JPH02796A - 固体支持体上にアンモニアに不安定な基で標識化されたオリゴヌクレオチド類の合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【発明の分野】

本発明は一般的に固相支持体上におけるオリゴヌクレオ
チド類の合成方法、より詳しくは合成オリゴヌクレオチ
ド類の蛍光染料による標準化方法に関する。

【発明の背景】

合成オリゴヌクレオチド類は、相補的デオキシリボ核酸
（ＣＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡライブラリーのスフ−リ
ングのためのプローブとして、及びＤＮＡポリメラーゼ
及び逆転写酵素によるＤＮＡ合成のためのプライマーと
して分子生物学において広汎な応用を有する。 後者の応用としては、部分的タンパク質配列方法及びタ
ンパク質生成物のための感受性生物学的アッセイが利用
可能である場合には稀なメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲ
ＮＡ）の固定のための技術、例えばガンマ−インターフ
ェロンについてグレイ等（Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ＋　Ｎ
ａｔｕｒｅ　　第２９５巻、５０３−５０８真、１９８
２年）、及びジオキシ鎖停止方法によるＤＮＡを配列す
るための技術、例えば、スミス等（Ｓｍ　ｉ　ｔｈｅｔ
　ａｌ、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ、１３巻、２３９９−２４１２頁１９８５年；シ
ュライヤー等（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ。 Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　１２９巻、１６９−１
７２頁、１９７９年）；及びサンガー等（Ｓａｎｇｅｒ
　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｍｏ１．旧ｏ１゜１４３巻、１
６１−１７８頁、１９８０年）などが挙げられる。 最近、ＤＮＡ配列決定方法における改良は複数蛍光ラベ
ルを利用して単一力ラムゲル上で自動的に配列決定を行
っている。例えば、スミス等（上掲）及びスミス等、Ｎ
ａｔｕｒｅ、３２１巻、６７４−６７９頁（１９８６年
）。典型的には、蛍光ラベルはプライマー〇造築過程に
おいて、その様な方法において最終工程（或いは一連の
工程）において用いられるオリゴヌクレオチドプライマ
ーに結合される。現在、ホスファイト−トリエステル法
において、新たに合成されたオリゴヌクレオチドをその
支持体から除去する前に蛍光ラベルを結合するために三
つまでの付加的段階が必要とされている。先ず第一は、
結合剤がヌクレオシドホスホルアミダイトを添加するの
に用いられる同一条件下でオリゴヌクレオチドの５′末
端に結合される。第二に、結合剤が例えば保護基を除去
することにより活性化されて、−級アミンなどの反応性
官能基を曝露する。そして最後に、活性化染料が結合剤
上の曝露官能基と反応させられる。 分光的に分解可能な蛍光標識の組の選択において重要な
りラスの染料であるローダミン染料で結合されたオリゴ
ヌクレオチドを標識しようと試みる場合に更に複雑な問
題が生ずる、例えば、スミス等（上掲）；及びローケン
等（ｌｏｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ。 Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、５巻、１５２−１５９頁、１９８
４年）。オリゴヌクレオチドをその支持体から切断する
ための主たる試薬は又、ローダミン染料を化学的に劣化
させ、それらの蛍光特性を激しく変化させる。この様に
、ローダミン染料が現在の固相合成方法に用いられる場
合には、それらはオリゴヌクレオチドが固相支持体から
切断された後に結合されなければならず、その結果付加
的工程を生じ、総合合成においてより大きな不便を生ず
る。 前記に濫み、固相ＤＮＡ合成における直接使用のための
染料−ホスホルアミダイト複合体が利用可能であればア
ベルを結合するために必要な工程を減することにより標
識化プライマー合成の効率を改良させるものと思われる
。 特に、ローダミン結合に必要とされる手動の液相合成工
程がローダミン染料の化学的完全性及び蛍光特性を保存
する切断試薬の利用可能性により省略することができる
ならば、幾つかのＤＮＡ配列決定系がより自動化に則し
たものとなると思われる。

【発明の概要】

広義に、本発明はアンモニア−不安定基で標準化された
オリゴヌクレオチド類の合成方法に向けられたものであ
る。本発明の一つの重要な側面は、三成分、即ち１〜３
個の炭素原子を有する低級アルキルアルコール、水、及
び３〜６個の炭素原子を有する非−求核障害アルキルア
ミンを含んでなる切断試薬により、アンモニア無しに固
相支持体及びオリゴヌクレオチド間の塩基−不安定結合
基の切断である。好ましくは、この切断試薬の三つの成
分は約１：１：１乃至約１：３：１（容■）の低級アル
コール：水：非−求核障害アルキルアミンの比で存在す
る。より具体的には、本発明は、固相支持体上でのロー
ダミン−標準化オリゴヌクレオチド類の合成方法を含む
ものである。好ましくは、この後者の方法は合成方法に
おいて、ローダミンホスホルアミダイト類の使用を含む
ものである。 好ましくは、標準化−求核障害アルキルアミンはイソプ
ロピルアミン、ｔ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ピ
ペリジン、ｔ−アミルアミン、ジイソプロピルアミン及
びジプロピルアミンから選ばれる。最も好ましくは、標
準化−求核障害アルキルアミンはＬ−ブチルアミンであ
る。 好ましくは低級アルキルアルコールはメタノール、エタ
ノール、及びプロパノールよりなる群から選ばれる。最
も好ましくは、低級アルキルアルコールはメタノールで
ある。 好ましくは、塩基−不安定結合基はコハク酸エステルで
ある。最も好ましくは、コハク酸エステルはオリゴヌク
レオチドの３′ヒドロキシ基によりオリゴヌクレオチド
を固相支持体に結合する。 本発明の重要な側面は、オリゴヌクレオチド合成完了時
におけるオリゴヌクレオチドを固相支持体に結合する塩
基−不安定結合部分、例えばコハク酸エステルの切断及
び／又は塩基不安定アミノ保護基例えばベンゾイルの除
去である。 本発明のもう一つの重要な側面は上記反応がローダミン
劣化なしに行われることにより、固相支持体上における
ローダミン標準化オリゴヌクレオチドの完全な合成を可
能にすることである。 本発明は固相支持体上のオリゴヌクレオチド類、特にロ
ーダミン染料で標準化されたオリゴヌクレオチド類の合
成方法を提供する。この方法の重要な特徴は、（１）オ
リゴヌクレオチドを固相支持体間の結合基、通常はコハ
ク酸エステルをオリゴヌクレオチドが固相支持体から遊
離されるように加水分解することができ、（２）オリゴ
ヌクレオチドの複素環塩基の環外アミンとアミノ保護基
、通常ベンゾイル或いはイソブチリルとの間の結合を加
水分解することができ、及び（３）オリゴヌクレオチド
に結合したローダミン染料の化学構造を変化させない切
断試薬の使用である。 本発明に用いられるローダミン染料は各種結合手段によ
りオリゴヌクレオチドに結合されてよい。 例えば、後で適当な誘導化ローダミン染料と反応させら
れてよい１種以上の官能基を有するオリゴヌクレオチド
類を誘導化するためのいくつかの手段が利用可能である
。例えば、オリゴヌクレオチドはアミン誘導化されてよ
く、適当なローダミン誘導体はイソチオシアネー）−Ｎ
−ヒドロキシスクシニミドなどである。アミノ或いはチ
オール官能基を有するオリゴヌクレオチド類を誘導化す
るための方法を開示する文献としては、コノリー等（Ｃ
ｏｎｎｏｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ）　、Ｎｕｃｌｅｆｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。 １３巻、４４８５−４４０２頁（１９８５）　、コノリ
ー、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　
１５巻、３１３１−３１３９頁（１９８７）　　；ルタ
（Ｒｕｔｈ）　、ＤＮＡ、　３巻、１２３頁（１９８４
）　　ｉハラランビデイス（ｔ！ａｒａｌａｎｂｉｄｉ
ｓ　ｅｔ　ａｌ）　、Ｎｕ−ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１５巻、４８５７−４８７６頁（
１９８７）；スミス（Ｓｉｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ）　、
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｂ、　１３
巻、２３９９−２４１２頁（１９８５）が挙げられる。 これらの文献は益に準用する。 好ましくは、ローダミン染料はローダミンホスホルアミ
ダイトとしてオリゴヌクレオチドと結合される。 固相オリゴヌクレオチド合成についての「切断」という
用語は固相支持体にオリゴヌクレオチドを結合させる結
合の破壊を意味する。通常、切断は結合オリゴヌクレオ
チドの３′ヒドロキシルと固相支持体の間のコハク酸エ
ステル結合の加水分解を含む。 本発明において用いられる「脱保護」という用語はオリ
ゴヌクレオチドの複素環塩基の環外アミンからの保護基
の除去を意味する。通常、脱保護は環外アミンとアミノ
保護基、例えばベンゾイル或いはイソブチリルなどより
なるアミド部分の加水分解を含む。文献において、「脱
保護」という用語は切断前のホスフェートジエステルか
らの保護基の除去を含むより一般的に用いられている場
合がある。その様な保護基がメトキシである場合には、
本発明において用いられる「脱保護」はそれらの除去を
含まない。この場合には、標準的チオフェルノール含有
試薬による追加の処理が必要である。 本発明において用いられる「オリゴヌクレオチド」とい
う用語は、少ないヌクレオチド例えば２〜２０乃至多く
のヌクレオチド例えば２０〜数百以上を含有するデオキ
シリボヌクレオチド或いはツボヌクレオチドのいづれか
の一本鎖を指す。より詳しくは、この用語は上記範囲の
大きさのデオキシリボヌクレオチドの一本鎖を指す。 本発明において用いられるアルキルアミンについての「
非−求核」とは、脱保護時（アルキルアミンの存在下）
にアミド保護基の加水分解が金環外アミンー保護基複合
体が離脱基として作用するアルキルアミンを含む競争的
求核置換反応に対して支配的であって、かくして、ヌク
レオチド塩基を修飾することを意味する。 ローダミン染料については、ローダミン染料の炭素原子
数を示すために、カラー・インデックス（Ｃｏｌｏｕｒ
　Ｉｎｄｅｘ）　、　　（＾５ｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏ
ｆ　ＴｅｘｔｉｌｅＣｈｅｍｉｓｔ、２版、１９７１　
）付番方法が用いられる。 キサンチン様梼造における炭素原子は下記の如くダッシ
ュを付けた番号で示され、９′−置換フェニルの炭素原
子は下記に示される如くダッシュを付けられない数によ
り示される。 好ましくは、本発明において用いられるローダミン染料
は、下記一般式により規定される群から選ばれる。 式中、 Ｚはアニオン基、好ましくはカルボキシレート或いはス
ルホネート、及びより好ましくはカルボキシレートであ
る。 Ｒ３及びＲ１は各々水素、ハロゲン、１〜８個の炭素原
子を有するアルキル、１〜８個の炭素原子を有するアル
キルエーテル或いは１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ルチオエーテル、及び、Ｒ３はＲ２と共に、及びＲ８は
Ｒ７と共に各々２〜５個の炭素原子を有し、それぞれ７
′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び２′
炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル鎖で
ある。 好ましくは、ＲＩ及びＲ８は各々水素、１〜３個の炭素
原子を有するアルキルくろろ或いは１〜３個の炭素原子
を有するアルキルエーテルであり、及びＲＩはＲ２と共
に、及びＲ８はＲ１と共に各々２〜３個の炭素原子を有
し、それぞれ７′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結
し、及び２′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結する
アルキル鎖を形成する。最も好ましくは、Ｒ３及びＲ６
は各々水素であり、及び、Ｒ３はＲｔと共に、及びＲ日
はＲ７と共に各々３個の炭素原子を有し、それぞれ７′
炭素を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び２′炭
素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル鎖を形
成する。 Ｒ２及びＲ１は各々１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ルであり、及びＲ２はＲ１と共に、及びＲ７はＲ８と共
に各々上記の如く２〜５個の炭素原子を有するアルキル
鎖である。好ましくは、Ｒ２及びＲ１は各々１〜３個の
炭素原子を有するアルキルであり、及びＲｔはＲ１と共
に、及びＲ７はＲ８と共に各々２〜３個の炭素原子を有
し、それぞれ７′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結
する、及び２′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結す
るアルキル鎖である。最も好ましくは、Ｒ２及びＲ１は
各々メチル或いはエチルであり、及びＲ２はＲ１と共に
、及びＲ１はＲ，と共に、各々３個の炭素原子を有し、
それぞれ７′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結する
、及び２′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するア
ルキル鎖である。 Ｒ１及びＲ６は各々１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ル、及びＲ３はＲ４と共に、及びＲ６はＲ３と共に各々
２〜５個の炭素原子を有し、それぞれ５′炭素を６′炭
素に結合する窒素に連結する、及び４′炭素を３′炭素
に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。好ましく
は、Ｒ１及びＲ６は各々１〜３個の炭素原子を有するア
ルキルであり、及びＲ３はＲ１と共に、及びＲ６はＲ６
と共に各々２〜３個の炭素原子を有し、それぞれ５′炭
素を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び４′炭素
を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル鎖である
。最も好ましくは、Ｒ３及びＲ，は各々メチル或いはエ
チルであり、及びＲ４はＲ４と共に、及びＲ４はＲ１と
共に各々３個の炭素原子を有し、それぞれ５′炭素を６
′炭素に結合する窒素に連結し、及び４′炭素を３′炭
素に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。 Ｒ４及びＲ２はそれぞれ水素、１〜８個の炭素原子を有
するアルキル、ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有する
アルキルエーテル、或いは１〜８個の炭素原子を有する
アルキルチオエーテル、及び、Ｒ４はＲ３と共に及びＲ
３はＲ，と共に各々上記２〜５個の炭素原子を有するア
ルキル鎖である。好ましくは、Ｒ４及びＲ１は各々水素
、クロロ、１〜３個の炭素原子を有するアルキル、或い
は１〜３個の炭素原子を有するアルキルエーテル、及び
Ｒ４はＲ３と共に、及びＲ３はＲ，と共に上記の如く２
〜３個の炭素原子を有するアルキル鎖である。最も好ま
しくは、Ｒ４及びＲ２は各々水素であり、及び、Ｒ４は
Ｒ１と共に、及びＲ９はＲ，と共に各々３個の炭素原子
を有し、それぞれ５′炭素を６′炭素に結合する窒素に
連結し、及び４′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結
するアルキル鎖である。 Ｌはその特性がそれが結合する基（本発明において「相
補的官能基」と称する）の性質に応じて異なる結合基を
表わす、結合官能基の具体例を表■にそれらの相補的官
能基及び得られる結合基と共に掲げる。最も好ましい結
合官能基はヒドロキシル相補的官能基と反応させられた
場合に、次いで酸化されてホスフェートエステル結合基
を与えるホスファイトエステル結合基を形成するホスホ
ルアミダイトである。 ＮＣ３ＮＨ２−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ Ｎ＝＼ ｌ Ｎ＝＼ 一 ＣＨ（Ｃｌｌ　ｚ）　２ Ｗ、、Ｗ、、及びＷ３は水素或いはクロロ、好ましくは
水素である。 この発明において用いられる「ローダミンＸ」（ＲＯＸ
）と略記）はＲ８及びＲ，、Ｒ，及びＲ４１Ｒ１及びＲ
，、Ｒ，及びＲＩｌが一緒に上記の如く３個の炭素のア
ルキル鎖を形成し、Ｂがカルボキシレートであり、及び
Ｗ、、Ｗ、、及びＷ、が水素であり、及び結合官能基が
それぞれ５′−或いは６′−炭素に結合している一般式
■の化合物を指す。本発明において用いられる「テトラ
メチルローダミン」　（「ＴＭＲ」と略記）はＲ１＊　
　Ｒ４＋Ｒｓ　、Ｒｓ　、　Ｗ＋　、Ｗｔ　、及びＷ、
が水素であり、Ｂがカルボキシレートであり、及びＲ２
＋　　Ｒ３ｒＲ６及びＲ１がメチルであり、結合官能基
がそれぞれ５′−或いは６′炭素に結合している一般式
Ｉの化合物を意味している。 幾つかの本発明において用いるローダミン染料は、たと
えばＥａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ社（ロチニスターニュ
ーヨーク）　、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社（
ジャンクション　シティ、オレゴン州）、或いはＲｅｓ
ｅａｒｃｈＯｒｇａｎｉｃｓ　（クリーブランド、オハ
イオ州）により市販されており、ソの他は米国特許第２
，２４２゜５７２号、同第２，１５３，０５９号、同第
３゜８２２．２７０号、同第３，９３２，４１５号及び
同第４，００５，０９２号各明細書の教示に従って合成
することができ、これらの文献は全て本に準用する。 ＲＯＸ及びＴＭＲは本発明において使用する最も好まし
いローダミン染料である。 ホスファイト−トリエステル、ホスホトリエステル、及
びＨ−ホスホネート化学による固相合成方法の詳細な説
明は広く利用可能である。例えば、イタクラ（Ｉｔａｋ
ｕｒａ　、米国特許第４，４０１，７９６号明細書）；
カルザース等（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ。 米国特許第４，４５８，０６６号、及び同第４゜５００
．７０７号各明細書）；マチラッチ等（Ｍａｔｔｅｕｃ
ｃｉ　　ａｔ　　ａｌ、　　Ｊ、　　八ｍｅｒ、　　Ｃ
ｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、　　　１０３　　巻、３１８５〜
３１９１頁、１９８１年）；カルザース等（Ｃａｒｕｔ
ｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ：　４巻、１〜１７頁（１９８年）；ジジ
ーンズ（Ｊｏｎｅｓ　）第２章、アッキンソン等（Ａｔ
ｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）第３章、及びスプロート等
（Ｓｐｒｏａｔ　ｅｔ　ａｌ）第４章、Ｇｒａｉｔ　４
５０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ；　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｉ
ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ＋ワシントン、　Ｄ、Ｃ，、１９８４
年）；フレーラー等（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、
　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１ｅｔｔｅｒｓ）２７巻、
４６９−４７２頁、１９８６）　、ガレラグ等（Ｇａｒ
ｅｇｇｅｔ　ａｌ　、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ　、　２７巻、４０５１４０５４頁及び４９
５５−４０５８頁、１９８６）　：及びフレーラー等（
Ｆｒｏｅｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。 １４巻、５３９９−５４０７頁、１９８６）。従って、
これらの文献は本に準用する。 好ましくは、本発明は、ホスファイトトリエステル法に
よるローダミン−標準化オリゴヌクレオチドの合成を含
むものである。即ち、ヌクレオチドをヌクレオシドホス
ホルアミダイトを成長鎖の５′ヒドロキシルと反応させ
ることによりヌクレオチドの成長鎖に逐次添加する。 特に、オリゴヌクレオチドはローダミンホスホルアミダ
イトを結合オリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシルと反
応させることにより標準化される。 本発明のローダミンホスホルアミダイトは、先ずローダ
ミンの５−或いは６−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（Ｎ
Ｈ３）エステルをアミノアルコール、例えばエタノール
アミン、ヘキサノールアミンなどとＮ、Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ）或いは同様な非プロトン極性溶媒
中で室温において反応させてローダミン染料の５−或い
は６−アルコールアミドを形成し、それを次いで標準手
段により反応液から分離する。このローダミン染料のア
ルコールアミドを次いで触媒量のテトラゾール及びジイ
ソプロピルアミンを含有するアセトニトリルにおいて室
温で過剰のジー（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メト
キシホスフィンと反応させてローダミンホスホルアミダ
イトを形成し、これを反応液から分離する。 一般的に、切断及び脱保護は本発明の切断試薬により、
先ず固相支持体に（塩基−不安定結合基を介して結合し
たオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドが固相から
放出されるように室温で約１〜２時間切断試薬に曝露し
、次いで放出されたオリゴヌクレオチドを含有する切断
試薬を環外アミンに結合した保護基が除去されるように
約８０〜約９０°Ｃで約２０〜約６０分間加熱すること
により行われる。或いは又、脱保護工程は、より低温で
行うことができるが、しかして反応は完結までより長く
かかり、例えば５５°Ｃにおいては加熱は５時間行われ
る。 切断及び脱保護後、標準化或いは未標準化オリゴヌクレ
オチドを標準的操作により精製する。例えば、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｓｅｒｓ　Ｂｕｌｌ
ｅｔｉｎ　Ｎｏ、１３（１９８７年４月１日改訂）；ガ
イド（Ｇａｉｔ）のＯｌｉ−ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ
ｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　ワシントン、
　Ｄ、Ｃ，、１９８４年）の第５章及び第６章。

【実施例】

以下の実施例は本発明を説明するのに役立つものである
。試薬の濃度、温度及びその他の可変パラメータの値は
本発明を例示するのみであり、それを制限するものと考
えられてはならない。 以下に、アミノアルキルホスホルアミドの一般的製造方
法を開示する。大まかに言って、同一の操作がコノジー
によりヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１５巻３１
３１−３１３９頁（１９８７年）　　（Ｃｏｎ−ｎｏｌ
ｌｙ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ、　Ｖｏｌ、　１５＋　ｐｇｓ。 ３１３１〜３１３９（１９８７）　）に開示されている
。これらの化合物は固相支持体に結合したアミノ誘導オ
リゴヌクレオチド類に有用である。本発明において有用
なアミノアルキルホスホルアミダイト類の一群は下記一
般式により定義される。 弐■ 式中、Ｂ、は固相支持体及びオリゴヌクレオチド間の塩
基−不安定結合基を切断することなしに除去することの
できる酸−不安足取いは塩基−不安定アミノ保護基を表
わす。その様な基はグリーンにより「有機合成における
保護基（ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏ
ｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　Ｊ、（Ｊｏｈｎ
　Ｗｉｌｅｙ＆５ｏｎｓ＋　　　−−ニーヨーク、１９
８１）第７章に説明されており、この章は本に準用する
。′好ましくは、塩基−不安定保護基は複素環の窒素、
或いはその前駆体のそれと共に塩基不安定アミド及びカ
ルバメート保護基、好ましくはトリハロアセチル、アセ
トアセチル及びフルオレニルメチルカルバメート、特に
９−フルオレニルメチルカルバメート及び９−（２−ス
ルホ）−フルオレニルメチルカルバメート及びトリフル
オロアセチルである。好ましい酸−不安定保護基として
は未誘導トリチル及びその低級（１〜３個の炭素原子を
含む）アルコキシ誘導体、特に４−モノメトキシトリチ
ルが挙げられる。Ｂ２及びＢ３はそれぞれ別々に水素。 低級アルキル、低級置換アルキル、特にハロー。 シアノ−８或いはニトロ−置換低級アルキル、低級アシ
ル、シアノ、ハロ、及びニトロを表わし、より好ましく
はＢ、及びＢ、は各々別々に水素。 低級アルキル、及び低級ハロアルキルを表わし、好まし
くはＢ２及びＢ３は水素を表わす。 Ｂ４は１０個までの炭素原子を含有するアルキル、アル
ケニル、アリール、アラルキル或いはシクロアルキルを
表わす。より好ましくは、Ｂ４は低級アルキル；電子引
抜きベーター置換エチル、特にベータートリハロメチル
−、ベーターシアノ、特にベータースルホ−、ベーター
ニトロ置換エチルなど；電子引抜き置換フェニルエチル
、特にハロー、スルホ−、シアノ−１或いはニトロ−置
換フェニル；或いは電子引抜き置換フェニルを表わす。 最も好ましくは、Ｂ４はメチル、ベーターシアノエチル
、或いは４−ニトロフェニルエチルを表わす。 本発明において用いられる「低級アルキル」という用語
は１〜６個の炭素原子を含む直鎖及び分岐鎖アルキル基
、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、タ
ー−ブチル、イソブチル。 ５ｅｃ−ブチル２ネオペンチル、ター−ペンチルなどを
示す。「低級アルキル」とは、電子−引抜き置換基例え
ばハロ、シアン、ニトロ、スルホ或いはモノ−ジー、或
いはトリハロメチルなどを有する低級アルキルを示す。 「低級アルキル」とは１個以上のハロゲン原子置換基、
通常フルオロ。 クロロ、ブロモ或いはヨードを有する低級アルキルを示
す。「低級アシル」とは非−二重結合炭素がハロー　シ
アノ−９或いはニトロ−置換基を有してもよい低級アル
キルよりなる１〜７個の炭素原子を　含むアシルを示す
。「電子引抜き」とはある置換基のそれが離れた分子の
原子価電子を吸引する傾向、即ち、それが電子陰性であ
ることを示す、マーチ、アドバンスト・オーガニック・
ケミストリー、第三版（Ｍａｒｃｈ、八ｄｖａｎｃｅｄ
　ＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｔｈ１ｒｄ　
Ｅｄ、　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ、　二ｓ−ヨーク、１
９８５年）〕。 ｊは２〜１０の範囲にある。 Ｒ′及びＲ“は各々別々に１０個までの炭素原子を含有
するアルキル、アラルキル、シクロアルキル、及びシク
ロアルキルアルキルを表わす。好ましくは、Ｒ′及びＲ
“は各々別々に低級アルキルを表わし、最も好ましくは
、上記ホスホルアミダイト類が直接結合剤として用いら
れる場合にはＲ′及びＲ＃は別々にホスホルアミダイト
ａの化学的安定性、従ってそれらの貯蔵寿命を高める立
体障害低級アルキルである。その様な立体障害低級アル
キルとしては、イソプロピル、Ｌ−ブチル。 イソブチル、　５ｅｃ−ブチル、ネオペチル、ター−ペ
ンチル、イソペンチル、　　５ｅｃ−ペンチルなどが挙
げられる。 Ｒ′及びＲ“は−緒に主鎖に５個までの及び合計１０個
までの炭素原子を含有し、該鎖の両末端原子価結合がＲ
′及びＲ“が結合している窒素原子に結合しているアル
キル鎖を形成するか、或いはＲ′及びＲ″はそれらが結
合する窒素原子と共に窒素、酸素及びイオウよりなる群
から選ばれる１個以上の追加のへテロ原子を含有しても
よい飽和窒素複素環を形成する。より好ましくは、Ｒ′
及びＲ″はそれらが結合する窒素と共にプロリジノ１モ
ルホリノ、或いはピペリジノを表わす。最も好ましくは
、Ｒ′及びＲ＃はそれらが結合する窒素と共にモルホリ
ノを形成する。 本発明において用いられるもう一つのアミノアルキルホ
スホルアミダイト類の群は次式で定義されるものである
。 （式中、Ｂ＋　、Ｂａ　、Ｒ’及びＲ“は上記の通りで
あり、及びｔは０〜８の範囲にあり、Ｓは０〜８の範囲
にあり、但し、Ｓ＋ｔは１〜８の範囲にある）。 上記アミノアルキルホスホルアミダイト類式■及び■を
合成するための一般的方法は次の工程を含んでなる。下
記一般式により規定されるＡロー置換−Ｎ、　Ｎ−ジー
置換−〇−置換ホスフィン：（式中、Ｘはハロゲン、通
常は塩素であり、及びＲ’、Ｒ”及びＢ４上記の通りで
ある）を下記一般式により規定されるアミノ−保護アル
コールアミン： Ｂ、−Ｎ　−（ＣＢＪ３）　ｊ　−ＯＲ弐■ （式中、Ｂ、、Ｂ、及びＢ３は上記の通りである）と反
応時に放出されるハロゲン酸を吸収する非−求核塩基、
例えばＮ、Ｎジイソプロピルエチルアミンなどのトリア
ルキルアミンを含有するジクロロメタンとの非−プロト
ン溶媒中で反応させる。 好ましくは、反応はアルゴンなどの不活性雰囲気下に行
われる。酸はホスホルアミダイト生成物のアミンが陽子
を加えて反応性にさせるので、反応液における酸性条件
は避けられるべきである。非−求核塩基は塩基と活性化
ホスホルアミダイト類との間の副反応の可能性を減少さ
せる。 上記物質を反応後、以下に第一反応液と称する反応液を
穏やかな塩基性溶液で洗浄して非−求核塩基の塩類を除
去する。最後に第一反応液をたとえばＭ　ｇ　Ｓ　Ｏａ
。Ｎ　ａ　、Ｓ　Ｏ，などで乾燥させて、保護アミノア
ルキルホスホルアミダイトを得る。 Ａ、保護アミノエチルホスホルアミダイトの調製クロロ
、Ｎ、Ｎジイソプロピルアミノメトキシホスフィン（５
，０ｍｆ、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社、ウィ
スコンシン州、ミルウォーキー、より市販）を０°Ｃに
おいて、アルゴン下に撹拌されたジクロロメタン（約４
０ｍｆ）中のＮ−（２−ヒドロキシエチル）−２，２，
２−）リフルオロアセタミド（３，９ｇ）、並びにジイ
ソプロピルエチルアミン（５，０ｍｊりの溶液に滴加し
た。（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２，２，２−）
リフルオロアセタミドはラザラス（Ｌａｚａｒｕｓ）及
びペンコピツク（Ｂｅｎｋｏｖｉｃ）によりＪ、　Ａｌ
ｌ１．Ｃｈｅ＋ａ、　Ｓｏｃ、　１０１巻、４３００〜
４３１２頁（１９７９）に開示される方法に従って合成
した：すなわち、５０ｍ／！のクロロホルム中のエチル
トリフルオロアセテート（５６，該、０゜４ｍｏ　ｌ）
を５０ｍ１のクロロホルム中２４．４　ｇ（０，４ｍｏ
ｌ）のエタノールアミンの撹拌された溶液に滴加した。 この溶液を室温で５時間撹拌し、回転蒸発させて溶媒を
除去して、１１５°Ｃ（４，３Ｔｏｒｒ）で蒸留し、５
８．５　ｇの油を得、これは引掻くと結晶化した。）室
温で０．５時間撹拌後、反応液を０．２Ｍ炭酸カリウム
溶液で２回及び塩水で１回洗浄し、乾燥させ（Ｍ　ｇ　
Ｓ　Ｏａ）、減圧下に濃縮してＮ−（２−（Ｎ’　　　
Ｎ’　−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニルオ
キシ）エチル）−２゜２．２−）リフルオロアセタミド
を無色液体として得た（７．７７ｇ）。 ’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　ｔ　Ｃｌ　ｚ　）　　：６３
．６（６Ｈ。 ｍ）　、３．４　（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝１２）、１．２　（
１２Ｈ，ｄ、Ｊ＝６．５） ”Ｐ　　ＮＭＲ（ＣＤｚＣｊ！□　Ｉ）ｌデカップリン
グ）：６１４９（ｓ） Ｂ、保護アミノプロピルホスホルアミダイトの調製 クロロ、Ｎ、Ｎジイソプロピルアミノメトキシホスフィ
ン（３，７ｍ１）を０°Ｃにおいて、アルゴン下に撹拌
されたジクロロメタン（約２０ｍＡ）中のＮ−（３−ヒ
ドロキシプロピル）−２，２゜２−トリフルオロアセタ
ミド（２，９ｇ、３−アミノ−１−プロパノール及びエ
チルトリフルオロアセテートからラザラス及びペンコピ
ツクによりＪ。 Ａｍｅｒ、　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｓｏｃ、　１０１巻、４
３００〜４３１２真（１９７９）に開示される方法と同
様にして合成）、及びジイソプロピルエチルアミン（３
，７ｍｆｆ１）の撹拌された溶液に滴加した。室温で３
時間撹拌後、反応液をヘキサン（１００ｍｊりに注いで
撹拌した。混合物を沈澱させ、上澄液を分離し、減圧下
に濃縮してＮ−（３−（Ｎ’　　　Ｎ’　−ジイソプロ
ピルアミノメトキシホスフィニルオキシ）プロピル）−
２，２，２−）リフルオロアセタミドを無色液体として
得た（５．２ｇ）。 ”Ｐ　　ＮＭＲ（ＣＨｚＣｊ！ｚ、’Ｈデカップリング
）：６１４９（ｓ） Ｃ，アミノエチルホスホルアミダイトによるオリゴヌク
レオチドのアミンｍｉ化 固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドの５′ヒドロ
キシルの脱トリチル化後９−フルオレニルメチル−保護
アミノエチルホスホルアミダイトをホスファイトトリエ
ステル合成のための標準的アセトニトリル／テトラゾー
ル反応溶媒中の約０．２Ｍの濃度にて添加した。この９
−フルオレニルメチル−保護アミノエチルホスホルアミ
ダイトはアグラワル等（Ａｇｒａｗａｌ　ｅｔ　ａｌ）
によりヌクレイツク・アッシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）。 １４巻　６２２７頁（１９８６）にも開示されているよ
うに、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２，２，２トリ
フルオロアセタミドをＮ−（２−ヒドロキシエチル）−
９−フルオレニルメチルガルバメートに代えた他はパー
トＡの物質と同様にして調製した。この９−フルオレニ
ルメチル−保護基は、８０８２０％（容量）のアセトニ
トリルと、ピペリジンの溶液により室温で除去した。上
記反応はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　モ
デル３ＢＯＡなどの標準的自動化ＤＮＡシンセサイザー
上で行った。 実施例ｎ、ＲＯＸ−ホスホルアミダイトの人９７、１　
ｍ　ｇ　（０，１５８ｍｍｏｌ）の５〜及び６−カルポ
ジキーＸ−ローダミンのエタノールアミンアミド及び１
３．５　ｍ　ｇ　（０，０７９ｍｍｏｌ）のジイソプロ
ピルアンモニウムテトラゾリドの混合物を、乾燥アルゴ
ンでパージし、８ｍｆの乾燥（水素化カルシウムから蒸
留）アセトニトリルで希釈した。 ０、４０　ｇ　（１，５３ｍｍｏｌ）のメトキシ−ビス
−（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを添加し、溶液
をアルゴン下に室温で撹拌した。２時間後に溶液を７ｍ
Ｉ！、づつのヘキサンで４回洗浄し、０．５％トリエチ
ルアミンを含有するクロロホルムで２００ｍ２に希釈し
、１００ｍＡの１：１　塩水：水で洗浄し、硫酸ナトリ
ウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた。ゴム状固体
をヘキサンと共にすりつぶし、高真空下に乾燥させ、こ
の操作を黒色のさらさらした固体が得られるまで繰返し
て１１３ｍｇのＲＯＸ−５−及びＲＯＸ−６ホスホルア
ミダイトを得た。 実施例ＩＩ［ＴＭＲ−ホスホルアミダイトの入６１．４
ｍｇ　（０，１３０ｍｍｏｌ）の５−及び６−カルボキ
シルテトラメチルローダミンのエタノールアミンアミド
混合物及び０．００５　Ｍジイソプロピルアンモニウム
テトラゾリド（０，００１３ｍｍｏｌ）の０．２６　ｍ
　ｌのアセトニトリル溶液を合一して、＜　０．１　ｍ
ｍ圧力で蒸発させ、次いでアルゴンでパージして１０ｍ
２の乾燥（水素化カルシウムから蒸留）アセトニトリル
で希釈した。０．２２ｇ（０，８４０ｍｍｏｌ）のメト
キシ−ビス−（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを添
加し、溶液を窒素下に室温で１．５時間撹拌した。得ら
れた反応液を５ｍｆづつのヘキサンで５回洗浄し、０．
５％のトリエチルアミンを含有するクロロホルムで１０
０ｍｊ！に希釈し、６０ｍ２の１：１の塩水：水で洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、ヘキサンと共
にこすり、高真空下に蒸発乾固させた。この操作を黒色
のさらさらした固体が得られるまで繰返し、６７．６　
ｍ　ｇのＴＭＲ−５−及びＴＭＲ−６−ホスホルアミダ
イトを得た。 本例において、保護１８−マーオリゴヌクレオチドはＡ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ　
　ＤＮＡシンセサイザー上でホスファイトトリエステル
法により合成した。通常の切断試薬、水酸化アンモニウ
ムの代わりに、それぞれ１：２：１の比のメタノール：
水：も−ブチルアミンの本発明の切断試薬を用いた。シ
ンセサイザーを反応器内の固相支持体及び結合オリゴヌ
クレオチドが逐次室温において１５００秒間（４Ｘ１５
００）切断試薬に曝露されるように再プログラム化した
。反応容器流出液を別の容器に集め、脱保護のために８
５°Ｃで４０分間加熱した。反応液を取出し、１８−マ
ーをＨＰＬＣにより反応液から分離した。取出し後、固
相支持体をＡＢＩモデルＢの標準的切断方法に従って濃
水酸化アンモニウムで処理した。この水酸化アンモニウ
ム切断からの反応液を次いでＨＰＬＣにより分析して追
加のオリゴヌクレオチド類が固相支持体から除去された
かどうかを求めた。二つの反応液のクロマトグラフの比
較は最初の切断反応により１００％のオリゴヌクレオチ
ド類が固相支持体から除去されたことを示した。 同一のオリゴヌクレオチドを１；２：１　メタノール：
水：ｔ−ブチルアミンの切断試薬による切断工程の時間
を、４Ｘ１５００秒の代わりに４×９００秒にした他は
同一方法で再び合成した。 ＨＰＬＣ分析は最初の切断反応において７１％のオリゴ
ヌクレオチドが切断されたことを示した。 同一の方法により行った。ＨＰＬＣ分析は約１０％のオ
リゴヌクレオチドが固相支持体から切断されたことを示
した。 本例における切断及び脱保護は、切断試薬を、１：１：
ｌの比のメタノール：水：ｔ−ブチルアミンにした他は
同一のシンセサイザ上で実施例■と同一の方法により行
った。ＨＰＬＣ分析は、約８０％のオリゴヌクレオチド
が固相支持体から切断されたことを示した。 本例における切断及び脱保護は、切断試薬を２：２：１
の比のメタノール：水：ｔ−ブチルアミンにした他は同
一のシンセサイザ上で実施例■とＲＯＸ及びＴＭＲ標準
化オリゴヌクレオチドを別々に、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ自動化ＤＮＡシンセサ
イザー上で合成した。ホスファイトトリエステル化学を
用いる同等のＤＮＡシンセサイザーも又、使用可能であ
った。標準化は、ＲＯＭホスホルアミダイト或いはＴＭ
Ｒホスホルアミダイトのいずれかを製造者によりヌクレ
オシドホスホルアミダイトを接合するために推薦された
条件下に、固相支持体に結合されたオリゴヌクレオチド
の５′ヒドロキシと反応させることにより達成された。 カルザス等（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ）。 米国特許第４．４１５，７３２号明細書、及びカルザス
等、ジェネティック・エンジニャリング（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、　　４巻、１〜１７頁
（１９Ｂ２）はＡｐｐｌｉｅｄ　１３ｉｏｓｙｓｔｅｍ
！モデル３８０Ｂシンセサイザーにより用いられる化学
の詳細な説明を与えている。従って、これらの文献は、
それらの説明のために準用する。ＲＯＸ及びＴＭＲホス
ホルアミダイトは０．５Ｍテトラゾール／アセトニトリ
ル溶液と組合わせて０．２Ｍアセトニトリル溶液として
用いられて合成サイクルに活性試薬を形成した。 切断及び脱保護は実施例■と同様にして行った。 ＲＯＸ及びＴＭＲ標準化オリゴヌクレオチドの完全性は
ＨＰ　Ｌ　Ｃ，ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び蛍
光ジデオキシＤＮＡ配列決定を用いた確実な試料による
比較により確認された。 前記本発明の好ましい実施態様の開示内容は例示及び説
明を目的として示されたものである。それは徹底的なも
のではなく、或いは本発明を開示された正確な形に限定
する趣旨のものではなく、明らかに上記開示に照らして
多くの修正及び変化が可能である。これらの実施態様は
本発明の原理及び実際的応用を最良に説明することによ
り当業者が本発明を各種実施態様において、又、考えら
れる特別な用途に適した各種修正をもって最良に利用で
きるように選ばれ、説明されたものである。 本発明の範囲は冒頭に掲げた特許請求の範囲により規定
されるものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）オリゴヌクレオチドと固相支持体との間の塩基−不
   安定結合基との切断方法であって、結合基を結合基が加
   水分解するまで切断試薬に曝露する工程を含んでなり、
   切断試薬が低級アルキルアルコール、水、及び３〜６個
   の炭素元素を有する非−求核障害アルキルアミンをそれ
   ぞれ約１：１：１乃至約１：３：１の容量比で含んでな
   ることを特徴とする方法。 ２）該低級アルキルアルコールがメタノール、エタノー
   ル及びプロパノールよりなる群から選ばれ、及び該比−
   求核障害アルキルアミンがイソプロピルアミン、ｔ−ブ
   チルアミン、ジエチルアミン、ピペリジン、ｔ−アミル
   アミン、ジイソプロピルアミン、及びジプロピルアミン
   よりなる群から選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３）該結合基がコハク酸エステルである特許請求の範囲
   第２項記載の方法。 ４）該切断試薬がメタノール、水、及びｔ−ブチルアミ
   ンをそれぞれ約１：２：１の比で含んでなる特許請求の
   範囲第３項記載の方法。 ５）固相支持体上にアンモニア−不安定基で標準化され
   たオリゴヌクレオチド類の製法であって、下記工程を含
   んでなることを特徴とする方法：塩基−不安定結合基に
   より固相支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを提供
   する工程； このオリゴヌクレオチドに１種以上のアンモニア−不安
   定基を結合してアンモニア−不安定基で標準化されたオ
   リゴヌクレオチドを形成する工程；及び その結合基を切断試薬によりアンモニア−不安定基で標
   準化されたオリゴヌクレオチドが固相支持体から遊離さ
   れるように切断する工程であって、切断試薬が、低級ア
   ルキルアルコール、水、及び３〜６個の炭素原子を含有
   する非−求核障害アルキルアミンをそれぞれ約１：１：
   １乃至約１：３：１の容量比で含んでなる工程。 ６）該結合基が該オリゴヌクレオチドの３′水酸基と該
   固相支持体の間に共有結合を形成する特許請求の範囲第
   ５項に記載の方法。 ７）（１）該低級アルキルアルコールがメタノール、エ
   タノール、及びプロパノールよりなる群から選ばれ、（
   ２）該非−求核障害アルキルアミンがイソプロピルアミ
   ン、ｔ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、
   ｔ−アミルアミン、ジイソプロピルアミン、及びジプロ
   ピルアミンよりなる群から選ばれ、及び（３）該塩基−
   不安定結合基がコハク酸エステルである特許請求の範囲
   第６項記載の方法。 ８）該アンモニア−不安定基がローダミン染料分子であ
   る特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９）該切断試薬がメタノール、水、及びｔ−ブチルアミ
   ンをそれぞれ約１：２：１の比で含んでなる特許請求の
   範囲第８項記載の方法。 １０）１種以上のローダミン染料分子を結合する該工程
   がローダミンホスホルアミダイトを該オリゴヌクレオチ
   ドの５′ヒドロキシルと反応させることを含む特許請求
   の範囲第８項記載の方法。 １１）該アンモニア−不安定基がローダミン染料分子で
   ある特許請求の範囲第５項記載の方法。 １２）２標準化ホスホルアミダイト。 １３）該ローダミンがテトラメチルローダミンである特
   許請求の範囲第１２項記載の化合物。 １４）該ローダミンがローダミンＸである特許請求の範
   囲第１２項記載の化合物。 １５）ローダミンホスホルアミダイト。