DE60214840T2

DE60214840T2 - Verfahren zur markierung und fragmentierung von dns

Info

Publication number: DE60214840T2
Application number: DE60214840T
Authority: DE
Inventors: Cecile Bourget; Mitsuharu Kotera; Jean Lhomme; Emmanuelle Trevisiol; Ali Laayoun; Christelle Tora; Isabelle Sothier
Original assignee: Biomerieux SA; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Current assignee: Biomerieux SA; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Priority date: 2001-05-04
Filing date: 2002-05-03
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2022-05-04
Also published as: CA2444926C; WO2002090584A3; JP2004527258A; FR2824335A1; JP4554159B2; EP1383925B1; CN1639356A; CA2444926A1; JP2010075211A; EP1383925A2; WO2002090584A2; AU2002313026B2; DE60214840D1; ATE340269T1; CN1325659C; HK1062033A1; ES2272723T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Fragmentieren und Markieren von DNA und ein Verfahren zur Verwendung von Nachweissonden für eine Zielnukleinsäure ebenso wie Anwendungen dieses Verfahrens, insbesondere auf dem Gebiet der Diagnostik.
Der Stand der Technik zeigt, dass viele Verfahren zum Markieren von Nukleinsäuren existieren.
Ein erstes Verfahren besteht darin, die Markierung an der Base zu befestigen, unabhängig davon, ob letztere eine natürliche Base oder modifizierte Base ist. Ein zweites Verfahren schlägt vor, die Markierung an dem Zucker zu befestigen, unabhängig davon, ob es ein natürlicher Zucker oder ein modifizierter Zucker ist. Ein drittes Verfahren hat zum Ziel, die Markierung am Phosphat anzubringen.
Die Markierung an der Base ist insbesondere bei dem Ansatz zum Markieren von Nukleinsäuren verwendet worden, bei dem direkt markierte Nukleotide eingebaut wurden.
Die Markierung am Zucker wird oft verwendet in dem Fall, wo die Oligonukleotide durch chemische Synthese hergestellt sind.
Die Markierung am Phosphat ist auch verwendet worden, um funktionalisierte Arme und Marker während der chemischen Synthese von Oligonukleotiden einzuführen.
In der Tat neigt der Fachmann auf dem Gebiet, der eine Markierung an einem Nukleotid oder einem Nukleotidanalog oder einer Nukleinsäure vornehmen muss dazu, dieses Binden an der Base oder an dem Zucker vorzunehmen, was für ihn oft bequemer ist und mehr Alternativen bereitstellt. Das ist in der Tat das, was sich aus dem Studium vieler Dokumente ergibt, wie beispielsweise EP-A-0,329,198, EP-A-0,302,175, EP-A-0,097,373, EP-A-0,063,879, US-A-5,449,767, US-A-5,328,824, WO-A-93/16094, DE-A-39 10 151, und EP-A-0,567,841 für die Base oder EP-A-0,286,898 für den Zucker.
Die Befestigung des Markers an dem Phosphat ist eine Technik, die komplexer ist als die Technik betreffend die Funktionalisierung der Base oder des Zuckers, und ist sehr viel weniger verwendet worden, insbesondere infolge der geringen Reaktivität des Phosphates (siehe z. B. Jencks W.P. et al J. Amer. Chem. Soc., 82, 1778–1785, 1960). In ähnlicher Weise wird in der Übersicht von O'Donnel und Mc Laughlin („Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure", S. 216–243, in „Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids", Ed Hecht S.M., Oxford University Press, 1996) betreffend Verfahren zum Einführen von Sonden in Oligonukleotidfragmente die wirksame Alkylierung des Internukleotidphosphodiester als unmöglich erachtet.
Ein zweites Problem besteht bei der Markierung von Nukleinsäuren, insbesondere großer Nukleinsäuren, d. h. solcher von mehr als hundert (100) Nukleotiden, die mit Nukleinsonden hybridisieren müssen. Dieses Problem ist mit der sterischen Hinderung oder dem Fehlen von Spezifität zwischen der Nukleinsäure und den Nukleinsonden verbunden. Dies führt zu einem Verlust an Empfindlichkeit beim Nachweis.
Die sterische Hinderung kann nicht nur das Ergebnis der Länge der Nukleinsäure sein, sondern auch des Vorhandenseins oder der Beibehaltung von Sekundärstrukturen. Die Fragmentierung erlaubt es, diese Strukturen zu zerstören und somit die Hybridisierung zu optimieren. Diese sterische Hinderung spielt eine besonders wichtige Rolle im Falle der Hybridisierung an Oberflächen, die Fangsonden mit hoher Dichte aufweisen, beispielsweise den DNA-Chips, die von der Firma Affymetrix („Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Shee et al., Science, 274, 610–614. „Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA sequence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022–5026) entwickelt wurden.
Bezüglich der Fragmentierung der Nukleinsäuren sind viele Verfahren im Stand der Technik beschrieben.
Erstens kann die Fragmentierung enzymatisch erfolgen, d. h. dass die Fragmentierung der Nukleinsäuren durch Nukleasen (DNasen) durchgeführt werden kann.
Zweitens kann die Fragmentierung chemisch erfolgen. Beispielsweise ist es, im Falle von DNA, möglich, die Depurinierung oder die Depyrimidierung der DNA durchzuführen, die in Gegenwart einer Base durch einen so genannten „β-Eliminations"-Mechanismus fragmentiert wird. Die Fragmentierung der DNA kann, u.a. durch Oxidations- und Alkylierungs-Mechanismen und dem Hinzufügen von freien Radikalen durchgeführt werden.
Schließlich kann die Fragmentierung physikalisch erfolgen, beispielsweise durch Beschallen oder durch einen photochemischen Weg.
Die Schwierigkeit besteht in der Tat darin, diese zwei Schritte aus Fragmentierung und Markierung zu kombinieren.
Die Patentanmeldung WO-A-99/65926 beschreibt ein Verfahren zum Markieren einer synthetischen oder natürlichen Ribonukleinsäure (RNA), das in der Fragmentierung der RNA und in der Markierung auf der Ebene des terminalen Phosphats besteht. Dieses Dokument beschreibt eine Anzahl von reaktiven funktionellen Gruppen, die für die Markierung im Zusammenhang mit Fragmentierung verwendet werden können. Diese funktionellen Gruppen erlauben es, RNAs zu markieren, wobei aber ein Fragmentierungsschritt damit verbunden sein muss, um eine wirksame Markierung zu erhalten, da diese Markierung an dem Phosphat erfolgt, das während der Fragmentierung freigesetzt wird. Weiterhin ist es erforderlich, relativ zu der RNA einen großen Überschuss an Markierungsreagens hinzuzufügen, um eine wirksame Markierung zu erhalten, was Probleme hinsichtlich Hintergrundrauschen induziert, das durch die überschüssige Markierung erzeugt wird. Schließlich ist dieses Verfahren nicht für doppelsträngige DNA anwendbar.
Es besteht daher ein Bedarf für eine einfache und wirksame Technik zum Markieren von DNA, die eine gute Markierungsausbeute und deshalb eine gute Empfindlichkeit erlaubt, die auf der Ebene der Markierungspositionen spezifisch ist und insbesondere die die Hybridisierungseigenschaften der bei der Herstellung der Doppelhelix vermittels Wasserstoffbrückenbindungen involvierten Basen nicht beeinträchtigt, und schließlich die Fragmentierung von DNA mit dem Ziel erlaubt, diese markierten DNA-Fragmente mit Nukleinsonden zu hybridisieren und insbesondere mit Nukleinsonden, die an einen festen Träger gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Markieren und Fragmentieren von einzel- oder doppelsträngiger Desoxyribonukleinsäure (DNA) umfassend die folgenden Schritte:

– Fragmentieren der DNA durch Erzeugen wenigstens einer abasischen Stelle auf der DNA,
– Binden eines Markers an wenigstens einer der Fragmente durch ein Markierungsreagens, wobei das Reagens kovalent und größtenteils an wenigstens ein Phosphat des Fragmentes kuppelt,

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bereitstellung von Nachweissonden für eine Zielnukleinsäure, das die Markierung und Fragmentierung einer einzel- oder doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure (DNA) umfasst, das die folgenden Schritte umfasst:

– Fragmentieren der DNA durch Erzeugung wenigstens einer abasischen Stelle auf der DNA,
– Binden eines Markers an wenigstens einem der Fragmente mittels eines Markierungsreagens, wobei das Reagens kovalent und überwiegend an wenigstens ein Phosphat des Fragmentes kuppelt.

Die Fragmentierung und die Markierung werden in einem oder zwei Schritten ausgeführt und die Markierung kann durchgeführt werden entweder vor, nach oder gleichzeitig mit der Fragmentierung.
Bevorzugterweise wird die Markierung und/oder Fragmentierung in einer im Wesentlichen wässrigen homogenen Lösung ausgeführt. Bevorzugterweise wird die Markierung oder die Fragmentierung gleichzeitig ausgeführt, d. h. dass die für diese zwei Schritte erforderlichen Reagenzien beispielsweise in einer im Wesentlichen wässrigen Lösung mit der Nukleinsäure zusammengegeben werden. Dies ist insbesondere der Fall für chemische oder enzymatische Fragmentierung. Im Falle einer mechanischen Fragmentierung mittels eines physikalischen Mittels bedeutet die gleichzeitige Durchführung von Markierung und Fragmentierung, dass das physikalische Mittel auf eine Lösung angewandt wird die wenigstens die Nukleinsäuren und das Markierungsreagens enthält.
Der Ausdruck im Wesentlichen wässrige Lösung soll so verstanden werden, dass sie eine Lösung bezeichnet, die wenigstens 50 % Wasser enthält. Diese Lösung enthält bevorzugterweise Salze wie eine Pufferlösung. Der Begriff homogene Lösung soll so verstanden werden, dass er eine Ein-Phasen-Lösung, wie beispielsweise eine Lösung aus Wasser/DMSO, bezeichnet, im Gegensatz zu einer Zwei-Phasen-Lösung, wie beispielsweise einer Lösung aus Wasser/Chloroform.
Die Fragmentierung der DNA vermittels der Erzeugung einer abasischen Stelle wird über den enzymatischen, chemischen oder physikalischen Weg durchgeführt.
Die Fragmentierung von DNA über den chemischen Weg wird durchgeführt, indem Nukleinsäure in Kontakt gebracht wird mit einem chemischen Mittel, das eine abasische Stelle erzeugt.
Beispiele für Bedingungen für chemische Fragmentierung vermittels einer abasischen Stelle der DNA sind angegeben in G. Pratviel et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34, S. 746–769, 1995; G. Pratviel et al., Adv. Inorg. Chem, 45, S. 251–312, 1998; D. S. Sigman et al. Chem. Rev., 93, S. 2295–2316, 1993; J. Lhomme et al., Biopolymers (Nucleic Acid Sciences), 52, S. 65–83, 1999.
Eine abasische Stelle wird erzeugt, wenn die N-glycosylische Bindung, die die modifizierte Base mit der Desoxyribose verbindet, hydrolysiert wird, wobei die Phosphodiesterbindung intakt gelassen wird. Dieses Phänomen wird Depurinierung (im Falle von Purinen) oder Depyrimidinierung (im Falle von Pyrimidinen) bezeichnet. Depurinierung tritt weit häufiger auf als die Depyrimidinierung.
Chemische Mittel wie beispielsweise saurer pH, Oxidationsmittel oder alkylierende Agenzien, können das Phänomen der Depurinierung und damit die Bildung von abasischen Stellen induzieren. Diese alkylierenden Agenzien bestehen aus elektrophilen Spezies, die mit den nukleophilen Stellen eines DNA-Fragmentes reagieren. Das Stickstoffatom an Position 7 des Guanins ist die Hauptstelle der Alkylierung von DNA. Zusätzlich zur Protonierung der Purine ist die Alkylierung eine der chemischen Modifikationen, die in der Lage ist, die N-glycosidische Bindung labiler zu machen.
Die Oxidation von DNA kann auch so genannte „alkalilabile" abasische Läsionen erzeugen, die zu der Fragmentierung von DNA in Gegenwart einer Base führen. Beispielsweise kann der Ribonolactonrest durch die Reaktion des Hydroxyl (OH)-Radikals mit dem C1'-Kohlenstoff erzeugt werden.
Die abasische Stelle ist sehr instabil. In ihrer Aldehydform kann sie leicht eine β-Eliminierung des an der 3'-Position gebunden Phosphodiesters erfahren, was zur Fragmentierung des DNA-Stranges führt.
Die Depurinierung erfolgt spontan unter physiologischen Bedingungen (pH 7,4 bei 37°C), aber die Reaktionsgeschwindigkeit ist sehr niedrig, im Größenordnungsbereich von 3 × 10^–11 Depurinierungen pro Sekunde, d. h. nicht für eine wirksame Fragmentierung zu verwenden. Um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen, werden alkylierende Agenzien, die die N-glycosidische Bindung fragiler machen, oder Enzyme, wie beispielsweise DNA-Glycosylasen, verwendet.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Fragmentierung wird erhalten durch die Verwendung eines sauren pH, d. h. eines pHs von weniger als 5, bevorzugterweise weniger als 4. Am vorteilhaftesten beträgt der pH etwa 3.
Ein Natriumformatpuffer mit pH 3 macht es möglich, dass die Nukleinsäuren wirksam gemäß der vorliegenden Erfindung fragmentiert werden. Dieser Puffer ist kompatibel mit den Bedingungen zum Markieren in einem Schritt, wie in den Beispielen gezeigt werden wird. In sogar noch vorteilhafterer Weise wird ein saures Medium (HCl, Karbonat, H₂SO₄) verwendet.
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung und mit dem Ziel, die Fragmentierung weiter zu erhöhen, enthält die Desoxyribonukleinsäure wenigstens eine modifizierte Base, die in der Lage ist, eine abasische Stelle leichter zu erzeugen.
Verschiedene modifizierte Basen können verwendet werden, wie beispielsweise N7-Alkylpurine, N3-Alkylpurine, O6-Alkylpurine, 8-Brompurine, 8-Thiopurine, 8-Alkylthiopurine, 8-Azidopurine oder 8-Alkylsulfonylpurine.
In dem Fall, wo die zu markierende Nukleinsäure durch eine enzymatische Amplifikationstechnik erzeugt wird, wie PCR, macht die Verwendung eines 8-Brompurins es möglich, einen wirksamen Einbau des Nukleotids während der Amplifikation vorzunehmen, was die Fragmentierung und das Markierungsverfahren gemäß der Erfindung entsprechend erleichtert, während eine ausgezeichnete Empfindlichkeit für den enzymatischen Amplifikationsschritt beibehalten wird. Ein 8-Methylthiopurin wird ebenfalls eingebaut, ohne die PCR-Amplifikation und die Einbaueffizienz zu stören. Einmal eingebaut wird die Thioetherbase durch ein Persäure oder ein Monopersulfatderivat, wie beispielsweise Natriumperoxymonosulfat, beispielsweise zu dem entsprechenden Sulfonyl oxidiert, das sehr labil ist. Es ist gezeigt worden, dass die Halbwertszeit der Hydrolyse eines 8-Methylsulfonylguanosins weniger als 2 Minuten ist, wohingegen die Halbwertszeit für sein natürliches Homolog 1000 Stunden beträgt.
Der Begriff Markierung soll so verstanden werden, dass er wenigstens einen Marker bezeichnet, der in der Lage ist, direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Eine nicht beschränkende Liste dieser Marker ist die folgende:

• Enzyme, die ein Signal erzeugen, beispielsweise durch Kolorimetrie, Fluoreszenz, Lumineszenz, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase,
• Chromophoren wie beispielsweise fluoreszierende, lumineszierende oder farbgebende Verbindungen,
• Gruppen mit einer Elektronendichte, die durch Elektronenmikroskopie oder durch ihre elektrische Eigenschaft nachweisbar sind, wie beispielsweise Leitfähigkeit, Amperometrie, Voltametrie, Widerstandsmessung,
• nachweisbare Gruppen, beispielsweise jene Moleküle, die eine ausreichende Größe aufweisen, um nachweisbare Modifikationen ihrer physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften zu induzieren; dieser Nachweis kann durchgeführt werden mittels optischer Verfahren, wie beispielsweise Beugung, Oberflächenplasmonresonanz, Oberflächenvariation, Kontaktwinkelvariation oder physikalische Verfahren wie beispielsweise Atomkraftspekroskopie, Tunneleffekt, und
• radioaktive Moleküle, wie beispielsweise ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I.

Bevorzugterweise ist der Marker kein radioaktiver Marker, um Sicherheitsprobleme zu vermeiden, die mit diesen Markern verbunden sind.
In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Marker elektrochemisch nachweisbar und ist der Marker insbesondere ein Derivat eines Eisenkomplexes wie beispielsweise ein Ferrocen.
Indirekte Systeme können ebenfalls verwendet werden, wie beispielsweise Liganden, die in der Lage sind, mit einem Anti-Liganden zu reagieren. Die Paare aus Ligand und Anti-Ligand sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt, was, beispielsweise, für die folgenden Paare gegeben ist: Biotin/Streptavidin, Hapten/Antikörper, Antigen/Antikörper, Peptid/Antikörper, Zucker/Lektin, Polynukleotid/komplementärer Strang des Polynukleotides. In diesem Fall ist es der Ligand, der die reaktive funktionelle Gruppe trägt. Der Anti-Ligand kann direkt durch den Marker nachweisbar sein, der in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist, oder kann selbst durch ein anderes Liganden/Anti-Liganden-Paar nachweisbar sein.
Ein weiteres Beispiel für indirekte Systeme verwendet eine spezifische kovalente Bindung zwischen dem Liganden und dem Anti-Liganden, beispielsweise Methylketon und Alkoxyamin. Beispiele für dieses System sind in den Patentanmeldungen WO-A-00/40590 und WO-A-98/05766 beschrieben.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Bindung zwischen dem Markierungsreagens und der Nukleinsäure kovalent, es ist aber oben beschrieben, dass nichtkovalente Wechselwirkungen verwendet werden können, insbesondere in Stacking-Systemen, oder in dem Fall, wo der Marker indirekt nachweisbar ist. Der Begriff „binden" umfasst deshalb diese verschiedenen Möglichkeiten.
Diese indirekten Nachweissysteme können, unter bestimmten Bedingungen, zur Amplifikation des Signals führen und man könnte Bezug beispielsweise auf die früheren Patentanmeldungen WO-A-00/07982, WO-A-01/92361 und WO-A-95/08000 der Anmelderin für chemische Amplifikation unter Verwendung von Polymeren oder auf die Anmeldung WO-A-01/44506, ebenfalls von der Anmelderin, für chemische Stacking-Amplifikationssysteme.
In einer besonderen Ausführungsform von Signalamplifikation sind wenigstens zwei Marker auf dem Markierungsreagens vorhanden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Tracer eine fluoreszierende Verbindung mit geringer sterischer Hinderung, wie beispielsweise Fluorescein, Dansyl, Chromophoren vom IR-Typ (Li-COR Inc, Lincoln NE, USA), Cyanin-Derivate wie beispielsweise Cy5 und Cy3 (Randolph J.B. et al, Nucleic Acids Res., 25(14), S. 2923–2929, 1997) und insbesondere die Cy5-Derivate, oder alternativ ist der Tracer ein Hapten mit geringer sterischer Hinderung, wie beispielsweise Biotin oder ein Abietan-Derivat (siehe Anmeldung WO-A-00/07982). Der Begriff geringe sterische Hinderung soll so verstanden werden, dass er ein Molekulargewicht von weniger als 1000 g/Mol bezeichnet.
Im Falle eines Fluorophors ist es bevorzugt, mit Fluorophoren zu arbeiten, deren Anregungswellenlänge größer ist als 450 nm, bevorzugterweise größer als 600 nm.
In dem Fall, wo der Tracer ein Hapten ist, der selbst kein Signal produziert, wie beispielsweise Biotin, wird der Nachweis durchgeführt durch die Reaktion eines Anti-Liganden wie oben beschrieben. Im Falle von Biotin wird bevorzugterweise Streptavidin oder ein anti-Biotin-Antikörper, der an eine fluoreszierende Verbindung gekuppelt ist, wie beispielsweise Fluorescein, Cy5 oder Phycoerythrin, verwendet. Im Falle von Abietan wird ein wie in WO-A-00/07982 beschriebener Antikörper verwendet.
Der Begriff „Desoxyribonukleinsäure" oder DNA bedeutet eine Abfolge von wenigstens zwei Desoxyribonukleotiden, die optional wenigstens ein modifiziertes Nukleotid umfassen, beispielsweise wenigstens ein Nukleotid, das eine modifizierte Base enthält, wie beispielsweise Inosin, Methyl-5-desoxycytidin, Dimethylamino-5-desoxyuridin, Desoxyuridin, Diamino-2,6-purin, Brom-5-desoxyuridin oder eine andere modifizierte Base, die die Hybridisierung erlaubt.
Diese DNA kann auch auf der Ebene der Internukleotidbindung, wie beispielsweise Phosphorthioate, H-Phosphonate, Alkylphosphonate, auf der Ebene des Rückgrats, wie beispielsweise alpha-Oligonukleotide (FR-A-2 607 507) oder PNAs (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 1895–1897, 1992) modifiziert sein. Diese DNA ist natürlich oder synthetisch, und/oder liegt in der Form eines Fragmentes vor. Die DNA ist einzel- oder doppelsträngig.
Insbesondere wird die DNA durch eine enzymatische Amplifikationstechnik erhalten, wie beispielsweise:

• PCR (Polymerase-Kettenreaktion), wie in den US-Patenten US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 und US-A-4,800,159 beschrieben, und ihr Derivat, nämlich die RT-PCR (Reverse Transkriptions-PCR), insbesondere in einem Ein-Schritt-Format, wie in der Patentanmeldung EP-A-0 569 272 beschrieben,
• LCR (Ligase-Kettenreaktion), wie beispielsweise in der Patentanmeldung EP-A-0 201 184 beschrieben,
• RCR (Reparatur-Kettenreaktion), wie in Patentanmeldung WO-A-90/01069 beschrieben.

Der Begriff Amplicons wird dann verwendet, um die DNA zu bezeichnen, die durch eine enzymatische Amplifikationstechnik erzeugt ist. Die DNA kann auch Ribonukleotide in einem kleinen Umfang enthalten, beispielsweise weniger als 10 %.
Eine jede dieser Modifikationen kann in Kombination erfolgen, solange wenigstens ein Phosphat in der DNA enthalten ist.
Das Markierungsreagens umfasst, als reaktive funktionelle Gruppe, ein Motiv, das ausgewählt ist aus: Diazomethyl; Alkylhalogen; Nitrosoharnstoff; Spirocyclopropan; Aziridin; Epoxid; Trifluorsulfonate.
Die reaktiven funktionellen Gruppen sind unten beschrieben:
Für die funktionelle reaktive Alkylhalogenid Gruppe bedeute X Br, Cl oder I. Vorteilerhafterweise ist das Markierungsreagens 5-(Brommethyl)fluoreszein.
Für die reaktive funktionelle Gruppe Nitrosoharnstoff ist R⁵ ein Alkyl oder H.
Die funktionelle Diazomethylgruppe ist bereits für die Alkylierung von Phosphatgruppen verwendet worden, es existieren aber eine Reihe von Problemen. Auf der einen Seite sind die Diazo-Derivate selbst instabil, was Probleme hinsichtlich der Verwendung dieser Markieurngsreagenzien in einem Markierungskit erzeugt und, andererseits, ist das Kupplungsprodukt instabil, was seine Verwendung ausschließt, wenn die Rolle des markierten Produktes darin besteht, die Anwensenheit eines biologischen Zielmoleküls in einer Probe nachzuweisen, oder wenn es das markierte Ziel ist, das es nachzuweisen gilt.
Schließlich sind Derivate, die die funktionelle Diazomethylgruppe tragen, in Wasser unlöslich, was dazu führt, dass Zwei-Phasen-Bedingungen für das Kuppeln mit Nukleinsäuren, die nur in Wasser oder wässrigen Puffern löslich und stabil sind, verwendet werden aber diese Bedingungen verringern die Reaktionsgeschwindigkeit und stören daher die Wirksamkeit der Kupplung.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das Markierungsreagens ausgewählt aus Verbindungen mit der Formel (1):
worin:

• R¹ H oder eine Alkyl-substituierte Alkyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe darstellt,
• Z einen nachweisbaren Marker umfasst.

Z und/oder R¹ sind ausgewählt, um die funktionelle Diazomethylgruppe zu stabilisieren, d. h. wenigstens eine der beiden Gruppen Z oder R¹ weist einen Phenyl-Nukleus auf.
Bevorzugterweise ist das Markierungsreagens aus Verbindungen der Formel (2) ausgewählt:
worin:

• R¹ H oder eine Alkyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe darstellt,
• R² ein nachweisbarer Marker ist,
• L ein Verbindungsarm ist, der eine lineare Verkettung aus wenigstens zwei kovalenten Bindungen enthält, und n 0 oder 1 ist, und
• Z ausgewählt ist aus:
worin:
• R³ und R⁴ unabhängig voneinander jeweils darstellen: H, NO₂, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR und R = Alkyl oder Aryl,
• -Y-X- -CONH-, -NHCO-, -CH₂O-, -CH₂S- darstellt.

In einer besonderen Ausführungsform von Formel (1) weist Z die folgende Struktur auf:
In diesem Fall und wenn R¹ H ist, ist das Markierungsagens 1-Pyrenyldiazomethan (PDAM).
Obwohl dieser Marker fluoresziert, ist die Anregungswellenlänge zu nahe an jenen von Nukleinsäuren. Ein indirekter Nachweis unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der gegen das Pyren-Motiv gerichtet ist, ist bevorzugt. Das Verfahren zum Herstellen dieses Antikörpers ist den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt (siehe beispielsweise Patentanmeldung WO-A-00/07982).
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens weist das Markierungsreagens die Formel (3) auf:
worin:

• R¹ H oder eine Alkyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe darstellt,
• R² einen nachweisbaren Marker darstellt,
• L ein Verbindungsarm ist, der eine lineare Verkettung von wenigstens zwei kovalenten Bindungen umfasst, und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist,
• R³ und R⁴ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: H, NO₂, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR mit R = Alkyl oder Aryl,
• -Y-X- -CONH-, -NHCO-, -CH₂O-, -CH_ZS- darstellt.

Vorteilhafterweise weist das Reagens die Formel (4) auf:
worin:

• R¹ H oder eine Alkyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe darstellt,
• R² einen nachweisbaren Marker darstellt,
• L ein Verbindungsarm ist, der eine lineare Verkettung von wenigstens zwei kovalenten Bindungen umfasst, und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist,
• R³ und R⁴ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: H, NO₂, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR mit R = Alkyl oder Aryl.

Vorteilhafterweise weist das Reagens die Formel (5) auf:
worin:

Vorteilhafterweise weist das Reagens die Formel (6) auf:
worin:

In den obigen Formeln (3) bis (6) stellen vorteilhafterweise R³ und R⁴ jeweils unabhängig voneinander dar: H, NO₂, OCH₃.
Entsprechend ist eine bevorzugte Verbindung gemäß Formel (6) eine solche mit Formel (6'):
worin:

• R¹ H oder eine Alkyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe darstellt,
• R² einen nachweisbaren Marker darstellt,
• L ein Verbindungsarm ist, der eine lineare Verkettung von wenigstens zwei kovalenten Bindungen umfasst, und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist.

Eine bevorzugte Verbindung gemäß Formel (4) ist eine solche mit Formel (4'):
worin:

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, wo es erwünscht ist, das Signal zu verstärken, sind wenigstens zwei Marker auf dem Markierungsreagens vorhanden. Insbesondere besitzt ein Agens, das es möglich macht, die Signalverstärkung gemäß der vorliegenden Erfindung auszuführen, eine Struktur R²-(L)_n der Formel (7) unten:
worin:

• R² einen nachweisbaren Marker darstellt,
• m eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist, bevorzugterweise zwischen 1 und 20,
• p eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist, vorteilhafterweise 2 bis 6, bevorzugterweise 4 ist.

Diese Struktur R²-(L)_n gilt ohne Unterscheidung für die Formeln (2) bis (6) oben.
Ein weiteres bevorzugtes Markierungsreagens für die Signalverstärkung ist das Reagens mit der Formel (8):
worin:

• R² einen nachweisbaren Marker darstellt,
• R³ H, NO₂, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR mit R = Alkyl oder Aryl darstellt,
• L ein Verbindungsarm ist, der eine lineare Verkettung von wenigstens zwei kovalenten Bindungen umfasst und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist,
• -Y-X- -CONH-, -NHCO-, -CH₂O-, -CH₂S- darstellt.

Vorteilhafterweise weist das Agens für die Signalverstärkung die Formel (9) auf:
worin:

• R² einen nachweisbaren Marker darstellt,
• R³ H, NO₂, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR mit R = Alkyl oder Aryl darstellt, bevorzugterweise stellt R³ H, NO₂ oder OCH₃ dar,
• L ein Verbindungsarm ist, der eine lineare Verkettung von wenigstens zwei kovalenten Bindungen umfasst, und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist.

Einige vorteilhafte Reagenzien der Erfindung sind:

a) eine solche mit Formel (10):
worin:
• R¹ H oder eine Alkyl- oder Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe darstellt,
• R² einen nachweisbaren Marker darstellt,
• L ein Verbindungsarm ist, der eine lineare Verkettung von wenigstens zwei kovalenten Bindungen umfasst, und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist,
b) eine solche mit der Formel (11):
worin:
• R¹ H oder eine Alkyl- oder Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe darstellt,
• R² einen nachweisbaren Marker darstellt,
• L ein Verbindungsarm ist, der eine lineare Verkettung von wenigstens zwei kovalenten Bindungen umfasst, und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist.
c) eine solche mit der Formel (12):
worin:
• R¹ H oder eine Alkyl- oder Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe darstellt,
• R² einen nachweisbaren Marker darstellt,
• L ein Verbindungsarm ist, der eine lineare Verkettung von wenigstens zwei kovalenten Bindungen umfasst, und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist.

Bevorzugterweise weist das Markierungsreagens:

a) die Struktur
auf, worin R¹ eine Methylgruppe oder ein Phenyl darstellt, oder
b) die Struktur
auf, worin R¹ eine Methyl- oder Phenyl-Gruppe darstellt, oder
c) die Struktur
auf, worin R¹ eine Methyl- oder Phenyl-Gruppe darstellt.

Andere bevorzugte Agenzien gemäß der Erfindung weisen die Formel (13) auf:
worin:

• R² einen nachweisbaren Marker darstellt,
• L ein Verbindungsarm ist, der eine lineare Verkettung von wenigstens zwei kovalenten Bindungen umfasst, und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist.

Insbesondere sind die Markierungsreagenzien gemäß dem Verfahren der Erfindung löslich in polaren Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind, wie beispielsweise DMF, DMSO, CH₃CN, THF, DMA (Dimethylacetamid), NMP (N-Methylpyrrolidon), DME (Dimethoxyethan).
Bevorzugterweise sind die Markierungsreagenzien in DMSO oder Wasser löslich.
Der Ausdruck mit Wasser mischbares Lösungsmittel soll so verstanden werden, dass es ein Lösungsmittel bezeichnet, das in einem Anteil von wenigstens 5 Vol.-% mit Wasser oder einem Salz enthaltenden, wässrigen Puffer mischbar ist.
Vorteilhafterweise umfasst, in den vorhergehenden Formeln, der Arm L ein Ethylenglycol- oder Polyethylenglycol-Motiv, um die Löslichkeit des Reagens in Wasser zu erhöhen.
Diese Reagenzien können somit in der homogenen Phase an Nukleinsäuren binden, wobei die homogene Phase aus einer im Wesentlichen wässrigen Lösung besteht, d. h. wenigstens 50 % Wasser enthält.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweisen von einzel- oder doppel-strängiger Ziel-Desoxyribonukleinsäure (DNA) zu beschreiben, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Fragmentieren und Markieren der DNAs gemäß einem der oben beschriebenen Verfahren,
b) Hybridisieren der markierten Fragmente mit wenigstens einer Nukleinsonde, die für die Ziel-Nukleinsäure ausreichend spezifisch ist,
c) Nachweisen des ausgebildeten Hybrids unter Verwendung des Markers.

Wie in den Beispielen gezeigt werden wird, erlaubt die Denaturierung der DNA vor der Hybridisierung, dass die Empfindlichkeit erhöht wird. Dieser Denaturierungsschritt erfolgt nach der Fragmentierung und der Markierung.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt ein enzymatischer Amplifikationsschritt vor der Fragmentierung und der Markierung. Der enzymatische Amplifikationsschritt erzeugt DNA-Amplicons von einer Ziel-DNA-Nukleinsäure, aber auch von einer Ziel-RNA-Nukleinsäure, wie beispielsweise einer Boten-RNA, einer Transfer-RNA oder ribosomalen RNA. Die RT-PCR-Technik ist, beispielsweise, ein bekanntes Mittel zum Amplifizieren von RNA.
Bevorzugterweise erfolgen die Fragmentierungs-, Markierungs- und Denaturierungs-Schritte sowohl im Falle einer natürlichen Ziel-Nukleinsäure als auch im Falle einer Zielnukleinsäure, die durch eine enzymatische Amplifikationstechnik erhalten ist, zur gleichen Zeit.
Die Fragmentierung durch Erzeugen einer abasischen Stelle umfasst den Verlust einer Base. Bei den Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäure und insbesondere bei den Genotypisierungs-Verfahren, d. h. bei den Verfahren, wo die Nukleinsäure einen Polymorphismus aufweist, der über ihre Sequenz verteilt ist, ist es erforderlich, eine Vielzahl von Modifikationen von Sequenzen zu identifizieren, von denen einige die Modifikation einer einzelnen Base zwischen dem Ziel und den Nuklein-Proben darstellen, deren Funktion darin besteht, diese Modifikation zu identifizieren (Fangsonden). Die Spezifität ist deshalb in diesem Zusammenhang essentiell. Überraschenderweise zeigt die vorliegende Erfindung, dass dieser Verlust einer Base die Hybridisierungsspezifität für eine markierte und fragmentierte Nukleinsäure gemäß der Erfindung überhaupt nicht beeinträchtigt.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht auch in einem Verfahren zum Nachweisen eines Polymorphismuses, der an zuvor bestimmten oder nicht bestimmten Positionen einer Ziel-Nukleinsäure verteilt ist, durch die Anwesenheit einer Vielzahl von Deletionen und/oder Insertionen und/oder Mutationen in der Sequenz der Zielnukleinsäure relativ zu einer sogenannten Referenzsequenz, umfassend die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen einer Ziel-DNA, die den ganzen zu studierenden Polymorphismus enthält, wobei die DNA optional durch eine enzymatische Amplifikationstechnik erzeugt ist,
b) Fragmentieren und Markieren der DNA durch eines der oben beschriebenen Verfahren,
c) Hybridisieren der Fragmente an eine Vielzahl von Nukleinsonden, die als Fangsonden bezeichnet werden, wobei die Vielzahl von Fangsonden an einen festen Träger gebunden ist und die Vielzahl von Fangsonden in ihrer Gesamtheit wenigstens den zu studierenden Polymorphismus abdecken,
d) Nachweisen der Hybride, die zwischen den markierten Fragmenten und wenigstens einen Teil der Nukleinsonden gebildet ist, unter Verwendung des Markers und Ableiten des Polymorphismus der Ziel-DNA davon.

Wie oben angegeben erlaubt ein Denaturierungsschritt nach dem Fragmentierungs- und Markierungsschritt, die Empfindlichkeit des Verfahrens zu erhöhen und dieser Schritt wird bevorzugterweise gleichzeitig mit dem Markierungs- und Fragmentierungsschritt durchgeführt.
Das Fragmentierungs- und Markierungs-Verfahren gemäß der Erfindung ist besonders nützlich in dem Fall, wo die markierte und fragmentierte DNA mit einer Vielzahl von Nukleinsäuren hybridisieren muss, insbesondere Oligonukleotiden, die an einen festen Träger an einer zuvor bestimmten Position gebunden sind, um einen DNA-Chip auszubilden. Der Begriff „DNA-Chip" soll so verstanden werden, dass er einen kleinen festen Träger bezeichnet, wo eine Vielzahl von Fangsonden an vorbestimmten Positionen gebunden sind. Der Ausdruck Vielzahl soll so verstanden werden, dass er einen festen Träger bezeichnet, der wenigstens zehn (10) Nukleinsonden mit unterschiedlichen Sequenzen enthält, vorteilhafterweise wenigstens Vierhundert (400), bevorzugterweise wenigstens Eintausend (1000).
In der Tat bedingt die Dichte der an den festen Träger gebundenen Nukleinsäure schwerwiegende steirische Einschränkungen während der Hybridisierung und die Fragmentierung erlaubt es, diesen Hybridisierungsschritt zu verbessern. Beispiele für diese DNA-Chips sind, z. B., in den Veröffentlichungen von G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, Seiten 40–44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, Seiten 1–10, 1997; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1(3), Seiten 183–200, 1996; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 22(15), Seiten 2915–2921, 1994; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 16, Seiten 541–546, 1998 angegeben. Der Begriff „fester Träger", wie hierin verwendet, umfasst alle Materialien, an die eine Nukleinsäure gebunden werden kann. Der feste Träger kann in der Form einer Mikrotiter-Platte vorliegen, einer Membran, eines Partikels oder einer im wesentlichen flachen Platte.
Die Erfindung erlaubt die Verwendung einer markierten DNA, wie oben definiert, als Sonde zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäure.
Um den Nachweis und/oder die Quantifizierung und/oder Reinigung der Ziel-Nukleinsäure zu erlauben, ist die markierte DNA in der Lage, einen Hybridisierungskomplex mit einer Nukleinsäure auszubilden. Beispielsweise ist die markierte Nukleinsäure ausreichend komplementär zu dem Ziel, um spezifisch zu hybridisieren, abhängig von den Reaktionsbedingungen und insbesondere der Temperatur oder der Salinität des Reaktionsmediums.
Das Nachweisverfahren ist für die Sequenzierung, die Boten-RNA-Expressionsprofilierung oder das Screenen auf Mutationen zum Zwecke der Forschung und das Screenen von Wirkstoffen in der pharmazeutischen Industrie, die Diagnose von Infektionskrankheiten (in der Bakteriologie, Virologie und Parasitologie) oder von genetischen Erkrankungen, für die Lebensmittel- oder industrielle Kontrolle anwendbar.
Viele Veröffentlichungen beschreiben diese Arten von Anwendungen: Antoine de Saizieu et al, Nature Biotechnology, 16, Seiten 44–48, 1998; Thomas R. Gingeras et al. Genome Research, 8, Seiten 435–448, 1998; David J. Lockhart et al, Nature Biotechnology, 14, Seiten 1675–1680, 1996; Daniel D. Shoemaker et al, Nature Genetics, Band 14, Seiten 450–456, 1996; R.J. Lipshutz et al; BioTechniques, 19(3), Seiten 442–447, 1995; David G. Wang et al, Science, 280, Seiten 1077–1082, 1998; Kevin L. Gunderson et al; Genome Research, 8, Seiten 1142–1152, 1998; Joseph G. Hacia et al; Nature Genetics, Band 14, Seiten 441–447, 1996.
Der Trend auf dem Gebiet der Diagnostik und insbesondere der Diagnostik von Infektionskrankheiten (beispielsweise AIDS oder Tuberkulose) besteht darin, den Empfindlichkeitsgrad auf den Nachweis eines einzelnen Moleküls in einer Probe abzusenken, die mehrere Milliliter im Falle einer Flüssigprobe von Blut oder Urin oder Celebrospinalflüssigkeit darstellen kann. Dieses Nachweisniveau kann nur erreicht werden, wenn alle Schritte von der Probennahme bis zum Abliefern von Ergebnissen optimiert sind. Insbesondere erlaubt in dem Fall, wo ein enzymatischer Amplifikationsschritt erforderlich ist, um die erforderliche Empfindlichkeit zu erreichen (virale oder bakterielle Infektionen wie beispielsweise HIV, HCV oder Tuberkulose), ein Markierungs- und/oder Fragmentierungs-Verfahren, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, dass die Empfindlichkeit der Amplifikationstechnik nicht beeinträchtigt wird, entweder weil es nicht erforderlich ist, die in der enzymatischen Amplifikationstechnik verwendeten Desoxyribonukleotide zu ersetzen, oder weil die eingebauten Desoxyribonukleotide die Empfindlichkeit nicht ändern.
Zusätzliche Informationen können in einer weiteren Anmeldung FR-2 824 323 der Anmelderin, die am 04. Mai 2001 mit der Registrierungsnummer FR01/06040 eingereicht wurde und auch in der internationalen Einreichung gefunden werden, die am gleichen Tag wie die vorliegende Erfindung eingereicht wurde.
Die beigefügten Figuren und Beispiele zeigen besondere Ausführungsformen und können nicht als den Schutzumfang der vorliegenden Erfindungen begrenzend betrachtet werden.
1 zeigt die Strukturformel verschiedener Reagenzien, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ebenso wie die sie bezeichnenden Abkürzungen (o- bedeutet ortho, m- meta und p- para).
Die 2A bis 2I stellen, analysiert durch Kapillarelektrophorese, die Profile einer kovalenten Kupplung verschiedener Reagenzien als eine Funktion der Zeit dar, die eine funktionelle Diazomethyl-Gruppe auf dem Uridin-3'-Monophosphat (3'-UMP) tragen, gemäß Beispiel 6.1. Die Moleküle sind die folgenden:

• PDAM in 2A,
• DPDAM bei 2 mM (Millimol Pro Liter) in 2B,
• DPDAM bei 20 mM in 2C,
• PMDAM in 2D,
• NPDAM in 2E,
• BioDPDAM in 2F,
• meta-BioPMDAM in 2G,
• para-BioPMDAM in 2H, und
• ortho-BioPMDAM in 21.

Die 3A bis 3D stellen, analysiert durch Kapillarelektrophorese, die Profile der Reaktion von meta-BioPMDAM mit vier (4) Nukleotid-3'-Monophosphaten gemäß Beispiel 6.2 als eine Funktion der Zeit dar. Die Moleküle sind die folgenden:

• 3'-CMP in der Ribonukleotidserie gemäß 3A,
• 3'-AMP in der Ribonukleotidserie gemäß 3B,
• 3'-GMP in der Ribonukleotidserie gemäß 3C, und
• 3'-TMP in der Desoxyribonukleotidserie gemäß 3D.

4 stellt, analysiert durch Kapillarelektrophorese, die Profile der Reaktion von meta-BioPMDAM mit einem Dinukleotid 5'-ApUp gemäß Beispiel 6.3 als eine Funktion der Zeit dar.
Die 5A bis 5D stellen das Protonen-NMR-Spektrum in D₂O verschiedener Konjugate zwischen dem meta-BioPMDAM und vier (4) Ribonukleotid-3'-Monophosphaten gemäß Beispiel 6.4 dar. Die Moleküle sind die folgenden:

• 3'-GMP in 5A,
• 3'-AMP in 5B,
• 3' CMP in 5C, et
• 3'UMP in 5D.

6 stellt ein Syntheseschema eines Markierungsreagens dar, das zwei Biotine für die chemische Amplifikation des Signals trägt.
7 zeigt den Fragmentierungsmechanismus in sauerem Medium durch die Ausbildung einer abasischen Stelle.
8 zeigt, gemäß Beispiel 8.1, die Abbaukinetiken bei saueren pH für verschiedene modifizierte Nukleoside (8-Brom-2'-desoxyadenosin (8-BrdA) und 5-Brom-2'-desoxycytidin (5-BrdC)) ebenso wie die vier natürlichen Nukleoside (dA, dC, dG und dT). Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Hydrolyse der Ausgangsnukleoside (auf der Y-Achse) über die Reaktionszeit in Minuten (X-Achse) dargestellt.
9 zeigt, gemäß Beispiel 11.2, die Markierungskinetiken als eine Funktion der Zeit bei einer Temperatur von 60°C mit dem PDAM-Reagens auf einem synthetischen ODN-5'-Phosphat. Die Ergebnisse sind in Form von Prozentsatz der Markierung bezüglich der Reaktionszeit dargestellt, die in Minuten (auf der X-Achse) ausgedrückt ist.
10 stellt, gemäß Beispiel 11.3, den Prozentsatz der Markierung als eine Funktion der Reaktionstemperatur dar. Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt, wobei die Y-Achse der Prozentsatz der Markierung und die X-Achse die Reaktionstemperatur in °C ist.
11 stellt einen Syntheseweg für ein Reagens gemäß Formel 4' dar, der das kommerzielle Reagens 5-Nitrovanillin verwendet. Die funktionelle Aldehydgruppe ist der Vorläufer der funktionellen Diazomethyl-Gruppe. Beispiel 1: Synthese von Reagenzien mit Biotin: Allgemeines Syntheseschema:
Beispiel 1.1: Synthese von meta-BioPMDAM:
• Verbindung Biotin-meta-Acetophenon 1a:
Das D-Biotin (1,0 Gramm (g), 4,1 Millimol (mMol)) wird in 45 Milliliter (ml) wasserfreiem DMF im heißen Zustand solubilisiert. Die Mischung wird auf 0°C unter Argon abgekühlt und dann werden N-Methylmorphlin (590 Mikroliter (μl), 5,33 mMol) und Isobutylchloroformat (840 μl, 6,60 mMol) hinzugegeben. Die Mischung wird für 30 Minuten (Min) weitergerührt und dann werden 3-Aminoacetophenon (824 mg, 6,10 mMol) und N-Methylmorpholin (480 μl, 4,35 mMol) in 10 ml DMF hinzugegeben. Die Lösung wird für 2 Stunden (h) bei 0°C unter Rühren gehalten und dann bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 3 ml MeOH aufgenommen und dann werden 50 ml Wasser hinzugegeben. Das erhaltene Präzipitat wird gefiltert, mit Wasser, CH₂Cl₂ und Ether gewaschen, um 1,2 g (80%) des rohen Produktes 1a zu erhalten. Die Umkristallisation aus dem MeOH-H₂O-Paar ergibt 1a (1,01 g, 70%) in der Form eines weißen Pulvers.
Schmelzpunkt 145°C. – IR (KBr): 3280, 2931, 2857, 1691, 1590,1540, 1487, 1434, 1298, 1266 cm–1. – RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) ä = 1,3–1,7 (m, 6H); 2,33 (t, J = 8 Hz, 2H); 2,55 (s, 3H); 2,58; (d, J = 12 Hz, 1H); 2,83 (dd, J = 12 et 5 Hz, 1H); 3,13 (m, 1H); 4,15 (m, 1H); 4,31 (m, 1H); 6,34 (s, 1H); 6,41 (s, 1H); 7,44 (t, J = 8 Hz, 1H); 7,64 (d, J = 8 Hz, 1H); 7,85 (d, J = 8 Hz, 1H); 8,17 (s, 1H); 10,05 (s, 1H). – MS (FAB/Glycerol), m/z: 362 [M+H]+.
• Verbindung meta-Hydrazon 2a:
Eine Lösung von 1a (500 mg, 1,38 mmol) und von Hydrazinmonohydrat (200 μl, 4,15 mmol) in absolutem Ethanol (8 ml) wird unter Rückfluss für 2 Std. erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird der weiße Niederschlag filtriert, mit Wasser und dann mit Ether gewaschen und getrocknet. Man erhält dadurch 385 mg (74%) von Produkt 2a in Form eines weißen Pulvers.
Schmelzpunkt 185°C. – IR (KBr): 3298, 2931, 2857, 1698, 1665, 1626, 1541, 1494, 1470, 1446, 1330, 1265 cm–1. – RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) ä = 1,3–1,7 (m, 6H); 1,98 (s, 3H); 2,26 (t, J = 8 Hz, 2H); 2,56; (d, J = 12 Hz, 1H); 2,81 (dd, J = 12 et 5 Hz, 1H); 3,11 (m, 1H); 4,13 (m, 1H); 4,29 (m, 1H); 6,39 (s, 3H); 6,42 (s, 1H); 7,22 (m, 2H); 7,50 (d, J = 8 Hz, 1H); 7,84 (s, 1H); 9,82 (s, 1H). – MS (FAB/Glycerol), m/z: 376 [M+H]+.
• Verbindung meta-Diazomethan 3a:
2a (180 mg, 0,48 mMol) werden in 2 ml DMF solubilisiert. Dann wird MnO₂ (340 mg, 3,9 mMol) hinzugegeben. Nach Rühren für 30 Minuten bei Raumtemperatur wird die Mischung durch einen gesinterten Trichter filtriert, der Celite (Stärke: 0,5 cm) und pulverförmigen Molekularsieb mit 3 Å (0,5 cm) enthält. Die Reaktionsmischung wird auf ein Volumen von etwa 0,5 ml konzentriert und dann werden 5 ml Ether hinzugegeben. Der sich ergebende Niederschlag wird filtriert, gewaschen mit Wasser und dann getrocknet. Die Verbindung 3a (170 mg, 95 %) wird in der Form eines rosa Pulvers erhalten.
Schmelzpunkt 160°C. – IR (KBr): 3278, 2935, 2859, 2038, 1704, 1666, 1605, 1577, 1536, 1458, 1430, 1263 cm–1. – RMN 1H (300 MHz) δ = 1,3–1,7 (m, 6H); 2,11 (s, 3H); 2,28 (t, J = 8 Hz, 2H); 2,57; (d, J = 12 Hz, 1H); 2,81 (dd, J = 12 et 5 Hz, 1H); 3,11 (m, 1H); 4,13 (m, 1H); 4,29 (m, 1H); 6,33 (s, 1H); 6,41 (s, 1H); 6,60 (m, 1H); 7,25 (m, 3H); 9,84 (s, 1H).).
Beispiel 1.2: Synthese von para-BioPMDAM
• Verbindung Biotin-para-Acetophenon 1b:
D-Biotin (1 g, 4,1 mMol) wird in 45 ml wasserfreiem DMF in heißem Zustand solubilisiert. Die Mischung wird unter Argon auf 0°C abgekühlt und dann werden N-Methylmorpholin (590 μl, 5,33 mMol) und Isobutylchloroformat (840 μl, 6,60 mMol) nacheinander zugegeben. Die Mischung wird 30 min lang umgerührt und dann wird 4-Aminoacetophenon (824 mg, 6,10 mmol) zugegeben. Die Lösung wird 2 h lang bei 0°C gerührt und dann bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Wasser aufgenommen. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert, mit Wasser und dann mit 50 ml MeOH im heißen Zustand gewaschen. Das weiße Präzipitat wird in DMF unter Erhitzen gelöst, und die erhaltene Lösung wird dann mit MeOH gewaschen. Das Filtrat ist wiedergewonnen und bis zur Trockne eingedampft, was 888 mg von 1b ergibt (2,46 mmol, 60%).
F 260°C. – IR (KBr): 3260, 2930, 2358, 1706, 1673, 1610, 1526, 1401, 1380, 1322, 1257, 1150 cm^–1. – ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 8,82 (s, 1H, NH-CO); 7,57 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H); 6,83 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H); 6,40 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 6,32 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,12 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,11 (m, 1H, CH-S); 2,80 und 2,55 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,35 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 2,10 (s, 3H, CH₃); 1,60–1,34 (m, 6H, (CH₂)₃).
• Verbindung para-Hydrazon 2b:
Verbindung 1b (870 mg, 2,4 mMol) wird in heißem Zustand in Ethanol (99 %, 8 ml) gelöst und dann Hydrazinmonohydrat (995 μl, 19,5 mMol) zugegeben. Die Lösung wird 3 h lang unter Rückfluss erhitzt. Der erhaltene weiße Niederschlag wird filtriert und mit eiskaltem Wasser gewaschen. 820 mg (90 %) des Produktes 2b werden dadurch in Form eines weißen Pulvers erhalten.
F 305°C. – IR (KBr): 3281, 3183, 2930, 2857, 1698, 1658, 1593, 1521, 1459, 1401, 1325, 1263, 1187 cm^–1. – ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 9,68 (s, 1H, NH-CO); 7,52 (s, 4H, J = 9 Hz, Ar-H); 6,43 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 6,21 (s, 2H, NH₂) 4,29 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,12 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,81 und 2,56 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,32 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1,97 (s, 3H, CH₃); 1,63–1,36 (m, 6H, (CH₂)₃).
• Verbindung para-Diazomethan 3b:
2b (200 mg, 0,53 mMol) wird in 10 ml DMF solubilisiert. Dann werden 800 mg MnO₂ zugegeben. Nach zehnminütigem Rühren wird die Mischung durch eine Mischschicht Celite (0,5 cm) und Molekularsieb (0,5 cm in Pulverform) filtriert. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Trockne verdampft und dann mit Ether gewaschen und getrocknet. Die Verbindung 3b (190 mg, 96 %) wird in Form eines rosa Pulvers erhalten.
F 180°C (dec). – IR (KBr): 3257, 2930, 2857, 2032, 1698, 1597, 1524, 1510, 1455, 1404, 1307, 1259, 1180 cm^–1. – ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 10,18 (s, 1H, NH-CO); 7,88 (d, 2H, J = 6 Hz, Ax-H); 7,7 (d, 2H, J = 6 Hz, Ar-H); 6,41 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 6,34 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,12 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,11 (m, 1H, CH-S); 2,80 und 2,55 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,35 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 2,10 (s, 3H, CH₃); 1,60–1,34 (m, 6H, (CH₂)₃).
Beispiel 1.3: Synthese von ortho-BioPMDAM
• Verbindung Biotin-ortho-Acetophenon 1c:
D-Biotin (1 g, 4,1 mMol) wird in 45 ml wasserfreiem DMF in heißem Zustand gelöst. Die Mischung wird unter Argon auf 0°C heruntergekühlt und dann werden N-Methylmorpholin (590 μl, 5,33 mMol) und Isobutylchloroformat (840 μl, 6,60 mMol) nacheinander zugegeben. Die Mischung wird 30 min lang gerührt und dann wird 2-Aminoacetophenon (824 mg, 6,10 mMol) zugegeben. Die Lösung wird für 3 h 30 min bei Raumtemperatur gerührt und dann bis zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird in 50 ml Wasser aufgenommen. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert, mit Wasser und dann mit 50 ml MeOH im heißen Zustand gewaschen. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert und mit Wasser gewaschen. Umkristallisierung wird durch Auflösen des Produktes in heißem Zustand in MeOH erreicht und es wird durch Zugabe von Wasser gefüllt. Der Niederschlag wird filtriert, mit Wasser und dann mit Ether gewaschen, um 1,1 g (2,95 mmol, 72 %) des groben Produktes 1c zu ergeben.
F 150°C. – IR (KBr): 3248, 2930, 2857, 2359, 1691, 1669, 1651, 1582, 1528, 1448, 1354, 1310, 1245, 1161 cm^–1. – ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 11,24 (s, 1H, NH-CO); 8,33 (d, 1H, J = 8,5 Hz, Ar-H); 7,97 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H); 7,57 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 7,18 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 6,44 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 4,30 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,80 und 2,55 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,61 (s, 3H, CH₃); 2,37 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1,62–1,38 (m, 6H, (CH₂)₃).
• Verbindung ortho-Hydrazon 2c:
Verbindung 1c (500 mg, 1,38 mMol) wird in heißem Zustand in Ethanol (99 %, 8 ml) gelöst und dann Hydrazinmonohydrat (572 μl, 11,1 mMol) zugegeben. Die Lösung wird 50 Minuten lang unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wird bis zur Trockne verdampft. Der erhaltene weiße Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewaschen und dann mit Ether getrocknet. 416 mg (11,1 mMol, 80 %) des Produktes 2c werden dadurch in Form eines weißen Pulvers erhalten.
F 161°C. – IR (KBr): 3412, 3240, 2930, 2857, 2351, 1706, 1677, 1604, 1590, 1531, 1463, 1444, 1372, 1303, 1270, 1169 cm^–1. – ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 11,97 (s, 1H, NH-CO); 8,35 (d, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 7,45 (d; 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 7,19 (t, 1H, J = 7,5 Hz, Ar-H); 7,04 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 6,61 (s, 2H, NH₂); 6,42 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 4,32 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,81 und 2,56 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 2,09 (s, 3H, CH₃); 1,63–1,36 (m, 6H, (CH₂)₃).
• Verbindung ortho-Diazomethan 3c:
2c (200 mg, 0,53 mMol) wird in 10 ml DMF solubilisiert. Dann werden 800 mg MnO₂ zugegeben. Nach fünfzehnminütigem Rühren wird die Mischung durch eine Mischschicht aus Celite (0,5 cm) und Molekularsieb (0,5 cm als Pulver) filtriert. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Trockne verdampft und dann mit Ether gewaschen und getrocknet. Die Verbindung 3c (130 mg, 65 %) wird in Form eines rosa Pulvers erhalten.
F 110°C. – IR (KBr): 3248, 2930, 2857, 2367, 2342, 2038, 1699, 1521, 1456 cm^–1.– ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 9,37 (s, 1H, NH-CO); 7,26–7,00 (m, 4H, Ar-H); 6,43 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 4,30 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,15 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,82 und 2,54 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,24 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 2,12 (s, 3H, CH₃); 1,63–1,37 (m, 6H, (CH₂)₃).
Beispiel 1.4: Synthese von meta-BioDPDAM
• Verbindung meta-Benzophenon 1d:
D-Biotin (500 mg, 2,05 mMol) wird in 23 ml wasserfreiem DMF in heißem Zustand gelöst. Die Mischung wird unter Argon auf 0°C heruntergekühlt und dann werden N-Methylmorpholin (295 μl, 2,67 mMol) und Isobutylchloroformat (420 μl, 3,28 mMol) nacheinander zugegeben. Die Mischung wird 30 min lang gerührt und dann werden 3-Aminoacetophenon (605 mg, 3,07 mMol) und N-Methylmorpholin (240 μl, 2,17 mMol) in 7 ml DMF zugegeben. Die Lösung wird bei 0°C 2 h lang gerührt und dann bis zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird in 1 ml MeOH aufgenommen und dann werden 25 ml Wasser hinzugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert, mit Wasser und Ether gewaschen, um 810 mg (93 %) des rohen Produktes 1d zu ergeben. Umkristallisierung des MeOH-H₂O-Paares ergibt 1d (630 mg, 72 %) in Form eines weißen Pulvers.
¹H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ = 10,10 (s, 1H, NH-CO); 8–7,39 (m, 9H, Ar-H); 6,43 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 4,27 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,84 und 2,55 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2, 31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1,59–1,36 (m, 6H, (CH₂)₃).
• Verbindung meta-Hydrazon 2d:
1d (350 mg, 0,83 mMol) wird in 5,5 ml absolutem Ethanol gelöst und dann Hydrazinmonohydrat (140 μl, 2,48 mMol) zugegeben. Die Lösung wird unter Rückfluss über Nacht erhitzt. Nach Verdampfung wird das Produkt in 1 ml Ethanol und Wasser aufgenommen. Der weiße Niederschlag wird umkristallisiert: er wird in einem Minimum an Ethanol in heißem Zustand gelöst und Wasser wird zugegeben, bis eine leichte Trübung eintritt. Nach Abkühlung wird der erhaltene Niederschlag mit Wasser gewaschen und mit Ether getrocknet. 264 mg (73 %) des Produktes 2d werden dadurch in Form eines weißen Pulvers erhalten.
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 9,99 (s, 1H, NH-CO); 9,80 (s, 2H, NH₂); 7,54–6,88 (m, 9H, Ar-H); 6,26 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 6,21 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,78 und 2,59 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,27 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1,57–1,36 (m, 6H, (CH₂)₃).
• Verbindung meta-Diazodiphenyl 3d:
3d (500 mg, 0,53 mMol) wird in 1 ml THF solubilisiert. Dann werden 80 mg aktiviertes MnO₂ zugegeben. Nach fünfminütigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Mischung durch eine Mischschicht aus Celite (0,5 cm) und Molekularsieb (0,5 cm in Pulverform) filtriert. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Trockne verdampft. Die Verbindung 3d (47 mg, 100 %) wird in Form eines violetten Öls erhalten.
¹H NMR(200 MHz, DMSO-d₆) δ = 9,95 (s, 1H, NH-CO); 7,60–6,9 (m, 9H, Ar-H); 6,42 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (großes s, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,83 und 2,59 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,27 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1,58–1,35 (m, 6H, (CH₂)₃). Beispiel 2: Reagens zur Markierung mit Cy5: Cy5-PMDAM
• Verbindung 2-[4-(N-Acetyl-N-phenylamino)buta-1,3-dienyl]-1,2,3,3-tetramethyl[3H] indoliumiodid 6
Die Mischung aus Malonaldehydbis(phenylimin)monohydrochlorid 5 (18,3 g, 70,0 mMol), NaOAc (9,0 g, 110 mMol) und 1,2,3,3-Tetramethyl[3H]indoliumiodid 4 (4,25 g; 14,1 mMol) in saurem Anhydrid (75 ml) wird bei 110°C 20 min lang erhitzt. Nach Abkühlung wird Ether (350 ml) hinzugegeben und der braune präzipitierte Feststoff wird filtriert und mit Ether (3 × 100 ml) gewaschen. Der Feststoff wird in 150 ml CH₂Cl₂ gelöst, filtriert (Entfernen der anorganischen Salze) und dann verdampft, um eine braunen Feststoff zu ergeben (6,0 g, 90 %).
¹H NMR (CDCl₃): δ = 8,64(d; 1H; J = 12 Hz; 1-H); 8,14 (t; 1H; J = 16; 12 Hz; 3-H); 7,63–7,19 (m; 9H); 6,90 (d; 1H; J = 15 Hz; 4-H); 5,82 (t; 1H; J = 12; 13 Hz; 2-H); 4,06 (s; 3H; NCH₃); (2,16 (s; 3H; -COCH₃); 1,74 (s; 6H; CH₃).
• Verbindung 1-(5-Carboxypentyl)-2,3,3-trimethyl[3H]indoliumbromid 9:
2,3,3-Trimethylindol 7 (10,0 g, 62,8 mMol) und 6-Bromohexansäure 8 (12,3 g, 62,8 mMol) werden ohne Lösungsmittel gemischt und bei 110°C 12 h lang unter Argon erhitzt. Das violett-rote zähflüssige Reaktionsgemisch wird mit Ethylacetat (2 × 60 ml, die Paste wird mit dem Spatel verrieben und der Überstand abdekantiert) und dann mit Aceton (50 ml, die Paste verfestigt sich) gewaschen. Der rosa Feststoff wird filtriert und dann im Vakuum getrocknet (16,0 g; 73 %).
• Verbindung Cy5COOH 10:
Die Mischung des Iodids 6 (6,0 g, 12,7 mMol), Bromids 9 (4,5 g, 12,7 mMol) und NaOAc (2,6 g, 32 mMol) in dem sauren Anhydrid (35 ml) wird bei 110°C 20 min lang erhitzt. Nach Abkühlung wird Ether (150 ml) hinzugegeben und der Niederschlag wird filtriert und mit Ether (3 × 50 ml) gewaschen. Der Feststoff wird in 100 ml CH₂Cl₂ gelöst, filtriert und durch Chromatographie auf einer SiO₂-Säule gereinigt (Eluent: MeOH 5–10 %/CH₂Cl₂). 3,4 g (44 %) werden erhalten.
¹H NMR (CDCl₃): δ = 8,03 (t; 2H; J = 10; 11 Hz, 2-H, 4-H); 7,38–6,91 (m; 9H; Ar-H, 3H); 6,41 (d; 1H; J = 14 Hz; 1-H); 6,31 (d; 1H; J = 13 Hz; 5-H); 4,07 (t; 2H, J = 7; 7 Hz α-CH₂); 3,68 (s; 3H; NCH₃); 2,47 (t; 2H, J = 7; 7 Hz; ε-CH₂); 1,71 (m; 18H; CH₃, β, γ und δ-CH₂).
• Verbindung zum Kuppeln von 3-Aminoacetophenon an Cy5COOH 10 (Produkt 11):
N-Methylmorpholin (360 μl, 3,2 mMol) wird zu einer Lösung von Cy5COOH 10 (1,19 g, 1,9 mMol) in 12 ml CH₂Cl₂ gegeben. Die Lösung wird mit einem Eisbad abgekühlt und dann wird Isobutylchloroformat (480 μl, 3,7 mMol) hinzugegeben. Nach fünfminütigem Rühren wird 3-Aminoacetophenon (488 mg, 3,6 mMol) hinzugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 3 h lang umgerührt. Bei Zugabe von 250 ml Ether wird ein pastenartiger Feststoff erhalten. Nach dem Rühren setzt sich der Feststoff am Boden des Rundkolbens ab und der Überstand wird abdekantiert. Es werden nochmals 50 ml Ether hinzugegeben und das Medium wird mit dem Spatel verrieben, um einen Feststoff zu ergeben. Dieser wird filtriert, mit Wasser und Ether gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Das Produkt (Iodid) wird dann in Ethanol gelöst und über eine Amberlit IRA900 (Cl^–; 15 g)-Säule gegeben. Die wiedergewonnene ethanolische Lösung wird bis zur Trockne verdampft und dann über eine SiO₂-Säule gegeben. 0,93 g (77 %) eines blauen Feststoffes werden erhalten.
• Verbindung Cy5-Hydrazon 12:
Hydrazinmonhydrat (180 μl, 3,1 mMol) wird zu einer Lösung aus Acetophenon 11 (0,93 g, 1,46 mMol) in 5 ml absolutem Ethanol gegeben, die bei Raumtemperatur 7 h lang gerührt wird. 50 ml Ether werden hinzugegeben und das Präzipitat wird filtriert und mit Ether gewaschen. Das rohe Produkt wird in 50 ml CH₂Cl₂ gelöst, die Lösung filtriert und dann auf 10 ml konzentriert. Das Produkt wird durch Zugabe von 100 ml Ether präzipitiert, filtriert, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es werden 540 mg des Produktes 12 (57 %) erhalten.
• Verbindung Cy5PMDAM 12bis:
300 mg MnO₂ werden zu einer Lösung aus 100 mg Hydrazon 12 in 2 ml DMF gegeben und die Mischung wird heftig 10 min lang gerührt. Die Suspension wird durch eine Celiteschicht filtriert und mit DMF (3 × 50 μl) gewaschen. 50 ml Ether werden hinzugegeben und das Öl, welches sich absetzt, wird mit dem Spatel zerrieben und der Überstand wird abdekantiert. Der Reinigungsprozess wird dreimal mit 25 ml Ether wiederholt und der dadurch erhaltene Feststoff filtriert und getrocknet. 65 mg (65 %) des Produktes 12bis werden erhalten. Die Reinheit des Produktes beträgt ungefähr 80–85 % (¹H NMR).
Beispiel 3: Andere synthetisierte Reagenzien:
Beispiel 3.1: Synthese von para-Nitrophenyldiazomethan (NPDAM):
4-Nitrobenzaldehydhydrazon ist kommerziell erhältlich (Referenz 28,118-2, Aldrich, Frankreich).
Daher wird mit 600 mg (3,64 mMol) dieses Produktes gearbeitet, welches in 9 ml THF gelöst wird. Die Lösung wird 5 Minuten lang gerührt und dann werden 1,26 g (4 Äquivalente, 14,56 mMol) MnO₂ vorsichtig hinzugegeben. Die Mischung wird 10 Minuten lang gerührt und dann filtriert. Das gewonnene Filtrat wird bis zur Trockne verdampft. Nach Waschen mit Pentan wird die Verbindung para-Nitrophenyldiazomethan in Form eines hellorangefarbenen Pulvers mit einer Ausbeute von 79 % (468 mg, 2,87 mMol) erhalten.
F 80–82°C. – ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ = 8,11 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H ₃); 7,18 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H₂); 6,06 (s, 1H, CH ₁-N₂).
Beispiel 3.2: Synthese von Phenylmethyldiazomethan (PMDAM):
Acetophenonhydrazon: Acetophenon (2,0 g, 16 mMol) wird in 16 ml absolutem Ethanol verdünnt und dann Hydrazin (2,3 ml, 48 mMol) hinzugegeben. Die Mischung wird auf Rückflusstemperatur erhitzt. Nach 2 h wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Ether (150 ml) aufgenommen. Das Medium wird mit Wasser (100 ml) gewaschen. Nach Trocknung über Na₂SO₄ wird der Ether verdampft. Es wird ein blassgelbes Öl (1,5 g, 11 mMol, 69 %) erhalten.
Phenylmethyldiazomethan (PMDAM): Hydrazon (150 mg, 1,1 mMol) wird in 3 ml THF gelöst. MnO₂ (480 mg, 5,5 mMol) wird hinzugegeben. Das Medium wird 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Medium färbt sich rot. Es wird filtriert und das Lösungsmittel verdampft. Ein rotes Öl (145 mg, 100 %) wird erhalten. Diese Reagens wird ohne Reinigung verwendet.
Beispiel 3.3: Synthese von Diphenyldiazomethan (DPDAM):
Benzophenonhydrazon ist kommerziellen Ursprungs (Referenz B 960-2, Aldrich, Frankreich).
Daher wird mit 196 mg (1,0 mMol) gearbeitet, welche in 5 ml THF gelöst werden. 435 mg (5 Äq., 5,0 mMol) MnO₂ werden hinzugegeben, die Mischung 10 Minuten lang gerührt und dann filtriert. Das erhaltene Filtrat wird bis zur Trockne verdampft. 193 mg (0,99 mMol) werden erhalten. Das Reagens wird ohne Reinigung verwendet. Beispiel 3.4: Synthese von NVDAM:
Die Synthese wird gemäß dem oben beschriebenen Protokoll durchgeführt, ausgehend von 6-Nitroveratraldehyd (Aldrich, Referenz 27.960-9). Beispiel 4: Synthese des biotinylierten Derivates ausgehend von NPDAM:
Das Derivat 2-Amino-4-nitrobenzaldehyd wird gemäß dem Verfahren von ME Wall et al. wie oben erwähnt hergestellt.
Die Herstellung des Diazomethans NPDAM ist identisch zu derjenigen, wie sie in Beispiel 3.1 oben beschrieben ist.
Beispiel 5: Herstellung der DNA-Nukleinsäuren:
Die DNA-(Amplicons) werden durch PCR ausgehend von einer genomischen 16S Mycobacterium tuberculosis-Ziel-DNA (10⁺⁴ Kopien als Anfangsziele) hergestellt unter Verwendung des Fast Start-Kits von Roche, 0,2 mM von jedem Desoxyribonukleotid (d-ATP, d-CTP, d-GTP, d-TTP), 0,3 μM Primer und 0,4 μl Enzyme.
Die PCR-Parameter lauten wie folgt:
–95° C: 4 min und dann 35 Zyklen (95° C: 30 sec; 55° C: 30 sec; 72° C: 30 sec) und dann 4° C. Die Amplicons werden qualitativ durch Agarosegelelektrophorese (1,5 %, TBE 0,5x) analysiert. Das abgeschiedene Volumen beträgt 5 μl und die Wanderung findet 20 min lang bei 100 Volt (V) statt. Die Visualisierung des PCR-Produktes findet unter einer UV-Lampe nach Färben mit Ethidiumbromid statt.
Die Bedingungen für die Kultur, die Extraktion der Mycobakterien und die Amplifikationsprimer sind in der Patentanmeldung WO-A-99/65926 offenbart.
Beispiel 6: Reaktionsfähigkeit der Markierungsreagenzien an Modellnukleotiden
Die Synthese der Markierungsreagenzien wird in den Beispielen 1 bis 4 beschrieben. Das PDAM der vorliegenden Erfindung ist kommerziell erhältlich (Referenz P1405, Molecular Probes, Eugene, Oreg.).
Beispiel 6.1: Markierung der UMP 3'-Phosphat-Monomere:
Die Reaktionsfähigkeit der Markierungsreagenzien, die eine funktionelle Diazomethyl-Gruppe aufweisen, wurde untersucht, um die Spezifität der Reaktion zu kontrollieren.
Es wurde ein Protokoll entwickelt, das daraus besteht, diese Reaktionsfähigkeit durch Kapillarelektrophorese an einer Modellverbindung, 3'-UMP (Uridin-3'-Monophosphat, Referenz U1126 Sigma), unter den folgenden Standardbedingungen zu untersuchen:
3'-UMP 0,04 mM; H₃BO₃ 2,0 mM Marker [der mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel (THF, AcOEt oder DMSO)] hinzugegeben wird; Lösungsmittel H₂O – CH₃CN – organisches Lösungsmittel (Mischverhältnis: 1/3/1).
Diese Lösung wird in zehn Teile zu 250 μl aufgeteilt, die auf 60°C erhitzt werden. Nach einer bestimmten Zeit werden zu einem jeden Teil 250 μl Dichlormethan hinzugegeben. Nach Rühren wird die organische Phase (Bodenphase) entfernt. Dieser Vorgang wird zwei weitere Male wiederholt. Nach Zentrifugieren (5 min, 5000 Umdrehungen pro Minute (rpm)) wird die wässrige Phase durch Kapillarelektrophorese analysiert. Die Kapillarelektrophorese (KE)-Bedingungen lauten wie folgt: KE-Analyse wurde mittels des Gerätes Beckman P/ACE 5000 durchgeführt. Es wurde eine unbehandelte geschmolzene Silicakapillare (75 μm × 50 cm) wurde verwendet. Die angelegte Spannung beträgt 30 kV (normale Polarität) und die Temperatur der Kapillare wurde bei 23°C gehalten. Die Elektrophoretogramme wurden bei 254 nm aufgezeichnet. Die Boratpufferlösung (0,1 M, pH 8,3) wurde aus Borsäure hergestellt durch Einstellen des pH-Wertes mit einer Kochsalzlösung und Filtern durch einen 0,2 μm Filter. Die Proben wurden unter Druck injiziert (0,5 psi, 5 sec). Jeder Analyse geht die Regeneration der Kapillare durch aufeinanderfolgendes Passieren unter Druck (20 psi) einer Kochsalzlösung (0,1 M, 2 min), Wasser (2 min) und Boratpuffer (2 min) voraus.
Die Reaktion wird durchgeführt durch Variieren der Reaktionszeit zwischen 0 und 4 Stunden, wie in jeder Figur angegeben, und die Ergebnisse für jedes getestete Reagens werden in 2A bis 2I mit den verwendeten Reagenzienkonzentrationen dargestellt.
Die Reaktionszeit wird in jedem Elektrophoretogram dargestellt.
Mit all den getesteten Reagenzien wird die ausschließliche Bildung eines monoalkylierten Produktes erreicht, was die Spezifität der Reaktion beweist.
Die Reaktionsfähigkeit, das heißt die Halbreaktionszeit des Reagens mit 3'-UMP, kann daher dadurch berechnet werden, dass man die Höhe der Peaks miteinander vergleicht, und die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle angeführt (die Standardbedingungen werden oben beschrieben): Tabelle 1: Reaktionsfähigkeit (Halbeaktionszeit) der Reagenzien

* Mit o-BioPMDAM ist die Reaktionsfähigkeit geschätzt, weil unter den Bedingungen einer Konzentration des Markierungsreagens von 2 mM die Reaktion in weniger als 5 min abgeschlossen ist. 21 verwendet daher eine Konzentration von 0,2 mM.

Da die Reaktion sehr spezifisch ist und bei allen getesteten Reagenzien zu keinen Nebenprodukten führt, kann nichtsdestoweniger festgestellt werden, dass es möglich ist, die Konzentration der Markierungsreagenzien zu erhöhen, ohne dass dies Auswirkungen auf die Spezifität der Markierung hat.
Wenn man also die Konzentration des DPDAM auf 20 mM erhöht (siehe 2C), beträgt die Reaktionsfähigkeit (Halbreaktionszeit) 2 Stunden. Das gleiche Ergebnis wird mit BioDPDAM (2F) erreicht, dessen Reaktionsfähigkeit 45 min bei einer Konzentration von 30 mM beträgt.
Beispiel 6.2: Testen von verschiedenen Nukleotid-3'-Monophosphaten:
Um jegliche Fehlinterpretation zu vermeiden, wurde eine weitere Studie des meta-BioPMDAM-Markers, der als ein signifikantes Beispiel betrachtet wird, mit anderen Nukleotid-3'-Monophosphaten durchgeführt.
Die getesteten Nukleotide sind die folgenden: 3'-AMP (Referenz 85,194-9 Aldrich), 3'-GMP (Referenz 151214, JCN), 3'-CMP (Referenz C1133, Sigma), 3'-TMP (Desoxyriboreihe) (Referenz T1008, Sigma). Die erhaltenen Elektrophoretogramme mit den verschiedenen Nukleotiden sind in 3A bis 3D dargestellt. Die in 3A angegebenen Reaktionszeiten sind für 3B bis 3D identisch.
Unabhängig vom Startnukleotid (Ribo- oder Desoxyriboreihe) wird die ausschließliche und vollständige Bildung des alkylierten Produktes nach 130 min bei 60°C beobachtet. Es ist wichtig zu bemerken, dass im Fall von Guanin (die Base, die mit handelsüblichen alkylierenden Reagenzien am besten reagiert) nur das Produkt, das mit Phosphat alkyliert ist, beobachtet wird, was die sehr hohe Selektivität der Reaktion beweist.
Diese Studie macht es auch möglich zu belegen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit nicht von der Beschaffenheit des Nukleotids als Substrat abhängt.
Beispiel 6.3: Studie eines Dinukleotides:
Die Alkylierung des Dinukleotides ApUp (Referenz A4298, Sigma) wurde mit meta-BioPMDAM durchgeführt, um die Selektivität der Reaktion gegenüber dem terminalen Phosphat relativ zum Internukleotidphosphat zu belegen. Die Überwachung der Reaktion durch Elektrophorese ist in 4 dargestellt. Die Bedingungen sind die bereits in Beispiel 6.1 beschriebenen Standardbedingungen.
Es wird die ausschließliche Bildung eines einzelnen Produktes beobachtet, was eine gute Selektivität von meta-BioPMDAM gegenüber dem terminalen Phosphat relativ zum Internukleotidphosphat zeigt.
Beispiel 6.4: Charakterisierung der Addukte mit den vier (4) Nukleotid-3'-Monophosphaten
Um sicherzustellen, dass die erhaltenen Produkte tatsächlich aus einer Alkylierung mit dem Phosphat resultieren, wurde die Synthese der Addukte der Monophosphate 3'-UMP, 3'-CMP, 3'-GMP und 3'-AMP mit dem meta-BioPMDAM-Reagens durchgeführt. Die Alkylierungsreaktion wird wie unten angegeben im präparativen Maßstab durchgeführt. Die Addukte, die mit Ausbeuten im Bereich von 70 % erhalten werden, werden gereinigt und dann durch Protonen- oder Phosphor-NMR untersucht.
Herstellungsprotokoll:
3'-UMP (in Form eines Dinatriumsalzes, 9,3 mg, 21,2 μMol) wird in 2 ml einer 0,1 M wässrigen H₃BO₃-Lösung gelöst und 2 ml CH₃CN, 6 ml MeOH und meta-BioPMDAM-Reagens (75 mg; 0,20 mMol) werden nacheinander zugegeben. Die Reaktion wird 2,5 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Sie wird durch Kapillarelektrophorese überwacht. 3 ml Wasser werden hinzugegeben und das überschüssige Reagens wird durch Extraktion mit CH₂Cl₂ entfernt. Die wässrige Phase wird verdampft. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst und durch Führen über eine Umkehrphasen-Silica-Säule (Lichroprep RP-18, Merck; Elution MeOH/H₂O (20/80)) gereinigt. 10 g (69 %) des Adduktes von 3'-UMP werden erhalten.
Die für die Addukte der 3' NMP (N = G, U, C, A) erhaltenen Protonen-NMR-Spektren sind in 5A bis 5D dargestellt. Die Identifizierung der Addukte wurde durch zweidimensionale ¹H/¹H NMR-Experimente (COSY) durchgeführt. Für jedes dieser Addukte sind zwei Diastereomere im Verhältnis 1/1 vorhanden.
Es ist nur ein Peak bei ungefähr 0 ppm (300 MHz, D₂O) für das Phosphor-NMR vorhanden.
Diese Experimente zeigen, dass die Reaktion tatsächlich spezifisch ist, dass nur ein Addukt beobachtet wird und dass das Markieren tatsächlich an dem Phosphor stattfindet. Es findet keine Nebenalkylierungsreaktion an den Basen statt. Die Markierungsprodukte sind daher für einen Hybridisierungsschritt besonders geeignet.
Beispiel 7: Studie zur Temperaturstabilität:
Alle Diazomethanderivate, wie sie in Tabelle 1 von Beispiel 6.1 oben beschrieben sind, werden im festen Zustand bei –20°C in einer Kühltruhe für mindestens 3 Monate aufbewahrt und es wird kein Verlust der Reaktionsfähigkeit beobachtet.
Die Stabilität der beiden Reagenzien NPDAM und meta-BioPMDAM bei Raumtemperatur auf dem Labortisch wurde durch ¹H NMR bestimmt. Wir beobachteten keinen Abbau, wenn NPDAM für einen Monat auf dem Labortisch ohne bestimmte Vorsichtsmaßnahmen belassen wurde. Wir beobachteten einen Abbau von ungefähr 25 % wenn meta-BioPMDAM auf dem Labortisch für fünfundzwanzig (25) Tage belassen wurde.
Die Stabilität des Markierungsreagens gegenüber Temperatur ist ein wichtiges Merkmal. Tatsächlich ist der endgültige Bestimmungsort eines solchen Reagens für die industrielle Anwendung ein Markierungskit. Ein Reagens, das nicht mindestens fünfzehn (15) Tage lang bei –20°C stabil ist, bevorzugterweise 1 Monat lang, ist unverkäuflich. Selbst wenn Lager- und Auslieferungsmittel bis zu –110°C existieren, besteht eine Beziehung zwischen der Stabilität bei –110°C und bei –20°C und darum ist der Wert von fünfzehn (15) Tagen bei –20° C, bevorzugterweise (1) Monat bei –20°C ein industrielles Minimum. Für jenseits von –110°C verfügen die Labors nicht über die erforderlichen Ausrüstungen (Gefrierschränke), um diese Reagenzien vom Standpunkt des Anwenders und des Herstellers aus zu lagern, und es gibt vom Standpunkt des Herstellers kein einfaches Mittel wie Trockeneis, um diese zu verschicken.
Bezüglich der Stabilität bei Raumtemperatur ist eine Stabilität von einigen Stunden, bevorzugterweise einem (1) Tag, ausreichend, um dem Benutzer die Markierung zu erlauben.
Beispiel 8: Studie zur Fragmentierung von DNA:
Beispiel 8.1: Hydrolyse von verschiedenen Nukleosiden in saurem Medium:
Das Ziel dieser Studie ist es, die Unterschiede betreffend die Stabilität zwischen natürlichen Nukleosiden, modifizierten Nukleosiden sowie Nukleosiden vom Purin- und Pyrimidintyp gegenüber saurem pH-Wert zu zeigen. Diese Studie wird es uns auch erlauben, die Fragmentierung von DNA besser zu kontrollieren, indem man ihre Basenzusammensetzung berücksichtigt.
Zwei modifizierte Nukleoside, 8-Brom-2'-desoxyadenosin (8-BrdA) und 5-Brom-2'-desoxycytidin (5-BrdC) sowie die vier (4) natürlichen Nukleoside (dA, dC, dG und dT) wurden in dieser Studie verwendet.
50 Nanomol (nMol) eines jeden Nukleosides werden in 50 mM Natriumformiat mit einem pH-Wert von 3 bei 95°C inkubiert. Die Inkubationszeiten variieren zwischen 0 und 45 min. Nach Trocknen im Vakuum und Aufnehmen in 20 μl reinem Wasser, werden die Proben (10 mMol) durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Hydrolyse des Anfangsnukleosids (auf der Y-Achse) im Verhältnis zur Inkubationszeit in Minuten (x-Achse) wiedergegeben, siehe 8.
Die Kurven von 8 zeigen, dass die Modifikation von Adenin an der Position 8 mit einem Bromatom diese Nukleoside weniger stabil werden lässt als das natürliche Nukleosid. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass unter den verwendeten Bedingungen die Depurinierung viel größer ist als die Depyrimidinierung.
Diese Studie zeigt, dass die Fragmentierung von DNA durch Depurinierung oder Depyrimidinierung durch Optimierung der Hydrolysebedingungen oder durch den Einbau von entweder modifizierter Basen, die weniger stabil sind als natürliche Basen, oder Basen, die nach ihrem Einbau modifiziert und hydrolisiert werden können, kontrolliert werden kann.
Beispiel 8.2: Fragmentierung von doppelsträngiger DNA durch den Einbau oder Nicht-Einbau eines modifizierten Nukleotids:
Drei PCR-Amplifikationen wurden parallel durchgeführt, beginnend mit einer genomischen 16S-Mycobacterium tuberculosis-Ziel-DNA (10⁺⁴ Anfangskopien) unter Verwendung des Fast Start-Kits von Roche, 0,2 mM von jedem Desoxyribonukleotid (d-ATP, d-CTP, d-GTP, d-TTP), 0,3 μM Primer und 0,4 μl Enzym.
Die PCR-Parameter sind jene aus Beispiel 5.
Im erste Fall wird das Protokoll wie im Fall einer sogenannten natürlichen PCR verwendet.
Im zweiten Fall wird das Protokoll verändert, um eine PCR bei 30 % 8Br-dATP zu erhalten. Das wird durch das Einführen von 0,2 mM d-CTP, d-GTP und d-TTP erreicht. 0,14 mM d-ATP und 0,06 mM 8-BrdATP werden ebenfalls eingeführt. (8-BrdATP ist kommerziellen Ursprungs (Referenz N-2005-1, TriLink Biotechnologies, San Diego Calif.).)
Im dritten Fall wird das Protokoll verändert, um eine PCR bei 50 % von 8-BrdATP zu erhalten. Das wird durch das Einführen von 0,2 mM d-CTP, d-GTP und d-TTP erreicht. 0,1 mM d-ATP und 0,1 mM 8-BrdATP werden ebenfalls eingeführt.
Die Studie der ausschließlichen Fragmentierung dieser Amplicons wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt: 50 mM Natriumformiat mit einem pH-Wert von 3 bei 95° C.
Die Analyse wurde auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel (8 % Polyacrylamid, 7 M Harnstoff, 1 × TBE) durchgeführt unter Verwendung von Färben mit Ethidiumbromid.
Nach fünfzehnminütiger Inkubation bei 95°C in 50 mM Natriumformiat mit einem pH-Wert von 3 wurden zwischen den drei (3) Zielmolekülen kein Unterschied sichtbar. In allen Fällen beobachteten wir die komplette Fragmentierung der PCR-Amplicons.
Die Depurinierung der PCR-Amplicons wurde auch bei unterschiedlichen pH-Werten und unterschiedlichen Temperaturen und Inkubationszeiten durchgeführt. Die Gelanalyse unter den oben genannten Bedingungen zeigt, dass bei einem pH-Wert von 3 die Fragmentierung nach nur zehnminütiger Inkubation bei 95°C vollständig ist. Bei diesem pH-Wert ist die Fragmentierung auch bei 60°C nach dreißigminütiger Inkubation vollständig.
Bei einem pH-Wert 4 ist eine Inkubation von 30 Minuten notwendig, um eine vollständige Fragmentierung der DNA-Amplicons bei sogar 95°C zu erreichen. Dieses Ergebnis ist sehr wichtig und zeigt, dass die bei saurem pH-Wert entstandene abasische Stelle instabil ist und daher zu einer Fragmentierung der DNA-Kette ohne eine weitere spezielle Behandlung führt.
Beispiel 9: Markierung und Fragmentierung von DNA mit dem meta-BioPMDAM (3a) in zwei Schritten:
Das meta-BioPMDAM-Derivat (3a) wurde gemäß dem in Beispiel 1.1 beschriebenen Reaktionsschema erhalten.
Die DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll erhalten.
Markierung
Es werden zu 10 μg PCR 38 μg reines Wasser (SIGMA), 50 μl Natriumformat pH 3 (100 mM in reinem Wasser) zugegeben und die Mischung für 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Dann werden 2 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) danach hinzugegeben. Die Lösung wurde verwirbelt und dann für zusätzliche 15 Minuten bei 60°C inkubiert.
Die Tests wurden doppelt durchgeführt, um in der Lage zu sein, die Fragmentierung der DNA auf Gel und die Markierungswirksamkeit durch Hybridisierung und Auslesen des DNA-Typs zu analysieren.
Reinigung
Die Reinigung wird auf einer QIAQUICK^TM-Säule durchgeführt (Nucleotide Removal-Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland). Das verwendete Reinigungsprotokoll ist das vom Hersteller empfohlene.
Nach Reinigung wird das Eluat in ein sauberes Röhrchen überführt, das 400 μl Hybridisierungspuffer (1,75 ml 20 × SSPE; 2,9 ml 5M Betain; 290 μl DTAB; 10 μl Antischaum 30 %) enthält. Die Referenzen für diese Substanzen sind:

• Betain-Referenz B-2754 Sigma und
• DTAB-Referenz D-5047 Sigma.

Die Lösung wird verwirbelt und für 10 Minuten bei 95°C inkubiert, um die DNA-Stränge zu separieren, die nicht während des Markierungsschrittes während der Fragmentierung (Denaturierungsschritt) denaturiert werden. Das Röhrchen wird dann vor Hybridisierung auf einen DNA-Chip in eine Wasser-Eis-Mischung bei 0°C eingetaucht.
Hybridisierung auf einem DNA-Chip
Nach dem Markierungsschritt während der Fragmentierung werden die erhaltenen Fragmente an einen DNA-Typ hybridisiert, der für die Analyse der 213- bis 415-Region der „Genbank" M20940-Sequenz der Mycobacterium tuberkulosis 16S-RNA konstruiert ist. Dieser DNA-Chip ist beschrieben in A. Troesch et al, J. Clin Microbiol., 37(1), Seiten 49–55, 1999.
Die Hybridisierungsschritte wurden auf einer Fluidstation (Affymetrix, Santa Clara, CA) durchgeführt unter Verwendung des Hybridisierungsprotokolls und der in A. Troesch et al, J. Clin Microbiol., 37(1), Seiten 49–55, 1999 beschriebenen Puffer. Ein zusätzlicher Schritt ist erforderlich, um das Biotin nachzuweisen (indirekter Nachweis).
Die Hybridisierung wird nachgewiesen durch das Kuppeln von Streptavidin, das mit Phycoerythrine (PE) markiert ist, und das mit dem Biotin des meta-BioPMDAM wechselwirkt unter den folgenden Bedingungen: 300 μl reines Wasser, 300 μl 100 mM Tris-Puffer pH7/1M NaCl/0,05 % Tween/0,005 % Antischaum; 6 μl BSA (50 mg/ml); 6 μl Streptavidin-PE (300 μg/ml). Die Referenzen für diese Substanzen sind wie folgt:

• Streptavidin-Phycoerythrin: Referenz R0438, Dako, Dänemark,
• Streptavidin-CY5: Referenz 00050, Dako, Dänemark,
• Antischaum-Referenz M5-575, Ultra Additives Inc., und
• Tween-Referenz P-7949, Sigma.

Auslesen des DNA-Chips:
Das Auslesen der an der Oberfläche des DNA-Chip emittierten Fluoreszenz nach Markierung und Hybridisierung ebenso wie die Erzeugung von Daten hinsichtlich Signalintensität und Prozentsatz Homologie werden durch Auslesesysteme und die Software durchgeführt, die von Affymetrix (GeneChip^® Instrument System und GeneChip^® Information System, Santa Clara CA) bereitgestellt werden.
Das Auslesesystem liefert Signal- und Hintergrundrauschintensitäten, die in rfu angegeben werden („relative Fluoreszenzeinheit"). Der Prozentsatz Homologie wird angegeben relativ zu einer Referenzsequenz, die, in diesem Falle die Mycobacterium tuberculosis-Sequenz ist.
Die Ergebnisse sind bezüglich mittlerer Intensität des Signals (I), des Hintergrundrauschens (B) und des Prozentsatzes Homologie (%) in Tabelle 2 unten angegeben.
Im allgemeinen wird erachtet, dass ein Prozentsatz an Homologie von mehr als 90 % ein zufriedenstellendes Ergebnis ist, obwohl ein Ergebnis von mehr als 95 % im Allgemeinen angestrebt wird. Oberhalb 95 % werden die Werte nicht länger angegeben, da sie im Falle des Mycobakterien-DNA-Chips nicht signifikant sind. Eine hohe Intensität mit einem niedrigen Hintergrundrauschen ist das zweite in den folgenden Beispielen angestrebte Ergebnis. Bei allen Ergebnissen wird das Hintergrundrauschen B von der mittleren Intensität I abgezogen.
Analyse auf einem Polyacrylamidgel
Die Proben, die auf einem Gel analysiert werden sollen, werden unter Vakuum getrocknet, in 10 μl reinem Wasser und 10 μl 2 × Blauformamid aufgenommen.
Die Wanderung wird auf einem 8 % Acrylamidgel in 1 × TBE für eine Stunde bei 15 V durchgeführt.
Es wurde saurer pH für die Fragmentierung der DNA verwendet. In der Tat erzeugt bei diesem pH das Depurinierungsphänomen sehr instabile abasische Stellen, die zu einer praktisch unmittelbaren Fragmentierung der DNA-Sequenzen bei hoher Temperatur fuhrt. Diese Art der Fragmentierung liefert DNA-5'-Phosphat-Fragmente.
Die Gelanalyse zeigt, dass die Inkubation der PCR-Amplicons für 60°C bei 30 Minuten in Lösung in Formiatpuffer (50 mM, pH 3) zu einer vollständigen Fragmentierung dieser Amplicons führt. Dies erlaubte uns, die Markierung während der Fragmentierung der DNA-Amplicons in Gegenwart des meta-BioPMDAM-Markers zu evaluieren.
Die Markierungsergebnisse während der Fragmentierung der DNA-Amplicons, ausgedrückt, als Prozentsatz Homologie, die Intensität der Signale und das Hintergrundrauschen sind in Tabelle 2 unten angegeben. Tabelle 2: Markierung und Fragmentierung der DNA-Amplicons ausgedrückt als Homologie, Intensität der Signale (I) und Hintergrundrauschen (B).
Dieses Beispiel zeigt, dass die Derivate der Erfindung für die Markierung der DNA-Fragmente verwendet werden können, die durch enzymatische Amplifikation in einem zweistufigen Protokoll erzeugt werden. Sie können auch verwendet werden zum Markieren von nicht-amplifizierter natürlicher DNA.
Beispiel 10: Markierung von DNA mit dem Cy5-PMDAM-Derivat (12bis):
Die Markierung der DNA mit diesem neuen Marker, der die Diazomethyl-Funktion trägt, wurde evaluiert unter Verwendung eines synthetischen DNA-Fragments.
Cy5-PMDAM (12bis)
Das Markierungsreagens Cy5-PMDAM (12bis) wird hergestellt gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll.
Ein zwanzig (20)-mer-Oligodesoxyribonukleotid (ODN) wird hergestellt gemäß dem sogenannten Phosphoramididverfahren. Ein Phosphat wird am 5'-Ende durch ein Standardphosphorylierungsreagens eingeführt, das mit der Phosphoamiditchemie kompatibel ist. Die Sequenz dieses ODN besteht aus allen natürlichen Basen der DNA (Sequenz des ODN: 5'CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3'). Diese Sequenz ist komplementär zu Fangsequenzen eines sogenannten „Modell"-DNA-Chips, der gemäß der Affymetrix-Technologie synthetisiert worden ist. Dieser DNA-Chip enthält Fangsonden, die bezüglich der Sequenz identisch sind, und die in einem gitterförmigen Muster auf der Oberfläche verteilt sind. Das Auslesen dieses DNA-Chips liefert Informationen hinsichtlich der Leistung der Markierung bezüglich Intensität, aber nicht hinsichtlich der Homologie.
Markierung:
Zu 50 Picomol (pMol) dieser ODN werden 10 μl Cy5-PMDAM (10 mM in DMSO) hinzugegeben. Das Endvolumen beträgt 100 μl. Nach Homogenisierung wird die Inkubierung bei 60°C für 30 Minuten durchgeführt.
Reinigung und Auslesen:
Die Reinigung, um überschüssiges Markierungsreagens zu entfernen, wird ausgeführt gemäß Beispiel 9. Das Auslesen des DNA-Chips wird durchgeführt gemäß Beispiel 17.
Ergebnisse:
Das Mittel der Markierungsintensitäten (I), die aus dem DNA-Chip ausgelesen werden, beträgt 16.644 rfu für ein Hintergrundrauschen (B) von 450 rfu.
Dieses Intensitätsniveau ist sehr hoch und zeigt, dass das Markierungsreagens Cy5-PMDAM (12bis) mit der Markierung der DNA-Fragmente an der Phosphatgruppe vollständig kompatibel ist. Beispiel 11: Markierung und Fragmentierung von DNA mit dem PDAM-Reagens: Beispiel 11.1: Markierung mit 1-Pyrenyldiazomethan (PDAM):
1-Pyrenyldiazomethan
PDAM wird erhalten von Molecular Probes (Eugene, OR) und wird in wasserfreiem DMSO solubilisiert. Zwei zwanzig (20)-mer-ODNs wurden als DNA-Modelle verwendet: ein 5'-Hydroxyl-20-mer-ODN und das gleiche 20-mer-ODN, das ein Phosphat am 5'-Ende trägt. Die Sequenz des ODN ist in Beispiel 10 beschrieben. Die Markierungsreaktion wird in einer Mischung, die 50 % DMSO und 1,5 mM 1-Pyrenyldiazomethan (PDAM) enthält, bei 60°C für 30 Minuten oder eine Stunde ausgeführt.
Die Markierungseffizienz wurde durch Dünnschichtchromatographie (in normaler Phase) in einem Eluenten aus Isopropanol/Ammonium/Wasser 60/10/30 evaluiert. Nach 30 Minuten ist das Kuppeln an dem ODN 5'-Phosphat abgeschlossen. Eine Stunde ist erforderlich, um ein teilweises Kuppeln an das 5'-Hydroxyl des ODN zu erhalten, das heißt etwa 50 %.
Die Ergebnisse von Beispiel 6 werden an einer Modellsequenz aus 20 Basen bezüglich der sehr bevorzugten Markierung des Reagens bestätigt, das eine funktionelle Diazomethylgruppe an dem terminalen Phosphat trägt. Die Markierung an einem Intranukleotidphosphat ist nicht eine schädigende Unannehmlichkeit, da sie zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit führen kann, indem mehr als eine Markierung auf dem Nukleinsäurefragment eingeführt wird. Dies erlaubt, dass die Nukleinsäure mit einer guten Empfindlichkeit an das komplementäre Ziel hybridisiert, während eine gute Hybridisierungsspezifität beibehalten wird.
Fachleute auf dem Gebiet können somit, durch Optimierungsreaktionen, die Spezifität der Markierung steuern, in dem, beispielsweise, das Markierungsreagens, die Reaktionszeit und die Temperatur variiert werden, um ein exklusives Markieren am terminalen Phosphat zu erhalten.
Beispiel 11.2: Kinetische Studie der Markierungsreaktion mit PDAM:
Diese Studie wurde durchgeführt unter Verwendung des ODN-20-mers mit 5'-Phosphat unter den vorstehenden Bedingungen, indem die Reaktionszeit variiert wurde. Die Markierungsausbeuten wurden durch Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie(HPLC)-Analyse unter den folgenden Bedingungen evaluiert:
Umkehrphasensäule Spheri-5 RP-18,5 μm, 220 × 4,6 mm (Perkin Elmer). Die verwendeten Puffer und Gradienten waren folgende:

• Puffer A: 0,1 M TEAA; Puffer B = 50 % Puffer A + 50 % CH₃CN, und
• Gradient von 10 bis 50 % B über 30 Minuten bei 1 ml/Min. bei Raumtemperatur.

Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt, die, auf der X-Achse, die Reaktionszeit, ausgedrückt in Minuten, und auf der Y-Achse den Prozentsatz an Markierung zeigt.
Die Ausbeute erreicht fast 90 % nach nur 10 Minuten Inkubation bei 60°C.
Beispiel 11.3: Wirkung der Temperatur auf die Markierung mit PDAM:
Die Markierung wurde durchgeführt unter Verwendung des 5'Phosphat-20-mer-ODN unter den vorstehenden Bedingungen, wobei die Inkubationstemperatur variiert wurde, und mit einer Inkubationszeit von 10 Minuten in einem jeden Fall.
Die Markierungsausbeuten wurden durch Umkehrphasen-HPLC-Analyse evaluiert.
Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt, wobei auf der Y-Achse der Prozentsatz der Markierung und auf der X-Achse die Reaktionstemperatur in °C angegeben ist.
Es ist sehr wichtig festzustellen, dass selbst bei Raumtemperatur (25°C) eine Markierung des ODN beobachtet wird. Nach zehnminütiger Inkubation bei 25°C beträgt die Markierungsausbeute etwa 25 %. Bei Temperaturen von mehr als 50°C werden Ausbeuten von mehr als 80 % erhalten.
Dies zeigt die Wirksamkeit und die Flexibilität dieser Chemie zum Markieren von DNA mit Reagenzien, die eine funktionelle Diazomethyl-Gruppe tragen.
Beispiel 12: Markierung und Fragmentierung von DNA-Amplicons, die durch PCR-Amplifikation erhalten wurden, mit dem Markierungsreagens meta-BioPMDAM (3a):
Das Derivat meta-BioPMDAM (3a) wurde gemäß dem in Beispiel 1.1 beschriebenen Reaktionsschema erhalten.
Die DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll erhalten.
Beispiel 12.1: Vergleich der Markierung mit und ohne Fragmentierung:
a. Markierung unter Fragmentierungsbedingungen:
Zu 10 μl PCR werden 50 μl Natriumformiat pH 3 (50 mM) und 2 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) hinzugegeben. Das Volumen wird auf 10 μl eingestellt. Die Lösung wird für 30 Minuten bei 60°C inkubiert.
b. Markierung ohne Fragmentierung
Zu 10 μl PCR werden 2 μl Meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) hinzugegeben. Das Volumen wird auf 100 μl eingestellt. Die Lösung wird für 30 Minuten bei 60°C inkubiert.
Der Rest des Protokolls ist identisch mit dem von Beispiel 9. Ergebnisse Tabelle 3: Vergleich der Markierung mit und ohne Fragmentierung
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass, ohne Fragmentierung, das Mittel der erhaltenen Intensitäten sich auf dem gleichen Niveau befindet wie das Hintergrundrauschen (500 rfu). Die Markierung während der Fragmentierung ergibt ein viel höheres Intensitätsniveau (4000 rfu) und eine sehr gute prozentuale Homologie. Die Kombination der zwei Schritte stellt in der Tat deshalb eine signifikante Verbesserung für den Nachweis einer Nukleinsäure mit einer Länge, von mehr als 100 Nukleotiden dar.
Beispiel 12.2: Wirkung der Denaturierung vor Hybridisierung auf einem DNA-Chip:
Zwei Markierungsreaktionen wurden parallel in zwei getrennten Röhrchen gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt: zu 10 μl PCR werden 50 μl Natriumformiatpuffer pH 3 (50 mM) und 2 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) hinzugegeben. Das Gesamtvolumen wird auf 100 μl eingestellt und für 30 bei 60°C inkubiert.
Nach Reinigung über eine Säule (Beispiel 9) wird die sich aus dem ersten Röhrchen ergebende Lösung für 10 Minuten bei 95°C inkubiert (um den DNA-Doppelstrang zu entpaaren) und dann wird das Röhrchen in eine Mischung aus Wasser und Eis bei 0°C bis zur Hybridisierung auf dem DNA-Chip eingetaucht.
Die sich aus dem zweiten Röhrchen ergebende Lösung wird auf dem DNA-Chip ohne vorherige Denaturierung hybridisiert. Die biotinylierten Fragmente, die an die Fangsonden an der Oberfläche des DNA-Chips hybridisiert sind, werden nachgewiesen durch Einführen eines Streptavidins, das mit Phycoerythrin markiert ist, unter Verwendung der in Beispiel 9 beschriebenen Bedingungen. Ergebnisse Tabelle 4: Wirkung von Denaturierung vor Hybridisierung auf einem DNA-Chip
Die in Tabelle 4 angegebenen erhaltenen Ergebnisse sind mit der Prähybridisierungs-Denaturierung höher als jene, die ohne den Denaturierungsschritt erhalten werden. Dies zeigt, dass die Denaturierung der DNA erforderlich ist, um ein gutes Intensitätsniveau zu erreichen. Die Fragmentierung vermittels der abasischen Stellen ist ein Mittel, um die Denaturierung einer doppelsträngigen DNA zu erleichtern und die Hybridisierung an die Fangsonden zu verstärken.
Um andere Markierungsreagenzien zu testen, und unter Berücksichtigung der unter den verschiedenen obigen Bedingungen erhaltenen Ergebnisse, definierten wir ein Referenzprotokoll unter Verwendung von Fragmentierung mit Natriumformiatpuffer (50 mM, pH 3) und einem Prähybridisierungs-Denaturierungsschritt.
Beispiel 13: Markierung und Fragmentierung des PCR-Amplicons mit dem biotinylierten Reagens in einem Ein-Schritt-Protokoll:
Die meta-, ortho- und para-BioPMDAM-Derivate wurden hergestellt gemäß dem in den Beispielen 1.1, 1.2 und 1.3 beschriebenen Protokoll. Sie wurden in wasserfreiem DMSO bei einer Konzentration von 100 mM solubilisiert.
Das Protokoll ist identisch mit dem von Beispiel 12.2 oben (Markierung und Fragmentierung in einem einzigen Schritt, gefolgt von einem Prähybridisierungs-Denaturierungsschritt). Ergebnisse Tabelle 5: Markierung und Fragmentierung des PCR-Amplicons mit dem biotinylierten Reagens in einem Ein-Schritt-Protokoll
Das optimierte Protokoll mit Markierung und Fragmentierung in einem einzelnen Schritt ergibt ausgezeichnete Ergebnisse mit verschiedenen Markierungsreagenzien, die die reaktive funktionelle Diazomethyl-Gruppe enthalten, wie die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse zeigen.
Beispiel 14: Markierung und Fragmentierung der DNA mit BioDPDAM
Die DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem im Beispiel 5 beschriebenen Protokoll hergestellt.
Die Synthese des Markierungsreagens ist in Beispiel 1 beschrieben.
Das Protokoll ist identisch mit dem von Beispiel 12.1, einschließlich des Denaturierungsschrittes bei 95°C vor dem Hybridisierungsschritt. Ergebnisse Tabelle 6: Markierung und Fragmentierung von DNA mit dem BioDPDAM
Dieses Ergebnis, beschrieben in Tabelle 6, zeigt, dass Substitutionen so wichtig wie die Phenylgruppe verwendet werden können, um die Reaktivität des Markierungsreagens zu optimieren, das eine funktionelle Diazomethangruppe trägt.
Beispiel 15: Markierung und Fragmentierung von DNA mit 5-(Brommethyl)fluoreszein:
Die DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll hergestellt.
Zu 10 μl PCR wurden 50 μl Natriumformiat pH 3 (100 mM) und 2 μl 5-(Brommethyl)fluoreszein (Molecular Probes, Eugen, OR) (100 mM in DMSO) hinzugegeben. Das Volumen wurde auf 100 μl eingestellt. Die Lösung wird für 30 min bei 60°C inkubiert.
Die Reinigungsbedingungen stimmen mit denen von Beispiel 9 überein. Ein Denaturierungsschritt wird wie in Beispiel 12.2 beschrieben durchgeführt.
Die anderen Bedingungen für Hybridisierung und Auslesen sind identisch mit jenen, wie sie im Artikel von A. Troesch et al. J. Clin. Microbiol., 37 (1), S. 49–55 1999 beschrieben sind. Die Fluoreszenz ist direkt auf dem Lesegerät nachweisbar. Tabelle 7: Markierung und Fragmentierung von DNA mit 5-(Brommethyl)fluoreszein
Dieses Ergebnis von Tabelle 7 zeigt, dass die Fragmentierung von DNA durch die Erzeugung von abasischen Stellen vollständig kompatibel ist mit einem Markierungsreagens, das eine reaktive funktionelle Alkylhalogenidgruppe trägt. Dieses Protokoll wird in einem Schritt (Fragmentierung und Markierung) realisiert, aber mit Intensitäten, die niedriger sind als mit Markern, die eine funktionelle Diazomethylgruppe tragen.
Beispiel 16: Markierung und Fragmentierung der DNA-Amplicons in Gegenwart von einem anderen chemischen Fragmentierungsreagens, das von Phenanthrolin abgeleitet ist:
DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll hergestellt. Zwei Arten von Bedingungen werden verwendet:
Bedingungen a:
Zu 10 μl PCR werden 20 μl Phenanthrolin-FeSO₄ (25 mM) und 2 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) hinzugegeben. Das Gesamtvolumen wird auf 100 μl eingestellt. Die Mischung wird für 60 min bei 95°C inkubiert.
Bedingungen b:
Zu 10 μl PCR werden 50 μl Natriumformiatpuffer pH 3 (100 mM in reinem Wasser) und 2 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) hinzugegeben. Das Gesamtvolumen wird auf 100 μl eingestellt. Die Mischung wird für 60 min bei 95°C inkubiert.
Die anderen Bedingungen für das Protokoll sind identisch zu jenen von Beispiel 9. Tabelle 8: Markierung und Fragmentierung der DNA-Amplicons in Gegenwart von Phenanthrolin
Die zwei Fragmentierungsbedingungen erlauben ein zufriedenstellendes Ergebnis, wie in Tabelle 8 gezeigt.
Die besten Ergebnisse werden mit Bedingungen (b) unter Verwendung der Fragmentierung bei saurem pH erhalten.
Beispiel 17: Fragmentierung der PCR-Amplicons, die durch Einbau von d-UTP-Fluoreszein markiert sind:
Einbau der markierten Nukleotide
Eine PCR-Amplifikation wurde gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt, um PCR-Amplicons zu erhalten, die mit Fluoreszein markiert sind (Markierung an den Basen).
Ausgehend von genomischer 16S-Ziel-DNA von Mycobacterium tuberculosis (10⁴ Kopien) unter Verwendung des Fast Start-Kits von Roche, 0,2 mM der Desoxyribonukleotide d-ATP, d-CTP und d-GTP ebenso wie 0,14 mM d-TTP und 0,06 mM d-UTP-12-Fluoreszein, 0,3 μM Primer und 0,4 μl Enzym. Der Prozentsatz an markiertem Nukleotid relativ zu seinem natürlichen Homolog d-UTP beträgt 30 %. Dieses Verhältnis wird üblicherweise bei Reaktionen zum Markieren von Amplicons durch Einbau der markierten Nukleotide verwendet.
Das d-UTP-12-Fluoreszein ist kommerziell erhältlich von Roche Diagnostics (Referenz 1373242, Mannheim, Deutschland).
Die Parameter für die PCR sind jene von Beispiel 5.
a. Fragmentierung der PCR-Amplicons, die zu 30 % d-UTP-Fluoreszein-markiert sind:
Zu 10 μl PCR werden 50 μl Natriumformatpuffer pH 3 (50 mM) hinzugegeben. Das Volumen wird auf 100 μl eingestellt. Die Lösung wird dann für 30 min bei 60°C inkubiert.
b. Markierung während der Fragmentierung der PCR-Amplicons, die 30 % d-UTP-Fluoreszein enthalten:
Zu 10 μl PCR werden 50 μl Natriumformatpuffer pH 3 (50 mM) und 50 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) hinzugegeben. Das Volumen wird auf 100 μl eingestellt. Die Lösung wird dann für 30 min bei 60°C inkubiert. Dieser Versuch entspricht einem Referenzprotokoll, das es erlaubt, verschiedene Markierungsstrategien zu vergleichen, indem die Variabilität infolge des Amplifikationsschrittes dispensiert wird.
Ein Reinigungsschritt auf einer Säule und ein Denaturierungsschritt bei 95°C werden in allen Fällen wie in Beispiel 9 durchgeführt.
Protokoll (a1):
Die durch Fragmentierung der mit d-UTP-Fluoreszein markierten Amplicons erhaltenen Nukleinsäuren (Bedingungen a)) werden auf einem DNA-Chip hybridisiert und in erster Instanz durch direktes Auslesen der Fluoreszenzsignale nachgewiesen, die durch das Fluoreszein emittiert werden, wie in Beispiel 15 beschrieben.
Protokoll (a2):
Ein Signalamplifikationsschritt wurde verwendet, um die Markierungsempfindlichkeit zu verbessern. Die Amplifikation des Signals wurde realisiert, indem, während des Hybridisierungsschrittes, ein biotinylierter anti-Fluorescein-Antikörper (Referenz 216-065-084, Jackson ImmunoResearch), und dann ein Streptavidin, das mit Phycoerythrin markiert ist, unter Verwendung der folgenden sukzessiven Bedingungen eingeführt wurde:

– 300 μl reines Wasser,
– 300 μl 100 mM Tris-Puffer pH 7/1 M NaCl/0,05 % Tween/0,005 % Antischaum, 2,4 μl BSA (50 mg/ml), 1,2 μl biotinylierter anti-Fluoreszein-Antikörper (1 mg/ml),
– 300 μl reines Wasser, und
– 300 μl 100 mM Tris-Puffer pH 7/1 M NaCl/0,05 % Tween/0,005 % Antischaum, 6 μl BSA (50 mg/ml); 6 μl Streptavidin-PE (300 μg/ml).

In diesem Protokoll fungiert das Fluoreszein als ein Hapten (Markierung, die indirekt mit einem markierten Antikörper nachweisbar ist) und nicht als ein Fluorophor.
Protokoll (b):
Die biotinylierten Fragmente (Bedingung b), die auf einem DNA-Chip hybridisiert sind, werden nachgewiesen durch Einführen eines Strepavidins, das mit Phycoerythrin markiert ist, unter Verwendung der folgenden Bedingungen:

– 300 μl reines Wasser, und
– 300 μl 100 mM Tris-Puffer pH 7/1 M NaCl/0,05 % Tween/0,005 % Antischaum; 6 μl BSA (50 mg/ml); 6 μl markiertes Streptavidin-PE (300 μg/ml).

Das Auslesen der an der Oberfläche des DNA-Chips emittierten Fluoreszenz nach Markierung und Hybridisierung, ebenso wie die Erzeugung von Daten bezüglich Signalintensität und Prozent Homologie werden durchgeführt durch die Auslesesysteme und die Software, wie sie von Affymetrix bereitgestellt werden. In diesem Kontext ist es wichtig festzustellen, dass das Auslesesystem, das verwendet wurde, zwei Filter enthält, die erlauben, direkt nachzuweisen:

– Fluoreszein in dem Fall, wo die Amplicons mit d-UTP-Fluoreszein alleine markiert sind, gemäß Protokoll al, oder alternativ
– Phycoerythrin in dem Falle, wo die Amplicons markiert sind:
– mit d-UTP-Fluorescein mit Amplifikation des Signals gemäß Protokoll a2, oder
– mit meta-BioPMDAM während ihrer Fragmentierung, gemäß Protokoll b.

In den zwei Fällen, in denen eine Visualisierung durchgeführt wurde unter Verwendung von Phycoerythrin, erlaubt die Verwendung eines Filters, sich von dem Signal zu befreien, das durch Fluoreszenz erzeugt wird, und es ist tatsächlich das Phycoerythrinsignal, das nachgewiesen wird. Ergebnisse Tabelle 9: Fragmentierung der PCR-Amplicons, die durch Einbau von d-UTP-Fluoreszein markiert sind
Die obigen Ergebnisse von Tabelle 9 zeigen, dass die chemische Fragmentierung, die die Erzeugung einer eine abasischen Stelle verwendet, kompatibel ist mit dem enzymatischen Markieren der DNA-Amplicons, und dass die Markierung vor der Fragmentierung erfolgen kann.
Die Intensitätsniveaus ebenso wie der Prozentsatz Homologie, die mit diesem Protokoll für enzymatischen Einbau des Fluorophors erhalten werden, sind niedrig verglichen mit jenen, die mit der Markierung während der Fragmentierung unter Verwendung des Markierungsreagens mit einer funktionellen Diazomethylgruppe, wie beispielsweise meta-BioPMDAM, erhalten werden (Bedingungen (b)).
Um das Intensitätsniveau zu erreichen, das mit dem meta-BioPMDAM-Derivat erhalten wird, ist ein Schritt für die Amplifikation des Signals erforderlich (Bedingungen a2). Dies zeigt in der Tat die Wirksamkeit der reaktiven funktionellen Diazomethylgruppe verglichen mit dem herkömmlichen Einbau der modifizierten Base wie beispielsweise d-UTP-Fluoreszein (Referenzprotokoll (b)).
Beispiel 18: Fragmentierung von doppelsträngiger DNA durch Beschallung:
DNA-Amplicons wurden erhalten unter Verwendung des in Beispiel 5 beschriebenen Protokolls. Diese Amplicons wurden fragmentiert durch Beschallung in Gegenwart und in Abwesenheit des Markers.
a. Markierung von PCR-Amplicons während Beschallung:
Zu 10 μl PCR-Reaktion wurden 2 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) hinzugegeben. Das Volumen wird auf 100 μl mit reinem Wasser eingestellt. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt. Die Mischung wird für 30 min bei 60°C in einem Ultraschallbad inkubiert (Frequenz 35 kH, Modell T460-H, Bioblock, Frankreich).
b. Markierung während chemischer Fragmentierung des PCR-Amplicons (Einschrittreferenzprotokoll):
Zu 10 μl PCR-Reaktion werden 50 μl Natriumformat pH 3 (50 mM) und 2 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) hinzugegeben. Das Volumen wird auf 100 μl eingestellt. Die Lösung wird für 30 min bei 60°C inkubiert.
Die Versuche werden doppelt durchgeführt, um in der Lage zu sein, die Fragmentierung der DNA auf einem Gel und die Wirksamkeit der Markierung durch Hybridisierung und Auslesen des DNA-Chips zu analysieren, wie oben beschrieben (Beispiel 9 bezüglich Phycoerythrinnachweis).
Analyse auf einem Gel
Die Analyse wurde durchgeführt auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel (8 % Polyacrylamid, 7 M Harnstoff, 1 × TBE) unter Verwendung von Ethidiumbromidfärbung.
Die Gelanalyse zeigt, dass die DNA-Amplicons durch Beschallung bei 60°C fragmentiert werden. Ergebnisse Tabelle 10: Fragmentierung von doppelsträngiger DNA durch Beschallung
Die Markierungsergebnisse von Tabelle 10 während Beschallung (Bedingungen a) sind zufriedenstellend. Dies zeigt, dass die physikalische Fragmentierung durch Beschallung der DNA-Ziele kompatibel ist mit der Chemie der Markierung mit Markierungsreagenzien, die eine funktionelle Diazomethylgruppe tragen.
Die schwachen Markierungsergebnisse in diesem Falle beruhen sicher auf der Tatsache, dass der Marker unter der Wirkung des Ultraschalls abgebaut wird. Die Ergebnisse mit Fragmentierung durch Erzeugung einer abasischen Stelle durch die Wirkung von saurem pH sind besser.
Beispiel 19: Markierung, Fragmentierung und Denaturierung von DNA in einem einzigen Schritt:
Die DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll erzeugt.
Zwei Markierungsreaktionen wurden durchgeführt:
a. Markierung, Fragmentierung und Denaturierung bei 95°C in einem einzelnen Schritt:
Zu 10 μl PCR werden 50 μl Natriumformatpuffer pH 3 (50 mM) und 2 μl meta-BioPMDAM-Marker (100 mM in wasserfreiem DMSO) hinzugegeben. Das Endvolumen wird auf 100 μl eingestellt. Die Lösung wird dann für 30 min bei 95°C inkubiert. In diesem Falle wurde die Reaktionsmischung auf einem DNA-Chip ohne vorherige Denaturierung hybridisiert.
b. Markierung und Fragmentierung bei 60° C:
Zu 10 μl PCR wurden 50 μl Natriumformatpuffer pH 3 (50 mM) und 2 μl meta-BioDPDAM-Marker (100 mM in wasserfreiem DMSO) hinzugegeben. Das Endvolumen wird auf 100 μl eingestellt. Die Lösung wird dann für 30 min bei 60°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde dann gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll gereinigt. Bei diesem Protokoll und vor Hybridisierung auf einem DNA-Chip wurden die DNA-Fragmente gemäß dem in Beispiel 12.2 beschriebenen Protokoll denaturiert. Ergebnisse Tabelle 11: Markierung, Fragmentierung und Denaturierung von DNA in einem einzigen Schritt
Beispiel 12.2 zeigte die Bedeutung der Fragmentierung der doppelsträngigen DNA für die Nachweisempfindlichkeit. Diese Ergebnisse in Tabelle 11 zeigen, dass mit dem Fragmentierungsansatz durch Erzeugen einer abasischen Stelle die Markierung, Fragmentierung und Denaturierung von DNA in einem einzigen Schritt durchgeführt werden kann, ohne die Nachweisempfindlichkeit zu beeinträchtigen was eine beachtliche Verbesserung vom Standpunkt der Einfachheit und der für den Anwender erforderlichen Zeit darstellt. Beispiel 20: Synthese von para-Bio-EG3-PDAM:
• Schützen von 4-Carboxylbenzaldehyd:
Das 4-Carboxybenzaldehyd ist kommerziellen Ursprungs. Es ist in einer Lösung aus Trimethylsilylchlorid (10 g, 92 mMol) in 100 ml MeOH gelöst (3 g; 20 mMol). Die Mischung wird für 40 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdampfen wird ein weißer Feststoff entsprechend 4-Methoxycarbonylbenzaldehyd 24 isoliert, das durch NMR charakterisiert wird und in der nächsten Reaktion, so wie es ist, verwendet wird.
¹H NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 10,07 (s, 1H, -CHO); 8,17 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,92 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 3,93 (s, 3H, CO-O-CH₃).
• Schützen von 4'-Methoxycarbonylbenzaldehyd:
Das 4-Methoxycarbonylbenzaldehyd (3,35 g; 20 mMol) wird in Trimethylorthoformiat (4,8 g; 40 mMol) in Gegenwart von Dowex 50WX8-100 (1 g) gelöst. Die Mischung wird unter Rückfluss für 2 h erhitzt und dann filtriert und verdampft. Nach einem Kristallisierungsversuch zeigt die NMR-Analyse, dass die Reaktion nicht vollständig ist und die letztere wird erneut in 30 ml MeOH, 30 ml CH(OMe)₃ und 1 g Dowex 50WX8-100 bei Raumtemperatur angesetzt. Die Filtration und dann die Verdampfung werden ausgeführt, um 3,55 g (16,89 mMol, 84 %) vom Produkt 25 zu erhalten.
¹H NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 8,01 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,50 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 5,41 (s, 1H, CH); 3,93 (s, 3H, -CO-O-CH₃); 3,29 (s, 6H, -O-CH₃).
• Verbindung 26:
Man solubilisiert Verbindung 25 (3,1 g, 14,8 mMl) in 16 ml (73 mMl) 4,7,10-Trioxa-1,13-Tridecandiamin. Die erhaltene Lösung wird auf 140–150°C für 2 h erhitzt. Die Mischung wird dann in 100 ml DCM (Dichlormethan oder CH₂Cl₂) gelöst und sechsmal mit 10 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO₄ getrocknet und dann eingedampft, bis ein Öl erhalten wird. Dieses Öl wird mit Pentan dreimal nacheinander gewaschen, gefolgt von Dekantierung und dann wird eine neue Extraktion mit DCM und H₂O durchgeführt. Nach Trocknen über MgSO₄ und Verdampfen wird das Produkt 26 mit einer Ausbeute von 63 % (9,27 mMol) erhalten.
¹H NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 7,78 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,46 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 5,39 (s, 1H, CH); 3,62–3,47 (m, 14H, H_{7',8',10',11'} und H_5',13' und H_3'); 3,29 (s, 6H, -O-CH₃); 2,72 (m, 2H, H_15') 1,87 (m, 2H, H_4'); 1,64 (m, 2H, H_14'); 1,30 (großes s, 2H, NH₂).
• Biotinylierte Verbindung 27:
Biotin (500 mg, 2,05 mMol) wird in 10 ml DMF suspendiert und dann 365 mg (2,25 mMol) CDI hinzugegeben. Diese Lösung wird für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Verbindung 26 (900 mg, 2,26 mMol) wird in 1 ml DMF gelöst und dann Tropfen für Tropfen zu der vorherigen Lösung hinzugegeben. Die solchermaßen erhaltene Mischung wird für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdampfen wird eine Flash-Chromatographie auf einer Säule (Säulendurchmesser 20 mm) mit 250 ml MeOH-DCM 6 % durchgeführt und dann mit 200 ml MeOH-DCM 7 % und schließlich mit 200 ml MeOH-DCM 8 %. Die Fraktionen entsprechend Produkt 27 werden vereinigt und dann bis zur Trockne eingedampft, um 1,00 g Öl mit einer Ausbeute von geschätzt 50 % zu ergeben.
¹H NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 9,50 (großes s, 1H, NH_Imidazol); 7,80 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,64 (s, 1H, H_Imidazol); 7,46 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5 und 1H, NH_2'); 7,05 (s, 2H, H_Imidazol); 6,76 (t, 1H, NH_16'), 6,20 (großes s, 1H, NH _B1); 5,44 (großes s, 1H, NH _B3); 5,37 (s, 1H, CH); 4,42 (m, 1H, H_B6a); 4,24 (m, 1H, H_B3a); 3,59–3,44 (m, 14H, H_{7',8',10',11'} et H_5',13' und H_3'); 3,29 (m, 8H, H_15' und 2-O-CH₃); 3,07 (m, 1H, H_B4); 2,84 und 2,66 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,13 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,85 (m, 2H, H_4'); 1,66 (m, 2H, H_14'); 1,40–1,37 (m, 6H, H_{B7, B8, B9}).
• Aldehydverbindung 28:
Das Acetal 27 wird in 50 ml Chloroform gelöst und dann werden 20 ml 2N HCl hinzugegeben. Die Zweiphasenmischung wird heftig für 15 min gerührt. Die organische Phase wird wiedergewonnen und über wasserfreiem NaHCO₃ getrocknet. Sie wird filtriert, verdampft und Verbindung 28 wird erhalten in der Form einer Paste (495 mg; 0,855 mMol) mit einer Gesamtausbeute von 42 % ausgehend von Biotin.
¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ = 10,05 (s, 1H, CHO); 7,98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,92 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 7,58 (t, 1H, NH_2'); 6,46 (t, 1H, NH_16'), 6,02 (großes s, 1H, NH _B1); 5,19 (großes s, 1H, NH _B3); 4,46 (m, 1H, H_B6a); 4,27 (m, 1H, H_B3a); 3,66–3,56 (m, 10H, H_7', _8',10',11' und H_5'); 3,50–3,29 (m, 4H, H_3',13'); 3,28 (m, 2H, H_15'); 2,95 (m, 1H, H_B4); 2,84 und 2,71 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,15 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,89 (m, 2H, H_4'); 1,72–1,63 (m, 6H, H_14', H_B7,B9); 1,23 (m, 2H, H_B8).
• Hydrazonverbindung 29:
Der Aldehyd 28 (495 mg; 0,855 mMol) wird in 10 ml absolutem Ethanol gelöst. Hydrazin (350 μl; 7,20 mMol) werden hinzugegeben und dann die Reaktionsmischung unter Rückfluss für 1 h erhitzt. Das nach Verdampfung erhaltene Öl wird in absolutem Ethanol gelöst, um erneut verdampft zu werden. Ein Schaum wird erhalten, der mit Pentan verrieben wird. Eine dem Produkt 29 (511 mg; 0,862 mMol) entsprechende Paste wird mit einer Ausbeute von 100 % erhalten.
¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ = 7,76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,72 (s, 1H, CH); 7,56 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 7,34 (t, 1H, NH_2'); 6,45 (t, 1H, NH_16'), 5,98 (großes s, 1H, NH _B1); 5,78 (großes s, 2H, NH₂); 5,18 (großes s, 1H, NH _B3); 4,44 (m, 1H, H_B6a); 4,26 (m, 1H, H_B3a); 3,62–3,56 (m, 10H, H_7',8'10'11' und H_5'); 3,48–3,45 (m, 4H, H_3',13'); 3,27 (m, 2H, H_15') 3,07 (m, 1H, H_B4); 2,84 und 2,68 (System ABX, 2H, ²J_AB= 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,11 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,86 (m, 2H, H_4'); 1,72–1,59 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1,21 (m, 2H, H_B8).
• Diazoverbindung 30:
Das Hydrazon 29 (357 mg; 0,602 mMol) wird in 17,5 ml DMF solubilisiert. MnO₂ (700 mg; 7,7 mMol) wird dann hinzugegeben. Nach Rühren für 12 min bei Raumtemperatur wird die Mischung auf Millipor filtriert, der Celite (Stärke: 2 cm) enthält und 3 Å (0,5 cm) pulverisierten Molekularsieb enthält. Die Reaktionsmischung wird bis zur Trockne eingedampft. Das erhaltene Restöl wird mit Ether dreimal nacheinander gewaschen. Die Verbindung 30 (295 mg, 0,491 mMol) wird in der Form eines leicht rosa farbenen Feststoffes mit einer Ausbeute von 82 % erhalten.
¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ = 8,28 (t, 1H, NH_2'); 7,77 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,74 (t, 1H, NH_16'); 7,00 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 6,38 (großes s, 1H, NH _B1); 6,32 (großes s, 1H, NH _B3); 5,80 (s, 1H, CH-N₂); 4,27 (m, 1H, H_B6a); 4,11 (m, 1H, H_B3a); 3,51–3,44 (m, 10H, H_{7',8',10',11'} und H_5'); 3,37 (m, 2H, H_15'); 3,32 (m, 4H, H_3',13'); 3,05 (m, 1H, H_B4); 2,79 und 2,58 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,02 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,69 (m, 2H, H_4'); 1,59–1,48 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1,25 (m, 2H, H_B8).
Die Reaktivität der Verbindung 30 wurde getestet an 3'-Uridinmonophosphat und durch Kapillarelektrophorese überwacht. Die Analysebedingungen sind jene von Beispiel 6.1. Die Ergebnisse zeigen eine Halbwertszeit von 45 min.
Das Reagens ist bei –20°C für wenigstens 1 Monat stabil.
Beispiel 21: Markierung und Fragmentierung von DNA-Amplicons mit dem Markierungsreagens para-Bio-EG3-PDAM:
Die Hauptvorteile dieser Art von Molekülen, d. h. PDAM-Derivate, die einen Polyethylenglycol-basierten Verbindungsarm tragen, bestehen darin, dass sie erlauben, dass die funktionelle Diazogruppe und das Biotin räumlich voneinander getrennt sind und die Löslichkeit und bei der letztendlichen Analyse die Reaktivität dieser Moleküle erhöht ist.
Das para-Bio-EG3-PDAM-Derivat 30 wurde gemäß dem in Beispiel 20 beschriebenen Reaktionsschema erhalten. Die DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll erhalten. Zwei Markierungsreaktionen wurden durchgeführt.
a. Markierung mit dem para-Bio-EG3-PDAM-Reagens:
Zu 10 μl PCR wurden 10 μl para-Bio-EG3-PDAM (100 mM in DMSO) und 77 μl Dnase/Rnase-freies Wasser hinzugegeben. Die Lösung ist homogen und weist keine Niederschläge auf. Diese Lösung wird für 10 min bei 95°C inkubiert und dann werden 3 μl 0,1 M HCl hinzugegeben und die Lösung wird für 10 min bei 95°C inkubiert.
Der Rest des Protokolls ist identisch zu dem von Beispiel 8.
b. Markierung mit dem meta-BioPMDAM-Reagens:
Zu 10 μl PCR werden 10 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) und 77 μl Dnase/Rnase-freies Wasser hinzugegeben. Die Synthese dieses Produktes ist in Beispiel 1.1 erwähnt. Die Lösung weist einen geringen Niederschlag auf. Diese Lösung wird für 10 min bei 95° C inkubiert. 3 μl 0,1 M HCl werden dann hinzugegeben und die Lösung für 10 min bei 95° C inkubiert.
Der Rest des Protokolls ist identisch zu dem von Beispiel 8. Ergebnisse: Tabelle 12: Vergleichsstudie der Markierung und Fragmentierung von DNA-Amplicons mit para-Bio-EG3-PDAM und meta-BioPMDAM
Die Signalintensitäten, die in dieser Tabelle 12 erhalten sind, sind sehr zufriedenstellend und der Prozentsatz Homologie ist sehr hoch. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Einführung eines Polyethylenglycolarms auf dem Diazomarkierungsmolekül es ermöglicht, die Löslichkeit des Reagens in wässriger Phase zu erhöhen. Der Test ist deshalb homogen. Weiterhin erlaubt die Erhöhung der Löslichkeit, die Reaktivität der Markierung zu erhöhen. Beispiel 22: Synthese von anderen PDAM-Derivaten, die einen Verbindungsarm auf der Grundlage von Polyethylenglycol enthalten: Beispiel 22.1: Synthese von meta-Bio-EG3-PMDAM: Syntheseschema
• Verbindung 68:
3-Aminoacetophenon (14,5 g, 107 mMol) werden in 50 ml wasserfreiem DMF solubilisiert. Bernsteinsäureanhydrid (10,7 g, 107 mMol) werden hinzugegeben und die Mischung wird fortgesetzt unter Argon und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 6 h wird die Lösung unter Vakuum konzentriert und 50 ml Methanol werden hinzugegeben. Das erhaltene Präzipitat wird abfiltriert und mit Methanol und Ether gewaschen. 19,4 g (81 %) des Produktes 68 werden so in der Form eine Pulvers erhalten, das eine gebrochen weiße Farbe aufweist.
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): d = 2,5–2,6 (m, 7H); 7,45 (t, 1H); 7,64 (d, 1H); 7,83 (d, 1H); 8,19 (s, 1H); 10,16 (s, 1H); 12,12 (s, 1H).
• Verbindung 69:
5,07 g (22 mMol) von Verbindung 68 werden in 10 ml wasserfreiem DMF unter Argon solubilisiert. Die Mischung wird auf Eis gegeben und 5,00 g (32 mMol) Carbonyldiimidazol hinzugegeben. Nach 20 Minuten werden 20 ml (94,6 mmol) 4,7,10-Trioxatridecandiamin (EG₃) langsam hinzugegeben. Nach 3 stündiger Reaktion bei Raumtemperatur wird das DMF verdampft und der Rest in 100 ml CH₂CL₂ aufgenommen. Extraktionen wurden mit gesättigtem NaHCO₃ und H₂O durchgeführt, woraufhin die organische Phase mit wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft wird. 4,34 g (46 %) des Produktes 69 werden so erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): d 0 1,59 (m, 2H); 1,87 (m, 2H); 2,16 (s, 3H); 2,40 (m, 2H); 2,55 (m, 2H); 3,08 (m, 2H); 3,45 (m, 16H); 7,30 (t, 1H); 7,42 (d, 1H); 7,70 (d, 1H); 7,83 (t, 1H); 7,97 (s, 1H); 10,00 (s, 1H).
• Biotinylierte Verbindung 70:
D-Biotin (1,0 g, 4,1 mMol) werden in 10 ml wasserfreiem DMF unter Argon solubilisiert. Die Mischung wird auf Eis abgekühlt und Carbonyldiimidazol (CDI) (0,665 g, 4,1 mMol) in 10 ml wasserfreiem DMF werden hinzugegeben. Nach 15 Minuten wird Verbindung 69 (1,8 g, 4,1 mMol) in 2 ml wasserfreiem DMF hinzugegeben. Man erlaubt, dass die Reaktion für 3 Stunden bei 35°C fortschreitet und dann wird DMF verdampft und der Rest in 100 ml CH₂CL₂ aufgenommen. Extraktionen werden mit gesättigtem NaHCO₃ und H₂O durchgeführt, woraufhin die organische Phase über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft wird. NMR-Charakterisierung des solchermaßen erhaltenen Produktes zeigt, dass eine Mischung von Produkt 70 und freiem EG₃ erhalten wird. Ein weiterer Reinigungsschritt wird durchgeführt, bevor die Synthese fortgesetzt wird.
Das Endprodukt, meta-Bio-EG₃-PMDAM wird nach zwei Syntheseschritten gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Schema erhalten.
Der Vorteil dieser Synthese ist zweifach. Einerseits wird Produkt 69 in nur zwei Schritten erhalten; dieses Produkt kann verwendet werden als Vorläufer des Diazos mit der Möglichkeit, daran nachweisbare Moleküle unterschiedlicher Art vermittels der terminalen Amingruppe zu befestigen. Diese Gruppe erlaubt auch, Verbindung 69 auf feste Träger aufzupfropfen mit dem Ziel der Immobilisierung von Nukleinsäuren. Andererseits besitzt Verbindung 71 das gleiche reaktive Zentrum wie meta-Bio-PMDAM (unser Referenzmolekül), was die Analyse der mit dem Einschluss des Ethylenglycols (EG₃)-Arms verbundenen Vorteile erleichtert.
Das Reagens ist bei –20°C für wenigstens einen Monat stabil. Beispiel 22.2: Synthese von Meta-Bio-EG4-PMDAM: Syntheseschema:
• Schützen des 3-Nitro-acetophenons 13:
33 g (0,20 mol) 3-Nitro-acetophenon werden in 400 ml Toluol gelöst und dann 40 ml (0,717 mol) Ethylenglycol und 600 mg (3,15 mMol) para-Toluolsulfonsäure (PTSA) hinzugegeben. Ein Dean Stark-System wird angebracht. Die Lösung wird für 3 Stunden bei 130°C erhitzt. Nachdem man erlaubt hat, dass die Lösung auf Raumtemperatur zurückgeht, werden 400 ml Ethylacetat hinzugegeben und dann wird die Lösung mit 8 ml gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO₄ getrocknet. Nach Verdampfen wird ein bleicher gelber Stoff 13 erhalten (39,72 g; 0,190 mol) mit einer Ausbeute von 95 %.
¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 7,11 (t, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 6,87–6,78 (m, 2H, Ar-H); 6,59 (dd, 1H, J = 6,5 Hz, Ar-H); 4,00 (m, 2H, H ₂C_Acetal); 3,79 (m, 2H, H ₂C_Acetal); 1,61 (s, 3H, CH₃).
• Herstellen des Amins 14:
Verbindung 13 (39,7 g; 0,190 mol) wird in 500 ml EtOH gelöst und dann 1 g von 10 % Palladium auf Kohlenstoff hinzugegeben. Die Mischung wird erhitzt, um das Ganze zu lösen und dann erlaubt man, dass die Lösung auf Raumtemperatur zurückkehrt. Nachdem ein Vakuum erzeugt worden ist und die Lösung unter H₂ gegeben worden ist, wird sie heftig für 5 Stunden weitergerührt. Die Lösung wird dann im heißen Zustand filtriert und verdampft. Das Produkt 14 wird mit Pentan gewaschen und in der Form eines Feststoffes (34 g, 0,189 mol) mit einer Ausbeute von 99 % isoliert.
¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 7,14 (t, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 6,85 (m, 2H, J = 7,5 Hz, Ar-H); 6,79 (s, 1H, Ar-H); 6,59 (dd, 1H, J = 6,5 Hz, Ar-H); 4,00 (m, 2H, H ₂C_Acetal); 3,77 (m, 2H, H ₂C_Acetal); 1,61 (s, 3H, CH₃).
• Bromierte Verbindung 15:
Das Amin 14 (12,3 g; 68,7 mMol) und Triethylamin (7 g; 69 mMol) werden in 150 ml DCM unter Argon gelöst. Eine Lösung von 13,8 g (60 mMol) Bromacetylbromid, gelöst in 150 ml DCM, wird tropfenweise bei –5°C hinzugegeben. Am Ende des Hinzugebens werden 100 ml wässriges 1N NaHCO₃ hinzugegeben. Die organische Phase wird zweifach nacheinander mit wässrigem NaHCO₃ gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Eindampfen bis zur Trockne werden 22,6 g eines braunen Öls entsprechend Verbindung 15 erhalten und dieses so wie es ist, für die nächste Reaktion verwendet.
¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 8,29 (s groß, 1H, NH); 7,62 (dt, 1H₄, J = 5 Hz, Ar-H); 7,47 (s, 1H, Ar-H₂); 7,38–7,19 (m, 2H, Ar-H_5,6); 4,00 (m, 2H, Br-CH ₂); 3,75 (m, 4H, H ₂C-H ₂C_Acetal); 1,61 (s, 3H, CH₃).
• Alkoholverbindung 16:
Natriumhydrid (3,3 g; 82,5 mMol) wird dreimal mit Pentan gewaschen und dann in 150 ml THF suspendiert, Tetraethylenglycol (50 ml; 0,29 mol) dann bei Raumtemperatur hinzugegeben. Die Reaktion wird für 15 Minuten weitergerührt und dann die Lösung auf –5°C abgekühlt.
Das Hinzugeben von Verbindung 15, zuvor in 25 ml THF verdünnt, erfolgt tropfenweise. Die Mischung wird weiter für 30 Minuten gerührt, um zu erlauben, dass sie auf Raumtemperatur zurückgeht. Die Lösung wird auf 100 ml konzentriert und dann mit 500 ml CHCl₃ verdünnt. Diese organische Phase wird dreimal nacheinander mit 250 ml wässrigem 1N NaHCO₃ gewaschen und dann über MgSO₄ getrocknet, bevor sie eingedampft wird. Das Produkt wird durch Flash-Chromatographie auf einer Siliciumdioxidsäule (Säule mit einem Durchmesser von 65 mm) mit 1,5 l MeOH-DCM 5 % und dann mit 500 ml MeOH-DCM 7 % und schließlich 500 ml MeOH-DCM 10 % gereinigt. Die Fraktionen entsprechend Verbindung 16 werden vereint und dann bis zur Trockne eingedampft, um 17,4 g (42,1 mMol) Produkt mit einer Ausbeute von 61 % zu ergeben.
¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 8,86 (s groß, 1H, NH); 7,71 (d, 1H, J = 7,5 Hz, Ar-H₄); 7,51 (s, 1H, Ar-H₂); 7,29–7,24 (m, 2H, Ar-H_5,6); 4,09 (m, 2H,CO-CH _2-O); 3,99 (m, 2H, H ₂C_Acetal); 3,72–3,53 (m, 20H, O-CH ₂-CH ₂-O, H₂C_Acetal und HO-CH ₂); 1,61 (s, 3H, CH₃).
• Tosylat-Verbindung 17:
Der Alkohol 16 (4,12 g; 10,0 mMol) wird in 5 ml Pyridin gelöst. 2,0 g (10,5 mMol) Tosylchlorid werden dann bei Raumtemperatur hinzgegeben. Die Mischung wird unter Argon für 10 Stunden gerührt. Sie wird mit 100 ml DCM verdünnt, die organische Phase dreimal mit 20 ml wässrigem 1N NaHCO₃ gewaschen und dann über MgSO₄ getrocknet, bis sie mit Toluol co-verdampft wird. Die Reinigung durch Flash-Chromatographie auf einer Säule (Säule mit 50 mm Durchmesser) wird durchgeführt mit 500 ml MeOH-DCM 2 % und dann 500 ml MeOH-DCM 3 % und schließlich 500 ml MeOH-DCM 4 %. Die Fraktionen entsprechend Produkt 17 werden vereint und dann bis zur Trockne eingedampft, um dann 3,68 g (6,48 mMol) Öl mit einer geschätzten Ausbeute von 65 % zu erhalten.
¹H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ = 8,86 (s groß, 1H, NH); 7,76 (d, 4H, J = 5,5 Hz, Ar-H_Tosyl); 7,60 (d, 1H, J = 7,5 Hz, Ar-H₄); 7,50 (s, 1H, Ar-H₂); 7,32–7,22 (m, 2H, Ar-H_5,6); 4,10 (m, 2H, CO-CH ₂-O); 4,00 (m, 2H, H ₂C_Acetal); 3,73–3,54 (m, 20H, O-CH ₂-CH ₂-O, H ₂C_Acetal und HO-CH ₂); 2,42 (s, 3H, Ar-CH₃); 1,61 (s, 3H, CH₃).
• Phthalimid-Verbindung 18:
Das Tosylat 17 (3,68 g; 6,48 mMol) wird in 1,52 g (10,0 mMol) DBU (1,8-Diazobicyclo[5.4.0]-Undecen) gelöst und dann das Phthalimid (1,47 g; 10 mMol) hinzugegeben. Die solchermaßen erhaltene Lösung wird auf 85–90°C für 17 Stunden erhitzt und dann verdampft. Das Produkt wird durch Flash-Chromatographie auf einer Silica-Säule (Säule mit einem Durchmesser von 50 mm) mit 1 l Aceton-DCM 15 %, und dann mit 1 l Aceton-DCM 20 % gereinigt. Die Verbindung 18 entsprechenden Fraktionen werden vereint und dann bis zur Trockne eingedampft, um 3,15 g (5,8 mMol) Produkt mit einer Ausbeute von 90 % zu ergeben.
¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 8,73 (s groß, 1H, NH); 7,79 (m, 2H, Ar-H_phta); 7,99 (m, 2H, Ar-H_phta et Ar-H₄); 7,49 (s, 1H, Ar-H₂); 7,27–7,18 (m, 2H, Ar-H_5,6); 4,10 (m, 2H, CO-CH ₂-O); 4,00 (m, 2H, H ₂C_Acetal); 3,69–3,56 (m, 20H, O-CH ₂-CH ₂-O, H₂C_Acetal et N_phta-CH ₂); 1,61 (s, 3H, CH₃).
• Amin-Verbindung 19:
Das Produkt 18 wird in 20 ml absolutem Ethanol gelöst, in dem unter Rückfluss auf 75–80°C erhitzt wird. Das Hydrazin (1,07 ml; 22,1 mMol) wird dann hinzugegeben und die Reaktion wird fortgesetzt für eine Stunde und 15 Minuten gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird auf gesinntertem Glas filtriert und die ethanolische Phase verdampft. Der weiße Niederschlag wird dann mit DCM gewaschen und die DCM-Phase wird verdampft. Das erhaltene gelbe Öl (2,3 g; 5,57 mMol) wird direkt für die nächste Reaktion verwendet, selbst wenn es Imidazol enthält, das nachfolgend während des Schrittes zum Entschützen des Acetals entfernt werden kann.
¹H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ = 8,83 (s groß, 1H, NH); 7,69 (d, 1H, J = 7,5 Hz, Ar-H₄); 7,51 (s, 1H, Ar-H₂); 7,30–7,19 (m, 2H, Ar-H_5,6); 4,10 (m, 2H, CO-CH ₂-O); 4,00 (m, 2H, H ₂C_Acetal) 3,69–3,56 (m, 20H, O-CH ₂-CH ₂-O, H ₂C_Acetal et H₂N-CH ₂); 1,61 (s, 3H, CH₃).
• Biotinylierte Verbindung 20:
D-Biotin (1,05 g; 4,32 mmol) wird in 10 ml wasserfreiem DMF solubilisiert. 790 mg (4,87 mMol) Carbonyldiimidazol (CDI) werden unter Argon hinzugegeben. Nach zehnminütigem Rühren wird das Amin 19, das in 5 ml DMF verdünnt ist, hinzugegeben. Die Lösung wird weiter für 40 Minuten gerührt und dann verdampft, bevor sie durch Flash-Chromatographie auf einer Säule gereinigt wird.
Zu diesem Zweck wird eine Säule mit einem Durchmesser von 50 mm verwendet mit, als Eluent, 500 ml MeOH-DCM 5 % und dann 500 ml MeOH-DCM 10 % und schließlich 500 ml MeOH-DCM 15 %. Die Fraktionen entsprechend Produkt 20 werden vereint und dann bis zur Trockne eingedampft, um ein gelbes Öl (1,66 g; 2,6 mMol) zu ergeben.
Das erhaltene gelbe Öl (2,4 g) enthält, gemäß dem NMR-Spektrum, etwa 30 Gewichtsprozent Imidazol. Es wird deshalb daraus gefolgert, dass die Ausbeute der Reaktion, die zum Produkt 20 führt, bezüglich des Ausgangsbiotins etwa 60 % beträgt.
¹H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ = 8,80 (s groß, 1H, NH); 7,66 (m, 3H, Ar-H₄ et H_Imidazol); 7,54 (s, 1H, Ar-H₂); 7,28–7,24 (m, 2H, Ar-H_5,6); 7,07 (s, 2H, H_Imidazol), 6,59 (t, 1H, NH_15'); 6,06 (s groß, 1H, NH _B1); 5,19 (s groß, 1H, NH _B3); 4,45 (m, 1H, H_B6a); 4,27 (m, 1H, H_B3a); 4,10 (s, 2H, H_3'); 4,00 (m, 2H, H ₂C_Acetal); 3,75–3,49 (m, 18H, O-CH ₂-CH ₂-O et H ₂C_Acecal,); 3,36 (m, 2H, H_14'); 3,09 (m, 1H, H_B4); 2,85 et 2,66 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,16 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,61 (s, 3H, CH₃); 1,59–1,3 (m, 6H, H_{B9,
B8, B7}).
• Keton-Verbindung 21:
Das Acetal 20 wird in 80 ml Chloroform gelöst und dann werden 30 ml 2N HCl hinzugegeben. Die Mischung wird für 45 Minuten heftig gerührt. Die organische Phase wird wiedergewonnen und dann über wasserfreiem NaHCO₃ getrocknet. Nach Filtration wird die Lösung verdampft und das erhaltene Öl wird mit Pentan gewaschen, um Produkt 21 (1,48 g; 2,48 mMol) mit einer Ausbeute von 99 % zu erhalten.
¹H-NMR (3,00MW, CDCl₃) δ = 8,99 (s groß, 1H, NH); 8,07 (s, 1H, Ar-H₂); 7,98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7,66 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7,42 (t, 2H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 6,38 (t, 1H, NH_15'); 5,78 (s groß, 1H, NH _B1); 4,96 (s groß, 1H, NH _B3); 4,47 (m, 1H, H_B6a); 4,29 (m, 1H, H_B3a); 4,13 (s, 2H, H_3'); 3,76–3,37 (m, 16H, O-CH ₂-CH ₂-O); 3,32 (m, 2H, H_14'); 3,11 (m, 1H, H_B4); 2,89 et 2,75 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,59 (s, 3H, CH₃); 2,16 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,64–1,40 (m, 6H, H_{B9,
B8, B7}).
• Hydrazon-Verbindung 22:
Das Keton 21 wird in 20 ml absolutem Ethanol gelöst. Die Mischung wird unter Erhitzen bei 75–80°C erhitzt. Hydrazin (816 μl; 16,81 mMol) wird dann hinzugegeben und die Mischung für 3 Stunden gerührt. Nach Filtration wird die Mischung bis zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Ethanol erneut gelöst, bis ein klebriger weißer Schaum erhalten wird. In einem zweiten Schritt wird diese Lösung in 50 ml Chloroform gelöst und dann werden 20 ml gesättigte NaHCO₃-Lösung hinzugegeben. Die Mischung wird gründlich gewaschen und dann die organische Phase entfernt. Sie wird über wasserfreiem Na₂CO₃ getrocknet und nach Filtration bis zur Trockne eingedampft, um einen neuen klebrigen Schaum zu ergeben. Dieser entspricht Produkt 22 (842 mg; 1,38 mMol) und wird mit einer Ausbeute von 66 % erhalten.
¹H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ = 8,81 (s groß, 1H, NH); 8,82 (s, 1H, Ar-H₂); 7,64 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7,32 (m, 4H, Ar-H_5,6); 6,43 (t, 1H, NH_15'); 5,89 (s groß, 1H, NH _B1); 5,46 (s groß, 2H, NH₂); 4,99 (s groß, 1H, NH _B3); 4,44 (m, 1H, H_B6a); 4,27 (m, 1H, H_B3a); 4,11 (s, 2H, H_3'); 3,70–3,37 (m, 16H, O-CH ₂-CH ₂-O); 3,32 (m, 2H, H_14'); 3,08 (m, 1H, H_B4); 2,87 et 2,67 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,11 (m, 5H, CH₃ et H_B10); 1,64–1,40 (m, 6H, H_{B9,
B8, B7}).
• Diazo-Verbindung 23:
Das Hydrazon 22 (100 mg; 0,164 mMol) wird in einem ml DMF unter Argon gelöst. 80 mg aktiviertes MnO₂ werden hinzugegeben und die Mischung wird für 30 Minuten heftig gerührt. Die Mischung wird durch eine Mischschicht aus Celite (3 cm) und pulverförmigem Molekularsieb (1cm) filtriert. Die Lösung wird dann bis zur Trockne eingedampft. Das am Ende der Verdampfung erhaltene Öl wird verrieben, bis ein rosafarbenes Pulver erhalten wird, das Verbindung 23 entspricht (78 mg; 0,128 mMol; 78 %).
¹H-NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ = 9,60 (s groß, 1H, NH); 7,89 (s, 1H, Ar-H₂); 7,76 (t, 1H, NH_15'); 7,35–7,25 (m, 4H, Ar-H_5,6); 6,64 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 6,36 (s groß, 1H, NH _B1); 6,32 (s groß, 1H, NH _B3); 4,28 (m, 1H, H_B6a); 4,08 (m, 1H, H_B3a); 4,06 (s, 2H, H_3'); 3,55-3,31 (m, 16H, O-CH ₂-CH ₂-O); 3,17 (m, 2H, H_14'); 3,08 (m, 1H, H_B4); 2,80 et 2,59 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,13 (m, 5H, CH₃); 2,13 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,99–1,30 (m, 6H, H_{B9, B8, B7}).
Die Reaktivität von Verbindung 23 wurde an Uridin-3'-Monophosphat getestet und durch Kapillarelektrophorese überwacht. Die Analysebedingungen sind jene von Beispiel 6.1. Die Ergebnisse zeigen eine Halbwertszeit von 30 Minuten.
Die Stabilität des Reagens ist größer als ein Monat bei –20°C. Beispiel 22.3: Synthese von Para-Bio-EG3-PMDAM: Syntheseschema:
• Schützen der 4-Acetylbenzoesäure:
Die 4-Acetylbenzoesäure (1 g; 6,1 mMol) wird in einer Lösung aus Trimethylsilylchlorid (TMSCI, 10 g; 92 mMol) in 5 ml MeOH gelöst. Die Mischung wird über Nach auf 90°C erhitzt. Nach Verdampfen wird ein weißer Feststoff entsprechend Verbindung 31 (1,21 g; 5,75 mMol) isoliert, durch NMR charakterisiert und so wie er vorliegt für die nächste Reaktion verwendet.
¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 8,08 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,59 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 3,18 (s, 6H, -O-CH₃); 1,53 (s, 3H, CH₃).
• Verbindung 32:
Verbindung 31 (1,21 g; 5,75 mMol) wird in 5 ml Trimethylorthoformiat in Gegenwart von Dowex 50WX8-100 (0,3 g) gelöst. Die Mischung wird über Nacht bei 60°C erhitzt und dann filtriert und verdampft, um Verbindung 32 (1,19 g; 5,3 mMol) mit einer Ausbeute von 87 % zu ergeben.
¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 8,00 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,54 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 3,89 (s, 1H, CO-O-CH₃); 3,16 (s, 6H, -O-CH₃); 1,51 (s, 3H, CH₃).
• Verbindung 33:
Verbindung 32 (1,17 g; 5,22 mMol) wird in 5 ml (22,7 mMol) 4,7,10-Trioxa-1,13-Tridecandiamin gelöst. Die erhaltene Lösung wird für 4 Stunden bei 140°C erhitzt. Die Mischung wird dann in 30 ml DCM gelöst und dreimal mit 10 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO₄ gewaschen und dann verdampft, bis ein Öl entsprechend Produkt 33 (1,44 g; 3,49 mMol) mit einer Ausbeute von 67 % erhalten wird.
¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 7,76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,51 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 3,62–3,47 (m, 14H, H_{7',8',10',11'} und H_5',13' und H_3'); 3,15 (s, 6H, -O-CH₃); 2,73 (m, 2H, H_15') 1,88 (m, 2H, H_4'); 1,65 (m, 2H, H_14'); 1,38 (s groß, 2H, NH₂).
• Biotinylierte Verbindung 34:
Das Biotin (780 mg; 3,19 mMol) wird in 13 ml DMF suspendiert. 590 ml (3,60 mMol) CDI werden dann hinzugegeben. Die Lösung wird für 30 Minuten beim Raumtemperatur gerührt. Verbindung 33 wird in 1 ml DMF gelöst und dann wird die vorherige Lösung Tropfen für Tropfen hinzugegeben. Die solchermaßen erhaltene Mischung wird für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdampfen des DMF wird eine Reinigung durch Flash-Chromatographie auf einer Säule (Säulendurchmesser 35 mm) mit 500 ml MeOH-DCM 6 % durchgeführt und dann mit 250 ml MeOH-DCM 8 % und schließlich 250 ml MeOH-DCM 8 %. Die Produkt 34 entsprechenden Fraktionen werden vereint und dann bis zur Trockne eingedampft, um 1,05 g Öl mit einer Ausbeute von geschätzt 30 % zu ergeben.
¹H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ = 8,49 (s groß, 1H, NH_Imidazol); 7,79 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6) 7,66 (s, 1H, H_Imidazol); 7,50 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 7,38 (t, 1H, NH_2'); 7,11 (s, 2H, H_Imidazol); 6,67 (t, 1H, NH_16'), 5,99 (s groß, 1H, NH _B1); 5,15 (s groß, 1H, NH _B3); 4,46 (m, 1H, H_B6a); 4,27 (m, 1H, H_B3a); 3,61–3,45 (m, 14H, H_{7',8',10',11'} et H_5',13' et H_3'); 3,28 (m, 2H, H_15'); 3,15 (s, 6H, -OCH₃); 2,85 (m, 1H, H_B4); 2,85 et 2,69 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,14 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,86 (m, 2H, H_4'); 1,69 (m, 2H, H_14'); 1,49 (s, 3H, CH₃); 1,42–1,39 (m, 6H, H_{B7,
B8, B9}).
• Verbindung 35:
Das Acetal 34 wird in 45 ml Chloroform gelöst und dann werden 10 ml 2N HCl hinzugegeben. Die Zwei-Phasen-Mischung wird heftig für 5 Minuten gerührt. Die organische Phase wird verdampft und über wasserfreiem NaHCO₃ getrocknet. Sie wird filtriert, verdampft und Verbindung 35 wird in der Form eines leicht gelblichen Feststoffes (5,04 mg; 0,87 mMol) mit einer Gesamtausbeute von 27 % ausgehend von Biotin erhalten.
¹H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ = 7,97 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,91 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 7,51 (t, 1H, NH_2'); 6,50 (t, 1H, NH_16'), 6,05 (s groß, 1H, NH _B1); 5,23 (s groß, 1H, NH _B3); 4,45 (m, 1H, H_B6a); 4,27 (m, 1H, H_B3a); 3,62–3,56 (m, 10H, H_{7',8',10',11'} et H_5'); 3,48-3,46 (m, 4H, H_3',13'); 3,27 (m, 2H, H_15'); 3,10 (m, 1H, H_B4); 2,85 et 2,71 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,60 (s, 3H, CH₃); 2,14 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,89 (m, 2H, H_4'); 1,72–1,61 (m, 6H, H_14', H_{B7 B9}); 1,40 (m, 2H, H_B8).
• Hydrazon-Verbindung 36:
Das Keton 35 (500 mg; 0,864 mMol) wird in 11 ml absolutem EtOH gelöst. Das Hydrazin (335 μl; 6,911 mMol) wird dann hinzugegeben und die Reaktionsmischung dann unter Rückfluss für eine Stunde erhitzt. Das nach Verdampfen erhaltene Öl wird in absolutem EtOH gelöst, damit es erneut verdampft wird. Ein klebriger Schaum entsprechend Produkt 36 (488 mg; 0,823 mMol) wird dann mit einer Ausbeute von 95 % erhalten.
¹H (300MHz, CDCl₃) δ = 7,76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,67 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 7,29 (t, 1H, NH_2'); 6,46 (t, 1H, NH_16'), 5,98 (s groß, 1H, NH _B1); 5,55 (s groß, 2H, NH₂); 5,14 (s groß, 1H, NH _B3); 4,45 (m, 1H, H_B6a); 4,24 (m, 1H, H_B3a); 3,62–3,51 (m, 10H, H_{7',8',10',11'} et H_5'); 3,47–3,45 (m, 4H, H_3',13'); 3,27 (m, 2H, H_15'); 3,07 (m, 1H, H_B4); 2,84 und 2,69 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,11 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10 und s, 3H, CH₃); 1,86 (m, 2H, H_4'); 1,72–1,59 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1,21 (m, 2H, H_B8).
• Diazo-Verbindung 37:
Das Hydrazon 36 (200 mg; 0,337 mMol) wird in 5 ml DMF gelöst. MnO₂ (450 mg; 5,17 mMol) werden dann hinzugegeben. Nach fünfzehnminütigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Mischung auf Millipor, das das Celite (Stärke 2 cm) und pulverisierten Molekülsieb 3 Å (0,5 cm) enthält, filtriert. Die Reaktionsmischung wird bis zur Trockne eingedampft. Das erhaltene Restöl wird mit Ether dreimal nacheinander gewaschen, bis ein Pulver erhalten wird. Verbindung 37 (290 mg, 0491 mMol) wird in der Form eines rosafarbenen Feststoffes mit einer Ausbeute von 93 % erhalten.
¹H-NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ = 8,33 (t, 1H, NH_2'); 7,83 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7,73 (t, 1H, NH_16'); 6,98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 6,39 (s groß, 1H, NH _B1); 6,33 (s groß, 1H, NH _B3); 4,30 (m, 1H, H_B6a); 4,12 (m, 1H, H_B3a); 3,51–3,45 (m, 16H, H_{7',8',10',11'} und H_5' und H_15' und H_3',13'); 3,07 (m, 1H, H_B4); 2,79 und 2,58 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,14 (s, 3H, CH₃); 2,04 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,77 (m, 2H, H_4'); 1,62–1,48 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1,31 (m, 2H, H_B8).
Die Reaktivität von Verbindung 37 wurde an Uridin-3'-Monophosphat getestet und durch Kapillarelektrophorese überwacht. Die Analysebedingungen sind jene von Beispiel 6.1. Die Ergebnisse zeigen eine Halbwertszeit von 60 Minuten.
Das Reagens ist bei –20°C für wenigstens einen Monat stabil. Beispiel 22.4: Synthese von Meta-Bio-EG3-PDAM: Syntheseschema:
• Schutz von Methyl-3-formylbenzoat 38:
Das Dowex 50WX8-100 Harz (2 g) wird in 25 ml MeOH und 25 ml Trimethylorthoformiat gelöst und dann für 15 Minuten gerührt. Nach Dekantieren wird das Harz zweimal nacheinander mit 20 ml MeOH gewaschen. Dieses Harz wird dann in 100 ml MeOH, 50 ml CH(OMe)₃ gegeben und 7,12 g (43,4 mMol) Methyl-3-fomylbenzoat werden hinzugegeben. Die Lösung wird für 15 Minuten gerührt und dann auf einem gefalteten Papier vor der Verdampfung filtriert. Das Produkt 39 (9 g; 43,1 mMol) wird in der Form einer leicht gelblichen Flüssigkeit mit einer Ausbeute von 99 % isoliert.
¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 8,10 (s, H, Ar-H₂); 7,9 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7,63 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7,42 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 5,40 (s, 1H, CH); 3,90 (s, 3H, -CO-O-CH₃); 3,31 (s, 6H, -O-CH₃).
• Verbindung 40:
Verbindung 39 (2 g; 9,5 mMol) wird in 10,4 ml (47,6 mMol) 4,7,10-Trioxa-1,13-Tridecandiamin gelöst. Die erhaltene Lösung wird bei 165°C für zwei Stunden erhitzt. Die Mischung wird dann in 80 ml DCM gelöst und viermal mit 20 ml Wasser gewaschen. Nach Trocknen über MgSO₄ und Verdampfen wird das Produkt 40 mit einer Ausbeute von 60 % (2,27 g; 5,69 mMol) isoliert.
¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 7,84 (s, H, Ar-H₂); 7,75 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7,53 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7,39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 5,38 (s, 1H, CH); 3,64–3,43 (m, 14H, H_{7',8',10',11'} et H_5',13' et H_3'); 3,29 (s, 6H, -O-CH₃); 2,72 (m, 2H, H_15') 1,87 (m, 2H, H_4'); 1,64 (m, 2H, H_14'); 1,30 (s groß, 2H, NH₂).
• Biotinylierte Verbindung 41:
Das D-Biotin (344 mg; 1,40 mMol) wird in 4 ml DMF suspendiert und dann werden 250 mg (1,54 mMol) CDI hinzugegeben. Die Lösung wird für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Verbindung 40 (616 mg; 1,54 mMol) wird in 2 ml DMF gelöst und dann die vorhergehende Lösung tropfenweise hinzugegeben. Die solchermaßen erhaltene Mischung wird weiter für 50 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdampfen wird eine Reinigung durch Flash-Chromatographie auf einer Säule (Säulendurchmesser 30 mm) mit 750 ml MeOH-DCM 10 % und dann mit 250 ml MeOH-DCM 15 % durchgeführt. Die Fraktionen entsprechend Produkt 41 werden vereinigt und dann bis zur Trockne eingedampft, um 740 mg Öl mit einer Ausbeute von geschätzt 50 % zu erhalten.
¹H NMR (200MHz, CDCl₃) δ = 7,87 (s, H, Ar-H₂); 7,78 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7,65 (s, 1H, H_Imidazol); 7,53 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7,39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 7,07 (s, 2H, H_Imidazol); 6,65 (t, 1H, NH_16'), 5,95 (großes s, 1H, NH _B1); 5,38 (s, 1H, CH); 5,15 (großes s, 1H, NH _B3); 4,43 (m, 1H, H_B6a); 4,27 (m, 1H, H_B3a); 3,59–3,44 (m, 14H, H_{7',8',10',11'} und H_5',13' et H_3'); 3,29 (m, 8H, H_15' und 2-O-CH₃); 3,07 (m, 1H, H_B4); 2,84 und 2,66 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,13 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,85 (m, 2H, H_4'); 1,66 (m, 2H, H_14'); 1,40–1,37 (m, 6H, H_B7,B8,B9).
• Aldehydverbindung 42:
Das Acetal 41 wird in 20 ml Chloroform gelöst und dann werden 5 ml 2N HCl hinzugegeben. Die zweiphasige Mischung wird kräftig für 15 min gerührt. Die organische Phase wird wiedergewonnen und über wasserfreiem NaHCO₃ getrocknet. Sie wird filtriert, verdampft und Verbindung 42 wird erhalten in der Form eines gelben Öls (593 mg; 1,02 mMol) mit einer Gesamtausbeute von 87 % bezogen auf Biotin.
¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ = 10,04 (s, 1H, CHO); 8,34 (s, H, Ar-H₂); 8,16 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7,96 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7,72 (t, 1H, NH_2'); 7,39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 6,51 (t, 1H, NH_16'); 6,00 (großes s, 1H, NH _B1); 5,30 (großes s, 1H, NH _B3); 4,46 (m, 1H, H_B6a); 4,27 (m, 1H, H_B3a); 3,66–3,56 (m, 10H, H_{7',8',10',11'} et H_5'); 3,50–3,29 (m, 4H, H_3',13'); 3,28 (m, 2H, H_15'); 2,95 (m, 1H, H_B4); 2,84 und 2,71 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,15 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,89 (m, 2H, H_4'); 1,72–1,63 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1,23 (m, 2H, H_B8).
• Hydrazonverbindung 43:
Der Aldehyd 42 (593 mg; 1,02 mMol) wird in 10 ml absolutem Ethanol gelöst. Das Hydrazin (400 μl; 8,19 mMol) wird hinzugegeben und dann die Reaktionsmischung unter Rückfluss für 50 min erhitzt. Das nach Verdampfen erhaltene gelbe Öl wird mit Ether verrieben, bis ein beiges Pulver entsprechend Produkt 43 (404 mg; 0,68 mMol) mit einer Ausbeute von 66 % erhalten wird. Reinigung durch Flash-Chromatographie auf einer Säule (Säulendurchmesser 15 mm) wird dann an einer 150 mg (0,253 mMol)-Probe mit 200 ml MeOH-DCM 20 % durchgeführt. Die Fraktionen werden vereinigt und dann bis zur Trockne eingedampft, um 144 mg Produkt 43 mit einer Ausbeute von 76 % zu ergeben.
¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ = 7,95 (s, H, Ar-H₂); 8,16 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7,76 (s, 1H, CH); 7,96 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7,38 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 6,45 (t, 1H, NH_16'); 5,98 (großes s, 1H, NH _B1); 5,72 (großes s, 2H, NH₂); 5,18 (großes s, 1H, NH _B3); 4,44 (m, 1H, H_B6a); 4,26 (m, 1H, H_B3a); 3,62–3,56 (m, 10H, H_{7',8',10',11'} et H_5'); 3,48–3,45 (m, 4H, H_3',13'); 3,27 (m, 2H, H_15'); 3,07 (m, 1H, H_B4); 2,84 und 2,68 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,11 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,86 (m, 2H, H_4'); 1,72–1,59 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1,21 (m, 2H, H_B8).
• Diazoverbindung 44:
Das Hydrazon 43 (100 mg; 0,187 mMol) wird in 4 ml DMF gelöst. MnO₂ (200 mg; 2,3 mMol) wird dann hinzugegeben. Nach dreizehnminütigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Mischung auf Millipor filtriert, das Celite (Stärke 2 cm) und pulverisierten Molekularsieb mit 3 Å (0,5 cm) enthält. Die Reaktionsmischung wird bis zur Trockne eingedampft. Das erhaltene Restöl wird mit Ether dreimal nacheinander gewaschen. Die Verbindung 44 (290 mg, 0,491 mMol) wird als orangefarbener Feststoff mit einer Ausbeute von 83 % erhalten.
¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ = 8,39 (t, 1H, NH_2'); 7,78 (t, 1H, NH_16'); 7,39–7,34 (m, Ar-H); 7,09 (d, Ar-H); 6,38 (großes s, 1H, NH _B1); 6,32 (großes s, 1H, NH _B3); 5,78 (s, 1H, CH-N₂); 4,27 (m, 1H, H_B6a); 4,11 (m, 1H, H_B3a); 3,51–3,44 (m, 10H, H_{7',8',10',11'} und H_5'); 3,37 (m, 2H, H_15'); 3,32 (m, 4H, H_3',13'); 3,05 (m, 1H, H_B4); 2,79 und 2,58 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2,02 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1,69 (m, 2H, H_4'); 1,59–1,48 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1,25 (m, 2H, H_B8).
Die Stabilität des Produktes liegt bei über 1 Monat bei –20°C.
Beispiel 23: Synthese von para-Cy5-EG3-PDAM:
Wie bereits in Beispiel 2 erwähnt, kann das Biotin durch einen anderen Marker wie beispielsweise Cy5 ersetzt werden. Dieses Beispiel zeigt, dass die funktionelle Diazogruppe, vom PDAM getragen, auch mit dieser Cy5-Markierung vermittels eines Polyethylenglycolverknüpfungsarmes verbunden werden kann. Syntheseschema: Das Gegenion I^– ist nicht in den Formeln 46, 47, 50' und 51 vorhanden.
• 2-[4-(N-Acetyl-N-phenylamino)buta-1,3-dienyl]-1,2,3,3-tetramethyl[3H]indoliumiodid 47:
Die Mischung aus Malonaldehyd-bis(phenylimin)-Monohydrochlorid 45 (13 g; 50,2 mMol), NaOAc (6,0 g; 69,7 mMol) und 1,2,3,3-Tetramethyl[3H]indoliumiodid 46 (3,01 g; 10 mMol) in Essigsäureanhydrid (50 ml) wird bei 110°C für genau 20 min erhitzt. Nach dem Abkühlen wird Ether (350 ml) hinzugegeben und der ausgefallene braune Feststoff wird abfiltriert und mit Ether (3 × 100 ml) gewaschen. Der Feststoff wird erneut in 150 ml CH₂Cl₂ gelöst, filtriert (Entfernen der anorganischen Salze) und dann mit 350 ml Ether gefällt, um einen braunen Feststoff zu ergeben (3,54 g, 54 %).
¹H NMR (CDCl₃): δ = 8,64 (d; 1H; J = 12 Hz; 1-H); 8,14 (t; 1H; J = 16; 12Hz; 3-H); 7,63–7,19 (m; 9H); 6,90 (d; 1H; J = 15 Hz; 4-H); 5,82 (t; 1H; J = 12; 13 Hz; 2-H); 4,06 (s; 3H; NCH₃); (2,16 (s; 3H; -COCH₃); 1,74 (s; 6H; CH₃).
• 1-(5-Carboxypentyl)-2,3,3-trimethyl[3H]indoliumbromid 50:
2,3,3-Trimethylindol 48 (10,0 g; 62,8 mmol) und 6-Bromhexansäure 49 (12,3 g; 62,8 mMol) werden ohne Lösungsmittel gemischt und bei 110°C für 12 h unter Argon erhitzt. Die violett- rote pasteuse Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat (2 × 60 ml, die Paste wird mit dem Spatel verrieben und der Überstand abdekantiert) und dann mit Aceton (50 ml, die Paste verfestigt sich) gewaschen. Der lilafarbene Feststoff wird abfiltriert und dann unter Vakuum getrocknet (16,0 g; 73 %).
• Cy5COOH-Verbindung 51:
Die Mischung des Iodids 47 (2,5 g; 5,3 mMol), des Bromids 50 (1,87 g; 5,3 mMol) und von NaOAc (1,08 g; 12,1 mMol) in Essigsäureanhydrid (11 ml) wird bei 120°C für 25 min erhitzt. Nach Abkühlen wird Ether (200 ml) hinzugegeben und das Präzipitat abfiltriert und mit Ether (3 × 50 ml) gewaschen. Der Feststoff entsprechend dem Produkt 51' wird in 100 ml CH₂Cl₂ gelöst und dann eingedampft. Er wird dann in 15 ml Essigsäure gelöst und für 30 min bei 120°C gerührt. Der Produkt 51 entsprechende Niederschlag wird dann nach Zugeben von 200 ml Ether und Filtrieren auf gesintertem Glas erhalten, mit einer Ausbeute von 84 % (2,71 g; 4,44 mmol).
¹H NRM (CDCl₃): δ = 8,03 (t; 2H; J = 10; 11 Hz, 2-H, 4-H); 7,38–6,91 (m; 9H; Ar-H, 3-H); 6,41 (d; 1H; J = 14 Hz; 1-H); 6,31 (d; 1H; J = 13 Hz; 5-H); 4,07(t; 2H, J = 7; 7 Hz; α-CH₂); 3,68 (s; 3H; NCH₃); 2,47 (t; 2H, J 7; 7 Hz; ε-CH₂); 1,71 (m; 18H; CH₃, β, γ und δ-CH₂).
• Kuppeln von Verbindung 26 mit Cy5COOH 51 (Produkt 52):
Zu einer Lösung aus Cy5COOH 51 (1,5 g; 2,46 mMol) in 15 ml CH₂Cl₂ wird N-Methylmorpholin (NMM, 405 μl; 3,68 mMol) hinzugegeben. Die Lösung wird in einem Eisbad abgekühlt und unter Argon gegeben und dann wird Isobutylchloroformiat (494 μl; 3,81 mMol) hinzugegeben. Nach zehnminütigem Rühren wird das Amin 26 (1,86 mg; 4,67 mMol) in 8 ml CH₂Cl₂ hinzugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 1 h 30 weitergerührt. 20 ml CH₂Cl₂ werden hinzugegeben und die Mischung wird mit 25 ml NaHCO₃ (1N) dreimal nacheinander gewaschen. Nach Trocknen über Na₂CO₃ wird die Lösung filtriert, um die Dichlormethanphase wiederzugewinnen, die verdampft wird.
Reinigung durch Flash-Chromatographie auf einer Säule (Säulendurchmesser 45 mm, 20 ml Fraktionen) wird durchgeführt mit, als Eluent, MeOH-DCM 10 %. Die Produkt 52 entsprechenden Fraktionen werden vereint und dann bis zur Trockne verdampft, um einen blauen Feststoff zu ergeben, der in CH₂Cl₂ gelöst wird. Produkt 52 wird dann gefällt und mit Ether gewaschen, um ein blaues Produkt mit einer Ausbeute von 72 % zu ergeben (1,45 g; 1,77 mMol).
Das Produkt 52 (Iodid) wird daraufhin in 54 ml Methanol gelöst und dann über eine Amberlit-IRA900-Säule (Cl^–; 15 g) geführt. Die wiedergewonnene methanolische Lösung wird bis zur Trockne eingedampft, um ein klebriges Öl zu ergeben, das erneut in CH₂Cl₂ gelöst wird. Die Verdampfung erlaubt es, Produkt 52' mit einer Ausbeute von 87 % zu erhalten.
• Aldehyd 53:
Das Acetal 52' wird in 10 ml DCM gelöst und dann werden 10 ml 2N HCl hinzugegeben. Die Lösung wird für 3 h 30 min weiter kräftig gerührt. Nach Hinzufügen von 20 ml DCM wird die Dichlormethanphase wiedergewonnen und dann über NaHCO₃ getrocknet. Das nach Verdampfen erhaltene Produkt wird dann mit Ether gewaschen, um den Aldehyd 53 mit einer Ausbeute von 90 % (1,18 g; 1,46 mMol) zu ergeben.
• Hydrazon 54:
Der Aldehyd 53 (200 mg; 0,247 mMol) wird in 1 ml absolutem Ethanol gelöst und Hydrazinmonohydrat (15,6 μl; 0,321 mMol) hinzugegeben. Die Lösung wird für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. 8 ml Ether werden hinzugegeben; die Mischung wird mit Ether durch dreimaliges aufeinanderfolgendes Dekantieren gewaschen und dann unter Vakuum getrocknet. 172 mg Hydrazin 54 (0,209 mMol; 85 % Ausbeute) werden erhalten und in einem Gefrierschrank gelagert.
• Diazo 55:
Zu einer Lösung aus 20 mg (0,243 mMol) Hydrazon 54 in 2 ml DMF werden 100 mg MnO₂ hinzugegeben und die Mischung wird kräftig für 5 min unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird durch eine Schicht aus Celite (Stärke: 2 cm) und pulverisiertem Molekularsieb mit 3 Å (0,5 cm) filtriert und mit DMF gewaschen. Die Lösung wird verdampft und dann der Rest mit Ether verrieben. Der solchermaßen erhaltene Feststoff wird getrocknet. 18 mg (0,185 mMol; 76 %) Diazo 55 werden erhalten.
Die Stabilität des Reagens ist größer als 1 Monat bei –20°C.
Beispiel 24: Synthese von meta-Fluo-EG3-PMDAM:
Wie bereits in Beispiel 23 erwähnt, kann das Biotin durch einen anderen Marker ersetzt werden. Dieses Beispiel zeigt, dass es auch möglich ist, die funktionelle Diazogruppe, die vom PMDAM getragen wird, mit diesem Fluoreszeinmarker vermittels eines Polyethylenglycolverbindungsarmes zu verknüpfen. Syntheseschema:
• Verbindung 72:
Fluoreszein-Isothiocyanat (250 mg, 0,64 mMol) werden in 1,6 ml wasserfreiem DMF, mit 2 % Pyridin, unter Argon gelöst. Das gelöste Produkt 69 (0,356 g, 0,81 mMol) wird zu 1,6 ml wasserfreiem DMF hinzugegeben. Man erlaubt, dass die Mischung für 3,5 h bei Raumtemperatur reagiert und dann wird das DMF verdampft und der Rückstand in 25 ml H₂O aufgenommen. Drei Extraktionen werden dann mit 50 ml CH₂Cl₂ durchgeführt und die wässrige Phase verdampft. 255 mg (48 %) von Produkt 72 werden erhalten.
• meta-Fluo-EG₃-Hydrazon-Tosyl-Verbindung 75:
Verbindung 72 (255 mg, 0,31 mMol) wird in 1,5 ml Ethanol unter Rückfluss gelöst. p-Toluensulfonyl-Hydrazin (69,2 mg, 0,37 mMol) in 1,5 ml Ethanol werden hinzugegeben und man erlaubt, dass die Mischung für 6 h reagiert. Die Mischung wird bis zur Trockne eingedampft und der Feststoff mit CH₂Cl₂, H₂O und Ether gewaschen. 18,5 mg (74 %) des Produktes 75 werden in der Form eines orangefarbenen Pulvers erhalten.
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): d = 1,6–1,8 (m, 4H); 2,13 (s, 1H); 2,28 (s, 1H); 2,36 (s, 1H); 2,80 (m, 1H); 3,07 (m, 2H); 3,46 (m, 12H); 6,5–6,7 (m, 6H); 7,1–8,3 (m, 9H).
• meta-Fluo-EG₃-PMDAM-Verbindung 74:
Das Hydrazon 75 (176 mg, 0,18 mMol) werden in 720 μl einer 10 % KOH-Lösung in wasserfreiem Methanol gelöst. Die Lösung wird unter Rückfluss für 3 h gehalten. Man erlaubt, dass sich die Lösung abkühlt und ein Niederschlag erscheint. Die Lösung wird filtriert und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Ether gewaschen und getrocknet.
Die NMR-Analyse zeigt das Verschwinden von Signalen bei 2,36 und 2,13 ppm (entsprechend den Methylresten des Tosyls und des Hydrazons) und das Auftreten eines Peaks bei 1,96 ppm (entsprechend dem Methyl des Diazo).
Beispiel 25: Diazomethyl-Intermediat, das eine nachfolgende Markierung erlaubt:
Es kann vorteilhaft sein, nicht eine direkte Markierung mit dem Diazomethyl-Markierungsreagens zu haben, das auch die Markierung R² trägt, sondern in zwei Stufen mit einer indirekten Markierung fortzufahren. In diesem Falle soll das Markierungsreagens, das die funktionelle Diazomethylgruppe trägt, präfunktionalisiert sein, d. h. sie soll auch eine funktionelle chemische Gruppe umfassen, die in der Lage ist, nachfolgend mit direkten oder indirekten Markern zu reagieren. Die Präfunktionalisierung kann erfolgen durch Einführen einer reaktiven kovalenten funktionellen Gruppe in das Markierungsreagens, die mit einer antireaktiven kovalenten funktionellen Gruppe des direkten oder indirekten Markern reagieren kann. Diese funktionellen Gruppen können aus einer elektrophilen organischen chemischen funktionellen Gruppe bestehen und einer nukleophilen organischen chemischen funktionellen Gruppe oder umgekehrt.
Ein Beispiel für eine derartige Markierungsstrategie ist im folgenden Schema veranschaulicht
in dem das Markierungsreagens, zusätzlich zu einer funktionellen Diazomethylgruppe, eine elektrophile oder nukleophile funktionelle Gruppe W¹ umfasst, die in der Lage ist, mit einer Markierung R² zu reagieren, die eine funktionelle Gruppe W² umfasst, die komplementär zu W¹ ist.
Beispielsweise ist W² eine funktionelle Alkoxyamingruppe, wenn W¹ eine funktionelle Methylketon- oder Aldehydgruppe ist.
In einem Verfahren zum Markieren eines biologischen Moleküls wie beispielsweise einer Nukleinsäure, wird die Nukleinsäure mit dem Markierungsreagens in Kontakt gebracht, das die funktionelle Diazomethylgruppe umfasst, und in einem nachfolgenden Schritt reagiert die Markierung W²-R² mit der Nukleinsäure vermittels der funktionellen Gruppe W¹.
Eine dieser Verwendungen besteht, beispielsweise, in einem Verfahren zur Amplifikation einer Sequenz einer Nukleinsäure oder in einem Verfahren zur Signalverstärkung. Zusätzliche Informationen hinsichtlich dieser Art von Markierung kann in der Patentanmeldung WO-A-98/05766 mit der Priorität vom 02. August 1996, und in der Patentanmeldung WO-A-00/40590 mit der Priorität vom 05. Januar 1999 gefunden werden. Beispiel 25.1: Synthese von MeCO-PMDAM: Syntheseschema:
Das Produkt 85, dessen Synthese in diesem Beispiel beschrieben ist, erlaubt es, die Markierung der natürlichen Nukleinsäuren durchzuführen vermittels der Reaktivität der funktionellen Diazomethylgruppe mit Phosphatgruppen, und somit eine funktionelle Methylketongruppe einzuführen, die nachfolgend verwendet werden kann, um ein nachweisbares (fluoreszierendes) Molekül einzuführen, das eine Alkoxyamingruppe besitzt.
Diese Synthese basiert auf bekannten Verfahren, die in der Chemie routinemäßig verwendet werden. Das Ausgangsmaterial ist das gleiche wie für die Synthese der Marker 71 und 74. Der erste Schritt besteht in der Schützung des terminalen Amins mit Fluorenylmethylformiat (Fmoc, 99). Die Auswahl dieser Schutzgruppe basiert auf ihrer Stabilität und ihren Spaltungsbedingungen.
Nach Ausbildung des geschützten Hydrazons 82 durch das zuvor verwendete Verfahren (meta-Fluo-EG₃-PMDAM-Beispiel) wird das terminale Amin entschützt unter milden basischen Bedingungen, was die Stabilität des Hydrazons gewährleistet. Methylacetoacetat wird verwendet, um die funktionelle Methylketongruppe durch eine Acylierungsreaktion des terminalen Amins zu erzeugen (siehe Bildung der Verbindungen 26 und 36). Die Bildung dieses Diazomethyls wird dann durch eines der oben beschriebnen Verfahren durchgeführt. Beispiel 25.2: Synthese von H₂NO-PMDAM: Syntheseschema:
Das Produkt 88, dessen Synthese in diesem Beispiel beschrieben ist, erlaubt es, die Markierung von natürlichen Nukleinsäuren durchzuführen vermittels der Reaktivität der funktionellen Diazomethylgruppe mit Phosphatgruppen und solchermaßen eine funktionelle Alkoxyamingruppe einzuführen, die nachfolgend verwendet werden kann, um ein nachweisbares (fluoreszierendes) Biotin-Molekül einzuführen, das eine Methylketongruppe besitzt.
Diese Synthese basiert auf dem Modell der vorhergehenden Synthese, d. h. der Verwendung des Vorläufers 69 von Fmoc für den Schutz des Amins und von Tosyl für den Schutz des Hydrazons. Das Einführen der funktionellen Alkoxyamingruppe (Verbindung 86) erfolgt unter Verwendung des Carboxymethoxylamins, (kommerziell) geschützt durch die funktionelle Fmoc-Gruppe (E. Trévisiol Thesis, LEDSS Grenoble, 1999). Wegen der milden Bedingungen für die letzte Entschützung (Verbindung 88) wird letztere unmittelbar nach der Bildung des Diazomethyls durchgeführt. Beispiel 26: Herstellen des PDAM-Derivates, das die Amplifikation des Signals erlaubt: Beispiel 26.1: Synthese der bis-biotinylierten Marker wie beispielsweise [Bio-EG3]2-PDAM: Syntheseschema:
• Reduktion von Trimethyl-1,3,5-benzentricarboxylat 56 zu dem Alkohol 57:
Der Triester 56 (12,6 g; 50,0 mMol) wird in 100 ml THF gelöst und dann werden 1,1 g (50,5 mMol) LiBH₄ bei Raumtemperatur hinzugegeben. Die rote Lösung wird bei 40 bis 45° C unter Rühren unter Argon für 1 h erhitzt. Nach Abkühlen (Eis) wird das überschüssige Hydrid vorsichtig zerstört (Emission von H₂) durch Hinzufügen von Wasser (200 ml) und dann von 2N HCl (30 ml). Die Farbänderung zu hellem Gelb wird beobachtet. Diese Lösung wird mit CH₂Cl₂ (100 ml und dann dreimal 50 ml) extrahiert, die organische Phase mit wasserfreiem NaHCO₃ gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und dann das Lösungsmittel verdampft, bis ein Öl (11,1 g) erhalten wird. Unter Verwendung von Flash-Chromatographie auf einer Silicasäule (Durchmesser = 40 mm, Eluent: Ethylacetat/Cyclohexan = 1/1) wird der Alkohol 57 (6,38 g, 57 %) erhalten.
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 8,53(t, 1H, J = 2 Hz); 8,18 (d, 2H, J = 2 Hz); 4,76 (s, 2H); 3,91 (s, 6H); 2,30 (s, 1H).
• Oxidation des Alkohols 57 zum Aldehyd 58:
Der Alkohol 57 (5,86 g; 26,1 mMol) wird in 100 ml THF gelöst und dann werden 40,0 g MnO₂ tröpfchenweise über 5 min bei Raumtemperatur hinzugegeben. Die Lösung wird über Nacht unter Argon gerührt. Die Lösung wird durch einen Büchner-Trichter filtriert, der mit einer Schicht aus Celite 545 versehen ist, mit CH₂Cl₂ gewaschen und dann werden die Lösungsmittel verdampft. Der rohe Feststoff (4,4 g) wird durch Flash-Chromatographie auf einer Silica-Säule (Durchmesser = 50 mm, Eluent: Ethylacetat/Cyclohexan 3/7) gereinigt. 3,44 g (59 %) des Aldehyds 58 werden erhalten.
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 10,11 (s, 1H); 8,89 (t, 1H, J = 1 Hz); 8,69 (d, 2H, J = 1 Hz) 3,98 (s, 6H).
• Bildung des Acetals 59:
Der Aldehyd 58 (3,21 g; 14,4 mMol) wird in 30 ml Methanol gelöst und dann werden 6,0 ml TMSCI hinzugegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur unter Argon für 1 h weitergerührt. Die Lösung wird mit 200 ml CH₂Cl₂ verdünnt und dann mit 1 M NaHCO₃ (100 ml) gerührt (Achtung, Austritt von CO₂). Die zwei Phasen werden getrennt, die wässrige Phase dreimal mit CH₂Cl₂ (25 ml) extrahiert, die organischen Phasen vereinigt, über MgSO₄ getrocknet und dann das Lösungsmittel verdampft. 3,55 g (92 %) des Acetals 59 werden erhalten.
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 8,63 (t, 1H, J = 2 Hz); 8,29 (d, 2H, J = 2 Hz); 5,45 (s, 2H); 3,93 (s, 6H); 3,32 (s, 6H).
• Hydrolyse des Diesters 59 zur zweibasigen Säure 60:
Der Diester 59 (3,18 g; 11,9 mMol) wird in 10 ml THF gelöst und dann wird eine KOH-Lösung (2,0 g, Pellet 85 %) in 10 ml Ethanol hinzugegeben. Nach 15 min bei Raumtemperatur werden die Lösungsmittel verdampft. Der Rest wird in H₂O (50 ml) gelöst. H₃PO₄ (etwa 2,5 ml, 85 %) werden hinzugegeben bis auf pH 3 und dann der weiße Niederschlag auf gesintertem Glas (#3) filtriert, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet. 2,59 g (91 %) der dibasischen Säure 60 werden erhalten.
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ = 8,43 (t, 1H, J = 1 Hz); 8,15 (d, 2H, J = 1 Hz); 5,53 (s, 1H); 3,27 (s, 6H).
• Trifluoracetamid 62:
Das Diamin 61 (66 g; 0,30 mol) wird in 250 ml CH₂Cl₂ gelöst und dann wird Ethyltrifluoracetat (11,8 ml, 0,10 mol) tropfenweise über 5 min bei 10°C unter Rühren unter Argon hinzugegeben. Nach 15 min bei Raumtemperatur wird die Lösung in einen Scheidetrichter überführt, mit H₂O (3 × 100 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. 22,4 g (71 %) des Monoamids 62 mit einer Reinheit von etwa 85 % (bestimmt durch ¹⁹F-NMR) werden erhalten. Diese Verbindung wird bei –20°C gelagert und ohne Reinigung verwendet.
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 3,5–3,6 (m, 12H); 3,42 (t, 2H, J = 6 Hz); 2,75 (t, 2H, J = 6 Hz); 1,81 (Quantiplet, 2H, J = 6 Hz); 1,67 (Quantiplet, 2H, J = 6 Hz); 1,30 (großes s, 2H). ¹⁹F-NMR (190 MHz, CDCl₃): δ = –76,3.
• Verbindung 63:
Zu einer Suspension von D-Biotin (6,39 g; 26,2 mMol) in 50 ml DMF wird Carbonyldiimidazol (CDI, 6,32 g, 80 %, 31,2 mMol) hinzugegeben. Die Mischung wird bei 55–60°C unter Rühren unter Argon für 30 min erhitzt. Vollständige Auflösung des Materials wird anfänglich beobachtet nach dem Sammeln in einer Masse mit Präzipitation eines weißen Feststoffes (CO₂-Emission). Das Amin (Öl) wird hinzugegeben mit der Hilfe von 5 ml CH₂Cl₂, um zu Spülen, und die Mischung wird bei 55–60°C für 3 h erhitzt. Das DMF wird unter Vakuum (< 1 mmHg) verdampft und der Rest wird mit CH₂Cl₂ (700 ml) und 2N HCl (100 ml) gerührt. Nach Filtration der zwei Phasen durch eine Schicht aus Celite 545 werden die Phasen getrennt, die wässrige Phase mit CH₂Cl₂ (15 × 100 ml) extrahiert, die organischen Phasen vereint, über wasserfreiem NaHCO₃ und MgSO₄ getrocknet und dann das Lösungsmittel verdampft. Der ölige Rückstand wird mit 150 ml Ether verrieben, um eine Suspension zu ergeben. Der pasteuse Feststoff ist schwierig zu filtrieren. Der Überstand wird abdekantiert und das Waschen mit Ether wird wiederholt. Nach Trocknen unter Vakuum werden 9,13 g (64 %) der Verbindung 63 erhalten.
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 3,5–3,6 (m, 12H); 3,42 (t, 2H, J = 6 Hz); 2,75 (t, 2H, J = 6 Hz); 1,81 (Quantiplet, 2H, J = 6 Hz); 1,67 (Quantiplet, 2H, J = 6 Hz); 1,30 (großes s, 2H).
• Verbindung 64:
Eine Lösung von Verbindung 63 in wässrigem Ammoniak (100 ml, 22 % wässrig) wird in einem 250 ml Rundbodenkolben mit einem Septum bei 55–60°C für 2 h erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wird in Methanol (20 ml) gelöst und über eine Dowex 21 K-Anionaustauschharzsäule [Höhe 12 cm × Durchmesser 35 mm, OH^–-Form, erhalten durch vorhergehendes Waschen mit 1N NaOH (1,5 l) und dann H₂O (1,5 l) und dann Methanol (1,5 l)]. Die von Trifluoracetat-Ion-freie Verbindung 64 geht in die ersten Fraktionen mit 200 ml Methanol über. Nach Verdampfen wird der Rest mit 50 ml Ether verrieben und dann abdekantiert. Das Waschen mit Ether wird fünfmal nacheinander wiederholt. Nach dem Trocknen wird die Verbindung 64 (6,43 g, 86 %) erhalten.
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 6,77 (t, 1H, J = 4 Hz); 6,32 (s, 1H); 5,52 (s, 1H): 4,45 (m, 1H); 4,28 (m, 1H), 3,50–3,68 (m, 12H); 3,30 (m, 2H), 3,11 (m, 1H); 2,86 (dd, 1H, J = 13 und 5 Hz), 2,75 (t, 2H, J = 13 Hz), 2,68 (d, 1H, J = 13 Hz); 2,16 (t, 2H, J = 7 Hz); 1,60–1,85 (m, 8H); 1,41 (m, 2H).
• [Bio-EG₃]₂-Acetal 65:
Zu einer Suspension der dibasischen Säure 60 (120 mg; 0,500 mMol) in Dichlorethan (5 ml) wird Carbonyldiimidazol (225 mg, 90 %, 1,25 mMol) hinzugegeben und die Mischung wird für 30 min bei 55–60°C unter Rühren unter Argon erhitzt. Das Amin 64 (550 mg; 1,23 mMol) wird hinzugegeben und die Lösung wird für 6 h bei 55–60°C erhitzt. Nach Verdampfen wird der Rückstand über eine Silicasäule (Durchmesser: 25 mm, Eluent: Methanol 15–30 % in CH₂Cl₂) geführt. 413 mg (75 %) von Verbindung 65 werden erhalten.
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 8,34 (s, 1H); 8,06 (s, 2H); 7,87 (m, 2H); 6,85 (m, 2H); 6,60 (s, 2H); 5,93 (s, 2H): 5,40 (s, 1H); 4,45 (m, 2H); 4,27 (m, 2H), 3,43–3,68 (m, 24H); 3,31 (s, 6H); 3,25 (m, 4H), 3,08 (m, 2H); 2,83 (dd, 2H, J = 13 und 5 Hz), 2,70 (t, 2H, J = 13 Hz); 2,13 (t, 4H, J = 7 Hz); 1,89 (Quintuplet, 4H, J = 7 Hz); 1,55–1,70 (m, 12H); 1,37 (m, 4H).
• [Bio-EG₃]₂-Aldehyd 66:
Das Acetal 65 (413 mg; 0,376 mMol), gelöst in Methanol, wird mit 2N HCl (0,5 ml) behandelt. Nach Verdampfen und Waschen mit Ether wird der Aldehyd 66 (0,37 g, 90 %) erhalten.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ = 10,11 (s, 1H); 8,82 (t, 2H, J = 6 Hz); 8,62 (s, 1H); 8,47 (s, 2H); 7,73 (t, 2H, J = 5 Hz); 4,30 (m, 2H); 4,11 (m, 2H), 3,30–3,60 (m, 24H); 3,06 (m, 6H); 2,80 (dd, 2H, J = 12 und 5 Hz), 2,56 (t, 2H, J = 12 Hz); 2,03 (t, 4H, J = 7 Hz); 1,78 (Quintuplet, 4H, J = 7 Hz); 1,35–1,60 (m, 12H); 1,28 (m, 4H).
• [Bio-EG₃]₂-PDAM 67:
Der Aldehyd 66 wird in das Diazomethan 67 umgewandelt gemäß dem für die Herstellung der Diazomethane verwendeten Verfahren (Beispiel 1).
Die Stabilität des Reagens ist größer als 1 Monat bei –20°C. Beispiel 26.2: Synthese von meta-Bio7-EG3-PMDAM: Syntheseschema:
• EG₃-Acetophenon-Verbindung 76:
3,6,9-Trioxa-1,11-undecandisäure (EG₃, 12,64 ml, 74 mMol) wird in 80 ml wasserfreiem DMF unter Argon gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 11,45 g, 55,5 mMol) wird dann in 20 ml wasserfreiem DMF gelöst und langsam hinzugegeben. Nach 30 min wird 3-Aminoacetophenon (5,0 g, 37 mMol) hinzugegeben und man erlaubt, dass die Reaktion für 1 h bei Raumtemperatur unter Argon voranschreitet. Das DMF wird dann abgedampft unter Vakuum und 70 ml CH₂Cl₂ werden hinzugegeben. Die Lösung wird abfiltriert und mit 3 × 25 ml 1 % Essigsäure extrahiert. Die wässrigen Phasen werden vereinigt und mit 25 ml CH₂Cl₂ gewaschen. Die organischen Phasen werden gemischt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockne eingedampft. Das Produkt wird erneut aus dem MeOH:H₂O-Paar erneut kristallisiert. 8,74 g (70 %) von Produkt 76 werden auf diese Weise erhalten.
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): d = 2,55 (s, 3H); 3,5–3,7 (m, 8H); 4,0 (s, 2H); 4,1 (s, 2H); 7,45 (t, 1H); 7,65 (d, 1H); 7,90 (d, 2H); 8,2 (s, 1H); 9,8 (s, 1H).
(NH₂)₇-EG₃-Acetophenon-Verbindung 77:
Das Produkt 76 (120 mg, 0,35 mMol) wird in 15 ml wasserfreiem DMF unter Argon gelöst, auf Eis gekühlt und DCC (110 mg, 0,53 mmol) werden danach hinzugegeben. Nach 30 min wird die Lösung über eine Lösung des kommerziellen Dendrimers „Starburst PAMAM Dendrimer, Generation 1'' (Aldrich, St. Quentin Fallavier) (1 g, 0,71 mMol, in 5 ml Methanol) hinzugegeben, langsam und unter kräftigem Rühren. Man erlaubt, dass die Reaktion für 1 h bei Raumtemperatur voranschreitet und die Mischung wird verdampft. Der Rückstand wird in 10 ml CH₂Cl₂ aufgenommen und zweifach mit 30 ml 1 % Essigsäure extrahiert.
Biot₇-EG₃-Acetophenon-Verbindung 78:
D-Biotin (1,73 g, 7,08 mMol) wird in 80 ml wasserfreiem DMF unter Argon solubilisiert und die Lösung wird auf Eis abgekühlt. N-Methylmorpholin (NMM, 856 μl, 7,7 mMol) und Isobutylchloroformat (1022 μl, 7,7 mMol) werden sukzessive hinzugegeben. Nach 30 min wird das Produkt 77 (1,13 g, 0,7 mMol, in 5 ml Methanol) hinzugegeben und man erlaubt der Reaktion, für 3 h auf Eis unter Argon voranzuschreiten. Die Mischung wird unter Vakuum auf 50 ml konzentriert und 100 ml CH₂Cl₂ werden hinzugegeben. Es bildet sich ein Niederschlag, der abfiltriert, mit Ether gewaschen und unter Vakuum getrocknet wird. 1,3 g von 78 werden in der Form eines weißen Pulvers erhalten.
• Biot₇-EG₃-Hydrazon-Verbindung 79:
Die Verbindung 78 (300 mg, 0,09 mMol) wird in 10 ml absolutem Ethanol unter Rückfluss gelöst. Hydrazinmonhydrat (20 ml, 0,40 mMol) wird hinzugegeben und man erlaubt, dass die Reaktion für 3 h unter Rückfluss voranschreitet. Nach dem Abkühlen bildet sich ein Niederschlag, der abfiltriert, mit Ether gewaschen und unter Vakuum getrocknet wird. 109 mg (36 %) des Produktes 79 werden so in der Form eines weißen Pulvers erhalten.
• Biot₇-EG₃-PMDAM-Verbindung 80:
Das Hydrazon 79 (100 mg, 0,03 mMol) wird in 5 ml wasserfreiem DMF bei 70°C solubilisiert. Man erlaubt, dass die Mischung auf Raumtempeartur zurückkehrt, und MnO₂ (31 mg, 0,36 mMol) werden hinzugegeben. Man erlaubt, dass die Reaktion für 10 min voranschreitet und das Manganoxid wird durch Filtration auf gesintertem Glas mit Celite (0,5 cm) und pulverisiertem Molekularsieb (0,5 cm) entfernt. Das Filtrat wird bis zur Trockne eingedampft, mit Ether gewaschen und über Vakuum getrocknet. 78 mg (78 %) des Produktes 80 werden somit erhalten.
Dendrimere sind arboreszente Moleküle, die, an den Enden, mehrere reaktive Gruppen wie beispielsweise Amine, Carboxyle, Hydroxyle und dergleichen besitzen (für eine Übersicht, siehe Newcome et al, (1996) Dendritic Molecules: Concept, Syntheses, Perspectives. VCH-Ausgabe, Weinheim, Deutschland). Die Synthese dieser Moleküle ist heutzutage vollständig kontrolliert und viele Dendrimere werden durch die chemische Industrie vermarktet. Die Wahl für TAMAM (Sigma-Aldrich) wurde getroffen auf der Grundlage seiner Stabilität, Löslichkeit und Flexibilität, da mehrere Versionen dieses Moleküls, mit einer unterschiedlichen Anzahl und Art von Enden, verfügbar sind. „PAMAM Generation 1" erlaubt es, sieben Moleküle des Markers (in einem einzelnen Syntheseschritt) für eine jede Diazomethylgruppe anzufügen.
Beispiel 27: Markierung und Fragmentierung von DNA-Amplicons mit meta-BioPMDAM in zwei Schritten:
Die DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll hergestellt. Zwei Markierungsreaktionen wurden durchgeführt:
a. Markierung und Fragmentierung in zwei Schritten:
Zu 10 μl PCR werden 10 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) und 77 μl Dnase/Rnase-freies Wasser hinzugegeben. Die Lösung wird für 10 min bei 95°C inkubiert. 3 μl 0,1 M HCl werden dann hinzugegeben und die Lösung wird für 10 min bei 95°C inkubiert.
b. Markierung und Fragmentierung in einem Schritt:
Zu 10 μl PCR werden 10 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO), 5 μl 0,1 M HCl und 75 μl Dnase/Rnase-freies Wasser hinzugegeben. Die Lösung wird für 30 min bei 60°C inkubiert.
Der Rest des Protokolls ist identisch zu dem von Beispiel 7. Ergebnisse: Tabelle 13: Vergleichsstudie der Markierung und Fragmentierung in zwei distinkten Schritten und in einem einzelnen Schritt
Wie in Tabelle 13 gezeigt, sind die mit dem Protokoll in einem Schritt erhaltenen Ergebnisse zufriedenstellend. Jene, die mit einer Markierung und Fragmentierung in zwei Schritten erhalten werden, sind sogar besser. Dieses Beispiel zeigt, dass die Markierungs- und Spaltungsschritte voneinander getrennt werden können, um die Markierung entsprechend dem verwendeten Ziel zu verbessern.
Beispiel 28: Markierung und Fragmentierung von DNA-Amplicons in verschiedenen Reaktionsformaten:
Die DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll hergestellt. Drei Markierungsreaktionen wurden durchgeführt.
a. Markierung und Fragmentierung in einem 250 μl-Format:
Zu 50 μl PCR werden 75 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) hinzugegeben und 102,5 μl Dnase/Rnase-freies Wasser. Die Lösung wird für 25 min bei 95°C inkubiert. 22,5 μl 0,1 M HCl werden dann hinzugegeben und die Lösung für 5 min bei 95°C inkubiert.
b. Markierung und Fragmentierung in einem 200 μl-Format:
Zu 50 μl PCR werden 75 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) und 52,5 μl Dnase/Rnase-freies Wasser hinzugegeben. Die Lösung wird für 25 min bei 95°C inkubiert. 22,5 μl 0,1 M HCl werden dann hinzugegeben und die Lösung für 5 min bei 95°C inkubiert.
c. Markierung und Fragmentierung in einem 150 μl-Format:
Zu 50 μl PCR werden 75 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) und 2,5 μl Dnase/Rnase-freies Wasser hinzugegeben. Die Lösung wird für 25 min bei 95°C inkubiert.
22,5 μl 0,1 M HCl werden dann hinzugegeben und die Lösung für 5 min bei 95°C inkubiert.
Der Rest des Protokolls ist identisch zu dem von Beispiel 9. Ergebnisse: Tabelle 14: Markierung und Fragmentierung gemäß verschiedenen Formaten
Die hinsichtlich Signal und Prozentsatz Homologie erhaltenen Ergebnisse sind in allen Fällen sehr zufriedenstellend. Weiterhin zeigen die Ergebnisse ähnliche Werte, gleichwohl das Reaktionsformat von 150 bis 250 μl variiert.
Dieses Beispiel zeigt eine Flexibilität des Reaktionsformates des Markierungsprotokolls, das unterschiedliche Volumina und insbesondere unterschiedliche Volumina von Amplifikationsprodukten akzeptieren kann.
Beispiel 29: Vergleich zwischen einem Protokoll, das einen Reinigungsschritt vor Fragmentierung verwendet, und einem Protokoll, das einen Reinigungsschritt nach Fragmentierung verwendet:
Die DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll hergestellt. Zwei Markierungsreaktionen wurden durchgeführt.
a. Markierung, Reinigung und dann Fragmentierung der DNA-Amplicons:
Zu 10 μl PCR werden 10 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) hinzugegeben und 80 μl Dnase/Rnase-freies Wasser. Die Lösung wird für 10 min bei 95°C inkubiert. Die Reinigung wird dann durchgeführt gemäß dem in Beispiel 9 beschriebenen Protokoll. Zur Lösung aus gereinigten markierten Amplicons werden 6 μl 0,1 M HCl hinzugegeben. Die Lösung wird für 10 min bei 95°C inkubiert. Vierhundert (400) μl Hybridisierungspuffer, vorerhitzt auf 95°C für 10 min, werden hinzugegeben.
Die Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers und der Rest des Protokolls sind identisch zu dem von Beispiel 9.
b. Markierung, Fragmentierung und dann Reinigung der DNA-Amplicons:
Zu 10 μl PCR werden 10 μl meta-BioPMDAM (100 mM in DMSO) und 77 μl Dnase/Rnase-freies Wasser hinzugegeben. Die Lösung wird für 10 min bei 95°C inkubiert.
3 μl 0,1 M HCl werden dann hinzugegeben und die Lösung wird wieder für 10 min bei 95°C inkubiert. Der Rest des Protokolls ist identisch zu dem von Beispiel 9. Ergebnisse: Tabelle 15: Vergleich zwischen einem Protokoll, das einen Reinigungsschritt vor Fragmentierung verwendet, und einem Protokoll, das einen Reinigungsschritt nach Fragmentierung verwendet
Dieses in Tabelle 15 präsentierte Ergebnis zeigt, dass der Reinigungsschritt zwischen den Markierungs- und Fragmentierungsschritten eingeführt werden kann. Weiterhin erlaubt die Einführung von Reinigung zwischen den Markierungs- und Fragmentierungsschritten, dass die Denaturierung während der Spaltung durchgeführt wird, um auf dem Chip alle markierten Amplicon-Fragmente zu hybridisieren. Beispiel 30: Synthese von 2-Nitro-para-BioPDAM: Syntheseschema:
• Schutz des Aldehyds:
5 g (25,5 mmol) 2,4-Dinitrobenzaldehyd werden in 250 ml Toluol gelöst und 200 ml Ethylenglycol und 150 mg para-Toluensulfonsäure hinzugegeben. Die Mischung wird unter Rückfluss erhitzt, wobei das Wasser in einem Dean-Stark-System für 6 h wiedergewonnen wird. Die Mischung wird mit 150 ml EtOAc und 100 ml H₂O behandelt. Die Lösung wird zweifach mit Ethylacetat extrahiert, die organische Phase mit MgSO₄ getrocknet und dann verdampft. Das erhaltene Öl, entsprechend Produkt 100, wird für die nächste Reaktion verwendet.
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 8,70 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₃); 8,44 (dd, 1H_aro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H₅); 8,02 (d, 1H_aro, J = 8 Hz, H₆); 6,49 (s, 1H, CH); 4,12–4,06 (m, 4H, CH₂-CH₂).
• Reduktion des Dinitro-Derivates 100:
Der geschützte 2-4-Dinitrobenzaldehyd (6,4 g; 25,5 mMol) wird in einer Mischung aus Ethanol und Wasser (6/1) gelöst und dann werden 2 Äquivalente Na₂S-Nonahydrat (12,3 g; 51,1 mMol) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wird dann für 30 min erhitzt. Sie wird verdampft und dann einer Extraktion unter Verwendung von Dichlormethan unterzogen. Nach Trocknen und Filtrieren wird das Reaktionsmedium verdampft, um ein Öl zu erhalten, das direkt auf einer Silicasäule (Cyclohexan/Ethylacetat 60/40) gereinigt wird. Die Verbindung 101 wird mit einer Ausbeute von 45 % isoliert.
Verbindung 101: F 58–60°C. – ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): 7,49 (d, 1H_Aro, J = 2 Hz, H₃); 7,09 (d, 1H_Aro, J = 2 Hz, H₆); 6,80 (dd, 1H_Aro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H₅); 6,27 (s, 1H, CH); 3,99–3,97 (m, 4H, CH₂-CH₂).
• Kuppeln mit Biotin
Das D-Biotin (1,0 g; 4,1 mMol) wird in 20 ml wasserfreiem DMF und 600 μl N-Methylmorpholin solubilisiert. Isobutylchloroformiat (700 μl; 5,5 mMol) werden unter Argon hinzugegeben, während auf Eis gekühlt wird. Die Mischung wird für 5 Minuten gerührt und dann 1 g (4,75 mMol) von Verbindung 101 und 500 μl N-Methylmorpholin hinzugegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur für 4 Stunden weitergerührt und dann bis zur Trockne eingedampft. Das erhaltene Öl wird direkt über eine Silikasäule geführt mit, als Elutionslösungsmittel, MeOH-DCM 7 % und dann 10 %. Das Produkt 102 (1,1 g; 2,52 mMol) wird mit einer Ausbeute von 62 % erhalten.
¹H NMR 200MHz, DMSO-d₆) δ = 10,40 (s, 1H, NH-CO); 8,31 (d, 1H_Aro, J = 2 Hz, H₃); 7,77 (dd, 1H_Aro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H₅); 7,68 (d, 1H_Aro, J = 2 Hz, H₆); 6,43 (s groß, 1H, NH-CO-NH); 6,36 (s groß, 1H, NH-CO-NH); 6,23 (s, 1H, CH); 4,28 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,92 (s, 4H, CH₂-CH₂); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,85 et 2,76 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1,61–1,39 (m, 6H, (CH₂)₃).
• Entschützen des Acetals:
Das Produkt 102 (768 mg; 1,76 mMol) wird in 25 ml THF suspendiert. Das ganze wird nach Zugabe von 4 ml 2N H₂SO₄ gelöst. Die Mischung wird weiter für 2 Stunden gerührt. Sie wird verdampft und dann abgespült und mit Wasser auf gesinntertem Glas gewaschen. Die Verbindung 103 (694 mg) in der Form eines gelben Pulvers wird mit einer Ausbeute von 90 % erhalten.
Schmelzpunkt 165°C. – ¹H-NMR (200MHz, DMSO-d₆) δ = 10,69 (s, 1H, NH-CO); 10,09 (s, H, CHO); 8,43 (d, 1H_Aro, J = 2 Hz, H₃); 7,91 (s, 2H_Aro, H₅ und H₆); 6,42 (s groß, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s groß, 1H, NH-CO-NH; δ = 6,23 (s, 1H, CH); 4,29 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,84 und 2,78 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1,61–1,39 (m, 6H, (CH₂)₃).
• Bildung des Hydrazons 104:
Der Aldehyd 103 wird in Ethanol suspendiert und die Suspension auf 80°C erhitzt. Wenn Hydrazin hinzugegeben wird, löst sich das Ganze und die Lösung wird unmittelbar orange gefärbt. Ein Niederschlag bildet sich nach 5 Minuten. Die Mischung wird unte Rühren für eine Stunde erhitzt. Sie wird auf einem gesinnterten Glas filtriert und dann der Niederschlag getrocknet. Das Produkt 104 (700 mg; 690 mMol) wird mit einer Ausbeute von 98 % erhalten.
Schmelzpunkt 169°C. – ¹H-NMR (200MHz, DMSO-d₆) δ = 10,31 (s, 1H, NH-CO); 8,31 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₃); 7,96 (s, H, CHO); 7,87 (d, 1H_Aro, J = 2 Hz, H₆); 7,68 (dd, 1H_Aro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H₅); 7,31 (s, 2H, NH₂); 6,42 (s groß, 1H, NH-CO-NH); 6,34 (s groß, 1H, NH-CO-NH); 4,29 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,84 und 2,78 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1,61–1,39 (m, 6H, (CH₂)₃).
• Bildung des Diazo 105:
Verbindung 104 (200 mg; 0,495 mMol) werden in 8 ml DMF gelöst. 400 mg MnO₂ werden hinzugegeben. Die Mischung wird kräftig für 10 Minuten gerührt. Sie wird auf Millipor enthaltend Celite (Stärke: 2 cm) und pulverförmigem Molekularsieb mit 3 Å (0,5 cm) filtriert. Sie wird bis zur Trockne eingedampft und dann mit Ether gewaschen. Die Mischung wird erneut auf Millipor filtriert. Verbindung 105 (180 mg; 0,445 mMol) wird in der Form eines orangefarbenen Pulvers mit einer Ausbeute von 98 % erhalten.
Schmelzpunkt 155°C. – ¹H-NMR (200MHz, DMSO-d₆) δ = 10,21 (s, 1H, NH-CO); 8,60 (d, 1H_Aro, J = 2 Hz, H₃); 7,77 (d, 1H_Aro, J = 6 Hz, H₅); 7,22 (d, 1H_Aro, J = 6 Hz, H₆); 6,60 (s, H, CH-N); 6,41 (s groß, 1H, NH-CO-NH); 6,33 (s groß, 1H, NH-CO-NH); 4,29 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,84 et 2,78 (System ABX, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2,29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1,61–1,39 (m, 6H, (CH₂)₃).
Die Reaktivität der Verbindung 105 wurde an Uridin-3'-Monophosphat getestet, gefolgt von Kapillarelektrophorese. Die Analysebedingungen sind jene von Beispiel 6.1. Die Ergebnisse zeigen eine Halbreaktionszeit von 45 Minuten.
Die Stabilität des Reagens ist größer als 1 Monat bei –20°C.
Beispiel 31: Markierung und Fragmentierung der DNA-Amplikons mit dem Markierungsreagens 2-Nitro-para-Bio-PDAM:
Das 2-Nitro-para-Bio-PDAM-Derivat wurde gemäß dem in Beispiel 30 beschriebenen Reaktionsschema erhalten. Die DNA-Amplicons wurden durch PCR-Amplifikation gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll hergestellt. Zwei Markierungsreaktionen wurden durchgeführt.
a. Markierung mit dem 2-Nitro-para-BioPDAM-Reagens:
Zu 10 μl PCR werden 2 μl 2-Nitro-para-bioPDAM (100 mM in DMSO), 5 μl 0,1 M HCl und 83 μl Dnase/Rnase-freies Wasser hinzugegeben. Diese Lösung wird für 30 Minuten bei 60°C inkubiert.
b. Markierung mit dem Meta-bioPMDAM-Reagens:
Zu 10 μl PCR werden 2 μl meta-bioPMDAM (100 mM in DMSO), 5 μl 0,1 M HCl und 83 μl Dnase/Rnase-freies Wasser hinzugegeben. Diese Lösung wird für 30 Minuten bei 60°C inkubiert.
Der Rest des Protokolls ist identisch zu dem von Beispiel 9. Ergebnisse: Tabelle 16: Vergleichsstudien zur Markierung von DNA mit dem 2-Nitro-para-BioPDAM-Derivat verglichen mit dem meta-BioPMDAM-Derivat
Das 2-Nitro-para-BioPDAM-Reagens, das für die Markierung der DNA verwendet wird, ergibt vorteilhaftere Ergebnisse hinsichtlich der Markierungsintensität und des Prozentsatzes Homologie.
Beispiel 32: Einführen einer Doppelbindung zwischen die funktionelle Diazomethyl-Gruppe und dem Phenyl-Nukleus, räumliches Trennen des DAM und Synthese eines Moleküls, das für dieses räumliche Trennen besonders geeignet ist:
Das Ziel, auf das abgestellt wird, ist das räumliche Trennen der funktionellen Diazomethylgruppe (DAM) der aromatischen Struktur, um die Wirkung einer sterischen Hinderung durch die Alkylierung des Phosphates und auch während der Hybridisierung der markierten Nukleinsäure mit ihrer komplementären Sequenz zu minimieren. Syntheseschema:
Für die Aldol-Reaktion zur Bildung von (Para-methoxycarbonyl)-Styrylmethylketon 89 verwendet man Ethylacetoacetat wegen der hohen Azidität des Protons des Methylens, was den Angriff der Formylgruppe, mit nachfolgender Eliminierung von H₂O (gefördert durch die Konjugation der Doppelbindung mit dem aromatischen Ring) und Decarboxylierung mit Hydrolyse in Folge des basischen Mediums erleichtert. Der Rest der Synthese ist ähnlich zu dem, was in den anderen Beispielen gezeigt worden ist.
Das Endprodukt Para-Bio-EG₃-SMDAM 90 besitzt zwei weitere Kohlenstoffe zwischen dem Diazomethyl und dem aromatischen Ring, was die möglichen sterischen Probleme limitiert, während die Stabilisierung des Diazomethyls durch das aromatische System durch Konjugation beibehalten wird.
Bespiel 33: Fangen und Nachweis einer Nukleinsäure auf einem festen Träger, der die Diazomethyl-Gruppen trägt
Die Reaktivität eines Harzes, das Diazomethylgruppen trägt, wurde untersucht, um seine Fähigkeit zu bestimmen, Nukleinsäuren zu binden.
4-(Diazomethyl)phenoxymethyl-polystyrol (Referenz 17338, Fluka) ist ein Harz, das hinsichtlich seiner Fähigkeit so beschrieben ist, dass es Carboxylgruppen bildet, insbesondere jene, die in Proteinen vorhanden sind (G. Bhalay, A.R. Dunstan, Tetrahedron Lett. 39, 7803 – 1998), aber es ist nicht hinsichtlich seiner Fähigkeit beschrieben, DNA-Moleküle zu binden. Wir testeten die Möglichkeit, Nukleinsäuren mit diesem Agens einzufangen und die Möglichkeit, sie durch einen kolorimetrischen Test zu visualisieren.
Das Experiment wird mit einem Teil der in dem HLA-DR-Oligo-Nachweiskit (Referenz 33202, bioMérieux, Frankreich, Grundprinzip beschrieben in dem Patent EP 549 776-B1) vorhandenene Reagenzien durchgeführt, was den Nachweis von Nukleinsäuren, die durch PCR in Mikroplatten amplifiziert werden, durch kolorimetrisches Auslesen erlaubt. Im Zusammenhang mit dem beschriebenen Experiment werden Nukleinsäuren, die durch PCR produziert werden, veranlasst, gleichzeitig mit dem getesteten Harz und mit einem Molekül para-Bio-EG3-PDAM, dessen Synthese in Beispiel 20 erwähnt ist, zu reagieren. Wenn die DNA mit den funktionellen Diazomethylgruppen, die an den zwei Verbindungen vorhanden sind, reagiert, wird es möglich sein, sie nach Waschen und Entfernen der Moleküle, die nicht-kovalent gebunden sind, unter Verwendung einer kolorimetrischen Reaktion zu visualisieren, die ein Enzym beteiligt, das an Streptavidin gekoppelt ist. Streptavidin ist kombiniert mit Meerrettichperoxidase, wobei es für dieses Enzym möglich ist, ein ortho-Phenylendiamin-Molekül (Farbe-1-Reagens des Kits) in eine Verbindung zu zersetzen, die bei einer Wellenlänge von 492 nm nachgewiesen werden kann.
Beispiel 33.1: Fangen und Nachweisen der DNA:
10 mg des Harzes werden für 30 Minuten bei 60°C mit 50 μl PCR, die wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt wurde, in 400 μl reinem Wasser (Sigma) inkubiert, das mit 5 μl para-Bio-EG3-PDAM supplementiert ist. Das Harz wird dann mit 500 μl PBS Tween-Puffer (Farbe 0-HLA-Reagens des Kits, PBS pH 7,0; 1 % Tween, 0,2 g/l BND; 0,01 g/l Ciproflaxacin) gewaschen. Das Harz wird dann in 100 μl PBS Tween und 250 μl Streptavidin-Hybridiserungspuffer (PBS pH 7,0 0,5 % Tween), supplementiert mit Streptavidin-HRP (S-911, MOLECULAR PROBES, EUGENE, OREGON, USA) verdünnt zu 1/10.000, resuspendiert. Die Reaktionsmischung wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Harz wird dann dreimal (3-mal) mit 500 μl PBS-Tween-Puffer gewaschen und es wird bei Raumtemperatur in Gegenwart eines chromogenen Reagens (1 Farbe 1-Tablette, ortho-Phenylendiamin-Hydrochlorid, verdünnt in 5 ml Farbe 2-Puffer, 100 mM Natriumphosphat, 50 mM Zitronensäure, 0,03 % H₂O₂) inkubiert. Nach Inkubation für 20 Minuten im Dunkeln wird die Reaktion mit 50 μl H₂SO₄ (1,8N Farbe 3-Reagens) blockiert. Der Überstand wird dann pipettiert und in eine Mikroplatte gegeben, um die Absorbanz des Reaktionsmediums bei 492 nm auszulesen.
Beispiel 33.2: Kontrolle ohne Nukleinsäure:
10 mg Harz werden für 30 Minuten bei 60°C in 425 μl reinen Wassers (Sigma) inkubiert; das mit 5 μl para-Bio-EG3-PDAM supplementiert ist. Das Harz wird dann mit 500 μl PBS-Puffer gewaschen und die Probe wird dann in einer Art und Weise behandelt, die identisch zu dem in Beispiel 33.1 beschriebenen Verfahren ist.
Beispiel 33.3: Kontrolle mit PCR, die ohne Zielmoleküle durchgeführt wird:
10 mg Harz werden in 400 μl reinen Wassers inkubiert, das mit 5 μl para-bio-EG3-PDAM supplementiert ist, für 30 Minuten bei 60°C, mit 50 μl PCR, die mit einem Volumen von 25 μl reinen Wassers anstelle des Volumens der beschriebenen genomischen DNA durchgeführt wird. Dieses Harz wird dann mit 500 μl PBS-Puffer gewaschen. Die Probe wird dann in einer Art und Weise behandelt, die identisch zu dem in Beispiel 33.1 beschriebenen Verfahren ist.
Beispiel 33.4: Kontrolle mit PCR ohne ein enthüllendes Molekül:
10 mg Harz werden mit 50 μl PCR in 400 μl reinen Wassers für 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Das Harz wird dann mit 500 μl PBS-Puffer gewaschen. Die Probe wird dann in einer Art und Weise behandelt, die identisch ist zu dem in Beispiel 33.1 beschriebenen Vorgehen.
Beispiel 33.5: Kontrolle mit nicht-gefangener Nukleinsäure:
10 mg Harz werden für 30 Minuten bei 60°C mit 400 μl reines Wasser inkubiert, das mit 5 μl para-Bio-EG3-PDAM supplementiert ist. Das Harz wird dann mit 500 μl PBS-Tween-Puffer (Farbe 0-HLA-Reagens des Kits, PBS pH 7,0; 1 % Tween, 0,2 g/l BND; 0,01 g/l Ciproflaxacin) gewaschen. Das Harz wird dann in 100 μl PBS-Tween und 250 μl Streptavidin-Hybridisierungspuffer, supplementiert mit Streptavidin-HRP, 1/10.000-fach verdünnt, erneut suspendiert. Zu diesem Präparat werden 50 μl eines DNA-Präparates hinzugegeben, das wie folgt hergestellt ist:
5 μl para-Bio-EG3-PDAM und 70 μl reines Wasser werden zu 25 μl DNA hinzugegeben, die aus einer PCR erhalten ist, die wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt ist. Die Mischung wird für 30 Minuten bei 60°C inkubiert und dann die überschüssige Markierung entfernt, indem das Präparat einer Reinigung auf einer QIAquick-Säule (Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) ausgesetzt wird, gemäß dem Protokoll, das vom Hersteller empfohlen wird, was eine letztendliche Elution in einem Volumen von 50 μl bewirkt.
Die Reaktionsmischung wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und wird dann gemäß dem in Beispiel 33.1 beschriebenen Verfahren behandelt. Ergebnisse Tabelle 17: Studie der Reaktivität eines Harzes, das Diazomethyl-Gruppen trägt
In Tabelle 17 zeigt ein hoher kolorimetrischer Wert eine hohe Konzentration an Enzym in dem Reaktionsmedium an entsprechend einer umfänglichen Anwesenheit von Nukleinsäure, die Biotinderivate trägt. Die Kontrollen zeigen an, dass das Signal nicht durch unspezifische Adsorption der DNA an das Kügelchen, einer Reaktion des para-Bio-EG3-PDAM auf dem Harz, oder einer Adsorption der Streptavidin-HRP auf dem Harz bedingt wird, sondern in der Tat durch die Anwesenheit von DNA, die kovalent gefangen und mit para-Bio-EG3-PDAM markiert ist.
Beispiel 34: Markierung eines PCR-Produkts, was sein Einfangen und seinen Nachweis in einer Mikrotiterplatte erlaubt
Die Möglichkeit, ein DNA-Molekül mit nur einer Art von Molekül, das eine funktionelle Diazomethyl-Gruppe trägt, zu markieren um diese Nukleinsäure in einem einzelnen Schritt in einer Mikroplatte einzufangen und nachzuweisen, ist in diesem Experiment gezeigt.
Das Experiment wird durchgeführt mit einem Teil des Reagens, das in dem HLA-DR-Oligo-Nachweiskit (Referenz 33 202, bioMérieux) vorhanden ist, was den Nachweis von Nukleinsäuren durch kolorimetrisches Auslesen erlaubt, die durch PCR in Mikroplatten amplifiziert sind. Im Kontext des beschriebenen Experimentes wird para-Bio-EG3-PDAM, dessen Synthese in Beispiel 20 beschrieben ist, mit Nukleinsäuren umgesetzt, die durch PCR hergestellt werden. Die DNA reagiert mit den Diazomethylgruppen des Moleküls und wird somit mit Biotin versehen, das auf seinem Phosphat aufgepfropft ist. Es wird dann möglich sein, die Nukleinsäure durch Inkubieren in einer Mikroplatte einzufangen, wo Streptavidin- Moleküle adsorbiert sind, und sie durch kolorimetrische Reaktion zu visualisieren. Ein Nachweisreagens wird verwendet, das auch ein Streptavidinmolekül ist, kombiniert mit Meerrettichperoxidase (HRP). Unter den verwendeten Bedingungen kann die Peroxidase ein ortho-Phenylendiamin-Molekül (Farbe 1-Reagens des Kits) in eine Verbindung zersetzen, die bei einer Wellenlänge von 492 nm nachgewiesen werden kann.
Beispiel 34.1: Fangen und Nachweis der durch PCR bereitgestellten DNA auf einer Mikroplatte:
10 μl DNA, die durch PCR-Amplifikation wie in Beispiel 5 beschrieben erhalten wurde, werden markiert, indem sie für 30 min bei 60°C in 80 μl reinen Wasser (Sigma) inkubiert werden, das mit 10 μl para-Bio-EG3-PDAM supplementiert ist. Nach dem Markieren wird die DNA auf einer QIAquick-Säule (Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll gereinigt und das letztendliche Eluat in 50 μl EB-Puffer (10 mM Tris EDTA, pH 8,5) gesammelt. Zwanzig (20) μl dieses Eluats werden in 180 μl PEG-Puffer (0,1 M NaPO3; 0,5 M NaCl; 0,65 % Tween 20; 0,14 mg/ml Lachsspermien-DNA (Gibco); 2 % PEG 4000), der mit Streptavidin-HRP (S-911, Molecular Probes, Eugene, OR, USA), verdünnt auf 1/10.000, supplementiert ist, verdünnt. Einhundert (100) μl dieses Präparates werden dann für 1 h bei 37°C inkubiert, entweder in einem Napf einer Streptavidin-beschichteten Combiplate 8, Referenz 95029263, Labsystem, Helsinki, Finnland) oder in einem Kontrollnapf, von einem Maxisorb-Streifen (Nunc, Dänemark).
Beispiel 34.2: Herstellen von Kontrollen:
Kontrollen werden gleichzeitig in der folgenden Art und Weise hergestellt:
A – Markierungskontrolle ohne DNA:
Neunzig (90) μl reinen Wassers, das mit 10 μl para-Bio-EG3-PDAM supplementiert ist, werden für 30 min bei 60°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wird dann in einer Art und Weise ähnlich dem oben in Beispiel 34.1 beschriebenen Vorgehen behandelt.
B – Markierungskontrolle ohne Marker:
Zehn (10) μl DNA, die durch PCR-Amplifikation erhalten werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, werden für 30 min bei 60°C in 90 μl reinen Wassers inkubiert. Die Reaktionsmischung wird dann in einer Art und Weise behandelt, ähnlich dem oben in Beispiel 34.1 beschriebenen Verfahren.
Alle Streifen werden dann dreimal mit 100 μl PBS-Tween-Puffer (Farbe 0 HLA-Reagens des Kits, PBS pH 7,0; 1 % Tween, 0,2 g/l BND; 0,01 g/l Ciproflaxacin) gewaschen und die Anwesenheit von Streptavidin-HRP wird dann durch Zugabe von 100 μl chromogenem Reagens (eine Farbe 1-Tablette, ortho-Phenylendiamin-Hydrochlorid, verdünnt in 5 ml Farbe 2-Puffer, 100 mM Natriumphosphat, 50 mM Zitronensäure, 0,03 % H₂O₂) visualisiert, für 20 min im Dunkeln inkubiert, wobei die Reaktion mit 50 μl H₂SO₄ (1,8 M Farbe 3-Reagens) dann blockiert wird. Die Absorbanz des Reaktionsmediums wird bei 492 nm gemessen. Ergebnisse: Tabelle 18: Nachweis von DNA, die gefangen und mit para-Bio-EG3-PDAM markiert ist
Das in Tabelle 18 dargestellte Ergebnis zeigt also, dass die mit para-Bio-EG3-PDAM markierte DNA in einem einzelnen Schritt eingefangen und in einem Mikroplattennapf nachgewiesen werden kann. Wie die Reaktionskontrollen belegen, geht das erzeugte Signal nur auf die DNA zurück und resultiert nicht aus einer nicht-spezifischen Adsorption der Nukleinsäure an die Wand der Mikroplatte, oder an Streptavidin, oder alternativ aus einer nicht-spezifischen Reaktion von Streptavidin-HRP mit nicht-markierter DNA oder mit dem Kunststoff der Mikroplatte.
Beispiel 35: Doppelmarkierung eines PCR-Produktes, was sein Fangen und seinen Nachweis auf einem festen Träger vom Mikroplatten-Typ erlaubt:
Die Möglichkeit der Markierung eines DNA-Moleküls mit zwei Molekülen, die funktionelle Diazomethylgruppen tragen, und in einem einzigen Schritt, um es einzufangen und es auf einer Mikroplatte nachzuweisen, wird in diesem Beispiel gezeigt.
Das Beispiel wird mit einem Teil der in dem HLA-DR-Oligo-Nachweiskit vorhandenen Reagenzien durchgeführt, was den Nachweis von Nukleinsäuren durch einfaches kolorimetrisches Auslesen erlaubt, die durch PCR in Mikroplatten amplifiziert sind. Im Kontext des beschriebenen Experimentes wird gleichzeitig:

– 1-Pyrenyldiazomethan (PDAM), und
– para-Bio-EG3-PDAM

Wenn die DNA mit den funktionellen Diazomethylgruppen, die auf den beiden Verbindungen vorhanden sind, reagiert, wird sie in der Lage sein, an einen Träger zu binden, der anti-Pyren-Antikörper trägt und es wird möglich sein, sie mit einem Streptavidinmolekül zu visualisieren, das mit Meerrettichperoxydase kombiniert ist. Dieses Enzym kann ein ortho-PhenylendiaminMolekül zu einer Verbindung zersetzen, die bei einer Wellenlänge von 492 nm nachgewiesen werden kann, wodurch es als Enthüllungsreagens wirkt.
Beispiel 35.1: Doppelmarkierung der DNA und Nachweis auf einer Mikroplatte
Anti-Pyrenantikörper wurden auf Maxisorp-Streifen mit acht (8) Näpfen adsorbiert, indem über Nacht bei Raumtemperatur 100 μl eine Lösung aus 1,1 μl anti-Pyrenantikörper, der in 100 μl Biocarbonatpuffer (0,05 M pH 9,6) verdünnt war, inkubiert wurde. Derartige Antikörper, als Kanninchen-anti-Pyren (Bezug YSRT-AHP236) bezeichnet, sind erhältlich von Accurate Chemical & Scientific (Westbury, New York, Vereinigte Staaten von Amerika). Natürlich hätte dies auch mit anderen kommerziell erhältlichen Antikörpern durchgeführt werden können, ohne dass es unterschiedliche Ergebnisse verglichen mit jenen gegeben hätte, die in diesem Beispiel erhalten wurden.
10 μl DNA, die durch PCR-Amplifikation erhalten werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden dann markiert, indem sie für 30 min bei 60°C in 40 μl reinen Wassers (Sigma), 10 μl para-Bio-EG3-PDAM, 2 μl PDAM (P-1405, 1-Pyrenyldiazomethan, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) und 38 μl DMSO inkubiert wurden.
Nach dem Markieren wurde die DNA gereinigt unter Verwendung eines QIAquick-Kits (QIAGEN) und das letztendliche Eluat wurde in 50 μl EB-Puffer (10 mM Tris EDTA, pH 8,5) gesammelt. Zwanzig (20) μl dieses Eluats wurden verdünnt in 180 μl PEG-Puffer (0,1 M NaPO3; 0,5 M NaCl; 0,65 % Tween 20; 0,14 mg/ml Lachsspermien-DNA (Gibco); 2 % PEG 4000), der mit Streptavidin-HRP (S-911, MOLECULAR PROBES, EUGENE, OR, USA), die 1/10.000 verdünnt war, supplementiert war. Einhundert (100) μl dieses Präparates wurden dann für 1 h bei 37°C entweder in einem adsorbierten Maxisorp-Streifennapf oder in einem nicht-adsorbierten Kontrollnapf inkubiert.
Beispiel 35.2: Herstellung von Kontrollen
Kontrollen wurden gleichzeitig in der folgenden Art und Weise hergestellt:
A – Kontrollen für das Markieren mit para-Bio-EG3-PDAM alleine:
Zehn (10) μl DNA, die durch PCR-Amplifikation erhalten werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, werden durch Inkubation für 30 min bei 60°C in 90 μl reinen Wassers markiert, das mit 10 μl para-Bio-EG3-PDAM supplementiert ist. Nach Markierung wird die DNA gereinigt unter Verwendung eines QIAquick-Kits und das letztendliche Eluat wird in 50 μl EB-Puffer gesammelt. Zwanzig (20) μl dieses Eluats werden in 180 μl PEG-Puffer verdünnt, der mit Streptavidin-HRP, verdünnt 1/10.000, supplementiert ist. Einhundert (100) μl dieses Präparates werden dann für 1 h bei 37°C inkubiert, entweder in einem adsorbierten Maxisorp-Streifennapf, oder in einem nicht-adsorbierten Napf.
B – Kontrollen für Markierung mit PDAM alleine:
Zehn (10) μl DNA, die durch PCR-Amplifikation erhalten werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, werden durch Inkubation für 30 min bei 60°C in 90 μl reinen Wassers markiert, das mit 2 μl PDAM und 38 μl DMSO supplementiert ist. Nach Markierung wird die DNA gereinigt unter Verwendung eines QIAquick-Kits und das letztendliche Eluat wird in 50 μl EB-Puffer gesammelt. Zwanzig (20) μl dieses Eluats werden in 180 μl PEG-Puffer verdünnt, der mit Streptavidin-HRP, verdünnt 1/10.000, supplementiert ist. Einhundert (100) μl dieses Präparates werden dann für 1 h bei 37°C inkubiert, entweder in einem adsorbierten Maxisorp-Streifennapf, oder in einem nicht-adsorbierten Napf.
C – Kontrolle ohne Markierung:
Zehn (10) μl DNA, die durch PCR-Amplifikation erhalten werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, werden für 30 min bei 60°C in 100 μl reinen Wassers inkubiert. Nach Markierung wird die DNA gereinigt unter Verwendung eines QIAquick-Kits und das letztendliche Eluat wird in 50 μl EB-Puffer gesammelt. Zwanzig (20) μl dieses Eluats werden in 180 μl PEG-Puffer verdünnt, der mit Streptavidin-HRP, verdünnt 1/10.000, supplementiert ist. Einhundert (100) μl dieses Präparates werden dann für 1 h bei 37°C inkubiert, entweder in einem adsorbierten Maxisorp-Streifennapf, oder in einem nicht-adsorbierten Napf.
Diese Streifen werden dann dreimal mit 100 μl PBS-Tween-Puffer (Farbe 0) gewaschen und dann die Anwesenheit von Streptavidin-HRP visualisiert durch Hinzugeben von 100 μl chromogenem Reagens (Farbe 2), für 20 min im Dunkeln inkubiert, wobei die Reaktion dann mit 50 μl H₂SO₄ (Farbe 3) blockiert wird. Die Adsorbanz des Reaktionsmediums wird dann bei 492 nm gemessen. Ergebnisse: Tabelle 19: Doppelmarkierung der DNA mit PDAM und para-Bio-EG3-PDAM
Das Ergebnis von Tabelle 19 zeigt deutlich ein großes Signal, das aus dem Einfangen der DNA in den Näpfen durch die anti-Pyrenantikörper resultiert, ebenso wie die gleichzeitige Markierung davon mit Streptavidin-HRP, das daran angebunden ist. Wie die Abwesenheit von Signal in den Kontrollen zeigt, ist dieser Nachweis spezifisch für die markierte DNA und beruht nicht auf nicht-spezifischer Adsorption der DNA oder des Streptavidin-HRP an den Kunststoff, oder auf einem nicht-spezifischen Binden des Enzyms an die gebundene DNA. Dieses Beispiel zeigt deshalb, dass es möglich ist, eine Doppelmarkierung der DNA in einem einzelnen Schritt auszuführen, wobei es bei dieser Doppelmarkierung möglich ist, dass sie verwendet wird, um gleichzeitig einzufangen und nachzuweisen.
Beispiel 36: Markierung eines PCR-Produktes, die gleichzeitig sein Einfangen und seinen Nachweis durch komplementäre Nukleinsonden erlaubt:
Dieses Experiment erlaubt es zu zeigen, dass es möglich ist, eine DNA spezifisch nachzuweisen, wobei die DNA an einer festen Oberfläche gefangen ist, unter Verwendung der Reaktivität der funktionellen Diazomethylgruppe an einer Phosphatgruppe der DNA.
Das Experiment wird durchgeführt mit einem Teil des Reagens, das in dem HLA-DR-Oligonachweisekit (Referenz 33202, bioMérieux, Frankreich) vorhanden ist, was den Nachweis von Nukleinsäuren durch kolorimetrisches Auslesen erlaubt, die durch PCR in Mikroplatten amplifiziert werden. Im Kontext des beschriebenen Experimentes wird para-Bio-EG3-PDAM mit durch PCR produzierten Nukleinsäuren umgesetzt. Die DNA reagiert mit den funktionellen Diazomethylgruppen des Moleküls und wird somit mit Biotinen versehen, die auf ihren Phosphaten aufgepfropft sind. Es wird dann möglich sein, die Nukleinsäure durch Inkubieren auf einer Mikroplatte einzufangen, wo Streptavidin-Moleküle adsorbiert sind und sie durch eine Sonde zu visualisieren, die aus einem Oligonukleotid besteht, das komplementär zu der eingefangenen Sequenz ist, kombiniert mit Meerrettichperoxidase, wodurch es für dieses Enzym möglich ist, farblose Moleküle von ortho-Phenylendiamin (Farbe 1-Reagens des Kits) in eine Verbindung zu zersetzen, die bei einer Wellenlänge von 492 nm nachgewiesen werden kann.
Beispiel 36.1: Einfangen und spezifischer Nachweis der DNA auf einer Mikroplatte:
Die Markierung von 10 μl DNA, die durch PCR-Amplifikation erhalten werden, wird doppelt durchgeführt, indem sie für 30 min bei 60°C mit 20 μl para-Bio-EG3-PDAM inkubiert wird. Nach der Markierung wird die DNA auf einer QIAquick-Säule (Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll und das letztendliche Eluat wird in 50 μl EB-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) gesammelt. Fünfundachtzig (85) μl der Mischung dieses Eluats werden mit 8,5 μl Reagens R4 (2N NaOH) für 5 min bei Raumtemperatur denaturiert und die Lösung wird dann mit 8,5 μl Reagens R5 (2N Essigsäure) neutralisiert. 850 μl Hybridisierungspuffer (R6 – Tris-HCl 10 mM, pH 7, 0,02 g/l BND, 0,01 g/l Ciproflaxacin) und 85 μl Nachweisoligonukleotid (R7 – 4 mM Natriumphosphat, 1 mM Kaliumphosphat, pH 7, 0,1 % reines Serumalbumin, 0,5 % Phenol) werden zu der Mischung hinzugesetzt. Einhundert (100) μl dieses Präparates werden entweder auf der Positivkontrolle eines Streifens R1 abgelegt, der mit dem Kit bereitgestellt wird (Einfangen durch eine Konsenssequenz des amplifizierten Gens) oder auf einer Streptavidin-beschichteten Combiplate 8-Platte (Referenz 95029263, Labsystem, Helsinki, Finnland) oder auf einer Maxisorp-Kontroll-Platte (Nunc, Dänemark).
Parallel wird die gleiche Hybridisierungsreaktion in einer zehnfachen und einer hundertfachen Verdünnung des DNA-Präparates in EB-Puffer durchgeführt, um die Empfindlichkeit der Technik zu testen.
Beispiel 36.2: Herstellen der Kontrollen:
Kontrollen wurden in der folgenden Art und Weise gleichzeitig hergestellt:
A – Vergleich mit dem HLA-DR-Kit:
Zehn (10) μl DNA, die durch PCR-Amplifikation erhalten werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, werden für 30 min bei 60°C mit 20 μl para-Bio-EG3-PDAM inkubiert. Nach Markierung wird die DNA auf einer QIAquick-Säule gesammelt und das letztendliche Eluat in einem Volumen von 50 μl EB-Puffer gesammelt. Die 45 μl Eluat werden mit 4,5 μl Reagens R4 für 5 min bei Raumtemperatur denaturiert und die Lösung wird neutralisiert mit 4,5 μl Reagens R5. 450 μl Hybridisierungspuffer R6 und 45 μl Nachweisoligonukleotid werden zur Mischung hinzugegeben. Einhundert (100) μl dieses Präparates werden entweder auf der Positivkontrolle eines Streifens R1 abgelegt, der mit dem Kit mitgeliefert wird (Hybridisierung mit einer Konsenssequenz des amplifizierten Gens) oder auf einer Streptavidin-Combiplate 8-Platte, oder auf einer Maxisorp-Kontroll-Platte.
B – Hybridisierung, die an einer DNA durchgeführt wird, die nicht mit der spezifischen Sonde hybridisiert:
Zehn (10) μl DNA, die wie in Beispiel 5 beschrieben durch PCR-Amplifikation erhalten werden, werden für 30 min bei 60°C mit 20 μl para-Bio-EG3-PDAM inkubiert. Diese Probe wird dann in einer Weise behandelt, die zu dem oben in Beispiel A beschriebenen Verfahren identisch ist.
C – Kontrolle ohne DNA
Zehn (10) μl Reagens R6 (Hybridisierungspulver) und 10 μl Reagens R7 (Nachweis von Olignukleotid) werden entweder auf der Positivkontrolle eines Streifens R1, der mit dem Kit bereitgestellt wird, abgelegt, oder auf einer Streptavidin-Platte oder einer Kontrollplatte von Maxisorp-Typ.
Alle Streifen des obigen Protokolls werden für eineinhalb Stunden bei 37°C inkubiert und dann dreimal mit 100 μl PBS-Tween-Puffer (Farbe 0-HLA-Reagens) gewaschen und dann die Anwesenheit der spezifischen Nachweissonde visualisiert durch Zugabe von 100 μl chromogenem Reagens (Farbe 2-Reagens, PBS pH 7,0; 1 % Tween, 0,2 g/l BND; 0,01 g/l Citroflaxacin) für 20 Minuten im Dunkel inkubiert, wobei die Reaktion mit 50 μl H₂SO₄ (1,8N Farbe 3-Reagens) blockiert wird. Die Absorbanz des Reaktionsmediums wird dann bei 492 nm gemessen. Ergebnisse: Tabelle 20: Spezifischer Nachweis auf einer Mikroplatte einer durch PCR erhaltenen DNA
Die Ergebnisse von Tabelle 20 zeigen eine ausgezeichnete Amplifikation des Ziels, was es möglich macht, eine Verwendung in einem diagnostischen Kontext ins Auge zu fassen. Dieses Beispiel zeigt, dass die Markierung auf den Phosphatgruppen das Einfangen von DNA erlaubt und nicht die spezifische Hybridisierung daran verhindert.
Beispiel 37: Einfangen und Amplifikation von DNA, die aus einem bakteriellen Lysat erhalten und mit para-Bio-EG3-PDAM markiert ist:
Dieses Beispiel zeigt, dass es möglich ist, bakterielle DNA einzufangen und zu amplifizieren unter Verwendung eines Einfangens basierend auf der Reaktivität der funktionellen Diazomethylgruppe auf dem Phosphat der Nukleinsäure.
Im vorliegenden Falle werden die Nukleinsäuren, die in einem bakteriellen Lysat enthalten und mit para-Bio-EG3-PDAM markiert sind, auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen eingefangen. Die Verwendung von magnetischen Kügelchen erlaubt es, letztere durch Magnetisierung während aufeinanderfolgender Waschungen zu immobilisieren, die darauf abstellen, zelluläre Reste zu entfernen, die im Reaktionsmedium vorhanden sind, wobei es erforderlich ist, diese Reste zu entfernen, da sie die PCR-Amplifikation initiieren können, die nachfolgend durchgeführt wird.
Die Amplifikationsprodukte waren in der Lage, durch Passagieren über DNA-Chips analysiert zu werden.
Die bakterielle DNA wird durch Lyse der Zellen erhalten, die in einer Mycobacterium tuberculosis-Kultur enthalten sind. Die Lyse wird durch mechanische Lyse vorgenommen. Genauer wird sie durchgeführt durch Beschallung, wobei die behandelte flüssige Probe Glaskügelchen enthält. Ein derartiges Verfahren ist in der Tat bereits von der Anmelderin in ihrer Patentanmeldung WO-A-99/15621 hinsichtlich der Kügelchen und in ihrer Patentanmeldung WO-A-00/60094 hinsichtlich der Beschallung beschrieben. Die Beschallung kann auch durchgeführt werden unter Verwendung eines Flüssigbades.
Andere Techniken, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, können jedoch verwendet werden, wie beispielsweise jene, die in dem US-Patent 5,902,746 und den Patentanmeldungen WO-A-98/54306 und WO-A-00/05338 beschrieben sind. All diese gewerblichen Schutzrechte gehören der Anmelderin.
Die bakterielle DNA wurde durch Picogrün (P-7589; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) gemäß dem vom Hersteller beschriebenen Protokoll quantifiziert, bei einer Konzentration von 10⁷ Kopien pro μl.
Zehn (10) μl Lysat werden in Gegenwart von 20 μl para-Bio-EG3-PDAM für 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Parallel werden 10 μl Lysat in 20 μl reinen Wassers (Sigma) unter den gleichen Bedingungen inkubiert.
Das Reaktionsmedium wird dann auf einer QIAquick-Säule (Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt. Das verwendete Reinigungsprotokoll ist dasjenige, das vom Hersteller empfohlen wird. Das finale Elutionsvolumen beträgt 50 μl.
Die markierten DNA-Fragmente werden dann auf magnetischen Kügelchen vom Typ Dynal (Dynabeads M-280 Streptavidin; Referenz 112.05; Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegen) eingefangen, die gemäß dem folgenden Protokoll hergestellt werden.
Neunzig (90) μl Dynal-Kügelchen werden zweifach mit 200 μl reinen Wassers Free (Sigma) gewaschen und werden in 200 μl PEG-Puffer (0,1 M NaPO₄, pH 7, 0,5 M NaCl; 0,65 % Tween 20; 0,14 ml Heringsspermien-DNA (Referenz 15634-017, GibcoBRL); 2 % PEG 4000) aufgenommen und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Sie werden dann zweifach mit 200 μl 1 × PBS-Puffer gewaschen, der 0,5 % Tween 20 enthält, und schließlich in 90 μl des gleichen Puffers aufgenommen.
Zehn (10) μl der markierten oder nicht-markierten DNA-Eluate werden für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 40 μl PEG-Puffer und 2,5 μl des Präparates aus magnetischen Kügelchen, wie es oben beschrieben ist, inkubiert.
Die Kügelchen werden dann dreimal mit 200 μl 1 × PBS-Puffer gewaschen, der 0,5 % Tween enthält, in 200 μl Wasser aufgenommen und für 20 Minuten bei 60°C inkubiert und dann wiederum viermal mit 200 μl PBS-Tween gewaschen. Die Kügelchen werden schließlich in 25 μl Wasser aufgenommen und eine PCR gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll durchgeführt. Zwei Reaktionskontrollen werden durchgeführt, eine mit 25 μl reinen Wassers und die andere mit 2,5 μl Kügelchen, die unter den gleichen Bedingungen hergestellt und gewaschen werden, wie die biologischen Proben, und in 25 μl Wasser aufgenommen waren.
Ergebnis:
Die PCR-Produkte werden dann durch Picogrün (P-7589; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) gemäß dem vom Hersteller beschriebenen Protokoll quantifiziert. Dieses Verfahren basiert auf der Verwendung eines Moleküls (Picogrün), das die Eigenschaft aufweist, nur fluoreszierend zu werden, wenn es innerhalb eines DNA-Moleküls angeordnet ist (indem es zwischen die Basen interkaliert wird). In Folge des sehr spezifischen Charakters dieser Interkalation und da das produzierte Fluoreszenzsignal direkt proportional der Menge an im Medium vorhandenen DNA ist, ist es möglich, auf diese Art und Weise sehr genau die Konzentration von Nukleinsäure zu bestimmen, die in einer Probe vorhanden ist. Das Signal wird dann in rfu (relative Fluoreszenzeinheit) ausgedrückt.
Die Analyse der Ergebnisse von PCR auf Gel zeigt die Anwesenheit einer einzelnen spezifischen Bande mit der erwarteten Größe in den aus genomischer DNA gewonnenen Proben, die mit para-Bio-EG3-PDAM markiert ist. Die Banden werden nicht nachgewiesen, wenn die PCR unter Verwendung einer nicht-markierten genomischen DNA durchgeführt wurde. Die Quantifizierung der DNA mit Picogrün erlaubt es, die Herstellung von DNA von genomischer DNA, die auf Kügelchen eingefangen ist, zu bestätigen. Tabelle 21: Quantifizierung der durch PCR hergestellten DNA aus einem bakteriellen Lysat, eingefangen und gereinigt durch para-Bio-EG3-PDAM
Eine Analyse auf einem DNA-Chip entsprechend dem in Beispiel 8 beschriebenen Protokoll erlaubt es, die Spezifität der Amplifikation zu bestätigen, wie in Tabelle 34 unten gezeigt. Tabelle 22: Spezifischer Nachweis des Ziels, das eingefangen und mit para-Bio-EG3-PDAM gereinigt ist
Dieses Beispiel zeigt, dass es möglich ist, eine biologische Probe herzustellen, um die Nukleinsäure zu amplifizieren, die sie enthält, unter Verwendung einer Fangtechnik auf der Grundlage der Reaktivität der funktionellen Diazomethylgruppe auf deren Phosphatgruppen.
Beispiel 38: Sukzessive Amplifikation von zwei Genen von einer bakteriellen DANN, die auf einem festen Träger gefangen ist:
Dieses Beispiel zeigt, dass es möglich ist, eine DNA mehrfach und an verschiedenen Zielen zu amplifizieren, die vermittels der Reaktivität der funktionellen Diazomethyl-Gruppe auf ihren Phosphatgruppen eingefangen ist.
Im vorliegenden Falle werden die Nukleinsäuren, die in einem bakteriellen Lysat enthalten und mit para-Bio-EG3-PDAM markiert sind, auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen eingefangen. Die Verwendung von magnetischen Kügelchen macht es möglich, letztere durch Magnetisieren während aufeinanderfolgender Waschschritte zurückzuhalten, die darauf abstellen, die zellulären Reste zu entfernen, die in dem Reaktionsmedium vorhanden sind, wobei es erforderlich ist, dass diese Reste entfernt werden, da sie die PCR-Amplifikationen inhibieren können, die nachfolgend durchgeführt werden. Diese Amplifikationen werden an zwei verschiedenen Genen erfolgen, die in der genomischen DNA vorhanden sind, und als 16S bzw. rpoB bezeichnet werden. Diese zwei Gene werden dann unter Verwendung von DNA-Chips analysiert.
Die bakterielle DNA wird erhalten, indem die Zellen lysiert werden, die in einer Mycobacterium tuberculosis-Kultur enthalten sind, gemäß dem bereits in Beispiel 37 beschriebenen Protokoll. Die bakterielle DNA wurde mit Picogrün gemäß dem vom Hersteller beschriebenen Protokoll quantifiziert bei einer Konzentration von 10⁷ Kopien pro μl.
Zehn (10) μl Lysat werden in Gegenwart von 20 μl para-Bio-EG3-PDAM für 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Parallel werden 10 μl Lysat in 20 μl reinen Wassers (Sigma) unter den gleichen Bedingungen inkubiert.
Das Reaktionsmedium wird dann auf einer QIAquick-Säule (Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt. Das verwendete Reinigungsprotokoll ist jenes, das vom Hersteller empfohlen wird. Das letztendliche Elutionsvolumen beträgt 50 μl.
Die markierten DNA-Fragmente werden dann auf magnetischen Dynal-Kügelchen eingefangen, die gemäß dem folgenden Protokoll hergestellt werden:
Neunzig (90) μl Dynal-Kügelchen werden zweifach mit 200 μl reinen Wassers Free (Sigma) gewaschen und dann aufgenommen in 200 μl PEG-Puffer (0,1 M Na PO₄, pH 7, 0,5 M NaCl; 0,65 % Tween 20; 0,14 ml Lachsspermien-DNA (Gibco); 2 % PEG 4000) und dann für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Sie werden dann zweifach mit 200 μl 1 × PBS-Puffer gewaschen, der 0,5 % Tween 20 enthält und schließlich in 90 μl desselben Puffers aufgenommen.
Zehn (10) μl der markierten oder nicht-markierten DNA-Eluate werden für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 50 μl PEG-Puffer und 2,5 μl des oben beschriebenen Präparates auf magnetischen Kügelchen inkubiert.
Die Kügelchen werden dann dreimal mit 200 μl 1 × PBS-Puffer gewaschen, der 0,5 % Tween enthält, in 200 μl Wasser aufgenommen und dann für 20 Minuten bei 60°C inkubiert und dann wiederum viermal mit 200 μl PBS-Tween gewaschen. Die Kügelchen werden schließlich in 25 μl Wasser aufgenommen und eine PCR gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll durchgeführt. Zwei Reaktionskontrollen werden durchgeführt, eine mit 25 μl reinen Wassers (Sigma) und die andere mit 2,5 μl Kügelchen, die unter den gleichen Bedingungen wie die biologischen Proben hergestellt und gewaschen werden und in 25 μl Wasser aufgenommen werden.
Nach Amplifikation wird das Reaktionsmedium gesammelt und die Kügelchen getrennt und mit 150 μl 1 × PBS gewaschen, die 0,5 % Tween enthält, und dann in 25 μl reinen Wassers (Sigma) resuspendiert. Eine weitere Amplifikation wird an den Kügelchen durchgeführt, aber in Gegenwart von Primern, die das rpoB-Gen amplifizieren sollen.
Kontrollamplifikationen, die unter Verwendung von nicht-eingefangener genomischer DNA durchgeführt werden, werden parallel an den zwei Amplifikationssystemen (rpoB und 16S) durchgeführt.
Ergebnis:
Die erhaltenen PCR-Produkte werden dann analysiert unter Verwendung von DNA-Chips gemäß dem in Beispiel 8 beschriebenen Protokoll. Tabelle 23: Analyse der DNA-Amplicons auf DNA-Chips, die von PCRs erhalten wurden, die sukzessive oder nicht amplifiziert wurden
Die Analyse der Ergebnisse von PCR auf Gel zeigt die Anwesenheit einer einzelnen spezifischen Bande mit der erwarteten Größe in den Proben, die von genomischer DNA hergestellt werden, die mit para-Bio-EG3-PDAM markiert ist. Die Banden werden nicht nachgewiesen, wenn die PCR durchgeführt wurde unter Verwendung von nicht-markierter genomischer DNA.
Die Analyse unter Verwendung eines DNA-Chips, wie in Tabelle 23 dargestellt, erlaubt es, die Spezifität der zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationen und deshalb die Fähigkeit zu bestätigen, eine aufeinanderfolgende Amplifikation verschiedener Gene durchzuführen, die auf einem festen Träger immobilisiert ist, was es möglich macht, die Entwicklung eines Multiplexsystems zu vermeiden, was oftmals die Empfindlichkeit und Wirksamkeit von Nukleinsäureamplifikationen erheblich verringert.
Beispiel 39: Einfangen und Amplifikation von DNA auf einer Nylonmembran, die Diazomethyl-Gruppen trägt:
Eine Nylonmembran, die dahingehend aktiviert ist, dass sie Diazomethyl-Gruppen trägt, wurde verwendet, um bakterielle DNA einzufangen, mit dem Ziel, diese durch PCR zu amplifizieren. Beispiel 39.1: Modifikation des Biodyne C-Filters: Syntheseschema:
Verbindung 68:
3'-Aminoacetophenon (14,5 g, 107 mMol) wird in 50 ml wasserfreiem DMF solubilisiert. Bernsteinsäureanhydrid (10,7 g, 107 mMol) wird hinzugegeben und die Mischung wird unter Argon und bei Raumtemperatur weitergerührt. Nach 6 Stunden wird die Lösung unter Vakuum konzentriert und 50 ml Methanol hinzugegeben. Das erhaltene Präzipitat wird abfiltriert und mit Methanol und Ether gewaschen. 19,4 g (81 %) des Produktes 68 werden somit in der Form eines gebrochen weißen Pulvers erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): d = 2,5–2,6 (m, 7H); 7,45 (t, 1H); 7,64 (d, 1H); 7,83 (d, 1H); 8,19 (s, 1H); 10,16 (s, 1H); 12,12 (s, 1H).
Verbindung 69:
5,07 g (22 mMol) von Verbindung 68 werden in 10 ml wasserfreiem DMF unter Argon solubilisiert. Die Lösung wird auf Eis gegeben und 5,00 g (0,32 mMol) Carbonyldiimidazol werden hinzugegeben. Nach 20 Minuten werden langsam 20 ml (94,6 mMol) 4,7,10-Trioxatridecantriamin (EG₃) hinzugegeben. Nach dreistündiger Reaktion bei Raumtemperatur wird das DMF verdampft und der Rückstand in 100 ml CH₂Cl₂ aufgenommen. Extraktionen werden mit gesättigtem NaHCO₃ und H₂O durchgeführt, wonach die organische Phase über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft wird. 4,34 g (46 %) von Produkt 69 werden somit erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): d = 1,59 (m, 2H); 1,87 (m, 2H); 2,16 (s, 3H); 2,40 (m, 2H); 2,55 (m, 2H); 3,08 (m, 2H); 3,45 (m, 16H); 7,30 (t, 1H); 7,42 (d, 1H); 7,70 (d, 1H); 7,83 (t, 1H); 7,97 (s, 1H); 10,00 (s, 1H).
Verbindung 91:
Ein 4 cm² großes Rechteck wird aus einem Blatt Biodyne C-Filter ausgeschnitten (Referenz 60314; Pall Gelman Laboratory; Ann Arbor; Michigan; USA), in eine Flasche eingeführt und mit 0,97 g (6 mMol) Carbonyldiimidazol (CDI) in 3 ml wasserfreiem DMF, auf Eis, unter Argon und unter kräftigem Rühren in Kontakt gebracht. Nach 20 Minuten wird die Lösung entfernt und der Filter mit DMF gewaschen. Eine Menge von 0,53 g von Produkt 68 (1 mMol) in 3 ml wasserfreiem DMF wird dann hinzugegeben und die Reaktion erfolgt über Nacht bei Raumtemperatur. Die Lösung wird dann entfernt und der Filter mit Ethanol abgespült, gewaschen und unter Vakuum getrocknet und unter Argon aufbewahrt.
Verbindung 92:
Der modifizierte Filter 91 wird in eine Lösung von 97 ml Hydrazinhydrat (2 mMol) in 4 ml absolutem Ethanol gegeben. Die Lösung wird für fünf Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nachdem man erlaubt hat, dass sie abkühlt, wird der Filter mit H₂O, Ethanol und Ether gewaschen, unter Vakuum getrocknet und unter Argon gegeben. Als nächstes werden 4 ml wasserfreies DMF und 86 mg MnO₂ (1 mMol) hinzugegeben und man erlaubt, dass die Mischung sich unter kräftigem Rühren umsetzt. Nach 20 Minuten wird die Lösung verworfen und der Filter mit DMF und Ether abgespült. Der Diazomethyl-modifizierte Filter 92 wird unter Argon bei einer Temperatur von –19 bis –31°C gelagert.
Beispiel 39.2: Biologische Tests:
Die aktivierte Membran wird in kleine Fragmente mit 2 mm² geschnitten, die für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 25 μl bakteriellem Lysat von Mycobacterium tuberculosis inkubiert, das durch mechanische Lyse hergestellt wurde, unter Verwendung der gleichen Techniken und der gleichen Endkonzentration wie in Beispiel 37, und 375 μl reinen Wassers (Sigma) inkubiert werden.
Die Membran wird danach bei 65°C für 60 Minuten in 100 ml Waschpuffer (5 % Formamid Sigma), 1 × SSPE (Perbio), 0,01 %-Triton X-100 gegeben, um die nicht-spezifischen Nukleinsäuren zu entfernen, die auf der Membran adsorbiert sind, und dann wird Letztere vor der Amplifikation in 1 ml reinen Wassers gelagert.
Die PCR wird durchgeführt, wie in Absatz 5.1 beschrieben, wobei das Reaktionsvolumen mit einer ausreichenden Menge an reinem Wasser eingestellt wird.
Parallel werden Kontrollen gemäß der gleichen Verfahrensweise mit Membranen durchgeführt, die Nukleinsäuren nicht kovalent binden können:

• Nicht-modifizierte Biodyne C-Membran (Membran A),
• Biodyne-Membran, die chemisch modifiziert ist gemäß dem beschriebenen Verfahren, aber nicht mit wasserfreiem DMF und MnO₂ behandelt ist; diese Kontrolle erlaubt es, das Verhalten der Membran zu verifizieren bei Abwesenheit von Diazomethylgruppen (Membran B) zu verifizieren, und
• Biodyne C-Membran, die nicht modifiziert ist, aber für 20 Minuten unter kräftigem Rühren mit wasserfreiem DMF und MnO₂ behandelt worden ist; diese Kontrolle erlaubt es, zu verifizieren, dass der letztere Schritt nicht die Adsorption von DNA an die Membran modifiziert (Membran C).

Um das Fehlen von Inhibition von PCR zu überprüfen, die durch die Behandlung der Membranen bedingt ist, wird ein weiteres Fragment der Membranen A, B und C gleichzeitig mit 25 μl bakteriellem Lysat amplifiziert (Röhrchen A', B' und C').
Die PCR-Produkte werden dann mit Picogrün gemäß dem vom Hersteller beschriebenen Protokoll quantifiziert. Ergebnis: Tabelle 24: Quantifizierung der durch PCR aus bakteriellem Lysat erhaltenen DNA, die auf einem festen Träger eingefangen ist.
Diese Ergebnisse von Tabelle 24 zeigen an, dass es möglich ist, Nukleinsäuren auf einem festen Träger kovalent vermittels der Diazomethyl-Chemie einzufangen, die aus einem Lysat erhalten sind. Die beobachtete Amplifikation beruht nicht auf einer nicht-spezifischen Adsorption der DNA an die Membran. Andererseits wird mit den mit den PCRs durchgeführten Kontrollen beobachtet, dass die Membranen keine Inhibierung der Amplifikationsreaktion verursachen.
Um die Art des amplifizierten Produktes auf der Membran zu überprüfen, wurde das Amplifikationsprodukt analysiert, indem es über einen DNA-Chip gemäß dem oben beschriebenen Protokoll gegeben wurde.

Claims

Verfahren zur Markierung und Fragmentierung einer einzel- oder doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure (DNA), umfassend: – Fragmentieren der DNA durch Erzeugen mindestens einer abasischen Stelle auf der DNA, – Binden eines Markers an mindestens eines der Fragmente durch ein Markierungsreagens, wobei das Reagens kovalent und größtenteils an mindestens ein Phosphat des Fragments kuppelt, wobei Fragmentierung und Markierung in einem Schritt erfolgen.
Verfahren zur Bereitstellung von Sonden zum Nachweis einer Zielnukleinsäure, umfassend die Markierung und Fragmentierung einer einzel- oder doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure (DNA), umfassend die folgenden Schritte: – Fragmentieren der DNA durch Erzeugen mindestens einer abasischen Stelle auf der DNA, – Binden eines Markers an mindestens eines der Fragmente durch ein Markierungsreagens, wobei das Reagens kovalent und größtenteils an mindestens ein Phosphat des Fragments kuppelt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmentierung und Markierung in zwei Schritten erfolgen.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmentierung und Markierung in einem Schritt erfolgen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die abasische Stelle durch Einwirkung eines wässrigen sauren Mediums erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der pH des sauren Mediums kleiner als 5, vorzugsweise kleiner als 4 ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige saure Medium ein Natriumformiatpuffer mit einem pH von etwa 3 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA mindestens eine modifizierte Base enthält, die eine abasische Stelle bilden kann.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierte Base, die eine abasische Stelle bilden kann, aus 8-Brompurinderivaten ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die abasische Stelle durch ein Alkylierungsmittel oder ein Oxidationsmittel erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens als reaktionsfähige Funktion eine Einheit enthält, die aus den folgenden Verbindungen ausgewählt ist: Diazomethyl; Alkylhalogenid; Nitrosoharnstoff; Spirocyclopropan; Aziridin; Epoxid; Trifluorsulfonaten.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens 5-(Brommethyl)fluorescein ist.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens aus Verbindungen der Formel (1):
worin: • R¹ für H oder eine Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl- oder substituierte Arylgruppe steht und • Z einen nachweisbaren Marker umfasst, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Z Folgendes ist:
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens ausgewählt ist aus Verbindungen der Formel (2):
worin: • R¹ für H oder eine Alkyl-, Aryl- oder substituierte Arylgruppe steht, • R² ein nachweisbarer Marker ist, • L ein Bindungsarm ist, der eine gerade Aneinanderreihung von mindestens zwei kovalenten Bindungen enthält, und n gleich 0 oder 1 ist und • Z ausgewählt ist aus:
worin: • R³ und R⁴ unabhängig voneinander für; H, NO₂, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR mit R = Alkyl oder Aryl stehen und • -Y-X- für -CONH-, -NHCO-, -CH₂O-, CH₂S- steht.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungreagens die Formel (3) hat:
worin: • R¹ für H oder eine Alkyl-, Aryl- oder substituierte Arylgruppe steht, • R² einen nachweisbaren Marker darstellt, • L ein Bindungsarm ist, der eine gerade Aneinanderreihung von mindestens 2 kovalenten Bindungen enthält, und n eine ganze Zahl gleich 0 oder 1 ist, • R³ und R⁴ unabhängig voneinander für: H, NO₂, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR mit R = Alkyl oder Aryl stehen und • -Y-X- für -CONH-, -NHCO-, -CH₂O-, CH₂S- steht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass R² eine fluoreszierende Verbindung oder ein Hapten ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel löslich ist.
Verfahren zum Nachweis einer einzel- oder doppelsträngigen Ziel-Desoxyribonukleinsäure (DNA), umfassend die folgenden Schritte: – Fragmentieren und Markieren der DNAs durch eines der Verfahren der Ansprüche 1 bis 18, – Hybridisieren der markierten Fragmente mit mindestens einer für die Zielnukleinsäure ausreichend spezifischen Nukleinsonde und – Nachweisen des gebildeten Hybrids mithilfe eines Markers.
Verfahren zum Nachweis einer doppelsträngigen Ziel-Desoxyribonukleinsäure (DNA) nach Anspruch 19, das ferner einen Denaturierungsschritt nach der Fragmentierung und Markierung enthält.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmentierung, Markierung und Denaturierung in einem einzigen Schritt durchgeführt werden.
Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure, umfassend die folgenden Schritte: – enzymatische Amplifizierung der Zielnukleinsäure, um eine Vielzahl an doppelsträngigen DNA-Amplikons zu erzeugen, – Fragmentieren und Markieren der DNA-Amplikons nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 18, – Hybridisieren der markierten Fragmente mit mindestens einer für die Zielnukleinsäure ausreichend spezifischen Nukleinsonde und – Nachweisen des gebildeten Hybrids mithilfe eines Markers.
Verfahren nach Anspruch 22, das ferner einen Denaturierungsschritt nach dem Fragmentierungs- und Markierungsschritt enthält.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmentierung, Markierung und Denaturierung in einem einzigen Schritt durchgeführt werden.
Verfahren zum Nachweis eines an zuvor bestimmten oder nicht bestimmten Positionen einer Zielnukleinsäure vorliegenden Polymorphismus durch Vorhandensein einer Mehrzahl an Deletionen und/oder Insertionen und/oder Mutationen in der Sequenz der Zielnukleinsäure im Vergleich zu einer so genannten Bezugssequenz, umfassend die folgenden Schritte: • Gewinnen einer Ziel-DNA mit der Gesamtheit des zu untersuchenden Polymorphismus, wobei die DNA gegebenenfalls durch eine enzymatische Amplifikationstechnik erzeugt wird; • Fragmentieren und Markieren der DNA durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18; • Hybridisieren der Fragmente mit einer Mehrzahl als Fangsonden bezeichneter Nukleinsonden, wobei die Mehrzahl Fangsonden an einem festen Träger fixiert ist und die Mehrzahl Fangsonden in ihrer Gesamtheit mindestens den zu untersuchenden Polymorphismus abdeckt; • Nachweisen der zwischen den markierten Fragmenten und mindestens einem Teil der Nukleinsonden gebildeten Hybride mithilfe eines Markers und Rückschließen auf den Polymorphismus der Ziel-DNA.
Verfahren nach Anspruch 25, das ferner einen Denaturierungsschritt nach dem Fragmentierungs- und Markierungsschritt enthält.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmentierung, Markierung und Denaturierung in einem einzigen Schritt durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger mindestens zehn (10), vorteilhafterweise mindestens vierhundert (400), vorzugsweise mindestens tausend (1000), Nukleinsonden mit unterschiedlichen Sequenzen trägt.