DE60225652T2

DE60225652T2 - Oligonukleotidmarkierungsreagenzien auf der Basis von azyklischen Nukleosiden, und deren derivatisierte Konjugate

Info

Publication number: DE60225652T2
Application number: DE60225652T
Authority: DE
Inventors: Jari Hovinen
Original assignee: Wallac Oy
Current assignee: Wallac Oy
Priority date: 2001-11-02
Filing date: 2002-10-10
Publication date: 2009-04-02
Anticipated expiration: 2022-10-11
Also published as: EP1308452B1; EP1308452A3; DE60225652D1; ATE389663T1; US20030118999A1; US7282581B2; EP1308452A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verbindungen zum Markieren von Oligonucleotiden unter Anwendung von entweder maschinenunterstützer Festphasenchemie oder von Polymerasen, und davon abgeleitete Konjugate.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Publikationen und andere hierin verwendete Materialien, um den Hintergrund der Erfindung zu verdeutlichen, und insbesondere Fälle, die weitere Details bezüglich der Technik bereitstellen, sind durch Bezugnahme vom Offenbarungsgehalt umfasst.
An verschiedene Liganden gebundene bzw. getetherte synthetische Oligonucleotide wurden als ein Forschungstool in der Molekularbiologie verwendet [für Übersichten siehe z. B. Iyer, R. P., Roland, A., Zhou, W. und Ghosh, K. Curr. Opin. Mol. Ther., 1999, 1, 344; Uhlman, E. und Peyman. A. Chem Rev, 1990, 90, 543; English. U. und Gauss, D. H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 613. Beaugace und Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; Wojczewski, C., Stolze, K. und Engels, J. W. Synlett, 1999, 1667]. Sie wurden angewendet auf die genetische Analyse und um den Mechanismus der Genfunktion aufzuklären. Oligonucleotide, die Reportergruppen tragen, hatten eine weitverbreitete Verwendung bei der automatisierten DNA-Sequenzierung, Hybridisierungsaffinitätschromatographie und der Fluoreszenzmikroskopie. Oligonucleotid-Biotinkonjugate werden umfassend verwendet als Hybridisierungssonden. Es wurde gezeigt, dass kovalent an Interkalatoren gebundene Antisens-Oligonucleotide, kettenspaltende Mittel oder Alkylierungsmittel wirksam sind als Genexpressionsregulatoren. Die sequenzspezifischen künstlichen Nukleasen, wenn sie gegen mRNA gerichtet sind, können Anwendungen selbst als Chemotherapeutika finden.
Die Markierungen bzw. Labels können an die Target- bzw. Zieloligonucleotide oder -polynucleotide entweder chemisch oder enzymatisch gebunden sein. Der chemische Ansatz beinhaltet oftmals die Herstellung von modifizierten Buildingblocks und ihre nachfolgende Insertion in synthetische Oligonucleotide während der Oligonucleotidsynthese. Alternativ kann natürliche DNA transformiert werden, z. B. durch Bisulfitkatalysierte Transaminierung von Cytosinresten [Biochemistry, 1980, 19, 1774] gefolgt von der Markierung der Aminofunktion mit entsprechenden Markierungsmolekülen. Der enzymatische Ansatz wiederum besteht aus der Herstellung von Nukleosidtriphosphaten, derivatisiert mit entsprechenden Bindungsmolekülen, und ihre Inkorporation in RNA- oder DNA-Struktur durch eine polymerase Reaktion.
Für mehrere Anwendungen, wie für DNA-Hybridisierungsassays ist es wünschenswert, mehr als eine Reportergruppe in die Oligonucleotidstruktur einzuführen. Dies kann durch drei alternative Verfahren erfolgen: (i) Durch Kupplung mehrerer Base- oder Kohlenhydrat-getetherte Nukleosid-Buildingblocks oder Nukleosidtriphosphaten an die wachsende Oligonucleotidkette, (ii) durch Funktionalisierung der internukleosidischen Phosphodiesterbindungen, oder (iii) durch Verwendung mehrerer multifunktionaler nicht-nukleosider Buildingblocks während des Oligonucleotidkettenaufbaus. All diese Verfahren haben ihre eigenen Nachteile. Da die Doppelhelixbildung der DNA auf der Wasserstoffbindung zwischen den komplementären Baseresten basiert, schwächen gebundene Gruppen an den Baseresten oftmals diese Wechselwirkungen. Dieses Problem kann leicht gelöst werden durch die Verwendung von Nukleosiden mit gebundenen Gruppen an dem 3'- oder 5'-Ende der Codierungssequenz oder durch Verwendung von Markierungen, gebunden an C5 von Pyrimidinresten. Die Einführung von gebundenen Gruppen an das Phosphatgrundgerüst erzeugt neue chirale Zentren und macht die Reinigung von diesen Analoga schwierig. Die Einführung des Tetherarms in den Kohlenhydratrest wiederum, verringert oftmals die Kupplungseffizienz des Phosphoramidids aufgrund von sterischer Hinderung.
Die Einführung von Linkerarmen an die Nukleobase wird meistens durchgeführt indem man einem Nukleosid mit einer guten Abgangsgruppe (N-Tosyl, N-Benzoyl, Halogen, Triazol, Thiol) am C4 der Pyrimidine oder C2, C8 oder C6 der Purine erlaubt mit dem entsprechenden nukleophilen Linkermolekül (z. B. einem Alkan-α,ω-diamin) zu reagieren. Da normalerweise ein Überschuss an Linkermolekülen und relativ extreme Reaktionsbedingungen verwendet werden müssen, können arbeitsaufwändige Reinigungsverfahren nicht vermieden werden. Die erforderlichen basischen Reaktionsbedingungen haben weitere Erfordernisse an die anderen Schutzgruppen in dem Zielmolekül zur Folge. Diese Probleme können gelöst werden durch das Binden der Linkermoleküle an das C5 der Pyrimidinbasen durch eine palladiumkatalysierte Kupplungsreaktion zwischen einem 5-Halogen-Pyrimidinnukleosid und einem Alkinyl- oder Allyllinker. Vor kurzem wurde die Bindung eines Linkerarms an dem N3 des 3', 5'-O-geschützten Thymidins [J. Org. Chem., 1999, 64, 5083; Nucleosides, Nucleotides, 1999, 18, 1339] und 2'-Deoxy-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridins [Org. Lett. 2001, 3, 2473] basierend auf einer Mitsunobu-Reaktion berichtet. Da die Kupplungsreaktion unter milden Bedingungen erfolgt, kann ein großer Bereich an Tethern eingeführt werden.
Der größte Teil der in der Literatur beschriebenen Verfahren beinhaltet das Einführen von funktionellen Gruppen in die Oligonucleotidstruktur während des Kettenaufbaus. Demnach muss die Einführung der Markierungsmoleküle in Lösung durchgeführt werden. Bei der Markierungsreaktion lässt man die Amino- oder Merkaptogruppen der Oligonucleotide in Lösung mit Isothiocyanat-, Halogenacetyl- oder 2,4,6-Triazinylderivaten der Markierungsmoleküle reagieren. Carbonsäuregruppen wiederum können markiert werden mit aminogetetherten Markierungen unter Zuhilfenahme von wasserlöslichem Carbodiimid. Da in allen Fällen die Markierungsreaktion in wässriger Lösung mit einem Überschuss an Markierungsreaktanten durchgeführt wird, können arbeitsaufwändige Reinigungsverfahren nicht vermieden werden. Insbesondere wenn die Einführung von mehreren Markierungen erforderlich ist, ist die Isolierung und Charakterisierung des gewünschten Konjugats extrem schwierig und oftmals praktisch unmöglich. Demnach wurden mehrere Versuche zur Einführung von Markierungsmolekülen oder ihrer entsprechend geschützten Vorstufen in die Oligonucleotidstruktur während des Kettenaufbaus unternommen [ US 4,948,882 ; US 5,583,236 ]. Die für die Festphasenchemie synthetisierten fluoreszierenden Markierungsmonomere sind meistens organische Farbstoffe (z. B. Fluoreszein, Rhodamin, Dansyl, Dabsyl, Pyren, Alexa, Cy, TAMRA), wobei mehrere dieser Blocks sogar kommerziell erhältlich sind. Jedoch leiden solche Markierungen und markierten Biomoleküle unter vielen allgemein bekannten Nachteilen, wie Ramanstreuung, anderen fluoreszierenden Verunreinigungen, geringer Wasserlöslichkeit, Konzentrationsquenching usw. In speziellen Bindungsassays liegen im Allgemeinen sehr geringe Konzentrationen an zu bestimmenden Analyten vor. Daher kann das mehrfache Markieren von Oligonucleotiden mit organischen Fluorphoren die Nachweisempfindlichkeit nicht in dem Maße erhöhen, wie sie für viele Anwendungen erforderlich ist. Für diesen Anwendungstyp sind Lanthanid(III)chelate, die Markierungen der Wahl, da sie nicht unter diesem Phänomen leiden. In DNA-Hybridisierungsassays ist die zeitaufgelöste Lumineszenzspektroskopie unter Verwendung von Lanthanidchelaten gut bekannt [Hemmilä et al. Bioanalytical Applications of Label ling Technologies, Wallac Oy, 1994]. Daher wurde eine Anzahl von Versuchen unternommen, um neue hochlumineszierende Chelatmarkierungen zu entwickeln, die geeignet sind für zeitaufgelöste fluorometrische Anwendungen. Diese beinhalten z. B. stabile Chelate zusammengesetzt aus Derivaten von Pyridinen [ US 4,920,195 ; US 4,801,722 ; US 4,761,481 ; PCT/FI91/00373 ; US 4,459,186 ; EP-Anmeldung 0 770 610 ; Remuinan et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1993, 1099], von Bipyridinen [ US 5,216,134 ], von Terpyridinen [ US 4,859,777 ; US 5,202,423 ; US 5,324,825 ] oder verschiedenen phenolischen Verbindungen [ US 4,670,572 ; US 4,794,191 ; italienisches Patent 42508 A789 ] als energiemediierende Gruppen und Polycarbonsäuren als chelatisierende Teile. Zusätzlich wurden verschiedene Dicarboxylatderivate [ US 5,032,677 ; US 5,055,578 ; US 4,772,563 ], makrozyklische Kryptate [ US 4,927,923 ; WO 93/5049 ; EP-A-493745 ] und makrozyklische Schiffbasen [ EP-A-369-000 ] publiziert. Es wurde auch ein Verfahren zum Markieren eines biospezifischen Bindungsreaktanden, wie Hapten, einem Peptid, einem Rezeptorliganden, einem Arzneimittel oder PNA-Oligomer mit lumineszierenden Markierungen unter Anwendung von Festphasensynthese publiziert [ US 6,080,839 ; EP 067205 A1 ]. Auch wurden Oligonucleotidmarkierungsreagenzien synthetisiert und bei der Multimarkierung von Oligonucleotiden verwendet [Nucleic Acids Res., 22, 1994, 2604; Org. Lett., 2001, 3, 2473].
Für mehrere Anwendungen, wie für jene, die einen Antisensapproach beinhalten, ist eine erhöhte Stabilität von Oligonucleotiden gegenüber Nukleasen erwünscht. Am Häufigsten wurde dies durch Modifikation des Phosphodiestergrundgerüstes (Mono- und Dithioate, Phosphoramidite) oder des Kohlenhydratrestes erreicht.
AUFGABEN UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung von vielseitig verwendbaren Verfahren für die chemische und enzymatische Inkorporation von Tethergruppen in Oligonucleotide, und in der Verbesserung einer kürzlich entwickelten Methode für die maschinenunterstützte Oligonucleotidderivatisierung [Org. Lett. 2001, 3, 2473].
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligonucleotidmarkierungsreagens, gegebenenfalls umfassend ein festes Trägermaterial, der Formel (I)
worin
R eine temporäre Schutzgruppe ist, wie 4,4'-Dimethoxytrityl (DMTr), 4-Methoxytrityl (MMTr), Trityl (Tr) oder (9-Phenyl)-xanthen-9-yl (Pixyl);
A entweder ein Phosphorylierungsrest
ist, worin
L O, S oder nicht vorhanden ist,
L' H, XCH₂CH₂CN oder XAr ist, worin Ar Phenyl oder dessen substituiertes Derivat ist, wobei der Substituent Nitro oder Chlor ist, und X O oder S ist;
L'' O^–, S^–, Cl, N(i-Pr)₂ ist; oder
A ein festes Trägermaterial ist, vorzugsweise „Controlled Pore"-Glas oder Polystyrol, gebunden an Z über einen Linker-Arm E'';
Z ein Brückenpunkt ist und gebildet ist aus
E ein Linker-Arm zwischen R und Z ist, E' ein Linker-Arm zwischen Z und Z' ist, E'' ein Linker-Arm zwischen Z und A ist und E''' ein Linker-Arm zwischen Z' und G ist, gleich oder verschieden, und gebildet ist aus einem bis zehn Resten, wobei jeder Rest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phenylen, Alkylen mit 1-12 Kohlenstoffatomen, Ethindiyl (-C≡C-), Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH-, -NH-CO, -CO-NR'- und -NR'-CO-), Carbonyl (-CO-), Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin (-N-R'), wobei R' ein Alkylrest mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist;
Z' eine Purin- oder Pyrimidinbase ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin und Hypoxanthen, worin E' an N1 der Pyrimidine und N9 der Purine gebunden ist und E''' an C7 der 7-Deazapurine, N3 oder C5 von Uracil, N3 von Thymin, C5 oder N⁴ von Cytosin, C8, N², N3 oder O⁶ von Guanin, C8, N⁶ oder C2 von Adenin gebunden ist und wobei die exocyclischen funktionellen Gruppen der Base geeignet geschützt sind, vorzugsweise mit Benzoyl, Isobutyryl oder Acetyl, oder
Z' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Imidazol, Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, 1,2,4-Triazin-3,5-dion, 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on, wobei E' an N1 von Imidazol, N2 von 1,2,4-Triazin-3,5-dion und 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on, und N7 von 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin und Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin gebunden ist und E'' an C4 oder C5 von Imidazol, C2 oder C9 von 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, C2, C4 oder C9 von Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, N4, C5 oder C6 von 1,2,4-Triazin-3,5-dion und N⁵ oder C6 von N⁵-Amino-1,2,4-triazin-3,5-dion gebunden ist und wobei die exocyclischen funktionellen Gruppen der Base geeignet geschützt sind, vorzugsweise mit Benzoyl, Isobutyryl oder Acetyl;
G eine geschützte bivalente aromatische Struktur ist, gebunden bzw. getethert an zwei Iminodiessigsäureestergruppen N(CH₂COOR'')₂, worin
R'' ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Allyl, Ethyltrimethylsilyl, Phenyl oder Benzyl ist, wobei der Phenyl- oder Benzylrest substituiert oder unsubstituiert sein kann, und eines der Wasserstoffatome durch E''' substituiert ist, und
die bivalente aromatische Struktur im Stande ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie zu übertragen auf ein Lanthanidion, nachdem das Markierungsreagens entschützt wurde und überführt wurde in eine Lanthanidchelatverbindung, oder
G eine Struktur ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

worin
R'' ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Allyl, Ethyltrimethylsilyl, Phenyl oder Benzyl ist, wobei der Phenyl- oder Benzylrest substituiert oder unsubstituiert sein kann, und eines der Wasserstoffatome durch E''' substituiert ist, oder
G eine geschützte funktionelle Gruppe ist, wobei die funktionelle Gruppe Amino, Aminooxy, Carboxyl, Thiol ist und die Schutzgruppe Phthaloyl, Trityl, 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl oder Trifluoracetyl für Amino und Aminooxy, Alkyl für Carbonyl und Alkyl oder Trityl für Thiol ist, oder
G ein geschützter oder ungeschützter organischer Farbstoff, ein geschütztes oder ungeschütztes Hapten oder eine geschützte oder ungeschützte Spinmarkierung ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Markierungsreagenzien der Formel (II)
worin:
R''''
oder Salze davon ist;
Z ein Brückenpunkt ist und gebildet ist aus
E ein Linker-Arm zwischen R'''' und Z ist, E' ein Linker-Arm zwischen Z und Z' ist, E'' ein Linker-Arm zwischen Z und A ist und E''' ein Linker-Arm zwischen Z' und G' ist, gleich oder verschieden, und gebildet ist aus einem bis zehn Resten, wobei jeder Rest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phenylen, Alkylen mit 1-12 Kohlenstoffatomen, Ethindiyl (-C≡C-), Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH-, -NH-CO-, -CO-NR'- und -NR'-CO-), Carbonyl (-CO-), Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-), Amin (-NH-) und tertiärem Amin (-N-R'), wobei R' ein Alkylrest mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist;
Z' eine Purin- oder Pyrimidinbase ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin und Hypoxanthen, worin E' an N1 der Pyrimidine und N9 der Purine gebunden ist und E''' an C7 der 7-Deazapurine, C5 von Uracil, C5 oder N⁴ von Cytosin, C8, N², N3 oder O⁶ von Guanin, C8, N⁶ oder C2 von Adenin gebunden ist, oder
Z' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Imidazol, Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, 1,2,4-Triazin-3,5-dion, 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on, worin E' an N1 von Imidazol, N2 von 1,2,4-Triazin-3,5-dion und 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on, und N7 von 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin und Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin gebunden ist und E'' an V4 oder C5 von Imidazol, C2 oder C9 von 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, C2, C4 oder C9 von Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, N4, C5 oder C6 von 1,2,4-Triazin-3,5-dion und N⁵ oder C6 von N⁵-Amino-1,2,4-triazin-3,5-dion gebunden ist;
G' eine bivalente aromatische Struktur ist, gebunden bzw. getethert an zwei Iminodiessigsäuregruppen N(CH₂COOH)₂, oder Salze davon, und ein Lanthanid(III)ion chelatisiert, wobei
eines der Wasserstoffatome substituiert ist durch E''' und
das Lanthanid(III)(Ln)ion Europium (Eu), Samarium (Sm), Terbium (Tb) oder Dysprosium (Dy) ist und
die bivalente aromatische Struktur im Stande ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie an das Lanthanidion zu übertragen, oder
G' eine Struktur ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
oder Salzen davon, wobei
eines der Wasserstoffatome durch E''' substituiert ist und
Ln gleich Eu, Tb, Sm oder Dy ist, oder
G' eine funktionelle Gruppe ist, wobei die funktionelle Gruppe Amino, Aminooxy, Carboxyl, Thiol ist, oder
G' ein organischer Farbstoff, Hapten oder eine Spinmarkierung ist.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Oligonucleotid- oder Polynucleotidkonjugat, umfassend eine Markierung, erhältlich durch die Verwendung eines Markierungsreagens der Formel (I) oder Formel (II). Das Konjugat umfasst eine codierende Sequenz, bestehend aus einem natürlichen DNA- und/oder RNA-Fragment oder des Monothioat, Dithioat oder Phosphoramidatanalogen, oder einem PNA-Oligonucleotid, oder deren Gemisch. Diese Markierung wird, eine oder mehrere, gleich oder verschieden, erhalten nach

i) Einführung des Markierungsreagens,
ii) Einführung und Entschützen des Markierungsreagens,
iii) Einführung und Entschützen des Markierungsreagens gefolgt von der Einführung eines Lanthanid(III)ions, wenn die Markierung ein lumineszierendes oder nicht-lumineszierendes Lanthanid(III)chelat ist, oder
iv) Einführung und Entschützen des Markierungsreagens gefolgt von der Einführung eines Signalrestes in Lösung als dessen Thiocyanat, aktiven Esters, Dichlortriazins, Aldehyds, Ketons oder Halogenacetamidoderivats, wenn das Markierungsreagens eine entschützte funktionelle Gruppe umfasst, an das 3'- oder/und 5'-Ende der Oligonucleotidkette oder/und innerhalb der codierenden Sequenz gebunden.

Die Hauptvorteile und Schlüsselschritte der Oligonucleotidderivatisierung unter Verwendung der Markierungsreagenzien und/oder Konjugate gemäß der Erfindung
Die vorliegende Erfindung für die Oligonucleotidderivatisierung kombiniert mehrere wichtige Merkmale:

(i) Die zuvor entwickelte Synthesestrategie für die Herstellung von nucleosidischen Oligonucleotidmarkierungsreagenzien kann genutzt werden.
(ii) Die synthetisierten Markierungsreagenzien sind Feststoffe. Daher bestehen bei der Lagerung und der Handhabung nicht die Probleme wie bei öligen nicht-nucleosidischen Phosphoamiditen.
(iii) Da die Building-Blocks bzw. Bausteine Derivate von azyklischen Nukleosiden mit einem an den Basenrest gebundenen Tetherarm sind, können sie hocheffizient unter Anwendung von Standardprotokollen an die Oligonucleotidkette gekoppelt werden.
(iv) Da der Tetherarm an den Basenrest gebunden ist, kann eine Mehrfachmarkierung von Oligonucleotiden erreicht werden.
(v) Wenn eine Ligandenstruktur/strukturen in die Oligonucleotidkette während des Kettenaufbaus eingeführt wird/werden, kann/können sie in den/die entsprechenden Lanthanid(III)chelat(e) unter Anwendung leicht modifizierter Entschützungsschritte überführt werden. Daher kann eine arbeitsaufwändige Markierung in Lösung ebenso wie die Synthese von aktivierten Chelaten und Oligonucleotiden getethert an funktionelle Gruppen, vermieden werden.
(vi) Für die Herstellung von 3'-getetherten Oligonucleotiden können die Ligandenstrukturen auch überführt werden in die entsprechenden festen Trägermaterialien, die bei der Festphasenoligonucleotidsynthese verwendet werden können.
(vii) Die Markierungsreagenzien können auch überführt werden in entsprechende Triphosphate und können unter Verwendung von Polymerasen in die Biomolekülstruktur eingefügt werden. Da die Moleküle die Kettenverlängerung nicht abbrechen, sollten mehrere davon ein Mehrfachmarkieren von Biopolymeren ermöglichen.
(viii) Die Oligonucleotid- und Polynucleotidkonjugate, synthetisiert unter Zuhilfenahme dieser Markierungsreagenzien, weisen eine verbesserte Stabilität gegenüber Nukleasen auf.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt das ESI-TOF (Elektronensprayionisierungsflugzeit) Massenspektrum (negativer Detektionsmodus) eines Oligonucleotidkonjugats 5'-X5-GTTCTTCTTGGAGTAA-3', hergestellt unter Verwendung des Markierungsreagens 11, nach Entschützen, Einführung des Europium(III)ions und Umkehrphasen HPLC-Reinigung. 1a zeigt das beobachtete Massenspektrum und 1b zeigt das Molekülion nach Dekonvolution. M- (beobachet) 7921,6, M- (berechnet) 7922,0.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung verbessert den kürzlich entwickelten Ansatz für die Oligonucleotidderivatisierung [Org. Lett. 2001, 3, 2473]. Der erfindungsgemäße Ansatz unterscheidet sich von dem genannten offenbarten Ansatz dadurch, dass ein optisch reiner Alkohol den Kohlenhydratrest ersetzt, wohingegen der Basenrest unverändert ist. Aufgrund des fehlenden Kohlenhydratrestes zeigen die Oligonucleotidsonden eine verbesserte Stabilität gegenüber Nukleasen [Nucleic Acids Res. 1991, 19, 2587]. Für einige Anwendungen, wie DNA-Hybridisierungsassays ist es wünschenswert, dass der markierte Teil nicht mit der Targetsequenz hybridisiert. Für diese Anwendungstypen sind die Markierungen an das 3'- oder 5'-Ende der codierenden Sequenz gebunden. Des Weiteren ist das Markierungsreagens derart konstruiert, dass es minimale Hybridisierungseigenschaften aufweist, d. h. die Markierung ist an Basenreste gebunden an Positionen, die für die Watson-Crick-Basenpaarbildung erforderlich sind, und der Alkoholrest der Markierungsreagenzien ist designed, um die Schmelztemperatur einer möglichen Dublex am Markierungspunkt zu verringern. Bei Anwendungen, bei denen ein Markieren innerhalb der Targetsequenz erforderlich ist, ist der Signalrest an Nukleobasen gebunden, die nicht für die Basenpaarbildung (z. B. C5 der Pyrimidine) erforderlich sind und der Alkoholrest ist derart designed, dass die Schmelztemperatur nicht verringert wird [Nucleic Acids Res. 1991, 19, 2587]. Dieser Typ an Markierungsreagenzien kann auch überführt werden in die entsprechenden Triphosphate und unter Verwendung einer Polymerasereaktion eingebaut werden in die Oligo- oder Polynucleotidstruktur.
Im Gegensatz zu mehreren kommerziell erhältlichen nicht-nukleosidischen Oligonucleotidbausteinen sind die Oligonucleotidmarkierungsreagenzien der Erfindung feste Materialien.
Die Markierungsreagenzien der Erfindung sind besonders geeignet für die Herstellung von Oligonucleotidkonjugaten mit mehreren funktionellen Gruppen oder Markierungsmolekülen in ihrer Struktur. Eine bevorzugte Alternative für G ist eine geschützte funktionelle Gruppe und für G' eine funktionelle Gruppe, wobei die funktionelle Gruppe vorzugsweise Amino, Carboxyl, Aminooxy oder Thiol ist.
Eine weitere bevorzugte Alternative für G und G' ist ein organischer Farbstoff oder eine Spinmarkierung. Bevorzugte organische Farbstoffe sind Dabsyl, Dansyl, Fluoreszein, Rhodamin, Alexa, Cy oder TAMRA.
Eine noch weitere bevorzugte Alternative für G und G' ist ein Hapten, insbesondere Biotin, Dinitrophenol oder Digoxigenin.
Eine besonders bevorzugte transiente Schutzgruppe R ist 4,4'-Dimethoxytrityl.
Der Ausdruck „bivalent" bei der Definition von G und G' bezeichnet eine chemische Gruppe, die an 2 Nachbaratome gebunden ist. Die bivalente aromatische Struktur G und G' ist vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Carbostyryl oder den im Schema 1 offenbarten Strukturen. Andere anwendbare bivalente aromatische Strukturen wurden offenbart, z. B. von M. Latva et al. [J. Luminesc., 75, 149–169 (1997)] und V. -M. Mukkala et al. [Helv. Chim. Acta, 75, 1621–1632 (1992)].
Der Substituent R''' ist vorzugsweise Methyl, Ethyl oder Allyl.
Am meisten bevorzugt ist das Markierungsreagens
(S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)-3-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato)]-3-(N6-trifluoracetamidohexyl)uracil,
(S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)-2-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato)]-1-{tetramethyl-2,2',2'',2'''-[(4-(hex-5-in-1-yl)pyridin-2,6-diyl)bis(methylen-nitrilo)}tetrakis(acetato)uracil,
(S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)-2-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato)]-1-[3- (2,2',2'',2'''-{[4'-(4''-(5-hexin-6-yl)phenyl)-2,2':6',2''-terpyridin-6,6''-diyl]bis(methylennitrilo)}tetrakis(acetato)uracil oder
(S)-1-[(3,4-dihydroxybutyl-4-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato]-1-(5-hydroxpthalimidohexin-1-yl-uracil).
Für die Multimarkierung bevorzugte Markierungen sind nicht-lumineszierende oder lumineszierende Lanthanid(III)chelate. Das Lanthanidchelat ist vorzugsweise Europium(III)-, Terbium(III)-, Samarium(III)- oder Dysprosium(III)chelat.
Die Erfindung wird weiter durch die nachfolgenden Beispiele erläutert. Die in dem experimentellen Teil verwendeten Strukturen und Syntheserouten sind in den Schemata 2 bis 6 angegeben. Schema 2 veranschaulicht die Synthese des Markierungsreagens 6. Die experimentellen Details sind in den Beispielen 1–5 und 16 angegeben. Schema 3 veranschaulicht die Synthese des Markierungsreagenz 11. Die experimentellen Details sind in den Beispielen 6–9 und 16 angegeben. Schema 4 veranschaulicht die Synthese des Markierungsreagenz 13 und die experimentellen Details sind in den Beispielen 10 und 16 angegeben. Schema 5 veranschaulicht die Herstellung eines Markierungsreagenz 19. Experimentelle Details sind in den Beispielen 11–16 angegeben. Schema 6 veranschaulicht das Verfahren zur Einführung von Lanthanid(III)chelaten in die Oligonucleotidstruktur unter Verwendung des Markierungsreagenz 6. Experimentelle Details sind in Beispiel 17 angegeben. Schema 7 veranschaulicht das Verfahren zur Einführung von Lanthanid(III)chelaten in die Oligonucleotidstruktur unter Verwendung des Markierungsreagenz 11. Experimentelle Details sind in Beispiel 18 angegeben. Beispiel 19 beschreibt Prinzipien der Oligonucleotidreinigung mit HPLC-Techniken. Schema 8 beschreibt die Syntheseroute für die Herstellung eines azyklischen Nukleo sidtriphosphats, welcher den enzymatischen Einbau von Lanthanid(III)chelaten in eine Polynucleotidstruktur ermöglicht.
EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Reagentien für die maschinenunterstützte Oligonucleotidsynthese wurden von Applied Biosystems (Foster City, CA) gekauft. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphodiamidit, N6-Trifluoracetamidohexanol und 3-Benzoyluracile wurden gemäß Literaturverfahren synthetisiert. Adsorptionssäulenchromatographie wurde mit Säulen, gepackt mit Silicagel 60 (Merck) durchgeführt. NMR Spektren wurden auf einem Brucker 250 bei 250,13 MHz für ¹H oder einem Jeol LA-400 Spektrometer bei 161,9 MHz für ³¹P aufgenommen. Me₄Si wurde als interne Referenz (¹H) und H₃PO₄ als eine externe Referenz (³¹P) verwendet. Die Kopplungskonstanten werden in Hz angegeben. Massenspektren wurden auf einem VG ZabSpec-ao TOF (EI)- und Perseptive Biosystems Mariner (ESI-TOF)-Geräten aufgenommen. Oligonucleotide wurden mit einem Applied Biosystems Expedite Synthesizer unter Anwendung von Phosphoramiditchemie und empfohlenen Protokollen (DMTr-Off-Synthese) zusammengesetzt.
Beispiel 1
Die Synthese von (S)-1-(2,3-O-Isopropyliden-2,3-dihydroxypropyl-3-benzoyluracil (1)
N3-Benzoyluracil (4,0 g, 18,5 mmol), S-Solketal (3,2 g, 24,0 mmol) und Triphenylphosphin (5,80 g, 22,0 mmol) wurden in trockenem THF (40 mL) aufgelöst. Diethylazodicarboxylat (3,50 mL, 22,0 mmol) wurde in 5 Portionen binnen 15 Min zugegeben und das Gemisch wurde für weitere zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Konzentration im Vakuum wurde das Produkt über Silicagel (Eluent Diethylether) gerei nigt. Die Ausbeute betrug 5.3 g (86%). ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.94 (1H, d, J 7,5); 7.66 (1H, m); 7.45 (2H, m); 7.35 (2H, d, J 8.1); 5.5.82 (1H, d, J 7.5); 4.38 (1H, m); 4.07 (2H, m); 3.71 (2H, m); 1.46 (3H, s); 1.35 (3H, s).
Beispiel 2
Die Synthese von (S)-1-(2,3-O-Isopropyliden-2,3-dihydroxypropyluracil (2)
Verbindung 1 (6,8 g) wurde in gesättigter wässriger Ammoniaklösung suspendiert und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, danach im Vakuum konzentriert und über Silicagel gereinigt (Eluent 5% Methanol in Dichlormethan V/V). ¹H NMR (CDCl₃) δ: 9.77 (1H, br); 7.84 (1H, d, J 5); 5.72 (1H, d, J 5); 4.40 (1H, m); 4.11 (2H, m); 3.73 (2H, m); 1.43 (3H, s); 1.34 (3H, s). (MS, EI⁺) 226. Die gereinigte Verbindung enthielt gemäß ¹H NMR- und MS-Analyse ein Äquivalent an Benzamid. Benzamid: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.48 (3H, m); 7.32 (2H, d, J 8); 6.13 (2H, br); (MS, EI⁺) 121.
Beispiel 3
Die Synthese von (S)-1-(2,3-O-Isopropyliden-2,3-dihydroxypropyl-3-(N6-trifluoracetamidohexyl)uracil (3)
Verbindung 2 (2,50 g, 11,05 mmol), N6-Trifluoracetamidohexan-1-ol (2,6 g, 12,16 mmol) und Triphenylphosphin (3,19 g, 12,16 mmol) wurden in trockenem THF (20 mL) suspendiert. DEAD (1,92 mL) wurde in vier Portionen während 15 Min zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Konzentration erfolgte die Reinigung über Silicagel (Eluent 3% Methanol in Dichlormethan V/V). ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.27 (1H, d, J 7.9); 6.69 (br t); 5.73 (1H, d, J 7.9); 4.38 (1H, m); 4.11 (2H, m); 3.94 (2H, t, J 7.0); 3.69 (2H, m); 3.35 (2H, q, J 6.4); 1.66 (4H, m); 1.42 (3H, s); 1.40 (4H, m); 1.34 (3H, s).
Beispiel 4
Die Synthese von (S)-1-(2,3-Dihydroxypropyl-3-(N6-trifluoracetamidohexyl)uracil (4)
Verbindung 3 wurde in Methanol, das Jod (1% G/V) enthielt, aufgelöst und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das überschüssige Jod wurde durch Zugabe von festem Natriumthiosulfat zerstört. Nach der Filtration und Konzentration wurde das Produkt über Silicagel isoliert (Eluent 10% Methanol in Dichlormethan (V/V). ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.28 (1H, d, J 7.8); 6.82 (1H, br t); 5.73 (1H, d, J 7.8); 4.00 (2H, m); 3.95 (2H, t, J 7.0); 3.80 (1H, m); 3.59 (2H, m); 3.35 (2H, q, J 6.4); 1.62 (4H, m); 1.37 (4H, m).
Beispiel 5
Die Synthese von (S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)]-3-(N6-trifluoracetamidohexyl)uracil (5)
Verbindung 4 wurde getrocknet durch Co-Verdampfung mit trockenem Pyridin und wurde in dem gleichen Lösungsmittel aufgelöst. 4,4'-Dimethoxytritylchlorid und katal. DMAP wurden zugegeben und das Gemisch wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt und konzentriert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgelöst, mit NaHCO₃ gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Reinigung über Silica (Eluent Diethylether) ergab die im Titel angegebene Verbindung als einen Feststoff. ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.26 (9H, m); 7.13 (1H, d, J 7.9); 6.83 (4H, d, J 8.9); 6.69 (1H, br); 5.61 (1H, d, J 7.9); 4.05 (2H, m); 3.89 (2H, t, J 7.0); 3.79 (6H, s); 3.68 (1H, m); 3,33 (2H, q, J 6.7); 3.18 (2H, d, J 5.2); 1.78 (1H, br); 1.60 (2H, m); 1.36 (2H, m).
Beispiel 6
Die Synthese von (S)-1-(2,3-O-Isopropyliden-2,3-dihydroxypropyl-3-(6-hexin-5-yl)uracil (6)
Verbindung 2 (2,50 g, 11,05 mmol); 5-Hexin-1-ol (n mL; 12,16 mmol) und Triphenylphosphin (3,19 g, 12,16 mmol) wurden in trockenem THF (20 mL) suspendiert. DEAD (1,92 mL) wurde in vier Teilen binnen 15 Min zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Konzentration erfolgte die Reinigung über Silicagel (Eluent 3% Methanol in Dichlormethan V/V). ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.26 (1H, d, J 8.1); 5.73 (1H, d, J 8.1); 4.38 (1H, m); 4.11 (2H, m); 3.96 (2H, t, J 7.0); 3.69 (2H, m); 2.80 (2H, br); 2.25 (2H, td, J 2.7 und 7.1); 1.95 (1H, t, 2.7); 1.76 (2H, m); 1.61 (2H, m); 1.42 (3H, s); 1.34 (3H, s). MS (EI⁺) 306.
Beispiel 7
Die Synthese von (S)-1-(2,3-O-Isopropyliden-2,3-dihydroxypropyl-3-(6-hexin-5-yl)uracil (8)
Verbindung 6 wurde entschützt und gereinigt, wie in Beispiel 4 beschrieben. ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.27 (1H, d, J 7.9); 5.74 (1H, d, J 7.9); 3.99 (2H, m); 3.96 (2H, t, J 7.3); 3.84 (1H, m); 3.61 (2H, m); 2.84 (2H, br); 2.25 (2H dt, J 2.7 und 7.0); 1.95 (1H, t, J 2.7); 1.75 (2H, m); 1.60 (1H, m).
Beispiel 8
Die Synthese von (S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)]-3-(hex-5-in-1-yl)uracil (9)
Verbindung 7 wurde dimethoxytrityliert und gereinigt unter Verwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren. ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.30 (9H, m); 7.22 (1H, d, J 7.9); 7.17 (4H, d, J 9.0); 5.74 (1H, d, J 7.9); 3.98 (4H, m); 3.94 (1H, m); 3.80 (6H, s); 2.45 (1H, br); 2.23 (2H, dt, J 2.7 und 7.2); 1.95 (1H, t, J 2.7); 1.76 (2H, m); 1.57 (2H, m).
Beispiel 9
Die Synthese von (S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)]-3-{tetramethyl 2,2',2'',2'''-[(4-(hex-5-in-1-yl)pyridin-2,6-diyl)bis(methylennitrilo)}-tetrakis(acetato)uracil (10)
Ein Gemisch aus 2,2',2'',2'''-[4-Brompyridin-2,6-diyl)bis(methylennitrilo)-tetrakis(acetate) und Verbindung 9 in trockenem THF und Triethylamin wurde mit Argon entlüftet. Bis(triphenylphosphin)-palladium(II)chlorid und CuI wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei 55°C 7 Stunden gerührt. Die abgekühlte Lösung wurde filtriert, das Filtrat wurde eingedampft und in Dichlormethan wieder aufgelöst. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert. Die Reinigung über Silicagel ergab die im Titel angegebene Verbindung als einen Feststoff (75%). ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.39 (2H, s); 7.27 (9H, m); 7.12 (1H, d, J 7.9); 6.83 (4H, d, J 8.8); 5.61 (1H, d, J 7.9); 4.11 (2H, m); 3.98 (4H, s); 3.94 (1H, m); 3.79 (6H, s); 3.70 (12H, s); 3.61 (8H, s); 3.17 (2H, d, J 4.9); 2.74 (1H, br); 2.44 (2H, t, J 7.1); 1.72 (2H, m); 1.65 (2H, m).
Beispiel 10
Die Synthese von (S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)]-3-(2,2'‚2'',2'''-{[4'-(4''-(5-hexin-6-yl)phenyl)-2,2':6',2''-terpyridin-6,6''-diyl]bis(methylennitrilo)}-tetrakis(acetato)uracil (12)
Ein Gemisch aus 2,2'‚2''‚2'''-{[4'-(4''-Bromphenyl)-2,2':6',2''-terpyridin-6,6''-diyl]bis(methylennitrilo)}-tetrakis(acetate) und Verbindung 9 in trockenem THF und Triethylamin wurde mit Argon entlüftet. Bis(triphenylphosphin)-palladium(II)chlorid und CuI wurden zugegeben und das Gemisch wurde 7 Stunden bei 55°C gerührt. Die abgekühlte Lösung wurde filtriert, das Filtrat wurde eingedampft und in Dichlormethan wieder aufgelöst. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert. Reinigung über Silicagel ergab die im Titel angegebene Verbindung als einen Feststoff (75%). ¹H NMR (DMSO-d₆): δ: 8.63 (2H, s); 8.55 (2H, d, J 7.7); 8.02 (2H, t J 7.7); 7.86 (2H, t, J 8.5); 7.62 (4H, t, J 7.3); 7.53 (1H, d, J 8.1); 7.42 (2H, d, J 7.4); 7.28 (4H, m); 6.88 (4H, d, J 8.8); 5.64 (1H, d, J 7.7); 5.32 (1H, d, J 5.5); 4.10 (4H, s); 3.86 (2H, m); 3.72 (8H, s); 3.68 (6H, s); 3.51 (1H, m); 2.97 (2H, m); 2.88 (2H, m); 2.51 (6H, m).
Beispiel 11
Die Synthese von (S)-1-(3,4-O-Isopropyliden-3,4-dihydroxybutyl)-3-benzoyl-5-ioduracil (14)
Die Titelverbindung wurde synthetisiert und unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durch Mitsunobu-Reaktion zwischen 3-Benzoyl-5-ioduracil und (S)-1,2-O- Isopropyliden-1,2,4-butantriol. ¹H NMR (CDCl₃) δ 7.92 (2H, d); 7.82 (1H, s); 7.67 (1H, t); 7.50 (2H, d); 4.09 (tot 3H, m); 3.89 (1H, m); 3.56 (1H, m); 2.04 (1H, m); 1.87 (1H, m); 1.44 (3H, s); 1.38 (3H, s).
Beispiel 12
Die Synthese von (S)-1-(3,4-Dihydroxybutyl)-3-benzoyl-5-ioduracil (15)
Verbindung 14 (1,17 g) wurde in 80%iger wässriger Essigsäure (15 mL) suspendiert und über Nacht bei 50°C gerührt. Alle flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Methylchlorid aufgelöst, mit gesättigter NaHCO₃ gewaschen, getrocknet und konzentriert. Reinigung über Silicagel (Eluent 10% MeOH in CH₂Cl₂) ergab die im Titel angegebene Verbindung als einen Feststoff. ¹H NMR (CDCl₃) δ 7.92 (2H, d); 7.83 (1H, s); 7.68 (1H, t); 7.51 (2H, d); 3.99 (2H, m); 3.69 (2H, m), 3.48 (1H, m); 1.90 (1H, m); 1.78 (1H, m).
Beispiel 13
Die Synthese von (S)-1-(3,4-Dihydroxybutyl)-5-ioduracil (16)
Debenzoylierung von Verbindung 15, wie in Beispiel 2 beschrieben, ergab Verbindung 16. Sie wurde in dem nächsten Schritt ohne weitere Charakterisierung verwendet.
Beispiel 14
Die Synthese von (S)-1-[(3,4-Dihydroxybutyl-4-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]-5-ioduracil (17)
Dimethoxytritylierung von Verbindung 16 unter Verwendung des in Beispiel 3 angegebenen Verfahrens ergab Verbindung 17. ¹H NMR (CDCl₃) δ 7.67 (1H, s); 7.26 (9H, m); 6.83 (4H, J 8.9) 3.87 (2H, m); 3.79 (6H, s); 3.72 (3H, m); 3.14 (2H, m); 3.09 (1H, br); 1.71 (1H, m); 1.66 (1H, m).
Beispiel 15
Die Synthese von (S)-1-[(3,4-Dihydroxybutyl-4-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]-5-(hydroxypthalimidohexin-1-yl)uracil (18)
Yogishawa-Reaktion zwischen Trifluoracetamidoproargylamin und Verbindung 17 unter Verwendung der in Beispiel 9 angegebenen Verfahren ergab die im Titel angegebene Verbindung als einen Feststoff.
Beispiel 16
Synthese der Phosphoramidite. Allgemeines Verfahren.
Vorgetrockneter Alkohol und 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (1,5 Äq) wurden in trockenem Acetonitril aufgelöst. 1H-Tetrazol (1 Äq; 0,45 M in Acetonitril) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 30 Min bei Raumtemperatur gerührt, bevor es in 5%ige NaHCO₃ gegossen und mit Dichlormethan extrahiert und über Na₂SO₄ getrocknet wurde. Die Reinigung erfolgte über eine Silicagelsäule (Eluent Petrolether:Ethylacetat:Triethylamin; 2:5:1, V/V/V).
(S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)-3-O-2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato)-3-(N6-trifluoracetamidohexyl)uracil (6). ³¹P NMR: δ 152.46 (0.5 P); 152.30 (0.5 P).
(S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)-3-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato)]-1-{tetramethyl 2,2',2'',2'''-[(4-hex-5-in-1-yl)pyridin-2,6-diyl)bis(methylennitrilo)}tetrakis(acetato)uracil (11).
³¹P NMR: δ 152.56 (0.5 P); 152.47 (0.5 P).
(S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)-2-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato)]-1-[3-(2,2',2'',2'''-{[4'-(4''-(5-hexin-6-yl)phenyl)-2,2':6',2''-terpyridin-6,6''-diyl]bis(methylennitrilo)}tetrakis(acetato)uracil (13).
³¹P NMR: δ 152.97 (0.5 P); 152.81 (0.5 P).
(S)-1-[(3,4-Dihydroxybutyl-4-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato]-1-(5-hydroxypthalimidohexin-1-yluracil) (19).
³¹P NMR: δ 152.85 (0.5 P); 152.74 (0.5 P).
Beispiel 17
Einführung von primären Aminogruppen in eine Oligonucleotidstruktur unter Verwendung von Verbindung 6 und Markierung von Aminofunktionen mit einem nicht-lumineszierenden Europium(III)chelat.
Modellsequenzen wurden synthetisiert auf einem ABI-Instrument und bis zu 10 Phosphoramidite 6 wurden an ihre 5'-Enden unter Standardbedingungen (Konzentration 0,2 M in Acetonitril; Kopplungszeit 60 s) gekoppelt. Es wurde kein Unterschied in der Kopplungseffizienz zwischen 6 und normalen nukleosidischen Bausteinen gemäß DMTr-Kationresponse detektiert. Nach Standard-ammoniolytischem Entschützen wurde das hergestellte Oligonucleotid auf PAGE isoliert und auf NAP Säulen entsalzt. Dieses Oligonucleotid wurde schließlich markiert mit einem nicht-lumineszierenden Europium(III)chelat, wie bei Dahlen et al., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 268 beschrieben.
Beispiel 18
Einführung von Lanthanid(III)chelaten in eine Oligonucleotidstruktur unter Verwendung von Verbindung 11
Modellsequenzen wurden wie vorstehend beschrieben synthetisiert. Eines oder fünf Phosphoramidite 11 wurden an deren 5'-Ende unter Verwendung von Standardbedingungen gekoppelt. Es wurde kein Unterschied in der Kopplungseffizienz zwischen 11 und normalen nukleosidischen Bausteinen detektiert. Wenn der Kettenaufbau abgeschlossen war, wurden die Oligonucleotide entschützt, durch Behandlung des festen Trägermaterials mit zunächst 0,1 M Natriumhydroxid für 4 Stunden bei Raumtemperatur. 1,0 M Ammoniumchlorid wurde anschließend zugegeben und die Lösung wurde im Vakuum konzentriert. der Rückstand wurde mit konzentriertem Ammoniak 16 Stunden bei 60°C behandelt. Danach wurde Europiumcitrat (19 Äq. pro Ligand) zugegeben und das Gemisch wurde 90 Min bei Raumtemperatur gehalten. Entsalzen mittels NAP, gefolgt von RP HPLC ergab die gewünschten Oligonucleotidkonjugate mit einem oder fünf Europium(III)chelaten in ihrer Struktur.
Beispiel 19
Reinigung von Oligonucleotidkonjugaten über HPLC
Die Oligonucleotidkonjugate wurden mittels Umkehrphasetechniken gereinigt, unter Verwendung von entweder HyPURITY^TM Elite (ThermoQuest), Purospher RP-18e (Merck) oder Inertsil ODS-3 (GL Sciences)-Säulen und TEAA Puffer und Acetonitrilgradienten als mobile Phase.

Claims

Markierungsreagens der Formel (I), nützlich zum Markieren eines Oligonucleotids unter Anwendung von Festphasenchemie,
worin R eine temporäre Schutzgruppe ist, wie 4,4'Dimethoxytrityl (DMTr), 4-Methoxytrityl (MMTr), Trityl (Tr) oder (9-Phenyl)-xanhen-9-yl(pixyl); A entweder ein Phosphorylierungsrest
ist, worin L O, S oder nicht vorhanden ist, L' H, XCH₂CH₂CN oder XAr ist, worin Ar Phenyl oder dessen substituiertes Derivat ist, wobei der Substituent Nitro oder Chlor ist, und X O oder S ist; L'' O^–, S^–, Cl, N(i-Pr)₂ ist; oder A ein festes Trägermaterial ist, vorzugsweise „Controlled Pore"-Glas oder Polystyrol, gebunden an Z über einen Linker-Arm E''; Z ein Brückenpunkt ist und gebildet ist aus
E ein Linker-Arm zwischen R und Z ist, E' ein Linker-Arm zwischen Z und Z' ist, E'' ein Linker-Arm zwischen Z und A ist und E''' ein Linker-Arm zwischen Z' und G ist, gleich oder verschieden, und gebildet ist aus einem bis zehn Resten, wobei jeder Rest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phenylen, Alkylen mit 1-12 Kohlenstoffatomen, Ethindiyl (-C≡C-), Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH-, -CO-NH-, -CO-NR'- und -NR'-CO-), Carbonyl (-CO-), Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin (-N-R'), wobei R' ein Alkylrest mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist; Z' eine Purin- oder Pyrimidinbase ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin und Hypoxanthen, worin E' an N1 der Pyrimidine und N9 der Purine gebunden ist und E''' an C7 der 7-Deazapurine, N3 oder C5 von Uracil, N3 von Thymin, C5 oder N⁴ von Cytosin, C8, N², N3 oder C⁶ von Guanin, C8, N⁶ oder C2 von Adenin gebunden ist und wobei die exocyclischen funktionellen Gruppen der Base geeignet geschützt sind, vorzugsweise mit Benzoyl, Isobutyryl oder Acetyl, oder Z' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Imidazol, Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, 1,2,4-Triazin-3,5-dion, 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on, wobei E' an N1 von Imidazol, N2 von 1,2,4-Triazin-3,5-dion und 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on, und N7 von 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin und Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin gebunden ist und E'' an C4 oder C5 von Imidazol, C2 oder C9 von 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, C2, C4 oder C9 von Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, N4, C5 oder C6 von 1,2,4-Triazin-3,5-dion und N⁵ oder C6 von N⁵-Amino-1,2,4-triazin-3,5-dion gebunden ist und wobei die exocyclischen funktionellen Gruppen der Base geeignet geschützt sind, vorzugsweise mit Benzoyl, Isobutyryl oder Acetyl; G eine geschützte bivalente aromatische Struktur ist, gebunden an zwei Iminodiessigsäureestergruppen N(CH₂COOR'')₂, worin R'' ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Allyl, Ethyltrimethylsilyl, Phenyl oder Benzyl ist, wobei der Phenyl- oder Benzylrest substituiert oder unsubstituiert sein kann, und eines der Wasserstoffatome durch E''' substituiert ist, und die bivalente aromatische Struktur im Stande ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie zu übertragen auf ein Lanthanidion, nachdem das Markierungsreagens entschützt wurde und überführt wurde in eine Lanthanidchelatverbindung, oder G eine Struktur ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
worin R'' ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Allyl, Ethyltrimethylsilyl, Phenyl oder Benzyl ist, wobei der Phenyl- oder Benzylrest substituiert oder unsubstituiert sein kann, und eines der Wasserstoffatome durch E''' substituiert ist, oder G eine geschützte funktionelle Gruppe ist, wobei die funktionelle Gruppe Amino, Aminooxy, Carboxyl, Thiol ist und die Schutzgruppe Phthaloyl, Trityl, 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl oder Trifluoracetyl für Amino und Aminooxy, Alkyl für Carbonyl und Alkyl oder Trityl für Thiol ist, oder G ein geschützter oder ungeschützter organischer Farbstoff, ein geschütztes oder ungeschütztes Hapten oder eine geschützte oder ungeschützte Spinmarkierung ist.
Markierungsreagens nach Anspruch 1, worin G eine geschützte funktionelle Gruppe ist, und die Gruppe ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Amino, Carboxyl, Aminooxy und Thiol.
Markierungsreagens nach Anspruch 1, worin G ein organischer Farbstoff ist und vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Dabsyl, Dansyl, Fluorescein, Rhodamin, TAMRA, Alexa und Cy.
Markierungsreagens nach Anspruch 1, worin G ein Hapten ist, vorzugsweise Biotin, Dinitrophenol oder Digoxigenin.
Markierungsreagens nach Anspruch 1, worin die temporäre Schutzgruppe R 4,4'-Dimethoxytrityl (DMTr) ist.
Markierungsreagens nach Anspruch 1, worin G eine bivalente aromatische Struktur ist und vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
Carbostyryl,
Markierungsreagens nach Anspruch 1, worin das Markierungsreagens nicht-lumineszierend ist und G ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
worin R''' ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Allyl, Ethyltrimethylsilyl, Phenyl oder Benzyl ist, wobei der Phenyl- oder Benzylrest substituiert oder unsubstituiert sein kann, und eines der Wasserstoffatome substituiert ist durch E'''.
Markierungsreagens nach Anspruch 7, worin R'' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Methyl, Ethyl und Allyl.
Markierungsreagens nach Anspruch 1, worin das Markierungsreagens ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)-3-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato]-3-(N6-trifluoracetamidohexyl)uracil (6), (S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)-2-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato]-1-{tetramethyl-2,2',2'',2'''-[(4-(hex-5-in-1-yl)pyridin-2,6-diyl)]bis(methylennitrilo)}tetrakis(acetato)uracil (11), (S)-1-[3-(4,4'-Dimethoxytrityl-2,3-dihydroxypropyl)-2-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato]-1-[3-(2,2',2'',2'''-{[4'-(4''-(5-hexin-6-yl)phenyl)-2,2':6',2''-terpyridin-6,6''diyl]bis(methylennitrilo)}tetrakis(acetato)uracil (13) und (S)-1-[3,4-Dihydroxybutyl-4-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidato]-1-(5-hydroxyphthalimidohexinyluracil) (19).
Markierungsreagens der Formel (II), nützlich zum Markieren eines Oligonucleotids unter Verwendung von Polymerasen,
worin: R''''
oder Salze davon ist; Z ein Brückenpunkt ist und gebildet ist aus
E ein Linker-Arm zwischen R'''' und Z ist, E' ein Linker-Arm zwischen Z und Z' ist, E'' ein Linker-Arm zwischen Z und A ist und E''' ein Linker-Arm zwischen Z' und G' ist, gleich oder verschieden, und gebildet ist aus einem bis zehn Resten, wobei jeder Rest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phenylen, Alkylen mit 1-12 Kohlenstoffatomen, Ethindiyl (-C≡C-), Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH-, -CO-NH-, -CO-NR'- und -NR'-CO-), Carbonyl (-CO-), Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-), Amin (-NH-) und tertiärem Amin (-N-R'), wobei R' ein Alkylrest mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist; Z' eine Purin- oder Pyrimidinbase ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin und Hypoxanthen, worin E' an N1 der Pyrimidine und N9 der Purine gebunden ist und E''' an C7 der 7-Deazapurine, C5 von Uracil, C5 oder N⁴ von Cytosin, C8, N², N3 oder O⁶ von Guanin, C8, N⁶ oder C2 von Adenin gebunden ist, oder Z' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Imidazol, Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, 1,2,4-Triazin-3,5-dion, 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on, worin E' an N1 von Imidazol, N2 von 1,2,4-Triazin-3,5-dion und 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on, und N7 von 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin und Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin gebunden ist und E'' an C4 oder C5 von Imidazol, C2 oder C9 von 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, C2, C4 oder C9 von Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, N4, C5 oder C6 von 1,2,4-Triazin-3,5-dion und N⁵ oder C6 von N⁵-Amino-1,2,4-triazin-3,5-dion gebunden ist; G' eine bivalente aromatische Struktur ist, gebunden an zwei Iminodiessigsäuregruppen N(CH₂COOH)₂, oder Salze davon, und ein Lanthanid(III)ion chelatisiert, wobei eines der Wasserstoffatome substituiert ist durch E'' und das Lanthanid(III)(Ln)ion Europium (Eu), Samarium (Sm), Terbium (Tb) oder Dysprosium (Dy) ist und die bivalente aromatische Struktur im Stande ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie an ein Lanthanidion zu übertragen, oder G' eine Struktur ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
oder Salzen davon, wobei eines der Wasserstoffatome durch E''' substituiert ist und Ln gleich Eu, Tb, Sm oder Dy ist, oder G' eine funktionelle Gruppe ist, oder G' ein organischer Farbstoff, Hapten oder eine Spinmarkierung ist.
Markierungsreagens nach Anspruch 10, worin G' eine funktionelle Gruppe ist und die Gruppe vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amino, Carboxyl, Aminooxy und Thiol.
Markierungsreagens nach Anspruch 10, worin G' ein organischer Farbstoff ist und vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Dabsyl, Dansyl, Fluorescein, Rhodamin, TAMRA, Alexa und Cy.
Markierungsreagens nach Anspruch 10, worin G' ein Hapten ist, vorzugsweise Biotin, Dinitrophenol oder Digoxigenin.
Markierungsreagens nach Anspruch 10, worin G' eine bivalente aromatische Struktur ist und vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Carbostyryl,
Markierungsreagens nach Anspruch 10, worin das Markierungsreagens nicht-lumineszierend ist und G' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
oder Salzen davon, wobei eines der Wasserstoffatome substituiert ist durch E''' und Ln gleich Eu, Tb, Sm oder Dy ist.
Oligonucleotidkonjugat, umfassend eine Markierung, wobei a) es erhältlich ist unter Verwendung eines Markierungsreagens gemäß Anspruch 1 oder 10 b) es eine codierende Sequenz, bestehend aus einem natürlichen DNA- und/oder RNA-Fragment oder seinem Monothioat-, Dithioat- oder Phosphoramidat-Analogon oder einem PNA-Oligonucleotid oder deren Gemisch, umfasst und c) die Markierung, eine oder mehrere, gleich oder verschieden, erhalten nach i) der Einführung des Markierungsreagens, ii) der Einführung und Entschützung des Markierungsreagens, iii) der Einführung und Entschützung des Markierungsreagens, gefolgt von der Einführung eines Lanthanid(III)ions, wenn die Markierung eine lumineszierende oder nicht-lumineszierende Lanthanid(III)chelatverbindung ist, oder iv) der Einführung und Entschützung des Markierungsreagens, gefolgt von der Einführung eines Signalrestes in Lösung als dessen Thiocyanat, aktiver Ester, Dichlortriazin, Aldehyd, Keton oder Halogenacetamidoderivat, wenn das Markierungsreagens eine entschützte funktionelle Gruppe umfasst, gebunden ist an das 3'- oder/und 5'-Ende der Oligonucleotidkette oder/und innerhalb der codierenden Sequenz.