DE69432419T2 - Ein elektrochemiluminescenter nachweis von nukleinsäuren auf basis der selbsttragenden sequenzreplikation - Google Patents

Ein elektrochemiluminescenter nachweis von nukleinsäuren auf basis der selbsttragenden sequenzreplikation Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zum Amplifizieren einer spezifischen Nukleinsäuresequenz und deren schneller Detektion und Quantifizierung unter Verwendung elektrochemolumineszent markierter Bindungsspezies.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Detektion und Quantifizierung einer in einer Probe vorhandenen spezifischen Nukleinsäuresequenz ist ein bekanntes diagnostisches Verfahren mit großer Spezifizität. Diese Spezifizität basiert auf dem Wissen um die spezifische Sequenz und die Erzeugung von Sonden, die spezifisch und komplementär sind.
  • Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von spezifischen Nukleinsäuresequenzen werden durch die folgenden Patente veranschaulicht: (1) US-Patent Nr. 5,130,238 richtet sich auf ein verbessertes Verfahren zum Amplifizieren einer spezifischen Nukleinsäuresequenz. Die Verbesserung des Amplifikationsverfahrens involviert den Zusatz von Dimethylsulfoxid (DMSO) alleine oder in Kombination mit Rinderserumalbumin (BSA); (2) das US-Patent Nr. 4,683,195 richtet sich auf ein Verfahren zum Amplifizieren und Detektieren einer Nukleinsäure-Zielsequenz, enthalten in einer Nukleinsäure oder einer Mischung derselben; (3) das US-Patent Nr. 4,683,202 betrifft ein Verfahren zum Amplifizieren einer gewünschten spezifischen Nukleinsäuresequenz, die in einer Nukleinsäure oder einer Mischung derselben enthalten ist; (4) das US-Patent Nr. 4,486,539 richtet sich auf ein Verfahren zum Identifizieren von Nukleinsäuren über einen einstufigen Sandwich-Hybridisierungstest; und (5) die WO 91/02814 richtet sich auf ein Verfahren zum Amplifizieren einer spezifischen Nukleinsäuresequenz.
  • Die Verwendung von hochspezifischen Nukleinsäuresonden ist in einigen Fällen das einzige Verfahren, das akkurate Ergebnisse erzielt, wenn das Protein fehlt, wie dies für die Analyse von Gendefekten wie der cystischen Fibrose zutrifft. Es ist ebenfalls in Fällen einer latenten Virusinfektion wie mit HIV1 oder Herpes wertvoll, wo durch die Infektion wenig oder kein Protein erzeugt wird. Die große Spezifizität der Nukleinsäuresonden macht diese auch in der Diagnose von infektiösen Mitteln wertvoll, die schwierig mit Antikörpern zu identifizieren sind, und zwar auf Grund von Kreuzreaktionen und dem Fehlen von Kreuzreaktionen zwischen Isotypen dieser Mittel. Zusätzlich gestattet die Analyse von DNS-Sequenzen die schnelle und effektive Selektion einer Sonde, die spezifisch sein wird. Dies ist mit antikörper-basierten Reagenzien nicht möglich.
  • Die größte Schwierigkeit und Einschränkung in der Anwendung der existierenden Nukleinsäuresondentechnologie ist die Komplexität und die langsame Methode zum Detektieren der spezifischen Sequenzen. Mit der Amplifikation von Nukleinsäuren sind die Einschränkungen der Nukleinsäuresondenverfahren, die mit geringen Konzentrationen an Zielmolekülen assoziiert waren, gelöst worden, und zwar in den oben identifizierten US-Patenten Nrn. 5,130,238; 4,683,195; 4,683,202.
  • Die Verwendung einer natürlichen Amplifkation ist in einigen Fällen zur Überwindung dieses Problems genutzt worden. Dies wird durch die Verwendung von ribosomaler RNS mit bis zu 100.000 Kopien pro Zelle beispielhaft gezeigt, wie im US-Patent Nr. 4,851,330 gelehrt. Dieses Verfahren nutzt ein schnelles Chemolumineszenz-Detektionssystem, um, ohne das infektiöse Mittel kultivieren zu müssen, effektiv zu sein, welches System eine Anzahl an Inkubationen und Waschschritten erfordert. Dieses Verfahren ist jedoch ebenfalls nur auf ausgewählte zelluläre Pathogene eingeschränkt und kann im Fall von viralen oder genetischen Defekten nicht angewandt werden.
  • Die WO 93/10267 beschreibt ein Verfahren zum Detektieren einer interessierenden Nukleinsäuresequenz im Amplifikationsprodukt einer Polymerasekettenreaktion oder einer anderen primer-dirigierten Reaktion. Genauer enthält die beschriebene Amplifikationsmischung mindestens eine Nukleotidsequenz, die der interessierenden Nukleinsäuresequenz komplementär ist und die entweder am 3'-Ende oder am 3'- und 5'-Ende mit einer Verbindung markiert worden ist, die zur Elektrochemolumineszenz befähigt ist. Die Elektrochemolumineszenz des markierten amplifizierten Produkts wird dann detektiert.
  • Die WO 93/12245 beschreibt ein Verfahren zur exponentiellen Amplifikation einer Nukleinsäure unter Anwendung eines einzelnen nicht gepaarten Primers. Der Primer kann mit einem detektierbaren Marker wie einem elektrochemolumineszenten Molekül markiert sein.
  • Ungeachtet der im Stand der Technik offenbarten Amplifikationsprozesse erfordert die vorliegende Erfindung keine Vorbehandlung der Probe, wie die Bindung an Festphasen oder Membranen, das Denaturieren der Probe, die Reinigung der Probe mittels Extraktion von Öl, Protein oder mittels Gelelektrophorese, und kann die Sonde dem Amplifikationsgemisch direkt zugesetzt, hybridisiert und analysiert werden. Dies war im Hinblick auf die Möglichkeit, dass die Sondensequenzen modifiziert würden oder eine Zerstörung der Probe verursachen würden, vermittelt durch die Enzyme und Bedingungen in dem Amplifikationsgemisch, überraschend. Beispielsweise zersetzt die Anwesenheit der RNAase H die Hybride zwischen DNS und RNS (die Grundlage der Sondenhybridisierung) abdaut, die spezifischen Hybride in jedem Versuch, das unreine Amplifikationsgemisch zu sondieren. Ebenfalls würde die Anwesenheit der reversen Transkriptase die Sonden im Hybridisierungsgemisch als Primer nutzen und diese aus der spezifischen Reaktion der Hybridisierungskomplexbildung entfernen. Zusätzlich zu diesen möglichen Problemen enthält der Puffer viele Komponenten, die Probleme sowohl für die Hybridisierung und auch für die Erzeugung von ECL über die spezifisch involvierte Chemie verursachen könnten, beispielsweise hohe Konzentrationen der Salze MgCl2, KCl, an Nukleotiden, Dithiothreitol, Spermidin, Dimethylsulfoxid, Glycerol und Proteinen. Diese Liste enthält zahlreiche Substanzen, die mit anderen Nukleinsäure-Sondenmethoden interferieren, und diese müssten entfernt werden, damit diese Verfahren arbeiten können; somit war die vorliegende Erfindung überraschenderweise zur Durchführung eines Nukleinsäure-Sondentests über ein einfaches Protokoll befähigt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt ein Verfahren zur Detektion einer spezifischen Nukleinsäuresequenz, umfassend die Schritte:
    • (a) Zusetzen einer Probe, von der man annimmt, dass sie die spezifische Nukleinsäuresequenz enthält, zu einer Reagenzmischung zur Bildung eines Reaktionsgemisches, wobei die Reagenzmischung umfasst:
    • (i) einen ersten Oligonukleotidprimer;
    • (ii) einen zweiten Oligonukleotidprimer;
    • (iii) eine DNS-dirigierte RNS-Polymerase,
    • (iv) eine RNS-dirigierte DNS-Polymerase;
    • (v) eine DNS-dirigierte DNS-Polymerase;
    • (vi) eine Ribonuklcase, die die RNS eines RNS/DNS-Hybrids hydrolysiert, ohne einzel- oder doppelsträngige RNS oder DNS zu hydrolysieren; worin der erste oder zweite Oligonukleotidprimer einen Promoter oder eine Antisense-Sequenz eines Promoters umfasst und worin der Promoter von der DNS-dirigierten RNS-Polymerase erkannt wird, und worin der erste oder zweite Oligonukleotidprimer wahlweise mit einer Bindungsspezies oder einer elektrolumineszenten (ECL) Spezies markiert ist, oder worin das Reaktionsgemisch wahlweise Nukleotide umfasst, markiert mit einer Bindungsspezies oder einer ECL-Spezies, in ausreichender Menge, um amplifizierte Zielmoleküle zu erzeugen, markiert mit der Bindungsspezies oder der ECL-Spezies;
    • (b) Inkubieren des Reaktionsgemisches für eine ausreichende Zeit, um die spezifische Nukleinsäuresequenz zur Bildung eines amplifizierten Nukleinsäuresequenzgemisches, enthaltend die amplifizierte Nukleinsäuresäuresequenz, zu amplifizieren;
    • (c) Erhalten einer Probe aus dem amplifizierten Nukleinsäuresequenzgemisch,
    • (d) Zusetzen der folgenden Reagenzien zu der Probe aus dem amplifizierten Nukleinsäuresequenzgemisch:
    • I) mindestens einer ersten Sonde einer Sequenz komplementär zu der amplifizierten Nukleinsäuresequenz, worin:
    • (i) dann, wenn ein Primer oder ein Nukleotid, markiert mit einer Bindungsspezies, in Schritt (a) als Einfangsonde vorhanden ist, die erste Sonde mit einer ECL-Spezies markiert ist; oder
    • (ii) dann, wenn ein Primer oder ein Nukleotid markiert mit einer ECL-Spezies in Schritt (a) vorhanden ist, die erste Sonde eine Einfangsonde ist, markiert mit einer Bindungsspezies; oder
    • (iii) dann, wenn die Primer oder Nukleotide aus Schritt (a) nicht mit einer ECL-Spezies oder einer Bindungsspezies markiert sind, die erste Sonde mit einer ECL-Spezies markiert ist und mindestens eine Einfangsonde, markiert mit einer Bindungsspezies, vorhanden ist, worin die Einfangsonde eine Sequenz komplementär zur amplifizierten Nukleinsäuresequenz aufweist; und
    • II) ein Kügelchen, beschichtet mit einem Bindungspartner für die Einfangsonde, um ein zweites Gemisch zu bilden;
    • (e) Inkubieren des zweiten Gemisches für ausreichende Zeit, um die Hybridisierung zwischen Sonde(n) und amplifizierter Nukleinsäuresequenz zu gestatten, um einen Komplex zu bilden, und um das Einfangen des Komplexes auf den Kügelchen zu gestatten; und
    • (f) Detektieren des an die Kügelchen gebundenen Komplexes unter Verwendung der ECL-Spezies.
  • Die Erfindung betrifft ein Diagnoseverfahren zur Detektion spezifischer Nukleinsäuresequenzen, die über Amplifikation erzeugt wurden, das schnell ist, weniger Schritte aufweist und weniger Anwenderzeit als herkömmliche diagnostische Verfahren erfordert. Die Amplifikation läuft bei einer relativ konstanten Temperatur ab, wobei eine Vielzahl an einzelsträngigen RNS-Spezies erzeugt wird. Die Hybridisierung an Sonden folgt dieser Amplifikation und wird bei einer relativ konstanten Temperatur durchgeführt, gefolgt von Analyse auf gebundene oder komplexierte elektrochemolumineszente Spezies. Somit ist das Diagnoseverfahren sowohl schnell als auch elektrochemolumineszent empfindlich, anders als andere Systeme, die zahlreiche Inkubationszyklen und mehrere Waschungen erfordern, gefolgt von mehreren Inkubationen zur Detektion der Nukleinsäure.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Amplifizieren einer spezifischen Nukleinsäuresequenz angewandt, gefolgt vom Zusatz von zwei Oligonukleotidsonden, eine mit einer Bindungsspezies, die Einfangsonde (das heißt Biotin oder Antigen) und eine mit einem elektrochemolumineszenten Marker.
  • Das Verfahren involviert die Synthese von einzelsträngiger RNS, einzelsträngiger DNS und doppelsträngiger DNS. Die einzelsträngige Antisense-RNS ist ein erstes Template für einen zweiten Primer. Die einzelsträngige DNS ist ein zweites Template für einen ersten Primer. Die doppelsträngige DNS ist ein drittes Template für die Synthese einer Vielzahl von Kopien des ersten Templates. Eine Sequenz des ersten oder des zweiten Primers ist einer Sequenz der spezifischen Nukleinsäuresequenz ausreichend komplementär und eine Sequenz des ersten oder zweiten Primers ist einer Sequenz der spezifischen Nukleinsäuresequenz ausreichend homolog. Ein zweiter Primer bindet an das 3'-Ende des ersten RNS-Templates und erzeugt das zweite DNS-Template. Ein 3'-Ende des ersten Primers hybridisiert an das 3'-Ende des zweiten DNS-Templates. Das zweite Template wird vom ersten Template entfernt und zur Erzeugung eines komplementären DNS-Strangs genutzt. Die resultierende Duplex-DNS dient als drittes Template zum Synthetisieren einer Vielzahl von ersten Templates, die wiederum den oben beschriebenen Zyklus wiederholen. Dieses Amplifikationsverfahren ist genauer in den folgenden Publikationen beschrieben: Kievits et al., 35, J. Vir. Method, 273–286 (1991); Bruisten et al., 9 AIDS Res. and Human Retroviruses, 259–265 (1993); EP-A-0 329 822; WO 91/02818; WO 91/02814 (ein im Wesentlichen vergleichbares Verfahren ist auch in der WO 88/10315 beschrieben). Nach Abschluss der Inkubation, wie oben beschrieben, werden Proben aus der Amplifikation entnommen und eine Mischung von komplementären Sonden und Kügelchen, beschichtet mit einer Bindungsspezies komplementär zu einer der Sonden im Hybridisierungspuffer, wird zugesetzt, gefolgt von Inkubation bei einer vorbestimmten Temperatur, um die Hybridisierung der Sonden an das erste Template und die Bindung einer der Sonden an die Kügelchen über eine Bindungsreaktion, das heißt Antikörper/Antigen oder Biotin/Streptavidin, zu gestatten. Bei Abschluss der Inkubation hat sich ein Komplex gebildet, der das erste Template, erzeugt aus der Amplifikationsreaktion, wie oben, hybridisiert an zwei unterschiedliche Sonden umfasst, von denen eine einen elektrochemolumineszenten Marker enthält und die andere eine Bindungsspezies. Dieser Komplex ist zusätzlich mit dem beschichteten Kügelchen komplexiert, das sein komplementäres Bindungspaar mit der Sonden-Bindungsspezies bildet. Der resultierende Komplex enthält das amplifizierte erste Template, die Sonde mit ihrem elektrochemolumineszenten Marker, die Einfangsonde mit ihrer Bindungsspezies und das Kügelchen mit seiner Beschichtung an Bindungsspezies (siehe 1), alle komplexiert über die spezifischen Wechselwirkungen jeder Komponente. Es ist ebenso zu verstehen, dass die während des NASBA-Cyclings erzeugten DNS-Sequenzen Ziele für die Hybridisierung und Detektion darstellen werden.
  • In einer anderen Ausführungsform der beanspruchten Erfindung kann die Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Kügelchen vor dem Hybridisierungsschritt durch Bildung einer kovalenten Bindung an das Kügelchen oder Bindungsspezies-Wechselwirkung (wobei die Bindungsspezies entweder über kovalente oder nicht kovalente Verfahren aufgeschichtet ist) oder indirekt über eine kovalente Bindung an eine Spezies, die das Kügelchen nicht kovalent beschichten kann, erfolgen. Ein Beispiel für diese indirekte kovalente Beschichtung kann die Form annehmen, dass die Sonde an einen Träger wie ein Protein gekoppelt ist, gefolgt vom Aufschichten über nicht kovalente Methoden auf die Kugeloberfläche.
  • In einer anderen Ausführungsform werden die Proben der Amplifikation mit einer ECL-Spezies markierten Sonde und einem Kügelchen gemischt, das mit einer Bindungsspezies für das zwischen der Sonde und dem amplifizierten ersten Template gebildete Hybrid beschichtet ist. Beispielsweise kann ein Hybrid aus DNS und RNS unter Anwendung eines spezifischen Antikörpers eingefangen werden. Ein Beispiel wäre die Anwendung eines Anti-DNS/RNS-Antikörpers (US-Patent Nr. 4,833,084, übertragen an Miles Inc.). Andere Antikörper, die solche gemischten Hybridmoleküle erkennen, würden sich ebenfalls als wertvoll erweisen, wie diejenigen Antikörper, die gegen Hybride aus RNS oder DNS, gegen Phosphonat, Phosporothioat, Alkyl- oder Arylphnsphonat basierte Nukleinsäuresequenzen gezogen wurden (Murakami et al., 24, Biochemistry, 4041-4046 (1985), auch erhältlich von Glenn Research, Sterling, Virginia). Diese Verfahren basieren auf der Bildung einer neuen molekularen Spezies bei Hybridisierung, bei der es sich um eine Bindungsspezies für einen Antikörper handelt, und das Ziehen von Antikörpern oder anderen Bindungsspezies gegen diese molekulare Spezies.
  • In noch einer anderen Ausführungsform kann das Testverfahren auch zum Quantifizieren der Menge an Nukleinsäure im Ausgangsmaterial verwendet werden. Dieses wird durch den Zusatz von spezifischen "Zusatz"-Proben zur Probe erzielt, die während der Reaktion amplifiziert werden. Die Bestimmung des "Zusatz"-Signals und des Probensignals gestattet die Berechnung eines Verhältnisses, das auf der ursprünglichen "Zusatz"-Konzentration beruht, und die Bestimmung der Probenkonzentration gestattet. Diese wird genauestens über die Anwendung mehrerer "Zusätze" ermittelt, die hinsichtlich ihrer Menge über den Bereich der möglichen Probenmengen erstreckt sind und die Erstellung einer Standardkurve zur Ablesung eines Verhältnisses von 1 : 1 zwischen Ziel und Probe gestatten. Hierauf beruhende Verfahren sind wohl verstanden (Van Gemen et al., 43, J. Vir. Methods, 177–187 (1993); Siebert und Larrick, 14, Biotechniques, 244–249 (1993); Piatak et al., 14, Biotechniques, 70–80 (1993)). Dieses Quantifizierungsverfahren wird durch die Verwendung eines schnellen und genauen Verfahrens zum Detektieren und zur Quantifikation verbessert, das durch die Verwendung der ECL-Marker und Verfahren mit der NASBA-Amplifikation bereitgestellt wird.
  • Die Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren für die Detektion einer spezifischen Nukleinsäuresequenz bereit, umfassend die Schritte:
    • (a) Bereitstellen eines einzelnen Reaktionsmediums, enthaltend Reagenzien, umfassend:
    • (i) einen ersten Oligonukleotidprimer,
    • (ii) einen zweiten Oligonukleotidprimer, umfassend eine Antisensesequenz eines Promotors,
    • (iii) eine DNS-dirigierte RNS-Polymerase, die den Promotor erkennt,
    • (iv) eine RNS-dirigierte DNS-Polymerase,
    • (v) eine DNS-dirigierte DNS-Polymerase,
    • (vi) eine Ribonuklease, die RNS aus einem RNS/DNS-Hybrid hydrolysiert, ohne einzel- oder doppelsträngige RNS oder DNS zu hydrolysieren,
    • (b) Bereitstellen in dem Reaktionsmedium von RNS, umfassend ein erstes RNS-Template, das die spezifische Nukleinsäuresequenz oder eine der spezifischen Nukleinsäuresequenz komplementäre Sequenz umfasst, unter solchen Bedingungen, dass sich ein Zyklus anschließt, worin
    • (i) der erste Oligonukleotidprimer an das erste RNS-Template hybridisiert,
    • (ii) die RNS-dirigierte DNS-Polymerase das erste RNS-Template nutzt, um ein zweites DNS-Template über Verlängerung des ersten Oligonukleotid-primers zu synthetisieren und dadurch ein RNS/DNS-Hybridintermediat bildet;
    • (iii) die Ribonuklease RNS hydrolysiert, die das RNS/DNS-Hybridintermediat ausmacht,
    • (iv) der zweite Oligonukleotidprimer an das zweite DNS-Template hybridisiert,
    • (v) die zweite DNS-dirigierte DNS-Polymerase den zweiten Oligonukleotidprimer als Template nutzt, um den Promotor mittels Verlängerung des zweiten DNS-Templates zu synthetisieren; und
    • (vi) die DNS-dirigierte RNS-Polymerase den Promotor erkennt und das zweite DNS-Template transkribiert, wodurch Kopien des ersten RNS-Templates bereitgestellt werden; und anschließend
    • (c) Beibehalten der Bedingungen für ausreichende Zeit, um eine gewünschte Amplifikation der spezifischen Nukleinsäuresequenz zu erzielen, gefolgt vom Zusatz von:
    • (i) mindestens einer Sondensequenz, komplementär dem ersten RNS-Template, markiert mit einer elektrochemolumineszenten Spezies,
    • (ii) mindestens einer zweiten Einfangsondensequenz, komplementär dem ersten RNS-Template, markiert mit einer Bindungsspezies,
    • (iii) einem Kügelchen, beschichtet mit einer komplementären Bindungsspezies zu der zweiten Sondensequenz; und anschließend
    • (d) Bereitstellen von Bedingungen an Temperatur und Puffer, um die Hybridisierung der Sonden an das erste RNS-Template und die Bindung der Bindungsspezies auf der zweiten Einfangsonde mit der komplementären Bindungsspezies auf dem Kügelchen zur Bildung eines kügelchen-gebundenen Komplexes zu gestatten; und anschließend
    • (e) Detektieren des kügelchen-gebundenen Komplexes unter Anwendung der elektrochemolumineszenten Spezies.
  • Die Erfindung stellt zusätzlich bereit ein Verfahren für die Detektion von amplifizierten Produkten, umfassen die Schritte:
    • (a) Amplifizieren einer Proben-Nukleinsäure unter Bedingungen zur Erzeugung eines amplifizierten Produkts;
    • (b) Mischen des amplifizierten Produkts mit zwei Bindungsspezies, umfassend
    • (i) eine ECL-markierte Bindungsspezies, die mit einem trimolekularen Komplex mit der amplifizierten Nukleinsäure und einer bivalenten Bindungsspezies wechselwirkt;
    • (ii) eine bivalente Bindungsspezies, die mit einem trimolekularen Komplex der amplifizierten Nukleinsäure und der ECL-markierten Bindungsspezies wechselwirkt; zur Bildung einer Bindungskomplexreaktion;
    • (c) Inkubieren der Bindungskomplexreaktion unter Bedingungen, welche die Bildung eines trimolekularen Komplexes aus amplifiziertem Produkt, ECL-markierter Bindungsspezies und bivalenter Bindungsspezies gestatten;
    • (d) Einfangen des trimolekularen Komplexes über die verbleibende Bindungsstelle der bivalenten Bindungsspezies auf einer festen Phase; und
    • (e) Quantifizieren des auf der festen Phase gefangenen ECL-Markers.
  • Detinitionen
  • Um die Erfindung klarer zu verstehen, werden bestimmte Ausdrücke wie folgt definiert:
    "Amplifiziertes Produkt" meint Nukleinsäuresequenzen, die durch Kopieren von Proben-Nukleinsäuresequenzen viele Male unter Anwendung einer enzymatischen Reaktion erzeugt wurden.
  • "Annealing" bezieht sich auf die Hybridisierung zwischen komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuren, wenn die Temperatur einer Lösung, umfassend die einzelsträngigen Nukleinsäuren, unter die Schmelz- oder Denaturierungstemperatur gesenkt wird.
  • Eine "Bindungsspezies" meint jede Spezies, von der bekannt ist, dass sie an andere molekulare Spezies bindet, und ist normalerweise als ein Paar an Spezies definiert, kann jedoch auch aus höheren Komplexen, das heißt drei oder vier, gebildet werden, die binden, beispielsweise Antikörper/Antigen oder Oligonukleotid/Antikörper oder Oligonukleotid/Antigen oder DNS/DNS oder DNS/RNS oder RNS/RNS oder DNS/RNS/DNS oder Biotin-DNS/ECLmarkierte DNS oder Rezeptor/Ligand oder DNS-Bindungsprotein wie Restriktionsenzyme, lac-Repressor.
  • Bei dem "Komplement" zu einer ersten Nukleinsäuresequenz handelt es sich bekanntermaßen um eine zweite Sequenz, umfassend diejenigen Basen, die über Watson-Crick-Hybridisierung mit der ersten Sequenz paaren. Somit stellt das Komplement zur Desoxyribonukleinsäuresequenz (DNS-Sequenz) 5'-ATGC-3' bekanntermaßen 5'-GCAT-3' dar. Für Duplizes oder doppelsträngige DNS werden die beiden Stränge als einander komplementär oder als ein komplementäres Paar beschrieben. Die Ausdrücke Komplement und Antikomplement können ebenfalls verwendet werden. Unter Bezugnahme auf die Identifizierung des Stranges der Duplex-DNS, aus dem die RNS-Transkription erfolgt, wird der Transkriptionsstrang üblicherweise als Plus und sein Komplement als Minus ("+" und "-") bezeichnet, oder der Transkriptionsstrang kann als Sensestrang und sein Komplement als Antisense bezeichnet werden. Zwei aneinander hybridisierte Stränge, wobei alle Basenpaare komplementär sind, sind 100% komplementär zueinander. Zwei Stränge, die hybridisiert aneinander 5% nicht komplementäre Basen aufweisen, sind 95% komplementär (oder die zwei Stränge weisen eine Komplementarität von 95% auf). Zusätzlich ist zu verstehen, dass Nukleinsäuresequenzen dreifach helikale Strukturen auf Basis einer spezifischen Wechselwirkung dreier Stränge bilden können, die als in spezifischer Weise zueinander komplementär innerhalb dieses dreisträngigen Hybrids betrachtet würden.
  • Die Ausdrücke "Detektion" und "Quantifizierung" werden als "Messungen" bezeichnet, wobei zu verstehen ist, dass die Quantifizierung die Herstellung von Referenzzubereitungen und Kalibrierungen erfordern kann.
  • Eine "elektrochemolumineszente Spezies (ECL-Spezies)" meint jede Verbindung, von der bekannt ist, dass sie elektrochemolumineszent ist;
    "Elektrochemolumineszente Marker (ECL-Marker)" sind diejenigen, die lumineszent Spezies werden, wenn sie elektrochemisch beeinflusst werden.
  • Elektrochemolumineszenztechniken sind eine Verbesserung der Chemolumineszenztechniken. Sie stellen eine empfindliche und genaue Messung der Anwesenheit und Konzentration eines interessierenden Analyten bereit. In einer solchen Technik wird die Probe einer voltametrischen Arbeitselektrode ausgesetzt, um die Lumineszenz zu triggern. Das von dem Marker erzeugte Licht wird gemessen und zeigt die Anwesenheit oder Quantität des Analyten an. Solche ECL-Techniken sind beschrieben in der veröffentlichten PCT-Anmeldung von Bard et al., PCT-Anmeldenummer US 85/02153, mit dem Titel "Luminescent Metal Chelate Labels and Means for Detection", und von Massey et al., PCT-Anmeldenummer US 87/00987, mit dem Titel "Electrochemiluminescent Assays"; PCT-Anmeldung Nr. US 88/03947, Veröffentlichungsnummer WO 89/04302 "Electrochemiluminescent Moieties and Methods for Their Use"; Hall et al., "Method and Apparatus for Conducting Electrochemiluminescent Measurements"; US-Anmeldung Seriennummer 744,890, eingereicht 14. August 1991; und Zoski und Woodward "Apparatus for Conducting Measurements of Electrochemiluminescent Phenomena", PCT/US 89/04854, entsprechend der anhängigen EP-Anmeldung Nr. 89/912913.4, Veröffentlichungsnummer 0441880.
  • Beispiele für ECL-Tags sind die "Tags NHS (N-Hydroxy-Succinimid) und der Phosphoramidit-Tag. Der Tag-NHS-Ester ist zum Markieren von Substanzen geeignet, enthalt freie Aminogruppen, die zur Reaktion mit dem NHS-Ester zur Bildung einer Amidbindung befähigt sind (siehe beispielsweise WO 86/02734). Der Phosphoramidit-Tag (Gudibande et al., US-Anmeldung Seriennummer 805,537 mit dem Titel "Improved Electrochemiluminescent Label for DNA Probe Assay") ist zum Markieren von Substanzen geeignet, enthaltend freie Amino-, Sulphydryl- oder Hydroxylgruppen, die Phosphorbindungen, insbesondere Phosphordiesterbindungen bilden.
  • Ein "ECL-Testpuffer" ist im Allgemeinen ein Verdünner, der Tripropylamin enthält, das für die elektrochemische Reaktion auf der Elektrode in einem ECL-Analysegerät erforderlich ist.
  • Ein "ECL-Verdünner" ist ein verdünnendes Reagenz, das in Verdünnungslösungen genutzt wird, enthaltend labile Biomoleküle, und zwar für Lagerzwecke.
  • Eine "ECL-Vorrichtung" ist jede Vorrichtung zur Durchführung von Tests auf Basis der Elektrochemolumineszenz. Solche ECL-Vorrichtungen sind beschrieben in der PCT-Anmeldung Nr. US 85/02153 von Bard et al., betitelt "Luminescent Metal Chelate Labels and Means for Detection", und in der PCT-Anmeldung Nr. US 87/00987 von Massey et al., betitelt "Electrochemiluminescent Assays"; PCT-Anmeldung Nr. US 88/03947, Veröffentlichungsnummer WO 89/04302 "Electrochemiluminescent Moities and Methods for Their Use"; Hall et al., "Method and Apparatus for Conducting Electrochemiluminescent Measurements", US-Anmeldung der Seriennummer 744,890; und G. Zoski und S. Woodward "Apparatus for Conducting Measurements of Electrochemiluminescent Phenomena", PCT/US 89/04854, entsprechend der anhängigen EP-Anmeldung Nr. 89/912913.4, Veröffentlichungsnummer 0441880.
  • Die "Homologie" zwischen Polynukleotidsequenzen bezieht sich auf das Maß der Sequenzähnlichkeit zwischen den jeweiligen Sequenzen. Zwei Stränge, die einander hinsichtlich der Sequenz identisch sind, verfügen über 100% Sequenzhomologie. Zwei Stränge, die sich in 5 % der Sequenzen unterscheiden, verfügen über 95% Sequenzhomologie. Je höher das Maß der Homologie zwischen zwei Strängen A und B, desto größer die Komplementarität zwischen A und dem Komplement von B.
  • Die "Hybridisierung" beschreibt die Bildung von doppelsträngigen oder Duplex-Nukleinsäuren aus komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuren. Die Hybridisierung kann zwischen ausreichend komplementärer einzelsträngiger DNS und/oder RNS erfolgen, um zu bilden:
    DNS/DNS, DNS/RNS oder RNS/RNS oder DNS/RNS/DNS oder Biotin-DNS/RNS/ECL-Marker-DNS. Dieses kann auch Sequenzen von Nukleotiden umfassen, die unter Anwendung modifizierter natürlicher Chemie miteinander verknüpft sind wie Nukleinsäuresequenzen auf Basis von Phosphonaten, Phosphorothioaten, Alkyl- oder Arylphosphonaten (Murakami et al., Biochemistry 24 (1985): 4041–4046, außerdem Glenn Research, Sterling, Virginia).
  • Der Ausdruck "Marker" oder "markiert", wenn er auf eine Nukleinsäure angewendet wird, meint, dass die tragliche Nukleinsäure mit einer Einheit verknüpft ist, die über ihre Eigenschaften detektiert werden kann, die umfassen können: ECL und Lumineszenz, Katalyse eines identifizierenden chemischen Substrats, Radioaktivität oder spezifische Bindungseigenschaften. Somit schließt der Ausdruck "Marker" Ligandeneinheiten ein, solange nicht anders angegeben.
  • Es ist ebenfalls im Stand der Technik wohl bekannt, dass der Ausdruck "Nukleinsäure" sich auf ein Polynukleotid jeglicher Länge bezieht, eingeschlossen DNS- oder RNS-Chromosomen oder Fragmente derselben, mit oder ohne modifizierte Basen, wie hierin beschrieben.
  • Ein "Nukleotid" ist mindestens eine der folgenden Basen: Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin oder Uracil, plus einem Zucker (Desoxyribose für DNS, Ribose für RNS), plus ein Phosphat. Um Monomere für die DNS-Polymerisationsreaktion bereitzustellen, sind typischerweise alle vier der Desoxynukleotidtriphosphate erforderlich. Ein Nukleotid, wie hierin definiert, kann auch modifizierte Basen umfassen wie 5-Methyl-dCTP und 7-Deaza-dGTP, die zur Verbesserung der Wirkung einer Polymerase auf den Templates eingesetzt werden. Der Ausdruck Nukleotid, wie er hierin verwendet wird, umfasst auch Basen, verbunden mit Biotin und Digoxigenin (Digoxigenin-11-UTP von Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) und Biotin-21-UTP und Amino-7-dUTP (Clontech, Palo Alto, California) und ECL-markierte Nukleotide (siehe die 6 und 7), die direkt in einen Primer oder in ein Primer-Verlängerungsprodukt während der Amplifikation eingebaut werden können, um für die selektive Bindung von amplifizierten Sequenzen zu sorgen.
  • Ein "Oligonukleotid" ist eine aus mindestens zwei Nukleotiden gebildete Sequenz.
  • Ein "Polynukleotid" ist ein langes Oligonukleotid und kann sowohl RNS als auch DNS sein.
  • Während der Ausdruck "Oligonukleotid" im Stand der Technik im Allgemeinen zur Bezeichnung kürzerer Nukleinsäureketten benutzt wird, und der Ausdruck "Polynukleotid" im Allgemeinen im Stand der Technik zur Bezeichnung längerer Nukleinsäureketten, eingeschlossen DNS- oder RNS-Chromosome oder Fragmente, genutzt wird, stellt die Verwendung des einen oder anderen Ausdrucks hierin keine Einschränkung oder Beschreibung der Größe dar, so lange nicht ausdrücklich angegeben.
  • Ein "Primer" ist ein relativ kurzes Segment eines Oligonukleotids, das einem Teil der interessierenden Sequenz komplementär ist (die interessierende Sequenz kann ein Unterfragment bzw. Subfragment innerhalb einer längeren Nukleinsäuresequenz sein). Der Primer stellt ein 5'-Ende des resultierenden Extensionsproduktes dar. Ein Primer, der an seinem 3'-Ende der interessierenden Sequenz auf den Templatestrang komplementär ist, ermöglicht die Einwirkung einer Polymerase auf dieses 3'-Ende bei Hybridisierung auf das Template. Es ist wohl bekannt, dass Modifikationen am 3'-Ende die Fähigkeit eines Oligonukleotids, als Primer zu fungieren, beeinflussen wird. Ein Beispiel ist der Einbau eines Didesoxynukleotids wie beim DNS-Sequenzieren, wodurch die Wirkung der DNS-Polymerasen verhindert wird. Es ist wohl bekannt, dass die Länge des Primers von der speziellen Anwendung abhängen wird, wobei jedoch 20–30 Basenpaare eine übliche Größe darstellen. Es ist wohl bekannt, dass ein Primer kein perfektes Komplement sein muss, damit eine erfolgreiche Hybridisierung abläuft. Ist der Primer ein unperfektes Komplement, wird hieraus ein Verlängerungsprodukt resultieren, dass die Primersequenz enthält, und während späterer Zyklen wird das Komplement zur Primersequenz in die Templatesequenz inkorporiert werden. Somit ist wohl bekannt, dass ein wohl gewählter Primer mit einer von derjenigen des Komplements des Templates geänderten Sequenz zur Bereitstellung der in vitro Mutagenese genutzt werden kann. Der Primer kann jegliche im Stand der Technik bekannte Nukleinsäurebasen, eingeschlossen jegliche im Stand der Technik bekannte modifizierte oder markierte Basen, wie oben definiert, enthalten, so dass das Primerverlängerungsprodukt diese Merkmale enthalten wird, um eine Trennung und Detektion des Primerverlängerungsproduktes zu gestatten. Ein Tag oder Marker, der vorteilhafterweise an einen Primer gebunden ist, kann einen ECL-fluoreszenten oder lumineszenten Tag, einen isotopischen Marker (beispielsweise ein Radioisotop oder Magnetresonanzmarker), einen Farbstoffmarker; einen Enzymmarker, eine antigenische Determinante, detektierbar durch einen Antikörper, oder eine Bindungseinheit wie Biotin enthalten, die es noch einer anderen Indikatoreinheit wie Streptavidin beschichteten Kügelchen gestattet, sich spezifisch an den Primer oder eine den Primer enthaltende Nukleinsäuresequenz anzuheften. Wenn die gemarkerten oder getagten Amplifikationsprodukte gebildet werden, können diese Amplifikationsprodukte durch die charakteristischen Eigenschaften des Tags oder Markers detektiert werden.
  • Der Ausdruck "Primerverlängerungsprodukt" beschreibt die Primersequenz zusammen mit dem Komplement zum Template, das während der Verlängerung des Primers produziert wird.
  • Eine "Sonde" ist eine einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure, die eine Sequenz komplementär zu einer interessierenden Nukleinsäuresequenz als Ziel aufweist und die ein zusätzliches Merkmal hat, das die Detektion der Sonden/Ziel-Duplex gestattet. Ein Fachmann wird verstehen, dass dann, wenn die Sonde und/oder das Ziel doppelsträngig ist, die doppelsträngige Nukleinsäure eine Strangtrennung durchlaufen muss, bevor eine Hybridisierung erfolgen kann. Falls eine dreisträngige Formation angewandt wird, ist es möglich, dass das doppelsträngige Ziel dann vor der Hybridisierung nicht in die einzelsträngige Form überführt werden muss.
  • Eine Sonde wird durch einen angehefteten Tag oder Marker detektierbar gemacht. Ein an eine Sonde angehefteter Tag oder Marker kann einen fluoreszenten, ECL- oder lumineszenten Tag, einen isotopischen Marken (beispielsweise ein Radioisotop oder magnetische Resonanz), einen Farbstoffmarker, einen Enzymmarker, eine durch einen Antikörper detektierbare antigenische Determinante oder eine Bindungseinheit wie Biotin umfassen, die es noch einer anderen Indikatoreinheit wie Streptavidin beschichteten Kügelchen gestattet, spezifisch an die Sonde anzuheften. Wenn die markierte oder Betagte Sonde/Ziel-Duplex gebildet ist, kann diese Duplex über die charakteristischen Eigenschaften des Tags oder Markers detektiert werden. Alternativ gestattet die Sonde mit ihrer Bindungseinheit, wie für die ECL-Tests in den folgenden Beispielen beschrieben, das Einfangen des markierten Ziels über Hybridisierung und Duplexbildung, was die Detektion mit Hilfe eines Markers oder anderer bekannter Mittel gestattet.
  • Eine "Probe" meint eine Mischung, enthaltend Nukleinsäuren.
  • Eine "Sequenz" (beispielsweise Sequenz, genetische Sequenz, Polynukleotidsequenz, Nukleinsäuresequenz) bezieht sich auf die tatsächlichen nummerierten Basen (beispielsweise Ribose oder Desoxyribose), die in einem Polynukleotidstrang vorhanden sind (beispielsweise gelesen in der 5'- und 3'-Richtung) und die relative Position dieser Basen zueinander.
  • Der Ausdruck "einzelner Primer" meint einen einzelnen, nicht gepaarten, spezifischen oder ausgewählten Primer, der so designed ist, dass er selektiv mit einer interessierenden Nukleinsäuresequenz als Ziel hybridisiert.
  • Die "spezifische Nukleinsäuresequenz" meint eine einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure, die man als eine Sonde nützen oder amplifizieren könnte.
  • Eine "spezifische oder ausgewählte" Nukleotidsequenz bezieht sich auf eine spezielle Sequenz, die von anderen Sequenzen unterscheidbar (beispielsweise über Hybridisierungsanalyse) ist (beispielsweise ist die spezifische Nukleotidsequenz 5'-ATGCCC-3' nicht dieselbe Sequenz wie 5'-AAGCCC-3').
  • Ein spezifischer oder ausgewählter Primer ist ein solcher, der designed ist, so dass er mit einer speziellen Templatesequenz hybridisiert, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen, indem der Primer dem 3'-Ende der Templatesequenz komplementär oder in etwa komplementär gemacht wird. Der spezifische Primer wird das gewünschte Ergebnis sogar dann selektiv erzielen, wenn die Templatesequenz als Ziel in einer Mischung von vielen anderen Nukleinsäuresequenzen vorliegt.
  • Der spezifische oder ausgewählte Primer unterscheidet sich von einem "universellen Primer", der ohne Unterschied an jede DNS-Sequenz annealen wird, an die eine komplementäre (zum Primer komplementäre) endständige Adaptersequenz angeheftet worden ist. Mit einem universellen Primer muss dafür Sorge getragen werden, die interessierende Nukleinsäuresequenz zu isolieren, oder anders das Ligationsverfahren nur auf die gewünschte DNS-Sequenz als Ziel zu richten, um das statistische Anheften des Adapters an alle vorhandenen Nukleinsäuresequenzen zu vermeiden.
  • Ein "Strang" ist eine einzelne Nukleinsäuresequenz. Somit kann eine Duplex oder ein doppelsträngiges Chromosom, Chromosomenfragment oder andere Nukleinsäuresequenz in zwei komplementäre Einzelstränge getrennt werden.
  • Die "Strangtrennung" bezieht sich auf die Umwandlung einer doppelsträngigen oder Duplex-Nukleinsäure in zwei komplementäre einzelsträngige Polynukleotide. Der Trennungsprozess kann wohl bekannte Techniken anwenden, eingeschlossen: die enzymvermittelte Trennung (beispielsweise über das Enzym Helikase), die physikalischchemische Trennung (pH, Ionenkonzentration und dergleichen) wie auch die thermische Trennung, auch bekannt als thermisches Denaturieren. Das thermische Denaturieren (das auch als "Schmelzen" bezeichnet wird) ist die Trennung eines doppelsträngigen Polynukleotids (vollständige oder teilweise Duplex) in mindestens zwei Einzelstränge an Polynukleotiden durch Erhöhen der Temperatur der dieses Pulynukleotid enthaltenden Lösung.
  • "Ausreichend komplementär" meint, dass zwei Nukleinsäuren zu einer spezifischen Wechselwirkung befähigt sind, die entweder eine primerabhängige oder template-dirigierte Synthese von DNS gestattet oder die es einer Sonde gestattet, an Nukleinsäuresequenz zu binden.
  • Ein "Template" meint beliebige Sequenzen an Nukleinsäure, auf denen eine komplementäre Kopie synthetisiert wird. Dies kann im Allgemeinen sein die DNS-zu-DNS-Replikation, die DNS-zu-RNS-Transkription oder die umgekehrte Transkription von RNS zu DNS. Ein DNS-Template stellt die Sequenzinformation für die Verlängerung des komplementären Primers über die DNS-Polymerasereaktion bereit. Ein RNS-Template kann die Sequenzinformation für die Verlängerung eines komplementären DNS-Primers über eine analoge Reaktion bereitstellen, die von dem Enzym reverse Transkriptase katalysiert wird. Es ist im Stand der Technik wohl bekannt, dass das Template in einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen Form vorliegen kann. Falls das Template in den Amplifikationsprozess in doppelsträngiger Form eintritt, wird das Template solange nicht mit seinem komplementären Primer hybridisieren, solange es nicht über den ersten thermischen Denaturierungszyklus denaturiert ist. Falls das Template in den Amplifikationsprozess bereits in der einzelsträngigen Form eintritt, wird der Primer mit seinem komplementären Template hybridisieren (beschrieben als Annealing, wenn ein Thermocycling genutzt wird), und zwar vor dem ersten thermischen Denaturierungsschritt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine allgemeine Veranschaulichung des Nukleinsäure-Hybridisierungsprozesses der Erfindung. Eine mit Biotin markierte Oligonukleotidsonde wird zusammen mit einer ECL-markierten Oligonukleotidsonde mit einer Probe gemischt, welche amplifizierte Zielmoleküle enthält, und zwar unter Bedingungen zur Bildung des gezeigten Komplexes. Die veranschaulichten Sonden binden spezifisch an distinkte Teile der amplifizierten Zielmoleküle. Das Streptavidin beschichtete Kügelchen wird separat mit dem vorgeformten Komplex umgesetzt, um einen zweiten Komplex zu bilden. Der zweite Komplex wird abgetrennt und/oder mit einer Elektrodenoberfläche (nicht gezeigt) in Kontakt gebracht, um die Lichtbildung zu induzieren.
  • 2 ist eine allgemeine Veranschaulichung eines alternativen Nukleinsäure-Hybridisierungsprozesses, worin ein biotinylierter Antikörper als Detektionshilfsmittel für den Komplex (1) aus ECL-markierter Oligonukleotidsonde und amplifiziertem Zielmolekül verwendet wird. Der Antikörper, hergestellt unter Anwendung herkömmlicher Techniken; bindet spezifisch an den Komplex aus Oligonukleotid und amplifiziertem Zielmolekül.
  • 3 ist eine allgemeine Veranschaulichung eines alternativen Nukleinsäure-Hybridisierungsprozesses, worin ein biotinyliertes Nukleotid in das amplifizierte Zielmolekül während des NAMBATM- oder eines NAMBATM-ähnlichen Amplifizierungsschrittes (siehe beispielsweise Kievitz et al, zuvor zitierte Literaturstelle) eingebaut wird, was zur Bildung des Amplifikationsgemisches führt, aus dem das Probenaliquot entnommen wird. Das gezeigte, biotinylierte, amplifizierte Zielmolekül bildet einen Komplex mit Streptavidin beschichteten Kügelchen.
  • 4 ist eine allgemeine Veranschaulichung eines alternativen Nukleinsäure-Hybridisierungsprozesses, worin die Bindungsspezies in das amplifizierte Zielmolekül über einen biotinylierten Primer eingebaut wird, der in einer der NAMBATM- oder NAMBATM-ähnlichen Amplifikationsstufen verwendet wird.
  • Fig. 5 ist eine allgemeine Veranschaulichung eines alternativen Nukleinsäure-Hybridisierungsprozesses, worin eine Oligonukleotidsonde direkt oder indirekt über eine kovalente Bindung oder eine spezifische Bindungspaareinheit an das Kügelchen gebunden ist.
  • 6 ist eine allgemeine Veranschaulichung eines alternativen Nukleinsäure-Hybridisierungsprozesses, worin der oder die ECL-Marker in das amplifizierte Zielmolekül während eines vorausgehenden Amplifikationszyklus in einem NAMBATM- oder NAMBATM-ähnlichen Prozess eingebaut wird bzw. werden.
  • 7 ist ein ECL-markiertes Nukleotid.
  • Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Amplifizieren einer spezifischen Nukleinsäuresequenz und deren schnelle Detektion und Quantifizierung. Die Amplifikation involviert die alternierende Synthese von DNS und RNS. In diesem Prozess wird einzelsträngige Antisense-(-)-RNS in einzelsträngige DNS umgewandelt, die wiederum in dsDNS umgewandelt wird und zu einem funktionalen Template für die Synthese einer Vielzahl an Kopien der ursprünglichen einzelsträngigen RNS wird. Ein erster und ein zweiter Primer werden in dem Amplifikationsverfahren genutzt. Eine Sequenz des ersten Primers oder des zweiten Primers ist einer Sequenz der spezifischen Nukleinsäuresequenz ausreichend komplementär und eine Sequenz des ersten oder des zweiten Primers ist einer Sequenz der spezifischen Nukleinsäuresequenz ausreichend homolog. Falls die spezifische Nukleinsäuresequenz doppelsträngig ist, dann können die Primer beide komplementär und homolog sein. Die Detektion der spezifischen Sequenzen, die amplifiziert werden, erfolgt durch die Anwendung von Sondensequenzen, die Hybride mit den Amplifikationsprodukten von entweder DNS oder RNS bilden. Diese Sondensequenzen sind im Allgemeinen einer Sequenz der spezifischen Nukleinsäuresequenz ausreichend komplementär, was zur Bildung eines spezifischen Hybrids führt. Diese Hybride werden anschließend durch Anwendung eines ECL-Detektionsinstruments detektiert, welches dem ECL-Marker die Erzeugung von Licht in kontrollierter Weise an der Oberfläche einer Elektrode gestattet, was wiederum dessen Detektion und Quantifizierung erlaubt (1, 2, 3, 4, 5, 6).
  • Die Tests auf diese amplifizierten Produkte können unter Anwendung einer Anzahl an Formaten erfolgen. Das bevorzugte Verfahren wendet zwei Sondenmoleküle nach dem Amplifikationsverfahren an, von denen eines mit einer Bindungsspezies (das heißt Biotin, Digoxin, Fluorescein) markiert ist, wobei die andere Sonde mit einem ECL-Marker (das heißt Ru-Chelat, Os-Chelat, Re, Rh) markiert ist. Diese Sonden werden der Probe aus der Amplifikationsreaktion zugesetzt, die eine Vielzahl an RNS-Kopien der ursprünglichen einzelsträngigen RNS oder DNS erzeugt, und sind der Vielzahl von RNS-Kopien der ursprünglichen einzelsträngigen RNS oder DNS komplementär oder ausreichend komplementär. Die Mischung aus Sonden und amplifizierter Nukleinsäure lässt man durch Steuerung der Temperatur und Pufferkomponenten hybridisieren, die für die spezifische Sonde und die Vielzahl der RNS-Kopien der ursprünglichen einzelsträngigen RNS oder DNS unter Anwendung dem Fachmann bekannter Methoden ausgewählt werden. Die Bildung dieser Hybriden gestattet die Bindung beider Sonden im selben Hybridkomplex. Diese werden anschließend aus der Inkubation mittels Zusetzen von Magnetkügelchen eingefangen, die mit einer Bindungsspezies beschichtet sind, die an die Bindungsspezies auf der Einfangsonde bindet (1). Beispielsweise kann mit Biotin auf der Sonde Streptavidin oder Avidin auf die Magnetkügelchen geschichtet werden, oder mit Digoxigenin auf der Sonde würde ein für Digoxigenin spezifischer Antikörper auf das Kügelchen geschichtet werden. Diese Mischung aus Hybridkomplex und Kügelchen würde anschließend unter Bedingungen inkubiert, von denen bekannt ist, dass sie die Bindungswechselwirkung der Bindungsspezies fördern. Diese Bedingungen zur Bindung von Bindungsspezies sind dem Fachmann wohl bekannt; beispielsweise Biotin an Streptavidin oder Avidin und Antigen/Antikörper-Wechselwirkungen.
  • Nach dem Einfangen des Hybridkomplexes auf den Magnetkügelchen kann die Probe gewaschen werden, indem man die Kügelchen über einen Magneten, der in engster Nähe zum Probenröhrchen angewandt wird, einfängt, oder man würde besser die Probe direkt auf ein ECL-Instrument bemustern, das die Magnetkügelchen und deren gebundene Komplexe einfangen würde, gefolgt von der elektrochemischen Reaktion des an die Oberfläche gebundenen ECL-Markers. Das aus dieser elektrochemischen Reaktion erzeugte Licht wird gemessen und zum Bestimmen der Menge an ECL-Marker genutzt, der einen Komplex mit dem Kügelchen gebildet hat. Diese Bestimmung der relativen Mengen an ECL-Marker, gebunden an die Kügelchen unter bestimmten Bedingungen, gestattet eine Bestimmung der Menge der Vielzahl an RNS-Kopien der ursprünglichen einzelsträngigen RNS oder DNS, die in der Amplifikation erzeugt wurden. Die Anwendung dieser Information bezüglich des Amplifikationsgrades der spezifischen DNS oder RNS gestattet die Diagnose der Proben-DNS oder -RNS für die Anwesenheit einer spezifischen DNS oder RNS als Sequenzen, welche die Anwesenheit eines Gens und/oder eines Organismus in einer Probe bestimmen.
  • Alternativ zum obigen Verfahren können wir zwei Oligonukleotide nutzen, die mit Bindungsspezies markiert sind, welche die Bildung eines Hybridkomplexes, wie oben beschrieben, gestatten, ohne dass jedoch ein ECL-Marker direkt an die Oligonukleotidsonde angeheftet ist. In diesem alternativen Format wird der ECL-Marker an den Hybridkomplex entweder vor der Hybridisierung zur Bildung des Komplexes oder danach durch Bildung eines Bindungspaarkomplexes angebunden. Beispiele für ein solches System wären die Anwendung einer Sonde, markiert mit Digoxin (Bindungsspezies oder Antigen), und einer Sonde, markiert mit Biotin (Bindungsspezies); diese zwei Sonden würden unter wohl bekannten Bedingungen einen Hybridkomplex mit der Vielzahl von RNS-Kopien der in der Amplifikation erzeugten ursprünglichen einzelsträngigen RNS oder DNS bilden. Nach der Bildung dieses Hybridkomplexes gestattet der Zusatz von mit ECL markiertem Anti-Digoxin-Antikörper (komplementäre Bindungsspezies oder spezifischer Antikörper) und mit Streptavidin (komplementäre Bindungsspezies) beschichteten Magnetkügelchen unter Bedingungen, von denen bekannt ist, dass sie die Bildung von Bindungswechselwirkungen gestatten (pH 4–9, 1 mM bis 2 M Salz, 0 bis 10% Detergenz), die Bindung des ECL-Markers an den Hybridkomplex durch Bindung von Antigen an Antikörper. Auch dieser Komplex wird auf der Oberfläche des Kügelchens über die Bindungswechselwirkung von Streptavidin an Biotin eingefangen. Der daraus resultierende vergrößerte Komplex an Sonden, hybridisiert an die Vielzahl von RNS-Kopien der ursprünglichen, in der Amplifikation erzeugten einzelsträngigen RNS oder DNS, wird anschließend über die Anwendung eines ECL-Analysegerätes analysiert.
  • Alternativ könnte die Bildung eines mit einer ECL-Spezies markierten spezifischen Komplexes durch die Anwendung einer Sondensequenz, markiert mit einer ECL-Spezies, erzielt werden, die dann, wenn sie an die Vielzahl von RNS-Kopien der in der Amplifikation erzeugten, ursprünglichen einzelsträngigen RNS oder DNS hybridisiert ist, eine Bindungsspezies bildet. Dieser Hybridkomplex oder diese Bindungsspezies wird anschließend durch Anwendung eines mit einer komplementären Bindungsspezies beschichteten Magnetkügelchens eingefangen, gefolgt von Analyse unter Anwendung eines ECL-Analysegerätes. Als Beispiele hierfür dienen Antikörper gegen DNS/RNS-Hybride (2).
  • Alternativ könnte die Amplifikation mit einer solchen Bindungsspezies erfolgen, dass die Bindungsspezies in die Vielzahl von DNS- und/oder RNS-Molekülen, die während des Amplifikationsprozesses erzeugt werden; eingebaut wird. Verfahren hierfür sind dem Fachmann wohl bekannt. Beispiele hierfür sind die Anwendung eines Primers (siehe Primer 2 im US-Patent Nr. 5,130,238), die modifiziert sind, um eine Bindungsspezies zu umfassen; dieser Primer wird anschließend in den DNS+-Strang über die Einwirkung einer reversen Transkriptase auf die RNS-Spezies und den Primer 2 eingebaut. Das DNS+-Produkt wäre eine DNS+-Spezies, kovalent gebunden an eine Bindungsspezies als Molekül. Diese DNS-Bindungsspezies als Molekül würde anschließend an eine ECL-markierte Sonde hybridisiert und zur ECL-Analyse auf Kügelchen über eine komplementäre Bindungsspezies eingefangen (4). Im selben Format könnte das DNS-Bindungsspezies-Molekül auf einem Kügelchen über Hybridisierung eingefangen werden, gefolgt von Bindung mit einer komplementären Bindungsspezies, markiert mit einem ECL-Marker, an die DNS-Bindungsspezies. Ein Beispiel der Bindungsspezies wäre Biotin und dessen komplementäre Bindungsspezies Streptavidin. Es ist selbstverständlich, dass die RNS– und DNS+ (1) mit einer Bindungsspezies markiert werden könnte durch Einschluss eines zuvor beschriebenen Nukleotids in die Amplifikationsreaktion, das modifiziert wurde, um eine Bindungsspezies, beispielsweise Biotin und Digoxigenin (Digoxigenin-11-UTP von Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) und Biotin-21-UTP und Amino-7-dUTP (Clontech, Palo Alto, California) und ECL-markierte Nukleotide (7) zu enthalten. Die resultierenden DNS+– oder RNS-Bindungsspezies als Moleküle können anschließend in den oben beschriebenen Testformaten eingesetzt werden (3).
  • Bei den Kügelchen, die in diesen Tests verwendet werden können, handelt es sich typischerweise um diejenigen von Dynal M450 und M280, beschichtet mit Streptavidin, andere Kügelchen können jedoch verwendet werden, solange die Kügelchen paramagnetisch sein können und in einem Größenbereich von 0,5 μm bis 10 μm liegen. Es ist für den Fachmann verständlich, dass das Einfang-Oligonukleotid an diese Kügelchen gekuppelt werden kann, was den Bedarf für eine Bindungsspezies ausschaltet (5).
  • Nachdem die Erfindung nun im Allgemeinen beschrieben worden ist, werden die folgenden Beispiele zum Zwecke der Veranschaulichung gegeben und sollen den Bereich der Erfindung nicht einschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Olionukleotidsynthese und Markierung
  • Die Oligonukleotide wurden auf einem automatischen Oligonukleotidsynthesegerät von Applied Biosystems (San Jose, California) hergestellt unter Anwendung der β-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie (Beaucage und Caruthers, 22, Tetrahedron Lett., 1859–62 (1982)). Die Oligonukleotid-Aminomodifikationen am 5'-Ende traten im letzten Kupplungsschritt auf. Clontech (San Diego, California) stellte die Aminomodifikatoren bereit (siehe US-Patent 5,141,813). Die resultierenden 5'-modifizierten Oligonukleotide enthielten alle einen Spacerarm mit sechs Kohlenstoffen an der Aminogruppe, bezeichnet als (C6, NH2).
  • Alle synthetischen Oligonukleotide wurden gereinigt, um jegliche kontaminierenden Aminogruppen zu entfernen, mittels Gelfiltration auf einer BIOGELTM-P6-Säule (Bio-Rad Labs, Richmond, California). Biotin wurde über die 5'-Aminogruppe der Oligonukleotide unter Anwendung von NHS-Biotin eingeführt (Clontech, San Diego, California). Der Tag-NHS-Ester-Marker (ein NHS-Ester des Ru-Trisbipyridyl-Komplexes) wurde über die Aminogruppe der modifizierten Oligonukleotide wie folgt eingeführt. Die Oligonukleotide (0,1 μMol) in 100 μl PBS (pH 7,4) wurden mit 0,5 μMol Tag-NHS-Ester-Marker, gelöst in DMSO, über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln umgesetzt. Die Oligonukleotide wurden aus diesen Markierungsreaktionen mittels Ethanolfällung rückgewonnen. Die Modifikationen des Oligonukleotids und die Markierung wurden wie folgt bezeichnet. Biotin:linker:'Oligonukleotid', um ein Oligonukleotid zu bezeichnen, modifiziert mit einer 5'-Aminogruppe und anschließend umgesetzt mit einem Biotin-NHS-Reagenz, um ein 5'-biotinyliertes Oligonukleotid zu erhalten. R:linker:'Oligonukleotid', um ein Oligonukleotid zu bezeichnen, modifiziert mit einer 5'-Aminogruppe und anschließend umgesetzt mit dem Ruthenium-Trisbypyridin-NHS-Reagenz, um ein 5'-Rutheniumchelat-Oigonukleotid zu erhalten. 'Oligonukleotid':linker:R, um ein Oligonukleotid zu bezeichneten, modifiziert mit einer 3'-Aminogruppe und anschließend umgesetzt mit dem Ruthenium-Trisbypyridin-NHS-Reagenz, um ein 3'-Rutheniumchelat-Oligonukleotid zu erhalten.
  • Die Sonden für den Pol2-Test waren wie folgt:
    Figure 00200001
  • Diese wurden mit den folgenden Modifikationen versehen:
    Figure 00200002
  • Die Amplifikation erfolgte wie in J. Vir. Methods. 35, (1991): 273, beschrieben.
  • Die Sonden für den Gag3-Test waren wie folgt:
    Sequenzen für die Analyse auf das HIV1-gag-Gen, Genbank HIVBH102 #1139–1167
    Figure 00210001
    hergestellt als:
    Figure 00210002
    für den gag3-Test unten. Die Amplifikationen erfolgten, wie beschrieben, in Van Gemen et al., 43, J. Vir. Methods, 177–187 (1993).
  • Weitere Sonden für die quantitativen gag-Assays waren wie folgt:
    Figure 00210003
  • Kontrollsequenz für die Quantifizierung, wie in Van Gemen et al., J. Vir. Methods (1993), beschrieben.
  • Die Verwendung dieser Sonden A, B und C wäre wie folgt:
    Verwendung von A als Einfangsonde und B, C zur Detektion oder B und C als Einfangsonden und A zur Detektion.
  • Um die erforderlichen Sonden zu erzeugen, wurden die folgenden Sequenzen hergestellt, unter Einbau von Biotin (Bindungsspezies) und des Ruthenium-Tribybypridin-Komplexes (ECL-Marker).
  • Sonde A, hergestellt als:
    Figure 00210004
  • Sonde B, hergestellt als:
    Figure 00210005
  • Sonde C, hergestellt als:
    Figure 00220001
  • Worin R den Ruthenium-Trisbypyridin-N-Hydroxysuccinamidester darstellt; umgesetzt mit einer Aminogruppe am Oligonukleotid. Die Aminogruppe wurde während der Synthese eingeführt.
  • Beispiel 2: Herstellung von Streptavidin-Magnetkügelchen
  • Zu 15 mg BSA (in 2–3 ml PBS) setzt man 105 μl Dimethylsulfoxid, enthaltend 50 mg/ml an Biotin-x-NHS (Clontech, San Diego, California) zu, gefolgt von Mischen und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 30 μl 1 M Glycin und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten abgestoppt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Gelfiltrationschromatographie (Bio-Gel P6, Bio-Rad Labs, Richmond, California) gereinigt. Das Biotin-BSA wurde unter Anwendung eines 0,2 μm-Filters und einer Spritze filtriert. 5 mg Biotin-BSA in 10 ml 0,2 M Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6 wurden zu 300 mg DYNABEADSTM (DYNAL Nr. 14002) zugesetzt, (DYNABEADS ist eine Marke der DYNAL, Great Neck, New York). Die Kügelchen umfassen entweder:
    • –Dynal M-450-Dynabeads, superparamagnetische Teilchen mit 4,5 μm Durchmesser, 30 mg/ml, erhalten von Dynal, 45 North Station Plaza, Great Neck, New York 11021; oder
    • –Dynal M–280 Dynabeads, superparamagnetische Teilchen mit 2,8 μm Durchmesser, 10 mg/ml, erhalten von Dynal, 45 North Station Plaza, Great Neck, New York 11021)

    und wurden mit Carbonat/Bicarbonat gewaschen. Diese Mischung wurde gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Die Kügelchen wurden magnetisch getrennt, gefolgt vom Zusatz von 10 ml ECL-Verdünner (37,5 mM KH2PO4. 109,2 mM K2HPO4 3H2O, 151,7 mM CaCl, 0,65 mM NaN3, 0,43 mM Rinderserumalbumin in H2O) und 100 μl tRNS (10 mg/ml). Diese Mischung ließ man 3–4 Stunden bei Raumtemperatur unter Mischen inkubieren. Die Kügelchen wurden einmal mit 10 ml ECL-Verdünner gewaschen und in 10 ml ECL-Verdünner und 100 μl tRNS (10 mg/ml) resuspendiert. Diese Mischung wurde gemischt und bei 2-6°C über Nacht inkubiert, um die Proteine auf den Kügelchen zu stabilisieren. Die Kügelchen wurden magnetisch getrennt und in 10 ml phosphatgepuffertem Kochsalz (PBS), 15 mg Streptavidin (Scripps Laboratories, San Diego, California, Katalog-Nr. S 1214), suspendiert, gefolgt von Mischen für eine Stunde. Die Kügelchen wurden viermal in 10 ml ECL-Verdünner bei 5 Minuten Mischen für jeden Waschschritt gewaschen. Die Kügelchen wurden schließlich in 29,7 ml ECL-Verdünner und 300 μl tRNS (10 mg/ml) auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml Teilchen plus 100 μg/ml tRNS resuspendiert.
  • Beispiel 3: Pol2-Test
  • Sondenlösung I: für 50 Tests vereinigten wir:
    50 μl 35OT1 (ECL-Oligo mit 1 mg/ml),
    50 μl 5OT2 (Biotin-markiertes Oligonukleotid mit 2 μg/ml).
  • Die Amplifikationen erfolgten unter Anwendung der Primer OT188 und OT42 nach den Verfahren, beschrieben in J. Vir. Method, 35 (1991) : 273.
  • Die Proben wurden über eines der beiden Verfahren hergestellt:
    • A) Zusatz von 16 μl AKZO-Puffer, enthaltend 0,1% SDS, 20 mM EDTA, zu 4 μl Probe aus der Amplifikation und Erwärmen für 5 Minuten auf 95°C.
    • B) Zusatz von 1,8 μl von 1,25% SDS, 240 mM EDTA, zu 20 μl Probe und Erwärmen auf 95°C für 5 Minuten.
  • In einem Teströhrchen wurden die folgenden vereinigt: 5 μl Sondenlösung I und 5 μl Probe, wie oben. Diese Proben wurden für 30 Minuten bei 50°C inkubiert, gefolgt von Zusatz von 5 μl Kügelchen (20 μg Dynal 450) und gemischt für 60 Minuten. Zu dieser Mischung gab man 485 μl ECL-Testpuffer hinzu und untersuchte die Proben in einem ECL-Analysegerät. Die untersuchten Proben waren "NT" als eine Kontrolle ohne Template, "A" für 10 Kopien HIV1 und "B" für 10.000 Kopien HIV1. Hierbei handelt es sich um 1 μl Aliquotes aus der Amplifikationsreaktion.
  • Die Ergebnisse waren wie folgt:
    Probe ECL-Signal
    Hintergrundsignal 204
    NT 1908 1884 1913
    A 1952 1862 1911
    B 175679 179986 167539
  • Die Ergebnisse belegten die Fähigkeit der Amplifikation und der ECL, die HIV1-Sequenzen schnell und empfindlich zu detektieren.
  • Beisiel 4: Gag3- und Pol2-Test
  • Um das Testsystem, wie oben belegt, zu verbessern, haben wir mehr Sonden und Kügelchen angewandt, um einen Test mit einem unvergleichlichen Bereich bereitzustellen. Die Amplifikationen erfolgten wie in Beispiel 3 und unter Verwendung der Primer OT83 und O82, wie beschrieben in 35, J. Vir. Method, 273 (1991) für das gag-Gen.
  • Sondenlösung I: für 50 pol2-Tests haben wir kombiniert:
    50 μl an 35OT1 (ECL-Oligo mit 20 μg/ml),
    50 μl 5OT2 (Biotin-markiertes Oligonukleotid mit 20 μg/ml).
  • Sondenlösung 2: für 50 gag3-Tests haben wir kombiniert:
    50 μl an AKZO2 (ECL-Oligo mit 20 μg/ml),
    50 μl an AKZO1 (Biotin-markiertes Oligonukleotid mit 20 μg/ml).
  • Die Proben wurden über eines der zwei Verfahren hergestellt:
    • A) Zusatz von 16 μl AKZO-Puffer, enthaltend 0,1% SDS, 20 mM EDTA, zu 4 μl Probe aus der Amplifikation und Erwärmen auf 95°C für 5 Minuten.
    • B) Zusatz von 1,8 μl an 1,25% SDS, 240 mM EDTA, zu 20 μl Probe und Erwärmen auf 95°C für 5 Minuten.
  • Das anfängliche Testprotokoll kombiniert in dem Teströhrchen in der folgenden Reihenfolge:
    5 μl Sonde,
    5 μl Probe.
  • Inkubieren bei 50°C für 30 Minuten, gefolgt von der Zugabe von 10 μl Kügelchen (40 μg) und Schütteln für 60 Minuten. Diese Proben wurden mit ECL-Testpuffer (485 μg) verdünnt und auf einem ECL-Analysegerät analysiert. Die getesteten Proben waren gag3 "G11", 1011 Kopien an HIV1; "G10", 1010 Kopien an HIV1; "G9", 109 an HIV1; "G8", 108 Kopien an HIV1; und "BB" Pufferkontrolle für den Hybridisierunghintergrund.
  • Dieses waren Proben reiner RNS, erzeugt als Testproben, enthaltend diese Anzahl an RNS-Molekülen im Test.
  • Die Ergebnisse waren wie folgt:
    Probe ECL-Signal
    Hintergrundsignal 82
    G11 249559 252442
    G10 12783 16059
    G9 1427 1429
    G8 334 330
    BB 250 250
    und pol2-Proben aus einer Amplifikationsreaktion, die 10.000 Kopien einer ursprünglichen HIV1-Sequenz einsetzte und ebenfalls auf X 1010 Kopien pro μl geschätzt wurde, basierend auf einer Gelelektrophorese nach Amplifikation. Diese Probe wurde verdünnt, um den Bereich des neuen Testformats für diese Probe zu ermitteln. Die Proben waren "P10", 5 × 1010; "P9", 5 × 109; "P8", 5 × 108; "P7", 5 × 107; "P6", 5 × 106, und "BB" als Probe, die keine amplifizierte Probe aufwies, sowie Kontrollen für die unspezifische Bindung im Test.
  • Die Ergebnisse waren wie folgt:
    Probe ECL-Signal
    Hintergrundsignal 82
    P1O 58762 62039
    P9 4696 4391
    P8 677 665
    P7 330 319
    P6 254 253
    BB 250 250
  • Dieses Experiment belegte die Fähigkeit des neuen Testformats, über mindestens 3,5 logarithmische Skalen an Probenkonzentrationen zu funktionieren und eine gute lineare Antwort zu erzeugen.
  • Beispiel 5: Gag3
  • Um das wie oben beschriebene Testsystem zu verbessern, haben wir mehr Sonden und Kügelchen eingesetzt, um einen Test mit einem Bereich ohne Parallelen bereitzustellen.
  • Sondenlösung 2: für 50 gag3-Tests haben wir kombiniert:
    50 μl an AKZO2 (ECL-Oligo mit 20 μg/ml),
    50 μl an AKZO1 (Biotin-markiertes Oligonukleotid mit 20 μg/ml).
  • Die Proben wurden über eines der zwei Verfahren hergestellt:
    • A) Zusatz von 16 μl AKZO-Puffer, enthaltend 0,1% SDS, 20 mM EDTA, zu 4 μl Probe aus der Amplifikation und Erwärmen auf 95°C für 5 Minuten.
    • B) Zusatz von 1,8 μl an 1,25% SDS, 240 mM EDTA, zu 20 μl Probe und Erwärmen auf 95°C für 5 Minuten.
  • Das anfängliche Testprotokoll kombiniert in dem Teströhrchen in der folgenden Reihenfolge:
    5 μl Sonde,
    5 μl Probe.
  • Inkubieren bei 50°C für 30 Minuten, gefolgt von der Zugabe von 10 μl Kügelchen (40 μg) und Schütteln für 60 Minuten. Diese Proben wurden mit ECL-Testpuffer (485 μl) verdünnt und auf einem ECL-Analysegerät analysiert. Bei den getesteten Proben handelte es sich um gag3 "G6", 106 Kopien an HIV1; "G5", 105 Kopien an HIV1; "G4", 104 Kopien an HIV1; "G3", 103 Kopien an HIV1; "G2", 102 Kopien an HIV1; "G 1 ", 101 Kopien an HIV1; und "NT1", "NT2", "NT3" als Kontrollen ohne Template für den Hintergrund. Die Proben dieser Kopienzahlen wurden wie in Beispiel 4 amplifiziert und 1 μl auf die Anwesenheiten der amplifizierten Sequenzen hin analysiert. Gleichfalls analysiert wurde eine "BB"-Probe, die keine amplifizierte Probe aufwies, wie auch Kontrollen für die unspezifische Bindung im Test.
  • Die Ergebnisse waren wie folgt:
    Probe ECL-Signal
    G6 55870 56541
    G5 57798 58354
    G4 66316 59120
    G3 74763 71190
    G2 75315 69284
    G1 301 296
    NT1 276 285
    NT2 283 295
    NT3 312 283
    BB 272 289
  • Beispiel 6: Patienten-Korrelations-Studie
  • Proben aus Patientenblut wurden fraktioniert und zum Erhalt der RNS zur Amplifikation wie in Beispiel 4 extrahiert. Dieses ergab Proben aus Vollblut (V), Blättchen (T), Makrophagen (M) und Plasma (P). Diese Proben wurden amplifiziert und der Southern-Blot-Analyse mit spezifischen Sonden unterworfen, um den Grad und die Art der Amplifikation aus diesen Proben zu bestimmen. Proben aus dieser Amplifikationsanalyse wurden anschließend der Analyse mittels des ECL-Systems unterworfen. Zusätzlich wurden in vitro erzeugte Standardproben als positive Kontrollen C2, 102, C3, 103; C4, 104; verwendet.
  • Sondenlösung 2: für 50 gag3-Tests haben wir kombiniert:
    50 μl an AKZO2 (ECL-Oligo mit 20 μg/ml),
    50 μl an AKZO1 (Biotin-markiertes Oligonukleotid mit 20 μg/ml).
  • Die 1 μl-Proben wurden auf 5 μl verdünnt und auf 0,1% SDS, 20 mM EDTA eingestellt, und für 5 Minuten auf 95°C erwärmt. Diesem folgte die Zugabe von 5 μl Sondenlösung, Inkubation für 30 Minuten bei 50°C, gefolgt von Zusatz von 10 μl Kügelchen (40 μg) und Schütteln für 60 Minuten. Diese Proben wurden mit ECL-Testpuffer (485 μl) verdünnt und auf einem ECL-Analysegerät analysiert.
  • Figure 00280001
  • Weitere Patientenproben wurden analysiert.
  • Figure 00280002
  • Alle diese Daten korrelierten mit den Southern-Blot-Hybridisierungsuntersuchungen, durchgeführt an den amplifizierten Proben, eingeschlossen die Probleme mit den Proben ohne Template, die Probleme hinsichtlich Kontaminationen zeigten. Der Test ergab Belege für einen Hakeneffekt in Probe 204P, die nach Verdünnung höhere Ergebnisse zeigt als mit 1 μl Probe. Diese Probe enthielt höchstwahrscheinlich mehr als den Grenzwert von 1012 für den vorliegenden Test bezüglich einer linearen Antwort.
  • Diese Daten wurden nachuntersucht mit Tests an Plasma als isolierter Probe, aufgeteilt auf gag3-Tests und pol2-Tests. Ebenfalls wurden Proben aus Vollbut (V) und Makrophagen (M), wo angegeben, hergestellt.
  • GAG3-Test ECL-Peaksignale.
  • Figure 00290001
  • POL2-Test ECL-Peaksignale.
  • Figure 00300001
  • Diese Patientendaten korrelierten mit vorhergehenden Northern-Blot-Analysen (Van Gemen et al., 45, J. Vir. Method (1993)).
  • Beispiel 7
  • Zusätzlich zu den obigen Testformaten haben wir einen Probensatz durchlaufen lassen, in dem alle die Komponenten zugesetzt und hybridisiert wurden, das heißt Proben, Sonden und Kügelchen, diese wurden bei 50°C wie zuvor inkubiert und Proben aus dieser Mischung nach 5 bis 30 Minuten entnommen; das Probensignal war nach dem Zeitpunkt von 5 Minuten maximal, was die Geschwindigkeit der Hybridisierung und die Flexibilität des Testsystems anzeigt. Bei den Proben handelte es sich um eine Mischung aus zwei zur Kontrolle amplifizierten Proben von 102 und 103 anfänglichen Templatemolekülen; diese Proben waren zuvor als positiv getestet worden. Bei "NT" handelt es sich um eine Probe, die negativ war.
  • Figure 00310001

Claims (12)

  1. Verfahren zur Detektion einer spezifischen Nukleinsäuresequenz, umfassend die Schritte: (a) Zusetzen einer Probe, von der man annimmt, dass sie die spezifische Nukleinsäuresequenz enthält, zu einer Reagenzmischung zur Bildung eines Reaktionsgemisches, wobei die Reagenzmischung umfasst: (i) einen ersten Oligonukleotidprimer; (ii) einen zweiten Oligonukleotidprimer; (iii) eine DNS-dirigierte RNS-Polymerase; (iv) eine RNS-dirigierte DNS-Polymerase; (v) eine DNS-dirigierte DNS-Polymerase; (vi) eine Ribonuklease, die die RNS eines RNS/DNS-Hybrids hydrolysiert, ohne einzel- oder doppelsträngige RNS oder DNS zu hydrolysieren; worin der erste oder zweite Oligonukleotidprimer einen Promoter oder eine Antisense-Sequenz eines Promoters umfasst und worin der Promoter von der DNS-dirigierten RNS-Polymerase erkannt wird, und worin der erste oder zweite Oligonukleotidprimer wahlweise mit einer Bindungsspezies oder einer elektrolumineszenten (ECL) Spezies markiert ist, oder worin das Reaktionsgemisch wahlweise Nukleotide umfasst, markiert mit einer Bindungsspezies oder einer ECL-Spezies, in ausreichender Menge, um amplifizierte Zielmoleküle zu erzeugen, markiert mit der Bindungsspezies oder der ECL-Spezies; (b) Inkubieren des Reaktionsgemisches für eine ausreichende Zeit, um die spezifische Nukleinsäuresequenz zur Bildung eines amplifizierten Nukleinsäuresequenzgemisches, enthaltend die amplifizierte Nukleinsäuresäuresequenz, zu amplifizieren; (c) Erhalten einer Probe aus dem amplifizierten Nukleinsäuresequenzgemisch; (d) Zusetzen der folgenden Reagenzien zu der Probe aus dem amplifizierten Nukleinsäuresequenzgemisch: I) mindestens einer ersten Sonde einer Sequenz komplementär zu der amplifizierten Nukleinsäuresequenz, worin (i) dann, wenn ein Primer oder ein Nukleotid, markiert mit einer Bindungsspezies; in Schritt (a) als Einfangsonde vorhanden ist, die erste Sonde mit einer ECL-Spezies markiert ist; oder (ii) dann, wenn ein Primer oder ein Nukleotid markiert mit einer ECL-Spezies in Schritt (a) vorhanden ist, die erste Sonde eine Einfangsonde ist; markiert mit einer Bindungsspezies; oder (iii) dann, wenn die Primer oder Nukleotide aus Schritt (a) nicht mit einer ECL-Spezies oder einer Bindungsspezies markiert sind, die erste Sonde mit einer ECL-Spezies markiert ist und mindestens eine Einfangsonde, markiert mit einer Bindungsspezies, vorhanden ist, worin die Einfangsonde eine Sequenz komplementär zur amplifizierten Nukleinsäuresequenz aufweist; und II) ein Kügelchen, beschichtet mit einem Bindungspartner für die Einfangsonde, um ein zweites Gemisch zu bilden; (e) Inkubieren des zweiten Gemisches für ausreichende Zeit, um die Hybridisierung zwischen Sonde(n) und amplifizierter Nukleinsäuresequenz zu gestatten, um einen Komplex zu bilden, und um das Einfangen des Komplexes auf den Kügelchen zu gestatten; und (f) Detektieren des an die Kügelchen gebundenen Komplexes unter Verwendung der ECL-Spezies.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das biotinylierte oder ECL-markierte Nukleotid zu Schritt (a) in ausreichender Menge zugesetzt wird, um biotinylierte bzw. ECL-markierte, amplifizierte Zielmoleküle zu erzeugen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin ein biotinylierter oder ein ECL-markierter Primer vollständig oder teilweise für entweder den ersten Primer oder den zweiten Primer aus Schritt (a) zur Bildung eines biotinylierten oder eines ECL-markierten amplifizierten Zielmoleküls ersetzt wird.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Einfangssonde und die erste Sonde, markiert mit der ECL-Spezies, vorhanden sind und die Einfangsonde und die erste Sonde an verschiedene Bereiche der amplifizierten Nukleinsäuresequenz binden.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Bindungsspezies Biotin und der Bindungspartner Streptavidin ist, kovalent an die Kugel gebunden.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Bindungsspezies Biotin und der Bindungspartner Streptavidin ist, beschichtet auf die Kugel.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Kugel eine Streptavidinkugel und die Einfangssonde eine mit Biotin markierte Oligonukleotidsonde ist, die mit der Streptavidinkugel vorinkubiert ist, um einen Komplex der Kugel und der Sonde, verbunden über eine Streptavidin/Biotin-Wechselwirkung, zu bilden.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der zweite Oligonukleotidprimer die Antisense-Sequenz des Promoters umfasst und worin die Inkubationsbedingungen diejenigen sind, die gestatten: (i) dass der erste Oligonukleotidprimer an ein erstes RNS-Template hybridisiert, das die spezifische Nukleinsäuresequenz oder eine Sequenz komplementär zu der spezifischen Nukleinsäuesequenz umfasst; (ii) dass die RNS-dirigierte DNS-Polymerase das erste RNS-Template nutzt, um ein zweites DNS-Template über Verlängerung des ersten Oligonukleotidprimers zu synthetisieren und dadurch ein RNS/DNS-Hybrid als Intermediat zu bilden; (iii) dass die Ribonuklease die in dem RNS/DNS-Hybrid als Intermediat enthaltene RNS hydrolysiert; (iv) dass der zweite Oligonukleotidprimer an das zweite DNS-Template hybridisiert; (v) dass die DNS-dirigierte DNS-Polymerase den zweiten Oligonukleotidprimer als Template nutzt, um den Promoter über Verlängerung des zweiten DNS-Templates zu synthetisieren; und (vi) dass die DNS-dirigierte RNS-Polymerase den Promoter erkennt und das zweite DNS-Template transkribiert.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der erste Oligonukleotidprimer die von der DNSdirigierten RNS-Polymerase erkannte Promotersequenz umfasst und worin die Inkubationsbedingungen diejenigen sind, die gestatten: (i) dass der erste Oligonukleotidprimer an ein erstes RNS-Template hybridisiert, das die spezifische Nukleinsäuresequenz oder eine Sequenz komplementär zu der spezifischen Nukleinsäuresequenz umfasst; (ii) dass die RNS-dirigierte DNS-Polymerase dieses erste RNS-Template nutzt, um ein zweites DNS-Template durch Verlängerung des ersten Oligonukleotidprimers zu synthetisieren und dadurch ein RNS/DNS-Hybrid als Intermediat zu bilden; (iii) dass die Ribonuklease die in dem RNS/DNS-Hybrid als Intermediat enthaltene RNS hydrolysiert; (iv) dass der zweite Oligonukleotidprimer an das zweite DNS-Template hybridisiert; (v) dass die DNS-gerichtete DNS-Polymerase den zweiten Oligonukleotidprimer als ein Template nutzt, um ein erstes DNS-Template zu synthetisieren, umfassend den Promoter; und (vi) dass die DNS-dirigierte Polymerase den Promoter erkennt und das erste DNS-Template transkribiert.
  10. Verwendung einer ersten Sonde, markiert mit einer ECL-Spezies, zur Detektion einer spezifischen amplifizierten Nukleinsäuresequenz in einem zyklischen DNS/RNS-Amplifikationstest, enthaltend eine DNS-dirigierte RNS-Polymerase, eine RNS-dirigierte DNS-Polymerase und eine DNS-dirigierte DNS-Polymerase, worin die erste Sonde der spezifischen amplifizierten Nukleinsäuresequenz oder einer dazu komplementären Sequenz komplementär ist.
  11. Verwendung einer Einfangsonde, markiert mit einer Bindungsspezies, zur Detektion einer amplifizierten Nukleinsäuresequenz in einem zyklischen DNS/RNS-Amplifikationstest, enthaltend eine DNS-dirigierte RNS-Polymerase, eine RNS-dirigierte DNS-Polymerase und eine DNS-dirigierte DNS-Polymerase, worin die Einfangsonde der spezifischen amplifizierten Nukleinsäuresequenz oder einer dazu komplementären Sequenz komplementär ist.
  12. Verfahren ,nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder Verwendung gemäß Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin die Sonde(n) direkt zum amplifizierten Nukleinsäure-sequenzgemisch oder einer Probe desselben zugesetzt wird bzw. werden.
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