DE69231124T2

DE69231124T2 - Schnelle bestimmungsverfahren für amplifikationsprodukte

Info

Publication number: DE69231124T2
Application number: DE69231124T
Authority: DE
Inventors: R. Gudibande; H. Kenton; R. Link
Original assignee: IGEN International Inc
Current assignee: Bioveris Corp
Priority date: 1991-11-15
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2012-11-14
Also published as: ATE193558T1; DE69231124D1; IL103754A0; IL103754A; GR3033605T3; KR0171629B1; AU658962B2; CA2100159C; AU3141293A; ES2146215T3; JPH06507316A; EP0567635B1; CA2100159A1; EP0567635A4; JP2788786B2; DK0567635T3; KR930703464A; EP0567635A1; WO1993010267A1; ZA928839B

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Detektion oder die Quantifizierung von amplifizierten Nucleinsäuresequenzen. Genauer betrifft die Erfindung die Detektion oder Quantifizierung von interessierenden Nucleinsäuren als interessierende Analyten in dem Amplifikationsprodukt einer Polymerasekettenreaktion in einem schnellen einstufigen homogenen Test.
Zahlreiche Publikationen sind in dieser Anmeldung durch in Klammern angegebene arabische Ziffern in Bezug genommen. Eine volle bibliografische Angabe dieser Bezugnahmen findet sich am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen. Diese Bezugnahmen beschreiben den Stand der Technik, auf den sich diese Erfindung bezieht.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Verwendung von Hybridisierungsverfahren für Nucleinsäuren zum Nachweis von Erkrankungszuständen und infektiösen Mitteln ist eine sich schnell entwickelnde Technologie (1). Diese Verfahren haben in großem Umfang einfache, nicht radioaktive Formate involviert, die danach streben, in klinischen Laboratorien akzeptiert zu werden (2, 3). Diese Tests nutzen chemolumineszente oder Enzymmarker oder Kombinationen derselben, um die gewünschte Empfindlichkeit zu erzielen (4). Die schnelle Probenherstellung, die durch die PCR angeboten wird, bietet die Möglichkeit, schnelle und einfache Tests zu entwickeln.

Nucleinsäureamplifikationsverfahren

Es ist wohlbekannt, dass eine Nucleinsäure wie Desoxyribonucleinsäure (DNS) während der Selbstreplikation als ihr eigenes Template dienen kann. Es ist ebenso wohlbekannt, dass eine doppelsträngige oder Duplex-Nucleinsäure in ihre Einzelstränge als Bestandteile getrennt werden kann. Diese Eigenschaften sind ausgenutzt worden, um die in vitro Amplifikation und Modifikation von Nucleinsäuresequenzen über die Polymerasekettenreaktion (PCR) zu gestatten.
Die PCR ist eine in vitro ablaufende, auf Enzymen basierende Replikation von Nucleinsäuresequenzen unter Ausnutzung von zwei Oligonucleotidprimern, die so designed sind, dass sie auf gegenüberliegenden Strängen hybridisieren und die interessierende Region bzw. den interessierenden Bereich auf der Ziel-Polynucleotidsequenz flankieren. Während sich wiederholender Zyklen wird die Nucleinsäure der Strangtrennung, typischerweise über thermische Denaturierung, unterworfen, werden die Primer (über Annealing, falls ein thermischer Zyklus genutzt wird), auf die einzelsträngigen Templates hybridisiert und verlängert ein Enzym wie eine DNS-Polymerase (DNS-Template für die DNS-Primerverlängerung) oder die reverse Transkriptase (Ribonucleinsäure- oder "RNS"-Template für die DNS-Primerverlängerung oder DNS-Template für die DNS-Primerverlängerung) die Primer auf den Templates. Beide Stränge (plus und minus), einschlisslich der neu synthetisierten Stränge, werden als Templates für die Verlängerung für beide Primer durch den Schritt der Strangtrennung verfügbar gemacht. Das Ergebnis ist mit zwei Primern ein exponenzieller Anstieg (daher der Ausdruck "Kettenreaktion") der Kopienzahl der Nucleinsäure als Template (sowohl Plus- als auch Minus-Stränge) in jedem Zyklus, da mit jedem Zyklus sowohl die Plus- als auch die Minusketten repliziert werden. Die Nucleinsäureduplex, die daraus resultiert, wird den Enden der verwendeten spezifischen Primer entsprechende Enden aufweisen. Es ist mit Hilfe der PCR möglich, eine Nucleinsäuresequenz in vitro zu amplifizieren, zu detektieren oder anders zu modifizieren.
Die Herstellung von Primern für die PCR erfordert, dass die Endsequenzen der Nucleinsäurestränge (sowohl des Plus- als auch des Minus-Templates), die amplifiziert oder detektiert werden sollen, bekannt sind (5). Die Sequenzinformation kann über die direkte Sequenzierung der Termini bzw. Enden der interessierenden Nucleinsäure oder über die Sequenzierung des Endes eines Polypeptids und das Erzeugen einer entsprechenden Kopie des Oligonucleotidprimers abgeleitet werden. Die optimale Primergröße ist typischerweise eine Länge von etwa 20-30 Basen, funktionierende Primer können jedoch in speziellen Umständen kürzer oder länger sein. Es ist wohlbekannt, dass mit abnehmender Primergröße die Wahrscheinlichkeit dafür steigt, dass der Primer an einem ungeplanten Ort auf der interessierenden Sequenz hybridisiert. Ungeplante Hybridisierungen können zu einem Unterbrechen der Amplifikation des gewünschten Produkts und der Erzeugung von Produkten mit entweder einer geringeren Größe oder einem unerwünschten Primerinsert führen. Somit erfordert die Selektion zweier für die PCR optimaler Primer das Vermeiden ungeplanter Hybridisierung mit der interessierenden Sequenz, wann immer praktisch durchführbar.
Die rationale Selektion der Primersequenz zur Vermeidung ungeplanter Hybridisierungen ist wohlbekannt. Es sind Algorithmen bekannt, über die der Fachmann vorgeschlagene Primersequenzen mit der gesamten Templatesequenz (falls bekannt) und mit jeder anderen Sequenz, von der bekannt ist, dass sie in der Testmischung vorhanden ist, vergleichen kann.
Die Notwendigkeit, die Endanteile der einander gegenüberliegenden Stränge einer interessierenden Nucleinsäuresequenz zu bestimmen und zwei damit hybridisierbare Primer herzustellen, kann mit Hilfe von Universalprimern vermieden werden. Alle vorhandenen DNS-Sequenzen erhalten eine Universalprimerbindungsstelle und werden über den Universalprimer amplifiziert.
Die PCR-Amplifikation ist verwendet worden, um neue Gensequenzen aus einer Polynucleotidsequenzbibliothek zu isolieren. Während neue Gene auch mit Hilfe einer ausreichend komplementären Sonde isoliert werden können, die einen Teil der Sequenz des neuen Gens enthält, fehlt es solchen Isolierungsverfahren über Sonden an der Empfindlichkeit, die von der PCR bereitgestellt wird.
In den Tests des Standes der Technik auf Basis der PCR sind Nucleinsäuresonden, markiert an ihrem 5'-Ende, eingesetzt worden, um auf den Nucleinsäuren als interessierenden Analyten zu hybridisieren. Diese Sonden treten gelegentlich an ihrem unmarkierten 3'-Ende in die Polymerasekettenreaktion ein, was zu falschen Ergebnissen führt. Die Tests des Standes der Technik sind außerdem heterogen, das heißt Trennungstests. Als solche sind sie zeitaufwändig und die multiplen involvierten Waschschritte führen die Möglichkeit von Kontaminationen der Testprobe ein.

Detektion von markierten Nucleinsäuresequenzen

Zahlreiche Verfahren und Systeme sind für die Detektion und Quantifikation von Nucleinsäuren als interessierenden Ana lyten in biochemischen und biologischen Substanzen entwickelt worden. Typischerweise wird das Vorliegen einer Nucleinsäure als interessierender Analyt über die Anwesenheit oder Abwesenheit eines beobachtbaren "Markers" oder "Labels" angezeigt, der an eine Sonde angeheftet ist, die an den interessierenden Analyten bindet. Von besonderem Interesse sind Marker, die über fotochemische, chemische und elektrochemische Mittel zur Lumineszenz angeregt werden können.
Die "Fotolumineszenz" ist der Prozess, durch den ein Material zur Lumineszenz induziert wird, wenn es elektromagnetische Strahlung absorbiert. Fluoreszenz und Phosphoreszenz sind Typen der Fotolumineszenz. "Chemolumineszente" Prozesse erfordern die Erzeugung von lumineszenten Spezies durch chemischen Transfer von Energie. Die "Elektrochemolumineszenz" erfordert die Erzeugung lumineszenter Spezies auf elektrochemischem Wege.
Elektrochemolumineszenz-Testtechniken (ECL-Testtechniken) sind eine Verbesserung der Chemolumineszenztechniken. Sie sorgen für eine empfindliche und genaue Messung der Anwesenheit und der Konzentration eines interessierenden Analyten. In solchen Techniken wird die inkubierte Probe einer voltametrischen Arbeitselektrode ausgesetzt, um die Lumineszenz zu triggern. In der richtigen chemischen Umgebung wird eine solche Chemolumineszenz durch eine an die Arbeitselektrode zu spezieller Zeit und auf spezielle Weise angelegte Spannung getriggert. Das Licht, das von dem Marker produziert wird, wird gemessen und zeigt die Anwesenheit oder Menge des Analyten an. Für eine vollständigere Beschreibung solcher ECL-Techniken wird auf die veröffentlichten PCT-Anmeldungen der Nrn US85/01253 (WO86/02734), US87/00987 (WO87/06706) und US 88/03947 (WO89/04302) Bezug genommen.
Es ist möglich, Elektrochemolumineszenztests mit und ohne einen Trennschritt während des Testverfahrens durchzuführen und die Signalmodulation bei verschiedenen Konzentrationen des Analyten so zu maximieren, dass genaue und empfindliche Messungen durchgeführt werden können.
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. US 89/04919 (WO90/ 05301) lehrt sensitive bzw. empfindliche spezifische Bindungstestverfahren auf Basis eines Lumineszenzphänomens, worin ein inertes, mikroteilchenförmiges Material spezifisch an eine der Bindungsreaktanten des Testsystems gebunden wird. Die Tests können in einem heterogenen Testformat (einer oder mehrere Trennschritte) durchgeführt werden, und können ebenso sehr vorteilhaft in einem homogenen Testformat (ohne Trennung) eingesetzt werden.
Die Lumineszenz entsteht aus der durch Exponieren der Markerverbindung an eine voltametrische Arbeitselektrode induzierte Elektrochemolumineszenz (ECL), wobei der Marker entweder an spezifische Bindungspartner gebunden oder ungebunden ist. Die ECL-reaktive Mischung wird kontrolliert getriggert, um Licht zu emittieren, und zwar über eine auf der Arbeitselektrode zu spezifischer Zeit und auf spezifische Weise angelegten Spannung, um Licht zu erzeugen.
Die WO-A-90 05302 und die WO-A-90 05296 betreffen bevorzugte Testzusammensetzungen.
Das US-Patent Nr. 5,061,445 und das US-Patent Nr. 5,247,243 lehren jeweils bevorzugte Vorrichtungen zur Durchführung von Tests auf ECL-Basis. Die WO-A-92 14138 und die WO-A- 92 14139 beschreiben bevorzugte Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von Tests auf ECL-Basis. Die Offenbarungen all dieser Anmeldungen gestatten die Detektion und die Quantifizierung einer extrem kleinen Menge an Analyten in einer Vielzahl von Tests, die in der Forschung und in klinischen Anwendungen durchgeführt werden.
F. F. Chehab und Y. W. Kan (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 86, Seiten 9178-9182, Dezember 1989) offenbaren die Verwendung von mit Fluoreszenzfarbstoff gemarkerten Nucleinsäureprimern für spezifisch amplifizierte DNS-Sequenzen. Die EP-A-379 369 offenbart die Verwendung einer Vielzahl von Markern, eingeschlossen Elektrochemolumineszenzreagenzien, die an eine Oligonucleotidsonde gebunden sind, zum Detektieren bekannter flankierender Sequenzen über einen verlängerten Primer. In beiden dieser Dokumente sind jedoch die Oligonucleotide an ihrem 5'-Ende markiert. Solche Oligonucleotide kranken daher an den Problemen des Standes der Technik, wie sie in der vorliegenden Beschreibung identifiziert wurden.

AUFGABEN DER ERFINDUNG

Es ist eine primäre Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur schnellen Durchführung von Tests auf Nucleinsäuren bereitzustellen, die in Polymerasekettenreaktionen oder anderen von Primern dirigierten Amplifikationen amplifiziert wurden.
Eine weitere und verwandte Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur schnellen Durchführung von empfindlichen, verlässlichen homogenen Tests auf Nucleinsäuren von Interesse bereitzustellen, die in Polymerasekettenreaktionen amplifiziert wurden.
Noch eine andere und verwandte Aufgabe der Erfindung besteht darin, solche Tests bereitzustellen, die die Waschschritte und die Probenkontamination, die mit den Tests des Standes der Technik verbunden sind, vermeiden.
Eine weitere und verwandte Aufgabe der Erfindung besteht darin, Tests bereitzustellen, die die Probleme und falschen Ergebnisse, die mit der Verwendung von 5'-Sonden assoziiert sind, vermeiden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Aufgaben werden in den schnellen Tests auf amplifizierte DNS ohne Trennung erzielt, was die Kontamination und die durch den Zusatz von Sonden und den mehrfachen Waschschritten, die in herkömmlichen Tests angewandt werden, verschwendete Zeit vermeidet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion einer interessierenden Nucleinsäuresequenz in dem Amplifikationsprodukt einer Polymerasekettenreaktion oder einer anderen Primer Reaktion bereit, umfassend die Schritte:
(a) Inkorporieren in ein Polymerasekettenreaktionsgemisch oder ein anderes Primer-dirigiertes Reaktionsgemisch von (i) mindestens einer Nucleinsäuresondensequenz komplementär zu einer amplifizierten interessierenden Nucleinsäuresequenz, worin die Sonde (i) am 3'-Ende derselben oder (ii) am 3'- und am 5'-Ende derselben mit einer Bindungsgruppe oder einem detektierbaren Marker markiert ist; und von (ii) mindestens einer Nucleinsäuresequenz als Primer zur Verwendung in der Polymerasekettenreaktion oder in anderen Primer-dirigierten Reaktionen, worin der Primer an seinem 5'- Ende mit der Bindungsgruppe oder einem detektierbaren Mar ker markiert ist, so das sowohl eine Bindungsgruppe als auch ein detektierbarer Marker in der Reaktionsmischung vorhanden sind;
(b) Durchführen einer Polymerasekettenreaktion oder einer anderen Primer-dirigierten Reaktion; und
(c) Messen des markierten Amplifikationsprodukts.
Eine Mischung aus Sonde und Primer wird in das Reaktionsgemisch einer PCR- oder einer anderen primerdirigierten Reaktion eingeführt, so dass die Mischung bei Zugabe des modifizierten Primers für die Reaktion vollständig ist. Die 3'- oder 3'5'-markierten Sonden werden nicht in das PCR-Produkt inkorporiert und behalten somit ihre Spezifität für die Hybridisierung bei, anders als die 5'-markierten Primer. Gemäß den eingesetzten, ausgewählten Markern werden Proben aus diesen PCR-Hybridisierungen anschließend beispielsweise in eine Suspension von Streptavidin-Kügelchen gesammelt und direkt in ein ECL-Analysegerät eingegeben.
Obwohl ein optionaler Verfahrensschritt, umfassend das Konzentrieren und das Waschen der markierten Amplifikationsprodukte, vor dem Messen der Elektrochemolumineszenz des markierten Amplifikationsprodukts angewandt werden kann, vermeidet diese schnelle Probenhandhabung die in den typischen Hybridisierungstests involvierten Waschschritte.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Testformat für einen schnellen einstufigen Test.
Fig. 2 ist ein Testformat für einen schnellen einstufigen Test auf HIV 1 gag.
Fig. 3 ist ein Test auf das zystische Fibrose-Gen, ein schneller einstufiger Test.
Fig. 4 ist ein Test auf synthetische zystische Fibrose- Gene, dessen Spezifität belegend.
Fig. 5 ist ein Test für zystische Fibrose-Gene in normalen human Proben.
Fig. 6 ist ein Test auf zystische Fibrose-Gene in human Proben von der University of North Carolina.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Definitionen

Um die Erfindung klarer zu verstehen, werden bestimmte Ausdrücke wie folgt definiert.
Ein "Nucleotid" ist eine der vier Basen: Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin (DNS) oder Uracil (RNS), zuzüglich einem Zucker (Desoxyribose für DNS, Ribose für RNS), zuzüglich eines Phosphats. Um Monomere für die DNS-Polymerisationsreaktion bereitzustellen, sind typischerweise alle vier der Desoxyribonucleotidtriphosphate erforderlich. Ein Nucleotid, wie es hier definiert ist, kann außerdem modifizierte Basen wie 5-Methyl-dCTP und 7-Deaza-dGTP umfassen, die eingesetzt werden, um die Wirkung der Polymerase auf den Templates zu verbessern. Der Ausdruck Nucleotid, wie er hier verwendet wird, umfasst außerdem an Biotin und Digoxigenin gebundene Basen (Digoxigenin-11-UTP von Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) und Biotin-21-UTP und Amino-7-dUTP (Clontech, Palo Alto, California), die direkt in einen Primer oder während der Amplifikation in ein Extensionsprodukt des Primers inkorporiert werden können, um für eine selektive Bindung der amplifizierten Sequenzen zu sorgen.
Ein "Oligonucleotid" ist eine Sequenz, die aus mindestens zwei Nucleotiden gebildet ist. Ein "Polynucleotid" ist ein langes Oligonucleotid und kann entweder RNS oder DNS sein. Während der Ausdruck Oligonucleotid in der Literatur im Allgemeinen verwendet wird, um kürzere Nucleinsäureketten zu bezeichnen, und "Polynucleotid" im Allgemeinen verwendet wird in der Literatur, um längere Nucleinsäureketten, eingeschlossen DNS- oder RNS-Chromosomen oder -Fragmente derselben, zu bezeichnen, ist die Verwendung des einen oder des anderen Ausdrucks hierin keine Beschränkung oder Beschreibung der Größe, solange dies nicht ausdrücklich angegeben ist.
Der Ausdruck "Nucleinsäure" bezieht sich auf ein Polynucleotid einer jeglichen Länge, eingeschlossen DNS- oder RNS- Chromosome oder -Fragmente derselben, mit oder ohne modifizierte Basen, wie oben beschrieben.
Eine "Sequenz" (beispielsweise Sequenz, genetische Sequenz, Polynucleotidsequenz, Nucleinsäuresequenz) bezieht sich auf die aktuellen angegebenen Basen (Ribose oder Desoxyribose), die in einem Polynucleotidstrang vorhanden sind, abgelesen in 5'-3'-Richtung.
Von dem "Komplement" einer ersten Nucleotidsequenz ist wohlbekannt, dass es sich um eine zweite Sequenz handelt, die diejenigen Basen umfasst, die über die Watson-Crick- Hybridisierung mit der ersten Sequenz paaren. Somit ist wohlbekannt, dass es sich bei dem Komplement zur Desoxyribonucleinsäuresequenz (DNS-Sequenz) 5'-ATGC-3' um 5'-GCAT- 3' handelt. Für eine Duplex oder doppelsträngige DNS werden jeder der beiden Stränge als komplementär zu dem anderen oder als komplementäres Paar beschrieben. Die Ausdrücke Komplement und Antikomplement können ebenfalls verwendet werden. Bezüglich der Identifizierung des Stranges der Duplex-DNS, von dem die Transkription der RNS erfolgt, wird der Transkriptionsstrang im Allgemeinen als plus und sein Komplement als minus (oder "+" und "-") beschrieben oder der Transkriptionsstrang kann als Sensestrang und sein Komplement als Antisense bezeichnet werden. Beide Stränge, die jeweils mit dem anderen hybridisiert sind, wobei alle Basenpaare komplementär sind, sind einander zu 100% komplementär. Zwei Stränge, die jeweils mit dem anderen hybridisiert 5% der Basen nicht-komplementär aufweisen, sind zu 95% komplementär (oder die zwei Stränge haben eine Komplementarität von 95%).
Die "Homologie" zwischen Polynucleotidsequenzen bezieht sich auf das Maß der Sequenzähnlichkeit zwischen den jeweiligen Sequenzen. Zwei Stränge, die einander in der Sequenz identisch sind, besitzen 100% Sequenzhomologie. Zwei Stränge, die sich in 5% der Sequenzen unterscheiden, haben eine Sequenzhomologie von 95%. Je größer das Maß der Homologie zwischen den Strängen A und B, desto größer die Komplementarität zwischen A und dem Komplement von B.
Eine "Sonde" ist eine einzel- oder doppelsträngige Nucleinsäure, die eine Sequenz hat komplementär zu einer interessierenden Nucleinsäure als Ziel und die ein weiteres Merkmal aufweist, welches die Messung der Duplex aus Sonde und Ziel ermöglicht. Der Fachmann wird verstehen, dass dann, wenn die Sonde und/oder das Ziel doppelsträngig ist, die doppelsträngige Nucleinsäure die Strangtrennung durchlaufen muss, bevor die Hybridisierung stattfinden kann.
Eine Sonde wird über einen angehefteten Tag oder Marker bzw. Label detektierbar gemacht. Ein an eine Sonde gebundener Tag oder Marker kann im Prinzip einen fluoreszierenden oder lumineszierenden Tag, einen isotopischen Marker (beispielsweise ein Radioisotop oder einen Magnetresonanzmarker), einen Farbstoffmarker, einen Enzymmarker, eine antigene Determinante, detektierbar über einen Antikörper, oder eine Bindungsgruppe wie Biotin umfassen, die es noch einer anderen Gruppe wie einem mit Streptavidin beschichteten Kügelchen ermöglicht, sich spezifisch an die Sonde anzuheften. Wenn die gemarkerte oder gelabelte Duplex aus Sonde und Probe sich bildet, kann diese Duplex über die charakteristischen Eigenschaften des Tags oder des Markers detektiert werden. Die Sonde mit ihrer Markergruppe wird von dem Ziel mit dessen Markergruppe über die Hybridisierung eingefangen und die Duplexbildung gestattet die Detektion über einen Marker.
Ein "Primer" ist ein relativ kurzes Segment eines Oligonucleotids, das einem Teil der interessierenden Sequenz komplementär ist (die interessierende Sequenz kann ein Subfragment in einer größeren Nucleinsäuresequenz sein). Ein Primer repräsentiert ein 5'-Ende des erhaltenen Verlängerungsprodukts. Ein Primer, der an seinem 3'-Ende der interessierenden Sequenz auf dem Templatestrang komplementär ist, ermöglicht die Bearbeitung dieses 3'-Endes durch eine Polymerase bei Hybridisierung auf dem Template. Ein Primer kann auch an seinem 5'-Ende mit einer Bindungsgruppe oder einem detektierbaren Marker modifiziert sein.
Die "Strangtrennung" bezeichnet die Umwandlung einer doppelsträngigen oder Duplex-Nucleinsäure in zwei komplementäre einzelsträngige Polynucleotide. Dieser Trennungsprozess kann wohlbekannte Techniken nutzen, eingeschlossen: die enzymvermittelte Trennung (beispielsweise über das Enzym Helicase (5), die physiko-chemische Trennung (pH, Ionenkonzentration und dergleichen) sowie die thermische Trennung, die auch als thermische Denaturierung bekannt ist. Die thermische Denaturierung (auch als "Schmelzen" bezeichnet) ist die Trennung eines doppelsträngigen Polynucleotids (vollständige oder teilweise Duplex) zu mindestens zwei Einzelsträngen von Polynucleotiden durch Erhöhen der Temperatur der Lösung, die das Polynucleotid enthält.
Die "Hybridisierung" beschreibt die Bildung einer doppelsträngigen oder Duplex-Nucleinsäure aus komplementären einzelsträngigen Nucleinsäuren. Die Hybridisierung kann zwischen ausreichend komplementären einzelsträngigen DNS und/oder RNS zur Bildung von DNS-DNS, DNS-RNS oder RNS-RNS stattfinden.
Die in vitro Amplifikation der DNS wird von der DNS-Polymerase katalysiert. Eine Anzahl von Typen von DNS-Polymerasen sind im Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen teilen sie die gemeinsame Eigenschaft des Katalysierens der Synthese einer doppelsträngigen DNS-Sequenz unter Verwendung eines einzelsträngigen Templates, an das ein Primer annealed ist. Die aus den meisten Organismen extrahierten DNS- Polymerasen werden bei den für die thermische Denaturierung von Nucleinsäuren erforderlichen Temperaturen inaktiv. Somit ist der Ersatz des Enzyms am Beginn jedes Thermozyklus oder die Zufügung eines Faktors, der die Wärmeinaktivierung verhindern kann, erforderlich, falls solche wärmeempfindlichen Enzyme eingesetzt werden. Die DNS-Polymerasen, die für die in vitro PCR wie auch für die Erfindung bevorzugt sind, sind von Organismen abgeleitet, die bei hohen Temperaturen gedeihen und somit wärmebeständig sind, das heißt somit adäquate katalytische Aktivität bei der Temperatur, die Duplex-DNS denaturiert, aufrechterhalten.
Die von der DNS-Polymerase katalysierte Reaktion ist im Stand der Technik bekannt und wird hier als "DNS-Polymerasereaktion" bezeichnet. Die Reaktion erfordert einige oder alle der vier Desoxyribonucleotidtriphosphate, Primer, vorzugsweise in molarem Überschuss, und ein Mittel für die zyklische Strangtrennung. Die Strangtrennung wird vorzugsweise durch thermisches Cyclieren zwischen Annealing- und Denaturierungstemperaturen bewirkt. Von der reversen Transkriptase ist bekannt, dass sie sowohl ein Kopieren von RNS in DNS als auch ein Kopieren von DNS in DNS vermittelt. Somit wird jede Anzahl von Enzymen, die nun bekannt sind, die Kettenreaktion katalysieren.
Die "Elektrochemolumineszenzmarker" oder "ECL-Marker" sind diejenigen, die bei elektrochemischer Einwirkung in lumineszente Spezies überführt werden können. Solche ECL-Marker sind in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen von Bard et al. und Massey et al. beschrieben (PCT US85/02153, WO86/ 02734 und PCT US87/00987, WO87/06706)
Die Ausdrücke "Detektion" und "Quantifizierung" werden als "Messung" angesprochen, wobei zu verstehen ist, dass die Quantifizierung die Erstellung von Bezugszusammensetzungen und Kalibrierungen erfordern kann.
Eine "ECL-Vorrichtung", ein "ECL-Analysegerät" ist jegliche Vorrichtung zur Durchführung von Tests auf Basis der Elektrochemolumineszenz.

Detaillierte Beschreibung

Verbesserte schnelle Tests auf amplifizierten Nucleinsäuresequenzen ohne Trennung sind unter Verwendung von Oligonucleotiden entwickelt worden, die 3' oder 3'5' elektrochemolumineszente Marker aufweisen. Oligonucleotide mit 3'- oder 3'5'-Markern sind nicht in der Lage, als Primer in der PCR oder anderen primerdirigierten Reaktionen zu fungieren. Sie verbleiben am Ende des Amplifikationsverfahrens verfügbar für die Hybridisierung an den Überschuss der amplifizierten Nucleinsäure.
Tests, die dieses Sondensystem verwenden, sind schnell, da die Sonde in dem thermozyklischen Programm hybridisieren kann. Durch Verwendung der ECL-Technologie zum Detektieren von Bindungsvorgängen wird die Notwendigkeit für externe Waschungen oder andere Manipulationen vermieden. Natürlich können Waschschritte optional angewandt werden. Diese Testformate machen die Notwendigkeit, separate Zugaben auszuführen und Kontaminationsprobleme zu riskieren, überflüssig. Obwohl im Folgenden hauptsächlich in Verbindung mit PCR-Reaktionen beschrieben, kann die Erfindung in jeglicher primerdirigierter Reaktion angewandt werden.
Tests zur Detektion des HIV 1 gag Gens und des Gens der humanen zystischen Fibrose auf Basis der Verwendung der zuvor beschriebenen PCR-Protokolle (6, 7) sind im Folgenden beschrieben. Ebenso beschrieben ist eine Untersuchung von 15 Patientenproben, die auf deren zystische Fibrosestatus getestet wurden. Bei den verwendeten Beispielen handelt es sich um fünf normale, fünf für die Deletion 508 heterozygote und fünf für die Deletion 508 homozygote.
In ihrer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Detektion einer interessierenden Nucleinsäuresequenz in dem Produkt einer Polymerasekettenreaktion oder einer anderen primerdirigierten Amplifikationsreaktion, umfassend die Schritte: (a) Inkorporieren in ein Polymerasekettenreaktionsgemisch oder ein anderes primerdirigiertes Reaktionsgemisch von mindestens einer markierten Nucleinsäuresequenz, die zur Elektrochemolumineszenz befähigt und der interessierenden Nucleinsäuresequenz komplementär ist, mit der Formel:
worin M Ruthenium, Osmium oder Rhenium ist, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; gleich oder verschieden sein können und jeweils H, Alkyl mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder eine Verbindungsgruppe bedeuten, NA die Nucleinsäuresequenz darstellt, die an eine der Bipyridylgruppen an ihrem 3'-Ende oder an zwei Bipyridylgruppen an ihren 3'- und ihrem 5'-Enden gebunden ist und worin n entweder 1 oder 2 ist, (b) Durchführen einer Polymerase- oder anderen primerdirigierten Reaktion und (c) Messen der Elektrochemolumineszenz des markierten Amplifikationsprodukts. In einer besonders bevorzugten Aus führungsform wird eine mehrfache Anzahl der 3'-markierten Nucleinsäuresequenzen in eine primerdirigierte Reaktion eingebaut.

BEISPIELE

Methodologie

Oligonucleotide wurden auf einem 380B DNS-Synthesegerät von Applied Biosystems synthetisiert und unter Verwendung von Aminomodifikatoren von Clontech (10) mit 5' oder 3'- Aminogruppen funktionalisiert. Für das HIV gag Gen spezifische Oligonucleotide-PCR-Tests waren der SK38-Primer (ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT), der SK39-Primer (TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC) und die SK19-Sonde (ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC) wie zuvor beschrieben (6). Die Sonde SK19 war sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende unter Verwendung von tag-NHS markiert. Im Falle des Gens der zystischen Fibrose waren die Oligonucleotide für das Primen CFF(GACTTCACTTCTAATGATGA) und CFR(CTCTTCTAGTTGGCATGCT). Die Sonden waren CFN2 (GAAACACCAAAGATGATATT) für das normale Gen und CFD2 (AACACC-AATGATATTTTCTTT) für die Deletion 508. Diese waren an 3'- und 3'5'-Stellen über Aminogruppen mit dem N- Hydroxysuccinimidester von Ru(bpy)&sub3;²&spplus; markiert (8, 9, 11). Die Primer SK39 und CFF waren die 5'-biotinylierten Primer in der Amplifikationsreaktion mit unmarkiertem SK38 bzw. CFR. Ein nichtspezifisches Oligonucleotid lambda 1 (GAAAATGTGCTGACCGGACATGAAAATGAG) wurde ebenfalls synthetisiert und am 3'-Ende markiert, um es als Kontrolle für Hintergrundsignale zu verwenden. Die Oligonucleotide wurden für das Markieren über die Biogel-P6-Säulenchromatografie in 0,3 M NaCl hergestellt, gefolgt von Ausfällen des ausgeschlossenen Oligonucleotidpeaks. Typischerweise wurden 0,1 uMol Oligonucleotid mit 0,5 uMol ORIGEN-Marker in 80% Dimethylsulfoxid/phosphatgepuffertem Kochsalz, pH 7,4, umgesetzt. Die Biotinylierung des Oligonucleotids erfolgte im Wesentlichen wie oben, mit der Ausnahme, dass zum Markieren Biotin-X-NHS (Clontech) in 50% Dimethylsulfoxid eingesetzt wurde. Die markierten Oligonucleotide wurden mit Ethanol ausgefällt und zur Entfernung von nicht eingebautem Marker gewaschen. Die synthetischen zystischen Fibrosesequenzen, die eingesetzt wurden, um die Spezifität des Systems zu testen, waren wie folgt: die normale Sequenz, CF-Normal; GACTTCACTTCTAATGATGATAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGAGCATGCCAACTAGAAGAG; und die mutierte Sequenz, CF D508; GACTTCACTTCTAATGATGATAAAGAAAATATCATTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGAGCATGCCAACTAGAAGAG.
Die PCR für das HIV 1 gag Gen wurde im Wesentlichen wie beschrieben (6) durchgeführt, unter Verwendung eines 25 ul Reaktionsvolumens, enthaltend 75 ng (7,5 pMol) des biotinylierten SK39 und 75 ng (7,5 pMol) SK38 und 1,25 ng SK19. Die auf dem Perkin-Elmer-Thermocycler verwendeten Temperaturzyklen waren wie folgt: 95ºC 1 Minute, 60ºC 1 Minute, die Zyklusanzahl betrug 40. Diesem folgte ein Zyklus von 60 ºC für 30 Minuten.
Die Polymerasekettenreaktionen für die zystischen Fibrose- Gene oder die synthetischen Gene wurden im Wesentlichen wie beschrieben (7) durchgeführt, unter Verwendung von 25 ul Reaktionsvolumen, enthaltend 75 ng (7,5 pMol) CFR und 75 ng (7,5 pMol) biotinyliertem CFF und 5 ng CFN2 oder CFD2, markiert an dem oder den 3'- oder 3'5'-Ende(n). Die Zyklusbedingungen für den zystischen Fibrosetest waren 30 Zyklen von 94ºC 1 Minute, 55ºC 2 Minuten, 72ºC 2 Minuten. Diesem folgte ein Zyklus von 98ºC für 5 Minuten, 65ºC 30 Minuten. Die synthetischen Gene wurden in einer Konzentration zum Nachahmen der Konzentration in normaler human DNS für eine einzelne Kopie von Genen eingesetzt, das heißt 3 · 10&sup5; pro ug DNS. Lachssperma-DNS wurde als nichtspezifische DNS in diesen Amplifikationsreaktionen des synthetischen Gens eingesetzt.
Nach der PCR/den Hybridisierungszyklen wurden 2 ul Proben zu 15 ug von 2,8 uM Streptavidin beschichteten Magnetkügelchen (Dynal, Great Neck, N. Y.) in 240 ul ECL-Testpuffer auf einem ECL-Analysegerät zugesetzt, 15 Minuten inkubiert, gefolgt von Analyse auf ECL. Im Fall des zystischen Fibrosetests wurden die Proben zu 250 ul aus 30% Formamid/ORIGEN- Testpuffer zugegeben.

BEISPIEL I

Testformat für den schnellen einstufigen Test

Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung eines biotinylierten Primers und eines unmarkierten Primers durchgeführt. Die PCR-Thermozyklen wurden wie üblich für 40 Zyklen durchgeführt. Am Ende der Thermozyklen wurde eine verlängerte Inkubation für die Hybridisierung angefügt. Die Proben am Ende des letzten Inkubationszyklus waren anschließend fertig für die Bindung an Kügelchen, Proben wurden entnommen und den Kügelchen zum Binden (15 Minuten) bei Raumtemperatur auf einem ECL-Analysegerät zugesetzt, anschließend auf Elektrochemolumineszenz analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.

BEISPIEL II

Test auf HIV 1 gag, schneller einstufiger Test

Die PCR wurde für 35 Zyklen mit den HIV 1 gag spezifischen Primern, einschließlich der SK19, 3'5'-markierten Sonde durchgeführt. Die Proben der 111 V 1 positiven DNS waren Verdünnungen des im Perkin Elmer Cetus Kit bereitgestellten Standards. Proben der PCR (2 ul) wurden zu Streptavidin- Kügelchen zugeführt, unter Schütteln für 15 Minuten inkubiert, und auf Elektrochemolumineszenz unter Verwendung eines ECL-Analysegeräts analysiert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Fig. 2 zeigt einen vereinfachten PCR-Test für den schnellen Nachweis bzw. die schnelle Detektion des HIV 1 gag Gens. Diese Fähigkeit beruht teilweise auf dem ECL-System und den Testformaten auf ECL-Basis. Das ECL-System stellt spezifisch (1) einen stabilen Marker, der den Härten der PCR widerstehen kann, (2) einen Testmodus, der auf Grund der Natur der ECL die Notwendigkeit externer Waschungen beseitigt, und (3) eine Empfindlichkeit für die Detektion eines Analyten bereit, die der Radioaktivität Konkurrenz macht.
Die Ergebnisse für die Untersuchung des HIV 1 gag belegten die Detektion einer Kopienanzahl bis hinab zu 12,5 Kopien unter geringen Mühen. Die Nützlichkeit dieses Verfahrens für ein schnelles Serientestsystem oder Screening System ist eindeutig und würde mit verbesserter Leistung des Thermozyklus die Detektion von viel geringeren Kopiezahlen gestatten.

BEISPIEL III

Test auf das Gen der zystischen Fibrose, schneller einstufiger Test

Der Test der Erfindung wurde zur Unterscheidung von Genen genutzt, die wenige Mutationen im Vergleich zum Normalgen aufwiesen, wie es im Fall für die 508-Codon-Deletion im zystischen Fibrose-Gen ist. Der Test wurde unter Verwendung von humaner DNS aus Zelllinien, humaner Plazenta, von normalen Subjekten und mit synthetischen Genen getestet.
Die PCR wurde für 30 Zyklen mit den für die zystische Fibrose spezifischen Primern durchgeführt, eingeschlossen dem 3'5'-markierten CFN2. Die Proben der DNS waren Verdünnungen von DNS, isoliert aus einer Humanzelllinie (HeLa, 8). Proben der PCR (2 ul) wurden zu Streptavidin-Kügelchen zugefügt, unter Schütteln für 15 Minuten inkubiert und auf Elektrochemolumineszenz unter Verwendung eines ECL-Analysegerätes analysiert.
Die Ergebnisse des Tests sind in Fig. 3 veranschaulicht. Der Erfolg des Tests auf das zystische Fibrose-Gen und, wie erwartet, die Empfindlichkeit des Systems, welche die Detektion des Gens in weniger als 1 ng von human DNS ermöglicht, ist belegt.

BEISPIEL IV

Test auf synthetische zystische Fibrose-Gene, Beleg der Spezifität

Um die Spezifität der Erfindung auf die zystischen Fibrose- Gene zu untersuchen, wurden zwei synthetische Sequenzen er zeugt, die die normale Gensequenz bzw. die mutierte Gensequenz, enthaltend die Deletion 508, enthielten. Diese Genstandards wurden auf die in humaner DNS gefundene Konzentration verdünnt, um die Spezifität der Hybridisierungsreaktion zu ermitteln, ohne Zweifel hinsichtlich der Natur der zystischen Fibrosesequenzen, die amplifiziert wurden.
Die PCR erfolgte für 30 Zyklen mit den für die zystische Fibrose spezifischen Primern, eingeschlossen die 3-markierten Sonden CFN2 und CFD2. Die Proben der DNS waren Verdünnungen der synthetischen DNS, die in Lachssperma-DNS aufbereitet war. Die Konzentration dieser Sequenzen war auf demselben Level, wie er in humaner DNS vorliegt. Proben der PCR (2 ul) wurden zu 15 ug Streptavidin-Kügelchen zugesetzt, unter Schütteln für 15 Minuten inkubiert und auf die Elektrochemolumineszenz unter Verwendung eines ECL-Analysegerätes analysiert.
Die in Fig. 4 gezeigten Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des Tests, spezifisch das normale oder das mutierte Gen zu detektieren. Dieses schnelle Testformat ist in der Lage, schnell zu detektieren und eng verwandte Sequenzen zu unterscheiden.

BEISPIEL V

Test auf zystische Fibrose-Gene in normalen human Proben

Die PCR wurde für 30 Zyklen mit den für die zystische Fibrose spezifischen Primern, eingeschlossen der 3'5'-markierten Sonden CFN2 und CFD2, durchgeführt. Die DNS-Proben waren einzelne Proben humaner DNS, isoliert aus einzelnen Chorionmembranen (Sigma Ltd.). Proben der PCR (2 ul) wurden zu 15 ug Streptavidin-Kügelchen zugesetzt, unter Schütteln für 15 Minuten inkubiert und auf Elektrochemolumineszenz unter Verwendung eines ECL-Analysegerätes analysiert.

BEISPIEL VI

Test auf zystische Fibrose-Gene in humanen Proben der University of North Carolina

Die Daten aus Beispiel IV wurden durch Testen eines Sets von human DNS-Proben aus North Carolina erhärtet, wobei jede der Proben genau gemäß dem Verfahren der Erfindung im Vergleich zu vorherigen Verfahren (7) getestet wurde. Die Daten zeigten einen weiten Bereich von Signalen auf Grund der Extravaganzen der PCR und der Abweichung hinsichtlich der DNS-Konzentration in der Probe; mit der Konsistenz bezüglich des Hintergrunds war es jedoch möglich, die Anwesenheit des normalen Gens über das mit der CFN2-Sonde erhaltene Signal und die Anwesenheit des mutierten Gens mit der CFD2-Sonde zu bewerten. Die Probe 15 in diesen Untersuchungen ergab das niedrigste Signal, das jedoch immer noch signifikant über dem unspezifischen Sondensignal war. Diese Daten sind in Fig. 6 angegeben.
Die PCR wurde für 30 Zyklen mit den für die zystische Fibrose spezifischen Primern, eingeschlossen die 3'-markierten Sonden CFN2, CFD2 und eine unspezifische Sonde (lambda 1), durchgeführt. Die DNS-Proben waren einzelne Proben humaner DNS bei 0,5 bis 2,5 ug/u1, wobei jeweils ein ul derselben in der PCR eingesetzt wurden. Proben der PCR (2 ul) wurden zu 15 ug Streptavidin-Kügelchen zugegeben, unter Schütteln für 15 Minuten inkubiert und auf Elektrochemolumineszenz unter Verwendung eines ECL-Analysegerätes analysiert.

LITERATURVERZEICHNIS

1. A. R. Newman, Analytical Chemistry 1990; 62: 1063A-1065A.
2. M. S. Urdea et al., Nucleic Acids Res. 1988; 16: 4937-56.
3. L. J. Arnold et al., Clin. Chem. 1989; 35 : 1588- 94.
4. S. Beck et al., Nucleic Acids Res. 1989; 17: 5115-5123.
5. K. B. Mullis U. S. Pat. Nos. 4,683,195 und 4,683,202.
6. C-Y Ou et al., Science 1988; 239: 295-97.
7. T. W. Prior et al., Clin. Chem. 1990; 36: 1756- 59.
8. J. H. Kenten et al., Clin. Chem. 1991; 37: 1626- 32.
9. veröffentlichte PCT-Anmeldung der Nr. US87/00987 (WO87/06706).
10. P. Nelson et al., Nucleic Acids Res. 1989; 17: 7187.
11. G. F. Blackburn et al., Clin. Chem. 1991; 37: 1534-39.

Claims

1. Verfahren zur Detektion einer interessierenden Nukleinsäuresequenz in dem Amplifikationsprodukt einer Polymerasekettenreaktion (PCR) oder einer anderen Primer-dirigierten Reaktion, umfassend die Schritte:

(a) Inkorporieren in ein Polymerasekettenreaktionsgemisch oder ein anderes Primer-dirigiertes Reaktionsgemisch von (i) mindestens einer Nukleinsäuresondensequenz komplementär zu einer amplifizierten interessierenden Nukleinsäuresequenz, worin die Sonde (i) am 3'-Ende derselben oder (ii) am 3'- und am 5'-Ende derselben mit einer Bindungsgruppe oder einem detektierbaren Marker markiert ist; und von (ii) mindestens einer Nukleinsäuresequenz als Primer zur Verwendung in der Polymerasekettenreaktion oder in anderen Primer-dirigierten Reaktionen, worin der Primer an seinem 5'-Ende mit einer Bindungsgruppe oder einem detektierbaren Marker markiert ist, so dass sowohl eine Bindungsgruppe als auch ein detektierbarer Marker in der Reaktionsmischung vorhanden sind;

(b) Durchführen einer Polymerasekettenreaktion oder einer anderen Primer-dirigierten Reaktion; und

(c) Messen des markierten Amplifikationsprodukts.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der detektierbare Marker eine Verbindung ist, die zur Elektrochemolumineszenz befähigt ist, und Schritt (c) das Messen der Elektrochemolumineszenz des markierten Amplifikationsprodukts umfasst.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die zur Elektrochemolumineszenz befähigte Verbindung die Formel:

hat, worin M ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ru, Os und Re; und worin L&sub1;, L&sub2; und L&sub3; gleich oder verschieden sind und jeweils bedeuten

worin R&sub1; und R&sub2; gleich oder verschieden sind und jeweils H, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Verbindung zu der Nukleinsäure bedeuten.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die zur Elektrochemolumineszenz befähigte Verbindung die Formel:

hat, worin M Ruthenium, Osmium oder Rhenium ist; R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; gleich oder verschieden sein können und jeweils H, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Verbindung zu der Nukleinsäure bedeuten, und wobei ein oder zwei Moleküle dieser Verbindung an die Nukleinsäure gebunden sind.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, umfassend einen weiteren Schritt des Konzentrierens und Waschens des markierten Amplifikationsprodukts vor Schritt (c) zum Messen der Elektrochemolumineszenz des markierten Amplifkationsprodukts.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Reaktion eine Primer-dirigierte Reaktion ist, umfassend die Schritte:

(a) Inkorporieren in das Primer-dirigierte Reaktionsgemisch von (i) mindestens einer Nukleinsäuresondensequenz komplementär zu einer interessierenden Nukleinsäuresequenz, worin die Sonde an ihrem 3'-Ende mit einer markierten Verbindung markiert ist;

(b) Durchführen einer Primer-dirigierten Reaktion; und

(c) Messen des markierten Amplifikationsprodukts.

7. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin eine Vielzahl von 3'-markierten Nukleinsäuresondensequenzen in eine Primer-dirigierte Reaktion inkorporiert sind.