JP2003522119A - 標識されたオリゴヌクレオチドの脱ブロック化方法 - Google Patents

標識されたオリゴヌクレオチドの脱ブロック化方法

Info

Publication number
JP2003522119A
JP2003522119A JP2000619814A JP2000619814A JP2003522119A JP 2003522119 A JP2003522119 A JP 2003522119A JP 2000619814 A JP2000619814 A JP 2000619814A JP 2000619814 A JP2000619814 A JP 2000619814A JP 2003522119 A JP2003522119 A JP 2003522119A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oligonucleotide
deblocking
ammonia
amino compound
detectably labeled
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
JP2000619814A
Other languages
English (en)
Inventor
グリラット ゲベイエフー，
リチャード エム． ピレス，
Original Assignee
インビトロジェン コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by インビトロジェン コーポレイション filed Critical インビトロジェン コーポレイション
Publication of JP2003522119A publication Critical patent/JP2003522119A/ja
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、オリゴヌクレオチドの実質的な脱ブロック化を生じる条件下で、ブロックされた検出可能な標識されたオリゴヌクレオチドを有効量の求核性アミノ化合物と接触させ、実質的にブロックされた検出可能な標識されたオリゴヌクレオチドを脱ブロックする方法に関連し、それによって実質的に脱ブロックされたオリゴヌクレオチドを提供する。好適な実施形態において、この方法の検出可能な標識は、蛍光標識（ヘキサクロロフルオレセイン、ＤＡＢＣＹＬ）である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、アミノ試薬（例えば、アンモニア）の使用によって標識されたオリ
ゴヌクレオチドを実質的に脱保護化または脱ブロック化するプロセスに関する。
【０００２】 （関連分野） 当業者には、種々の固相オリゴヌクレオチド合成技術は公知である。このよう
な技術としては、ホスホラミダイト、ホスホトリエステル、ホスホジエステル、
亜リン酸塩およびＨ−ホスホネート法などが挙げられ、これらの各々は分子生物
学の分野で一般的に公知である。例えば、ｂ−シアノエチルホスホラミダイト法
は、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ」と題されたＣａｒｕｔｈｅｒｓらに付与された米国特許第４，４５８
，０６６号（参考として本明細書中に援用される）に記載される。
【０００３】 オリゴヌクレオチドのホスホラミダイトに基づく合成は、環外アミノ基の保護
化を必要とする。この目的のために最も一般的に使用される保護基は、アデニン
の６−アミノおよびシステインの４−アミノについてはベンジルであり、そして
グアニンの２−アミノについてはイソブチロイルである。オリゴヌクレオチドは
、ヌクレオシドホスホラミダイトを使用して固体支持体上で合成され、ここでア
ミノ基は以下に示されるように保護される。
【０００４】
【化１】 合成の完了後、オリゴヌクレオチドは支持体から切断され、そしてこれらの保
護基は、濃水酸化アンモニウムを使用する高温での加水分解により除去される。
加水分解後、水酸化アンモニウムを蒸発し、所望のオリゴヌクレオチドを得る。
【０００５】 これらの保護基の除去のために熱い濃水酸化ナトリウムを使用することは、こ
のような過酷な条件に耐え得る保護基に対して使用され得る修飾基を限定してき
た。水酸化アンモニウム中で加熱される色素含有オリゴのような修飾されたオリ
ゴは、使用され得ない。なぜなら、これらの条件下で色素は安定でないからであ
る。一般的に、色素標識オリゴは、２４時間以上の室温での水酸化アンモニウム
を用いる処理によって脱保護化されるか、またはこの目的のために特別な試薬を
必要とする。例えば、米国特許第４，９６５，３４９号を参照のこと。あるいは
、オリゴは、熱い濃水酸化アンモニウムの使用を必要としない容易に除去できる
保護基を有するホスホラミダイトを使用して調製され得る。Ｂｏａｌ，Ｊ．Ｈ．
ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３１１５−３１１７（１９９６）を
参照のこと。
【０００６】 濃水酸化アンモニウムを用いた脱保護化が、低下した温度でなされる標準方法
は、不完全な脱保護化および色素標識オリゴヌクレオチドの全体の低品質を生じ
る。しばしばこれは、低収量を生じるつまらない精製を必要とする。
【０００７】 米国特許第４，９６５，３４９号は、低級アルコール、水および非求核性妨害
性（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）アルキルアミンを含む試薬を用いる固相支持体とオリゴ
ヌクレオチドとの間の塩基不安定性連結基の加水分解法を記載する。この特許に
従って、この切断試薬は、固体支持体からの切断の間、ローダミン色素の蛍光特
徴を保存する。
【０００８】 米国特許第５，５１４，７８９号は、気体切断／脱保護試薬（例えば、気体ア
ンモニア、水酸化アンモニウム蒸気、およびメチルアミン）を用いる固体支持体
からの新規に合成されたオリゴヌクレオチドの切断方法および脱保護化法を記載
する。
【０００９】 米国特許第５，５１８，６５１号は、アルキルアミン（例えば、ｔ−ブチルア
ミンおよびメチルアミン）を使用する不溶化および保護化オリゴヌクレオチドの
切断方法および脱保護化法を記載する。この特許に従って、オリゴヌクレオチド
の脱保護化および切断は、室温で、そして約９０分未満で生じる。
【００１０】 米国特許第５，７３８，８２９号は、気体アンモニアまたは水酸化アンモニウ
ム蒸気を用いる固定化オリゴヌクレオチドのインキュベーションを含む固体支持
体からのオリゴヌクレオチドの切断方法および脱保護化法を記載する。この特許
に従って、この方法は、この方法自体に、９６までの個別の合成プロセスを行う
ために使用され得る支持体（例えば、マイクロタイタープレート）の使用を付与
する。
【００１１】 Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｖｉｒｇｉｎｉａ
は、フェノキシアセチル保護化ｄＡ、４−イソプロピルフェノキシアセチル保護
化ｄＧおよびアセチル保護化ｄＣを提供し、これらはオリゴヌクレオチドを調整
するために使用され得る。Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈのウェブサイトに従っ
て、これらのモノマーは、感受性の標識試薬（例えば、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５（登
録商標）およびＨＥＸ）と共に使用され得る。なぜなら、切断および脱保護は、
２時間室温で、水酸化アンモニウムを用いてか、または０．００５Ｍ炭酸カリウ
ム（無水メタノール中）を用いて行われ得るからである。さらに、このウェブサ
イトに従って、アセチル保護化ｄＣモノマーを含むオリゴヌクレオチドを、水酸
化アンモニウム／メチルアミンを用いる１０分間の６５℃以下での処理によって
脱保護化し得る。
【００１２】 本発明者らは今や、圧力下および高温での求核性アミノ化合物の使用が、色素
標識オリゴの脱保護化に効果的な方法であることを見出した。この方法で脱保護
化される色素標識オリゴは十分に脱保護され、そして高品質である。さらに、こ
のプロセスは単純であり、そして時間を節約し、脱ブロック化（プロセシング）
の時間を約２８時間〜１時間減少する。
【００１３】 （発明の簡単な要旨） 本発明は、検出可能な標識されたオリゴヌクレオチドの脱ブロック化プロセス
に関する。このプロセスは、オリゴヌクレオチドの脱ブロック化を生じる条件下
で、ブロックされた検出可能な標識されたオリゴヌクレオチドを有効量の求核性
アミノ化合物と接触させる行程を包含し、これによって脱ブロックされるオリゴ
ヌクレオチドを提供する。
【００１４】 （発明の詳細な説明） 本発明は、実質的に検出可能な標識されたオリゴヌクレオチドの脱ブロック化
プロセスに関する。このプロセスは、ブロックされた検出可能な標識されたオリ
ゴヌクレオチドを有効量の脱ブロック化試薬（例えば、求核性アミノ化合物）と
接触させる行程を包含する。好ましくは、脱ブロック化試薬は、環境温度で気体
である。
【００１５】 本発明は、水性アンモニアを使用するオリゴヌクレオチドの従来の脱ブロック
化方法よりも、多くの利点（脱ブロック化されたオリゴヌクレオチドの改良され
た質（純度）、より高い収量、およびより短い反応時間を含む）を提供する。さ
らに、アミノ化合物は、（アンモニア、メチルアミンおよびエチルアミンの場合
に）脱気によって実質的に除去され得、従って、脱ブロックされたオリゴヌクレ
オチドの簡便な回収を提供する。室温で液体であるより高分子量のアミノ化合物
の場合、アミノ化合物は、アミノ化合物を除去するために、オリゴヌクレオチド
があまり可溶性でない有機溶媒（例えば、アセトニトリル、ジエチルエーテルな
ど）を用いて脱ブロックされたオリゴヌクレオチドを洗浄することによって、除
去され得る。次いで、脱ブロックされたオリゴヌクレオチドは、直接に水、緩衝
液または他の溶液に再懸濁され得、そして分子生物学的試薬として（例えば、配
列決定、ＰＣＲにおける診断試薬として、またはプローブとして）直接使用され
得る。この緩衝液は、存在し得る任意の残りの求核性アミノ化合物（例えば、ア
ンモニア）を中和するように選択され得る。特に好ましい緩衝液は、酢酸塩、硫
酸塩、塩酸塩、リン酸塩またはＴｒｉｓ−（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン
（ＴＲＩＳ（登録商標））遊離酸形態であるが、ＴＲＩＳ（登録商標）と同じお
およそのイオン強度およびｐＫａの代替緩衝液を使用しても同じ結果である。他
の好ましい緩衝液は、トリエチルアンモニウム塩（例えば、アセテート塩）であ
る。緩衝塩に加えて、カリウム（好ましくは、塩化カリウムまたは酢酸カリウム
）およびマグネシウム（好ましくは、塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム
）のような補因子塩が含まれ得る。緩衝溶液および／または脱ブロック化反応混
合物への１以上の炭水化物および／または糖の添加はまた有利であり得、保存の
際の生成物の安定を高めることを支持する。好ましくはこのような炭水化物また
は糖としては、スクロース、トレハロースなどが挙げられるが、これらに限定さ
れない。このような炭水化物および／または糖は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯ）を含む多くの供給源から市販される。
【００１６】 求核アミノ化合物は、アンモニアまたはアンモニア蒸気（例えば、底部に多量
の水酸化アンモニウムを有するシール可能なチャンバーの加熱より得られる）、
またはＣ1〜6アルキルアミノ化合物であり得る。アルキル基は、直鎖または分枝
鎖であり得る。このようなアルキルアミノ化合物の例としては、メチルアミン、
エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ｓｅｃブ
チルアミン、ペンチルアミンおよびヘキシルアミンが挙げられる。求核性アミノ
化合物が、環境温度で液体である場合、吸引下で、加熱を有して、または有さな
いで除去され得る。好ましい実施形態において、求核性アミノ化合物は、少なく
とも水蒸気で飽和されている。
【００１７】 オリゴヌクレオチドの標識は、オリゴヌクレオチドの検出のための任意の従来
的な標識であり得、それらとしては、限定されないでキサンテン（例えば、フル
オレセイン、エオシン、エリトロシン）、ローダミン（例えば、Ｔｅｘａｓ Ｒ
ｅｄ（登録商標））、ベンズイミダゾール、エチジウム、プロピジウム、アント
ラサイクリン、ミトラマアイシン、アクリジン、アクチノマイシン、メロシアニ
ン（ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅｓ）、クマリン（例えば、４−メチル−７−メトキ
シクマリン）、ピレン、クリセン、スチルベン、アントラセン、ナフタレン（例
えば、ダンシル、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル）、サリチル
酸、ベンズ−２−オキサ−１−ジアゾール（ベンゾフランとしても公知である）
（例えば、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）
、インドジカルボシアニン（例えば、Ｃｙ３（登録商標）およびＣｙ５（登録商
標）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．
より入手可能）、フルオレサミン、およびソラレン）からなる群より選択される
蛍光色素が挙げられる。例えば、米国特許第４，９９７，９２８号、同第５，２
６２，５３６号およびＥＰ６３，８７９を参照のこと。多くのこれらの色素の有
用な形態は、市販されている。Ａ．Ｗ．Ｗａｇｎｅｒ、第１章、Ａｐｐｌｉｃａ
ｉｔｏｎｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔａｙｌｏｒら（編）、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６）を参照のこと。特定の例としては、６−（フルオレ
セイン−６−カルボキサミド）ヘキサノエート（ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（６−Ｆ
ＡＭ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ヘキサクロロフルオ
レセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ
−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（６−ＪＯＥ
）、およびＢＯＤＩＰＹが挙げられる。好ましい実施形態において、オリゴヌク
レオチドを、Ｔｙａｇｉ，Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８（１９９６）に従って、分
子標識技術で標識する。アンモニアの存在下で分解する１つの標識は、６−テト
ラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）である。
【００１８】 ブロックされた標識されたオリゴヌクレオチドは、周知の方法（例えば、ホス
ホルアミダイト、ホスホトリエステル、ホスホジエステル、亜リン酸塩およびＨ
−ホスホネート法）で調整され得、これらの各々は、分子生物学の分野で一般的
に公知である。例えば、ｂ−シアノエチルホスホラミダイト法は、「Ｐｒｏｃｅ
ｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題さ
れたＣａｒｕｔｈｅｒｓらに付与された米国特許第４，４５８，０６６号に記載
され、それは本明細書中に参考として援用される。Ｅ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）
、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１
）；ＧＢ ２，１２５，７８９；および米国特許第４，４１５，７３２号、同第
４，７３９，０４４号および同第４，７５７，１４１号をまた参照のこと。この
ようなオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、
ＤＮＡおよびＲＮＡの誘導体ならびにそれらの混合物であり得る。ＲＮＡの場合
、塩基安定性２’−保護基が好ましい。ブロックされた標識されたオリゴヌクレ
オチドは、遊離であり得るか、または気体脱ブロック化試薬によってもまた切断
される固相上に固定化され得る。次いで、脱ブロックされたオリゴヌクレオチド
は、水または緩衝液で固相を洗浄することによって回収され得る。
【００１９】 ブロッキング基は、Ａ、ＧおよびＣの環外アミノ基に存在する。チミンは、保
護化を必要としない。このようなブロッキング基は、Ｃ1〜6アルカノイル（例え
ば、イソブチリル）、アリーロイル（ベンゾイル）、フェノキシアセチル、Ｃ1
〜6アルコキシアセチル、およびジメチルホルムアミドであり得る（ｄＡのＮ6ま
たはｄＧのＮ2で）。脱ブロック化試薬がアルキルアミンである場合、塩基Ｃが
、アセチル基でブロックされることが望ましい。亜リン酸についてのブロッキン
グ基は、シアノエチル基であり得る。これらのブロッキング基のすべては、ブロ
ック化試薬で同時に切断される。
【００２０】 ブロック化反応は、（本発明に従って、オープンチャンバーが使用され得るが
）好ましくは、加熱され得るシール可能なチャンバー内で行われ得る。このよう
なシール可能なチャンバーとしては、スクリューキャップバイアル、Ｐａｒｒボ
トルなどが挙げられる。支持体からのオリゴヌクレオチドの合成および切断は、
市販のＤＮＡ合成機（例えば、ＡＢＩ ３８０Ｂ ＤＮＡ合成機）またはマルチ
ウェルチャネル（例えば、９６ウェルプレート）上のハイスループットな合成の
ためにセットアップされる他の装置を用いて行われ得る（例えば、米国特許第５
，４７２，６７２号および同第５，５２９，７５６号、および１９９８年９月２
８日に提出された米国出願第０９／１６２，３４８号を参照のこと（これらは、
その全体が参考として本明細書中に援用される））。
【００２１】 脱ブロック化試薬は、オリゴヌクレオチドを脱ブロックするのに有効量で存在
する。一般的に、脱ブロック化試薬は、オリゴヌクレオチドに比較して大過剰で
存在する。アンモニアの場合、シール可能なチャンバーは、約２０〜２００ｐｓ
ｉ、最も好ましくは約８０ｐｓｉのアンモニアで充填され得る。液体アルキルア
ミノ化合物の最適な量は、従来の実験のみで決定され得る。
【００２２】 脱ブロック化反応は、約室温〜約１５０℃の温度で行われる。最も好ましくは
、脱ブロック化試薬がアンモニアである場合、反応は約９５℃で行われる。
【００２３】 脱ブロック化反応を、約１分〜約２時間行う。より好ましくは、この反応は、
約１分〜約１時間行われる。脱ブロック化試薬がアンモニアである場合、反応が
約４５℃で行われることが好ましい。
【００２４】 「実質的に脱ブロックされた」とは、本発明に従った脱ブロック化反応後、脱
ブロックされたオリゴヌクレオチドが、例えばイオン対ＨＰＬＣ、キャピラリー
電気泳動または質量分析によって検出可能でないことを意味する。
【００２５】 以下の実施例は、本発明の方法および組成物の例示であり、限定ではない。分
子生物学および化学、特にオリゴヌクレオチドの合成において通常に遭遇する他
の適切な修飾および種々の条件およびパラメーターの適用は、この開示から当業
者に明白であり、本発明の精神および範囲内である。
【００２６】 （実施例） 標準条件（室温かつ２４時間）およびまたは気相（４５分、８０ｐｓｉ、９５
℃）下でのフルオレセイン（ＦＡＭ）標識オリゴの脱ブロック化の例は、添付さ
れる（図１Ａおよび１Ｂに）。クロマトグラムから理解され得るように、標準脱
ブロック化についてのピークは、より広く、不完全な脱保護化が存在することを
示す。しかし、アンモニアを用いた脱ブロック化のクロマトグラムは、より鋭い
ピークを示し、完全な脱保護および分解のないことを示す。
【００２７】 別の例において、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）およびＤＡＢＣＹＬ
（分子標識）で標識されたオリゴヌクレオチドを、種々の条件下で脱ブロックし
た（図２Ａ〜２Ｄ）。標準脱ブロック化条件（９５℃、濃アンモニア、７５分、
図２Ａ）ならびに２４時間以上の室温処理（図２Ｂおよび図２Ｃ）は、色素の分
解に起因し得る新しいピークの形成を示す。クロマトグラフ（図２Ｄ）から理解
され得るように、気相下での脱ブロック化は、よりより品質のオリゴヌクレオチ
ドを提供する。
【００２８】 （実験手順：） 高圧反応器内に（ホスホラミダイトに基づく自動化合成より得た）色素−オリ
ゴ−ＣＰＧを配置する。水蒸気で飽和された気体アンモニア（８０ｐｓｉ圧力）
で、反応器を充填する。シールされた反応器を９５℃まで、４５分間加熱する。
圧力を放し、そして室温までＣＰＧを冷却する。水を用いてＣＰＧからオリゴヌ
クレオチドを溶出する（５０〜２００ｎｍｏｌスケール合成については、約３０
０μｌで十分である）。
【００２９】 本明細書中に記載されるすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明に関
連する当業者のレベルを示す。各個別の刊行物または特許出願が具体的かつ個別
にその全体において参考として援用されるように示されるのと同じ程度まで、す
べての刊行物、特許および特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、濃水酸化アンモニウムを用いた室温で２４時間の脱保護化後の色素
標識されたオリゴ（５’−ＦＡＭ−ＧＧＴ ＣＣＧ ＡＣＣ ＡＧＡ ＴＧＧ
ＣＧＡ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＡＣ ＧＧＡ；配列番号１）の分析を示すイオン対
ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。緩衝液Ａ＝５ｍＭ ＴＢＡＰ（２０ｍＭ ＮＨ 4 ＨＰＯ4中）。緩衝液Ｂ＝ＣＨ3ＣＮ、１０分間以上の４０％Ｂ〜６０％Ｂの勾
配、流速２ｍｌ／分。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、９５℃、４５分間の気体アンモニア（８０ｐｓｉ）を用いた脱保護
化後の色素標識されたオリゴ（５’−ＦＡＭ−ＧＧＴ ＣＣＧ ＡＣＣ ＡＧＡ ＴＧＧ ＣＧＡ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＡＣ ＧＧＡ；配列番号１）の分析を示
すイオン対ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。緩衝液Ａ＝５ｍＭ ＴＢＡＰ（２０
ｍＭ ＮＨ4ＨＰＯ4中）。緩衝液Ｂ＝ＣＨ3ＣＮ、１０分間以上の４０％Ｂ〜６
０％Ｂの勾配、流速２ｍｌ／分。
【図２Ａ】 図２Ａは、濃水酸化アンモニウムを用いた９０℃、７５分間の脱保護化後の分
子指標（５’−ＨＥＸ−ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＣＴ ＣＴＣ ＣＡＡ ＴＴＴ Ｇ
ＣＴ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＣ ＤＡＢＣＹＬ）の分析を示すイオン対Ｈ
ＰＬＣクロマトグラフを示す。緩衝液Ａ＝５ｍＭ ＴＢＡＰ（２０ｍＭ ＮＨ4
ＨＰＯ4中）。緩衝液Ｂ＝ＣＨ3ＣＮ、１０分間以上の４０％Ｂ〜６０％Ｂの勾配
、流速２ｍｌ／分。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、濃水酸化アンモニウムを用いた室温での２４時間の脱保護化後の分
子指標（５’−ＨＥＸ−ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＣＴ ＣＴＣ ＣＡＡ ＴＴＴ Ｇ
ＣＴ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＣ ＤＡＢＣＹＬ）の分析を示すイオン対Ｈ
ＰＬＣクロマトグラフを示す。緩衝液Ａ＝５ｍＭ ＴＢＡＰ（２０ｍＭ ＮＨ4
ＨＰＯ4中）。緩衝液Ｂ＝ＣＨ3ＣＮ、１０分間以上の４０％Ｂ〜６０％Ｂの勾配
、流速２ｍｌ／分。
【図２Ｃ】 図２Ｃは、濃水酸化アンモニウムを用いた室温での４０時間の脱保護化後の分
子指標（５’−ＨＥＸ−ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＣＴ ＣＴＣ ＣＡＡ ＴＴＴ Ｇ
ＣＴ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＣ ＤＡＢＣＹＬ）の分析を示すイオン対Ｈ
ＰＬＣクロマトグラフを示す。緩衝液Ａ＝５ｍＭ ＴＢＡＰ（２０ｍＭ ＮＨ4
ＨＰＯ4中）。緩衝液Ｂ＝ＣＨ3ＣＮ、１０分間以上の４０％Ｂ〜６０％Ｂの勾配
、流速２ｍｌ／分。
【図２Ｄ】 図２Ｄは、気体アンモニア（８０ｐｓｉ）を用いた９５℃、１時間の脱保護化
後の分子指標（５’−ＨＥＸ−ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＣＴ ＣＴＣ ＣＡＡ ＴＴ
Ｔ ＧＣＴ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＣ ＤＡＢＣＹＬ）の分析を示すイオ
ン対ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。緩衝液Ａ＝５ｍＭ ＴＢＡＰ（２０ｍＭ
ＮＨ4ＨＰＯ4中）。緩衝液Ｂ＝ＣＨ3ＣＮ、１０分間以上の４０％Ｂ〜６０％Ｂ
の勾配、流速２ｍｌ／分。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ Ｆターム(参考） 4C057 BB02 BB05 DD01 MM04 MM05

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 実質的にブロックされた検出可能な標識されたオリゴヌクレ
    オチドの脱ブロック化方法であって、該方法は、該ブロックされた検出可能な標
    識されたオリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドの脱ブロック化を生じる
    条件下で、有効量の求核性アミノ化合物と接触させる工程を包含し、それによっ
    て該実質的に脱ブロックされたオリゴヌクレオチドを提供する、方法。
  2. 【請求項２】 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 前記検出可能な標識がヘキサクロロフルオレセインである、
    請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記検出可能な標識がＤＡＢＣＹＬである、請求項２に記載
    の方法。
  5. 【請求項５】 前記求核性アミノ化合物がアンモニアである、請求項１に記
    載の方法。
  6. 【請求項６】 前記アンモニアが約２０〜２００のｐｓｉで存在する、請求
    項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記アンモニアが約８０のｐｓｉで存在する、請求項５に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 前記求核性アミノ化合物がアンモニア気体である、請求項１
    に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記求核性アミノ化合物が、Ｃ1〜6アルキルアミンである、
    請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記実質的に脱ブロックされたオリゴヌクレオチドを緩衝
    液中に溶解する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記条件が、約室温〜約１５０℃で前記方法を行うことを
    含む、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記条件が、約９５℃で前記方法を行うことを含む、請求
    項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記条件が、約１分間〜約２時間前記方法を行うことを含
    む、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記条件が、約４５分間前記方法を行うことを含む、請求
    項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記実質的にブロックされた検出可能な標識されたオリゴ
    ヌクレオチドが固相上に固定化される、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記実質的に脱ブロックされたオリゴヌクレオチドが、前
    記条件下で前記固相から放出される、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記実質的に脱ブロックされたオリゴヌクレオチドが、水
    または緩衝液を用いて前記固相を洗浄することによって回収される、請求項１６
    に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 実質的にブロックされた検出可能な標識されたオリゴヌク
    レオチドの脱ブロック化方法であって、該方法は、該ブロックされた検出可能な
    標識されたオリゴヌクレオチドを、約８０ｐｓｉ、９５℃で、約４５分間、水蒸
    気で飽和した有効量のアンモニアと接触させる工程を包含し、それによって実質
    的に脱ブロックされたオリゴヌクレオチドを提供する、方法。
  19. 【請求項１９】 前記ブロックされた検出可能な標識されたオリゴヌクレオ
    チドが固相上に固定化される、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記実質的に脱ブロックされたオリゴヌクレオチドが前記
    固相から放出される、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記実質的に脱ブロックされたオリゴヌクレオチドが水ま
    たは緩衝液を用いて前記固相を洗浄することによって回収される、請求項２０に
    記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ブロックされた検出可能な標識されたオリゴヌクレオチド
    および該オリゴヌクレオチドを実質的に脱ブロックするのに十分な有効量の求核
    性アミノ化合物を含む、組成物。
  23. 【請求項２３】 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項２２に記載
    の組成物。
  24. 【請求項２４】 前記求核性アミノ化合物がアンモニアである、請求項２２
    に記載の組成物。
  25. 【請求項２５】 前記求核性アミノ化合物がアンモニア気体である、請求項
    ２２に記載の組成物。
JP2000619814A 1999-05-24 2000-05-24 標識されたオリゴヌクレオチドの脱ブロック化方法 Ceased JP2003522119A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13584899P 1999-05-24 1999-05-24
US60/135,848 1999-05-24
PCT/US2000/014274 WO2000071559A1 (en) 1999-05-24 2000-05-24 Method for deblocking of labeled oligonucleotides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003522119A true JP2003522119A (ja) 2003-07-22

Family

ID=22469987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000619814A Ceased JP2003522119A (ja) 1999-05-24 2000-05-24 標識されたオリゴヌクレオチドの脱ブロック化方法

Country Status (8)

Country Link
US (5) US6593464B1 (ja)
EP (1) EP1185544B1 (ja)
JP (1) JP2003522119A (ja)
AT (1) ATE415409T1 (ja)
AU (1) AU5285800A (ja)
CA (1) CA2375060A1 (ja)
DE (1) DE60040912D1 (ja)
WO (1) WO2000071559A1 (ja)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200078554A (ko) * 2017-10-20 2020-07-01 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰
US11452980B2 (en) 2013-08-05 2022-09-27 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized gene libraries
US11492727B2 (en) 2019-02-26 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor
US11492728B2 (en) 2019-02-26 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
US11492665B2 (en) 2018-05-18 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
US11512347B2 (en) 2015-09-22 2022-11-29 Twist Bioscience Corporation Flexible substrates for nucleic acid synthesis
US11550939B2 (en) 2017-02-22 2023-01-10 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage using enzymatic bioencryption
US11562103B2 (en) 2016-09-21 2023-01-24 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
US11691118B2 (en) 2015-04-21 2023-07-04 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
US11697668B2 (en) 2015-02-04 2023-07-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
US11807956B2 (en) 2015-09-18 2023-11-07 Twist Bioscience Corporation Oligonucleic acid variant libraries and synthesis thereof

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ515673A (en) * 1999-05-21 2004-03-26 Invitrogen Corp Compositions and methods for labeling of nucleic acid molecules
AU5285800A (en) * 1999-05-24 2000-12-12 Invitrogen Corporation Method for deblocking of labeled oligonucleotides
JP2007531794A (ja) 2004-04-05 2007-11-08 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドの合成および精製に使用する方法および反応試薬
CA2562685C (en) 2004-04-27 2013-09-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
JP4584987B2 (ja) * 2004-04-30 2010-11-24 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド Ｃ５修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチド
US7615618B2 (en) * 2004-06-30 2009-11-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
WO2006093526A2 (en) 2004-07-21 2006-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
US7632932B2 (en) 2004-08-04 2009-12-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
CA2975855A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
EP3384077A4 (en) 2015-12-01 2019-05-08 Twist Bioscience Corporation FUNCTIONALIZED SURFACES AND THEIR PREPARATION
KR102212257B1 (ko) 2016-08-22 2021-02-04 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 핵산 라이브러리
US10907274B2 (en) 2016-12-16 2021-02-02 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
US10894959B2 (en) 2017-03-15 2021-01-19 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
EP3638782A4 (en) 2017-06-12 2021-03-17 Twist Bioscience Corporation SEALLESS NUCLEIC ACID ASSEMBLY METHODS
CN111566125A (zh) 2017-09-11 2020-08-21 特韦斯特生物科学公司 Gpcr结合蛋白及其合成
US10936953B2 (en) 2018-01-04 2021-03-02 Twist Bioscience Corporation DNA-based digital information storage with sidewall electrodes
EP3987019A4 (en) 2019-06-21 2023-04-19 Twist Bioscience Corporation BARCODE-BASED NUCLEIC ACID SEQUENCE ARRANGEMENT

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02796A (ja) * 1987-12-24 1990-01-05 Applied Biosystems Inc 固体支持体上にアンモニアに不安定な基で標識化されたオリゴヌクレオチド類の合成方法
JPH07505904A (ja) * 1992-04-24 1995-06-29 ベックマン　インスツルメンツ　インコーポレーテッド オリゴヌクレオチド類を開裂及び脱保護する方法及び試薬
JPH09504950A (ja) * 1993-11-12 1997-05-20 ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク 核酸検出用ハイブリダイゼーションプローブ、共通ステム、方法およびキット
JPH09208595A (ja) * 1996-01-29 1997-08-12 Perkin Elmer Corp:The ３’−標識ポリヌクレオチドの直接合成用の固体支持体試薬
US5756705A (en) * 1997-03-05 1998-05-26 Wang; Edge Renfeng Method for labeling oligonucleotide with ammonia-sensitive ligands
WO1998023774A1 (en) * 1996-11-29 1998-06-04 Third Wave Technologies, Inc. Fen-1 endonucleases, mixtures and cleavage methods

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4055469A (en) 1976-12-10 1977-10-25 Eastman Kodak Company Purification of microbial enzyme extracts using synthetic polyelectrolytes
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
CA1219824A (en) 1981-04-17 1987-03-31 David C. Ward Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US4419509A (en) * 1981-08-24 1983-12-06 Eli Lilly And Company Process for de-cyanoethylating blocked nucleotides
ZA831626B (en) 1982-08-25 1983-11-30 Velsicol Chemical Corp New triazine compositions of matter
US5539097A (en) 1983-09-02 1996-07-23 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide polymeric support system
IT1202321B (it) 1985-06-06 1989-02-02 Uni Degli Studi Di Parmo Nucleotidi ciclici fluorescenti biologicamente attivi
US4739044A (en) 1985-06-13 1988-04-19 Amgen Method for derivitization of polynucleotides
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US4997928A (en) 1988-09-15 1991-03-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5428148A (en) 1992-04-24 1995-06-27 Beckman Instruments, Inc. N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis
US5472672A (en) 1993-10-22 1995-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Apparatus and method for polymer synthesis using arrays
US5736480A (en) 1994-02-22 1998-04-07 California Institute Of Technology Supported phase chiral sulfonated BINAP catalyst solubilized in alcohol and method of asymmetric hydrogenation
US5623068A (en) * 1994-03-07 1997-04-22 Beckman Instruments, Inc. Synthesis of DNA using substituted phenylacetyl-protected nucleotides
US5897838A (en) * 1994-03-11 1999-04-27 Barrskogen, Inc. Apparatus for rapid evaporation of aqueous solutions
US5514789A (en) 1994-04-21 1996-05-07 Barrskogen, Inc. Recovery of oligonucleotides by gas phase cleavage
US5888397A (en) 1995-06-07 1999-03-30 Arch Develop. Corp. Process for recovering chaotropic anions from an aqueous solution also containing other ions
EP0819119B1 (en) * 1996-01-16 2003-04-02 Lumigen, Inc. Compounds, compositions and methods for generating chemiluminescence with phosphatase enzymes
US5942608A (en) 1996-10-29 1999-08-24 Council of Sciemtific & Industrial Research and Department of Biotechnology Process for preparing a universal support for the synthesis of oligonucleotides
US5773590A (en) 1997-04-08 1998-06-30 Betzdearborn Inc. Methods of separating lignin solids and black liquor from tall oil fatty acids
US6583168B1 (en) * 1997-11-25 2003-06-24 Applera Corporation Sulfonated diarylrhodamine dyes
WO1999038962A2 (en) 1998-02-02 1999-08-05 Gentra Systems, Inc. Compositions and methods for using a lysing matrix for isolating dna
US6468743B1 (en) * 1998-05-18 2002-10-22 Conagra Grocery Products Company PCR techniques for detecting microbial contaminants in foodstuffs
US5942609A (en) * 1998-11-12 1999-08-24 The Porkin-Elmer Corporation Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support
US6255476B1 (en) * 1999-02-22 2001-07-03 Pe Corporation (Ny) Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports
AU5285800A (en) * 1999-05-24 2000-12-12 Invitrogen Corporation Method for deblocking of labeled oligonucleotides
JP2004513629A (ja) 2000-11-09 2004-05-13 インヴィトロジェン　コーポレーション オリゴヌクレオチドからユニバーサルリンカーを除去する方法
JP2004518421A (ja) 2000-12-12 2004-06-24 インビトロジェン コーポレイション 固体マトリックスから核酸分子を解放させるための組成物および方法
US6664388B2 (en) * 2001-03-08 2003-12-16 Applera Corporation Reagents for oligonucleotide cleavage and deprotection

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02796A (ja) * 1987-12-24 1990-01-05 Applied Biosystems Inc 固体支持体上にアンモニアに不安定な基で標識化されたオリゴヌクレオチド類の合成方法
JPH07505904A (ja) * 1992-04-24 1995-06-29 ベックマン　インスツルメンツ　インコーポレーテッド オリゴヌクレオチド類を開裂及び脱保護する方法及び試薬
JPH09504950A (ja) * 1993-11-12 1997-05-20 ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク 核酸検出用ハイブリダイゼーションプローブ、共通ステム、方法およびキット
JPH09208595A (ja) * 1996-01-29 1997-08-12 Perkin Elmer Corp:The ３’−標識ポリヌクレオチドの直接合成用の固体支持体試薬
WO1998023774A1 (en) * 1996-11-29 1998-06-04 Third Wave Technologies, Inc. Fen-1 endonucleases, mixtures and cleavage methods
US5756705A (en) * 1997-03-05 1998-05-26 Wang; Edge Renfeng Method for labeling oligonucleotide with ammonia-sensitive ligands

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11452980B2 (en) 2013-08-05 2022-09-27 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized gene libraries
US11559778B2 (en) 2013-08-05 2023-01-24 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized gene libraries
US11697668B2 (en) 2015-02-04 2023-07-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
US11691118B2 (en) 2015-04-21 2023-07-04 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
US11807956B2 (en) 2015-09-18 2023-11-07 Twist Bioscience Corporation Oligonucleic acid variant libraries and synthesis thereof
US11512347B2 (en) 2015-09-22 2022-11-29 Twist Bioscience Corporation Flexible substrates for nucleic acid synthesis
US11562103B2 (en) 2016-09-21 2023-01-24 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
US11550939B2 (en) 2017-02-22 2023-01-10 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage using enzymatic bioencryption
KR20200078554A (ko) * 2017-10-20 2020-07-01 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰
JP7066840B2 (ja) 2017-10-20 2022-05-13 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション ポリヌクレオチド合成のための加熱されたナノウェル
US11745159B2 (en) 2017-10-20 2023-09-05 Twist Bioscience Corporation Heated nanowells for polynucleotide synthesis
JP2021502803A (ja) * 2017-10-20 2021-02-04 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション ポリヌクレオチド合成のための加熱されたナノウェル
KR102637566B1 (ko) 2017-10-20 2024-02-16 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰
US11492665B2 (en) 2018-05-18 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
US11732294B2 (en) 2018-05-18 2023-08-22 Twist Bioscience Corporation Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
US11492728B2 (en) 2019-02-26 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
US11492727B2 (en) 2019-02-26 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor

Also Published As

Publication number Publication date
US20120253028A1 (en) 2012-10-04
CA2375060A1 (en) 2000-11-30
WO2000071559A1 (en) 2000-11-30
US20160024138A1 (en) 2016-01-28
US8093372B2 (en) 2012-01-10
US9085797B2 (en) 2015-07-21
US20030120063A1 (en) 2003-06-26
US8524882B2 (en) 2013-09-03
DE60040912D1 (de) 2009-01-08
US20140066612A1 (en) 2014-03-06
ATE415409T1 (de) 2008-12-15
EP1185544A4 (en) 2002-07-17
EP1185544A1 (en) 2002-03-13
US6593464B1 (en) 2003-07-15
WO2000071559A9 (en) 2001-06-21
AU5285800A (en) 2000-12-12
EP1185544B1 (en) 2008-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9085797B2 (en) Method for deblocking of labeled oligonucleotides
EP2089343B1 (en) Click chemistry for the production of reporter molecules
US5750343A (en) Methods of detecting nucleic acids with nucleotide probes containing 4'-substituted nucleotides and kits therefor
EP0786468B1 (en) Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides
JP2511005B2 (ja) インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法並びにそれに用いる試薬
US6825331B2 (en) Aminooxy functionalized oligomers, oligomer arrays and methods of using them
US5798210A (en) Derivatives utilizable in nucleic acid sequencing
US6664388B2 (en) Reagents for oligonucleotide cleavage and deprotection
Boger et al. DNA Alkylation Properties of the Duocarmycins:(+)-Duocarmycin A, epi-(+)-Duocarmycin A, ent-(−)-Duocarmycin A and epi, ent-(−)-Duocarmycin A
Pitsch An Efficient Synthesis of Enantiomeric Ribonucleic Acids from D‐Glucose
EP0090789A1 (en) Chemical DNA synthesis
WO1999043694A1 (en) Improved methods for synthesis of oligonucleotides
JPH0665280A (ja) 蛍光標識化合物、その調製法および使用
Horn et al. Solid supported hydrolysis of apurinic sites in synthetic oligonudeotides for rapid and efficient purification on reverse-phase cartridges
US6399765B1 (en) Methods for removing dimethoxytrityl groups from oligonucleotides
US20040044195A1 (en) Process for separating and deprotecting oligonucleotides
CN1122137A (zh) 二聚体块的合成及其在装配寡核苷酸中的应用
Sigmund et al. A new type of fluorescence labeling of nucleosides, nucleotides and oligonucleotides
Piel et al. Synthesis of the oligodeoxyribonucleotide, d (CpTpGpGpApTpCpCpApG), and its substrate activity with the restriction endonuclease, BamHI
CA1214735A (en) Nucleotide compound preparation and method for producing the same
Martinez 3 Oligonucleotide Synthesis and Purification
Fillon et al. 3 Oligonucleotide Synthesis
AU2002306655A1 (en) Reagents for oligonucleotide cleavage and deprotection

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20070524

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070524

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422

Effective date: 20070524

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20070608

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070711

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101004

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20101228

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110111

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110330

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20110519

A045 Written measure of dismissal of application [lapsed due to lack of payment]

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A045

Effective date: 20110926