.J, em que: t = tempo de vida do estado excitado do doador na ausência do aceitador; k2 = é um factor de orientação relativa do doador e do aceitador; n = indice de refracção da luz visível no meio interveniente ; qD = eficiência quântica do doador na ausência do aceitador; R = distância entre o doador e o aceitador (em angstrom); 39
Jda = o integral de (FD) (eA) (W4) com respeito a W a todos os comprimentos de onda de sobreposição; com:
Fd = pico normalizado do espectro de fluorescência do doador, eA = coeficiente de absorção molar do aceitador (M“1cm“1) , e W = comprimento de onda (nm).
Para qualquer doador e aceitador bem definidos, uma distância à qual 50 % da transferência de energia de ressonância ocorre pode ser calculada e designa-se como R0. Por causa de a velocidade da transferência de energia de ressonância depender da 6a potência da distância entre o doador e o aceitador, a transferência da energia de ressonância muda rapidamente quando R varia em relação a Ro. A 2Ro, muito pouca transferência da energia de ressonância ocorre, e a 0,5 Ro, a eficiência da transferência é quase completa, a não ser que outras formas de desexcitação predominem (isto é, desactivação por colisão). Têm sido compilados os valores de Ro para muitos pares de doadores e aceitadores, e eles variam entre 22 e 72 angstrom. 40
Em AND em dupla hélice, uma separação de 10 bases corresponde a cerca de 34 angstrom. Marcando as bases do AND com fluoróforos aceitadores e doadores, a transferência da energia de ressonância tem sido utilizada a titulo de uma régua espectroscópica para se observar a geometria da hélice do ADN e para analisar a estrutura de uma junção de ADN de quatro caminhos. A transferência da energia de ressonância também pode ser utilizada para monitorizar a hibridização. Caso um oligonucleótido marcado seja hibridizado a uma cadeia de um perfil marcado, pode levar-se R desde um valor muito maior do que Ro a um valor bem inferior a Ro, aumentando a transferência da enerqia de ressonância de uma forma notável. Em alternativa, 2 sondas marcadas podem ser hibridizadas com um perfil com a mesma cadeia para se obter uma alteração semelhante na transferência de energia da fluorescência. A utilização prática da transferência da energia de ressonância para monitorizar a hibridização depende da sensibilidade que for necessária e de quanto tempo estiver disponível. Utilizando uma técnica de hibridização competitiva com 1 nM de sondas marcadas, o ADN amplificado por PCR foi detectado ao fim de 15 minutos a 40°C. É desejável um aparecimento mais rápido do sinal. Caso apenas estejam disponíveis segundos para a hibridização, os produtos de PCR podiam ser convenientemente quantificados a cada ciclo de amplificação. Ainda para além disto, a extensão da hibridização da sonda podia ser monitorizada durante um ciclo de temperatura. 41 A hibridização é um processo de segunda ordem (veja-se B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hibridization. Em: Nucleic Acid Hibridization: A Practical Approach 47-71, (B. Hames, S. Higgins editores, 1985) . Quando a concentração da sonda é muito superior à concentração do alvo, a velocidade de hibridização é inversamente proporcional à concentração de sonda. Por exemplo, duplicando a concentração de sonda, o tempo de hibridização passa para metade. Seriam necessárias concentrações elevadas de sonda para uma monitorização ciclo a ciclo durante a PCR, porque a hibridização tem que ocorrer antes de o local de hibridização ser atingido pela extensão devida à polimerase.
As concentrações elevadas de sonda necessárias para se monitorizar a hibridização durante a PCR necessitam de um par de transferência da energia de ressonância com caracteristicas únicas. Considere-se a excitação de um par constituído por um doador (D) e um aceitador (A) , utilizando luz. 0 número de fluoróforos de D e de A que são directamente excitados será proporcional ao(s) coeficiente(s) de extinção (e) de cada fluoróforo ao comprimento de onda de excitação, ou: Número de moléculas de D directamente excitadas = (K)(ED) Número de moléculas de A directamente excitadas = (K)(EA)
Em que K é uma constante de proporcionalidade. A desexcitação do doador ocorrerá por fluorescência, por 42 transferência da energia de ressonância, e por outros processos que se podem resumir como de desactivação térmica. Se pF = probabilidade da transferência da energia de ressonância, e pTD = probabilidade da desactivação térmica do doador, então a probabilidade da fluorescência do doador é: 1*Pf‘Ptd e o número de moléculas de doador fluorescentes e: (K)(eD)( l-pK-pTD)
Se a probabilidade de se detectar uma emissão do doador na janela de emissão do doador (por exemplo, uma janela a jusante de um selector de bandas) for pDD, então o número de emissões do doador que se observam é: (PnoMK.)(eD)( 1 -Pf-Ptd)
Agora, o número de fluoróforos aceitadores excitados é a soma do n+úmero daqueles que são directamente excitados com o dos que são excitados por transferência da energia de ressonância: (K)íeA) - <K)(eD)(pK) 43
Se Pia = probabilidade da desactivação térmica do aceitador, então a probabilidade de fluorescência do aceitador é: * 'Pr.··. E o número de moléculas de aceitador fluorescentes é: [(K)(eA) + (K)(eD)(pF)][l-(pTA)]
Caso a probabilidade de se detectar uma emissão na janela de emissão do aceitador seja Paa, então o número de emissões do aceitador que se observam será: (pAA)[(K)(eA) + (K.)(eD)(pF)] [l-(pTA)]
Por último, se a probabilidade de se observar uma emissão do doador na janela de emissão do aceitador for pDA, então o número de emissões observadas (tanto de D como de A) na janela de emissão do aceitador é: (p.vv)[(K)(eA) + (K.)(eu)(pK)] [l-(pTA)] ~ (ΡηΑ)(κ)(«ι>)(1-Ρρ*Ρτυ)
Uma vez que as medições de fluorescência são relativas e K está presente em todos os termos, removendo K e voltando a arranjar a equação, a intensidade observada na janela do doador é proporcional a (excitação do doador) -(transferência de energia): 44
D (®dXPddX 1 *Ptd) (®dXPddXPf) e a intensidade observada na janela do aceitador é proporcional a (excitação do aceitador) + (transferência de energia) + (emissão do doador na janela do aceitador): 2) (®α)(Ραα)(1·Ρτα) + (XdXPddXPfX^Pta) + (ε0)(ΡθΑΧ1-Ρτυ-Ρρ)
As transferências da energia de ressonância aumentam, o sinal do doador diminui e o sinal do aceitador aumenta. A alteração percentual do sinal depende da intensidade da luz de base em cada janela. Com concentrações elevadas de sondas, esta intensidade luminosa de base é elevada. Durante a PCR, quando variam as concentrações de alvo (produto) que é necessário monitorizar, não é possível fazer com que a concentração do doador seja igual à concentração do alvo. 0 excesso de moléculas doadoras contribui para a intensidade luminosa de base tanto na janela do doador como na do aceitador, e mascara parcialmente os fenómenos de transferência de energia. A luz de base na janela do aceitador provém não apenas da emissão do doador na janela do doador, mas também da excitação directa do aceitador. Esta intensidade de base pode ser minimizada utilizando valores pequenos de eA e de
Pda · 45 0 par de transferência de energia fluoresceina/rodamina, habitualmente utilizado para a detecção de ácidos nucleicos, tem uma fluorescência de base elevada. Tanto a excitação directa do aceitador (eA, ca. 10 % de Θμαχ) e a emissão do doador a comprimentos utilizados para detectar a emissão do aceitador (Pda, ca. 20 % do pico da emissão) são elevadas. Pode utilizar-se este par para monitorizar a hibridização se a concentração de sonda for semelhante à concentração do alvo e se se permitir um tempo suficiente para se completar a hibridização. Não se trata de um par de fluoróforos útil para a monitorização continua da PCR porque são necessárias concentrações elevadas de sonda e porque a concentração do perfil durante a PCR se altera continuamente. Não tem sido possivel monitorizar a concentração do produto durante a PCR por hibridização, até hoje, porque não se havia encontrado nenhum par de transferência de energia de ressonância que fosse adequado. Tem havido algumas tentativas para se utilizar a transferência da energia de ressonância para a detecção directa, "não competitiva" da hibridização. Por exemplo, na Patente U.S. N°. 5-565.322 afirma-se "a eficiência da transferência de energia que se observa, em termos de re-emissão pelo aceitador, era relativamente pequena". A concentrações de sonda que sejam suficientemente elevadas para que ocorra uma hibridização significativa durante segundos, a linha de base de fluorescência é elevada demais. 46 A fluoresceína é talvez o fluoróforo mais utilizado de todos. 0 seu coeficiente de extinção e a sua eficiência quântica são elevadas e ela extensivamente utilizada em microscopia, em imunoensaios, e em citometria de fluxo. É o doador num par de transferência da energia de ressonância habitualmente utilizado, com a rodamina. 0 Cy5 é um fluoróforo emitindo no vermelho que é razoavelmente popular, e tem um coeficiente de extinção muito elevado. A estrutura do éster de N-hidroxissuccinimida do Cy5 está ilustrada na Figura 6, e a estrutura do corante relacionado, Cy5.5, está ilustrada na Figura 7. Estes corantes são corantes de indodicarbocianina que são habitualmente utilizados em citometria de fluxo e em sequenciadores automatizados por fluorescência, e estão disponíveis junto da Amersham (Pittsburg, PA). Tanto a fluoresceína como o Cy5 se encontram comercialmente disponíveis sob a forma de amidites para incorporação directa, automatizada, em oligonucleótidos. No entanto, nunca foi descrito o Cy5 como interveniente num par de transferência da energia de ressonância com a fluoresceína. Intuitivamente, a emissão da fluoresceína e a absorção do Cy5 não se sobrepõem o suficiente para que seja considerada uma transferência da energia de ressonância. 0 espectro de emissão da fluoresceína e o espectro de absorção do Cy5 ligados a nucleótidos estão ilustrados na Figura 8. Quando se normalizam as áreas sob as curvas, a sobreposição dos espectros técnicos é de 19 %. A excitação do Cy5.5 encontra-se desviada mais para o vermelho, de cerca de 25 nm, diminuindo ainda mais a sobreposição com a emissão da fluoresceína, para uns 15 %. Trabalhar na zona do 47 vermelho/infravermelho do espectro é vantajoso quando há que escolher componentes ópticas para a instrumentação. Podem utilizar-se diodos de laser para a iluminação, os detectores de fotodiodos têm uma sensibilidade excelente, e a maior parte dos materiais têm uma auto fluorescência minima na região espectral pertinente.
Apesar de uma sobreposição espectral pequena, verificou-se que a fluoresceina, quer com o Cy5 quer com o Cy5.5, constitui um par excelente para monitorizar a transferência da energia de ressonância para a hibridização durante a PCR.
Exemplo 3 (Exemplo de referência)
Amplificou-se um fragmento de beta-globina com 110 pb a partir de 50 ng de ADN genómico humano, seguindo o processo do Exemplo 2, com os iniciadores internos CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-fluoresceina (SEQ ID NO:3) e Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G-p (SEQ ID NO: 18) a 0,2 μΜ cada um deles, e com 0,8 U de polimerase KlenTaql (uma variante deficiente em 5'-exonuclease da polimerase Taq - Patente U.S. N°. 5.436.149), numa mistura reaccional com 10 pL. Hibridizaram-se as sondas internamente aos iniciadores na mesma cadeia e elas ficaram imediatamente adjacentes, sem quaisquer bases entre elas.
Sintetizaram-se as sondas e os iniciadores usando química de fosfoxamidites convencional tal como é conhecida na técnica, utilizando um Pharmacia Biotech Gene Assembler 48
Plus (Piscataway, New Jersey). Sintetizou-se a sonda marcada com 3'-fluoresceina cobre uma cassete marcada com fluoresceina (Glen Research. Sterling. VA) com um tritilo-ON final para adjuvar a purificação por HPLC de fase reversa sobre C18. Recolheu-se o pico que eluia mais tarde e removeu-se o tritilo num PolyPack (Glen Research). Eluíu-se o oligo marcado com fluoresceina com 50 % de acetonitrilo e voltou a purificar-se de novo por HPLC de fase reversa sobre C18. Sintetizou-se a sonda marcada com 5'-Cy5 com um agente químico de fosforilação no terminal 3' (Glen Research) e adicionando um amidite de Cy5 (Pharmacia) ao terminal 5' durante a síntese com tritilo-OFF. Removeram-se as sequências falhadas por HPLC de fase reversa sobre C18. Verificou-se a pureza da sonda por electroforese sobre poliacrilamida bem como através da absorvância do corante e do oligo.
Levou-se a cabo a HPLC numa coluna Hypersil ODS de 4 x 250 mm (Hewlett Packard) com uma fase móvel de trietanolamina 0,1 M:acetato e um gradiente de acetonitrilo de 1 mL/minuto. Monitorizou-se no eluído tanto a absorvância (A26o) como a fluorescência (excitação a 490 nm, emissão a 520 nm para a fluoresceina, e excitação a 650 nm, emissão a 670 nm para o Cy5) . Os nucleótidos tritilados e os marcados com fluoresceina foram eluídos com um gradiente de 10-20 % de acetonitrilo, enquanto os oligonucleótidos marcados com Cy5eluíram ao longo de um gradiente de 10-40 % de acetonitrilo. 49 A ciclização da temperatura ocorreu a 94 °C durante 0 segundos com uma taxa de aproximação programada de 20°C/segundo, 60°C durante 20 segundos com uma taxa de aproximação programada de 20°C/segundo, e 75°C durante 0 segundos com uma taxa de aproximação de l°C/segundo num ciclizador rápido de temperatura de fluorescência capilar. Durante a ciclização da temperatura, adquiriram-se em cada ciclo a fluorescência da fluoresceina e do Cy5 no final do segmento de hibridização/extensão. Observou-se a transferência da energia de ressonância tanto como um decréscimo da fluorescência da fluoresceina, como através de um aumento da fluorescência do Cy5, a partir de por volta do ciclo 26 da amplificação (Figura 9) . Em geral, prefere-se observar a razão entre a fluorescência da Cy5 e a da fluoresceina.
Os resultados inesperadamente bons com o par de fluoresceina/Cy5 podem pelo menos racionalizar-se parcialmente. O integral de sobreposição, JDa, depende não só da sobreposição espectral, mas também do coeficiente de extinção do aceitador (o Cy5 tem um coeficiente de extinção de 250.000 M_1cm_1 a 650 nm) , e da 4a potência do comprimento de onda. Ambos estes factores vão favorecer um valor elevado de JDa para o Cy5, mesmo atenta a pequena sobreposição espectral. Recentemente, mostrou-se que a ficoeritrina e o Cy7 eram em conjunto uma sonda eficaz para a imunofluorescência, apear da pequena sobreposição espectral. Num exemplo ulterior será demonstrada a utilidade das sondas de fluoresceina e de Cy5.5 como sondas de hibridização. A transferência da energia de ressonância 50 de fluorescência pode ser utilizada para monitorizar a hibridizaçao de ácido nucleico mesmo quando os corantes em interacçao apresentam uma pequena sobreposição espectral. A utilização de fluoresceina com Cy5, com Cy5.5 e com outros corantes que emitam no vermelho ou no infravermelho, a titulo de pares de transferência da energia de ressonância para monitorizar a hibridização, não tinha sido anteriormente detectada. A fluoresceina apresenta uma longa 'cauda' de emissão que vai até aos 600 nm, 700 nm e mesmo para além disso, e que pode ser utilizada para excitar estes corantes do vermelho longínquo e do infravermelho. A velocidade de transferência de energia depende do integral de sobreposição, mas também é afectada pela 6a potência da distância entre os fluoróforos. Caso os fluoróforos sejam concebidos de tal modo que os corantes de transferência da energia de ressonância estejam na proximidade, a velocidade de transferência é elevada. Pelo menos com fluoresceína/Cy5, com fluoresceína/Cy5.5 e com pares semelhantes, a transferência da energia de ressonância parece predominar em relação à desactivação colisional e a outras formas de perda de energia quando os fluoróforos estão próximos um do outro, tal como no exemplo acima em que os fluoróforos se ligam a sondas adjacentes sem bases no meio. A utilidade potencial de um par de transferência da energia de ressonância para sonda de hibridização pode ser avaliada observando a alteração na razão de intensidade luminosa nas janelas do doador e do aceitador à transferência da energia de ressonância mínima e máxima. 51
Uma maneira de se obterem as transferências máxima e mínima é ligar ambos os fluoróforos ao mesmo oligonucleótido e medir a razão de fluorescência antes e depois de uma digestão com fosfodiesterase.
Exemplo 4 (Referência)
Sintetizou-se a sonda duplamente marcada com fluoresceína/Cy5 Cy5-CTGCCG-F-TACT GCCCTGTGGG GCAAGGp (SEQ ID NO:19) usando química de fosforamidite normal, em que p é um 3'-fosfato terminal (reagente de fosforilação química, Glen Research) , F é um resíduo de a fluoresceína introduzido sob a forma de um amidite com um esqueleto de 2-aminobutil-l,3-propanodiol para manter a distância natural de 3 átomos de carbono de fosfodiéster entre nucleótidos (ClonTech, Paio Alto, CA) , e adiciona-se Cy5 sob a forma de um amidite (Pharmacia). Obteve-se a razão de fluorescências entre Cy5 e fluoresceína em Tris 0,1 M, a pH 8,0, antes e depois de uma hidrólise à exaustão usando fosfodiesterase (Sigma, St. Louis, MO). Após hidrólise, a alteração da razão de fluorescência foi de 220 vezes. Adquiriu-se uma sonda duplamente marcada com fluoresceína/rodamina, F-ATGCCCT*CCC CCATGCCATC CTGCGTp (SEQ ID NO:20) da Perkin Elmer (Foster City, CA), em que F é fluoresceína e * é uma rodamina ligada a um resíduo T modificado por um braço de ligação aminado. A alteração de razão de fluorescência (da rodamina em relação à da fluoresceína) foi de 22 vezes após a hidrólise com fosfodiesterase. 52 0 sinal potencial obtido do par fluoresceina/Cy5 era portanto 10 vezes superior àquele que se obtinha do par fluoresceina/rodamina.
Exemplo 5 (Referência)
Estudou-se o efeito de sondas de hibridização adjacentes durante a PCR, tanto no aspecto de razão entre ambas, de concentração como de espaçamento, entre a fluoresceina e o Cy5 como marcadores. Utilizou-se a amplificação do local da beta-qlobina e o par de sondas do Exemplo 3 e observou-se a alteração máxima da razão de fluorescência de Cy5 em relação a fluoresceina. O sinal máximo ocorreu quando a razão entre sondas marcadas com Cy5 e fluoresceina era de 2:1 (Figura 10). A esta razão de 2:1, o melhor sinal ocorreu a uma concentração de sonda de fluoresceina de 0,2 μΜ e a uma concentração de sonda marcada com Cy5 de 0,4 μΜ (Figura 11). Também se determinou o número óptimo de bases localizadas entre sondas de hibridização adjacentes durante a PCR. Sintetizaram-se diversas sondas com o mesmo comprimento mas com ligeiras alterações na localização da sua posição de hibridização, de acordo com o Exemplo 3, de modo a que quando se hibridizavam com o alvo de beta-globina, ficassem entre as sondas 0, 1, 2, 3, 4, ou 6 bases. O sinal mais forte durante a PCR ocorreu para uma base situada entre as sondas (Figura 12) . Embora se detectasse alguma transferência da energia de ressonância a um espaçamento de 15, e mesmo de 25 bases, ocorria uma transferência muito melhor a 0-5 bases de distância. 53
Heller et al. (Patente U.S. No. 4.996.143), verificaram que a eficiência da transferência de energia diminuía quando o número de nucleótidos entre fluoróforos diminuía de 4 para 0 unidades. De forma contrastante, e melhor transferência de energia com o par fluoresceína/Cy5 foi registada com entre 0 e 2 nucleótidos interpostos entre elas. Método da sonda de hibridização. Sintetizando 2 sondas que se hibridizam em posições adjacentes de um alvo, e marcando cada uma delas com um fluoróforo de um par de transferência da energia, a transferência da energia de ressonância aumenta quando a hibridização ocorre (Figura 5C) . 0 par fluoresceína/rodamina é o mais habitualmente utilizado para a detecção de ácidos nucleicos.
Descreve-se neste documento um método de hibridização homogéneo específico para uma dada sequência, para se detectarem produtos de PCR. Não é óbvio o modo de conseguir isto. Utilizar sondas de hibridização durante a amplificação contraria a intuição. Não parece que possam ocorrer tanto a hibridização da sonda como a extensão por polimerase. Para e obter uma fluorescência específica de uma sequência, as sonda têm que estar hibridizadas, mas as sondas não podem ser hibridizadas para a polimerase completar a extensão a partir do iniciador e amplificar o ADN de forma exponencial. 54
Uma solução para este problema é utilizar uma única sonda com uma dupla marcação, e utilizar a actividade de 5'-exonuclease das polimerases de ADN estáveis ao calor habituais para clivar a sonda durante a extensão, separando desta forma os 2 fluoróforos. Neste caso, o sinal de fluorescência provém da separação do par de transferência da energia de ressonância aquando da hidrólise (Figura 5B), e não da aproximação dos fluoróforos por hibridização adjacente (Figura 5C) . No entanto, as sondas duplamente marcadas são difíceis de fazer, obrigando à adição manual de pelo menos um fluoróforo ao oligo e necessitando habitualmente de uma purificação muito trabalhosa. As sondas são caras, e serão necessárias duas sondas duplamente marcadas para uma quantificação competitiva de um alvo ou para detectar uma mutação. Uma preocupação adicional é que a fluorescência observada apenas depende da quantidade acumulada de sonda hidrolisada, e não directamente da quantidade de produto presente em qualquer ciclo bem determinado. Isto origina um aumento continuado da fluorescência mesmo depois do 'planalto' da PCR ter sido atingido. Por último e da maior importância, a hidrólise das sondas nem sempre ocorre durante a extensão pela polimerase, um efeito que não se compreende muito bem. Por exemplo, a sonda duplamente marcada com fluoresceína/Cy5 do Exemplo 4 evidenciou muito pouca hidrólise durante a PCR quando estava flanqueada pelos iniciadores. De facto, foram feitas diversas sondas duplamente marcadas com fluoresceína/Cy5, incluindo aquelas que possuíam marcadores terminais, e todas evidenciavam uma hidrólise fraca e uma geração de sinal durante a amplificação. 55 A detecção homogénea de produtos de PCR com sondas de hibridização adjacentes resolveria muitos dos problemas do sistema 5'-exonuclease. A síntese de sondas de hibridização adjacentes é relativamente simples porque estão disponíveis amidites tanto para a fluoresceína como para o Cy5, para incorporação directa durante uma síntese automatizada e porque não é necessário marcar duplamente uma sonda. Uma vez que a sua fluorescência provém da hibridização e não da hidrólise, a dependência da fluorescência da sonda em relação à temperatura poderia ser utilizada para a detecção de mutações e a sua quantificação. No entanto, a utilização de sondas de hibridização adjacentes para uma detecção homogénea dos produtos de PCR nunca foi anteriormente descrita. De forma surpreendente, tanto a hibridização para originar um sinal como a amplificação por extensão por polimerase através da área bloqueada pelas sondas, são dois processos que podem ocorrer.
Exemplo 6 (Referência)
Amplificou-se um fragmento com 110 pb de beta-globina a partir do ADN genómico com sondas adjacentes marcadas com fluoresceína e com Cy5m tal como se descreveu no Exemplo 3. Utilizou-se quer 0,4 U (Taq) , quer 0,8 U (fragmento de Stoffel, Perkin Elmer , ou KlenTaql) de enzima, em misturas reaccionais com 10 pL. A não ser aonde se indicar algo em contrário, a ciclização da temperatura ocorreu a 94 °C durante 0 segundos com uma aproximação 56 programada de 20°C/segundo, a 60°C durante 20 segundos com uma velocidade de aproximação de 20°C/segundo, e a 75°C durante 0 segundos com uma velocidade de aproximação de l°C/segundo A Figura 13 mostra o desenvolvimento de fluorescência por duas sondas de hibridização adjacentes, logo a seguir à amplificação do perfil durante 30 ciclos. Depois de uma curta desnaturação a 94°C, baixou-se a temperatura até 60 °C e a fluorescência aumentou durante cerca de 20 segundos. A grandeza do sinal é maior com uma polimerase deficiente em exonuclease (fragmento de Stoffel) do que com a polimerase Taq nativa que inclui actividade de 5'-exonuclease. Passados cerca de 20 segundos, a fluorescência baixa à medida que a polimerase substitui e/ou hidrolisa as sondas. A diminuição relativa da fluorescência é ligeiramente mais rápida quando a polimerase tem actividade como 5'-exonuclease (ADN polimerase Taq) do que quando não tem esta actividade (fragmento de Stoffel).
Na Figura 14 (painel de cima), a temperatura é variada ciclicamente entre 94°C e 60°C com um período de manutenção de 20 segundos a 60°C. Adquire-se a fluorescência no final dos 20 segundos quando a fluorescência é máxima. Ocorre uma boa amplificação com a Taq (exo") , mas não com o fragmento de Stoffel (exo”) o que se pode verificar tanto pelo desenvolvimento da fluorescência como em geles de agarose (não se mostram os geles). No entanto, quando se aumenta o tempo de permanência a 60°C dos 20 segundos para 120 segundos (Figura 14, painel do meio), a polimerase exo" amplifica 57 bem. A menor velocidade de substituição da sonda com uma polimerase exo" necessita aparentemente de mais tempo a 60 °C para uma amplificação eficiente do que a polimerase exo". O tempo necessário para as polimerases exo pode ser encurtado aumentando lentamente a temperatura de 60 °C até 75°C (Figura 14, painel de baixo). A polimerase estaca quando chega à sonda. No entanto, às temperaturas de fusão da sonda, as sondas fundem para fora do perfile a polimerase continua já livre para completar a polimerização da cadeia. A polimerização é completada desde que a temperatura não seja aumentada depressa demais a seguir à fusão da sonda. A Figura 14 (painel de baixo) mostra uma polimerase exo” (Taq) e duas polimerase exo” (fragmento de Stoffel e KlenTaql).
Quando está presente actividade de exonuclease, parte da sonda é hidrolisada em cada ciclo, tal como o manifesta uma diminuição da fluorescência quando a amplificação é extensiva. Observa-se isto nas Figuras 13 e 14 (painéis do meio e de baixo), mas não ocorre com polimerases exo”. Uma vez que a fluorescência obtida é estável durante uma amplificação extensiva, as polimerases exo” tais como a KlenTaq 1 são preferidas. O sucesso de utilizar sondas de hibridização adjacentes para monitorizar a PCR depende de diversos factores. Maximiza-se a transferência da energia de ressonância quando existam 0 a 2 bases entre sondas de hibridização adjacentes. Para aumentar a fracção de cadeias que hibridizam com as sondas antes de o iniciador se 58 prolongar através da área de hibridização da sonda, as temperaturas de fusão das sondas têm que ser superiores às temperatura de fusão dos iniciadores (preferivelmente > 5°C) .
Fluorescência ciclo a ciclo. Uma análise convencional do ponto final da amplificação do ADN por electroforese sobre gel identifica a dimensão do produto e estima a sua pureza. No entanto, uma vez que a amplificação é inicialmente estocástica, e depois exponencial, e por último estagna, e utilidade da análise do ponto final para quantificação é limitada. Descreve-se neste documento a monitorização ciclo a ciclo para quantificação do número de cópias inicial do perfil com sondas de hibridização. Tal como os especialistas da técnica entenderão, a monitorização uma vez por ciclo de diversas amostras que estão sob amplificação do ADN é uma ferramenta quantitativa poderosa. Consegue-se a monitorização ciclo a ciclo adquirindo a fluorescência durante a extensão ou durante o conjunto das fases de hibridização/extensão de cada ciclo, e relacionando a fluorescência com a concentração de produto.
Exemplo 7
Levou-se a cabo a monitorização da PCR ciclo a ciclo por três técnicas diferentes de fluorescência. Monitorizou-se a fluorescência recorrendo a (i) o corante especifico para duplas cadeias SYBR™ Verde I, (ii) uma diminuição da desactivação da fluoresceina pela rodamina 59 após clivagem por exonuclease de uma sonda hidrolítica duplamente marcada (Exemplo de Comparação) e (iii) a transferência da energia de ressonância da fluoresceina para o Cy5 por sondas de hibridização adjacentes (Exemplo de Comparação). Os reagentes e as condições que se utilizaram na amplificação foram tais como os que se descreveram no Exemplo 2. Os iniciadores humanos de beta-globina RS42/KM29 (536 pares de bases) e PC03/PC04 (110 pares de bases) foram descritos em C.T. Wittwer et al.r Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids Res. 4353-4357 (1989), que ora se incorpora neste documento por citação, a ciclização de temperatura de referência para a beta-globina foi de 95°C de máxima, 61°C de mínima, 15 segundos a 72°C e uma velocidade média entre temperaturas de 5,2°C/segundo. Os iniciadores de beta-actina e a sonda duplamente marcada com fluoresceína/rodamina foram obtidos da Perkin Elmer (no. N808-0230), a ciclização de temperatura para a beta-actina foi de 94 °C de máximo, 60 °C durante 15 segundos, com uma velocidade média entre temperaturas de 6,2°C/segundo As sondas com um único marcador 5'-CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT G.AGG.A-fluoresceína-3' (SEQ ID NO:3) e 5'-Cy5-AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAGp (SEQ ID NO:4) foram sintetizadas tal como no Exemplo 3. Estas sondas adjacentes hibridizam internamente em relação ao par de iniciadores PC03/PC04 de beta-globina e na mesma cadeia de ADN, e estão separadas por um par de bases. A ciclização da temperatura foi feita com um máximo de 94°C, a 59°C durante 20 segundos com uma velocidade média de variação entre temperaturas de 60 7,0°C/segundo. Utilizaram-se as sondas de hibridização (beta-actina e beta-globina) ambas a 0,2 μΜ.
Quando se monitorizam múltiplas amostras uma vez por ciclo com SYBR™ Verde I, pode distinguir-se uma gama de concentrações iniciais do perfil de 107-108 tal como se representa na Figura 15. Esta amplificação provém de um iniciador, fragmento com 536 pares de bases do gene da beta-globina, com SYBR™ Verde I a titulo de corante especifico para a dupla cadeia. Quando se normalizam os dados em termos de percentagem da fluorescência máxima de cada amostra, havia uma separação clara entre o caso de cem cópias iniciais e o de dez cópias. No entanto a diferença entre populações iniciais de uma cópia e dez cópias era marginal, e não havia qualquer diferença entre valores médios de uma e de zero cópias por amostra.
Por outro lado, as sondas específicas para determinadas sequências apresentam uma gama dinâmica semelhante mas parecem discriminar no caso de se ter mesmo só uma cópia inicial do perfil, em relação a controlos negativos. A geração de sinal com sondas de 5'-exonuclease (fragmento de beta-actina, Figura 16) depende não só da síntese do ADN, mas necessita também de hibridização e de hidrólise entre os fluoróforos da sonda duplamente marcada. Esta hidrólise diminui a desactivação, e a razão de emissão de fluorescência da fluoresceína em relação à rodamina aumenta. Enquanto a fluorescência dos corantes de dupla cadeia acaba por permanecer constante com o excesso de ciclização (Figura 15), o sinal das sondas de exonuclease 61 continua a aumentar a cada ciclo (Figura 16) . Embora não haja um valor liquido de produto sintetizado, a hibridização da sonda e a hidrólise continuam a ocorrer. A medida que o número de cópias de perfil diminui até menos de 103, a intensidade do sinal diminui, mas ainda é possível quantificar um número de cópias pequeno porque o sinal do controlo negativo é estável.
Na Figura 17, monitoriza-se a amplificação utilizando sondas de hibridização adjacentes e é expressa sob a forma de uma razão entre a fluorescência de Cy5 e a de fluoresceína. A alteração da razão de fluorescência é em grande medida devida a um aumento da fluorescência de Cy5 por transferência da energia de ressonância (Figura 9). Em contraste com o que sucede nas sondas de hidrólise duplamente marcadas, o sinal de fluorescência das sondas de hibridização diminui a números de ciclos elevados caso a polimerase disponha de uma actividade de exonuclease (veja-se também a Figura 14).
Demonstrar-se-ão agora dois métodos diferentes de detecção da hibridização através da transferência da energia de ressonância durante a PCR, a título de exemplos de comparação. 0 primeiro método utiliza duas sondas de hibridização adjacentes, uma marcada em 3' com fluoresceína e outra marcada em 5' com Cy5. À medida que se acumula produto durante a PCR, as sondas hibridizam na proximidade uma da outra durante o segmento de hibridização de cada ciclo 0 segundo método utiliza um iniciador marcado com Cy5 e uma única sonda de hibridização. 0 iniciador marcado é 62 incorporado no produto de PCR durante a amplificação e só é necessária uma única hibridização.
Exemplo 8 A monitorização ciclo a ciclo da PCR foi levada a cabo por transferência da energia de ressonância entre um iniciador marcado com Cy5 e uma sonda de hibridização marcada com fluoresceina. Comparou-se com a monitorização com sondas de hibridização adjacentes Cy5/fluoresceina. 0 iniciador marcada com Cy5 era CAACTTCATC CACGT*TCACC (SEQ ID N0:21) em que T* é uma base T modificada com o Cy5 ligado, e a sonda correspondente era GTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA-fluoresceina (SEQ ID NO:22). As sondas de
hibridização adjacentes eram CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT CC-fluoresceina (SEQ ID NO:23) e Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAAp (SEQ ID NO:24). Sintetizaram-se as sondas de hibridização seguindo o processo do Exemplo 3 e utilizaram-se a 0,2 μΜ. O iniciador marcado com Cy5 foi sintetizado em dois passos. Utilizou-se uma síntese automatizada para incorporar um modificador de amino C6dT (Glen Research) na posição T pretendida. Em seguida, conjugou-se manualmente o éster monovalente de N-hidroxissuccinimida de Cy5 (Figura 6) ao agente de ligação de amino de acordo com as instruções do fabricante (Amersham) . A purificação por HPLC foi levada a cabo tal como se descreveu no Exemplo 3.
Utilizou-se o iniciador marcado com Cy5 (0,5 μΜ) em vez do PC04, para amplificar o fragmento com 110 pares 63 de bases de beta-globina do ADN genómico humano, tal como no Exemplo 3, excepto que se utilizaram 0,4 U de polimerase Taq para 10 pL de mistura reaccional. As sondas de hibridização adjacentes também monitorizavam a amplificação do mesmo fragmento de beta-globina. A variação ciclica da temperatura foi feita a 94°C durante 0 segundos e a 60°C durante 20 segundos. Monitorizou-se a fluorescência uma vez em cada ciclo no final do segmento de hibridização/extensão. Em ambos os métodos, a transferência de energia de fluorescência para o Cy5 aumenta com a hibridização e é representada sob a forma de uma razão entre a fluorescência do Cy5 e a da fluoresceina (Figura 18) .
Em experiências adicionais, variou-se o número de bases interpostas entre o marcador Cy5e o marcador fluoresceina. Observou-se a melhor transferência da energia de ressonância de fluorescência com cerca de 4-6 bases entre os fluoróforos, embora fosse detectável um sinal até pelo menos 15 bases de separação.
Em contraste com as sondas de hidrólise, o sinal de fluorescência das sondas de hibridização não é cumulativo e desenvolve-se de novo durante cada fase de hibridização. A fluorescência é uma medida directa da concentração do produto porque a hibridização é uma reacção de pseudo primeira ordem. Como a concentração da sonda é muito maior do que a do produto, a fracção de produto hibridizado à sonda é independente da concentração do produto. Estas caracteristicas indicam que utilizar-se uma 64 única sonda de hibridização em conjunto com um iniciador marcado proporcionará um melhor monitor da acumulação de produto, para quantificação. A variância inerente das diferentes técnicas de fluorescência durante a monitorização ciclo a ciclo também é importante para a quantificação.
Exemplo 9
Levou-se a cabo a amplificação do ADN de acordo com o Exemplo 2 para cada um de três métodos diferentes de monitorização da fluorescência. Utilizou-se o SYBR™ Verde I a uma diluição de 1:10.000 na amplificação de um fragmento de 205 pares de bases da beta-globina, a partir dos iniciadores KM29 e PC04. A sonda de hidrólise e as condições são as especificadas no Exemplo 7. A sonda de hibridização, TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG-fluoresceina (SEQ ID NO: 5) foi utilizada com ο KM29 e o iniciador marcado com Cy5, CAACTTCATCCACGTT*CACC (SEQ ID NO:6), em que T* era uma base T marcada com Cy5, foram sintetizadas tal como se descreveu no exemplo 8. Todas as amplificações foram levadas a cabo com dez réplicas a partir de 15.000 cópias do perfil (50 ng de DN genómico humano/10 yL) . Os ciclos de temperatura incluiam uma duração de 31 segundos (máximo de 94°C, 60°C durante 20 segundos, velocidade média entre as temperaturas de 6,2°C/segundo). Adquiriu-se a fluorescência para cada amostra entre os segundos 15 e 20 da fase de hibridização/extensão. 65 A Figura 19 permite comparar os três métodos de monitorização da fluorescência para a PCR. As sondas de fluorescência são o corante de ADN de dupla cadeia SYBR™ Verde I (Figura 19A), um sonda de hidrólise duplamente marcada com fluoresceina/rodamina (Figura 19B), e uma sonda de hibridização marcada com fluoresceina com um iniciador marcado com Cy5 (Figura 19C). Todas as sondas tinham quase a mesma sensibilidade com a fluorescência detectável ocorrendo por volta do ciclo 20. Com amplificação prolongada, o sinal continuava a aumentar quando estava presente a sonda de hidrólise, mantinha-se na presença do SYBR™ Verde 1, e diminuia ligeiramente com a sonda de hibridização. Os valores da precisão obtida em cada um dos três métodos de monitorização da fluorescência está comparada na Figura 19D. Os valores da média + /- desvio padrão estão representados para cada ponto. Representaram-se os dados sob a forma de coeficiente de variação (desvio padrão/média) da razão de fluorescência acima do valor da linha de base (tomada como sendo a média da medida nos ciclos 11-15).
Embora a alteração da razão de fluorescência obtida a partir da sonda de hidrólise seja maior do que a obtida da sonda de hibridização (Figuras 19B e 19C), o coeficiente de variação da fluorescência das sondas de hidrólise é maior (Figura 19D) . Isto é, a fluorescência resultante do método da sonda de hibridização é mais preciso do que o que utiliza uma sonda de hidrólise, mesmo que os valores absolutos dos sinais sejam inferiores. Isto é uma vantagem inesperada das sondas de hibridização em 66 relação às sondas de hidrólise duplamente marcadas mais habituais.
Quantificação do número inicial de cópias do perfil. A PCR quantitativa tem-se tornado uma técnica importante tanto em investigação biomédica como no laboratório clinico. 0 processo de quantificação inclui amiúde experimentar uma série de amostras contendo quantidades conhecidas de cópias iniciais do perfil com a sequência alvo para se obter uma curva de calibração. 0 número de cópias de uma amostra com um número desconhecido é determinado por extrapolação entre os valores conhecidos. Quando se monitoriza uma curva de amplificação completa ciclo a ciclo utilizando fluorescência, radioactividade ou qualquer outro método que permita obter um sinal proporcional à quantidade de ADN presente, estão disponíveis muitos pontos de dados para análise e não é óbvio qual o valor a seleccionar para representar um padrão ou uma incógnita. A técnica anterior implica escolher um "valor limiar" do sinal e depois utilizar o número de ciclos quando o padrão ou a incógnita atravessa esse valor limiar como sendo o valor representativo (veja-se Higuchi & Watson, EPA 0 640.828 Al). Este método utiliza uma quantidade muito pequena dos dados disponíveis numa curva de amplificação. Para além disto, a atribuição do valor limiar é altamente subjectiva e está à mercê de preferências ou inclinações, conscientes ou inconscientes, consegue utilizar-se muito mais dos dados disponíveis de uma forma objectiva numa curva de amplificação. Preferivelmente, podem encontrar-se equações que descrevem 67 a forma das curvas de amplificação modelando factores do processo subjacente.
Podem utilizar-se diversas equações diferentes para se ajustarem aos dados obtidos durante a amplificação. A amplificação do ADN apresenta tipicamente um segmento logarítmico linear e os dados neste segmento podem ser ajustados a uma equação que descreve um aumento exponencial tal como é de esperar de uma amplificação de ADN. A porção da curva de amplificação de AFN cujo logaritmo é linear pode ser descrita pela equação: y = A*[DNA]*(1+E)n em que A é um factor de escala que transforma unidades de sinal em unidades de ADN; [DNA] é a concentração inicial de ADN na mistura reaccional; E é a eficiência da reacção; e n é o número de ciclos.
Um processo de quantificação envolveria: (1) ajustarem-se os padrões conhecidos a esta equação permitindo que variassem os parâmetros A e E, e (2) ajustarem-se as amostras desconhecidas à equação utilizando os valores de A e de E dos padrões e permitindo que [DNA] varie. Esta técnica utiliza muito mais quantidade dos dados e recorre a uma porção dos dados, a porção de variação linear do logaritmo, que tem probabilidade de ser a mais informativa. As Figuras 20, 21 e 22 mostram um exemplo deste método. Amplificaram-se várias diluições de T a 1/10 de um produto de PCR purificado para se obter uma curva 68 padrão e utilizou-se um padrão de ADN genómico humano "desconhecido". A Figura 20 mostra que a região de variação linear do logaritmo é facilmente identificada quer pelo utilizador, quer por um programa. A Figura 21 mostra o ajuste da equação y=A*[DNA]*(1+E)n ao padrão com 104 cópias. A Figura 22 utiliza valores médios obtidos a partir de diversos padrões para A e E e ajusta [DNA] . O valor do ajuste de 16.700 é muito próximo do valor teórico para uma única cópia de gene num ADN genómico (15.000 cópias).
Utilizando todos os dados da curva de amplificação incluir-se-ia o valor do ruido de base e o valor do 'planalto'. Enquanto a um número de cópias elevado o planalto não é informativo, a um número de cópias pequeno ele é amiúde proporcional ao número de cópias inicial. O valor da linha de base poderia ser útil para se determinar o primeiro ponto que evidencia um aumento significativo de sinal. Nesta altura todos os factores envolvidos na forma da curva de amplificação de ADN ainda não são conhecidos, e portanto uma metodologia é descrever a forma da curva. A Figura 23 mostra curvas de amplificação utilizando sondas de hibridização fluorescentes para detectar uma gama de concentrações de perfil de ADN com cinco ordens de grandeza. Cada uma das curvas é ajustada à equação: \-((ast\+ab)-(ds*x+db))/(l+(x/c)Ab)-r(ds*x+db) na qual "as"é a linha de base do coeficiente de variação, "ab" é a intersecção da linha de base com o eixo dos yy, "ds" é a forma da linha de planalto, "db" é a 69 intersecção da linha de planalto com o eixo doa yy, "c" é o número de ciclos aos quais a reacção está a meio caminho entre a linha de base e o planalto (A50) , e "b" é o coeficiente angular da porção da curva de amplificação cujo logaritmo é linear.
Esta equação dá bons ajustes para estes dados de amplificação, e a Figura 24 mostra que o valor de A50 se correlaciona bem com o logaritmo do número inicial de cópias ao longo de sete ordens de grandeza. A Figura 25 mostra a mesma equação ajustando-se aos dados de amplificações que utilizaram uma sonda de hidrólise para detectar o ADN, variando o perfil ao longo de 5 ordens de grandeza. Esta equação dá bons ajustes a estes dados de amplificação, e a Figura 26 mostra que o valor de A50 se correlaciona bem com o logaritmo do número inicial de cópias. Isto demonstra a flexibilidade da metodologia baseada na utilização da curva toda para o ajuste uma vez que a equação tinha dado bons ajustes tanto aos planaltos súbitos das curvas de amplificação com sonda de hibridização como aos 'planaltos' com crescimento uniforme das curvas obtidas a partir de sondas de hidrólise.
Os ajustes de curva total não se limitam a esta equação. A Figura 27 mostra uma amplificação de três concentrações do perfil de ADN ajustados à equação: y=(((as*x+ab)-(clmax*x/dd+x)) / (1 +(x/c)Ab))+(dmax*x/dd-x), 70 que é semelhante às primeiras equações a 6 parâmetros excepto pelo facto de o planalto ser definido por uma curva hiperbólica de preferência a uma linha. A Figura 28 mostra que o valor de A5o para esta equação se correlaciona bem com o número de cópias iniciais.
Se por um lado se utilizou A50 nestes exemplos e se podia escolher o nivel entre o da linha de base e o do planalto se uma técnica bem determinada era mais robusta a valores menores ou a valores maiores no perfil de amplificação. Por exemplo avaliam-se diversas curvas de amplificação padrão quanto à melhor correlação entre o número de cópias iniciais e o A50, o A40, o A30, o A2o, e o Aio. Determina-se o nivel de amplificação que se correlaciona melhor com o número de cópias iniciais. Isto será diferente para sistemas de detecção diferentes. A Figura 19 mostra o coeficiente de variação para diversos sistemas de detecção. O nivel de amplificação que melhor permite prever é provavelmente o nivel que apresenta o menor coeficiente de variação.
Como a reacção de amplificação do ADN é ela própria mais bem compreendida, poderiam utilizar-se outras equações que utilizassem parâmetros que reflectissem processos físicos. O planalto da curva de amplificação de ADN tem causas diferentes em reacções diferentes. Ele deve-se frequentemente à incapacidade dos iniciadores para competirem com a rehibridização do produto nos ciclos tardios. Este efeito podia ser capturado com um parâmetro que é dependente do quadrado da concentração do produto na 71 reacção (uma vez que a velocidade de rehibridização é proporcional ao quadrado da concentração do produto). Outra causa do planalto pode ser o esvaziamento dos iniciadores. As reacções em que o iniciador é limitativo têm uma forma caracteristica, elas têm um planalto muito súbito que pode ser reconhecido. Os ajustes a reacções limitadas pelos iniciadores incluirão parâmetros que definem este topo afiado. As reacções limitadas por enzimas apresentam um planalto muito arredondado que pode ser ajustado com esta forma. Podem encontrar-se factores de peso relativo que reflectem os coeficientes conhecidos de variação para o sistema em apreço de modo a dar mais peso aos pontos de dados que são mais fiáveis. Ajustando um maior número de pontos num perfil de amplificação, podem obter-se estimativas mais precisas e robustas do número de cópias iniciais. Pode utilizar-se um ou mais parâmetros destes ajustamentos para estimar o n+úmero de cópias iniciais de amostras desconhecidas.
Monitorização continua da fluorescência da PCR.
Descrever-se-á agora a caracteristica da monitorização continua, isto é, monitorizar-se muitas vezes durante cada ciclo de PCR. Se por um lado a monitorização da fluorescência durante a PCR pode ser feita uma vez durante cada ciclo a uma temperatura constante, a invenção presente proporciona a vantagem importante de proporcionar uma monitorização contínua ao longo do ciclo de PCR. A temperatura é importante porque a fluorescência muda quando a temperatura muda. As Figuras 29A&B demonstram a relação inversa existente entre a temperatura e a fluorescência 72 para o SYBR™ Verde 1. Este efeito lança alguma confusão durante a variação cíclica da temperatura, o qual se elimina habitualmente levando em consideração a fluorescência uma vez por ciclo a uma temperatura constante da extensão. No entanto, de acordo com a invenção presente, monitorizar a fluorescência durante a variação da temperatura é muito informativo. Antes da invenção presente, a monitorização continua da fluorescência em cada ciclo, por oposição a uma vez por ciclo, nunca foi levada a cabo. De acordo com a invenção presente, o tempo, a temperatura e a fluorescência são adquiridos de segundo a segundo, ou mesmo a cada 200 milissegundos, a cada 100 milissegundos, ou mesmo a uma frequência superior. Estes dados podem revelar pormenores finos da desnaturação do produto, da hibridização e da extensão, e da hibridização e fusão das sondas durante a variação cíclica rápida, não disponíveis nos métodos que se utilizavam anteriormente.
Exemplo 10
Amplificou-se um fragmento de 180 pares de bases do gene do antigénio superficial da hepatite B. a partir de 106 cópias de produto de PCR purificado, utilizando os iniciadores 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:l), e 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO:2),(sequência Genbank HVHEPB). Utilizaram-se as condições de amplificação do Exemplo 2 excepto que a mistura reaccional continha uma diluição a 1:20.000 de SYBR™ Verde I e MgCl2 2 mM. Cada ciclo de temperatura durou 27 segundos (92°C de temperatura máxima, 59°C de mínima, 5 segundos a 70°C, velocidade média 73 entre temperaturas de 3,0°C/segundo). Adquiriram-se valores do tempo, temperatura, e de 2 canais de fluorescência a cada 200 milissegundos representando-se em continuo sob a forma de gráficos de fluorescência vs. número do ciclo e de fluorescência vs. temperatura. A Figura 30 mostra um traçado tridimensional de temperatura, tempo e fluorescência para os ciclos 10 a 34. Esta curva tridimensional também aparece sob a forma de projecções bidimensionais na Figura 30, da temperatura vs. tempo, da fluorescência vs. tempo, e da fluorescência vs. temperatura. Na projecção da temperatura vs. tempo da Figura 30 repete-se cada ciclo e proporciona-se essencialmente a mesma informação que estava incluida na Figura 3. Uma vez que a fluorescência varia inversamente com a temperatura, a projecção de fluorescência vs. tempo ilustrada na Figura 30 nos primeiros ciclos é uma imagem num espelho, à escala, da representação da temperatura v. tempo (veja-se a Figura 2 9) . À medida que se acumula produto, a fluorescência aumenta a todas as temperaturas, com o produto de dupla cadeia. No entanto a temperaturas desnaturantes, a fluorescência regressa à linha de base uma vez que só fica presente ADN de cadeia singela. A projecção da fluorescência vs. temperatura de corantes de dupla cadeia ilustrada na Figura 30 elimina o eixo do tempo e mostra a dependência em relação à temperatura do concentração de duplas cadeias, durante a amplificação do ADN.
Exemplo 11 74
Amplificou-se um fragmento de 536 pares de bases do gene humano de beta-globina a partir de 25 ng de ADN genómico e de uma diluição a 1:10.000 de SYBR™ Verde I num volume de 5 pL. Cada ciclo de temperatura levou 28 segundos (95°C de máximo, 61°C de minimo, 15 segundos a 72°C com um velocidade média entre temperaturas de 5,2°C/segundo). As outras condições são as mesmas que as descritas na Figura 30. Estão representados os ciclos 15-40. A dependência da temperatura evidenciada pela concentração de duplas cadeias durante a PCR é revelada por representações da fluorescência vs. temperatura tais como os representados na Figura 31. Os primeiros ciclos representados parecem idênticos, com um aumento não linear da fluorescência a temperaturas mais baixas. À medida que a amplificação prossegue, os ciclos de temperatura aparecem como ansas crescentes entre as temperaturas de hibridização e de desnaturação. À medida que a amostra é aquecida, a fluorescência é alta até ocorrer a desnaturação, à medida que a amostra arrefece, a fluorescência aumenta, reflectindo a hibridização do produto. Quando a temperatura é constante durante a extensão, um aumento de fluorescência correlaciona-se com uma síntese adicional de ADN.
Tal como será entendido por quem compreenda esta descrição, uma monitorização contínua ao longo de um ciclo pode proporcionar conhecimentos acerca do mecanismo da amplificação do ADN, que não se encontravam anteriormente disponíveis na técnica. Utilizando a invenção presente, tornam-se discerníveis muitos aspectos da amplificação do ADN que até à data se compreendiam muito mal. Por exemplo, 75 a amplificação em ciclos rápidos desnatura o produto em menos de um segundo, enquanto a técnica anterior utiliza entre dez segundos e um minuto para a desnaturação. Observar a fusão do produto por monitorização da fluorescência em tempo real recorrendo a corantes de duplas cadeias de acordo com a invenção presente (Figuras 30 e 31) mostra que a utilização dos períodos de desnaturação mais curtos é eficaz. A título de um outro exemplo, haviam sido propostas muitas causas para o conhecido 'efeito do planalto', mas poucos dados estão disponíveis para distinguir entre as alternativas. Tal como se ilustra na Figura 31, a rehibridização do produto é muito rápida. De facto, durante os ciclos mais tardios de amplificação, uma maioria do produto é rehibridizado em cada ciclo durante o arrefecimento antes de ser atingida a temperatura de hibridização da sonda. Isto ocorre com velocidades de arrefecimento de 5-10°C/segundo em instrumentação de ciclos rápidos. A rehibridização do produto com dispositivos de variação cíclica da temperatura mais lentos, da técnica anterior, será mais extensiva e este efeito indesejável será maior. A rehibridização do produto parece ser uma causa principal, e talvez a única, do 'efeito de planalto'.
Considere-se agora a monitorização contínua de sondas específicas para determinadas sequências. Tal como será entendido ao compreender esta descrição, a monitorização contínua ao longo de um ciclo pode identificar a natureza da fluorescência da sonda.
Exemplo 12 (Exemplo de Comparação) 76
Levou-se a cabo uma monitorização continua da amplificação medindo a cada 200 milissegundos, com uma sonda de hidrólise duplamente marcada (beta-actina) com sondas de hibridização adjacentes (beta-globina) tal como no Exemplo 7. Na Figura 32A, mostram-se os ciclos 20-45 de uma reacção monitorizada com a sonda de hidrólise. As sondas de hidrólise apresentam uma alteração linear da razão de fluorescência com a temperatura e um aumento paralelo da fluorescência à medida que mais sonda é hidrolisada. Em contraste, a razão de fluorescência das sondas de hibridização varia radicalmente com a temperatura (Figura 32B, ciclos 20-40). Durante a fase de hibridização/extensão, as sondas hibridizam-se com produto de cadeia singela e a razão de fluorescência (Cy5/fluoresceina) aumenta. Durante o aquecimento até temperaturas de desnaturação do produto, as sondas dissociam-se a cerca de 70°C, levando os teores da razão de fluorescência de novo aos valores da linha de base.
Exemplo 13
Amplificou-se um fragmento de beta-globina com 110 pares de bases proveniente de 50 ng de AND genómico, num volume de 10 pL. Seguiram-se as condições de amplificação e utilizaram-se as sondas de hibridização adjacentes do Exemplo 3, utilizando-se quer 0,4 U de polimerase Taq, quer 0,8 U de KlenTaql. Monitorizou-se a fluorescência a cada 100 milissegundos. Os gráficos de fluorescência vs. temperatura quando se utilizou KlenTaql 77 (Figura 33) e Taq (Figura 34) demonstram que as sondas fundem a cerca de 70°C. O sinal máximo usando a KlenTaql é maior do que o obtido com a Taq, por causa da actividade de exonuclease desta última. Nos ciclos mais tardios quando se utiliza a Taq, a fluorescência de cada ciclo começa a diminuir porque diminui a concentração de sonda intacta. Na Figura 35 (KlenTaql) e na Figura 36 (Taq) apresentam-se os gráficos tridimensionais de variação da temperatura, tempo, e fluorescência. A combinação da invenção presente de (1) monitorização continua da fluorescência dentro de cada ciclo de temperaturas, e (2) análise da dependência da hibridização em relação à temperatura e ao tempo, proporciona vantagens que não se podem obter de outro modo. A Figura 2 mostra que a informação que anteriormente não se podia obter pode agora se extraida por monitorização continua ao longo do ciclo. A monitorização continua da fluorescência durante a fase do ciclo em que ocorre a fusão do produto proporciona informação útil sobre a pureza, a identidade, e a quantidade do ADN presente durante esse ciclo.
Quando se aquece uma reacção de PCR da temperatura de extensão à temperatura de desnaturação, todo o ADN da amostra funde para dar cadeias únicas. Pode observar-se esta desnaturação através de uma diminuição da fluorescência do SYBR™ Verde I. Para produtos de PCR pequenos, a transição de fusão ocorre numa gama estreita de temperaturas e refere-se o ponto médio dessa gama de fusão 78 como sendo o Tm. Do mesmo modo que a separação por dimensões na electroforese sobre gel, a análise de picos de fusão mede uma caracteristica fundamental do ADN e pode ser utilizada para identificar produtos amplificados. Ao contrário do que acontece na electroforese sobre gel, a análise de curves de fusão pode distinguir entre produtos com o mesmo comprimento mas com razões GC/AT diferentes. Para além disto, dois produtos com igual comprimento e conteúdo em GC, mas que difiram na localização dos GC (por exemplo, num produto em que estão homogeneamente distribuídos vs. outro em que existe uma grande concentração de GC numa extremidade), obtêm-se curvas de fusão muito diferentes. A temperatura à qual fundem os produtos de PCR varia numa gama alargada. Utilizando formulas empíricas conhecidas na técnica, o efeito do conteúdo em GC sobre a temperatura de fusão (Tm) do ADN permite prever que uma dupla cadeia com 0 % de GC fundiria a menos 41°C do que uma dupla cadeia com 100 % de GC. A conteúdo em GC constante, um dímero de iniciador com 40 pares de bases fundiria a menos 12°C do que um produto contendo 1.000 pb. Portanto, a gama de Tm para os produtos potenciais da PCR é de pelo menos 50°C. Esta gama larga permite a diferenciação da maior parte dos produtos de PCR pelas suas curvas de fusão. Portanto, a combinação da monitorização da fluorescência da PCR com a análise das curvas de fusão proporciona simultaneamente a amplificação, a detecção, e a diferenciação dos produtos de PCR. 79
Exemplo 14
Adquiriram-se curvas de fusão de AND para três produtos de PCR diferentes num fluorimetro de micro volume integrado com um ciclizador térmico para 24 amostras contendo óptica para a fluorescência do SYBR™ Verde I (LightCycler LC24, Idaho Technology, Idaho Falis, Idaho). Os iniciadores para a amplificação do gene do antigénio da superfície da hepatite B com 180 pares de bases eram 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:l) e 5'-AGAAGATGAG
GCATAGCAGC-3'(SEQ ID NO:2). Os iniciadores para amplificação do antigénio especifico da próstata com 292 pares de bases (PSA) eram 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3'-(SEQ ID NO: 7) e 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3' (SEQ ID NO:8). A amplificação do gene humano da beta-globina com 536 pares de bases foi feita tal como no Exemplo 7. Levou-se a cabo a PCR tal como se descreveu no Exemplo 2. Os produtos de amplificação foram purificados por extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, seguindo-se uma lavagem repetida através de um micro concentrador
Centricon 30 (disponível junto da Amicon, de Danvers, Massachusetts). Determinaram-se as concentrações dos perfis pela absorvância a 260 nm e todos tinham valores da razão A(260)/A(280) maiores do que 1,7.
Pipetaram-se cinquenta ng de AND purificado em Tris 50 mM, a pH 8,5, 2 mM em MgCl2, e 250 yg/mL de albumina de soro de bovino e um volume de 5 yL para o reservatório aberto em plástico de tubos de reacção compósitos em vidro/plástico, centrifugou-se a baixa 80 velocidade para se colocar a amostra no topo do capilar em vidro, e selou-se por dentro com uma rolha em plástico. Adquiriram-se os dados de fluorescência para as curvas de fusão integrando o sinal ao longo de 0,25 - 2,0 segundos durante uma transição linear de temperatura até 95°C a 0,Ι-ΙΟ, 0°C/segundo . Adquiriu-se a fluorescência em continuo e representou-se sob a forma de um gráfico de fluorescência vs. temperatura no ambiente de trabalho do LabView (National Instrument, Austin, TX) . A Figura 37 mostra as curvas de fusão dos três produtos purificados da PCR.
Os valores de Tm dos três produtos da Figura 37 estão todos numa gama de 6 graus e duas das curvas diferem apenas de curves 2 graus. Esta separação pequena é mais do que suficiente para permitir uma diferenciação fácil dos produtos. A importância da percentagem de GC face ao comprimento, sobre Tm, é ilustrada pelo facto de o produto do ADN com 292 pb da PSA fundir a uma temperatura superior à do fragmento mais comprido com 536 pb da beta-globina. As curvas de fusão são amiúde obtidas a velocidades de 0,5°C/minuto para assegurar equilíbrio. Para além disto, à medida que a velocidade de aquecimento diminui, a curva de fusão desloca-se para temperaturas inferiores e torna-se mais pontiaguda (Figura 38, fragmento da hepatite B). Note-se no entanto que as curvas de fusão da Figura 37 foram obtidas durante uma velocidade de aquecimento de 0,2°C/segundo (12°C/minuto) e que conseguem diferenciar produtos cuja diferença de valores de Tm é de 2°C ou menos. 81 0 valor aparente de Tm dos produtos de PCR TAMBÉM depende da concentração de corante específico para duplas cadeias de ADN (Figura 39, fragmento da hepatite B). Concentrações mais elevadas do corante aumentam a estabilidade da dupla cadeia de ADN e a Tm observada.
Para a monitorização das curvas de fusão com SYBR™ Verde I, as condições preferidas de diluição a 1:7.000-1:30.000 de SYBR Verde I, com velocidades de aquecimento de 0,1-0,5°C/segundo. Estas condições permitem uma diferenciação fácil de produtos que apenas diferem em Tm de 2°C.
Um controlo mais preciso da temperatura e programas para a análise de picos de fusão diminuirão a diferença de Tm detectável até uma fracção de um grau. Isto permitirá uma diferenciação da maior parte dos produtos de PCR. Nem todos os produtos podem ser diferenciados através da Tm no entanto, do mesmo modo que é possível tresler resultados de electroforese por causa da co-migração de dois ou mais produtos, é possível que algumas das fusões de produto para as quais a gama que é expectável não inclui o produto pretendido. No entanto, caso nenhum ADN funda na gama do produto que era expectável, pode afirmar-se conclusivamente que nenhum produto expectável está presente.
Outra forma de diferenciação de produtos disponível a partir da análise das curvas de fusão são os perfis distintivos de fusão em determinados domínios em 82 produtos de PCR mais longos. Enquanto os produtos mais curtos (<300 pb) fundem em geral numa só transição, os produtos mais longos podem ter domínios internos de fusão que dão curvas de fusão com uma forma complexa e distintiva. Estas curvas de fusão complexas podem ser utilizadas a título de impressões digitais para a identificação dos produtos. A análise das curvas de fusão pode ser utilizada para diferenciar os produtos pretendidos de produtos não específicos tais como os dímeros dos iniciadores. Os dímeros dos iniciadores fundem todo ao longo de uma larga gama de temperaturas baixas; muito diferentes das curvas de fusão afiadas dos produtos específicos da amplificação por PCR. Produtos heterogéneos grandes que resultaram de se levarem a cabo muitos ciclos com baixa selectividade de hibridização apresentam curvas de fusão mais largas, quando são comparadas com o produto de PCR puro.
Exemplo 15 A amplificação do fragmento do gene da beta-globina com 536 pb foi levada a cabo tal como no Exemplo 7, com uma diluição de 1:30.000 de SYBR™ Verde I excepto que se variaram as condições. Na reacção A (Figura 40), não se adicionou nenhum perfil, e a reacção foi feita com ciclos com 94~°C durante 0 segundos, 60°C durante 0 segundos, e 72°C durante 10 segundos, em 30 ciclos, para se produzirem pequenos produtos não específicos de amplificação. Na B, a amplificação de 106 cópias iniciais de perfil purificado 83 sob condições de pequena selectividade (94°C durante 0 segundos, 50°C durante 0 segundos, e 72°C durante 10 segundos) ao longo de 55 ciclos, permitiu obter produtos de amplificação com uma larga gama de dimensões na electroforese sobre gel e fundindo ao longo de uma gama larga de temperaturas. No C, variou-se ciclicamente a temperatura de 106 cópias iniciais de perfil purificado, a 94°C durante 0 segundos, a 60°C durante 0 segundos, e a 72°C durante 10 segundos, em 30 ciclos, e obtém-se uma única banda forte fundindo por uma transição súbita. A velocidade de transição de temperaturas foi de 0,2 °C/segundo. Um produto digerido por Hind III do ADN de fago λ (M) é utilizado a titulo de marcador. A Figura 40 mostra como as curvas de fusão reflectem de forma precisa a especificidade de uma reacção de PCR. A curva de fusão a alta temperatura e com um máximo bem definido C corresponde a uma única banda num gel. A curva de fusão de baixa temperatura e muito arredondada A provém de uma análise de um controlo sem perfil que apenas mostra dimeros de iniciadores. Uma amplificação excessiva do produto em C dá a curva de fusão intermediária B, ainda claramente diferenciável da do produto especifico.
As curvas de fusão que constam, por exemplo, da Figura 37, podem ser mais bem quantificadas tomando em primeiro lugar a derivada da fluorescência (F) com respeito à temperatura (T) . Esta derivada está representada como -dF/dT vs. Te converte as curvas de fusão em picos de fusão. 84
Exemplo 16
Os fragmentos de gene da hepatite B purificada e da beta-globina do Exemplo 14 foram individualmente fundidos e em conjunto com uma velocidade de transição de temperatura de 0,2°C/segundo, e nas outras condições tal como se especificaram no Exemplo 14 (Figura 41). A determinação que é de certa forma subjectiva de Tm partir das curvas de fusão (em cima) é facilmente estimada a olho a partir dos picos de fusão (em baixo). A área sob os picos de fusão também pode ser quantificada por integração da área sob as curva. A linha de base da fluorescência foi em primeiro lugar subtraída da curva de -dF/dT vs. T assumindo que a intensidade da linha de base varia tal como a área sob a curva. Depois fez-se um ajuste aos picos por regressão não linear de mínimos quadrados com gaussianas, utilizando a média, o desvio padrão, e a altura do pico como parâmetros de aj uste. Tomou-se a área sob cada gaussiana como área do pico . Todos os cálculos foram levados a cabo no ambiente de programação Lab View (National Instruments, Austin, TX). A Figura 41 mostra um exemplo desta conversão das curvas de fusão em picos de fusão. Inclui-se o código para estes cálculos a título de apêndice A da descrição. A capacidade de distinguir produtos específicos dos dímeros de iniciadores e outros sinais adventícios da reacção melhora a utilização de corantes específicos para duplas cadeias de ADN na quantificação de números de cópias 85 iniciais pequenos. Números relativamente elevados de cópias iniciais de perfis foram já quantificados utilizando brometo de etidio (Higuchi & Watson, supra). No entanto, a números de cópias iniciais pequenos, a linha de base da amplificação dos dimeros de iniciadores e outros sinais de amplificação estranhos ao processo interferem com o sinal especifico da amplificação. Com a capacidade da invenção presente de diferenciar produtos específicos em relação a produtos de amplificação não específicos, os corante específicos para duplas cadeias de ADN podem ser utilizados para quantificar números iniciais pequenos de cópias do perfil. Isto é vantajoso por causa da simplicidade de utilização destes corantes. Podem utilizar-se os corantes específicos para ADN de dupla cadeia em qualquer amplificação e não são necessários oligonucleótidos marcados fluorescentemente feitos de propósito. A quantificação de números de cópias muito pequenos com corantes específicos para o ADN de dupla cadeia necessita de uma muito boa especificidade de amplificação ou, tal como é proporcionado pela invenção presente, um meio de diferenciar o produto pretendido de uma amplificação não específica.
Exemplo 17 A metodologia desenvolvida para a determinação da pureza do produto foi utilizada para melhorar a PCR quantitativa baseada na monitorização uma vez ao dia da fluorescência de corante específico para ADN de dupla cadeia. Adquiriu-se a fluorescência uma vez em cada ciclo 86 depois da extensão do produto por polimerase numa série de reacções em que se variou a concentração inicial de perfil de beta-globina purificado (veja-se a Figura 42A). 0 perfil de beta-globina e as condições de amplificação eram tais como foram apresentadas no Exemplo 7. 0 aumento da fluorescência cujo logaritmo é linear, acima da linha de base, começou a um ciclo cujo número dependia da concentração inicial de perfil. As representações de cinco reacções em que se variou de 106 a 102 cópias por reacção, estavam separados por cerca de quatro ciclos. A amostra com uma média de 102 cópias por reacção evidenciou uma diminuição na eficiência da reacção, e as reacções com um número inicial de cópias inferior a 100 deram perfis de fluorescência que eram menos úteis. Os perfis de fluorescência para as reacções que continham 10 e 1 (em média) cópias aumentam em ordem inversa, e o controlo negativo evidenciou uma amplificação a partir de cerca de 30 ciclos. Isto é devido à amplificação dos dimeros dos iniciadores e a outros produtos não específicos de amplificação que não se podem distinguir do produto pretendido por monitorização da fluorescência uma vez por ciclo com corantes específicos para ADN de dupla cadeia.
Adquiriram-se os picos de fusão para cada amostra (Figura 42B) e verificou-se que eles se correlacionavam bem com os resultados da electroforese (Figura 42C). As reacções que continham em média zero e uma cópias iniciais do perfil não originaram banda de electroforese discernivel na localização esperada para os 536 pares de bases. As reacções que continham 10 e 100 cópias iniciais do perfil 87 evidenciaram bandas fracas na electroforese. Isto concordava bem com a análise dos picos de fusão, não se tendo observado nenhuma fusão de ADN na gama do produto pretendido (90 - 92°C) para as reacções que continham zero e uma cópias iniciais, e apenas se observando pequenos picos nesta gama de temperaturas quando se partiu de 10 e de 100 cópias. As bandas electroforéticas fortes para as reacções que continham 103 - 106 cópias iniciais correlacionam-se bem com picos de fusão grandes na gama esperada de 90 - 92°C. A razão entre o produto pretendido e o produto total, determinada por integração do pico de fusão, variava entre 0,28 para 105 cópias e 0,0002 para zero cópias iniciais do perfil. Cada valor de fluorescência na Figura 41A foi multiplicado pela razão adequada para se obter a representação gráfica corrigida (designada "fluorescência corrigida" na 42D). Este procedimento alarga a gama dinâmica eficaz da quantificação até entre 10 e 1 cópias iniciais do perfil.
Os pontos de fusão podem ser utilizados para distinguir produtos específicos de produtos não específicos (Figura 40) e eles podem também ser utilizados para distinguir entre dois produtos de PCR purificados misturados um com o outro (Figura 41) , portanto também poderiam ser úteis para distinguir entre dois produtos específicos amplificados em conjunto num único tubo reaccional. As curvas de fusão obtidas por monitorização 88 continua de reacções de PCR de acordo com a invenção presente são úteis em PCR de misturas.
Exemplo 18
Neste exemplo, dois fragmentos de gene foram amplificados em simultâneo a partir de ADN genómico, e monitorizou-se com a fluorescência do SYBR” Verde I. Durante cada ciclo de amplificação, diferentes produtos de amplificação desnaturam a temperaturas de fusão que dependem do comprimento do produto, da razão de GC, e de outros factores bem conhecidos na técnica. A temperatura à qual cada produto funde pode ser monitorizada com o corante especifico para duplas cadeias, SYBR™ Verde I. Amplificou-se um fragmento com 81 pares de bases do gene da fibrose quistica utilizando os iniciadores descritos neste documento pelas SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:15, em conjunto com um fragmento com 98 pares de bases do oncogene c-erbB-2 (HER2/neu), utilizando os iniciadores descritos neste documento como SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17.
As reacções de amplificação continham Tris-HCl 50 mM, a pH 8,3, MgCl2 3 mM, 500 yg/mL de albumina de soro de bovino, dNTP 200 μΜ de cada, e eram 0,5 μΜ nos iniciadores da fibrose quistica, 0,3 μΜ nos iniciadores de HER2/neu, continham também uma diluição a 1:30.000 de SYBRT™ Verde I, 1 U de polimerase de ADN AmpliTaq Gold (Perkin Elmer, Foster City, CA), e 50 ng de ADN genómico humano num volume de 10 yL. 89
Depois da activação da polimerase a 95°C durante 30 minutos, as amostras forma submetidas a 35 ciclos térmicos iniciando-se a 94 °C durante 0 segundos (coeficiente angular = 20) , 55° C durante 0 segundos (coeficiente angular = 20) , e 70 °C durante 10 segundos (coeficiente angular = 20). Arrefeceram-se as amostras a 70°C, e adquiriu-se a fluorescência continuamente durante um aumento de temperatura a 0,2°C/segundo até 94°C. As curvas de fusão (Figura 43) mostravam claramente dois produtos diferentes fundindo a 78°C (CFTR) e a 88°C (neu). Os dois produtos diferem em Tm de cerca de 10°C e são facilmente distinguíveis. A amplificação de vários ácidos nucleicos é útil nos casos em que seja necessário um controlo interno durante a amplificação. Por exemplo, muitas translocações são detectáveis por PCR colocando iniciadores de cada lado do ponto de quebra. Se não ocorrer nenhuma amplificação, a translocação não está presente enquanto o ADN estiver intacto e não estiver presente nenhum inibidor. Estas possibilidades podem ser excluídas amplificando um local de controlo positivo presente na mesma mistura reaccional. Este tipo de amplificações de controlo é levada a cabo no melhor cenário usando controlos internos com amplificação e detecção em simultâneo.
Exemplo 19
Neste exemplo, seguiu-se o procedimento do Exemplo 18 excepto que após a activação da polimerase a 90 95°C durante 30 minutos, variou-se ciclicamente a temperatura das amostras a 94°C durante 0 segundos (coeficiente angular = 20), a 55°C durante 20 segundos (coeficiente angular = 20), e a 70°C durante 10 segundos (coeficiente angular = 20) ao longo de 20 ciclos, seguindo-se a 94°C durante 0 segundos (coeficiente angular = 1), 55°C durante 0 segundos (coeficiente angular = 20), e 70°C durante 20 segundos (coeficiente angular = 20) ao longo de 15 ciclos. Para os ciclos 26-31, adquiriu-se continuamente a fluorescência durante cada transição a l°C/segundo entre 70°C e 94°C. Transformaram-se as curvas de fusão em picos de fusão e representaram-se (Figura 44).
Note-se que a eficiência da amplificação do fragmento CFTR parece superior à do fragmento neu. A eficiência da amplificação pode ser rigorosamente determinada integrando os dados dos picos de fusão tal como no Exemplo 16.
Este tipo de dados quantitativos em relação a um controlo tem muitas aplicações. Por exemplo, determinados oncogenes, tais como o HER2/neu, são amplificados in vivo em muitos tumores. Isto é, os genes são replicados no ADN genómico, às vezes com muitas réplicas. Amiúde, o comportamento clínico do tumor depende do grau de replicação do oncogene. A amplificação do oncogene e de um perfil de controlo permite uma avaliação quantitativa do número relativo de cópias. A titulo de mais um exemplo, a quantificação da carga virai em pacientes infectados com o HIV ou com a hepatite C é importante em prognóstico e em 91 terapia. Utilizando um perfil de controlo e monitorizando a eficiência da amplificação tanto do perfil de controlo como do natural durante a amplificação, consegue-se uma determinação quantitativa precisa do número de cópias iniciais do perfil. A caracteristica da invenção presente de utilizar as curvas para uma quantificação relativa será agora explicada. De acordo com a invenção presente, uma utilização adicional para as curvas de fusão é a PCR quantitativa. A Figura 42 mostrava que existia uma correlação entre a área sob o pico de fusão e a quantidade de produto especifico. A quantificação relativa de dois produtos da PCR seria possível caso os dois produtos fossem amplificados com eficiência semelhante (ou se as diferentes eficiências fossem conhecidas e fossem compensadas). A quantificação relativa de dois produtos pela integração das áreas dos picos de fusão (veja-se o Exemplo 16) é um aspecto da invenção em apreço.
Exemplo 20
Amplificaram-se e purificaram-se tal como no Exemplo 2 os fragmentos dos genes da fibrose quística e HER-2-neu, e ajustou-se a sua concentração a 175 pg/mL. Misturaram-se as amostras em diversas proporções (total 8 pL) adicionando-se cada uma a tampão (1 pL) e a SYBR™ Verde I (1 pL). As concentrações finais eram de 50 mM de Tris, a pH 8,3, MgCl2 3 mM, com 250 pg/mL albumina de soro de bovino, com uma diluição a 1:30.000 de SYBR™ Verde I. 92
Adquiriram-se as curvas de fusão a 0,2°C/segundo, subtraiu-se a fluorescência da linha de base e integraram-se os picos tal como se descreveu no Exemplo 16. Representam-se os resultados na Figura 45. Foi obtida uma correlação excelente entre os valores relativos das áreas sob os picos de fusão e as quantidades relativas dos dois produtos. A quantificação dos valores relativos dos dois produtos de PCR é importante em muitas aplicações quantitativas de PCR. A amplificação simultânea de dois ou mais produtos seguida pela integração das áreas sob os picos de fusão respectivos será extremamente útil neste dominio, quantifica-se amiúde o mARN em relação à quantidade de mARN de um gene de referência ('•housekeeping gene') .
Outra utilização importante desta quantificação relativa é em PCR competitiva quantitativa. Tipicamente sintetiza-se um competidor que tenha os mesmos locais de iniciação, mas que difira em comprimento da sequência alvo original. Numa amostra desconhecida colocam-se quantidades conhecidas do competidor leva-se a cabo a avaliação das quantidades relativas. Podem fazer-se competidores que difiram da sequência alvo pelo seu valor de Tm e não pelo seu comprimento. Podem avaliar-se quantitativamente as quantidades relativas dos produtos comparando as áreas sob os picos de fusão respectivos. Como se sabe a quantidade de um dos produtos, pode obter-se a quantidade do alvo original. Utilizar o método dos picos de fusão é significativamente mais fácil do que utilizar os métodos 93 actuais que envolvem fazer PCR em múltiplos tubos para cada amostra desconhecida e amiúde retirar tubos a diversos números de ciclo durante a reacção, para se localizar a parte da reacção em que a variação do loqaritmo é linear. Têm em seguida que se determinar as quantidades relativas dos dois produtos. Isto é habitualmente feito marcando um dos dNTP com um radioisótopo e depois quantificando a quantidade de marcador que foi incorporada em cada banda, após uma separação por electroforese sobre gel de agarose. Em comparação, a invenção em apreço torna possivel monitorizar-se a reacção continuamente de modo a que seja facilmente identificada a parte da amplificação em que a variação do logaritmo da concentração é linear. Podem determinar-se rapidamente as quantidades relativas por integração dos picos de fusão. Um processo que levava um dia inteiro pode agora ser levado a cabo em menos do que uma hora.
Da descrição anterior, entender-se-á que a monitorização da fluorescência durante a amplificação do ADN é uma técnica analítica extremamente poderosa. Quando se pretendam a detecção e a quantificação de uma sequência especifica, pode utilizar-se sondas da transferência da energia de ressonância em vez de corantes específicos para duplas cadeias de ADN. A Tm das sondas de hibridização altera-se de cerca de 4-8°C quando está presente uma única base que não corresponda. Quando se coloca uma sonda de hibridização no local de uma mutação, é possível detectar mutações de uma única base através de uma alteração da temperatura de fusão da sonda. 94
Exemplo 21 (Exemplo de Comparação) A mutação do factor V de Leiden é uma alteração de uma única base (de G para A) na qual um resíduo de glutamina dá lugar a um resíduo de arginina, no resíduo de aminoácido 506 (R506Q). Para mais informação, consulte-se R. M. Bertina et al., Mutation in Blood Coagulation Factor V Associated with Resistance to Activated Protein C, 369 Nature 64-67 (1994), e J. Voorberg et al., Association of Idiopathic Venous Thromboembolism with a Single Point-Mutation at Arg506 of Factor V, 343 Lancet 1535-36 (1994), ambos os quais se incorporam por citação. Tal como se utiliza neste documento, "local da mutação do factor V de Leiden" significa a posição do nucleótido no gene do factor V, na qual uma base guanina presente no tipo selvagem é substituída por uma base de adenina no factor V do mutante de Leiden. A SEQ ID NO:9 mostra uma porção do gene do tipo selvagem do factor V, e a SEQ ID NO 10 mostra a porção correspondente do gene do factor V de Leiden, incluindo em cada um destes casos o nucleótido relevante na posição 31. A sequência nucleotídica completa do gene do factor V está descrita em R. J. Jenny et al., Complete DNA and Derived Amino Acid Sequence of Human Factor V, 84 Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 4846-50 (1987), que se incorpora neste documento por citação, e também se pode obter esta sequência no local HUMF10 do Genbank. A troca de aminoácidos na proteína mutante do factor V torna este factor de coagulação resistente à degradação, e aumenta a tendência para coagular e à trombose. Sendo a causa mais habitual da 95 trombofilia de origem genética, esta mutação é o alvo de um teste laboratorial habitual feito em laboratórios clinicos de genética molecular. 0 método padrão de análise para a mutação do factor V de Leiden é amplificar o segmento do gene por PCR, digerir os produtos amplificados resultantes com uma endonuclease de restrição que corte a sequência de tipo selvagem mas não a do mutante, e distinguir entre os produtos desta digestão provenientes do tipo selvagem e os produtos não digeridos provenientes do mutante por electroforese sobre gel. R.M. Bertina et al., supra. Este é um método bem conhecido na técnica para a análise de mutações bem definidas. Um tal teste leva cerca de 4 horas, incluindo a amplificação por PCR (2 horas), a digestão enzimática (1 hora), e a electroforese (1 hora). Incluem-se nos passos após a amplificação abrir-se o tubo contendo a amostra, adicionar-se o enzima, e transferir-se a amostra digerida para o aparelho de electroforese. 0 processamento após a amplificação aumenta o risco de contaminação do produto final, e a manipulação tem que ser feita com cuidado para impedir erros na identificação das amostras. Um método que em simultâneo amplificasse e analisasse as mutações pontuais eliminaria estas preocupações.
Um método capaz para conseguir uma amplificação completa e de uma análise da mutação de Leiden do factor V em meia hora num só instrumento inclui amplificar-se de forma assimétrica uma porção da amostra de ADN genómico humano contendo o local da mutação, seguida pela obtenção e 96 análise de uma curva de fusão para o ADN amplificado. Prepara-se o ADN genómico seguindo métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo tal como em J. Sambrook et al.r Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, 1989), que se incorpora neste documento por citação. Preferivelmente, obtém-se a curva de fusão pela metodologia de transferência da energia de ressonância que se descreveu acima, com uma sonda de hibridização fluorogénica. Um ensaio deste tipo discrimina facilmente entre o tipo selvagem homozigótico, o mutante homozigótico, e genótipos heterozigóticos. Numa concretização preferida, a sonda oligonucleotidica é marcada em 3' com fluoresceina e concebida de modo a hibridizar no ADN amplificado perto de um iniciador marcado com Cy5 para a transferência da energia de ressonância. Pode aplicar-se este método a qualquer mutação definida. A sonda oligonucleotidica terá de preferência um comprimento de cerca de 15-40 residuos de nucleótido. A sonda poderia conceptualmente conter apenas 10 residuos de nucleótido, mas no entanto, incluem-se nas desvantagens possíveis deste tipo de oligonucleótidos curtos uma pequena especificidade, uma temperatura de fusão baixa, e ruido de base mais elevado. Também se poderiam utilizar oligonucleótidos com mais do que 40 residuos, mas eles seriam desnecessariamente grandes demais. Portanto, os limites das dimensões das sondas oligonucleotidicas são apenas os que são impostos pela sua funcionalidade. A sonda oligonucleotidica deve incluir a mutação, mas a mutação não deve de preferência corresponder quer ao residuo de 97 nucleótido terminal 5', quer ao 3', da sonda. Uma vez que a invenção presente se baseia em curves de fusão, e que se sabe que a ausência de emparelhamento de bases nos terminais tem um efeito menor sobre as propriedades de fusão do que em locais internos, a sonda deverá ser concebida de tal forma que a mutação ocorra numa posição interna.
Os oligonucleótidos iniciadores para a amplificação do local de mutação que se seleccionou terão preferivelmente um comprimento de cerca de 15 a 30 residuos. Poderiam utilizar-se iniciadores mais curtos do que a gama preferida mas eles podem não ser tão específicos como se pretenderia. De forma semelhante, poderiam utilizar-se iniciadores mais compridos do que os da gama preferida, mas isso seria desnecessariamente caro. Desta forma, os limites das dimensões dos iniciadores de PCR são apenas os impostos pela funcionalidade. A distância entre o par em transferência da energia de ressonância também é importante para o funcionamento adequado da invenção. A distância óptima entre o par em transferência da energia de ressonância é de cerca de nucleótidos. É preferida uma distância de cerca de 2 a 8 nucleótidos, embora seja funcional uma distância de até cerca de 10-15 nucleótidos. Posicionando-se o par em transferência da energia de ressonância em nucleótidos adjacentes não é necessariamente uma boa ideia porque a distância entre o par em transferência da energia de 98 ressonância depende das posições relativas na hélice do ADN.
Neste exemplo, levou-se a cabo a amplificação por PCR em misturas reaccionais de 10 pL que incluiam Tris 50 mM, a pH 8,3, MgCl2 3 mM, 500 pg/mL de albumina de soro de bovino, concentrações 200 pM de cada dNTP, 0,5 pM em iniciador marcado com Cy5 (SEQ ID NO:11), 0,2 pM em iniciador oposto não marcado (SEQ ID NO: 12), 0,1 pM em sonda marcada com fluoresceina (SEQ ID NO:13), com 0,4 U de polimerase Taq, e com cinquenta ng de ADN genómico humano. Testaram-se quatro amostras diferentes de ADN: AND genómico humano de um individuo que era homozigótico no que respeita à mutação de Leiden do factor V: ADN genómico humano de um individuo heterozigótico; ADN genómico humano de um individuo homozigótico em relação ao tipo selvagem do alelo do factor V; e um controlo negativo isento de ADN. A orientação do iniciador marcado com Cy5, da sonda marcada com fluoresceina, bem como o local da mutação (identificado por um asterisco) estão ilustrados em seguida:
Cy5 i 5'-TAATCTGTAAGAGCAGATCC-3' (SEQ ID NO: 11) *
TAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGGTATT (SEQIDNO:9) ATTAG AC ATTCTCGT CT AGGG ACCTGTCCGCTCCTT AT GTCC ATAA 3'-CTGTCCGCTCCTTATGTCCATAA-5'(SEQ ID NO: 13)
Fluoresceina A sequência do iniciador oposto não marcado era TGTTATCACACTGGTGCTAA (SEQ ID NO:12) e o produto amplificado tinha um comprimento de 186 pares de bases. Obteve-se o 99 iniciador marcado com Cy5 tal como no Exemplo 8. As condições de variação ciclica eram 94°C durante 0 segundos (coeficiente angular=20), 50°C durante 10 segundos (coeficiente angular =20), e 72°C durante 0 segundos (coeficiente angular =1) para 50 ciclos, seguindo-se um arrefecimento até 45°C e uma monitorização da fluorescência em continuo ao longo de um coeficiente angular de 0,2°C/segundo até 94°C, para a curva de fusão. Obtiveram-se as curvas de fusão com a melhor qualidade no final da amplificação usando uma velocidade lenta de transição de temperatura (0,2°C/segundo - Figura 4 6), embora a monitorização durante cada ciclo a l°C/segundo entre 50°C e 94°C também proporcionasse uma identificação clara do genótipo (Figura 47) . O mais fácil é visualizar as curves de fusão representando as primeiras derivadas da fluorescência em valores negativos, em função da temperatura, vs. temperatura (-dF/dT vs. T). Uma tal representação permite uma identificação visual fácil de todos os genótipos possíveis a partir dos dados de fluorescência tal como foram obtidos.
Quanto mais perto o marcador Cy5 estiver do terminal 3' do iniciador, maior é o sinal da transferência da energia de ressonância. No entanto, o terminal 3' tem que ter um grupo 3'-hidroxilo livre para a extensão pela polimerase, e colocar o Cy5 perto demais do terminal 3' (quer na base 3', quer na penúltima) pode inibir a ligação da polimerase, e a extensão. A sonda com 3'-fluoresceína deve hibridizar tão perto quanto possível do iniciador (pode tolerar-se uma sobreposição mínima de 1-3 bases) e o 100 local da mutação deve estar perto do meio da sonda. Uma separação por 5 bases entre os fluoróforos hibridizados e uma mutação na base 8 numa sonda de 23 bases deu uma alteração da curva de fusão de 8°C entre a sequência do mutante e a de tipo selvagem (Figura 46).
Também se pode levar a cabo a detecção de mutações por fusão de uma sonda utilizando 2 sondas marcadas em vez de uma sonda marcada e um iniciador marcado. Nesta concretização, marca-se uma sonda em 5' com Cy5 e marca-se a outra sonda em 3' com fluoresceina. Uma vez que ambas estas sondas fluorescentes podem ser directamente sintetizadas dos amidites, não é necessário nenhum passo manual de síntese como o é no sistema utilizando sonda/iniciador. Deverá conceber-se a sonda marcada com fluoresceina de tal modo que o local da mutação esteja perto do centro da sonda marcada com fluoresceina. O comprimento da sonda marcada com Cy5 deverá ser concebido de tal modo que ela funda a uma temperatura superior (>5°C) do que a sonda marcada com fluoresceina e que inclui o local de mutação. Atento o facto que a linha de base da fluoresceina dá mais problemas do a do Cy5, a concentração da sonda marcada com Cy5 deverá preferivelmente ser 2-5 vezes a da sonda marcada com fluoresceina. As duas sondas devem hibridizar com a mesma cadeia de ADN genómico, e o par de transferência da energia de ressonância deve estar separado por cerca de 0 a 5 resíduos de nucleótidos. Em alternativa, a sonda que inclui a zona da mutação pode ser marcada com Cy5 e a outra sonda ser marcada com fluoresceina. 101
Entender-se-á que as sondas e os iniciadores especificos descritos neste documento para detecção da mutação no factor V de Leiden foram-no a titulo meramente ilustrativo, e que uma pessoa com conhecimentos médios da técnica seria capaz de conceber outras sondas e outros iniciadores para a detecção de mutações sem ter que trabalho experimental em demasia seguindo os princípios e as linhas gerais que se incluíram neste documento. Deverá também entender-se que embora a invenção esteja descrita com respeito à detecção de mutantes provenientes da alteração de um única base num ADN genómico, se podem empregar os mesmos princípios à detecção de mutantes de cADN. A preparação do cADN obriga a passos processuais adicionais e também necessita de mais tempo, tal como se sabe bem na técnica, e portanto prefere-se utilizar ADN genómico atentas as vantagens da velocidade ser maior e do custo ser inferior. Para além disto, pode utilizar-se a mesma técnica para detector inserções e delecções concebendo a sonda de hibridização de tal modo que a sua temperatura de fusão se altere quando estiver presente a mutação ou polimorfismo. Pode utilizar-se a invenção para detectar qualquer mutação conhecida relativamente à qual seja possível conceber uma sonda que apresente temperaturas de fusão diferentes quando está hibridizada com um mutante e quando está hibridizada com o tipo selvagem.
Embora se hajam utilizado a fluoresceína e o Cy5 como marcadores da transferência da energia de ressonância 102 no exemplo acima, podem ser utilizados com a fluoresceina outros aceitadores, tais como o Cy5.5.
Exemplo 22 (Exemplo de Comparação)
Amplificou-se o local do factor V do Exemplo 21 tal como anteriormente excepto que se marcou o iniciador com Cy5.5 em vez de Cy5. Observou-se a emissão do Cy5.5 através de um dicróico que apenas permitia a passagem da radiação de 683 nm e de um filtro de interferência permitindo a passagem da banda de 683-703 nm. A razão entre o Cy5.5 e a fluoresceina aumentava para além da linha de base por volta do ciclo 30 e duplicava aproximadamente por volta do ciclo 50 de uma amplificação assimétrica. Quando havia sido amplificada com AND de tipo selvagem, o valor de Tm da sonda era de 65-66°C, tal como resultava da avaliação dos picos de fusão.
Outro exemplo para se detectarem mutações de uma só base será descrito em seguida.
Exemplo 23 (Exemplo de Comparação)
Existe uma mutação pontual habitual no gene (C677T) da metilenotetrahidrofolato reductase (MTHFR), que transforma um residuo de alanina num residuo de valina, obtendo-se um enzima instável ao calor. Esta mutação pode diminuir a actividade do MTHFR e levar a teores elevados de homocisteina no plasma o que tem sido considerado como um factor de risco independente para doença vascular precoce e 103 para a trombose, como se sabe bem na técnica. Um dos iniciadores foi marcado com Cy5 (TGAAGGAGAAGGTGTCT*GCGGGA) (SEQ ID NO:25) na qual T* representa um residuo de T modificado ligado a Cy5 (veja-se no Exemplo 9 a sua síntese e purificação). A sequência da sonda era fluoresceína-CCTCGGCTAAATAGTAGTGCGTCGA (SEQ ID NO:26) e o outro iniciador era AGGACGGTGCGGTGAGAGTG (SEQ ID NO:27). Amplificou-se um fragmento com 198 pares de bases do gene MTHFR a partir de 50 ng de ADN genómico humano em Tris 50 mM, a pH 8,3, que era 2 mM em MgCl2, com 500 pg/mL de albumina de soro de bovino, 0,2 mM em cada dNTP, 0,5 μΜ no iniciador marcado com Cy5, 0,1 μΜ no iniciador oposto, 0,1 μΜ na sonda marcada com fluoresceína, e contendo 0,4 U de polimerase Taq de ADN em 10 pL. Cada ciclo durou 30 segundos consistindo numa desnaturação a 94°C seguida por um passo de 20 segundos de hibridização/extensão combinadas a 60°C. A velocidade de transição de temperaturas entre os passos foi de 20°C/segundo. Ao fim de 60 ciclos, adquiriu-se uma curva de fusão como se segue: aquecimento de 50->65°C a 0,5°C/segundo, de 65->75°C a 0,1°C/segundo, e de 75->94°C a 0,5°C/segundo. Depois de se subtrair a linha de base e de se transformar em picos de fusão, distinguiam-se facilmente todos os genótipos possíveis (Figura 48). 0 poder de discriminação das sondas de hibridização também é utilizado com grande vantagem numa PCR com diversos substratos, ou competitiva. Por exemplo, concebe-se um perfil artificial com uma única mudança de base no interior e concebe-se uma sonda de hibridização de modo a abarcar a alteração de base, tal como nos Exemplos 104 21 e 23. Determina-se a amplificação relativa do competidor e a do perfil natural adquirindo e integrando os picos de fusão tal como no Exemplo 16. Em alternativa, quando se utilizarem múltiplas sondas que sequencialmente indicam por fusão diferentes alvos a temperaturas diferentes, consegue-se uma quantificação relativa usando a mesma análise. Em geral, utilizando sondas de hibridização, pode tornar-se específica com sondas qualquer das técnicas quantitativas descritas acima para corantes específicos de AND de dupla cadeia.
Concentração Absoluta do Produto Através da Cinética de Rehibridização do Produto. Também se levam a cabo vantajosamente determinações da concentração do produto utilizando a invenção presente. A monitorização em continuo da formação de AND de dupla cadeia permite quantificar o AND em qualquer dos ciclos da amplificação por cinética de rehibridização. Diminui-se rapidamente a temperatura da amostra a parti da temperatura de desnaturação e mantém-se constante a uma temperatura inferior que seja ainda suficientemente elevada para impedir a hibridização do iniciador (Figura 2) . A velocidade da rehibridização do produto segue uma cinética de segunda ordem (veja-se B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, Em: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach 47-71 (B. Hames & S. Higgins, editores, (1985), que ora se incorpora neste documento por citação). Para qualquer produto bem determinado da PCR e para qualquer temperatura, pode medir-se uma constante de velocidade de segunda ordem. Uma vez 105 conhecida a constante de velocidade, pode determinar-se qualquer concentração de ADN desconhecida a partir dos dados experimentais de rehibridização. O arrefecimento nunca é instantâneo, e portanto ocorre alguma rehibridizaçao antes de se atingir uma temperatura constante. Um arrefecimento rápido maximizará a quantidade de dados que se tornam disponíveis para determinação da constante de velocidade e da concentração em ADN. A técnica necessita de produto de PCR puro, mas isso pode ser assegurado pelas curvas de fusão que também se obtêm durante a ciclização da temperatura utilizando a invenção presente.
Este método de quantificação pela invenção presente é vantajosamente independente de qualquer variação entre as intensidades luminosas de diversas amostras.
Exemplo 24
Amplificou-se um fragmento com 536 pares de bases do gene da beta-globina a partir de ADN genómico humano (Exemplo 7) e purificou-se (veja-se o Exemplo 2). Misturaram-se quantidades diferentes do AND purificado com uma diluição a 1:30.000 de SYBR™ Verde I em 5 pL de Tris 50 mM, pH 8,3 que era 3mM em MgCl2. Desnaturaram-se as amostras a 94°C e depois arrefeceram-se rapidamente até 85°C. Monitorizou-se a fluorescência a 520-550 nm a 85°C ao longo do tempo. Quando se testaram concentrações diferentes de ADN, a forma da curva de rehibridização era característica da concentração em ADN (Veja-se a Figura 106 49). Para qualquer produto de PCR e temperatura, a constante de velocidade de segunda ordem que pode ser determinada. A Figura 50 mostra a determinação de uma constante de velocidade de rehibridização de segunda ordem para 100 ng do fragmento com 536 pares de bases em 5 pL a 85°C. Ajustou-se a estes dados, por regressão não linear de minimos quadrados usando como parâmetros flutuantes Fmax, Fmln, to e k, a curva de uma equação de velocidade de segunda ordem que se mostra na Figura 50. Os programas de análise para o ajuste deste tipo de curvas, são bem conhecidos na técnica (por exemplo, o programa de ajuste de curvas definidas pelo utilizador no Delta Graph, DeltaPoint, Inc., Monteray, CA) . Uma vez conhecida a constante de velocidade, pode determinar-se uma concentração de ADN desconhecida a partir dos dados experimentais de rehibridização.
Definida a constante de velocidade (k), determinam-se as concentrações em ADN para amostras em que eram desconhecidas. As curvas de fluorescência vs. tempo de amostras desconhecidas são submetidas a um ajuste por análise não linear de regressão de minimos quadrados, preferivelmente durante a ciclização da temperatura em tempo real (por exemplo, utilizando o método não linear de Levenberg-Marquardt descrito no ambiente de programação LabView, National Instruments, Austin, TX). Para este ajuste, Fmax, Fmln, to, e [DNA] são os parâmetros flutuantes e k é constante. 107
Uma vez que determinados corantes fluorescentes afectam a rehibridização , de um modo que depende da sua concentração , o facto de se assumir uma cinética de segunda ordem para a rehibridização do produto tem que ser confirmado determinando a constante de velocidade a diferentes concentrações padrão de ADN. A relação é definida e incorpora-se uma fórmula alternativa para o ajuste caso seja necessário.
Também se exemplifica a utilização das velocidades de hibridização das sondas para determinar as concentrações de produto. A velocidade da fluorescência transferência da energia de ressonância é seguida ao longo do tempo após um arrefecimento rápido até a uma temperatura de hibridizaçao da sonda, que seja superior à temperatura de hibridizaçao do iniciador (Figura 2) . Para o caso da amplificação com um iniciador marcado e uma sonda marcada, a velocidade de hibridização (e a geração da fluorescência) é de segunda ordem. Quando se utilizam duas sondas marcadas, a velocidade do desenvolvimento da fluorescência é de terceira ordem. Mostram-se na Figura 18 estes dois tipos de sistemas. Quando a(s) concentração(ões) da(s) sonda(s) é(são) muito maior(es) do que a concentração do produto, são adequadas para descrever os sistemas equações de pseudo primeira ordem e de pseudo segunda ordem. As equações de velocidade apropriadas para estas condições diferentes são bem conhecidas na técnica (veja-se Young, B. e Anderson, M., supra). Para os objectivos desta invenção, é adequado que a técnica anterior sugira que se testem 108 experimentalmente equações de velocidade apropriadas e se corrijam caso seja necessário.
Quando se utilizam as velocidades de hibridização de sondas para determinar as concentrações de produto, incluem-se nos efeitos que possivelmente interferem a rehibridização do produto (com translocação da sonda por migração de ramo) e a hibridização e extensão de iniciador através da sonda. Este ultimo efeito é minimizado quando os valores de Tm da sonda são mais altos que os valores de Tm do iniciador e escolhe-se a temperatura de hibridização da sonda para minimizar a hibridização do iniciador. A Figura 13 mostra que mesmo que ocorra extensão, a fluorescência aumenta com o tempo durante cerca de 20 segundos. Durante este periodo, o aumento da fluorescência depende da concentração do produto.
Utilizam-se as velocidades de hibridização do iniciador para se determinar a concentração do produto à semelhança do método descrito acima para determinar a concentração do produto por rehibridização do produto. Os passos são resumidos tal como se segue: (1) seleccionar a equação de velocidade apropriada para o sistema, (2) experimentar com padrões de AND conhecidos para se determinar a constante de velocidade, (3) confirmar a validade da equação de velocidade comparando constantes de velocidade diferentes provenientes de concentrações diferentes, e (4) utilizar as constantes de velocidade para se determinar a concentração de ADN das incógnitas a partir dos seus dados de hibridização da sonda. 109
Utilização dos Dados de Fluorescência para Controlar a Variação Ciclica da Temperatura. Em contraste com a análise do ponto final e com a análise ciclo a ciclo, a invenção presente também pode monitorizar a fluorescência todo ao longo de cada ciclo de temperatura. Pode utilizar-se a monitorização continua da fluorescência para controlar os parâmetros de variação ciclica da temperatura. A invenção presente utiliza informação da fluorescência para controlo em tempo real e para optimização da amplificação. A monitorização continua da fluorescência de amostras em PCR contendo um corante especifico para ADN de dupla cadeia ou sondas oligonucleotidicas com marcação fluorescente podem ser utilizadas para monitorizar a hibridização e a fusão durante ciclos individuais de amplificação. Esta informação pode ser utilizada pelos algoritmos de controlo da temperatura dentro do aparelho de variação cíclica da temperatura, para melhorar e redefinir as condições de variação térmica cíclica. Na PCR convencional ela é levada a cabo programando todos os parâmetros da variação cíclica antes da amplificação. Com a monitorização contínua, a determinação das necessidades para a variação cíclica da temperatura pode ocorrer durante a própria amplificação, com base na observação contínua da hibridização, da extensão, e da desnaturação. Os benefícios potenciais de se utilizar a informação da hibridização para controlar a temperatura incluem: 1. Assegurar uma desnaturação completa do produto da PCR em cada ciclo, enquanto: 110 a. Se minimiza a exposição a temperaturas de desnaturação excessivamente elevadas evitando deste modo danos induzidos pelo calor nos produtos de amplificação e na polimerase. Se limita o período durante o qual o produto está exposto a temperaturas de desnaturação, o que é especialmente útil para a amplificação de produtos longos. b. se aumenta a especificidade da reacção ao minimizar-se a temperatura de desnaturação. Isto selecciona contra produtos com uma Tm maior do que a do produto de amplificação pretendido. 2. Maximizar a eficiência da amplificação assegurando períodos de tempo adequados para a hibridização do iniciador em cada ciclo enquanto: a. Se minimiza a quantidade de tempo dispendido para a amplificação ao permitir que não passe mais tempo que do aquele que é necessário para se conseguir uma determinada eficiência da hibridização do iniciador. b. Se aumenta a especificidade da reacção por se minimizar o tempo passado à temperatura de hibridzação. 111 3. Maximizar a eficiência da amplificação assegurando períodos de tempo adequados para a extensão do produto enquanto: a. Se minimiza o intervalo de tempo necessário para a amplificação não permitindo que se prolongue mais do que o necessário para se completar a extensão do produto. b. Se aumenta a especificidade da reacção seleccionando-se contra produtos mais longos do que o produto de amplificação pretendido. Estes produtos necessitariam mais tempo do que o período de tempo atribuído para se completar a extensão do produto. 4. Iniciar as alterações da variação térmica cíclica na dependência do nível de fluorescência obtido ou da eficiência corrente da amplificação. Por exemplo, podem minimizar-se tanto um excesso de amplificação como produtos não específicos da reacção terminando a variação cíclica da temperatura quando a eficiência baixa até um nível determinado. A título de outro exemplo, pode modificar-se a variação cíclica da temperatura para se iniciarem aumentos de temperatura mais suaves para se adquirir uma curva de fusão quando a fluorescência se torna detectável. Isto poupa tempo porque os aumentos 112 mais lentos não precisam de ser utilizados nos ciclos anteriores. Na prática continuada desta invenção podem tornar-se evidentes outras cambiantes desejáveis. 0 controlo baseia-se numa estimativa dos parâmetros da reacção a partir dos dados de fluorescência. Os dados originais de fluorescência são quer adquiridos sob a forma de uma alteração da fluorescência ao longo do tempo (velocidades especificas de desnaturação dependentes da temperatura, hibridização, e extensão), uma alteração da fluorescência com a temperatura (Tm do produto ou de uma sonda), quer de uma alteração da extensão da amplificação (rendimento e eficiência da amplificação) . Estas velocidades, os valores de Tm e as suas primeiras e segundas derivadas são utilizadas para determinar os parâmetros reaccionais óptimos que incluem a temperatura de desnaturação e o tempo, a temperatura de hibridização do iniciador e o tempo, a temperatura de hibridização da sonda e o tempo, a temperatura de extensão enzimática e o tempo, bem como o número de ciclos.
Os corantes específicos para AND de dupla cadeia são utilizados para o controlo da desnaturação, para 0 controlo da extensão, e para iniciar as alterações da ciclização térmica a um determinado nivel ou a uma determinada eficiência da amplificação. Os corantes para a transferência da energia de ressonância são utilizados para o controlo da hibridização tal como se descreverá de acordo com o exemplo que se segue. 113
Exemplo 25
Modificou-se um ciclizador térmico com monitorização da fluorescência comercial (LC24 LightCycler, Idaho Technology Inc., Idaho Falis, Idaho) , de modo a que os seus programas deixaram de incluir pontos bem determinados de temperatura/tempo, mas em vez disso adquiriam-se valores da fluorescência, os quais eram em seguida utilizados para controlo do ciclo térmico.
Tal como se representa no Diagrama de Blocos Funcional (Figura 51), o Programa de Tempo de Operação comunica através de interfaces em série e de aquisição digital com o Ciclizador da Luz. Isto permite um acesso de alto nível quer aos dados de temperatura quer de fluorescência e quaisquer destes podem ser utilizados pelo Programa a Nível da Placa para o controlo da temperatura. No entanto, na concretização corrente do instrumento, só os dados de temperatura é que são transformados para uma forma digital a nível do Equipamento de Controlo. Os dados de fluorescência são enviados sob uma forma analógica através da interface de Aquisição Digital, são analisados pelo Programa do Tempo da Operação, e enviados de novo para os Programas a Nível da Placa por intermédio a interface em série.
Controlo da fusão do produto: 114
Adquiriu-se um pico de fusão para o produto da PCR que se pretendia e uma fluorescência da linha de base para a amostra que continha a mistura reaccional à the temperatura a que o produto se encontrava completamente fundido.
Cada ciclo de reacção utilizou então este valor de fluorescência como alvo. A metodologia de abordagem da desnaturação do produto envolveu dois passos para se ultrapassar o atraso temporal devido à necessidade de se enviar o valor da fluorescência para um computador distante, para análise, e depois de ser devolvida a instrução de que já havia sido atingido o valor. Para cada passo de fusão do produto, aumentou-se a temperatura até a fluorescência atingir um valor intermédio, e depois reduziu-se a potência de aquecimento de modo que um aumento da temperatura de cerca de 3°C/segundo desse ao computador tempo para analisar a fluorescência e sinalizasse ao ciclizador térmico que tinha ocorrido a desnaturação do produto. A representação da variação de temperatura/tempo resultantes (Figura 52) mostra um aumento característico da temperatura de fusão a partir do ciclo 20 à medida que a concentração do produto de amplificação aumenta. O valor de Tm do produto é função da concentração do produto.
Hibridização/extensão do produto: 115
Durante uma manutenção duradoura à temperatura de hibridização/extensão, monitorizou-se a fluorescência e utilizou-se esta informação para assegurar que tinha sido atribuído um período adequado, mas não longo demais, para a extensão do produto. Monitorizou-se a fluorescência a intervalos de 10 segundos, quando a fluorescência aumentava mais do que uma razão bem determinada (tipicamente 1,00 -1,05), continuava-se o passo de hibridização/extensão. Em caso contrário, iniciava-se o passo de fusão do produto seguinte. O intervalo de 10 segundos foi seleccionado para que a temperatura da fase combinada de hibridização/extensão se mantivesse no mínimo durante 20 segundos. A representação gráfica de fluorescência/tempo que resume a situação (Figura 52) evidencia um aumento característico do tempo de permanência à temperatura combinada de hibridização/extensão à medida que cresce a concentração do produto de amplificação. Quando a concentração do iniciador e a da polimerase se tornam limitativas, é preciso mais tempo para completar a extensão do produto, em cada ciclo.
Planalto de Amplificação:
No final de cada passo de hibridização/extensão, o valor da fluorescência era adquirido e armazenado. Quando este valor tinha aumentado para 1,2 vezes o valor mais baixo da fluorescência de fim de ciclo e em seguida tinha parado de aumentar a menos de um valor regulável 116 (tipicamente 1,00 - 1,02), terminava-se a ciclização térmica. Em alternativa, iniciou-se um passo de aquisição de curva de fusão entrando num aumento lento, de 0,1 - 0,2°C/segundo, da temperatura, passando a Tm do produto e monitorizando a fluorescência da a mostra continuamente. A representação gráfica da fluorescência/tempo (Figura 52) mostra que depois de vinte cinco ciclos de amplificação a razão de crescimento da fluorescência ciclo a ciclo diminuiu abaixo de 1,00 e a reacção terminou.
Numa concretização da invenção presente, a detecção do planalto de amplificação é utilizada para adquirir curvas de fusão de resolução elevada para cada amostra numa experiência com diversas amostras conduzidas cada uma dela em ciclos da temperatura óptima para cada amostra. Quando uma amostra chega ao seu planalto de amplificação, adquire-se uma curva de fusão para essa amostra; em seguida recomeça-se a ciclização térmica regular até outra reacção chegar ao seu planalto de amplificação. A monitorização em tempo real e o controlo da hibridização distintamente da extensão também são proporcionadas pela invenção presente. Quando um dos iniciadores for marcado em 3' com Cy5, não pode ocorrer extensão. No entanto, caso se misture iniciador marcado (Ι-ΙΟ %) com iniciador não marcado (90-99 %) , a eficiência da amplificação seja ligeiramente menor, mas a hibridização é observável sob a forma de uma transferência de energia de 117 fluorescência de um corante específico de duplas cadeias para o Cy5. Marca-se o iniciador com menor valor de Tm (tal como se determina por termodinâmica do vizinho mais próximo e é conhecido na técnica) com Cy5 e inclui-se SYBR™ Verde I a título de corante específico para duplas cadeias. Em alternativa, pode monitorizar-se indirectamente a hibridização do iniciador com oligonucleótidos complementares equivalentes. Concebe-se um oligonucleótido com o mesmo comprimento e a mesma Tm do que o iniciador com menor Tm, sem nenhuma complementaridade para a sequência amplificada. Marca-se este oligonucleótido em 5' com Cy5 e o seu complemento em 3' com fluoresceína, ou com outro par de transferência da energia de ressonância. Segue-se a hibridização destes oligonucleótidos por transferência da energia de ressonância. Utiliza-se uma concentração de uma sonda igual à concentração do iniciador que tem uma Tm mais baixa e a concentração da outra sonda muito menor do que a da primeira para se obter uma cinética de pseudo primeira ordem que é semelhante à cinética de primeira ordem da hibridização do iniciador ao produto. A eficiência desta hibridização é monitorizada e utilizada para controlar a temperatura de hibridização bem como os períodos, por um destes métodos.
Também se encontra no âmbito da invenção presente substituir por completo os valores previamente determinados da temperatura e do tempo pelo controlo através dos dados de fluorescência que vão sendo obtidos. Por exemplo, colocam-se três amostras num ciclizador térmico de 118 fluorescência com capacidade para utilização dos dados recolhidos para controlo. As amostras são: 1. Uma amostra que não reaja contendo produto amplificado e SYBR™ Verde I. 2. Uma amostra que não reaja contendo iniciadores complementares marcados fluorescentemente e com uma Tm iqual à do iniciador com menor Tm e nas concentrações identificadas acima. 3. A amostra que se pretende amplificar e SYBR™ Verde I. A cada ciclo de amplificação, assegura-se a desnaturação do produto monitorizando a amostra 1 à medida que se aumenta a temperatura. Determina-se uma curva de fusão em tempo real e quando a amostra já desnaturou, inicia-se a transição para o passo de hibridização. Monitoriza-se a hibridização ao iniciador indirectamente através da hibridização de dois iniciadores complementares na amostra 2. Um dos iniciadores é marcado em 3' com fluoresceina e o outro é marcado em 5' com Cy5 ou um corante semelhante. Diminui-se a temperatura até que a amostra 2 mostre hibridização ao iniciador, tal como indicada por um aumento da razão de fluorescência a 670 nm / 540 nm. Esta razão aumenta devido à transferência da energia de ressonância entre os fluoróforos quando eles se aproximam devido à hibridização. Segue-se a extensão do 119 produto monitorizando a fluorescência de uma ou mais das amostra em decurso, tal como se demonstrou para o Exemplo 25.
Resumo. Da descrição acima, entender-se-á que a monitorização da fluorescência em continuo durante a amplificação do ADN para monitorizar a hibridização é uma técnica analitica extremamente poderosa. Utilizando os métodos descritos neste documento e dependendo do número inicial de cópias de perfil presentes, a identificação do produto e a sua quantificação podem ser conseguidas em cinco a vinte minutos depois de se iniciar a variação ciclica da temperatura. A invenção presente consegue diversas vantagens que anteriormente não se encontravam disponíveis na técnica. Por exemplo, a invenção presente proporciona métodos de fluorescência de cor única para monitorizar a pureza do produto, uma quantificação relativa por PCR de diversas amostras em conjunto, ou por PCR competitiva, quantificações absolutas de produtos por cinética de rehibridização, e portanto um método melhorado para a quantificação da quantidade inicial de um perfil através das representações da fluorescência vs. número de ciclos. A invenção presente também proporciona métodos de duas cores, específicos para sequências, para detectar variação da sequência, quantificação relativa levando a cabo PCR de amostras em conjunto ou por PCR competitiva, quantificação do produto por cinética de hibridização de sondas, e quantificação do perfil inicial por representações de fluorescência vs. número de ciclos. 120 A tabela seguinte compara corantes específicos para ADN de dupla cadeia, sondas de hidrólise, e sondas de hibridização úteis na monitorização contínua da PCR. A fluorescência dos corantes específicos para ADN de dupla cadeia depende do estado das cadeias do ADN. As sondas de hidrólise duplamente marcadas são desactivadas enquanto intactas e a fluorescência do doador aumenta quando a sonda é hidrolisada. As sondas de hibridização dependem de uma maior transferência da energia de ressonância quando a hibridização aproxima 2 fluoróforos um do outro.
Resumo das Sondas Fluorescentes para monitorização contínua
da PCR jSonda Fluorescente jjiCorante de dc de|Hidrólise |Hibridização ÍADN 1 1 ÍMecanismo |Estado |cadeias | dalDesnecessária iDifícil das|Desactivação ilTransf erênciai iSimples Síntese Sonda | | Especificidade |ϊν do produto pequência pequência lAnálise | fusão |Análise IMulticolor dalSim iNão
:NãO IS i m
Pim IS i m
Adquirem-se tempo, temperatura e fluorescência Ι-ΙΟ vezes por segundo e podem observar-se pormenores finos da hibridização do produto e/ou da sonda durante a variação 121 cíclica da temperatura. Com corantes específicos para ADN de dupla cadeia, the a hibridização do produto com respeito à temperatura é utilizada para identificar produtos através das curvas de fusão, para além disto, consegue-se uma quantificação relativa do produto por amplificação dita multipleXf de dois ou mais produtos diferentes que tenham Tm diferentes. Para além disto, leva-se a cabo PCR competitiva alterando a sequência interna dos iniciadores comuns de modo a obterem-se produtos que tenham valores de Tm diferentes. Consegue-se uma quantificação absoluta do produto arrefecendo rapidamente o produto desnaturado e observando a cinética de rehibridização. A sensibilidade da quantificação do perfil inicial com representações gráficas de fluorescência vs. número de ciclos é incrementada pela análise das curvas de fusão de produtos para se controlar a amplificação não especifica, e algoritmos de ajuste de curvas. Por último, o fornecimento imediato dos dados de fluorescência para se controlarem as condições de desnaturação, os períodos de alongamento e o rendimento do produto, são obtidas monitorizando o estado das cadeias do produto com corantes específicos para ADN de dupla cadeia. A capacidade de se monitorizar a hibridização de uma sonda usando a fluorescência durante a variação cíclica da temperatura é uma ferramenta poderosa. A invenção presente proporciona métodos de fluorescência de duas cores que dependem da hibridização da sonda (não da hidrólise) para uma detecção específica da sequência e para uma quantificação durante a PCR. A cinética de hibridização das sondas e a fusão das sondas de hibridização proporcionam 122 informação que não se encontra disponível a partir das sondas que se baseiam na hidrólise entre os fluoróforos por exonuclease. A monitorização contínua de sondas de hibridização específicas de uma sequência pode ser seguida ao longo das alterações de temperatura por transferência da energia de ressonância. A fusão de sondas ocorre a temperaturas características determinadas pelas suas sequências e pela sua complementaridade em relação ao produto. Foram pormenorizados na invenção presente dois esquemas, (1) duas sondas de hibridização adjacentes, e (2) uma sonda marcada que se hibridiza a um produto de PCR de cadeia única que incorpora um iniciador marcado. A temperatura de fusão das sondas específicas de determinadas sequências identifica e discrimina produtos durante a PCR. Os polimorfismos ou mutações do ADN, incluindo mutações de uma única base, são detectados por alterações dos Tm das sondas. Para além disto, é conseguida uma quantificação relativa do produto por amplificação multiplex de pelo menos dois produtos diferentes em conjunto, com uma ou mais sondas que fundam a temperaturas diferentes partir dos produtos em que se encontram. Para além disto, leva-se a cabo PCR competitiva alterando a sequência interna dos iniciadores de modo que uma ou mais sondas se hibridizem com o competidor e com o perfil natural a diferentes valores de Tm. Em alternativa, pode levar-se a cabo a PCR relativa ou competitiva por análise a diversas cores, com sondas marcadas com fluoróforos diferentes, tais como Cy5 e Cy5.5. Determina-se a concentração absoluta de produto por análise da cinética da hibridização de sondas. Determina-se o número inicial de cópias do perfil a partir de 123 representações gráficas da fluorescência vs. número de ciclos, recorrendo a algoritmos de ajuste de curvas.
Quando se pretenda fazer uma análise multiplex numa reacção de PCR, é prática comum utilizar diferentes marcadores fluorescentes com espectros de emissão distinguiveis para identificar os diversos produtos. A análise é complicada pelo número limitado de fluoróforos disponiveis e pelos espectros de emissão sobreponiveis dos fluoróforos que se encontram disponiveis (veja-se Η. M. Shapiro, supra). A análise da hibridização de produtos ou de sondas através de curvas de fusão é outro método para distinguir entre múltiplos produtos da PCR. Seguindo a hibridização durante a variação ciclica da temperatura, pode minimizar-se o número de sondas e/ou de cores espectrais que são necessárias para se distinguirem diversos produtos. A invenção presente pode assumir outras formas especificas ainda, sem que se afaste do seu espirito ou das suas caracteristicas essenciais. As concretizações descritas devem ser consideradas sob todos os seus aspectos apenas como ilustrações e não como restrições à invenção. 0 âmbito da invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações apensas e não pela descrição que antecede. Todas as alterações que se possam considerar adentro do significado e gama da equivalência das reivindicações devem também ser consideradas como incluídas no âmbito destas reivindicações. 124 0 código de programação para se levarem a cabo as análises das curvas de fusão e outras análises pode ser encontrado nas Figuras 53-105.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) ENTIDADE SOLICITANTE: Wittwer, Cari T. Ririe, Kirk M. Rasmussen, Randy P. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Monitorização da
Hibridização Durante a PCR (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 27 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Thorpe. North & Western, (B) RUA: 9035 South 700 East, Suite 200 (C) CIDADE: Sandy (D) ESTADO: Utah (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 84070 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DO MEIO: Disquete, 3,5 polegadas, capacidade de armazenagem de 1,44 Mb 125
(B) COMPUTADOR: Toshiba T2150CDS (C) SISTEMAO OPERATIVO: Windows 95 (D) PROGRAMA: Word Perfect 7.0 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE ENTRADA: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/658.993 (B) DATA DE ENTRADA: 04-JUN-96 (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/818,267 (B) DATA DE ENTRADA: 17-MAR-97 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: Alan J. Howarth (B) NÚMERO DE REGISTO: 36.553 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE ESCANINHO: 8616.CIP7
(ix) INFORMAÇÃO SOBRE CONTACTOS POR TELECOMUNICAÇÃO 126 (A) TELEFONE: (801)566-6633 (B) TELEFAX: (801)566-0750 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:l: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
CGTGGTGGAC (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1 TTCTCTCAAT 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:2: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
AGAAGATGAG (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2 GCATAGCAGC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 127 (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
CAAACAGACA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3 CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA 35 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:4: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
AAGTCTGCCG (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4 TTACTGCCCT GTGGGGCAAG 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear 128
128 TCTGCCGTTA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5 CTGCCCTGTG GGGCAAG 27 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:6: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
CAACTTCATC (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6 CACGTNCACC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:7: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
CTGTCCGTGA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7 CGTGGATT 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 129 (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
AAGTCCTCCG (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8 AGTATAGC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:9: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
TAATCTGTAA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9 GAGCAGATCC CTGGACAGGC GAGGAATACA GGTATT 46 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear 130
130 TAATCTGTAA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: GAGCAGATCC CTGGACAGGC AAGGAATACA GGTATT 46 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:11: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
TAATCTGTAA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: GAGCAGATCC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:12: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
TGTTATCACA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: CTGGTGCTAA 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 131 (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA:: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
AATACCTGTA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: TTCCTCGCCT GTC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:14: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
ATGCCTGGCA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: CCATTAAAGA 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear 132
132 GCATGCTTTG (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO 15: ATGACGCTTC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:16: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
CGGATCTTCT (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: GCTGCCGTCG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:17: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
CCTCTGACGT (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: CCATCATCTC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 133 (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18: GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G 31 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:19: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19: CTGCCGTACT GCCCTGTGGG GCAAGG 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear 134
134 ATGCCCTCCC (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20: CCATGCCATC CTGCGT 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:21: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
CAACTTCATC (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21: CACGTTCACC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:22: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
GTCTGCCGTT (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22: ACTGCCCTGT GGGGCAA 27 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 135 (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
CCTCAAACAG (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23: ACACCATGGT GCACCTGACT CC 32 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:24: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
GAAGTCTGCC (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24: GTTACTGCCC TGTGGGGCAA 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear 136
136 T GAAGGAGAA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25: GGTGTCTGCG GGA 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:26: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
CCTCGGCTAA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26: ATAGTAGTGC GTCGA 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: de cadeia única (D) TOPOLOGIA: linear
AGGACGGTGC (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 27: GGTGAGAGTG 20
Lisboa, 9 de Julho de 2009.

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para se analisar uma sequência de ADN alvo de uma amostra biológica, incluindo o método referido os passos de se amplificar a sequência alvo por reacção com polimerase em cadeia na presença de uma entidade fluorescente ligada a ácidos nucleicos, incluindo a reacção de polimerase em cadeia referida acima os passos de se adicionar uma polimerase termicamente estável e iniciadores para a sequência de ácidos nucleicos alvo à amostra biológica efectuando-se ciclos térmicos sobre a amostra biológica a uma temperatura pelo menos desnaturante e a uma temperatura de elongação; se excitar a amostra com luz com um comprimento de onda absorvido pela entidade fluorescente ligada a ácidos nucleicos; se monitorizar a fluorescência dependente da temperatura proveniente da entidade fluorescente ligada a ácido nucleico quando se altera a temperatura da amostra; se adquirir uma curva de fusão do produto amplificado a partir do citado passo de monitorização; e se levar a cabo uma análise da curva de fusão do produto amplificado. 2 2. 0 método da reivindicação 1 no qual a entidade fluorescente ligada a ácido nucleico que se referiu inclua um corante fluorescente ligado a um ácido nucleico de dupla cadeia. 3. 0 método da reivindicação 1 no qual a entidade fluorescente ligada a ácido nucleico seja SYBR™ Verde 1. 4. 0 método da reivindicação 2 no qual o corante fluorescente especifico para ácido nucleico de dupla cadeia seja um membro seleccionado de entre os elementos de um conjunto formado por SYBR™ VERDE I, brometo de etidio, verde pico, laranja de acridina, laranja de tiazole, Y0-PR0-1, e cromomicina A3. 5. 0 método da reivindicação 1 no qual a entidade fluorescente ligada a ácido nucleico seja o SYBR™ Verde I, o passo de excitação inclua excitar-se a amostra biológica com luz a um comprimento de onda absorvido pelo SYBR™ Verde I, e o passo de monitorização inclua: monitorizar-se a fluorescência dependente da TM temperatura do SYBR Verde I. 6. 0 método da reivindicação 5 no qual o passo de monitorização inclua determinar-se um perfil de fusão da sequência alvo amplificada. 3 7. 0 método da reivindicação 1 incluindo também os passos de se determinar uma constante de velocidade de segunda ordem para a sequência alvo amplificada para se determinar a concentração da sequência alvo amplificada, incluindo o passo de determinação da constante de velocidade de segunda ordem: aumentar-se a temperatura de uma mistura contendo uma concentração conhecida da sequência alvo amplificada e uma quantidade eficaz de um corante fluorescente específico para uma dupla cadeia, acima da temperatura de desnaturação da sequência alvo amplificada para se obter uma sequência alvo amplificada desnaturada; se diminuir rapidamente a temperatura da mistura que inclui a quantidade conhecida de desnaturada até uma temperatura seleccionada inferior à temperatura de desnaturação da sequência alvo amplificada enquanto se monitoriza continuamente a fluorescência da mistura em função do tempo; e se representar a fluorescência em função do tempo para se determinar a fluorescência máxima, a fluorescência mínima, o instante em 4 que a fluorescência é mínima, e a constante de velocidade de segunda ordem para a concentração conhecida da sequência alvo amplificada a partir da equação: r« n · mu * P iwi ' k((-te)fDNAj^l na qual F é a fluorescência, Fmax é a fluorescência máxima, Fmin é a fluorescência mínima, k é a constante de velocidade de segunda ordem, to é o instante a que ocorre Fmin e [DNA] é a concentração conhecida da sequência alvo amplificada. 8. 0 método da reivindicação 1 no qual a sequência de ácido nucleico alvo seja um segmento seleccionado de um perfil do ácido nucleico alvo, a reacção de polimerase em cadeia ocorra numa mistura reaccional e a mistura reaccional contenha também uma quantidade desconhecida do perfil de ácido nucleico alvo, um segundo par de oligonucleótidos iniciadores configurados para amplificarem um segmento seleccionado do perfil de referência, e uma quantidade conhecida do perfil de referência, em que da amplificação resulte um segmento amplificado do perfil alvo e um segmento amplificado do perfil de referência, o passo de monitorização inclua monitorizar-se a fluorescência emitida em função da temperatura para se obter uma curva de fusão dos produtos amplificados na qual o segmento amplificado do perfil alvo 5 e o segmento amplificado do perfil de referência fundam a diferentes temperaturas; obterem-se a partir das curvas de fusão picos de fusão e determinarem-se quantidades relativas do perfil alvo e do perfil de referência a partir desses picos de fusão; e calcular-se a concentração do perfil alvo com base na quantidade conhecida do perfil de referência e as quantidades relativas de perfil do alvo e de perfil de referência. 9. 0 método da reivindicação 1 no qual a amplificação ocorra numa mistura reaccional e os iniciadores estejam configurados para amplificarem a sequência de ácido nucleico alvo para se obter um produto alvo amplificado, contendo também a mistura reaccional um perfil de controlo positivo e um segundo par de oligonucleótidos iniciadores configurados para amplificarem o perfil de controlo positivo para se obter um produto de controlo amplificado, o passo de monitorização inclua monitorizar-se em continuo a fluorescência durante um ciclo de amplificação da reacção de polimerase em cadeia para se obter um primeiro pico de fusão do produto alvo amplificado caso a sequência de ácido nucleico seja amplificada, e um segundo ponto de fusão do produto de controlo amplificado caso o perfil de controlo positivo seja amplificado; em que obter-se o segundo pico de fusão indica que a reacção da polimerase em cadeia estava operacional, obter-se o primeiro pico indica que o segmento seleccionado como alvo era amplificável, e a ausência do primeiro pico de fusão indica que o segmento alvo seleccionado não era amplificável. 6
10. O método da reivindicação 3, no qual o passo de amplificação produz produtos amplificados e a fluorescência dependente da temperatura seja utilizada para identificar os produtos amplificados, em que os produtos amplificados sejam identificados por análise das curvas de fusão.
11. O método da reivindicação 10, no qual as quantidades relativas de dois ou mais produtos amplificados sejam determinadas por análise das curvas de fusão.
12. O método da reivindicação 10, no qual as áreas sob as curves de fusão sejam determinadas por uma análise não linear de regressão de mínimos quadrados da soma de múltiplas curvas gaussianas. Lisboa, 9 de Julho de 2009
PT97931089T 1996-06-04 1997-06-04 Monitorização da hibridização durante a pcr PT912766E (pt)

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