DE69728370T2

DE69728370T2 - Analyseverfahren basierend auf Signalverstärkung

Info

Publication number: DE69728370T2
Application number: DE69728370T
Authority: DE
Inventors: Dr. Henrik Orum; Dr. Troels Koch; Dr. Martin Borre; Henrik Frydenlund Hansen
Original assignee: PNA Diagnostics ApS Denmark
Current assignee: PNA Diagnostics ApS Denmark
Priority date: 1996-12-21
Filing date: 1997-12-17
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2017-12-18
Also published as: US6020132A; DE69728370D1; JPH10179198A; CA2218440A1; ES2214586T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre Nukleinsäureverbindungen mit der Fähigkeit zur Bildung von Triplexstrukturen für die Herstellung und Reinigung solcher chimärer Verbindungen und ihre Verwendung in Signalamplifikationstechniken.
Hintergrund der Erfindung
Nachweis und Quantifizierung von Nukleinsäuremolekülen ist ein fundamentaler Bestandteil mehrerer diagnostischer Techniken. Die Menge an verfügbaren Nukleinsäure-Zielmolekülen in einer spezifischen Probe ist jedoch in der Regel gering, weshalb die direkte Hybridisierung mit einer Polynukleotidsonde daher in vielen Fällen für einen Nachweis nicht ausreichend ist. Im Falle eines infektiösen Organismus bestand die klassische Lösung aus einer Anreicherung durch Anzüchtung, dies ist jedoch zeitaufwändig und daher für eine schnelle Diagnose nicht geeignet. Eine Möglichkeit zur Umgehung dieser Probleme ist die Amplifikation des Zielmoleküls. Dies kann auf mehreren Wegen erreicht werden, beispielsweise durch die Polymerasekettenreaktion (PCR, wie beschrieben in USA-A-4,683,195 oder EP-A-O 630 971), die Ligasekettenreaktion (LCR, EP-A-O 320 308) oder NASBA (EP-A-329 822). Alle diese Techniken verwenden jedoch Enzyme zur Amplifikation der Nukleinsäurezielmoleküle und haben demzufolge den Nachteil, dass Verbindungen in der Testprobe diese Enzyme hemmen können. Die derzeitigen, auf diesen Techniken beruhenden Protokolle beinhalten daher häufig aufwändige Schritte zur Probenpräparation, wie beispielsweise die Reinigung und Einengung von DNA. Darüber hinaus steigt das Risiko einer Kontamination erheblich, wenn die Zielsequenz amplifiziert wird. Zur Überwindung von Kontaminationsproblemen sind mehrere Verfahren beschrieben worden, darunter 1) Verdau mit Nukleasen, die in spezifischer Weise Nukleinsäuremoleküle abbauen, welche während der vorangegangenen Analyse gebildet wurden (EP-A-O 401 037) und 2) spezielle Laborpraktiken, mit denen ein Überführen von Material zwischen neuen Proben und zuvor analysiertem Material minimiert wird. Verfahren zum Vermeiden von Kontamination und Hemmung sind in der Regel jedoch teuer und mühsam.
Eine weitere Lösung für die Signalamplifikation wäre die Anwendung eines Verfahrens, in dem die Anzahl von Signal produzierenden Verbindungen erhöht ist. Solche Verfahren sind beispielsweise beschrieben in EP-A-O 317 077, WO 95/01365 und WO 95/08000. Diese Techniken nutzen multivalente Intermediärsonden mit einer großen Anzahl von identischen Nukleotidsequenzen, die kovalent aneinander gebunden sind, und jede Intermediärsonde kann gleichzeitig mit bis zu 50 Signal produzierenden Sekundärsonden hybridisieren. Die Intermediärsonden in diesen Techniken sind allerdings große Moleküle, was eine ungünstige Kinetik ergibt.
Es wäre daher sehr wünschenswert, ein Verfahren für die Signalamplifikation zur Verfügung zu haben, das schnell, einfach und empfindlich ist und auf stabilen Verbindungen und nicht-enzymatischen Reaktionen beruht.
Aus WO 92/11390 A1 sind Dreifachhelixstrukturen bekannt. Solche Dreifachhelixstrukturen werden durch Binden einer so genannten „Triplexsonde" an einen Duplex gebildet, d. h. die Dreifachhelixstruktur wird durch Anheften an oder Strangverdrängung durch einen Duplex gebildet. Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich insofern, als dass mehrere Sondenmoleküle verwendet werden, die ein für das Binden an das zu bestimmende Molekül konzipiertes Segment enthalten sowie einen Teil, der das Binden an das gleiche Sondenmolekül durch Basenpaarung minimieren soll, wodurch Dreifachhelixstrukturen gebildet werden.
Aus PNAS USA Band 89, 495–498 (1992) sind Dreifachhelixstrukturen bekannt. Solche Dreifachhelixstrukturen werden durch intermolekulare Triplexbildung zwischen einer doppelsträngigen Sequenz und einer Sonde gebildet. Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich insofern, als dass mehrere Sonden moleküle verwendet werden, die ein für das Binden an das zu bestimmende Molekül konzipiertes Segment enthalten sowie einen Teil, der das Binden an das gleiche Sondenmolekül durch Basenpaarung minimieren soll, wodurch Dreifachhelixstrukturen gebildet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Bestimmen eines Moleküls A mit einer Sequenz SA von Nukleobasen, wobei sich das Molekül durch die Sequenz SA an einer Dreifachhelixstruktur beteiligen kann, umfassend das Bereitstellen einer Reaktionsmischung mit mehreren Sondenmolekülen B mit einem ersten Segment B1, das sich an einer Dreifachhelixstruktur mit A durch Sequenz SA beteiligen kann, und einem Segment B2, das eine direkte oder indirekte Bestimmung erlaubt, Inkubieren der Reaktionsmischung bei Bedingungen, welche die Bildung von Dreifachhelixstrukturen ermöglichen und Bestimmen der Bildung von Dreifachhelixstrukturen mithilfe des Segments B2.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Molekül, das für dieses Verfahren besonders vorteilhaft ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen eines Analyten mithilfe des oben erwähnten Verfahrens zum Bestimmen eines Moleküls A.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung mehrerer Dreifachhelixstrukturen (Triplexstrukturen) für das Bestimmen eines Analyten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist eine schematische Darstellung von Strukturen, die aus Molekülen A und Sonden B gebildet sind.
1 B ist eine schematische Darstellung von Strukturen, die zeigt, wie die Strukturen aus 1A erweitert werden können.
2 ist eine schematische Darstellung eines DNA- und eines PNA-Moleküls.
In 3 sind mehrere Wege zur Verknüpfung von Sondensegmenten angegeben. Im Falle der Segmente mit DNA und PNA findet die Bildung eines intramolekularen Duplexes bevorzugt im Fall A und B statt. Das heißt, dass Fall C und D bevorzugte Anordnungen zur Bildung von Dreifachhelixstrukturen sind. 3 enthält die in der Spezifikation für die Anordnung und Ausrichtung von Strängen verwendete Nomenklatur.
4 zeigt schematisch die Struktur einer beispielhaften PNA, die im bevorzugten antiparallelen Modus an DNA gebunden ist. Des Weiteren ist gezeigt, dass Nukleinsäureanaloga durch die Anheftung von Gruppen modifiziert werden können, was die Löslichkeit der Sonde verbessert und im Falle von PNA die Addition eines Lysinrestes ist.
5 zeigt ein Schema eines in einem der beispielhaften, erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten Konstruktes, wobei eine Zielnukleinsäure mithilfe einer Primärsonde analysiert wird, mehrere, jeweils aus einem DNA- und einem PNA-Segment bestehende Sonden und Sekundärsonden mit einer Reportergruppe und mit einem blockierten Ende, das verhindert, dass die Sonde an weiteren Anordnungen teilnimmt. Es zeigt, dass es mithilfe der Erfindung möglich ist, eine Vielzahl von Markierungsstellen zu erhalten und daher eine Signalamplifikation zu erreichen.
In 6A ist ein Schema einer beispielhaften Ausführungsform der Erfindung gezeigt, in der eine erste Sonde B mit zwei Segmenten B1 und B2 und eine zweite Sonde C mit zwei Segmenten C1 und C2 verwendet wird. Die Segmente B1 und C1 bestehen aus PNA und die Segmente B2 und C2 bestehen aus DNA.
6B zeigt das Ergebnis einer wie in 6A durchgeführten Anordnung, jedoch in Gegenwart von vier Sonden, genannt B, C, D und E, die jeweils zwei Segmente haben. Beide Segmente der Sonde C und E bestehen aus DNA, die beiden Segmente der Sonden B und D bestehen aus PNA.
7 zeigt eine Sequenz und den Bindungsmodus eines Moleküls von Sonde C und zwei Molekülen von Sonde D, wobei das zweite Segment von Sonde D an das erste Segment von Sonde C binden kann.
8 zeigt schematisch ein Sondenmolekül mit zwei PNA-Segmenten, wobei die Aminoenden durch eine Linkerhälfte L kovalent aneinander gebunden sind.
9 zeigt den Modus, in dem zwei PNA-Moleküle an einen Strang DNA binden.
10 zeigt eine Anordnung mit nur einem Molekül B. In diesem Fall ist B1 PNA und B2 eine Nukleinsäure.
11 zeigt die Schmelzkurven von Komplexen, die zwischen den Oligos von Beispiel 1 (bezeichnet als B1 und C2) gebildet worden sind, und zwar gemessen bei pH 4,75 und bei pH 9,5.
12 zeigt ein Autoradiogramm, das die unterschiedlichen Startkomponenten und Reaktionsprodukte für die Bildung von Duplices und Triplices zeigt.
13 zeigt ein Autoradiogramm für die Bildung eines Komplexes aus Duplices und Triplices, wobei die Menge des einzigen Duplex-bildenden Oligonukleotids von Spur 1 bis Spur 7 ansteigt (0; 1; 5; 10; 20; 40; 100 pmol DA262). Spur 8 enthält nur die Triplex-bildende Komponente DA256.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Ein Molekül A kann jede Hälfte mit einer Sequenz SA von Nukleobasen sein, deren Sequenz vorzugsweise mindestens 9 Basen lang, am bevorzugtesten jedoch zwischen 10 und 30 Basen lang ist. Die Nukleobasen sind vorzugsweise in linearer Weise kovalent an ein Gerüst gebunden, insbesondere so, dass das Molekül durch Basenpaarung an eine Nukleinsäure mit einer Sequenz von Basen binden kann, die komplementär zu der Basensequenz in Molekül A sind. Beispiele von Molekül A sind Nukleinsäuren wie RNA, DNA oder Derivate davon und Nukleinsäureanaloga. Sehr bevorzugt ist, dass es sich bei der Nukleinsäure um DNA handelt. Molekül A kann auch eine molekulare Hälfte sein, beispielsweise ein Protein oder Hapten, an welchem eine Nukleinsäuresequenz bzw. die Sequenz eines Nukleinsäureanalogons befestigt ist.
A kann ein von einer Probe stammendes Molekül sein, wobei das Vorhandensein, Nichtvorhandensein oder die Menge dieses Moleküls nachgewiesen und in Vorhandensein/Nichtvorhandensein oder/und Menge analysiert werden sollen, Molekül A kann jedoch auch eine Sonde bzw. Sondeneinheit sein, die selbst für die Bestimmung eines Analyten bestimmt ist. Die Absicht hinter dem Vorhandensein bzw. dem Gebrauch der Sequenz SA in Molekül A ist es, die Anzahl der Bindungsstellen für Marker bzw. die Anzahl von Markern, die an Molekül A angebracht sind bzw. angebracht werden können, zu erhöhen. Die Herkunft und die Funktion des Teils von Molekül A, der nicht an der Amplifikation eines Signals teilnimmt, kann daher entsprechend dem jeweils zu erfüllenden Zweck gewählt werden. Des Weiteren kann die Menge an Molekül A unbekannt sein, beispielsweise in Verfahren zum Bestimmen von Molekül A als Analyt in einer Probe, oder bekannt sein, beispielsweise, wenn eine definierte Menge von Molekül A zu einer Probe dazugegeben wird, insbesondere zum Bestimmen eines Analyten (beispielsweise Antigene, Antikörper, Haptene, etc.), der sich von Molekül A unterscheidet.
Sequenz SA kann natürliche Nukleobasen wie A, C, G, T und U oder nicht-natürliche Basen, wie 7-Deaza-G und Mischungen enthalten. Sequenz SA zeichnet sich vor allem dadurch aus, dass sie ein Sondenmolekül B durch Basenpaarung binden kann.
Eine Dreifachhelixstruktur bzw. Triplexstruktur besteht aus drei Molekülsträngen, von denen jeder eine Nukleobasensequenz aufweist, die eine Basenpaarung eingehen kann. Der Bindungsmodus zwischen den drei Strängen umfasst vorzugsweise sowohl die Basenpaarung nach Watson/Crick als auch die Basenpaarung nach Hoogsteen. Die Bildung von Dreifachhelixstrukturen erfordert, dass die Sequenz zweier daran beteiligter Stränge zu dem dritten Strang hoch komplementär ist. In bevorzugten Dreifachhelixstrukturen bestehen zwei der Stränge aus Pyrimidinnukleobasen einer beliebigen Sequenz, während der dritte Strang aus der komplementären Purinnukleobasensequenz besteht. Die Dreifachhelixstruktur hat daher vorzugsweise eine Länge von mindestens sechs Purin- bzw. sechs Pyrimidinnukleobasen.
In WO 95/01370 ist gezeigt, dass Peptidnukleinsäuren (PNAs) mit Nukleinsäuren Triplexstrukturen bilden können. Dieser Patentanmeldung können daher Kriterien zum Bilden von Dreifachhelices entnommen werden. PNAs und ihre Synthese sind in WO 92/20702 und WO 94/25477 offenbart. In einer Ausführungsform besteht das PNA-Gerüst aus sich wiederholenden Einheiten von Ethylaminoglycin-Hälften, wobei die Nukleobasen an die Glycinaminogruppe gebunden sind. PNAs dieser Definition enthalten daher einen Aminoterminus (- NH₂) und einen Carboxylsäureterminus (-COOH). Diese Termini können durch Anheftung anderer Hälften oder das Weglassen von Gruppen modifiziert werden (beispielsweise die Bindung an Gruppen, die die Löslichkeit erhöhen, wie z. B. Lysin).
In 3 sind vier mögliche Fälle einer intramolekularen Basenpaarung zwischen einem DNA- und PNA-Teil eines Sondenmoleküls gezeigt. Voraus setzung für 3 ist, dass der PNA- und der DNA-Teil durch Basenpaarung hybridisieren können. Es wird deutlich, dass die Art der Verknüpfung der PNA-Sequenz mit einer DNA-Sequenz, wie in 2C und 3D gezeigt, gegenüber den in 4A und 3B gezeigten Ausführungsformen bevorzugt ist. Im Fall A ist der 5'-Terminus der DNA (Kopf) an das Carboxylende der PNA (Schwanz) gebunden. Zum Bilden von Dreifachhelixstrukturen sollte daher die antiparallele Anordnung der Sequenzen vermieden und die parallele Anordnung bevorzugt werden.
Eine erfindungsgemäße Sonde ist eine Einheit, die zum Binden eines Markers einer beliebigen Art an ein zu bestimmendes Molekül verwendet wird. Diese Bindung kann direkt oder indirekt sein.
Eine Anordnung der vorliegenden Erfindung ist so definiert, dass sie mindestens ein, vorzugsweise nur ein, Molekül A und eine Vielzahl verschiedener, identischer Sondenmoleküle, vorzugsweise mehr als 2 und am meisten bevorzugt zwischen 10³ und 10⁷ Sondenmoleküle, enthält.
Jedes Sondenmolekül B ist so definiert, dass es mindestens zwei Segmente enthält. Sie werden im Folgenden als B1 und B2 bezeichnet. Diese Segmente sind vorzugsweise und am praktischsten kovalent miteinander verbunden, entweder direkt oder indirekt über eine Linkerhälfte. Aus der ausführlichen Beschreibung der Erfindung ist ersichtlich, dass die Verknüpfung der beiden Segmente im Wesentlichen den Zweck der Fixierung der Anordnungen/Ausrichtung der Segmente in jedem Sondenmolekül und der Auseinanderhaltung der Bereiche zwischen B1 und B2 erfüllen muss. Die Linkerhälfte L kann daher die Funktion haben, eine chemische Einheit zum Verbindung der Termini dieser Segmente bereit zu stellen, kann aber des Weiteren die Funktion haben, einen definierten Abstand zwischen den zu verknüpfenden Segmenten bereit zu stellen. Erfindungsgemäße Linkerhälften sind bivalente Hälften mit 1 bis 100 Atomen oder mehr. Typische Linkerhälften sind Alkylengruppen, Dicarboxylsäurehälften, Diaminhälften oder Aminosäurehälften. Der bevorzugte Abstand ist zwischen 20 und 100 Atome, gemessen zwischen den Atomen nach dem ersten Nicht-Basen-Atom benachbarter Basen. Ein Beispiel eines Sondenmoleküls ist in 8 gezeigt. In dieser schematischen Darstellung sind zwei PNA-Moleküle, jedes mit einem Amino- und einem Carboxylterminus, durch eine Linkerhälfte L miteinander verknüpft, welche die beiden Aminotermini der PNAs verbindet. Carboxylsäuretermini von PNAs können beispielsweise mithilfe herkömmlicher Kondensationsmittel wie Diimiden, beispielsweise 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethylcarbodiimid (EDC) verbunden sein. Des Weiteren sind steife Linker vorteilhaft, da sie intramolekulare Hybridisierung vermeiden.
Im Falle eines Sondenmoleküls mit einem PNA- und einem DNA-Segment verbinden bevorzugte Linkerhälften Hydroxylgruppen des DNA-Segments mit dem Amino- oder dem Carboxylende des PNA-Segments (vergleiche 3). Moleküle mit Segmenten von Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga sind in WO 95/08556 und WO 95/14706 beschrieben. Diese chimären Moleküle können in der vorliegenden Erfindung als Sondenmoleküle verwendet werden. Mindestens eines der Segmente des Sondenmoleküls kann an einer Dreifachhelixstruktur teilnehmen.
Dieses Segment ist daher vorzugsweise konzipiert, um aus einer Sequenz von Nukleobasen bestehen, die zu Sequenz SA des Moleküls A komplementär ist.
Mit erfindungsgemäßer Komplementarität ist eine Komplementarität von über 90% einer aufeinander folgenden Zahl von Nukleobasen einer Länge von mindestens neun Basen gemeint. Komplementarität wird durch Wasserstoffbindung zwischen Basen beurteilt.
Während Segment B1 für das Binden an Molekül A konzipiert ist, ist Segment B2 konzipiert, um die Bindung durch Basenpaarung an Segment B1 desselben Sondenmoleküls (intramolekulare Bindung) zu minimieren. Daher sollten Anordnungen von 2C und 3D gewählt werden. Ein anderer Weg zum Vermeiden intramolekularer Bindung es, die Länge des Linkers vorzugsweise klein genug zu wählen, um eine solche Bindung sterisch zu verhindern.
Bedingungen zum Bilden von Dreifachhelixstrukturen können je nach Art der Hälften, aus denen Sequenz SA und Segment B1 bestehen, variieren. Für PNAs und DNA sind die Reaktionsbedingungen in WO 95/01370 beschrieben. Diese Bedingungen können auf das Binden von Molekül B an Molekül A angewandt werden. Vorzugsweise umfassen diese Bedingungen einen pH-Wert von unter 7, der eine Protonierung von Zytosinmolekülen vermittelt. Für Dreifachhelixstrukturen, die aus anderen Strängen bestehen, kann ein Fachmann die optimalen Bedingungen für die Triplexbildung durch Titrationsexperimente oder durch Vergleichen von Schmelzkurven und Assoziationskurven bestimmen.
Die Reaktion zur Bildung von Dreifachhelixstrukturen kann so lange fortfahren, wie erforderlich, um so viele Dreifachhelixstrukturen zu bilden, wie beabsichtigt ist, was in der Regel zwischen 1 Min. und 12 Stunden, vorzugsweise zwischen 15 und 30 Minuten, dauert. In der Regel würde man die Reaktion nach einer definierten Reaktionszeit anhalten, um auch die Menge an Molekülen A in der Reaktionsmischung zu schätzen, beispielsweise in einem quantitativen Assay. Ein solches Anhalten der Reaktion kann durchgeführt werden, indem der pH-Wert so verändert wird, dass keine weitere Triplexbildung auftreten kann. Der pH-Wert wird daher in den eher basischen Bereich verändert, vorzugsweise auf einen pH-Wert von über B.
Die Bildung von Dreifachhelices wird bestimmt, indem das an Molekül A gebundene Segment B2 als Maß für das Vorhandensein, Nichtvorhandensein oder die Menge von Molekül A verwendet wird. Je nach der molekularen Struktur des Segments B2 gibt es viele Wege zur Bestimmung dieses Segments. In einem ersten Beispiel kann Segment B2 anhand seiner Nukleobasensequenz bestimmt werden. Diese Sequenz macht die Verwendung weiterer Sonden möglich, die eine zu der Sequenz von Segment B2 komplementäre Nukleobasensequenz umfassen.
In einer Ausführungsform erfolgt die Bestimmung von Segment B2 durch eine Sonde mit einer zu Segment B2 komplementären Sequenz und einer Reportergruppe. Reportergruppen sind in der Regel als Hälften bekannt, die ihrerseits nachweisbar sind oder durch Koppeln an eine nachweisbare Hälfte nachgewiesen werden können. Beispiele von Reportergruppen sind Fluoreszenzhälften, wie z. B. Fluoreszein, und Enzyme, wie z. B. Peroxidase, oder immunologisch aktive Substanzen wie Haptene, wie z. B. Digoxigenin oder farbige Substanzen, wie z. B. Rhodamin, oder Vitamine wie Biotin. Diese markierte Sonde wird im Folgenden Sekundärsonde genannt. Die Sekundärsonden enthalten vorzugsweise keine weitere Nukleobasensequenz, die zu einer in der Reaktionsmischung enthaltenen Sequenz komplementär ist, und sollen daher den Vorgang des Hinzufügens weiterer Sondenmoleküle zu Molekül A anhalten.
Die Sekundärsonde kann jederzeit zu der Reaktionsmischung oder sogar zu einem der Reagenzien der Reaktion zugegeben werden. In einer ersten Ausführungsform, in der die Sekundärsonde als ein Blocker für das Binden weiterer Sondenmoleküle verwendet wird, wird die Sekundärsonde am Beginn der Inkubation zu der Reaktionsmischung gegeben. Die Menge an Sekundärsonde muss so gewählt sein, dass sie noch immer ein Verstärken der Anzahl von an Molekül A gebundenen Bindungsstellen (beispielsweise B2) erlaubt, aber auch ein darauf folgendes Binden an ein Verhältnis dieser Bindungsstellen. Die Menge an Sekundärsonden ist daher in der Regel geringer als die Menge an Sondenmolekülen B. Sekundärsonden können des Weiteren zur Steuerung des Amplifikationsgrads verwendet werden.
In einer zweiten Ausführungsform wird die Sekundärsonde nach bzw. vor der Inkubation zu der Reaktionsmischung zugegeben, um die Reaktion anzuhalten. In diesem Fall ist die Menge an Sekundärsonde zu gewählt, dass sie die Menge an wahrscheinlich während der Inkubation gebildeten, freien Segmenten B2 übersteigt. Diese Menge richtet sich nach der Menge von Molekülen A in der Mischung, der Menge an Sondenmolekülen, die der Mischung zugegeben werden, und der Länge der Inkubationsdauer.
Das Molekül A kann dann über den in der Sekundärsonde vorhandenen Marker bestimmt werden. Diese Bestimmung wird genauso wie die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren für diese Marker durchgeführt. Die Bestimmung umfasst vorzugsweise die Kalibrierung des Systems, indem die identische Reaktionssequenz für eine Reaktionsmischung mit bekannten Mengen an Molekül A durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung nutzt im Allgemeinen die Idee, dass die Bildung von Dreifachhelixstrukturen die Bildung verzweigter Strukturen und dadurch die Bildung mehrerer Stellen zum Binden von Markern erlaubt. Je mehr Sondenmoleküle an einem Molekül A angeordnet sind, desto mehr Bindungsstellen werden geschaffen. Durch Nutzung dieses Prinzips gibt es je nach Art der beiden, die Sondenmoleküle ausmachenden Segmente verschiedene Möglichkeiten zum Anordnen von Sonden mithilfe der Bildung von Dreifachhelixstrukturen. Erfindungsgemäß ist es möglich, nur eine Art von Sondenmolekül zu verwenden, es ist jedoch auch möglich, unterschiedliche Arten von Sondenmolekülen zu kombinieren. Während der erste Ansatz den Vorteil hat, dass es nicht erforderlich ist, Sondenmoleküle unterschiedlicher Sequenzen zu synthetisieren, könnte der zweite Ansatz den Vorteil haben, dass die Anordnungsreaktion besser an spezifische Anforderungen angepasst werden kann. Im Folgenden ist für jeden Ansatz eine Ausführungsform beschrieben.
In einer ersten Ausführungsform wird nur eine Art von Sondenmolekül verwendet. Dieses Sondenmolekül stellt daher Sondenmolekül B dar. In 10 ist eine schematische Struktur einer Anordnung gezeigt, die während der Inkubation mehrerer Sondenmoleküle B mit einem Molekül A gebildet werden. In dieser Ausführungsform ist Segment B1 ein Bestandteil, der zweimal an der Bildung eines Triplex teilnimmt und B2 ist ein Bestandteil, der nur einmal an dieser Dreifachhelixstruktur teilnimmt. Ein Beispiel für Bestandteil B1 ist PNA, während B2 dann DNA sein kann. Sequenz und Ausrichtung der Segmente wird entsprechend den in 2 und 3 dargelegten Prinzipien gewählt. Es ist ersichtlich, dass die Anordnung umso größer wird und umso mehr Bindungsstellen für die Bestimmung beispielsweise von Segmenten B2 verfügbar sind, beispielsweise zum Binden einer markierten Sekundärsonde, je länger die Inkubationsdauer ist.
In einer zweiten Ausführungsform, die ebenfalls Chimären eines Segments verwendet, das zweimal in einer Dreifachhelixstruktur vorkommen kann, und eines Segments, das einmal in einer Dreifachhelixstruktur vorkommt, werden zwei Arten von Sondenmolekülen verwendet. Diese Sondenmoleküle unterscheiden sich in ihrer Struktur dahingehend, dass die Sequenzen von Segment 1 und 2 einer jeder Art bzw. Sonde so gewählt sind, dass diese Segmente keine Dreifachhelices mit dem anderen Segment derselben Art von Sonde bilden können. Das zweite Segment B2 des ersten Sondenmoleküls B kann jedoch an einer Dreifachhelixstruktur mit dem ersten Segment C1 der zweiten Sonde C teilnehmen, und das zweite Segment C2 der zweiten Sonde C kann eine Dreifachhelixstruktur mit dem ersten Segment B1 eines weiteren Sondenmoleküls B teilnehmen. Während der Inkubation dieser Sondenmoleküle mit Molekül A wird eine Anordnung mit einer verzweigten Struktur gebildet, in welche die Sondenmoleküle abwechselnd eingebaut sind. Eine solche Struktur ist in 5 gezeigt. Des Weiteren zeigt 5, dass Sekundärsonden mit einem zu einem der Segmente B2 oder C2 der Sondenmoleküle B oder C komplementären Segment eingebaut werden können, um der Anordnung einen Marker hinzuzufügen, wenn die Sekundärsonde als ein Terminator des Anordnungsvorgangs wirkt. Die Sekundärsonde sollte dann kein anderes, zu einem anderen Segment der Sondenmoleküle B und C komplementäres Segment enthalten. Dies wird mit dem Begriff blockiertes Ende bezeichnet. 5 zeigt des Weiteren die Bildung von Triplices unterschiedlicher Ausrichtung, je nach Sequenz der Sondenmoleküle.
Wie außerdem ersichtlich ist, enthalten die Segmente vorzugsweise Purine oder Pyrimidine, d. h. ein Segment enthält nur Purine, während das Andere nur Pyrimidine enthält. Dies ist bevorzugt, da sich hochstabile Dreifachhelices bilden, wenn Pyrimidine einer PNA sich durch Basenpaarung mittels Bindung nach Watson/Crick und Hoogsteen an Purine einer DNA binden.
Die Segmente der Sondenmoleküle können unabhängig voneinander synthetisiert werden, besonders, wenn die Segmente unterschiedliche Gerüste haben. Die Synthese von PNAs ist in WO 92/20702 beschrieben, wohingegen die Synthese von Desoxyribonukleotiden nach einer großen Vielfalt von Verfahren möglich ist, umfassend die chemische Synthese über Phosporamidite oder, vor allem für längere Sequenzen, durch Verfahren, bei denen Enzyme verwendet werden, wie bei der vorlagen(template)-abhängigen Synthese oder Restriktion doppelsträngiger Nukleinsäuren. In einem späteren Schritt werden die beiden Segmente durch die Linkerhälfte L miteinander verbunden. Der Linker kann jede molekular Einheit sein, beispielsweise Aminosäurereste, z. B. Aspartat oder Glutamat, oder andere Verbindungen, wie beispielsweise 8-Aminodioxaoktansäure (Ado, gemäß DE-A-3943522) oder Hexamethylen.
In einer dritten Ausführungsform, die sowohl Duplexbildung als auch Triplexbildung beinhalten kann, wird eine erste Art von Sonden mit ersten und zweiten Segmenten verwendet, die zweimal in einer Triplexstruktur vorkommen, wohingegen eine zweite Art von Sondenmolekülen erste und zweite Segmente enthält, die nur einmal in Triplexstrukturen vorkommen. In einem Beispiel enthält Sonde B zwei PNA-Segmente und Sonde C enthält zwei DNA-Segmente. Die Sequenz von Segment C1 ist so, dass sie Segment B2 bindet, und die Sequenz von Segment C2 ist so gewählt, dass sie Sequenz B1 eines weiteren Moleküls von Sonde B bindet. Wie oben ausgeführt, sind Sequenz und Symmetrie der Sequenzen wiederum so gewählt, dass die Sonden nicht intramolekular binden können und die Gesamtsequenz von Sonde B nicht komplementär ist zu der Gesamtsequenz von Sonde C. Eine Anordnung dieser Sonden B und C führt zu einer abwechselnden Anordnung der Sonden. Die Synthese solcher Sonden kann besonders vorteilhaft sein, da sie ohne Unterbrechung einer automatisierten chemischen Synthese synthetisiert werden können.
Wenn die Anordnungsreaktion vier oder mehr Bestandteile umfasst (wie in 6B), können einige Verbindungen (beispielsweise Verbindungen B und C sowie D und E oder B, C und D oder C, D und E) kombiniert und vor dem allgemeinen Mischen in Reaktion gebracht werden. Die Duplex- bzw. Triplexhybridisierungen können daher gesondert durchgeführt werden. Alternativ kann jede Verbindung schrittweise zugegeben werden, wobei jeder Schritt von einem Waschschritt gefolgt wird.
Wie oben für die chimären Moleküle beschrieben, ist es möglich, Anordnungen mit mehr Sonden zu konstruieren. Ein Beispiel für ein solches Konstrukt ist in 6B gegeben. In diesem Fall ist Segment B2 von Sonde B komplementär zu einem Segment C1 von Sonde C, Segment C2 ist komplementär zu einem ersten Segment D1 einer weiteren Art von Sonde D, welche außerdem ein Segment D2 enthält, das komplementär ist zu einem ersten Segment E1 einer weiteren Art von Sondenmolekül E, welches seinerseits ein Segment E2 enthält, das zu der Sequenz von Segment B1 komplementär ist. Diese Anordnung erfordert, dass beispielsweise Segment C2 nicht komplementär ist zu einem Segment B1 und D1 und Segment C2 ist nicht komplementär zu Segment B1 und C1. Auf diese Weise ist eine gesteuerte Anordnung einer Vielzahl von Sonden mithilfe von Dreifachhelixstrukturen möglich.
Die Verwendung von Sondenmolekülen mit nur einer Art von Gerüst in beiden Segmenten hat den Vorteil einer einfacheren Synthese der Sondenmoleküle. Die Sondenmoleküle können einfach als Ganzes aus monomeren Einheiten synthetisiert werden, ohne dass ein späterer Verknüpfungsschritt erforderlich ist. Wenn es gewünscht ist, einen Linker zum Verbinden der Segmente 1 und 2 zu verwenden, oder wenn eine entgegengesetzte Ausrichtung der Segmente gewählt ist, kann es vorteilhaft sein, die Segmente unabhängig voneinander zu synthetisieren und sie, wie oben erwähnt, in einem späteren Schritt zu verbinden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Molekül B mit einer, Segmente B1 und B2 enthaltenden Nukleobasensequenz, wobei B1 ein Gerüst mit Peptidbindungen und B2 ein natürliches Gerüst enthält und wobei die Segmente direkt oder durch eine Linkerhälfte kovalent aneinander gebunden sind und wobei die Bindung zwischen dem Aminoterminus von B1 und dem 3'-Terminus von B2 bzw. dem Carboxylsäureterminus von B1 und dem 5'-Terminus von B2 vorliegt. Eine erfindungsgemäße Peptidbindung ist die chemische Bindung zwischen einer CO-Gruppe und einer NR-Gruppe, wobei R ein Wasserstoff oder C₂-C₆-Acyl oder C₁-C₆-Alkyl ist. Ein natürliches Gerüst enthält Zucker-Phosphat-Einheiten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren für die Bestimmung eines Analyten, umfassend das Bereitstellen einer Reaktionsmischung mit einem Molekül A mit einer Nukleobase SA, wobei das Molekül durch die Sequenz eine Dreifachhelixstruktur bilden kann und an den Analyten, mehrere Sondenmoleküle B, umfassend ein erstes Segment B1, das sich an einer Dreifachhelixstruktur mit A durch die Sequenz SA beteiligen kann, und ein zweites Segment B2 binden kann, Inkubieren der Reaktionsmischung bei Bedingungen, die die Bildung von Dreifachhelices erlauben und Bestimmen der Bildung von Dreifachhelices mithilfe des Segments B2 als ein Maß für den zu bestimmenden Analyten. Vorzugsweise ist das Molekül A eine Sonde, die in einer Menge in der Reaktionsmischung vorhanden ist, die sich nach Vorhandensein/Nichtvorhandensein bzw. der Menge des Analyten richtet. Ein verfahrensgemäßer Analyt ist jedes Molekül, das bestimmt werden soll. Typische Analyten sind Bestandteile von Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut oder Flüssigkeiten daraus, wie z. B. Serum oder Plasma, oder Harn oder Sputum. Manche Flüssigkeiten erfordern vorbereitende Schritte, um die Analyten in zugängliche Form zu bringen. Beispielsweise könnte es erforderlich sein, Zellwände zu lysieren, um Analyten freizusetzen. Die Analyten können bei spielsweise Antikörper, Antigene, Haptene oder Nukleinsäuren sein. Nukleinsäuren sind bevorzugte Analyte. Um ein flexibles System für eine universelle Amplifikation zu erhalten, ist es bevorzugt, eine Primärsonde mit einem ersten Segment an Nukleobasen zu verwenden, die komplementär zu einem Abschnitt der Analytsequenz sind, und ein zweites Segment, das eine Nukleobasensequenz enthält, welche zu Segment B1 komplementär ist. In diesem System können die Sondenmoleküle für Analyten mit unterschiedlichen Nukleobasensequenzen verwendet werden. Ein gebildetes Konstrukt ist in 6 gezeigt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Bildung von mehreren Dreifachhelixstrukturen für die Bestimmung eines Analyten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammensetzung von Stoffen, umfassen einen Bestandteil N mit einer Sequenz N1, die eine Triplexstruktur bilden kann, und einer Sequenz N2, die für weitere Hybridisierung zugänglich ist, und einen Bestandteil M mit einer Sequenz M1, die eine Triplexstruktur mit einer Sequenz N1 formen kann, und einer Sequenz M2, die für weitere Hybridisierung zugänglich ist. Beispiele für Bestandteile N und M sind Molekül A und Sonde B bzw. Sonde B und Sonde C. Diese Zusammensetzungen von Stoffen sind Zwischenprodukte in der Anordnung des obigen Vorgangs. Sie können jedoch weiters verwendet werden, um Nukleinsäuren zu bestimmen. Ein Beispiel für Bestandteil O ist Sonde D.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung beispielhaft darstellen und Bedingungen für das erfolgreiche Durchführen des Verfahrens festlegen:
Allgemein
Die PNAs wurden gemäß WO 92/20702 synthetisiert. Gegebenenfalls werden modifizierende Gruppen angeheftet, während die PNAs noch geschützt waren und sich an der Festphase befanden. Die PNAs hatten aufgrund der Auswahl des festen Trägers und der späteren Art und Weise, wie die PNAs von der Festphase entkoppelt wurden, eine Amidfunktion am COOH-Ende. In diesem Fall bezeichnen wir das C-Ende mit -CONH₂. Das Aminoende wird als -H bezeichnet. Monomere für die Synthese der PNAs wurden von Millipore, USA, erworben. Oligonukleotide wurden chemisch in einem automatischen Synthetisiergerät synthetisiert.
Beispiel 1
Analyse von Bedingungen für die Triplexbildung
Um die Fähigkeit zur Triplexbildung von Oligos einzuschätzen (beispielsweise PNAs oder Sonden B und C), wurde die Schmelztemperatur Tm bei pH 4,5 und 9,5 gemessen, da bei höheren pH-Werten keine Hoogsteen-Basenpaarung möglich ist. Insgesamt wurde 1 ml einer Lösung mit 0,1 M Phosphatpuffer mit dem gewünschten pH-Wert, 9 μM PNA und 4,5 μM DNA 10 Minuten lang auf 95°C erhitzt und konnte dann langsam 18 Stunden lang auf 22°C abkühlen. Danach wurden 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer mit dem relevanten pH-Wert zugegeben und die optische Dichte wurde gemessen, indem die Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 0,5°C/Min. von 25°C auf 95°C erhöht wurde. Wie aus 12 ersichtlich ist, ist die Tm von Segment B1 und C2 bei pH 4,5 90°C und bei pH 9,5 58°C. Eine solche pH-Abhängigkeit zeigt, dass Hoogsteen-Basenpaarung wesentlich zu der Stabilität des Hybridisierungskomplexes beiträgt und dass Triplexbildung stattgefunden hat.
Die Sequenz von Segment B1 (PNA) und C2 (DNA) ist
Beispiel 2
Synthese von DNA-PNA-Chimären
Ein DNA-Oligo mit einem aus sechs Kohlenstoffatomen (Hexamethylen) bestehenden Linker und einem Terminus wurde mit einem PNA-Oligo mit einem Glutamatrest am Aminoterminus verknüpft, d. h., das DNA-Oligo SIG1 mit PNA187 und das DNA-Oligo SIG2 mit PNA 184. Die Reaktionsmischung war wie folgt:

5 μl DMSO
2 μl EDC, 0,5 M
2 μl Imidazol, 1 M
3,6 nmol PNA (PNA187 oder PNA184)
3,5 nmol DNA (SIG1 oder SIG2)
H₂O auf 20 μl

Wobei:

Ac steht für Acetyl.
Die Reaktion erfolgte über die Dauer von 1–5 Tagen bei 22°C.
Es wurden Chimären mit den folgenden Sequenzen hergestellt:
Die DNA wurde mit ³²P-ddATP durch herkömmliche, enzymatische, terminale Verlängerung markiert.
Beispiel 3
Analyse von Chimären durch Gelchromatografie
Nach der Reaktion wurden zu 30 μl 5 μl 80%iges Formamid gegeben, die Mischung wurde 5 Minuten lang auf 95°C erhitzt, auf nassem Eis 10 Minuten lang abgekühlt und auf ein 12%iges, denaturierendes Polyacrylamidgel aufgetragen.

18 ml 20%ige Gelmischung
10,8 ml 8%iger Harnstoff
1,2 ml 10 × TBE (0,9 M Tris-Borat, 0,01 M EDTA)
300 μl APS (Ammoniumpersulfat)
10 μl TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin)

Beispiel 4
Reinigung von Chimären
Nach der Elektrophorese wurde ein die Chimäre enthaltendes Gelfragment aus dem Gel geschnitten, in 1 ml TE-Puffer 5 Min. lang gewaschen, danach in 200 μl TE pH 8,3 gelegt und bei starkem Schütteln über Nacht bei 55°C extrahiert.
Beispiel 5
Bildung von Anordnungen für die Signalamplifikation
Um zu zeigen, dass Komplexe von DNA mit PNA gebildet werden können, in denen sowohl ein Teil der DNA als auch ein Teil der PNA zum Binden weiterer Sondenmoleküle zugänglich sind, wurden die folgenden PNA- und DNA-Moleküle inkubiert:
Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt.
Experiment 1:
Dabei handelt es sich lediglich um die Herstellung einer Lösung mit 1 pmol DA256* (siehe Spur 1).
Experiment 2:
In diesem Experiment wurden 1 pmol DA256* und 10 pmol PNA414 in 10 μl Wasser gemischt und über Nacht inkubiert (siehe Spur 2).
Experiment 3:
In diesem Experiment wurden 1 pmol DA256* und 10 pmol PNA380 inkubiert. Dieses Experiment ergibt eine DNA, in der zwei PNAs über Triplexbildung gebunden sind. Dies ist das erste Molekül, das als eine Sonde in Nukleinsäurehybridisierungsassays verwendet werden kann, wenn der Teil der DNA, der nicht an der Triplexbildung teilnimmt, zu einem ausgewählten Bereich einer Zielnukleinsäure komplementär ist. Anstatt einer Bindungsstelle wurden nun zwei Bindungsstellen (die freien, zugänglichen Teile der PNAs) erzeugt (siehe Spur 3).
Experiment 4:
In diesem Experiment werden zwei DNA-Moleküle (1 pmol DA256* und 20 pmol DA262) zusammen mit 10 pmol PNA380 inkubiert. Dieses Experiment zeigt, dass die auf PNA 380 verbliebenen Bindungsstellen mit DNA-Molekülen mit komplementärer Sequenz weiter reagieren und Duplices bilden. Dies ist aus Spur 4 in 12 ersichtlich, wo der in Spur 3 zu sehende, gebildete Komplex zu Gunsten von Banden mit höherem Molekulargewicht verschwendet.
Beispiel 5:
Dieses Experiment zeigt, dass auch der DNA-Teil von DA256 für eine Hybridisierung mit einem PNA-Molekül zugänglich ist, wobei ein Duplex gebildet wird. In diesem Experiment werden 1 pmol DA256*, 5 pmol PNA414 und 10 pmol PNA380 gemischt und über Nacht inkubiert. In Spur 5 von 5 ist zu sehen, dass sich im Vergleich zu Spur 3 ein Komplex mit höherem Molekulargewicht gebildet hat, was auf eine zusätzliche Duplexbildung mit PNA414 hinweist.
Beispiel 6:
In diesem Experiment wurden alle vier Sonden zusammengemischt, um Anordnungen mit sehr hohem Molekulargewicht zu erzeugen. 1 pmol DA256*, 9 pmol DA256, 10 pmol DA262, 10 pmol PNA380 und 10 pmol PNA414 werden gemischt und über Nacht inkubiert. Wie aus Spur 6 von 13 zu sehen ist, haben sich Strukturen mit hohem Molekulargewicht gebildet. Dies ist der erste Hinweis darauf, dass die Bindungsstellen von ursprünglich 1 Sonde viermal verstärkt wurden. Bei dem Gel von 12 handelt es sich um ein 12%iges Polyacrylamidgel und der Lauf fand mit einem TAE-Puffer mit pH 7,0 statt.
Beispiel 6
Bildung einer Anordnung mit verdoppelten Bindungsstellen
Dieses Experiment zeigt die Bildung des Komplexes, der eine erste Sonde (DA256) enthält, die über Triplexbildung an weitere Sonden (PNA380) bindet, welche jeweils über Duplexbildung eine weitere Sonde (DA262) binden. Die Sequenzen der verwendeten Oligomere sind in Beispiel Nr. 6 gegeben. Die Bedingungen sind die Folgenden:
Die Proben 1–7 enthalten:

1 pmol DA256*
9 pmol DA256
40 pmol PNA380
X pmol PNA 262 (X = 0; 1; 5; 10; 20; 40; 100)

Gel: 12% Polyacrylamid
Puffer: TAE pH 7,0
Die Ergebnisse sind in 13 dargestellt. Die Spuren entsprechen den oben angegebenen Proben. Es zeigt sich, dass sich mit geringeren Konzentrationen von DA262 hauptsächlich eine Anordnung von Da256 und ONA380 bildet, die ein höheres Molekulargewicht hat als DA256. Mit höher werdenden Mengen von DA262 bildet sich ein Komplex mit höherem Molekulargewicht (vor allem Spur 6 und 7). In Spur 7 ist das hauptsächliche Produkt der Komplex, der eine Triplexstruktur und zwei Duplexstrukturen enthält.
SEQUENZ LISTE

Claims

Verfahren zum Bestimmen eines Moleküls A mit einer Sequenz SA von Nukleobasen, wobei sich das Molekül durch die Sequenz SA an einer Dreifachhelixstruktur beteiligen kann, umfassend – Bereitstellen einer Reaktionsmischung mit mehreren Sondenmolekülen B mit einem ersten Segment B1, das sich an einer Dreifachhelixstruktur mit A durch Sequenz SA beteiligen kann, und einem Segment B2, – Inkubieren der Reaktionsmischung bei Bedingungen, die zur Bildung von verzweigten Dreifachhelixstrukturen führen, und – Bestimmen der Bildung von verzweigten Dreifachhelixstrukturen mithilfe des Segments B2.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Segment B2 sich an einer Dreifachhelixstruktur beteiligen kann.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Segment B1 und/oder B2 in der Dreifachhelixstruktur zweimal vorkommen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung von verzweigten Dreifachhelixstrukturen mithilfe einer Sonde C erfolgt, umfassend ein erstes Segment C1, das an Segment B2 binden kann, und ein zweites Segment C2, wobei sich entweder C1 oder C2 oder beide an einer Dreifachhelixstruktur beteiligen können, und Bestimmen der Bildung von Dreifachhelices mithilfe von Segment C2.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich Segment C2 an einer Dreifachhelixstruktur beteiligen kann.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Segment C1 und/oder C2 in einer Dreifachhelixstruktur zweimal vorkommen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eines der Segmente B1 und B2 eine Nukleobasensequenz auf einem nicht natürlichen Gerüst enthält und das andere eine Nukleobasensequenz auf einem natürlichen Gerüst enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 – 6, dadurch gekennzeichnet, dass B1 und B2 eine Nukleobasensequenz auf einem nicht natürlichen Gerüst enthalten und C1 und C2 eine Nukleobasensequenz auf einem natürlichen Gerüst enthalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung von verzweigten Dreifachhelixstrukturen mithilfe einer markierten Sonde C erfolgt, die eine zu B2 komplementäre Nukleobasensequenz enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht natürliche Gerüst ein Gerüst mit Peptidbindungen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei ein zusätzliches multiples Sondenmolekül bzw. mehrere zusätzliche multiple Sondenmoleküle, D, E, an der Bildung von mehreren Dreifachhelixstrukturen in Form von verzweigten Dreifachhelixstrukturen beteiligt sind, wobei die zusätzlichen Sondenmoleküle jeweils ein erstes Segment enthalten, das an ein Segment eines anderen Sondenmoleküls binden kann, und ein zweites Segment, wobei sich eines der Segmente bzw. beide Segmente an einer Dreifachhelixstruktur beteiligen kann bzw. können.
Molekül mit einer Nukleobasensequenz mit Segmenten B1 und B2, wobei B1 ein Gerüst mit Peptidbindungen enthält und B2 ein natürliches Gerüst enthält und wobei die Segmente entweder direkt oder über eine Linkerhälfte kovalent aneinander gebunden sind und wobei die Bindung zwischen dem Aminoterminus von B1 und dem 5'-Terminus von B2 vorliegt bzw. dem Carboxylsäureterminus von B1 und dem 3'-Terminus von B2 vorliegt und wobei sich die Segmente beide an Dreifachhelixstrukturen beteiligen können.
Verfahren zum Bestimmen eines Analyten, umfassend – Bereitstellen einer Reaktionsmischung mit einem Molekül A mit einer Nukleobasensequenz SA, wobei das Molekül durch die Sequenz SA eine Dreifachhelixstruktur bilden kann und an den Analyten und mehrere Sondenmoleküle B, umfassend ein erstes Segment B1, das sich an einer Dreifachhelixstruktur mit A durch die Sequenz SA beteiligen kann, und ein zweites Segment B2, binden kann, – Inkubieren der Reaktionsmischung bei Bedingungen, die zur Bildung von verzweigten Dreifachhelixstrukturen führen, und – Bestimmen der Bildung von verzweigten Dreifachhelixstrukturen mithilfe des Segments B2 als ein Maß für den zu bestimmenden Analyten.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation zu einem vorbestimmten Zeitpunkt durch Verändern des pH-Wertes der Reaktionsmischung oder durch Zugabe von Blockierungsmolekülen angehalten wird.
Verwendung eines Moleküls A und eines Moleküls B für die Bildung von verzweigten Dreifachhelixstrukturen für die Bestimmung eines Analyten, wobei Molekül A eine Nukleobasensequenz SA enthält, die sich an der Bildung einer Dreifachhelixstruktur beteiligen und des Weiteren an den Analyten und an die Moleküle B binden kann, wobei Molekül B ein erstes Segment B1 enthält, das sich an einer Dreifachhelixstruktur mit A durch die Sequenz SA beteiligen kann, und ein zweites Segment B2, das sich an einer Dreifachhelixstruktur beteiligen kann.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei Molekül B eine Nukleobasensequenz mit Segmenten B1 und B2 enthält, wobei B1 ein Gerüst mit Peptidbindungen enthält und B2 ein natürliches Gerüst enthält, und wobei die Segmente entweder direkt oder indirekt über eine Linkerhälfte aneinander gebunden sind und wobei die Bindung zwischen dem Aminoterminus von B1 und dem 5'-Terminus von B2 bzw. dem Carboxylsäureterminus von B1 und dem 3'-Terminus von B2 vorliegt.
Verwendung eines Moleküls B und eines Moleküls C für die Bildung von verzweigten Dreifachhelixstrukturen für die Bestimmung eines Moleküls A mit einer Sequenz SA von Nukleobasen, das sich durch die Sequenz SA an Dreifachhelixstrukturen beteiligen kann, wobei Molekül B ein erstes Segment B1 enthält, das sich an einer Dreifachhelixstruktur mit A durch Sequenz SA beteiligen kann, und ein Segment B2, das zur weiteren Hybridisierung in der Lage ist, sich optional an einer Dreifachhelixstruktur beteiligen kann, und wobei das Molekül C ein erstes Segment C1 enthält, das an Segment B2 binden kann, und ein zweites Segment C2, das Segment B1 einer weiteren Sonde B binden kann, wobei die Sondenmoleküle auf alternative Weise eingebaut sein können.