DE69916877T2

DE69916877T2 - Ligations-vermittelte assemblierung und nachweis von polynukleotiden auf einem festträger

Info

Publication number: DE69916877T2
Application number: DE69916877T
Authority: DE
Inventors: W. Michael HUNKAPILLER; C. Andrew HIATT
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: HIATT, ANDREW C., SAN DIEGO, CALIF., US; Applied Biosystems LLC
Priority date: 1998-11-12
Filing date: 1999-08-24
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2019-08-25
Also published as: EP1129215B1; DE69916877D1; WO2000029616A1; EP1129215A1; ATE265545T1; US5942609A; JP3544945B2; CA2353076A1; JP2002531071A; AU770217B2; AU5783899A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Assemblierung, Analyse, Detektion und Spaltung von Polynukleotiden auf einem Festträger durch Anlagerungs-, Ligations- und Verlängerungs-Schritte.
REFERENZEN

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HINTERGRUND
Die Veränderung von funktionellen Gensequenzen stellt die Basis für eine molekulare Klonierung dar. Eine leichte Verfügbarkeit von synthetischen Genen bei überschaubaren Kosten wird eine Umwandlung der Information einer Gensequenz in die Information einer Genfunktion beschleunigen. Die bewusst entworfenen synthetischen Gene mit einzigartiger Sequenz geben einen Anreiz für Genexpressionsstudien, indem Mutanten-Proteine für Studien verfügbarer gemacht werden.
Das klassische Verfahren der de-novo-Gensynthese erfordert eine sequentielle Anlagerung (Hybridisierung) und Ligation von synthetischen Oligonukleotid-Komponenten, und zwar ein paar zur selben Zeit, in einer homogenen wässrigen Lösung (Khorana, 1979; Blackburn, 1996). Bei diesem Verfahren wird ein Gemisch von überlappenden, komplementären Oligonukleotide bei Bedingungen angelagert, welche die Bildung eines korrekten doppelsträngigen Fragments (Duplex-DNA) mit Strangunterbrechungen („nicks") an benachbarten Positionen entlang der zwei Stränge begünstigen. Das entstehende Konstrukt wird dann isoliert und mehreren aufeinander folgenden Runden der Anlagerung, Ligation und Isolierung ausgesetzt. Das Verfahren erfordert eine effiziente, schnelle und spezifische Hybridisierung, eine chemische Synthese von allen Bestandteilen des Gens und viele analytische als auch Aufreinigungsschritte. WO 90/00626 offenbart ein Verfahren zur Polynukleotid-Assemblierung, bei dem eine Reihe von überlappenden Oligonukleotiden angelagert und, soweit notwendig, verlängert wird, um Lücken („gaps") aufzufüllen und zu ligieren.
Die Aufreinigung von intermediären Duplex-Fragmenten nach einer Anlagerung und Ligation ist oft kompliziert und bezüglich der Entfernung von allen fehlangelagerten, verkürzten oder auf andere Weise nicht vollständigen Konstrukten nicht wirkungsvoll. Zusätzlich hängt eine optimale Hybridisierung von allen Duplex-Fragmenten und Oligonukleotiden von der fachmännischen Auswahl der Oligonukleotide innerhalb des Gens ab. Während das entstehende doppelsträngige Polynukleotid bis zu einer Länge von mehreren Kilobasen hergestellt werden kann, beträgt die Ausbeute typischerweise weniger als 1% und die synthetischen Genkonstrukte haben eine stark verminderte biologische Aktivität im Vergleich zu nativen Genen, wenn sie anhand der Protein-Expressionsspiegel gemessen werden (Agrawal, 1970).
Die Beschränkungen des klassischen Verfahrens zur Gensynthese umfassen die bekannten Unvollkommenheiten der chemischen Oligonukleotidsynthese, insbesondere die von langen Oligonukleotiden, welche Unreinheiten zur Folge haben, die folgendermaßen entstehen: (i) verkürzte Sequenzen, die sich nicht gepaart haben, (ii) Nukleobasen-modifizierte Sequenzen, (iii) unvollständig entschützte Sequenzen und (iv) andere nukleotidische und nicht-nukleotidische Übergangsprodukte. Eine Hybridisierung von unreinen Oligonukleotidgemischen kann zu Fehlpaarungen („mismatches") und einer verschlechterten Hybridisierungs- und Ligationseffizienz führen. Das Nettoergebnis sind niedrige Ausbeuten von funktionellen Oligonukleotiden mit korrekter Sequenz zur Verwendung bei einer synthetischen Gen-Assemblierung. Ein effizientes Verfahren für die schnelle und wirtschaftliche Assemblierung von Polynukleotiden, d. h. Genen oder Genfragmenten, ist wünschenswert.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zur Assemblierung und zum Nachweis eines Polynukleotids auf einem Festträger. Die Verfahren sind gerichtet auf eine schnelle, effiziente, kostengünstige und groß angelegte Synthese von Polynukleotiden zur Verwendung, z. B., als synthetische Gene für die rekombinante Proteinexpression, als Sonden für diagnostische Assays oder als therapeutische Gegensinn-(„antisense")-Agenzien. Die resultierenden Polynukleotide auf einem Festträger können (i) durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert werden, (ii) durch Fluoreszenz- basierende Hybridisierungs- und Exonuklease-Assays quantifiziert und detektiert werden, (iii) für nützliche Zwecke verändert werden, während sie an den Festträger gebunden sind oder (iv) von dem Festträger gespalten werden.
In einem ersten Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese eines Polynukleotids auf einem Festträger, wobei das Verfahren die Schritte der Anlagerung von Oligonukleotiden an ein immobilisiertes Oligonukleotid auf einem Festträger, das Ligieren von Nick-Stellen, das Wiederholen der Anlagerung und Ligation mit 1–100 Zyklen, das Entfernen der Brücken-Oligonukleotide unter denaturierenden Bedingungen, die Anlagerung eines Primers an das immobilisierte Ligationsprodukt und die Verlängerung von Teilen des Polynukleotids mit einer Polymerase und Nukleotid-5'-triphosphaten einschließt, um doppelsträngige Polynukleotide auf einem Festträger zu erzeugen.
Das erste Ende eines Oligonukleotids ist auf einem Festträger immobilisiert. Das nicht-immobilisierte Ende trägt eine Phosphatgruppe. Ein oder mehrere Brücken-Oligonukleotide, welche 6–40 Nukleotide umfassen und Lücken von einem oder mehreren Nukleotiden in dem nicht-mobilisierten Strang bilden, und zwei oder mehrere Assemblierungs-Oligonukleotide, welche 20–200 Nukleotide umfassen, werden an das immobilisierte Oligonukleotid derart angelagert, dass zwischen den benachbarten Assemblierungs-Oligonukleotiden ein ligierbarer Nick gebildet wird.
Die Nick-Stellen werden dadurch ligiert und bilden ein immobilisiertes Ligationsprodukt. Ein Primer wird an das immobilisierte Ligationsprodukt angelagert und verlängert, um ein doppelsträngiges Polynukleotid zu erzeugen. Die Anlagerungs- und Ligationsschritte werden ausreichend oft wiederholt, um das entworfene immobilisierte doppelsträngige Polynukleotid zu assemblieren. Verschiedene Kombinationen von Assemblierungs- und Brücken-Oligonukleotiden für die Assemblierung von Polynukleotiden sind in den 1–6 gezeigt.
Ein Brücken-Oligonukleotid, das 6–40 Nukleotide umfasst, lagert sich an das immobilisierte Oligonukleotid an, wodurch das Brücken-Oligonukleotid komplementär ist zu dem nicht-immobilisierten Ende des immobilisierten Oligonukleotids und ein erstes doppelsträngiges Fragment mit einem Überhang erzeugt. Ein Assemblierungs-Oligonukleotid, welches 20–200 Nukleotide umfasst und das typischerweise länger ist als das Brücken-Oligonukleotid und komplementär ist zu dem Überhang des nicht-immobilisierten Strangs lagert sich an ein Nukleotid an, das benachbart zu dem nicht-immobilisierten Ende des immobilisierten Oligonukleotids ist, um ein zweites doppelsträngiges Fragment zu erzeugen, das eine Nick-Stelle und einen Überhang aufweist. Zusätzliche Assemblierungs- und Brücken-Oligonukleotide werden eingeführt und lagern sich an, um Nick-Stellen in dem immobilisierten Strang und Lücken in dem nicht-immobilisierten Strang zu bilden. Die Nick-Stellen werden in dem immobilisierten Strang durch DNA-Ligase oder durch chemische Ligationsmittel ligiert. Die Anlagerungs- und Ligationsschritte werden mit 1–100 Zyklen wiederholt, und die Brücken-Oligonukleotide werden unter denaturierenden Bedingungen entfernt. Der nicht-immobilisierte Strang wird durch Polymerase, Primer und Nukleotid-5'-triphosphaten verlängert, um ein doppelsträngiges Polynukleotid zu erzeugen.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Verfahren zur Verfügung, um das assemblierte, doppelsträngige Polynukleotid auf dem Festträger durch fluoreszierende Hybridisierungs-Assays nachzuweisen und zu quantifizieren. Das Verfahren umfasst weiter die Anlagerung einer selbst-löschenden Fluoreszenzsonde, einschließlich Reporter- und Quencher-Resten, die komplementär sind zu dem Polynukleotid, nachdem die Synthese abgeschlossen ist. Die Sonde kann Nukleotide in der Nähe des 5'-Terminus umfassen, welche im Wesentlichen komplementär sind zu den Nukleotiden in der Nähe des 3'-Terminus, wodurch die nicht-angelagerte Sonde in einem gelöschten Zustand vorliegt. Nach der Anlagerung der Sonde an das Polynukleotid geht die Quench-Wirkung verloren oder wird im Wesentlichen verringert und die Fluoreszenz kann nachgewiesen werden.
Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um das doppelsträngige Polynukleotid auf einem Festträger durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) zu amplifizieren oder um das Produkt der Polymerasekettenreaktion durch den auf Fluoreszenz basierenden Exonuklease-Assay nachzuweisen und zu quantifizieren (Lee, 1993; Holland 1991).
Die erfindungsgemäßen Verfahren können modifiziert werden, um das immobilisierte einzelsträngige Polynukleotid von der Festphase durch chemisches oder Restriktionsenzymverdau zu spalten.
Es kann eine Vorrichtung konstruiert werden, um ein Polynukleotid auf einem Festträger zu synthetisieren, indem die Schritte der Anlagerung, Ligation und Primer-Verlängerung in einer zyklischen Weise automatisiert werden. Flüssige Reagenzien können aus Gefäßen an die Festträger unter Mikroprozessor-Kontrolle entsprechend einem Programm abgegeben werden.
Bestimmte Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können viele der Einschränkungen und Unvollkommenheiten des klassischen Verfahrens (Khorana, 1979) der Gensynthese beseitigen und einige oder alle der folgenden Vorteile besitzen:

1) Der Festträger dient dazu, um ein effizientes Waschen und Entfernen von überschüssigen oder nicht-angelagerten Oligonukleotiden, Übergangsprodukten, Reagenzien und Kontaminanten zu ermöglichen. Aufreinigungen vor der Vervollständigung der Gen-Assemblierung sind nicht notwendig.
2) Eine DNA-Ligase benötigt eine absolute Spezifität während der Ligation und hat den Vorteil einer Lesekorrektur, d. h. sie liefert das korrekte Ligationsprodukt.
3) Eine DNA-Polymerase benötigt auch eine perfekte Komplementarität beim Schritt der Verlängerung und hat auch den Vorteil einer Lesekorrektur, d. h. sie liefert das korrekte Verlängerungsprodukt.
4) Eine Verlängerung des nicht-immobilisierten Strangs benötigt nur einen Teil des betreffenden Gens, das mit synthetischen Oligonukleotiden konstruiert werden soll.
5) Die synthetischen Oligonukleotide können relativ kurz sein, dadurch werden sie kostengünstig, hoch rein und leicht verfügbar sein.
6) Weitere Experimente können auf dem assemblierten Polynukleotid durchgeführt werden, während es auf dem Festträger immobilisiert ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die aufeinander folgende Anlagerung eines Brücken-Oligonukleotids 25 (1b) an ein immobilisiertes, terminal-phosphoryliertes Assemblierungs-Oligonukleotid 20 (1a), gefolgt durch ein Assemblierungs-Oligonukleotid 40, das Erzeugen eines Nicks 45 in dem immobilisierten Strang (1c), die Ligation des Nicks um ein immobilisiertes Ligationsprodukt 60 (1d) zu bilden und die Verlängerung mit einer Polymerase (1e), um ein immobilisiertes, doppelsträngiges Polynukleotid 65 zu synthetisieren.
2 zeigt die gleichzeitige Anlagerung von zwei Oligonukleotiden als ein Gemisch, einem Brücken-Oligonukleotid 25 und einem Assemblierungs-Oligonukleotid 40, an ein immobilisiertes, terminal-phosphoryliertes Assemblierungs-Oligonukleotid 20 (2a), das Erzeugen eines Nicks 45 in dem immobilisierten Strang (2b), das Ligieren des Nicks, um ein immobilisiertes Ligationsprodukt 60 (2c) zu bilden, und die Verlängerung mit einer Polymerase (2d), um ein immobilisiertes, doppelsträngiges Polynukleotid 65 zu synthetisieren.
3 zeigt die gleichzeitige Anlagerung eines oder mehrerer Brücken-Oligonukleotide 25 und zwei oder mehrere Assemblierungs-Oligonukleotide 40 an ein immobilisiertes, terminal-phosphoryliertes Assemblierungs-Oligonukleotid 20 (3a), die Erzeugung von Nicks 45 in dem immobilisierten Strang und Lücken 70 in dem nicht-immobilisierten Strang (3b ), die Ligation der Nicks, um ein immobilisiertes Ligationsprodukt 60 (3c) zu bilden, und die Verlängerung mit einer Polymerase (3d), um ein immobilisiertes, doppelsträngiges Polynukleotid 65 zu synthetisieren.
4 zeigt die aufeinander folgende Anlagerung eines Brücken-Oligonukleotids 25 (4b) an ein immobilisiertes, terminal-phosphoryliertes Assemblierungs-Oligonukleotid 20 (4a), gefolgt von einem Assemblierungs-Oligonukleotid 40, die Erzeugung eines Nicks 45 in dem immobilisierten Strang (4c), die Ligation des Nicks, um ein immobilisiertes Ligationsprodukt 60 (4d) zu bilden, das Wiederholen der Anlagerungs- und Ligations-Schritte (4e) für n Male und die Verlängerung mit einer Polymerase (4f), um ein immobilisiertes, doppelsträngiges Polynukleotid 65 zu synthetisieren.
5 zeigt die gleichzeitige Anlagerung von zwei Oligonukleotiden als ein Gemisch, einem Brücken-Oligonukleotid 25 und einem Assemblierungs-Oligonukleotid 40, an ein immobilisiertes, terminal-phosphoryliertes Assemblierungs-Oligonukleotid 20 (5a), die Erzeugung eines Nicks 45 in dem immobilisierten Strang (5b), die Ligation des Nicks, um ein immobilisiertes Ligationsprodukt 60 (5c) zu bilden, das Wiederholen der Anlagerungs- und Ligationsschritte (5d) für n Male und die Verlängerung mit einer Polymerase, um ein immobilisiertes, doppelsträngiges Polynukleotid 65 (5e) zu synthetisieren.
6 zeigt die gleichzeitige Anlagerung eines oder mehrerer Brücken-Oligonukleotide 25 und zweier oder mehrerer Assemblierungs-Oligonukleotide 40 an ein immobilisiertes, terminal phosphoryliertes Assemblierungs-Oligonukleotid 20 (6a), die Erzeugung von Nicks 45 in dem immobilisierten Strang und Lücken 70 in dem nicht-immobilisierten Strang (6b), die Ligation der Nicks, um ein immobilisiertes Ligationsprodukt 60 (6c) zu bilden, das Wiederholen der Anlagerungs- und Ligationsschritte (6d) für m Male und die Verlängerung mit einer Polymerase, um ein immobilisiertes, doppelsträngiges Polynukleotid 65 (6e) zu synthetisieren.
7 zeigt die Strukturen von 5'-Carboxyfluoreszein (5-FAM), 6-Carboxyfluoreszein (6-FAM), 2',4',1,4,-Tetrachlorfluoreszein (TET), 2',4',5',7',1,4-Hexachlorfluoreszein (HEX) und 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyrhodamin (JOE), wobei L ein Linker ist und die substituierten Formen davon einschließt.
8 zeigt die Strukturen von Quencher-Resten Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA) und Tetrapropan-6-carboxyrhodamin (ROX), DABSYL und DABCAL, wobei L ein Linker ist und die substituierten Formen davon einschließt.
9 zeigt den TagMan^® Exonuklease-Assay, wobei die selbst-löschende Sonde 1 eine Reportermarkierung, F, und eine Quencher-Markierung, Q, einschließt und Ziel-Primer 3a und 3b werden an das Ziel-Polynukleotid 2 hybridisiert. Während der Polymerisationsphase der Amplifizierung werden die Primer 3a' und 3b unter Verwendung eines Polymerase-Enzyms verlängert, wobei dadurch die verlängerten Primer 4a und 4b gebildet werden, z. B. durch Verwendung einer DNA-Polymese. Während der Primer-Verlängerungsreaktion dient eine 5'→3'Nukleaseaktivität der Polymerase dazu, um die Sonde 1 zu schneiden, so dass Sondenfragmente entstehen, einschließlich dem Reporter-tragenden Fragment 5 und dem Quencher-tragenden Fragment 6. Somit werden die Reporter- und Quencher-Markierungen voneinander getrennt, wobei dadurch der Energieübergang zwischen den beiden verhindert wird und die Emission des Reporters nach Verdau der Sonde nicht gelöscht wird, was einen Anstieg bei der Fluoreszenz zur Folge hat.
DEFINITIONEN
Soweit nicht anders angegeben, sollen die folgenden hier verwendeten Begriffe und Phrasen die folgenden Bedeutungen haben:
„Polynukleotid" oder „Oligonukleotid" bezeichnet lineare Polymere von natürlichen Nukleotid-Monomeren oder Analoga davon, einschließlich doppel- und einzelsträngiger Desoxyribonukleotide „DNA", Ribonukleotide „RNA", α-anomerische Formen davon und dergleichen.
„Oligonukleotid-Analoga" sind polymerische Analoga von Oligonukleotiden, die aus monomerischen Nukleotid-Analog-Einheiten hergestellt worden sind und einige der Qualitäten und Eigenschaften besitzen, die mit Nukleinsäuren in Verbindung gebracht werden.
„Nukleotid" ist die Monomer-Einheit in biopolymerischen Nukleinsäuren, wie DNA oder RNA, abgekürzt als „Nt". Ein Nukleotid ist aus drei Resten aufgebaut: Zucker, Phosphat und Nukleobase (Blackburn, 1996). Wenn sie Teil einer Duplex sind, werden Nukleotide auch als „Basen" oder „Basenpaare" bezeichnet, abgekürzt als „Bp". Die am meisten gängigen natürlich vorkommenden Nukleobasen, Adenin (A), Guanin (G), Uracil (U), Cytosin (C) und Tymin (T) besitzen die Wasserstoff-Bindungsfunktionalität, welche einen Polynukleotid-Strang an einen anderen in einer sequenzspezifischen Weise bindet. „Nukleosid" bezeichnet ein Nukleotid, dem ein Phosphat fehlt. Gewöhnlicherweise sind die Nukleosid-Monomere durch „Phosphodiester-Verknüpfungen" verbunden, wobei solche, soweit hier verwendet, Phosphodiester-Bindungen oder Bindungen, die Phosphat-Analoga davon einschließen, bezeichnen, einschließlich assoziierten Gegenionen, z. B. H⁺, NH₄ ⁺, Na⁺ und dergleichen. Polynukleotiden variieren typischerweise in der Größe von ein Paar monomerischen Einheiten, z. B. 8–40 Nt bis mehreren Tausend monomerische Einheiten. Die meisten molekularbiologischen Anwendungen für Polynukleotide benötigen einheitliche Sequenzen von 15–30 Nt. Wenn ein DNA-Polynukleotid durch eine Buchstabenabfolge dargestellt wird, wie z. B. „ATGCCTG", wird dies so verstanden, dass die Nukleotide in 5'→3' Reihenfolge von links nach rechts angeordnet sind. Die Enden eines einzelsträngigen Oligonukleotids werden als „5'-Terminus" und 3'-Terminus" bezeichnet.
„Watson/Crick-Basenpaarung" bezeichnet das komplementäre Muster von spezifischen Paaren von Nukleotiden in DNA, RNA und Analoga davon, welche über Wasserstoff-Brückenbindungen aneinander binden, z. B. A paart mit T und U und G paart mit C.
„Verknüpfungsstelle" bezeichnet das Atom auf einem Oligonukleotid, an das ein Linker verknüpft ist.
„Linker" bezeichnet ein oder mehrere Atome, die ein Oligonukleotid an einen Festträger, Markierung oder anderen Rest verbinden.
Der Ausdruck „Festträger" bezeichnet ein Material in der Festphase, welches mit Reagenzien in der Flüssigphase durch heterogene Reaktionen interagiert. Festträger können mit Oligonukleotiden durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung über eine oder mehrere Verknüpfungsstellen derivatisiert sein und dadurch ein Oligonukleotid an den Festträger „immobilisieren".
Der Ausdruck „Anlagerung" wird synonym zu „Hybridisierung" verwendet und bezeichnet die Watson/Crick-Basenpaarungsinteraktionen zwischen zwei Oligonukleotid-Strängen innerhalb einer Duplex.
Der Ausdruck „Überhang" bezeichnet einen Einzelstrang-Terminus einer Duplex von Basen-gepaarten Oligonukleotiden. Der Überhang kann eine oder mehrere Basen lang sein und ermöglicht eine Anlagerung eines komplementären Oligonukleotids vor der Ligation und Verlängerung während der Polynukleotid-Assemblierung.
„Denaturierende" Bedingungen oder Reagenzien zerstören die Basenpaarung und verursachen eine Auftrennung einer Duplex in Einzelstränge. Denaturierende Bedingungen und Reagenzien umfassen Erhitzung, basischer pH, hohe Salzkonzentrationen und spezifische Denaturierungsmittel, wie Formamid und Ammoniumhydroxid.
„Nicht-denaturierende" Bedingungen ermöglichen die Erhaltung von Basenpaarungen in Duplex-Strukturen. Nicht-denaturierende Bedingungen umfassen typischerweise niedrige Temperatur, neutraler pH, niedrige Salzkonzentrationen, neutrale wässrige Puffer und Reagenzien, welche nicht die Wasserstoff-Brückenbindung zwischen Nukleobasen unterbrechen.
Der Ausdruck „ligieren" bezeichnet die Reaktion der kovalenten Verknüpfung von benachbarten Oligonukleotiden durch Bildung einer Internukleotid-Verknüpfung.
Der Ausdruck „Ligase" bezeichnet eine Enzymklasse und deren Funktionen bei der Bildung einer Phosphodiester-Bindung von benachbarten Oligonukleotiden, welche an dasselbe Oligonukleotid angelagert werden. Eine besonders effiziente Ligation findet statt, wenn das terminale Phosphat von einem Oligonukleotid und die terminale Hydroxylgruppe eines benachbarten zweiten Oligonukleotids über deren komplementären Sequenzen innerhalb einer Doppel-Helix aneinander angelagert werden, d. h., wo der Ligationsprozess ein „Nick" bei einer ligierbaren Nick-Stelle ligiert und eine komplementäre Duplex erzeugt (Blackburn, 1996). Die Stelle zwischen den benachbarten Oligonukleotiden wird als „ligierbare Nick-Stelle", „Nick-Stelle" oder „Nick" bezeichnet, wobei die Phosphodiester-Bindung nicht vorhanden oder gespalten ist.
Der dazwischen liegende einzelsträngige Teil zwischen zwei Oligonukleotiden in einer Duplex wird als eine „Lücke" („gap") bezeichnet, die aus einem oder mehreren Nukleotiden besteht. Eine Lücke kann durch Verlängerung von einem 3'-Terminus eines Primers entfernt oder „ausgefüllt" werden.
„Primer-Verlängerungsreaktion", „Verlängerung" und „verlängern" bezeichnet eine Reaktion zwischen einer Template-/Primer-Duplex, 5'-triphosphat-Nukleotiden (NTP) und einer Polymerase, was das Hinzufügen des Nukleotids an ein 3'-Ende des Primers zur Folge hat, so dass die hinzugefügten Nukleotide komplementär sind zu den korrespondierenden Nukleotiden des Nukleinsäure-Templates.
„Markierung" bezeichnet eine Gruppe, die mit an einem Oligonukleotid verknüpft ist. Die Markierung ist in der Lage, eine Funktion zu übernehmen, wie z. B. ein Signal für den Nachweis des Moleküls zu senden durch Mittel, wie Fluoreszenz, Chemilumineszenz und elektrochemische Lumineszenz (Hermanson, 1996). Alternativ ermöglicht eine Markierung die Auftrennung oder Immobilisierung des Moleküls durch ein spezifisches oder nicht-spezifisches Abfangverfahren (Andrus, 1995).
„Primer" bezeichnet ein Oligonukleotid, das in der Lage ist, sich selektiv an eine spezifizierte Ziel-Nukleinsäure anzulagern und danach als Initiationsstelle einer Primer-Verlängerungsreaktion zu dienen, wobei der Primer in 5'→3'-Richtung verlängert wird.
Der Ausdruck "5'→3'-Nuklease-Aktivität" bezeichnet eine Enzymaktivität, welche eine Nukleinsäure an Phosphodiester-Bindungen spaltet. Diese Aktivität kann entweder endogen (spaltet an internen Phosphodiester-Bindungen) oder exogen (spaltet an der Phosphodiester-Bindung, die am nächsten zu dem 5'- oder dem 3'-Terminus des Nukleinsäurestrangs ist) sein.
Der Ausdruck „selbst-löschend" bezeichnet einen intermolekularen Fluoreszenz-Energieübergangseffekt, z. B. sind ein Reporter und Quencher auf einem Oligonukleotid in einer Konfiguration gebunden, die einen Energietransfer von dem Reporter auf den Quencher ermöglicht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es wird nun im Detail Bezug genommen auf die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung. Beispiele hierzu sind in den dazugehörigen Zeichnungen verdeutlicht. Während die Erfindung in Verbindung mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird, soll diese in keiner Weise auf diese Ausführungsformen beschränkt sein. Vielmehr soll die Erfindung Alternativen, Modifikationen und Äquivalente umfassen, welche innerhalb der Erfindung eingeschlossen sind, entsprechend den anhängigen Patentansprüchen.
I. SYNTHESE DER ASSEMBLIERUNGS- UND BRÜCKEN-OLIGONUKLEOTIDE
Im Allgemeinen folgt der Entwurf und die Synthese der erfindungsgemäßen Brücken- und Assemblierungs-Oligonukleotiden nach konventionellen Anleitungen (Beaucage, 1992; Caruthers, 1983). Das Phosphoramidit-Verfahren der Oligonukleotidsynthese (Beaucage, 1983; Beaucage, 1992) ist das universell am meisten favorisierte Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden, die in der Erfindung verwendet werden. Das Phosphoramidit-Verfahren ist ein stark verfeinerter chemischer Ablauf der zyklischen Hinzufügung von Nukleotid-Monomereinheiten zu einer Kette von DNA, die auf einem Festträger zunimmt, und wird gewöhnlicherweise unter Verwendung von automatisierten, kommerziell erhältlichen Synthesegeräten praktiziert, welche als Mikroprozessor-kontrollierte Reagenz-Abgabe-Roboter arbeiten, z. B. ABI 39I, 392, 394 und 3948 DNA-/RNA-Synthetisierer (Perkin-Eimer Corp.) (Caruthers, 1984). Der 5'- oder 3'-Terminus eines Oligonukleotids kann mit einem Phosphoramidit-Reagens (Horn, 1986) oder enzymatisch mit einer Polynukleotid-Kinase und ATP (Berger, 1987, Seiten 438–39) phosphoryliert werden.
Oligonukleotide können auf, Festträgern über eine beliebige einer Reihe von gut bekannten kovalenten Bindungen oder nicht-kovalenten Interaktionen auf Festträgern immobilisiert sein. Der Träger umfasst unlösliche Materialien, vorzugsweise hat er einen starren oder halbstarren Aufbau und kann eine beliebige Form haben, z. B. kugelförmig, wie in Kügelchen, rechtwinklig, irreguläre Teilchen, Harze, Gele, Mikrosphären oder im Wesentlichen flach sein. In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, eine Reihe von physikalisch getrennten Syntheseregionen auf dem Träger zu entwerfen mit, z. B. Vertiefungen, angehobenen Bereichen, Versenkungen, Pins, Schlitzen, Stäbchen, Stiften, inneren oder äußeren Wänden von Zylindern und dergleichen.
Bevorzugte Trägermaterialien umfassen ein Agarose, Polyacrylamid, magnetische Kügelchen (Stamm, 1995), Polystyrol (Andrus, 1993), kontrolliertes Porenglas (Caruthers, 1984), Polyacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Polyamid, Polyethylen, Polyethylenoxid oder Copolymere und Transplantate von solchen. Polyethylenoxid-/Polystyrol-Copolymere werden weitläufig für die Synthese von kleinen Molekülen und Peptiden verwendet und ist ein besonders bevorzugter Festträger der vorliegenden Erfindung (Tentagel, Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland). Die hydrophile Natur der Polyethylenoxid-Gruppen fördert die schnellen Kinetiken und Bindung, wenn wässrige Lösungsmittel verwendet werden. Weitere Ausführungsformen von Festträgern umfassen kleine Teilchen, Membranen, Fritten, nicht-poröse Oberflächen, adressierbare Anordnungen, Vektoren, Plasmide oder Polynukleotid-immobilisierende Medien.
Entsprechend ihrer Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren werden die Oligonukleotide durch kovalente Bindungen, ionische Bindungen oder andere Affinitäts-Interaktionen mit chemisch reaktiver Funktionalität an die Festträger verknüpft. Oligonukleotide können an Festträgern an deren 3'-, 5'-Zucker- oder Nukleobasenstellen (Goodchild, 1990; Beaucage, 1993) verknüpft werden. Die 3'-Stelle für die Anheftung über einen Linker an den Träger ist aufgrund der vereinfachten Oligonukleotidsynthese und -Effizienz und aufgrund der vielen Optionen, die für stabile oder selektiv spaltbare Linker verfügbar sind, bevorzugt (Beaucage, 1992). Auf diese Weise können Präparationen von immobilisierten Oligonukleotiden in Größenbereichen von Gramm bis Kilogramm erhalten werden bei Ladebereichen von 1–2000 nMol Oligonukleotid pro Gramm Träger und vorzugsweise in einem Bereich von 500–100 nMol Oligonukleotid pro Gramm Träger.
Die Immobilisierung wird vorzugsweise durch eine kovalente Bindung zwischen dem Träger und dem Oligonukleotid fertiggestellt. Die Verbindungseinheit oder Linker ist so konstruiert, dass sie stabil ist und den Zugang der immobilisierten Nukleinsäure an deren Sequenzgegenstück erleichtert. Alternativ sind nicht-kovalente Verbindungen, wie z. B. zwischen Biotin und Avidin oder Streptavidin, nützlich. Ein typisches Verfahren zur Anheftung von Oligonukleotiden ist die Kopplung eines mit Thiol funktionalisierten Polystyrol-Kügelchens mit einem 3'-Thiol-Oligonukleotid unter milden oxidierenden Bedingungen, um einen Disulfid-Linker zu bilden. Beispiele von anderen Linker mit funktionellen Gruppen umfassen Ester, Amid, Carbamat, Harnstoff, Sulfonat, Ether und Thioester.
Ein 5'- oder 3'-biotinyliertes Oligonukleotid kann auf Avidin oder Streptavidin, das an einen Träger gebunden ist, wie Glas oder SEPHAROSE^TM (Pharmacia Biotech), immobilisiert werden.
Alternativ kann der 5'-Terminus eines Oligonukleotids an einen Festträger immobilisiert werden. Die Richtung des assemblierten Polynukleotids und des Oligonukleotid-Bestandteils der vorhergehenden Ausführungsformen würden somit umgedreht sein, obgleich auch gleichermaßen geeignet und effizient.
II. ANLAGERUNG LIGATION UND VERLÄNGERUNG
Anlagerung
Oligonukleotide werden vorzugsweise für die Assemblierung in wässrigen Medien angelagert, welche die Watson/Crick-Basenpaarung fördern bei oder nahe der Raumtemperatur. Beispielhafte Anlagerungsbedingungen ist ein Temperaturbereich von 30–65°C und ein Assemblierungslösungsmittel von 0,2–1,0 M NaCl oder KCl, 10–50 mM MgCl₂, 100 mM Tris-HCl und 0–50% Formamid, bei pH = 7–9 (Berger, 1987; Seite 549). Zum Beispiel wird 1 mg Träger (1 nMol, geladen mit 1 μMol Oligonukleotid/gm) mit 5 nMol von jedem Oligonukleotid während jedem Anlagerungs- und Ligationszyklus angelagert in einem Gesamtvolumen von 10–50 μl Lösung.
Ligation
In einer Ligationsreaktion bewirkt ein Ligationsreagens die Ligation einer ligierbaren Nick-Stelle, die sich zwischen zwei Assemblierungs-Oligonukleotiden befindet. Die DNA-Ligase übernimmt die enzymatische Ligation bei einer ligierbaren Nick-Stelle, um eine Internukleotid-Phosphodiester-Bindung zu erzeugen und einen kontinuierlichen Strang in dem immobilisierten Ligationsprodukt zu erzeugen. Die Ligation mit DNA-Ligase ist hoch spezifisch und kommt im Allgemeinen nur bei einer perfekten Komplementarität in der Nähe der Nick-Stelle vor. Zusammen mit ATP oder NAD⁺, katalysiert die DNA-Ligase die Bildung einer Phosphodiester-Bindung zwischen dem 5'-Phosphoryl-Terminus und dem 3'-Hydroxyl-Terminus von zwei doppelsträngigen Oligonukleotiden (Wu, 1987; Helfman, 1987; Grossman, 1994).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die 5'-Phosphatgruppe eines Assemblierungs-Oligonukleotids an das 3'-Hydroxyl eines benachbarten Assemblierungs-Oligonukleotids ligiert. Typischerweise ist der 5'-Terminus der ligierbaren Nick-Stelle phosphoryliert und der 3'-Terminus ist Hydroxyl, obwohl die gegensätzliche Orientierung von 5'-Hydroxyl und 3'-Phosphat auch zu einer effizienten Ligation durch DNA-Ligase führt (Sambrook, 1989, Seite 5.61). Die enzymatische Ligation des assemblierten Oligonukleotids auf einem Festträger kann durch Behandlung des assemblierten Polynukleotids auf dem Festträger durchgeführt werden (z. B. 1c., 1), beispielsweise mit 20 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP und 50 mM Tris-HCl, gefolgt durch den Zusatz von T4-DNA-Ligase oder anderen Formen von Ligase. Zum Beispiel würde 1 nMol assembliertes Polynukleotid einer Ligation mit einer Einheit Ligase in einem Gesamtvolumen von 10–50 μl Lösung untergehen (Aono, 191). Nach mehreren Minuten bis mehreren Stunden bei 37°C bei leichter Bewegung wird der Träger dann gefiltert, zentrifugiert oder abgesaugt, um überschüssige flüssige Reagenzien zu entfernen und mit einem neutralen, wässrigen Puffer, wie z. B. mehrere ml 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7, gewaschen.
Eine ligierbare Nick-Stelle eines assemblierten Polynukleotids kann auch mit Reagenzien chemisch ligiert werden, beispielsweise mit Bromcyan und Dicyclohexylcarbodiimid, um eine Internukleotid-Phosphatbindung zwischen zwei benachbarten, assemblierten Oligonukleotiden zu bilden, wobei eines davon eine 5'- oder 3'-Phosphatgruppe trägt, die an ein Brücken-Oligonukleotid angelagert sind (Shabarova, 1991).
Der Festträger kann unter denaturierenden Bedingungen nach jeder Ligation gewaschen werden, um nicht-immobilisierte Stränge zu entfernen. Bevorzugte Denaturanzien umfassen Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Formamid, Harnstoff, Natriumchlorid und Natriumacetat.
Verlängerung
Das in wiederholter Weise angelagerte und ligierte immobilisierte Ligationsprodukt, von dem die Brücken-Oligonukleotide unter denaturierenden Bedingungen entfernt worden sind, wird mit DNA-Polymerase, einem Primer, Nukleotid-5'-triphosphaten und anderen Reagenzien, die für eine Verlängerung notwendig sind, um ein doppelsträngiges Polynukleotid auf dem Festträger zu erzeugen, kopiert (6e).
In einer Primer-Verlängerungsreaktion wird ein Primer, der komplementär zu dem Polynukleotid ist, an das Polynukleotid angelagert. Eine DNA-Polymere katalysiert die nachfolgende Verknüpfung der komplementären Nukleotide aus Nukleotid-5'-triphosphaten an den 3'-Terminus des Primers durch Bildung von neuen Internukleotid-Phosphatbindungen. Ein neuer komplementärer DNA-Strang wird somit ausgehend vom Primer verlängert.
Nach Vervollständigung der Anlagerungs- und Ligationszyklen können die immobilisierten Stränge des assemblierten Polynukleotids an ein oder mehrere Brücken-Oligonukleotide angelagert werden, durch welche die Nick-Stellen ligiert werden. Die einzelsträngigen Teile oder „Lücken" des assemblierten Polynukleotids können durch eine Primer-Verlängerung aufgefüllt werden, gefolgt durch Ligation des Nicks. Der 3'-Terminus innerhalb einer Lücke in einer Duplex kann ausgehend von dem 3'-Terminus eines Primers durch eine DNA-Polymerase und 2'-Desoxynukleotid-5'-triphosphaten unter bekannten Bedingungen verlängert werden (Berger, 1987, Seiten 91–98). Polymeraseenzyme, die für den Verlängerungsschritt der erfindungsgemäßen Syntheseverfahren geeignet sind oder für die Verwendung bei der Amplifizierung des Polynukleotids durch Polymerasekettenreaktion geeignet sind, schließen all diejenigen ein, die in der Lage sind, Nukleotid-triphosphate von einem Polynukleotid, das an einen Festträger immobilisiert ist, zu polymerisieren. Bevorzugte Polymerase-Enzyme haben eine hohe Genauigkeit und Prozessivität. Geeignete Enzyme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, T7-DNA-Polymerase, T4-Polymerase, Taq-Polymerase und AMV- (oder MuLV) reverse Transkriptase oder nahe homologe Mutanten (Sambrook, 1989, Seiten 5.35–56). Bevorzugter ist das Enzym für den Verlängerungsschritt und die Polymerasekettenreaktion Taq-Polymerase oder eine nahe homologe Mutante davon.
Alternativ kann der nicht-immobilisierte Strang von dem immobilisierten Ligationsprodukt unter denaturierenden Bedingungen entfernt werden. Eine Primer-Verlängerung mit Polymerase, einem Primer und Nukleotid-5'-triphosphaten kann den immobilisierten Strang ausgehend von der Primer-Anlagerungsstelle kopieren. Der Primer wird an dessen 3'-Hydroxyl in Richtung des 3'-Terminus des immobilisierten Strangs verlängern.
Nukleotid-5'-triphosphate (NTP), die zur Verwendung bei dem Verlängerungsschritt der erfindungsgemäßen Syntheseverfahren oder Verwendung bei der Amplifizierung des Polynukleotids durch Polymerasekettenreaktion geeignet sind, umfassen all diejenigen, die fähig sind, durch ein Polymerase-Enzym polymerisiert zu werden. Geeignete NTP umfassen sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Nukleotid-triphosphate und sind nicht beschränkt auf ATP, dATP, CTP, dCTP, GTP, dGTP, UTP, TTP, dUTP, 5-Methyl-CTP, 5-Methyl-dCTP, ITP, dITP, 2-Amino-ATP, 2-Amino-dATP und die α-Thio-triphosphate, 2'-O-Methyl-ribonukleotid-5'-triphosphate, 2'-F1uor-NTP und 2'-Amino-NTP für all die oben genannten. Vorzugsweise sind die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nukleotid-triphosphate ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dATP, dCTP, dGTP, TTP und Gemischen davon.
Modifizierte Nukleobasen könne auch verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf 5-Br-UTP, 5-Br-dUTP, 5-F-UTP, 5-F-dUTP, 5-Propynyl-dCTP und 5-Propynyl-dUTP. Die meisten dieser Nukleotid-triphosphate sind von kommerziellen Quellen leicht erhältlich, beispielsweise Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Nukleotid-triphosphate werden vorteilhafterweise in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, zumindest da sie im Allgemeinen billiger als die Phosphoramiditnukleosidmonomere sind, die bei der chemischen Synthese von Oligonukleotiden verwendet werden.
Alternativ können Fluoreszenz-markierte dNTP zugefügt werden oder anstelle eines oder mehrerer ATP, GTP, CTP TTP ersetzt werden, um fluoreszierende Farbstoffe in das doppelsträngige assemblierte Polynukleotid-Produkt einzufügen.
Typische Bedingungen einer Primer-Verlängerung können den Zusatz der folgenden Lösung (1–50 μl) zu dem assemblierten Polynukleotid auf einem Festträger (50–1000 pMol) umfassen: Primer-Oligonukleotid (wenn benötigt), 1 Einheit DNA-Polymerase, 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM Dithiothreitol, 4 mM Spermidin, 8 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 160 μg/ml BSA, 0,02% Trion X-100 und 2 mM von jeweils ATP, GTP, CTP, TTP. Zum Beispiel werden nach 10 Minuten bis 2 Stunden bei 37°C überschüssige flüssige Reagenzien von dem Träger entfernt und der Träger wird mit 0,5–5 ml neutralem wässrigem Puffer gewaschen, wie beispielsweise 0,1 M Triethylammoniumacetat (Sambrook, 1989, Seiten 5.35–5.50).
III. ASSEMBLIERUNG VON POLYNUKLEOTIDEN
Mehrere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind hier beschrieben, welche das Verfahren der Assemblierung von Polynukleotiden auf einen Festträger veranschaulichen.
1. Sequentielle Anlagerung
In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Assemblierungsverfahrens wird ein Assemblierungs-Oligonukleotid 10, der vorzugsweise eine 5'-Phosphatgruppe 11 aufweist, z. B. 1–10 mg, 0,5–20 nMol, an einen Festträger 15 über einen linker 16 immobilisiert (1a., 1). Das immobilisierte Assemblierungs-Oligonukleotide 20 wird in einem Assemblierungs-Lösungsmittel, z. B. 0,2 M NaCl oder KCl und 0–50% Formamid, suspendiert. Wässrige Assemblierungs-Lösungsmittel, welche eine Watson/Crick-Basenpaarung bei oder nahe der Raumtemperatur ermöglichen, sind bevorzugt. Ein Brücken-Oligonukleotid 25, z. B. im 2–10-fachen molaren Überschuss, 1–200 nMol, wird zugeführt mit einer Sequenz, die zumindest teilweise komplementär ist zu dem immobilisierten Assemblierungs-Oligonukleotid 20 unter Bedingungen, welche eine Anlagerung des Brücken-Oligonukleotids an das immobilisierte Assemblierungs-Oligonukleotid 20 fördern, um ein Hybrid 21 zu bilden, der eine Duplex-Region 30 und einen ersten Überhang 35 (1b.) aufweist. Überschüssiges oder nicht-angelagertes Brücken-Oligonukleotid 25 und andere Unreinheiten können durch Waschen des Festträgers unter nicht-denaturierenden Bedingungen entfernt werden. Es wird ein Assemblierungs-Oligonukleotid 40, z. B. in 2–10-fachem molarem Überschuss, 1–20 nMol, das eine Sequenz aufweist, die zumindest teilweise komplementär ist mit dem Überhang 35, hinzugefügt. Das Assemblierungs-Oligonukleotid 40 lagert sich an den Überhang 35 des Brücken-Oligonukleotids 25 und benachbart zu dem immobilisierten Oligonukleotid 10 an, erzeugt eine ligierbare Nick-Stelle 45 und einen zweiten Überhang 50 (1c.).
Ein ligierendes Agens, z. B. DNA-Ligase, ATP und weitere Reagenzien, die für eine Ligation notwendig sind, werden zugeführt, um das immobilisierte Assemblierungs-Oligonukleotid 20 an das benachbarte Assemblierungs-Oligonukleotid 40 zu ligieren, um ein immobilisiertes Ligationsprodukt 60 zu bilden (1d.).
Ein Gegenstück des immobilisierten Ligationsprodukts wird dann mit DNA-Polymerase, einem Primer, Nukleotid-5'-triphosphaten und anderen Reagenzien, die für eine Primer-Verlängerung notwendig sind, synthetisiert, um ein doppelsträngiges Polynukleotid auf dem Festträger 65 zu erzeugen (1e.).
2. Gleichzeitige Anlagerung mit zwei Oligonukleotiden
In einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Assemblierungsverfahrens wird ein immobilisiertes Assemblierungs-Oligonukleotid 20 (2a., 2) in einem Assemblierungs-Lösungsmittel suspendiert. Es werden ein Brücken-Oligonukleotid 25 mit einer Sequenz, die zumindest teilweise komplementär ist zu dem immobilisierten Oligonukleotid, und ein Assemblierungs-Oligonukleotid 40, mit einer Sequenz, die zumindest teilweise komplementär ist zu dem Brücken-Oligonukleotid, als ein Gemisch zugeführt. Das Brücken-Oligonukleotid 25 lagert sich an das immobilisierte Assemblierungs-Oligonukleotid 20 an und das Assemblierungs-Oligonukleotid 40 lagert sich benachbart an das immobilisierte Assemblierungs-Oligonukleotid 20 an, wobei eine ligierbare Nick-Stelle 45 und ein Überhang 50 (2b.) entsteht. Überschüssige oder nicht-angelagerte Oligonukleotide 25 und 40 und andere Unreinheiten könne durch Waschen unter nicht-denaturierenden Bedingungen entfernt werden.
Ein ligierendes Agens, z. B. DNA-Ligase, ATP und weitere Reagenzien, die für eine Ligation notwendig sind, werden zugeführt, um das immobilisierte Assemblierungs-Oligonukleotid 20 an das benachbarte Assemblierungs-Oligonukleotid 40 zu ligieren, um ein immobilisiertes Ligationsprodukt 60 (2c.) zu bilden.
Ein Gegenstück zu dem immobilisierten Ligationsprodukt wird dann mit DNA-Polymerase, einem Primer, Nukleotid-5'-triphosphaten und weiteren Reagenzien, die für eine Primer-Verlängerung notwendig sind, synthetisiert, um ein doppelsträngiges Polynukleotid an den Festträger 65 zu erzeugen (2d.).
Das Vorausgegangene kann in der gleichen Weise und mit ähnlichen Mengen durchgeführt werden, wie in Abschnitt III.1 beschrieben.
3. Gleichzeitige Anlagerung mit mehr als zwei Oligonukleotiden
In einer dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Assemblierungsverfahrens wird ein immobilisiertes Assemblierungs-Oligonukleotid 20 (3a., 3) in einem Assemblierungs-Lösungsmittel suspendiert. Mehr als zwei Anlagerungs-Oligonukleotide, z. B. 40a–c, werden als ein Gemisch zugeführt. Das Gemisch enthält ein oder mehrere Brücken-Oligonukleotide 25a–c, welche sich anlagern, um Lücken 70a–b zu bilden, und ein oder Assemblierungs-Oligonukleotide 40a–c, welche sich anlagern, um ligierbare Nick-Stellen 45a–c (3b.) zu bilden. Überschüssige oder nicht-angelagerte Oligonukleotide 25 und 40 und andere Unreinheiten können durch Waschen unter nicht-denaturierenden Bedingungen entfernt werden.
Ein ligierendes Agens, z. B. DNA-Ligase, ATP und weitere Reagenzien, die für eine Ligation notwendig sind, werden zugeführt, um die Nick-Stellen an den benachbarten Assemblierungs-Oligonukleotiden zu ligieren, um ein immobilisiertes Ligationsprodukt 60 (3c.) zu bilden.
Ein Gegenstück zu dem immobilisierten Ligationsprodukt wird dann mit den DNA-Polymerase, einem Primer, Nukleotid-5'-triphosphaten und weiteren Reagenzien, die für eine Primer-Verlängerung notwendig sind, synthetisiert, um ein doppelsträngiges Polynukleotid auf dem Festträger 65 (3d.) zu erzeugen.
Das Vorausgegangene kann in der gleichen Weise und mit ähnlichen Mengen, wie in Abschnitt III.1 beschrieben, durchgeführt werden.
4. Repetitive sequentielle Anlagerung
Die Schritte der sequentiellen Anlagerung eines Brücken- und eines Assemblierungs-Oligonukleotids, wie in Abschnitt III.1 beschrieben, gefolgt von Ligation mit dazwischen liegenden Waschschritten, können bis zu 100 Mal oder öfter wiederholt werden. (4e.). Das sich wiederholt angelagerte und ligierte immobilisierte Ligationsprodukt 75 wird mit DNA-Polymerase, einem Primer, Nukleotid-5'-triphosphaten und weiteren Reagenzien, die für eine Verlängerung notwendig sind, um ein immobilisiertes doppelsträngiges Polynukleotid auf dem Festträger 65 zu bilden, vervielfältigt (4f.).
Das Vorausgegangene kann in der gleichen Weise und mit ähnlichen Mengen, wie in Abschnitt III.1 beschrieben, durchgeführt werden.
5. Repetitive gleichzeitige Anlagerung mit zwei Oligonukleotiden
Die Schritte der gleichzeitigen Anlagerung eines Brücken- und eines Assemblierungs-Oligonukleotids, wie in Abschnitt III.2 beschrieben, gefolgt von Ligation mit dazwischen liegenden Waschschritten, können bis zu 100 Mal oder öfter wiederholt werden. (5d.). Das sich wiederholt angelagerte und ligierte immobilisierte Ligationsprodukt 75 wird mit DNA-Polymerase, einem Primer, Nukleotid-5'-triphosphaten und weiteren Reagenzien, die für eine Verlängerung notwendig sind, um ein immobilisiertes doppelsträngiges Polynukleotid auf dem Festträger 65 zu bilden, vervielfältigt (5e.).
Das Vorausgegangene kann in der gleichen Weise und mit ähnlichen Mengen, wie in Abschnitt III.1 beschrieben, durchgeführt werden.
6. Repetitive gleichzeitige Anlagerung mit mehr als zwei Oligonukleotiden
Die Schritte der gleichzeitigen Anlagerung von mehr als einem Brücken-Oligonukleotid und mehr als einem Assemblierungs-Oligonukleotid, wie in Abschnitt III.2 beschrieben, gefolgt von Ligation mit dazwischen liegenden Waschschritten, können bis zu 100 Mal oder öfter wiederholt werden. (6d.). Das sich wiederholt angelagerte und ligierte immobilisierte Ligationsprodukt 75 wird mit DNA-Polymerase, einem Primer, Nukleotid-5'-triphosphaten und weiteren Reagenzien, die für eine Verlängerung notwendig sind, um ein immobilisiertes doppelsträngiges Polynukleotid auf dem Festträger 65 zu bilden, vervielfältigt (6e.).
Das Vorausgegangene kann in der gleichen Weise und mit ähnlichen Mengen, wie in Abschnitt III.1 beschrieben, durchgeführt werden.
IV. ENTWURF EINER POLYNUKLEOTID-ASSEMBLIERUNG
Es wird ein Gen mit bekannter DNA-Sequenz und von besonderem Interesse für eine Assemblierung ausgewählt. Die Größe des Gens kann zwischen 50 Bp bis 5.000 Bp oder mehr betragen. Bei der Planung wird ein Strang der Polynukleotid-Sequenz, die synthetisiert werden soll, in einem zusammenhängenden Satz von Assemblierungs-Oligonukleotid-Sequenzen von 20–200 Nt, bevorzugt 30–50 Nt, aufgeteilt. Es werden Brücken-Oligonukleotide von 6–40 Nt entworfen, um Assemblierungs-Oligonukleotide anzulagern und um die Nick-Stellen auf dem immobilisierten Strang zu bilden. Die Größe des komplementären Überhangs bei den Oligonukleotiden, welche die Duplex-Bereiche bilden, kann von beliebiger Länge sein, so dass eine ausreichende Spezifität und Affinität gewährleistet ist. In einer bevorzugten Ausführungsbeispiel wird der komplementäre Überhang 5 bis 10 Nt sein und kann bis zu 50 Nt betragen. Die Assemblierungs- und Brücken-Oligonukleotide, welche das assemblierte Gen umfassen, werden entsprechend der vorhergesagten Anlagerungseigenschaften, z. B. thermische Schmelztemperatur, T_m, ausgewählt. Die Duplex-Bereiche, die durch die Anlagerung der Oligonukleotide entstehen, müssen stabil genug sein, um den Waschschritt und andere Behandlungen zu überstehen und um eine effiziente Ligation durchzumachen.
Assemblierungs-Polynukleotide können enthalten: (i) Nukleotid-Einheiten, wie A, dA, C, dC, G, dG, U, T, dU, 5-Methyl-C, 5-Methyl-dC, I, dI, 2-Amino-A, 2-Amino-dA, 5-Br-U, S-Br-dU, S-F-U, S-F-dU, 5-Propynyl-dC, 5-Propynyl-dU, (ii) Internukleotid-Verbindungen, wie Phosphodiester, Phosphorothioat, N-3-Phosphoramidat und (ii) Zucker, wie 2'-Desoxyribose, 2'-O-Methyl-ribonukleotide, 2'-Fluor-ribonukleotide und 2'-Amino-ribonukleotid-Analoga.
Kommerziell erhältliche Softwareprogramme können verwendet werden, um den optimalen Satz von Oligonukleotiden zu entwerfen, basierend auf Berechnungen der Hybridisierungsenergie, welche einen schmalen Bereich bei den T_m-Werten ergeben (Sambrook, 1989, Seite 11.46). Weitere Erwägungen für den Entwurf einer Oligonukleotid-Sequenz sind (i) das Vermeiden von selbst-komplementären Haarnadelbereichen, (ii) das Vermeiden von Regionen mit schlechter Syntheseeffizienz, z. B. vier oder mehr aufeinander folgende G-Monomere, (iii) seltene oder schlecht exprimierte codons und (iv) Positionierung von Restriktionsstellen für die Spaltung und weitere Klonierungsvorgänge. Der vollständige Satz von Oligonukleotiden, welche benötigt werden, um die erfindungsgemäßen Assemblierungsverfahren durchzuführen, kann auf diese Weise entworfen und synthetisiert werden.
Die immobilisierte doppelsträngige Polynukleotid-Sequenz kann eine konservierte oder eine universelle Sequenz sein und braucht nicht Teil des funktionellen Gens sein. Die Sequenz des immobilisierten Fragments kann eine Restriktionsstelle enthalten, die durch ein Restriktionsenzym spaltbar ist. Das immobilisierte Oligonukleotid kann an ein größeres Polynukleotid-Fragment verbunden sein, wie z. B. ein Plasmid oder Vektor. Beispiele von geeigneten erfindungsgemäßen Plasmiden schließen M13-abgeleitete Vektoren, pUC und pGEM ein (Sambrook, 1989, Kapitel 1), welche in bakteriellen Großkulturen wachsen gelassen und geerntet werden können (Berger, 1987, Seiten 145–70) und an bekannten Restriktionsstellen zur Assemblierung von Polynukleotiden geschnitten werden können.
V. AMPLIFIKATION VON IMMOBILISIERTEN POLYNUKLEOTIDEN AUF EINEM FESTTRÄGER
Immobilisierte Ligationsprodukte können als Matrizen durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden (Stamm, 1995). Nachdem die Assemblierung von z. B. 50–1.000 pMol immobilisiertes Ligationsprodukt beendet ist, können PCR-Reagenzien als eine Lösung zugeführt werden, einschließlich DNA-Polymerase, Nukleotid-5-triphosphate und zwei Primer, die komplementär sind zu (i) dem immobilisierten Ligationsprodukt und (2) dessen Gegenstück. Die Temperatur kann zwischen den Anlagerungs-/Verlängerungs-/ und Denaturierungs-Temperaturen zyklisch verändert werden, um Kopien des doppelsträngigen Polynukleotids von dem immobilisierten Ligationsprodukt in Lösung zu bilden. Die Einführung von Fluoreszenzfarbstoffen als Fluoreszenz-markierte Primer oder als fluoreszierende Nukleotide kann Fluoreszenz-markierte und detektierbare Polynukleotide erzeugen. Es können mehrere PCR-Produkte verschiedener oder derselben Größen von einem einzelnen assemblierten Polynukleotid mit einer Vielzahl von Primern erhalten werden, wobei jeder zu verschiedenen Teilen des immobilisierten Ligationsprodukts komplementär ist und als Paare auf den sich gegenüberliegenden Strängen ausgewählt werden. Wenn Primer, die bestimmte PCR-Produkte definieren, mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, können mehrere PCR-Produkte spektral voneinander unterschieden werden, und dadurch detektiert und quantifiziert werden. Die Multiplex-PCR auf einem Festträger ist auch ein einfacher und effizienter Weg, um mit Matrizen für eine PCR auf einem Festträger umzugehen, wobei dadurch weniger Kontaminationen von zufällig zerstreuten Templates und eine fehlerhafte Amplifikation vorkommt.
Die Sequenz des immobilisierten Ligationsprodukts kann durch die Festphasen-Sanger-Didesoxy-DNA-Sequenzierverfahren analysiert werden.
VI. DETEKTION UND QUANTIFIZIERUNG VON IMMOBILISIERTEN POLYNUKLEOTIDEN DURCH FLUORESZENZ
Assemblierte Polynukleotide auf einem erfindungsgemäßen Festträger können durch Fluoreszenz-Sonden-Assays detektiert und quantifiziert werden. Die Assays schließen eine selbst-löschende Oligonukleotid-Sonde ein, die komplementär ist zu einem Teil des immobilisierten Ligationsprodukts. Die Sonde umfasst einen fluoreszierenden Reporterfarbstoff und einen Quencher, die so angeordnet sind, dass sie über eine des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET)-Wirkung interagieren (Clegg, R. 1992). Der Quencher kann mit dem Reporter interagieren, um dessen Lichtemission zu verändern, was gewöhnlicherweise in eine geringere Emissionseffizienz des Reporters resultiert. Die Effizienz des Quenchens vermindert sich mit dem Abstand des Reporters zu dem Quencher.
In der vorliegenden Erfindung kann die Sonde Nukleotide in der Nähe des 5'-Terminus umfassen, welche im Wesentlichen komplementär sind zu den Nukleotiden in der Nähe des 3'-Terminus, wobei die nicht-angelagerte Sonde in einem gelöschten Zustand vorliegt. Nach der Anlagerung der Sonde an das immobilisierte Ligationsprodukt wird die Quench-Wirkung vermindert und die Fluoreszenz kann nachgewiesen werden. Der Anstieg bei der Fluoreszenz von selbst-komplementären, selbst-löschenden Sonden („Molecular Beacons") nach einer Hybridisierung an die Ziel-Polynukleotide ist für empfindliche Assay-Ergebnisse ausreichend (Tyagi, 1996; Tyagi, 1997).
Ein auf Fluoreszenz basierender Exonuklease-Assay (TagMan^®) stellt Echtzeitmessungen von Amplifikationsprodukten während einer PCR bereit (Lee, 1993; Holland, 1991). Eine selbst-löschende Fluoreszenz-Sonde, die komplementär ist zu einer Stelle des immobilisierten Ligationsprodukts, ist in dem PCR-Gemisch eingeschlossen. Während der Amplifikation lagert sich die Sonde an das Ziel an und wird durch die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der Polymerase verdrängt und gespalten (9). Es wird ein fluoreszierendes Signal ausgesendet, welches proportional ist zu der Menge des vorliegenden asemblierten Polynukleotids (Livak, 1996; Lee, 1993). Der Exonuklease-Assay ergibt einen direkten Nachweis der PCR-Produkte, die aus der Amplifikation der assemblierten Polynukleotide auf dem Festträger stammen ohne einer weiteren Probenverarbeitung. Mit dem Fortschreiten der PCR vorangeht, spaltet die Polymerase die angelagerte Sonde und trennt den Reporter und Quencher voneinander, was zu einem Anstieg bei der Fluoreszenz führt.
Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließen Verfahren für Endpunkt- und Echtzeit-Messungen eines Amplifikationsprodukts ein, das von dem immobilisierten Polynukleotid gebildet wurde. In einem Endzeit-Modus wird die Fluoreszenzmessung durchgeführt nachdem die Amplifikation des assemblierten Polynukleotids beendet ist. In einem Echtzeit-Modus werden Fluoreszenzmessungen mehrere Male während der Amplifikationsreaktion durchgeführt, z. B. nach jedem Thermozyklus eines PCR-Prozesses. Der Echtzeit-Modus ist bevorzugt, wenn eine quantitative Messung des assemblierten Polynukleotids (Laden des Polynukleotids pro Gramm Festträger) benötigt wird.
VII. SELBST-LÖSCHENDE SONDEN
In einer bevorzugten Ausführungsform der selbst-löschenden Fluoreszenz-Sonde wird der Reporterfarbstoff von dem Quencher-Farbstoff durch mindestens zwölf Nukleotide getrennt, der Reporterfarbstoff wird an den 5'-Terminus oder 3'-Terminus der selbst-löschenden Fluoreszenz-Sonde verknüpft und der Quencher-Farbstoff wird an den 5'-Terminus oder 3'-Terminus verknüpft (Livak, 1998). Die selbst-löschende Sonde ist so konstruiert, dass sie den Reporter in unmittelbare Nähe des Quenchers bringt, so dass ein effizienter Energieübergang von dem Reporter auf den Quencher stattfinden kann (Clegg, 1992; Cardullo, 1988; Livak, 1995). Der Reporter und der Quencher können auch an das 3'-terminale Nukleotid angeheftet sein. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung sind der Fluoreszenzfarbstoff und Quencher an interne Stellen auf dem Polynukleotid verknüpft. Die Erfindung schließt auch Ausführungsformen ein, bei denen eines der zwei Fluorophoren an einer internen Stelle lokalisiert ist und das andere Fluorophor an einen Terminus des Polynukleotids angeheftet ist.
Farbstoffe, die als Reporter geeignet sind, können auch als Quencher geeignet sein. In gleicher Weise können Farbstoffe, die als Quencher geeignet sind, auch als Reporter geeignet sein. In einer Ausführungsform einer selbst-löschenden Sonde wird 6-Carboxyfluoreszein (6-FAM) an dem 5'-Terminus der Sonde als Reporter markiert und 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) wird an den 3'-Terminus als Quencher markiert, so dass der TAMRA-Farbstoff im Wesentlichen alle Fluoreszenz-Emissionen durch 6-FAM auslöscht, bis er durch die Polymerase gespalten ist.
Bevorzugte Ausführungsformen von Reporterresten sind Fluoreszein-Farbstoffe mit der unten aufgeführten allgemeinen Struktur und Zahlensystem, wobei L ein Linker ist.
Bevorzugte Ausführungsformen von Fluoreszein-Reporter-Farbstoffen sind 5-Carboxyfluoreszein (5-FAM), 6-Carboxyfluoreszein (6-FAM), 2',4',1,4,-Tetrachlorfluoreszein (TET), 2',4',5',7',1,4-Hexachlorfluoreszein (HEX) und 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluoreszein (JOE) (7). Andere Ausführungsformen von Reporterresten sind Cyanin-Farbstoffe, Dansyl-Derivate und dergleichen.
Bevorzugte Ausführungsformen von Quencher-Resten sind; (i) Rhodamin-Farbstoffe (Bergot, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA) und Tetrapropan-6-carboxyrhodamin (ROX) und (ii) DABSYL, DABCYL, Cyanin, Anthraquinon, Nitrothiazol und Nitroimidazol-Verbindungen und dergleichen (8). Rhodamin-Farbstoffe haben die unten aufgeführte allgemeine Struktur und Zahlensystem, wobei L ein Linker ist.
Erfindungsgemäße Fluoreszein- und Rhodamin-Derivate können an einer oder mehreren der oben aufgeführten nummerierten Positionen substituiert sein.
VIII. SPALTUNG VON POLYNUKLEOTIDEN
Das assemblierte Polynukleotid kann von dem Festträger durch Spaltung des Linkers durch chemische oder enzymatische Mittel oder eine Kombination von beiden freigesetzt werden. Durch enzymatische Spaltung können die Assemblierungs- und Brücken-Oligonukleotide so gewählt werden, dass sie eine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz enthalten, die typischerweise 4–8 Basenpaare lang ist, dann kann eine Spaltung des assemblierten Polynukleotids von dem Festträger mit dem geeigneten Restriktionsenzym stattfinden. Zum Beispiel kann die Spaltung der Sequenz, die in dem unten aufgeführten Beispiel wiedergegeben ist, innerhalb 50 pMol eines assemblierten Polynukleotids in einem Gemisch von 1 Einheit HindIII-Restriktionsenzym, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 50 nM NaCl, 1 mM Dithiothreitol, pH 7,9 bei 25°C in einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt werden.
Ein einzelsträngiges, assembliertes Polynukleotid auf einem Festträger kann durch Restriktionsenzyme gespalten werden, indem ein Oligonukleotid mit 6–40 Nt oder länger an eine Restriktionsstelle des Polynukleotids hybridisiert, gefolgt von einer Behandlung mit dem korrespondierenden Restriktionsenzym. Eine Spaltung wird an der doppelsträngigen Restriktionsstelle stattfinden, was zu einer Abtrennung des Polynukleotids von dem Festträger führt. Das klebrige Ende („sticky end") des gespaltenen Polynukleotids wird dann für Ligations- und Klonierungsschritte bereitstehen.
Durch chemische Spaltung kann das assemblierte Polynukleotid eine labile Funktionalität aufwiesen, welche durch chemische Reagenzien spaltbar ist. Zum Beispiel kann L in der oben gezeigten Figur eine Trityl-Gruppe sein, die mit einer schwachen Säure gespalten werden muss, wie z. B. eine kurze Behandlung bei Raumtemperatur mit Essigsäure. Alternativ kann L eine labile basische Gruppe sein, wie z. B. Ester oder Carbamat, die mit Ammoniumhydroxid, Natriumhydroxid oder anderen wässrigen Reagenzien bei oder bei ungefähr pH 12 gespalten wird. Der Linker L kann eine funktionelle Disulfit-Gruppe sein, welche durch milde reduzierende Agenzien, wie Dithiothreitol (Cleland's Reagens) spaltbar ist. Der Linker L kann eine funktionelle Silyl-Ether-Gruppe sein, die durch Fluorid-Ion mit Reagenzien, wie Tetrabutylammonium-fluorid spaltbar ist. Typische Bedingungen für eine Ester-Bindung eines assemblierten Polynukleotids auf einem Festträger würde die Behandlung von ungefähr 1 mg Träger mit 100 μl konzentriertem Amoniumhydroxid bei 25°C für 6 Stunden einschließen und Abführen des Überstands in ein separates Gefäß zum Entfernen des Ammoniaks und Wassers unter Vakuum.
X. AUTOMATISIERUNG DER ASSEMBLIERUNG
Eine Vorrichtung kann entworfen werden, um ein Polynukleotid auf einem Festträger durch Automatisierung der Schritte der Anlagerung, Ligation und Primer-Verlängerung in einer zyklischen Weise entsprechend der vorliegenden Erfindung zu synthetisieren. Flüssige Reagenzien können von Gefäßen an die Festträger unter Mikroprozessorkontrolle entsprechend einem Programm abgegeben werden. Die Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, speziell die enzymatischen Mittel der Polynukleotid-Assemblierung auf die Festträger-Chemie hat den Vorteil der Einfachheit und Effizienz, die durch andere chemische Festphasen-Biopolymere und kleine Molekül-Synthese-Verfahren realisiert sind. Eine Temperaturkontrolle kann durch Eintauchen der Reaktionsgefäße in kühlende oder erhitzende Fluide oder durch Platzierung in Kühl-/Aufwärmzonen, z. B. Hitzeblocks, Ofen, Gefrierboxen, realisiert werden. Sämtliche Schritte des Assemblierungsprozesses und des thermischen Zyklisierens während einer PCR können zwischen 0–100°C durchgeführt werden. Die heterogenen Reaktionen der vorliegenden Erfindung, bei denen flüssige Reagenzien an einen immobilisierten Reaktant auf einer stationären Festphase abgegeben werden, können schnelle Kinetiken und hohe Ausbeuten aufweisen, während die Notwendigkeit einer Produktaufbereitung, -isolierung und -aufreinigung entfällt. Somit sind sich wiederholende Prozesse, wie Monomer-Additionen, in assemblierenden Biopolymeren für eine Festträgersynthese durch manuelle und automatisierte Mittel gut geeignet. Die vorliegende Erfindung trägt selbst zur Automatisierung mit hohem Durchsatz und paralleler Synthese von Genen bei.
Anordnungen, adressierbare Orte auf einer Oberfläche, an denen Reagenzien, Detektionselemente oder Vorrichtungen lokalisiert werden können, können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Typischerweise ist die Anordnung eine ebene Oberfläche mit Orten, die in einem Format innerhalb einer Vorrichtung fixiert sind, durch welche die automatisierten Mittel in wiederholter Weise zum Zweck des (i) Ausführens von chemischen oder enzymatischen Reaktionen, (ii) Nachweises von Veränderungen oder Interaktionen oder (iii) Fixierens oder Einrahmens zum Anzeigen einer Vielfalt von Proben eingesetzt werden können. Die räumliche Verteilung der Syntheseanordnung kann eine zweidimensionale Oberfläche sein, die durch einen programmierbaren automatisierten Roboter-Flüssigkeitsabgabe-Apparat adressierbar ist.

Claims

Verfahren zum Synthetisieren eines Polynukleotids auf einem Festträger, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a. Anlagerung eines oder mehrerer Brücken-Oligonukleotide und zweier oder mehrerer Assemblierungs-Oligonukleotide, wobei die Brücken-Oligonukleotide 6–40 Nukleotide umfassen, so dass eine ligierbare Nickstelle zwischen benachbarten Assemblierungs-Oligonukleotiden gebildet wird, wobei die Assemblierungs-Oligonukleotide 20–200 Nukleotide umfassen, die Brücken-Oligonukleotide Lücken von einem oder mehreren Nukleotiden in dem nicht-immobilisierten Strang bilden und eines der Assemblierungs-Oligonukleotide an einem Festträger immobilisiert ist; b. Ligieren der ligierbaren Nickstellen, wobei dadurch ein immobilisiertes Ligationsprodukt gebildet wird; c. Wiederholen der Schritte a. und b. mit 1 bis 100 Zyklen; d. Entfernen der Brücken-Oligonukleotide unter denaturierenden Bedingungen; e. Anlagerung eines Primers an das immobilisierte Ligationsprodukt und f. Verlängerung des Primers mit Polymerase und Nukleotid-5'-Triphosphaten, um ein immobilisiertes doppelsträngiges Polynukleotid zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Festträger umfasst ist von kleinen Teilchen, Kügelchen, Membranen, Fritten, nicht-porösen Oberflächen, adressierbaren Anordnungen, Vektoren, Plasmiden oder Polynukleotid-immobilisierenden Medien.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Synthetisieren eines Polynukleotids mit einer Länge zwischen 50 und 5000 Nukleotid-Basenpaaren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt f. der Verlängerung des Primers, der an das immobilisierte Ligationsprodukt angelagert ist, Nukleotid-5'-Trisphosphate umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: ATP, dATP, CTP, dCTP, GTP, dGTP, UTP, TTP, dUTP, 5-Methyl-CTP, 5-Methyl-dCTP, ITP, dITP, 2-Amino-ATP, 2-Amino-dATP, 5-Br-UTP, 5-Br-dUTP, 5-F-UTP, 5-F-dUTP, 5-Propynyl-dCTP, 5-Propynyl-dUTP und die korrespondierenden α-Thiotriphosphate, 2'-O-Methylribonukleotidtriphosphate, 2'-Fluor-NTP, 2'-Amino-NTP-Analoge und mit Fluoreszenz markierte NTP.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die fluoreszierenden Markierungen an die N-9- oder C-8-Position des Purins oder Deazapurins und die C-5-Position des Pyrimidins gebunden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus FAM, TET, HEX oder JOE.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Assemblierungs- und Brücken-Oligonukleotide Nukleotideinheiten enthalten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: A, dA, C, dC, G, dG, U, T, dU, 5-Methyl-C, 5-Methyl-dC, I, dI, 2-Amino-A, 2-Amino-dA, 5-Br-U, 5-Br-dU, 5-F-U, 5-F-U, 5-F-dU, 5-Propynyl-dC, 5-Propynyl-dU und die korrespondierenden Phosphorothioate, N-3-Phosphoramidate, 2'-O-Methylribonukleotide, 2'-Fluorribonukleotide und 2'-Aminoribonukleotid-Analoge.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt des periodischen Waschens unter nicht-denaturierenden Bedingungen nach den Schritten a. und b.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend die Schritte des Waschens des Trägers unter denaturierenden Bedingungen nach jedem Ligationsschritt b.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Denaturierungsmittel ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Formamid, Harnstoff, Natriumchlorid und Natriumacetat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polynukleotide durch chemische Spaltung vom Träger gespalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polynukleotide durch enzymatische Spaltung vom Träger gespalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt der Anlagerung einer selbst-löschenden Fluoreszenzsonde, die komplementär zu dem immobilisierten Polynukleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die selbst-löschende Fluoreszenzsonde umfasst wird von Nukleotiden in der Nähe des 5'-Terminus, die im Wesentlichen komplementär sind zu den Nukleotiden in der Nähe des 3'-Terminus, wobei die nicht-angelagerte Sonde in einem gelöschten Zustand vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Anlagerung der selbst-löschenden Fluoreszenzsonde an das immobilisierte doppelsträngige Polynukleotid durch Fluoreszenznachweis gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt f. der Verlängerung des Primers, der an das immobilisierte Ligationsprodukt angelagert ist, eine Polymerase-Kettenreaktion ist, umfassend: eine thermostabile Nukleinsäure-Polymerase, die 5'→3'-Nukleaseaktivität hat, wobei der Primer komplementär ist zu dem immobilisierten Ligationsprodukt, ein zweiter Primer, der komplementär ist zu dem Gegenstück des immobilisierten Ligationsprodukts, 5'-Nukleotidtriphosphate und eine selbst-löschende Fluoreszenzsonde; wobei die Sonde in mindestens einer Einzelstrangkonformation vorliegt, wenn sie nicht an das Polynukleotid angelagert ist, wobei ein Quencher die Fluoreszenz eines Reporters und mindestens eine Konformation löscht, wenn er an das immobilisierte Ligationsprodukt angelagert ist, wobei die Fluoreszenz des Reporters nicht gelöscht wird, und die Schritte Anlagerung der Primer an das immobilisierte Ligationsprodukt; Amplifizieren des immobilisierten Ligationsprodukts durch PCR, wobei Ziel-Polynukleotid-Amplifikationsprodukte erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Nukleinsäure-Polymerase die selbst-löschende Fluoreszenzsonde während der Amplifikation verdaut, um den Reporter von dem Quencher zu trennen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Ziel-Polynukleotid-Amplifikationsprodukte durch Fluoreszenznachweis gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Ziel-Polynukleotid-Amplifikationsprodukte durch Endpunktanalyse gemessen und quantifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Ziel-Polynukleotid-Amplifikationsprodukte durch Echtzeitanalyse gemessen und quantifiziert werden.