DE3856481T2

DE3856481T2 - Farbstoffmarkierte Phosphoramaditen

Info

Publication number: DE3856481T2
Application number: DE3856481T
Authority: DE
Inventors: Steven Fung; Steven M. Menchen; Sam Lee Woo
Original assignee: PE Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1987-12-24
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 2002-04-18
Anticipated expiration: 2008-12-23
Also published as: EP0617047A1; DE3853060T2; EP0323152B1; JP2787775B2; DE3856481D1; JPH02796A; US4965349A; EP0323152A3; DE3853060D1; EP0323152A2; EP0617047B1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren zum Synthetisieren von Oligonucleotiden auf Festphasenträgern, und genauer ausgedrückt Verfahren zum Markieren von synthetischen Oligonucleotiden mit Fluoreszenzfarbstoffen, die farbstoffmarkierte Phosphoramidite verwenden.
Synthetische Oligonucleotide finden breite Verwendung in Molekularbiologie als Sonden zum Durchmustern komplementärer Desoxyribonucleinsäure- (cDNA) und genomischer DNA-Genbibliotheken, und als Primer für DNA- Synthese durch DNA-Polymerasen und reverse Transcriptasen. Die letzteren Anwendungen umfassen Techniken zum Identifizieren seltener Boten-RNAs (mRNAs), wenn Teilproteinsequenzinformation und eine empfindliche biologische Analyse für das Proteinprodukt zur Verfügung stehen, z. B. wie bei Gamma-Interferon, Gray et al., Nature, Bd. 295, Seiten 503-508 (1982), und Techniken zum Sequenzzieren von DNA durch das Didesoxykettenabbruchverfahren, z. B. Smith et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, Seiten 2399-2412 (1985); Schreier et al., J. Mol. Biol., Bd. 129, Seiten 169-172 (1979); und Sanger et al., J. Mol. Biol., Bd. 143, 161-178 (1980).
Vor kurzem sind für Verbesserungen bei DNA- Sequenzzierungsmethoden mehrere Fluoreszenzmarkierungen genutzt worden, um Sequenzzierung automatisch auf einem einfachen Säulengel auszuführen, z. B. Smith et al. (oben zitiert), und Smith et al., Nature, Bd. 321, Seiten 674-679 (1986). Typischerweise werden die Fluoreszenzmarkierungen an den in solchen Verfahren verwendeten Oligonucleotidprimern in dem letzten Schritt (oder der letzten Reihe von Schritten) in dem Prozess zum Aufbauen von Primern befestigt. Momentan werden in dem Phosphittriester-Verfahren vor Entfernung des frisch synthetisierten Oligonucleotids von seinem Träger bis zu drei zusätzliche Schritte zum Befestigen einer Fluoreszenzmarkierung benötigt: Zuerst wird ein Bindungsagens an dem 5'-Ende des Oligonucleotids unter den gleichen Bedingungen befestigt, die zum Hinzufügen von Nucleosidphosphoramiditen verwendet werden. Zweitens wird das Bindungsagens aktiviert, z. B. durch Entfernen einer Schutzgruppe zum Freilegen einer reaktionsbereiten Funktionalität, so wie eines primären Amins. Und schließlich wird ein aktivierter Farbstoff mit der freiliegenden Funktionalität an dem Bindungsagens zur Reaktion gebracht.
Zum Beispiel beschreiben GB-A-2153356 und Entsprechung FR- A-2556726 ein Verfahren zum Bilden eines markierten Polynucleotids durch Synthetisieren eines eine aliphatische Aminogruppe enthaltenden Polynucleotids und zur Reaktion bringen der Aminogruppe mit einer geeignet reaktionsbereiten Markierung.
Zusätzliche Komplikationen können auftreten, wenn man versucht, das befestigte Oligonucleotid mit einem Rhodaminfarbstoff zu markieren, einer wichtigen Klasse von Farbstoffen in der Auswahl spektral auflösbarer Sätze von Fluoreszenzmarkierungen, z. B. Smith et al. (oben zitiert); und Loken et al. Cytometry, Bd. 5, Seiten 152-159 (1984). Das primäre Reagens zum Abspalten eines Oligonucleotids von seinem Träger zersetzt chemisch auch Rhodaminfarbstoffe, was radikal ihre Fluoreszenzeigenschaften ändert. Immer wenn Rhodaminfarbstoffe in aktuellen Festphasensyntheseprotokollen verwendet werden, müssen sie daher befestigt werden, nachdem das Oligonucleotid von dem Festphasenträger abgespalten worden ist, was zu einem zusätzlichen Schritt und größerer Unbequemlichkeit in der gesamten Synthese führt.
In Anbetracht des vorhergehenden würde die Erhältlichkeit von Farbstoff-Phosphoramiditkonjugaten für direkte Verwendung in Festphasen-DNA-Synthese die Effizienz markierter Primersynthese durch Verringern der Anzahl von Schritten verbessern, die zum Befestigen einer Markierung benötigt werden. Insbesondere wären einige Systeme für DNA- Sequenzierung leichter für Automatisierung anpassbar, wenn der für Rhodaminbefestigung benötigte manuelle Schritt von Flüssigphasensynthese durch die Erhältlichkeit eines Spaltungsagens beseitigt werden könnte, welches die chemische Integrität und Fluoreszenzeigenschaften von Rhodaminfarbstoffen bewahrt.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein farbstoffmarkierte Phosphoramidite so wie rhodaminmarkierte Phosphoramidite.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Synthetisieren von Oligonucleotiden, die mit ammoniaklabilen Gruppen markiert sind. Einen wichtigen Aspekt der Erfindung stellt die Spaltung von basenlabilen Bindungsgruppen zwischen einem Festphasenträger und einem Oligonucleotid ohne Ammoniak durch ein Spaltungsreagens dar, das drei Komponenten aufweist: einen niederen Alkylalkohol mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Wasser, und ein nichtnucleophiles gehindertes Alkylamin, das von 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthält. Vorzugsweise liegen die drei Komponenten des Spaltungsreagens in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 : 1 bis etwa 1 : 3 : 1 (nach Volumen) von niederem Alkylalkohol: Wasser: nichtnucleophilem gehindertem Alkylamin vor. Genauer ausgedrückt, umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren von rhodaminmarkierten Oligonucleotiden auf einem Festphasenträger. Vorzugsweise umfasst dieses letztere Verfahren die Verwendung von Rhodaminphosphoramiditen in dem Syntheseprozess.
Vorzugsweise wird das nichtnucleophile gehinderte Alkylamin ausgewählt aus der Gruppe, die aus Isopropylamin, t-Butylamin, Diethylamin, Piperidin, t-Amylamin, Diisopropylamin, und Dipropylamin besteht. Am stärksten bevorzugt ist das nichtnucleophile gehinderte Alkylamin t- Butylamin.
Vorzugsweise ist der niedere Alkylalkohol ausgewählt aus der Gruppe, die aus Methanol, Ethanol und Propanol besteht. Am stärksten bevorzugt ist der niedere Alkylalkohol Methanol.
Vorzugsweise ist die basenlabile Bindungsgruppe ein Succinatester. Am stärksten bevorzugt bindet der Succinatester das Oligonucleotid an den Festphasenträger mittels der 3'-Hydroxylgruppe des Oligonucleotids.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Spaltung basenlabiler Bindungskomponenten, die Oligonucleotide an Festphasenträger koppeln, z. B. Succinatester, und/oder die Entfernung basenlabiler Aminoschutzgruppen, z. B. Benzoyl beim Abschluss der Oligonucleotidsynthese. Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung besteht darin, dass die obigen Reaktionen ohne die Zersetzung von Rhodamin durchgeführt werden, wodurch die vollständige Synthese von rhodaminmarkierten Oligonucleotiden auf Festphasenträgern ermöglicht wird.
Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Synthetisieren von Oligonucleotiden auf einem Festphasenträger, insbesondere von mit einem Rhodaminfarbstoff markierten Oligonucleotiden. Ein wichtiges Merkmal des Verfahrens stellt die Verwendung eines Spaltungsreagens (1) dar, das die Bindungsgruppe, gewöhnlich ein Succinatester, zwischen dem Oligonucleotid und dem Festphasenträger hydrolysieren kann, so dass das Oligonucleotid von dem Festphasenträger gelöst wird, (2) das die Bindung zwischen exocyclischen Aminen der heterocyclischen Basen eines Oligonucleotids und Aminoschutzgruppen, gewöhnlich Benzoyl oder Isobutyryl, hydrolysieren kann, und (3) das nicht die chemische Struktur von an dem Oligonucleotid befestigten Rhodaminfarbstoffen ändert.
In der Erfindung verwendete Rhodaminfarbstoffe können an Oligonucleotiden durch eine Vielzahl von Bindungsmitteln befestigt werden. Zum Beispiel stehen mehrere Mittel zum Derivatisieren von Oligonucleotiden mit einer oder mehreren Funktionalitäten zur Verfügung, die später mit einem geeignet derivatisierten Rhodaminfarbstoff zur Reaktion gebracht werden können. Zum Beispiel können die Oligonucleotide aminoderivatisiert sein und das geeignete Rhodaminderivat kann Isothiocyanat, N-Hydroxysuccinimid oder dergleichen sein. Verweisstellen, die Verfahren zum Derivatisieren von Oligonucleotiden mit Amino- oder Thiofunktionalitäten offenbaren, umfassen Connolly et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, Seiten 4485-4402 (1985); Connolly, Nucleic Acids Research, Bd. 15, Seiten 3131-3139 (1987), Ruth, DNA, Bd. 3, Seite 123 (1984); Haralambidis et al., Nucleic Acids Research, Bd. 15, Seiten 4857-4876 (1987), und Smith et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, Seiten 2399-2412 (1985).
Vorzugsweise werden die Rhodaminfarbstoffe an Oligonucleotiden als Rhodaminphosphoramidite befestigt.
Der Ausdruck "Spaltung" in Bezug auf Festphasen- Oligonucleotidsynthese bedeutet die Aufspaltung der Bindung, die ein Oligonucleotid an einem Festphasenträger befestigt. Gewöhnlich beinhaltet Spaltung Hydrolyse einer Succinatesterbindung zwischen dem 3'-Hydroxyl eines befestigten Oligonucleotids und dem Festphasenträger.
Der Ausdruck "Schutzaufhebung", wie er hier verwendet wird, bedeutet Entfernen von Schutzgruppen von den exocyclischen Aminen der heterocyclischen Basen eines Oligonucleotids. Gewöhnlich beinhaltet Schutzaufhebung Hydrolyse einer Amidkomponente, die aus einem exocyclischen Amin und einer Aminoschutzgruppe, z. B. Benzoyl oder Isobutyryl besteht. In der Literatur wird der Ausdruck "Schutzaufhebung" manchmal allgemeiner verwendet, einschließlich der Entfernung von Schutzgruppen von den Phosphatdiestern vor Spaltung. Wenn solche Schutzgruppen Methoxy sind, schließt "Schutzaufhebung" wie hier verwendet nicht ihre Entfernung ein. In diesem Fall ist zusätzliche Behandlung mit einem thiophenolhaltigen Standardreagens erforderlich.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Oligonucleotid" allgemein auf eine einsträngige Kette von entweder Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden, die wenige Nucleotide, z. B. 2-20, bis viele Nucleotide, z. B. 20 bis mehrere hundert oder mehr enthält. Genauer ausgedrückt, bezieht sich der Ausdruck auf eine einsträngige Kette von Desoxyribonucleotiden in dem oben beschriebenen Größenbereich.
Mit "nichtnucleophil" in Bezug auf die in der Erfindung verwendeten Alkylamine ist gemeint, dass während Schutzaufhebung (in Anwesenheit des Alkylamins) die Hydrolyse der Amidschutzgruppe das Übergewicht über die das Alkylamin beinhaltende konkurrierende nucleophile Substitutionsreaktion haben wird, wobei der gesamte exocyclische Aminschutzgruppenkomplex als eine austretende Gruppe wirkt, wodurch die Nucleosidbase modifiziert wird.
In Bezug auf die Rhodaminfarbstoffe wird das Nummerierungsschema des Colour Index (Association of Textile Chemists [Vereinigung von Textilchemikern], 2. Ausg. 1971) verwendet, um die Kohlenstoffatome der Rhodaminfarbstoffe zu identifizieren. Kohlenstoffatome in der xanthenartigen Struktur werden durch Primzahlen wie unten angegeben identifiziert, und Kohlenstoffatome des 9'- substituierten Phenyls werden wie unten angegeben durch Nichtprimzahlen identifiziert.
Vorzugsweise werden Rhodaminfarbstoffe für Verwendung mit der Erfindung aus der Gruppe ausgewählt, die durch die folgende Formel definiert ist: Formel I
worin:
Z eine anionische Gruppe, vorzugsweise Carboxylat oder Sulfonat, und stärker bevorzugt Carboxylat ist.
R&sub1; und R&sub8; allein genommen jeweils Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkylether mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, oder Alkylthioether mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, und R&sub1; zusammengenommen mit R&sub2; und R&sub8; zusammengenommen mit R&sub7; Alkylketten mit von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen sind, die das 7'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 2'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'- Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden.
Vorzugsweise sind R&sub1; und R&sub8; allein genommen jeweils Wasserstoff, Alkyl mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Chlor, oder Alkylether mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, und R&sub1; zusammengenommen mit R&sub2; und R&sub8; zusammengenommen mit R&sub7; bilden jeweils eine Alkylkette mit von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, die das 7'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 2'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'- Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden. Am stärksten bevorzugt sind R&sub1; und R&sub8; allein genommen jeweils Wasserstoff, und R&sub1; zusammengenommen mit R&sub2; und R&sub8; zusammengenommen mit R&sub7; bilden jeweils eine Alkylkette mit 3 Kohlenstoffatomen, die das 7'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 2'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'- Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden.
R&sub2; und R&sub7; allein genommen sind jeweils Alkyl mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, und R&sub2; zusammengenommen mit R&sub1; und R&sub7;, zusammengenommen mit R&sub8; sind jeweils Alkylketten mit von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen wie oben beschrieben. Vorzugsweise sind R&sub2; und R&sub7; allein genommen jeweils Alkyl mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, und R&sub2; zusammengenommen mit R&sub1; und R&sub7; zusammengenommen mit R&sub8; sind Alkylketten mit jeweils von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, die das 7'- Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 2'- Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden. Am stärksten bevorzugt sind R&sub2; und R&sub7; allein genommen Methyl oder Ethyl, und R&sub2; zusammengenommen mit R&sub1; und R&sub7;, zusammengenommen mit R&sub8; sind Alkylketten mit jeweils 3 Kohlenstoffatomen, die das 7'- Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 2'- Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden.
R&sub3; und R&sub6; allein genommen sind jeweils Alkyl mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, und R&sub3; zusammengenommen mit R&sub4; und R&sub6; zusammengenommen mit R&sub5; sind Alkylketten mit jeweils von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, die das 5'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 4'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'- Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden. Vorzugsweise sind R&sub3; und R&sub6; allein genommen Alkyl mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, und R&sub3; zusammengenommen mit R&sub4; und R&sub6; zusammengenommen mit R&sub5; bilden Alkylketten mit jeweils von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, die das 5'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 4'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'-Kohlenstoffatom befestigen Stickstoff verbinden. Am stärksten bevorzugt sind R&sub3; und R&sub6; allein genommen Methyl oder Ethyl, und R&sub3; zusammengenommen mit R&sub4; und R&sub6; zusammengenommen mit R&sub5; sind Alkylketten jeweils mit 3 Kohlenstoffatomen, die das 5'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 4'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'- Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden.
R&sub4; und R&sub5; allein genommen sind Wasserstoff, Alkyl mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogen, Alkylether mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, oder Alkylthioether mit von 1 bis 8, Kohlenstoffatomen, und R&sub4; zusammengenommen mit R&sub3; und R&sub5; zusammengenommen mit R&sub6; sind Alkylketten jeweils mit von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie oben beschrieben.
Vorzugsweise sind R&sub4; und R&sub5; allein genommen Wasserstoff, Chlor, Alkyl mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, oder Alkylether mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, und R&sub4; zusammengenommen mit R&sub3; und R&sub5; zusammengenommen mit R&sub6; sind Alkylketten jeweils mit von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, wie oben beschrieben. Am stärksten bevorzugt sind R&sub4; und R&sub5; allein genommen Wasserstoff, und R&sub4; zusammengenommen mit R&sub3; und R&sub5; zusammengenommen mit R&sub6; sind Alkylketten jeweils mit 3 Kohlenstoffatomen, die das 5'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 4'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'- Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden.
L stellt eine Bindungsfunktionalität dar, deren Charakter von der Beschaffenheit der Gruppe abhängt, an der sie zu befestigen ist (hier als eine "Komplementärfunktionalität" bezeichnet). Exemplarische Bindungsfunktionalitäten sind in Tabelle I zusammen mit ihren Komplementärfunktionalitäten und resultierenden Bindungsgruppen aufgelistet. Die am stärksten bevorzugte Bindungsfunktionalität ist ein Phosphoramidit, welches bei Reaktion mit einer Hydroxyl- Komplementärfunktionalität eine Phosphitester- Bindungsgruppe bildet, die wiederum oxidiert wird, um eine Phosphatester-Bindungsgruppe zu erhalten. Tabelle I
W&sub1;, W&sub2; und W&sub3; sind Wasserstoff oder Chlor, und vorzugsweise Wasserstoff.
Wie hier verwendet soll sich der Ausdruck "Rhodamin X" (abgekürzt "ROX") auf die Verbindungen von Formel I beziehen, in denen R&sub1; und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; und R&sub7; und R&sub8; zusammengenommen werden, um wie oben beschrieben 3 Kohlenstoffalkylketten zu bilden, Z Carboxylat ist, und W&sub1;, W&sub2; und W&sub3; Wasserstoff sind, und worin die Bindungsfunktionalität an den 5- bzw. 6-Kohlenstoffatomen befestigt ist. Wie hier verwendet, soll der Ausdruck "Tetramethylrhodamin" (abgekürzt "TMR") die Verbindungen von Formel I bedeuten, in denen R&sub1;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub8;, W&sub1;, W&sub2; und W&sub3; Wasserstoff sind, Z Carboxylat ist, und R&sub2;, R&sub3;, R&sub6; und R&sub7; Methyl sind, und wobei die Bindungsfunktionalität an den 5- bzw. 6-Kohlenstoffatomen befestigt ist.
Einige Rhodaminfarbstoffe für Verwendung mit der Erfindung sind im Handel erhältlich, z. B. Eastman Kodak Company (Rochester, New York), Molecular Probes, Inc. (Junction City, OR), oder Research Organics (Cleveland OH), und andere können in Übereinstimmung mit den Lehren der US- Patente 2,242,572; 2,153,059; 3,822,270; 3,932,415; und 4,005,092 synthetisiert werden, die alle durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
ROX und TMR sind die am stärksten bevorzugten Rhodaminfarbstoffe für Verwendung mit der Erfindung.
Ausführliche Beschreibungen von Verfahrensweisen für Festphasensynthese durch Phosphittriester, Phosphotriester und H-Phosphonatchemien stehen umfangreich zur Verfügen, z. B. Itakura, US-Patent 4,401,796; Caruthers et al. US- Patente 4,458,066 und 4,500,707; Matteucci et al. J. Amer. Chem. Soc., Bd. 103, Seiten 3185-3191 (1981); Caruthers et al. Genetic Engineering, Bd. 4, Seiten 1-17 (198), Jones, Kapitel 2, Atkinson et al. Kapitel 3, und Sproat et al. Kapital 4, in Gait, Herausgeber, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach [Oligonucleotidsynthese: Ein praktischer Ansatz](IRL Press, Washington, D. C., 1984); Froehler et al. Tetrahedron Letters, Bd. 27, Seiten 469-472 (1986); Garegg et al. Tetrahedron Letters, Bd. 27, Seiten 4051-4054 und 4055-4058 (1986); und Froehler et al. Nucleic Acids Research, Bd. 14, Seiten 5399-5407 (1986).
Vorzugsweise beinhaltet die vorliegende Erfindung die Synthese von rhodaminmarkierten Oligonucleotiden durch den Phosphittriester-Ansatz. Demzufolge werden Nucleotide aufeinanderfolgend einer wachsenden Kette von Nucleotiden hinzugefügt, indem Nucleosidphosphoramidite mit dem 5'- Hydroxyl der wachsenden Kette zur Reaktion gebracht werden.
Genau ausgedrückt, werden Oligonucleotide markiert, indem ein Rhodaminphosphoramidit mit dem 5'-Hydroxyl des befestigten Oligonucleotids zur Reaktion gebracht wird.
Rhodaminphosphoramidite der Erfindung werden hergestellt, indem zuerst der 5- oder 6-N-Hydroxysuccimid (NHS)-Ester von Rhodamin mit einem Aminoalkohol, z. B. Ethanolamin, Hexanolamin, oder dergleichen in N,N-Dimethylformamid (DMF) oder einem ähnlichen aprotischen polaren Lösungsmittel bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht, um ein 5- oder 6- Alkoholamid des Rhodaminfarbstoffs zu bilden, welches dann von der Reaktionsmischung durch Standardmittel getrennt wird. Das Alkoholamid des Rhodaminfarbstoffs wird dann mit einem Überschuss von di-(N,N-Diisopropylamino)methoxyphosphin bei Raumtemperatur in Acetonitril, das katalytische Mengen von Tetrazol und Diisopropylamin enthält, zur Reaktion gebracht, um das Rhodaminphosphoramidit zu bilden, welches dann von der Reaktionsmischung getrennt wird.
Allgemein werden Spaltung und Schutzaufhebung durch das Spaltungsreagens der Erfindung bewirkt, indem zuerst ein an einen Festphasenträger (über eine basenlabile Bindung) befestigtes Oligonucleotid dem Spaltungsreagens bei Raumtemperatur etwa 1-2 Stunden lang ausgesetzt wird, so dass das Oligonucleotid von dem Festträger freigegeben wird, und dann das das freigegebene Oligonucleotid enthaltende Spaltungsreagens etwa 20 bis etwa 60 Minuten bei etwa 80 bis etwa 90º erhitzt wird, so dass die an den exocyclischen Aminen befestigten Schutzgruppen entfernt werden. Alternativ kann der Schutzaufhebungsschritt bei einer niedrigeren Temperatur erfolgen, aber es wird länger dauern, die Reaktion abzuschließen, z. B. das Erhitzen kann 5 Stunden bei 55ºC dauern.
Nach Spaltung und Schutzaufhebung werden die markierten oder unmarkierten Oligonucleotide durch Standardprozeduren gereinigt, z. B. Applied Biosystems Users Bulletin Nr. 13 (1. April, 1987, verbesserte Auflage); oder Kapitel 5 und 6 in Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C. 1984).

Beispiele

Die folgenden Beispiele dienen zum Illustrieren der vorliegenden Erfindung. Die Konzentrationen von Reagenzien, Temperaturen, und die Werte anderer variabler Parameter sollen lediglich die Erfindung beispielhaft darstellen und sollen nicht als Begrenzung derselben angesehen werden.

BEISPIEL I. Zubereitung von Aminoalkylphosphoramidit- Bindungsagenzien

Im folgenden sind allgemeine Prozeduren zum Zubereiten von Aminoalkylphosphoramiditen offenbart. Ungefähr die gleichen Prozeduren sind durch Connolly in Nucleic Acids Research, Bd. 15, Seiten 3131-3139 (1987) offenbart. Diese Verbindungen sind für Aminoderivatisierung von Oligonucleotiden verwendbar, die an einem Festphasenträger befestigt sind. Eine Gruppe von in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Aminoalkylphosphoramiditen sind durch die folgende Formel definiert: Formel II
worin:
B&sub1; eine säurelabile oder basenlabile Aminoschutzgruppe darstellt, die ohne Spaltung der basenlabilen Bindungsgruppe zwischen vom Festphasenträger und dem Oligonucleotid entfernt werden kann. Solche Schutzgruppen sind durch Greene in Protective Groups in Organic Synthesis [Schutzgruppen in organischer Synthese] (John Wiley & Sons, New York, 1981), Kapitel 7 beschrieben, welches Kapitel durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Vorzugsweise sind basenlabile Schutzgruppen, wenn zusammengenommen mit dem Stickstoff des Heterorings oder dem seines Vorgängers, basenlabile Amid- und Carbamatschutzgruppen, vorzugsweise Trihalogenacetyle, Acetoacetyl, und Fluorenylmethylcarbamate, insbesondere 9- Fluorenylmethylcarbamat und 9-(2-Sulfo)- Fluorenylmethylcarbamat, und Trifluoracetyl. Vorzugsweise umfassen säurelabile Schutzgruppen nichtderivatisiertes Trityl, und seine niederen (von 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthaltenden) Alkoxyderivate, insbesondere 4- Monomethoxytrityl. B&sub2; und B&sub3; getrennt genommen stellen jeweils Wasserstoff, niederes Alkyl, niederes substituiertes Alkyl, inbesondere halogen-, cyano-, oder nitrosubstituiertes niederes Alkyl, niederes Acyl, Cyan, Halogen, oder Nitro- dar; stärker bevorzugt stellen B&sub2; und B&sub3; getrennt genommen Wasserstoff, niederes Alkyl und niederes Halogenalkyl dar; und am stärksten bevorzugt stellen B&sub2; und B&sub3; Wasserstoffe dar.
B&sub4; stellt Alkyl, Alkenyl, Aryl, Aralkyl oder Cycloalkyl dar, die bis zu 10 Kohlenstoffatomen enthalten. Stärker bevorzugt stellt B&sub4; niederes Alkyl; elektronenabziehendes beta-substituiertes Ethyl, insbesondere beta- trihalogenmethyl-, beta-cyano-, beta-sulfo-, beta-nitro- substituiertes Ethyl oder dergleichen;
elektronenabziehendes substituiertes Phenyl, insbesondere halogen-, sulfo-, cyano- oder nitrosubstituiertes Phenyl; oder elektronenabziehendes substituiertes Phenylethyl dar. Am stärksten bevorzugt stellt B&sub4; Methyl, beta-Cyanoethyl, oder 4-Nitrophenylethyl dar.
Der Ausdruck "niederes Alkyl" bezeichnet wie hier verwendet Alkylgruppen gerader Kette oder verzweigter Kette, die von 1-6 Kohlenstoffatome enthalten, z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, Neopentyl, tert-Pentyl und dergleichen. "Niederes substituiertes Alkyl" bezeichnet niederes Alkyl mit elektronenabziehenden Substituenten, so wie Halogen, Cyan, Nitro-, Sulfo-, oder Mono-, Di- oder Trihalogenmethyl oder dergleichen. "Niederes Halogenalkyl" bezeichnet ein niederes Alkyl mit einem oder mehreren Halogenatomsubstituenten, gewöhnlich Fluor, Chlor, Brom oder Iod. "Niederes Acyl" bezeichnet ein Acyl, das von 1-7 Kohlenstoffatomen enthält, wobei die nicht doppelt gebundenen Kohlenstoffatome ein niederes Alkyl möglicherweise mit Halogen-, Cyan- oder Nitrosubstituenten aufweisen. "Elektronenabziehend" bezeichnet die Tendenz eines Substituenten, Valenzelektronen des Moleküls anzuziehen, von dem es getrennt ist, d. h. er ist elektronennegativ, March, Advanced Organic Chemistry, Dritte Ausgabe, (John Wiley, New York, 1985).
j liegt in dem Bereich von 2 bis 10.
R' und R" getrennt genommen stellen Alkyl, Arakyl, Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl dar, die bis zu 10 Kohlenstoffatome enthalten. Vorzugsweise stellen R' und R" getrennt genommen niederes Alkyl dar, und am stärksten bevorzugt, wenn die obigen Phosphoramidite direkt als Bindungsagenzien verwendet werden, sind R' und R" getrennt genommen sterisch hindernde niedere Alkyle, die die chemische Stabilität der Phosphoramidite und folglich ihre Gebrauchsfähigkeitsdauer vergrößern. Solche sterisch hindernden niederen Alkyle umfassen Isopropyl, t-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, Neopentyl, tert-Pentyl, Isopentyl, sec-Pentyl und dergleichen.
R' und R" zusammengenommen bilden eine Alkylenkette, die bis zu 5 Kohlenstoffatomen in der Grundkette und eine Gesamtzahl von bis zu 10 Kohlenstoffatomen enthält, wobei beide Endvalenzbindungen der Kette an dem Stickstoffatom befestigt sind, an dem R' und R" befestigt sind; oder R' und R" bilden, wenn zusammengenommen mit dem Stickstoffatom, an dem sie befestigt sind, einen gesättigten Stickstoffheteroring, der ein oder mehrere zusätzliche Heteroatome aus der Gruppe enthalten kann, die aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel besteht. Stärker bevorzugt stellen R' und R " zusammengenommen und mit dem Stickstoff, an dem sie befestigt sind, Pyrrolidino, Morpholino oder Piperidino dar. Am stärksten bevorzugt stellen R' und R" zusammengenommen und mit dem Stickstoff, an dem sie befestigt sind, Morpholino dar.
Eine andere Gruppe von Aminoalkylphosphoramiditen, die in der Erfindung verwendet werden können, umfassen die durch die folgende Formel definierten: Formel III
worin B&sub1;, B&sub4;, R', und R" wie oben aufgeführt sind, und t in dem Bereich von 0 bis 8 liegt, und s im Bereich von 0 bis 8 liegt, abhängig von der Bedingung, dass s + t in dem Bereich von 1 bis 8 liegt. Die allgemeine Prozedur zum Synthetisieren der obigen Aminoalkylphosphoramidite der Formeln II und III umfasst die folgenden Schritte. Halogensubstituiertes N,N-di-substituiertes-0- substituiertes Phosphin, definiert durch die Formel:
worin X ein Halogen, gewöhnlich Chlor ist, und R' und R" und B&sub4; wie oben angegeben sind, wird zur Reaktion gebracht mit einem aminogeschützten Alkoholamin, das durch die folgende Formel definiert ist:
worin B&sub1;, B&sub2; und B&sub3; wie oben angegeben sind, in einem aprotischen Lösungsmittel so wie Dichlormethan oder dergleichen, das eine nichtnucleophile Base, zum Beispiel ein Trialkylamin so wie N,N-Diisopropylethylamin oder dergleichen enthält, welche die während der Reaktion freigesetzte Halogensäure absorbiert. Vorzugsweise erfolgt die Reaktion unter einer inerten Atmosphäre so wie Argon. Säurebedingungen in der Reaktionsmischung sollten vermieden werden, da Säure verursacht, dass das Amin des Phosphoramiditprodukts protoniert und dadurch reaktionsbereit wird. Die nichtnucleophile Base verringert die Wahrscheinlichkeit von Nebenreaktionen zwischen der Base und aktivierten Phosphoramiditen.
Nachdem die obigen Materialien zur Reaktion gebracht wurden, wird die Reaktionsmischung, im folgenden als die erste Reaktionsmischung bezeichnet, mit einer leicht basischen Lösung zum Entfernen von Salzen der nichtnucleophilen Base gewaschen. Zum Abschluss wird die erste Reaktionsmischung getrocknet, z. B. mit MgSO&sub4;, Na&sub2;SO&sub4; oder dergleichen, um ein geschütztes Aminoalkylphosphoramidit zu erhalten.

A. Zubereitung eines geschützten Aminoethylphosphoramidits.

Chloro-N,N-Diisopropylaminomethoxyphosphin (5,0 ml, erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) wurde tropfenweise bei 0ºC einer gerührten Lösung von N-(2- Hydroxyethyl)-2,2,2-Trifluoracetamid (3,9 g) und Diisopropylethylamin (5,0 ml) in Dichlormethan (etwa 40 ml) unter Argon hinzugegeben. (N-(2-Hydroxyethyl)-2,2,2- Trifluoracetamid wird durch Befolgen der Prozeduren synthetisiert, die durch Lazarus und Benkovic in J. Am. Chem. Soc., Bd. 101, Seiten 4300-4312 (1979) offenbart sind: Ethyltrifluoracetat (56,8 g, 0,4 mol) in 50 ml Chloroform wird tropfenweise einer gerührten Lösung von 24,4 g (0,4 mol) Ethanolamin in 50 ml Chloroform hinzugegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt, rotationsverdampft zum Entfernen des Lösungsmittels, und bei 115ºC (4,3 Torr) destilliert, um 58,5 g Öl zu erhalten, das nach Kratzen kristallisierte. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden wurde die Reaktionsmischung zweimal mit 0,2 M Kalziumcarbonatlösung und einmal mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und unter verringertem Druck konzentriert, um N-(2-(N',N'- Diisopropylaminomethoxyphosphinyloxy)ethyl-2,2,2- Trifluoracetamid als eine farblose Flüssigkeit (7,77 g) zu erhalten.
¹H-NMR (CD&sub2;Cl&sub2;): δ 3,6 (6H, m), 3,4 (3H, d, J = 12), 1,2 (12H, d, J = 6,5)
³¹P-NMR (CD&sub2;Cl&sub2;, ¹H entkoppelt): δ149 (s)

B. Zubereitung eines geschützten Aminopropylphosphoramidits.

Chloro-N,N-Diisopropylaminomethoxyphosphin (3,7 ml) wurde tropfenweise bei 0ºC einer gerührten Lösung von N-(3- Hydroxypropyl)-2,2,2-Trifluoracetamid (2,9 g, synthetisiert von 3-Amino-1-Propanol und Ethyltrifluoracetat in einer Weise ähnlicher derjenigen, die durch Lazarus und Benkovic in J. Am. Chem. Soc., Bd. 101, Seiten 4300-4312 (1979) offenbart ist) und Diisopropylethylamin (3,7 ml) in Dichlormethan (etwa 20 ml) unter Argon hinzugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 3 Stunden, wurde die Reaktionsmischung in Hexan (100 ml) gegossen und gerührt. Die Mischung wurde sich absetzen gelassen und der Überstand wurde getrennt und unter verringertem Druck konzentriert, um N-(3-(N',N'-Diisopropylaminomethoxyphosphinyloxy)propyl- 2,2,2-Trifluoracetamid als eine farblose Flüssigkeit (5,2 g) zu erhalten.
³¹P-NMR (CH&sub2;Cl&sub2;, ¹H entkoppelt): δ149 (s)
C. Amino-Derivatisierung eines Oligonucleotids durch Aminoethylphosphoramidit.
Nach Detritylierung des 5'-Hydroxyl eines an einem Festphasenträger befestigten Oligonucleotids wird ein 9- fluorenylmethylgeschütztes Aminoethylphosphoramidit bei einer Konzentration von etwa 0,2 M in dem Acetonitril/Tetrazol-Standardreaktionslösungsmittel für Phosphittriestersynthese hinzugegeben. Das 9- fluorenylmethylgeschützte Aminoethylphosphoramidit wird genauso wie das Material von Teil A unter der Ausnahme zubereitet, dass N-(2-Hydroxyethyl)-2,2,2-Trifluoracetamid durch N-(2-Hydroxyethyl)-9-Fluorenylmethylcarbamat ersetzt wird, wie auch durch Agrawal et al., Nucleic Acids Research, Bd. 14, Seiten 6227 (1986) offenbart ist. Die 9- Fluorenylmethyl-Schutzgruppe wird bei Raumtemperatur durch eine 80 : 20 (Volumen)Prozent-Lösung von Acetonitril und Piperidin entfernt. Die obigen Reaktionen werden auf einem automatischen DNA-Standardsynthetisiergerät ausgeführt, so wie dem Model 380A von Applied Biosystems oder einem ähnlichen Gerät.

BEISPIEL II. Synthese von ROX-Phosphoramidit

Eine Mischung von 97,1 mg (0,158 mmol) der Ethanolaminamide von 5- und 6-Carboxy-X-Rhodamin und 13,5 mg (0,079 mmol) Diisopropylammoniumtetrazolid wurde mit trockenem Argon gespült und mit 8 ml trockenem (von Kalziumhydrid destilliertem) Acetonitril verdünnt; 0,40 g (1,53 mmol) Methoxy-bis-(Diisopropylamino)phosphin wurde hinzugegeben und die Lösung wurde bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Nach zwei Stunden wurde die Lösung viermal mit 7 ml Teilen Hexan gewaschen, auf 200 ml mit 0,5% Triethylamin enthaltendem Chloroform verdünnt, mit 100 ml von 1 : 1 Salzlösung: Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und bis zur Trockenheit verdampft. Der gummiartige Feststoff wurde mit Hexan pulverisiert und unter Hochvakuum getrocknet; dieser Prozess wurde wiederholt, bis ein dunkler, frei fließender Feststoff erhalten wurde, der 113 mg ROX-5 und ROX-6-Phosphoramidite erbrachte.

BEISPIEL III. Synthese von TMR-Phosphoramidit

Eine Mischung von 61,4 mg (0,130 mmol) der Ethanolaminamide des 5- und 6-Carboxytetramethylrhodamins und 0,26 ml einer Acetonitrillösung von 0,005 M Diisopropylammoniumtetrazolid (0,0013 mmol) wurden kombiniert und bei < 0,1 mm Druck bis zur Trockenheit verdampft, anschließend mit Argon gespült und mit 10 ml trockenem (destilliert von Kalziumhydrid) Acetonitril verdünnt; 0,22 g (0,840 mmol) Methoxy-bis- (Diisopropylamino)phosphin wurden hinzugegeben und die Lösung wurde 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde fünfmal mit 5 ml Teilen Hexan gewaschen, mit 0,5% Triethylamin enthaltendem Chloroform auf 100 ml verdünnt, mit 60 ml von 1 : 1 Salzlösung. Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und mit Hexan pulverisiert und unter Hochvakuum bis zur Trockenheit verdampft; dieser Prozess wurde wiederholt, bis ein dunkler, frei fließender Feststoff erhalten wurde, der 67,6 mg TMR-5- und TMR-6-Phosphoramidite erbrachte.

BEISPIEL VI. Abspaltung und Schutzaufhebung eines geschützten Oligonucleotids, das über einen Succinimatester an einem Festphasenträger befestigt ist, durch 1 : 2 : 1 Methanol : Wasser : t-Butylamin.

In diesem Beispiel wurde ein geschütztes 18-mer Oligonucleotid durch das Phosphittriesterverfahren auf einem DNA-Synthetisiergerät des Models 380B von Applied Biosystems synthetisiert. Das übliche Spaltungsreagens, Ammoniaklösung, wurde durch das Spaltungsreagens der Erfindung ersetzt: Methanol: Wassert-Butylamin in einem Verhältnis von 1 : 2 : 1. Das Synthetisiergerät wurde neu programmiert, so dass der Festträger und das befestigte Oligonucleotid in dem Reaktionsbehälter nacheinander dem Spaltungsreagens viermal 1500 Sekunden lang (4 · 1500) bei Raumtemperatur ausgesetzt wurden. Die Reaktionsbehälterausflüsse wurden in einem getrennten Behälter gesammelt und wurden für Schutzaufhebung 40 Minuten lang auf 85ºC erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde entfernt und das 18-mer wurde durch HPLC (Hochdruckflüssigchromatographie) von der Reaktionsmischung getrennt. Nach Entfernung wurde der Festphasenträger mit konzentrierter Ammoniaklösung entsprechend dem Standardspaltungsprotokoll des ABI Models 380B behandelt. Die Reaktionsmischung von der Ammoniaklösungsspaltung wurde dann durch HPLC analysiert zur Bestimmung, ob zusätzliche Oligonucleotide von dem Festphasenträger entfernt wurden. Vergleich der Chromatogramme der beiden Reaktionsmischungen zeigten, dass 100 Prozent der Oligonucleotide von dem Festphasenträger durch die Anfangsabspaltungsreaktion entfernt wurden.
Das gleiche Oligonucleotid wurde erneut mit einem identischen Protokoll mit der Ausnahme synthetisiert, dass die Dauer des Spaltungsschritts mit dem Spaltungsreagens aus 1 : 2 : 1 Methanol : Wasser : t-Butylamin 4 · 900 Sekunden anstatt 4 · 1500 Sekunden betrug. HPLC-Analyse zeigte, dass 71 Prozent der Oligonucleotide in der Anfangsabspaltungsreaktion abgespalten wurden.

BEISPIEL V. Abspaltung und Schutzaufhebung eines geschützten Oligonucleotids, das über einen Succinimatester an einem Festphasenträger befestigt war, durch 1 : 1 : 1 Methanol : Wasser : t-Butlyamin.

Die Abspaltung und Schutzaufhebung wurde in diesem Beispiel auf dem selben Synthetisiergerät und mit dem selben Protokoll wie in Beispiel IV unter der Ausnahme durchgeführt, dass das Spaltungsreagens Methanol : Wasser : t-Butylamin in einem Verhältnis von 1 : 1 : 1 war. HPLC-Analyse zeigte, dass ungefähr 80 Prozent der Oligonucleotide von dem Festphasenträger abgespalten wurden.

BEISPIEL VI. Abspaltung und Schutzaufhebung eines geschützten Oligonucleotids, das über ein Succinimatester an einem Festphasenträger befestigt war, durch 2 : 2 : 1 Methanol : Wasser : t-Butlyamin.

Die Abspaltung und Schutzaufhebung wurde in diesem Beispiel auf dem selben Synthetisiergerät und mit dem selben Protokoll wie in Beispiel IV unter der Ausnahme durchgeführt, dass das Spaltungsreagens Methanol : Wasser : t-Butylamin in einem Verhältnis von 2 : 2 : 1 darstellte. HPLC- Analyse zeigte, dass ungefähr 10 Prozent der Oligonucleotide von dem Festphasenträger abgespalten wurden.

BEISPIEL VII. Festphasensynthese von TMR- und ROX- markierten Oligonucleotiden und Abspaltung und Schutzaufhebung mit 1 : 2 : 1 Methanol : Wasser : t-Butylamin

ROX- und TMR-markierte Oligonucleotide wurden getrennt auf einem automatischen DNA-Synthetisiergerät des Models 380B von Applied Biosystems synthetisiert. Vergleichbare DNA- Synthetisiergeräte, die die Phosphittriesterchemie verwenden, könnten auch benutzt werden. Markierung wurde durch Reaktion entweder eines ROX-Phosphoramidits oder eines TMR-Phosphoramidits mit dem 5'-Hydroxyl des an dem Festphasenträger befestigten Oligonucleotids unter den Bedingungen erreicht, die durch den Hersteller zum Befestigen von Nucleosidphosphoramiditen empfohlen werden. Caruthers et al. US-Patent 4,415,732, und Caruthers et al. Genetic Engineering, Bd. 4, Seiten 1-17 (1982), liefern ausführlicher Beschreibungen der durch das Synthetisiergerät des Models 380B von Applied Biosystems verwendeten Chemie. Dementsprechend sind diese Verweisstellen durch Bezugnahme für diese Beschreibungen eingeschlossen. Die ROX- und TMR-Phosphoramidite wurden als 0,2 M Acetonitrillösungen kombiniert mit einer 0,5 M Tetrazol/Acetonitrillösung zum Bilden eines aktivierten Reagens in dem Synthesezyklus verwendet. Abspaltung und Schutzaufhebung wurden wie in Beispiel IV beschrieben durchgeführt. Die Integrität der ROX- und TMR-markierten Oligonucleotide wurde durch Vergleich mit authentischen Proben unter Verwendung von HPLC, Polyacrylamidgelelektrophorese und Fluoreszenzdidesoxy-DNA- Sequenzierung bestätigt.
Die vorhergehenden Offenbarung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung ist für Illustrations- und Beschreibungszwecke vorgelegt worden. Es ist nicht beabsichtigt, dass sie erschöpfend ist, und viele Abwandlungen und Änderungen sind im Licht der obigen Lehren möglich. Die Ausführungsformen wurden gewählt und beschrieben, um am besten die Prinzipien der Erfindung und ihrer praktischen Anwendung zu erklären, und dadurch andere Fachleute in diesem Gebiet in die Lage zu versetzen, die Erfindung am besten in verschiedenen Ausführungsformen und mit verschiedenen Abwandlungen passend zu der bestimmten beabsichtigten Verwendung zu nutzen.

Claims

1. Fluoreszenzfarbstoffmarkiertes Phosphoramidit.

2. Farbstoffmarkiertes Phosphoramidit nach Anspruch 1, bei dem der Farbstoff ein Rhodaminfarbstoff ist.

3. Farbstoffmarkiertes Phosphoramidit nach Anspruch 2, bei dem der Rhodaminfarbstoff durch die folgende Formel definiert ist:

worin:

L ein durch die folgende Formel definiertes Phosphoramidit ist:

-NH-(CH&sub2;)j-O-P(OB&sub4;)(NR'R")

j eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist;

B&sub4; Alkyl, Alkenyl, Aryl, Aralkyl oder Cycloalkyl ist, das bis zu 10 Kohlenstoffatome enthält;

R' und R" getrennt genommen jeweils Alkyl, Aralkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkylalkyl sind, das bis zu 10 Kohlenstoffatome enthält; oder R' und R" zusammengenommen eine Alkylenkette bilden, die bis zu 5 Kohlenstoffatome in der Grundkette und eine Gesamtzahl von bis zu 10 Kohlenstoffatomen enthält, wobei beide Endvalenzbindungen der Kette an dem Stickstoffatom befestigt sind, an dem R' und R" befestigt sind; oder R' und R", wenn zusammen mit dem Stickstoffatom genommen, an dem sie befestigt sind, einen gesättigten Stickstoffheteroring bilden, der ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel enthält;

Z Carboxylat oder Sulfonat ist;

R&sub1; und R&sub8; allein genommen jeweils Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkylether mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, oder Alkylthioether mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, oder R&sub1; zusammengenommen mit R&sub2; und R&sub5; zusammengenommen mit R&sub7; Alkylketten mit jeweils von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen sind, die das 7'- Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 2'- Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden;

R&sub2; und R&sub7; allein genommen jeweils Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind;

R&sub3; und R&sub6; allein genommen jeweils Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, oder R&sub3; zusammengenommen mit R&sub4; und R&sub6; zusammengenommen mit R&sub5; Alkyl mit jeweils von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen sind, die das 5'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 4'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'- Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden;

R&sub4; und R&sub5; allein genommen jeweils Wasserstoff, Alkyl mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkylether mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkylthioether mit von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Halogen sind; und

W&sub1;, W&sub2; und W&sub3; jeweils Wasserstoff oder Chlor sind.

4. Farbstoffmarkiertes Phosphoramidit nach Anspruch 3, bei dem

Z Carboxylat ist;

R&sub1; und R&sub8; allein genommen jeweils Wasserstoff, Alkyl mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Chlor, oder Alkylether mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind, oder R&sub1; zusammengenommen mit R&sub2; und R&sub8; zusammengenommen mit R&sub7; jeweils eine Alkylkette mit von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen bilden, die das 7'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 6'- Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 2'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden;

R&sub2; und R&sub7; allein genommen jeweils Alkyl mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind;

R&sub3; und R&sub6; allein genommen jeweils Alkyl mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind; oder R&sub3; zusammen mit R&sub4; und R&sub6; zusammengenommen mit R&sub5; Alkylketten mit jeweils von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen sind, die das 5'-Kohlenstdffatom mit dem an dem 6'-Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden bzw. das 4'-Kohlenstoffatom mit dem an dem 3'- Kohlenstoffatom befestigten Stickstoff verbinden; und

R&sub4; und R&sub5; allein genommen Wasserstoff sind.

5. Farbstoffmarkiertes Phosphoramidit nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, bei dem

B&sub4; Methyl, beta-Cyanoethyl, oder 4-Nitrophenylethyl ist;

R' und R" getrennt genommen jeweils ausgewählt sind aus Isopropyl, t-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Pentyl, Isopentyl oder sec-Pentyl oder R' und R" zusammengenommen Morpholino sind.

6. Farbstoffmarkiertes Phosphoramidit nach einem der Ansprüche 2 bis 5, bei dem der Rhodaminfarbstoff Rhodamin X darstellt.

7. Farbstoffmarkiertes Phosphoramidit nach einem der Ansprüche 2 bis 5, bei dem der Rhodaminfarbstoff Tetramethylrhodamin ist.