JP4554159B2 - Dnaを標識化および断片化する方法 - Google Patents
Dnaを標識化および断片化する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4554159B2 JP4554159B2 JP2002587643A JP2002587643A JP4554159B2 JP 4554159 B2 JP4554159 B2 JP 4554159B2 JP 2002587643 A JP2002587643 A JP 2002587643A JP 2002587643 A JP2002587643 A JP 2002587643A JP 4554159 B2 JP4554159 B2 JP 4554159B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- labeling
- dna
- mmol
- nucleic acid
- fragmentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 0 CNC(*)*1CC1 Chemical compound CNC(*)*1CC1 0.000 description 5
- ZPOQGUUTGCSCNH-UHFFFAOYSA-N COCC(C(C1)OC)OC1O Chemical compound COCC(C(C1)OC)OC1O ZPOQGUUTGCSCNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- URLKBWYHVLBVBO-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(C)cc1 Chemical compound Cc1ccc(C)cc1 URLKBWYHVLBVBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Description
前記のDNA上に少なくとも1つの非塩基性部位を生成することにより、DNAを断片化するステップと、
標識試薬を用いて、断片の少なくとも1個にマーカーを結合させ、その際、前記の試薬は共有結合により主に、前記断片の少なくとも1個のホスフェートに連結するステップとを含む、一本鎖または二本鎖デオキシリボ核酸(DNA)を標識化および断片化する方法を記載している。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼなどの、例えば測色法、蛍光、発光により検出可能なシグナルを生じる酵素、
蛍光、発光または呈色化合物などの発色団、
電子顕微鏡観察により、または導電性、電流測定、電圧測定、インピーダンスなどの電気的特性により検出可能な電子密度を有する基、
その分子が、物理的および/または化学的特性の検出可能な修飾をもたらすに十分なサイズを有する検出可能な基であって、検出が、回折、表面プラズモン共鳴、表面変化、接触角変化などの光学的方法により、または原子間力分光法、トンネル効果などの物理的方法により実施することができる基、
32P、35Sまたは125Iなどの放射性分子。
特許US-A第4683195号、US-A第4683202号およびUS-A第4800159号に記載のPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)およびそのRT-PCR(逆転写PCR)誘導法、特に、特許EP-A第0569272号に記載の一段階方式、
例えば、特許出願EP-A第0201184号で開示されているLCR(リガーゼ連鎖反応)、
特許出願WO-A第90/01069号に記載のRCR(修復連鎖反応)。
R1は、Hまたはアルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
Zは、検出可能なマーカーを含む]。
R1は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R2は、検出可能なマーカーであり、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しく、
Zは、
R3およびR4は相互に独立に: H、NO2、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
-Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-を表す)から選択される]から選択する。
R1は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R2は、検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
R3およびR4は相互に独立に: H、NO2、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
-Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-を表す]。
有利には、試薬は式(4)である。
R1は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R2は、検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
R3およびR4は相互に独立に: H、NO2、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールである]。
有利には、試薬は式(5)である。
R1は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R2は、検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
R3およびR4は相互に独立に: H、NO2、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールである]。
有利には、試薬は式(6)である。
R1は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R2は、検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
R3およびR4は相互に独立に: H、NO2、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールである]。
R2は、検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数である]。
R1は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R2は、検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数である]。
R2は、検出可能なマーカーを表し、
mは、1から100、好ましくは1から20の整数であり
pは、1から10、有利には2から6の整数、好ましくは4である]。
R2は、検出可能なマーカーを表し、
R3は、H、NO2、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数であり、
-Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2-を表す]。
R2は、検出可能なマーカーを表し、
R3は、H、NO2、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールを表し、好ましくはR3は、H、NO2、OCH3を表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数である]。
a) 式(10)
R1は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R2は、検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数である]である。
R1は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R2は、検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数である]。
R1は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R2は、検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数である]。
a) 構造
R1は、メチル基またはフェニルを表す]、
b) 構造
R1は、メチルまたはフェニル基を表す]、
c) 構造
R1は、メチルまたはフェニル基を表す]を有する。
R2は、検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状の連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数である]。
a) 前記の方法のいずれかに従い、DNAを断片化および標識するステップと、
b) ターゲット核酸に対して十分に特異的な少なくとも1個の核酸プローブに、標識された断片をハイブリダイゼーションするステップと、
c) マーカーを使用して、生じたハイブリッドを検出するステップ
を含む、一本鎖または二本鎖ターゲットデオキシリボ核酸(DNA)を検出する方法を記載することである。
a) 調査対象の多型性全体を含むターゲットDNAを得るステップであって、前記DNAが場合によって、酵素増幅技術により生成するステップと、
b) 前記の方法のいずれかにより、前記DNAを断片化および標識するステップと、
c) 捕捉プローブと称する複数の核酸プローブに、前記断片をハイブリダイゼーションするステップであって、複数の捕捉プローブが、固体支持体に結合し、複数の捕捉プローブがその全体で、少なくとも調査対象の多型性を対象とするステップと、
d) マーカーを使用して、標識された断片と少なくとも一部の核酸プローブの間に生じたハイブリッドを検出し、それからターゲットDNAの多型性を推測するステップを含む。
好ましい実施形態の記載
化合物ビオチン メタ-アセトフェノン1a:
D-ビオチン(1.0グラム(g)、4.1mmol(mmol)を、温かい状態の無水DMF45ミリリットル(ml)に溶かす。混合物をアルゴン下に0℃に冷却し、次いで、N-メチルモルホリン(590マイクロリットル(μl)、5.33mmol)およびクロロギ酸イソブチル(840μl、6.60mmol)を順次加える。混合物を30分間(min)攪拌し続け、次いで、DMF10ml中の3-アミノアセトフェノン(824mg、6.10mmol)およびN-メチルモルホリン(480μl、4.35mmol)を加える。溶液を0℃に2時間(h)維持し、次いで、蒸発乾燥させる。残留物をMeOH3mlにいれ、次いで、水50mLを加える。得られた沈殿物を濾過し、水、CH2Cl2およびエーテルで洗浄すると、粗製生成物1a1.2g(80%)が得られる。MeOH-H2O対から再結晶化させると、白色の粉末の形の1a(1.01g、70%)が得られる。
融点145℃。- IR (KBr): 3280, 2931, 2857, 1691, 1590, 1540, 1487, 1434, 1298, 1266 cm-1。- 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 1.3-1.7 (m, 6H); 2.33 (t, J = 8 Hz, 2H); 2.55 (s, 3H); 2.58; (d, J = 12 Hz, 1H); 2.83 (dd, J = 12および5 Hz, 1H); 3.13 (m, 1H); 4.15 (m, 1H); 4.31 (m, 1H); 6.34 (s, 1H); 6.41 (s, 1H); 7.44 (t, J = 8 Hz, 1H); 7.64 (d, J = 8 Hz, 1H); 7.85 (d, J = 8 Hz, 1H); 8.17 (s, 1H); 10.05 (s, 1H)。- MS (FAB/グリセロール), m/z: 362 [M+H]+。
1a(500mg、1.38mmol)およびヒドラジン一水和物(200μl、「4.15mmol)からなる無水エタノール(8ml)溶液を還流下に2時間加熱する。室温まで冷却した後に、白色の沈殿物を濾過し、水で、次いでエーテルで洗浄し、乾燥させる。こうすると、生成物2a 385mg(74%)が白色の粉末の形で得られる。
融点185℃。- IR (KBr): 3298, 2931, 2857, 1698, 1665, 1626, 1541, 1494, 1470, 1446, 1330, 1265 cm-1。- 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 1.3-1.7 (m, 6H); 1.98 (s, 3H); 2.26 (t, J = 8 Hz, 2H); 2.56 (d, J = 12 Hz, 1H); 2.81 (dd, J = 12および5 Hz, 1H); 3.11 (m, 1H); 4.13 (m, 1H); 4.29 (m, 1H); 6.39 (s, 3H); 6.42 (s, 1H); 7.22 (m, 2H); 7.50 (d, J = 8 Hz, 1H); 7.84 (s, 1H); 9.82 (s, 1H)。- MS (FAB/グリセロール), m/z: 376 [M+H]+。
2a(180mg、0.48mmol)を、DMF2mlに溶かす。次いで、MnO2(340mg、3.9mmol)を加える。室温で30分間攪拌した後に、セライト(厚さ0.5cm)および3Å粉末分子ふるい(0.5cm)を含有する焼結漏斗を介して、混合物を濾過する。反応混合物を濃縮して約0.5mlの容量にし、次いで、エーテル5mlを加える。生じた沈殿物を濾過し、水で洗浄し、次いで乾燥させる。化合物3a(170mg、95%)が、ピンク色の粉末の形で得られる。
融点160℃。- IR (KBr): 3278, 2935, 2859, 2038, 1704, 1666, 1605, 1577, 1536, 1458, 1430, 1263 cm-1。- 1H NMR (300 MHz) δ = 1.3-1.7 (m, 6H); 2.11 (s, 3H); 2.28 (t, J = 8 Hz, 2H); 2.57 (d, J = 12 Hz, 1H); 2.81 (dd, J = 12および5 Hz, 1H); 3.11 (m, 1H); 4.13 (m, 1H); 4.29 (m, 1H); 6.33 (s, 1H); 6.41 (s, 1H); 6.60 (m, 1H); 7.25 (m, 3H); 9.84 (s, 1H)。
化合物ビオチン パラ-アセトフェノン1b
D-ビオチン(1g、4.1mmol)を、温かい状態の無水DMF45mlに溶かす。混合物をアルゴン下に0℃に冷却し、次いで、N-メチルモルホリン(590μl、5.33mmol)およびクロロギ酸イソブチル(840μl、6.60mmol)を順次、加える。混合物を30分間攪拌し、次いで、4-アミノアセトフェノン(824mg、6.10mmol)を加える。溶液を0℃で2時間攪拌し続け、次いで、蒸発乾燥させる。残留物を水50mlに入れる。得られた沈殿物を濾過し、水で、次いで温かい状態のMeOH50mlで洗浄する。白色の沈殿物を加熱しながら、DMFに溶かし、次いで、得られた溶液を、濾過し、MeOHで洗浄する。濾液を回収し、蒸発乾燥させると、1b 888mg(2.46mmol、60%)が得られる。
融点260℃。- IR (KBr): 3260, 2930, 2358, 1706, 1673, 1610, 1526, 1401, 1380, 1322, 1257, 1150 cm-1。- 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 8.82 (s, 1H, NH-CO); 7.57 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H); 6.83 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H); 6.40 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.32 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.28 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.12 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.11 (m, 1H, CH-S); 2.80および2.55 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.35 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 2.10 (s, 3H, CH3); 1.60-1.34 (m, 6H, (CH2)3)。
化合物1b(870mg、2.4mmol)を温かい状態でエタノール(99%、8ml)に溶かし、次いで、ヒドラジン一水和物(995μl、19.5mmol)を加える。溶液を還流下に3時間加熱する。得られた白色の沈殿物を濾過し、氷冷水で洗浄する。こうすると、生成物2b 820mg(90%)が白色の粉末の形で得られる。
融点305℃。- IR (KBr): 3281, 3183, 2930, 2857, 1698, 1658, 1593, 1521, 1459, 1401, 1325, 1263, 1187 cm-1。- 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 9.68 (s, 1H, NH-CO); 7.52 (s, 4H, J = 9 Hz, Ar-H); 6.43 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.21 (s, 2H, NH2); 4.29 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.12 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.81および2.56 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.32 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1.97 (s, 3H, CH3); 1.63-1.36 (m, 6H, (CH2)3)。
2b(200mg、0.53mmol)をDMF10mlに溶かす。次いで、MnO2800mgを加える。10分間攪拌した後に、混合物を、セライト(0.5cm)分子ふるい(粉末の形の0.5cm)混合層を介して濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで、エーテルで洗浄し、乾燥させる。化合物3b(190mg、96%)が、ピンク色の粉末の形で得られる。
融点180℃ (分解)。- IR (KBr): 3257, 2930, 2857, 2032, 1698, 1597, 1524, 1510, 1455, 1404, 1307, 1259, 1180 cm-1。- 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 10.18 (s, 1H, NH-CO); 7.88 (d, 2H, J = 6 Hz, Ar-H); 7.7 (d, 2H, J = 6 Hz, Ar-H); 6.41 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.34 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.28 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.12 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.11 (m, 1H, CH-S); 2.80および2.55 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.35 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 2.10 (s, 3H, CH3); 1.60-1.34 (m, 6H, (CH2)3)。
化合物ビオチンオルト-アセトフェノン1c:
D-ビオチン(1g、4.1mmol)を、温かい状態の無水DMF45mlに溶かす。混合物をアルゴン下に0℃に冷却し、次いで、N-メチルモルホリン(590μl、5.33mmol)およびクロロギ酸イソブチル(840μl、6.60mmol)を順次、加える。混合物を30分間攪拌し続け、次いで、2-アミノアセトフェノン(824mg、6.10mmol)を加える。溶液を室温で3時間30分攪拌し続け、次いで、蒸発乾燥させる。残留物を水50mlに入れる。得られた沈殿物を濾過し、水で、次いで温かい状態のMeOH50mlで洗浄する。得られた沈殿物を濾過し、水で洗浄する。温かい状態のMeOH中に生成物を溶かし、水を加えることにより再沈殿させることにより、再結晶を実施する。沈殿物を濾過し、水で、次いでエーテルで洗浄すると、粗製生成物1c 1.1g(2.95mmol、72%)が得られる。
融点150℃。- IR (KBr): 3248, 2930, 2857, 2359, 1691, 1669, 1651, 1582, 1528, 1448, 1354, 1310, 1245, 1161 cm-1。- 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 11.24 (s, 1H, NH-CO); 8.33 (d, 1H, J = 8.5 Hz, Ar-H); 7.97 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H); 7.57 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 7.18 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 6.44 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.30 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.80および2.55 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.61 (s, 3H, CH3); 2.37 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1.62-1.38 (m, 6H, (CH2)3)。
化合物1c(500mg、1.38mmol)を温かい状態でエタノール(99%、8ml)に溶かし、次いで、ヒドラジン一水和物(572μl、11.1mmol)を加える。溶液を還流下に50分間加熱する。溶液を蒸発乾燥させる。得られた白色の沈殿物を濾過し、水で洗浄し、次いでエーテルを用いて乾燥させる。こうすると、生成物2c 416mg(11.1mmol、80%)が、白色の粉末の形で得られる。
融点161℃。- IR (KBr): 3412, 3240, 2930, 2857, 2351, 1706, 1677, 1604, 1590, 1531, 1463, 1444, 1372, 1303, 1270, 1169 cm-1。- 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 11.97 (s, 1H, NH-CO); 8.35 (d, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 7.45 (d, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 7.19 (t, 1H, J = 7.5 Hz, Ar-H); 7.04 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 6.61 (s, 2H, NH2); 6.42 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.32 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.81および2.56 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 2.09 (s, 3H, CH3); 1.63-1.36 (m, 6H, (CH2)3)。
2c(200mg、0.53mmol)を、DMF10mlに溶かす。次いで、MnO2800mgを加える。15分間攪拌した後に、セライト(0.5cm)分子ふるい(粉末の形で0.5cm)混合層を介して混合物を濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで、エーテルで洗浄し、乾燥させる。化合物3c(130mg、65%)が、ピンク色の粉末の形で得られる。
融点110℃。- IR (KBr): 3248, 2930, 2857, 2367, 2342, 2038, 1699, 1521, 1456 cm-1。- 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 9.37 (s, 1H, NH-CO); 7.26-7.00 (m, 4H, Ar-H); 6.43 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.30 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.15 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.82および2.54 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.24 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 2.12 (s, 3H, CH3); 1.63-1.37 (m, 6H, (CH2)3)。
化合物メタ-ベンゾフェノン1d:
D-ビオチン(500mg、2.05mmol)を、温かい状態の無水DMF23mlに溶かす。混合物をアルゴン下に0℃に冷却し、次いで、N-メチルモルホリン(295μl、2.67mmol)およびクロロギ酸イソブチル(420μl、3.28mmol)を順次、加える。混合物を30分間攪拌し続け、次いで、DMF7ml中の3-アミノベンゾフェノン(605mg、3.07mmol)およびN-メチルモルホリン(240μl、2.17mmol)を加える。溶液を0℃で2時間攪拌し続け、次いで、蒸発乾燥させる。残留物をMeOH1mlにいれ、次いで、水25mlを加える。得られた沈殿物を濾過し、水、次いでエーテルで洗浄すると、粗製生成物1d 810mg(93%)が得られる。MeOH-H2O対から再結晶させると、白色の粉末の形の1d(630mg、72%)が得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 10.10 (s, 1H, NH-CO); 8-7.39 (m, 9H, Ar-H); 6.43 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.27 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.84および2.55 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1.59-1.36 (m, 6H, (CH2)3)。
1d(350mg、0.83mmol)を、無水エタノール5.5mlに溶かし、次いで、ヒドラジン一水和物(140μl、2.48mmol)を加える。溶液を還流下に一夜加熱する。蒸発の後に、生成物をエタノールおよび水1mlに入れる。白色の沈殿物を再結晶させる: これを、温かい状態の最小量のエタノールに溶かし、若干の曇りが生じるまで、水を加える。冷却した後に、得られた沈殿物を水で洗浄し、次いで、エーテルを用いて乾燥させる。こうすると、生成物2d264mg(73%)が、白色の粉末の形で得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 9.99 (s, 1H, NH-CO); 9.80 (s, 2H, NH2); 7.54-6.88 (m, 9H, Ar-H); 6.26 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.21 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.28 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.78および2.59 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.27 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1.57-1.36 (m, 6H, (CH2)3)。
3d(500mg、0.53mmol)をTHF1mlに溶かす。ついで、活性化MnO280mgを加える。室温で5分間攪拌した後に、セライト(0.5cm)-分子ふるい(粉末の形で0.5cm)混合層を介して、混合物を濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させる。化合物3d(47mg、100%)が、紫色のオイルの形で得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 9.95 (s, 1H, NH-CO); 7.60-6.9 (m, 9H, Ar-H); 6.42 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.28 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.83および2.59 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.27 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1.58-1.35 (m, 6H, (CH2)3)。
無水酢酸(75ml)中の一塩酸マロンアルデヒドビス(フェニルイミン)5(18.3g、70.0mmol)、NaOAc(9.0g、110mmol)およびヨウ化1,2,3,3-テトラメチル[3H]インドリウム(4.25g、14.1mmol)の混合物を110℃に20分間加熱する。冷却した後に、エーテル(350ml)を加え、沈殿する茶色の固体を濾過し、エーテル(3×100ml)で洗浄する。固体を、CH2Cl2150mlに再溶解させ、濾過し(無機塩の除去)、次いで、蒸発させると、茶色の固体(6.0g、90%)が得られる。
1H NMR (CDCl3): δ = 8.64 (d, 1H, J = 12 Hz, 1-H); 8.14 (t, 1H, J = 16, 12 Hz, 3-H); 7.63-7.19 (m, 9H); 6.90 (d, 1H, J = 15 Hz, 4-H); 5.82 (t, 1H, J = 12, 13 Hz, 2-H); 4.06 (s, 3H, NCH3); 2.16 (s, 3H, -COCH3); 1.74 (s, 6H, CH3)。
2,3,3-トリメチルインドール7(10.0g、62.8mmol)および6-ブロモヘキサン酸8(12.3g、62.8mmol)を、溶剤を用いずに混合し、アルゴン下に、110℃に12時間加熱する。赤紫色のペースト状反応混合物を酢酸エチル(2×60ml、ペーストをスパチュラで粉砕し、上澄みをデカンテーション除去する)で、次いで、アセトン(50ml、ペースト凝固)で洗浄する。ピンク色の固体を濾過し、次いで真空下に乾燥させる(16.0g;73%)。
ヨウ化物6(6.0g、12.7mmol)、臭化物9(4.5g、12.7mmol)およびNaOAc(2.6g、32mmol)からなる無水酢酸(35ml)中の混合物を110で20分間加熱する。冷却した後に、エーテル(150ml)を加え、沈殿物を濾過し、エーテル(3×50ml)で洗浄する。固体を、CH2Cl2100mlに溶かし、濾過し、SiO2カラムでクロマトグラフィー(溶離剤: MeOH5〜10%/CH2Cl2)により精製する。3.4g(44%)が、得られる。
1H NMR (CDCl3): δ = 8.03 (t, 2H, J = 10, 11 Hz, 2-H, 4-H); 7.38-6.91 (m, 9H, Ar-H, 3-H); 6.41 (d, 1H, J = 14 Hz, 1-H); 6.31 (d, 1H, J = 13 Hz, 5-H); 4.07 (t, 2H, J = 7, 7 Hz, α-CH2); 3.68 (s, 3H, NCH3); 2.47 (t, 2H, J = 7,7 Hz, ε-CH2); 1.71 (m, 18H, CH3, β,γおよびδ-CH2)。
N-メチルモルホリン(360μl、3.2mmol)を、Cy5COOH 10(1.19g、1.9mmol)のCH2Cl212ml溶液に加える。溶液を氷浴で冷却し、次いで、クロロギ酸イソブチル(480μl、3.7mmol)を加える。5分間攪拌した後に、3-アミノアセトフェノン(488mg、3.6mmol)を加える。混合物を室温で3時間攪拌する。エーテル250mlを加えると、ペースト状の固体が得られる。攪拌した後に、固体を放置して、丸底フラスコの底部に位置させ、上澄みをデカンテーション除去する。エーテル50mlを再び加え、媒体を、スパチュラで粉砕して、固体を得る。後者を濾過し、水、エーテルで洗浄し、次いで、真空乾燥させる。次いで、生成物(ヨウ化物)をエタノールに溶かし、アンバーライトIRA900(Cl-;15g)カラムに通す。エタノール溶液を回収し、蒸発乾燥させ、次いで、SiO2カラムに通す。青色の固体0.93g(77%)が得られる。
アセトフェノン11(0.93g、1.46mmol)の無水エタノール5ml溶液に、ヒドラジン一水和物(180μl、3.1mmol)を加え、これを室温で7時間攪拌する。エーテル50mlを加え、沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄する。粗製生成物を、CH2Cl250mlに溶かし、溶液を濾過し、ついで、濃縮して10mlにする。エーテル100mlを加えて、生成物を沈殿させ、濾過し、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥させる。生成物12(57%)540mgが得られる。
MnO2300mgを、ヒドラゾン12 100mgのDMF2ml溶液に加え、混合物を10分間激しく攪拌する。セライトの層を介して、懸濁液を濾過し、DMF(3×500μl)で洗浄する。エーテル50mlを加え、沈降するオイルを、スパチュラで粉砕し、上澄みをデカンテーション除去する。洗浄操作を、エーテル25ml用いて3回繰り返し、こうして得られた固体を濾過し、乾燥させる。生成物12a 65mg(65%)が得られる。生成物の純度は、約80〜85%(1H NMR)である。
実施例3.1: パラニトロフェニルジアゾメタン(NPDAM)の合成:
4-ニトロベンズアルデヒドは、市販されている(参照28、118-2、Aldrich, France)。
融点80-82℃。- 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 8.11 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H 3); 7.18 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H 2); 6.06 (s, 1H, CH 1-N2)。
アセトフェノンヒドラゾン: アセトフェノン(2.0g、16mmol)を、無水エタノール16ml中で希釈し、次いで、ヒドラジン(2.3ml、48mmol)を加える。混合物を還流温度まで加熱する。2時間後、溶剤を蒸発させ、残留物をエーテル(150ml)に入れる。媒体を水(100ml)で洗浄する。Na2SO4上で乾燥させた後に、エーテルを留去する。淡黄色のオイル(1.5g、11mmol、69%)が得られる。
ベンゾフェノンヒドラゾンは、市販品に由来する(参照B960-2Aldrich, France)。
PCRにより、16S結核菌(Mycobacterium tuberculosis)ゲノムDNAターゲット(出発ターゲットとしての10+4コピー)から、RocheからのFast start kit、デオキシリボヌクレオチドそれぞれ0.2mM(d-ATP、d-CTP、d-GTP、d-TTP)、プライマー0.3μMおよび酵素0.4μlを使用して、DNA増幅産物を生成する。
-95℃: 4分、次いで35サイクル(95℃: 30秒; 55℃: 30秒; 72℃: 30秒)、次いで4℃。増幅産物を、アガロースゲル電気泳動法により定量分析する(1.5%、TBE 0.5X)。析出される容量は5μlであり、移動を、100ボルト(V)で20分間行う。PCR生成物の可視化を、臭化エチジウムで染色した後に、UVランプ下で実施する。
標識試薬の合成は、実施例1から4に記載している。本発明に記載のPDAMは、市販されている(参照P1405、Molecular Probes, Eugene, OR)。
ジアゾメチル官能基を有する標識試薬の反応性を、反応の特異性を制御するために研究した。
3'-UMP0.04mM;H3BO3 2.0mM;マーカー2.0mM[適切な有機溶剤(THF, AcOEt またはDMSO)を加える];溶剤H2O-CH3CN-有機溶剤(比: 1/3/1)。
間違った解釈を回避するために、重要な試験であるメタ-BioPMDAMマーカーでの付加的な研究を、他のヌクレオチド3'一リン酸を用いて実施した。
ジヌクレオチドApUp(参照A4298、Sigma)のアルキル化を、メタ-BioPMDAMを用いて実施して、ヌクレオチド間ホスフェートに対する、末端リン酸の反応の選択性を確かめた。電気泳動による反応の監視を、図4に示す。条件は、既に記載した実施例6.1の標準的条件である。
得られた生成物が確かにホスフェートでのアルキル化から生じていることを確かめるために、一リン酸3'-UMP、3'-CMP、3'-GMPおよび3'-AMPとメタ-BioPMDAM試薬との付加生成物の合成を実施した。アルキル化反応を、下記に示す調製規模で実施した。70%の規模の収率で得られた付加生成物を生成し、次いで、プロトンまたはリンNMRにより調べた。
3'-UMP(二ナトリウム塩の形で、9.3mg、21.1μmol)を、0.1MのH3BO3水溶液2mlに溶かし、次いで、CH3CN2ml、MeOH6ml、次いでメタBioPMDAM試薬(75mg;0.20mmol)を順次、加える。反応を室温で2.5時間実施する。毛細管電気泳動により監視する。水3mlを加え、次いで、過剰の試薬を、CH2Cl2での抽出により除去する。水相を留去する。残留物を少量の水に溶かし、逆相シリカゲルカラム(Lichroprep RP-18、Merck;MeOH/H2O(20/80)溶離)に通過させることにより精製する。3'-UMPの付加生成物10(69%)が得られる。
前記実施例6.1の表1に記載の全てのジアゾメタン誘導体を、固体状態で、冷凍庫中、-20℃で、少なくとも3カ月貯蔵しても、反応性の損失は観察されない。
実施例8.1: 酸性媒体中での様々なヌクレオシドの加水分解
この研究の目的は、天然ヌクレオシドと修飾ヌクレオシドとの、さらにプリンとピリミジンタイプヌクレオシドとの、酸性pHに対する安定性に関する差を証明することである。この研究によって、その塩基組成を考慮することにより、DNAの断片化をより良好に制御することができるようになる。
RocheからのFast start kit、デオキシリボヌクレオチドそれぞれ0.2mM(d-ATP、d-CTP、d-GTP、d-TTP)、プライマー0.3μMおよび酵素0.4μlを使用して、16S結核菌ゲノムDNAターゲット(出発ターゲットとしての10+4コピー)から平行出発して、3つのPCR増幅を実施した。
実施例1.1に記載の反応スキームに従い、メタ-bioPMDAM誘導体(3a)を得た。
PCR10μlに、精製水(Sigma)38μl、ギ酸ナトリウム50μl(精製水中100mM)を加え、混合物を60℃で30分間インキュベーションする。次いで、メタ-bioPMDAM(100mMのDMSO)2μlを加える。溶液をボルテックス処理し、次いで、60℃でさらに15分間インキュベーションした。
精製を、QIAQUICK(登録商標)カラム(Nucleotide Removalキット、Qiagen, Hilden, Germany)で実施する。使用精製プロトコルは、メーカーにより推奨されるプロトコルである。
ベタイン参照 B-2754 Sigmaおよび
DTAB参照 D-5047 Sigmaである。
断片化の間の標識ステップの後に、得られた断片を、結核菌16S RNAの"Genbank"M20940シークエンスの領域213-415を分析するために設計されたDNAチップの上にハイブリダイゼーションさせる。このDNAチップは、A.Troesch et al., J. Clin. Microbiol, 37(1), 49-55頁, 1999年に記載されている。
ストレプトアビジン-フィコエリトリン: 参照R0438、Dako、Denmark、
ストレプトアビジン-CY5: 参照C0050 Dako Denmark、
消泡剤参照M5-575, Ultra Additives Inc.および
ツイーン参照P-7949、Sigma。
標識化および断片化の後にDNAチップの表面で放出された蛍光の読み取り、さらに信号強度および相同性パーセンテージを示すデータの作成を、Affymetrix(GeneChip(登録商標)Instrument SystemおよびGeneChip(登録商標)Information System, Santa Clara CA)により提供される読み取り系およびソフトウェアにより行う。
通常、90%を上回る相同性パーセンテージが十分な結果であるが、95%を上回る結果が通常求められると考えられる。95%を上回ると、この値はもはや示されたない。これは、マイコバクテリアDNAチップの場合には重要ではないためである。低いバックグラウンドノイズを伴う高い強度が、後の実施例で求められる第2の結果である。全ての結果で、バックグラウンドノイズBは、平均強度Iから推測されている。
ゲル上で分析されることを意図されたサンプルを、真空乾燥させ、精製水10μlおよび2×青色ホルムアミド10μlに入れる。
ジアゾメチル官能基を有する新規のマーカーでのDNAの標識を、合成DNA断片を使用して評価した。
DNAチップの上で読み取られた標識強度(I)の平均は、バックグラウンドノイズ(B)450rfuで、16644rfuである。
実施例11.1: 1-ピレニルジアゾメタン(PDAM)での標識:
反応時間を変えることにより、前記の条件下に、20マーのODN5'-ホスフェートを使用して、この研究を実施した。次の条件下に、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、標識収率を評価した:
逆相カラムSpheri-5 RP-18 5μm、220×4.6mm(Perkin Elmer)。使用された緩衝液および勾配は:
緩衝液A: 0.1MのTEAA;緩衝液B=緩衝液A50%+CH3CN50%および
室温で、1ml/分で、30分かけてのB10から50%の勾配。
インキュベーション時間を変え、それぞれの場合に10分のインキュベーション時間で、前記の条件下に、20マーのODN5'-ホスフェートを使用して、標識を実施した。
実施例1.1に記載の反応スキームに従い、メタ-bioPMDAM誘導体(3a)を得た。
a. 断片化条件下での標識:
PCR10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(50mM)およびメタ-BioPMDAM2μl(DMSO中100mM)を加える。容量を100μlに調節する。溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。
PCR10μlに、メタ-BioPMDAM2μl(DMSO中100mM)を加える。容量を100μlに調節する。溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。
次のプロトコルに従い、2本の別々の管で平行して、標識反応を実施した: PCR10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(50mM)およびメタ-BioPMDAM2μl(DMSO中100mM)を加える。全容量を100μlに調節し、60℃で30分間インキュベーションする。
実施例1.1、1.2および1.3に記載のプロトコルに従い、メタ-、オルト-およびパラ-bioPMDAM誘導体を調製した。これらを、100mMの濃度で、無水DMSOに溶かした。
実施例5に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。
実施例5に記載のプロトコルを従い、PCRによりDNA増幅産物を調製した。
実施例5に記載のプロトコルに従い、PCR増幅によりDNA増幅産物を調製した。2つのタイプの条件を使用する:
条件a:
PCR10μlに、フェナントロリン-FeSO420μl(25mM)およびメタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)2μlを加える。全容量を、100μlに調節する。混合物を、95℃で60分間インキュベーションする。
PCR10μlに、ギ酸ナトリウム緩衝液pH3 50μl(精製水中100mM)およびメタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)2μlを加える。全容量を、100μlに調節する。混合物を、95℃で60分間インキュベーションする。
標識されたヌクレオチドの導入
次のプロトコルに従い、PCR増幅を実施して、フルオレセインで標識されたPCR増幅産物を生成した(塩基上で標識)。
PCR10μlに、ギ酸ナトリウム緩衝液pH3 50μl(精製水中100mM)を加える。容量を、100μlに調節する。次いで溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。
PCR10μlに、ギ酸ナトリウム緩衝液pH3 50μl(精製水中50mM)およびメタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)2μlを加える。容量を、100μlに調節する。ついで溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。この試験は、参照プロトコルに対応し、このことにより、増幅ステップによる変動性を省くことにより、様々な標識手段を比較することができる。
d-UTP-フルオレセインで標識された増幅産物の断片化により得られた核酸(条件a)を、DNAチップにハイブリダイゼーションし、第一に、実施例15に記載されたように、フルオレセインにより放出される蛍光シグナルを直接読み取ることにより検出する。
シグナル増幅ステップを使用して、標識感度を改善した。ハイブリダイゼーションステップの間に、ビオチン化抗フルオレセイン抗体(参照216-065-084、Jackson ImmunoResearch)、次いでフィコエリトリンで標識されたストレプトアビジンを導入することにより、次の連続条件で、シグナルの増幅を実施した:
精製水300μl、
100mMのトリス緩衝液pH7 300μl/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;BSA2.4μl(50mg/ml)、ビオチン化抗フルオレセイン抗体1.2μl(1mg/ml)、
精製水300μl、
100mMのトリス緩衝液pH7 300μl/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;BSA6μl(50mg/ml)、ストレプトアビジン6μl(300μg/ml)。
DNAチップの上にハイブリダイゼーションされたビオチン化断片(条件b)を、次の条件を使用して、フィコエリトリンで標識されたストレプトアビジンを導入することにより現させた:
精製水300μlおよび
100mMのトリス緩衝液pH7 300μl/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;BSA6μl(50mg/ml);標識されたストレプトアビジン-PE 6μl(300μg/ml)。
プロトコルa1に従い、d-UTP-フルオレセインのみで増幅産物が標識されている場合には、フルオレセイン、もしくは
増幅産物が、
プロトコルa2に従いシグナルの増幅を伴うd-UTP-フルオレセインで、または
プロトコルbに従いその断片化の間のメタ-bioPMDAMで
標識されている場合には、フィコエリトリン。
実施例5に記載のプロトコルを使用して、DNA増幅産物を得た。これらの増幅産物を、マーカーの存在下および不在下に、超音波処理することにより、断片化した。
PCR反応10μlに、メタ-bioPMDAM2μl(DMSO中100mM)を加える。容量を、精製水を用いて100μlに調節し、pHを、6.5に調節する。混合物を、超音波容器の浴(周波数35kHz、モデルT460-H、Bioblock, France)中、60℃で30分間インキュベーションする。
PCR反応10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(50mM)およびメタ-bioPMDAM2μl(DMSO中100mM)を加える。容量を、精製水を用いて100μlに調節する。この溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。
臭化エチジウム染色を使用して、分解ポリアクリルアミドゲル(ポリアクリルアミド8%、7Mの尿素、1×TBE)で、分析を実施した。
実施例5に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。
a. 単一ステップでの95℃での標識、断片化および変性:
PCR反応10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(50mM)およびメタ-bioPMDAM2μl(無水DMSO中100mM)を加える。最終容量を、100μlに調節する。この溶液を、95℃で30分間インキュベーションする。この場合、反応混合物を、予め精製することなく、DNAチップの上でハイブリダイゼーションさせた。
PCR反応10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(50mM)およびメタ-BioPMDAMビオチンマーカー2μl(無水DMSO中100mM)を加える。最終容量を、100μlに調節する。次いで、この溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、反応混合物を、前記のプロトコルに従い精製した。このプロトコルでは、DNAチップの上でハイブリダイゼーションさせる前に、断片を、実施例12.2に記載のプロトコルに従い変性させた。
4-カルボキシベンズアルデヒドは、市販品である。これ(3g;20mmol)を、塩化トリメチルシリル(10g;92mmol)のMeOH100ml溶液に溶かした。混合物を室温で40時間攪拌し続ける。蒸発の後に、4-メトキシカルボニルベンズアルデヒド24に対応する白色の固体を単離し、NMRにより同定し、そのまま、次の反応のために使用する。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 10.07 (s, 1H, -CHO); 8.17 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.92 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 3.93 (s, 3H, CO-O-CH3)。
Dowex 50WX8-100(1g)の存在下に、4-メトキシカルボニルベンズアルデヒド(3.35g;20mmol)を、オルトギ酸トリメチル(4.8g、40mmol)で溶かす。混合物を還流下に2時間加熱し、次いで、濾過し、蒸発させる。再結晶処置の後に、NMR分析により、反応が完全ではないことが分かり、後者を、MeOH30ml、CH(OMe)330mlおよびDowex 50WX8-1001g中、室温で再開する。濾過、次いで蒸発を実施すると、生成物25 3.55g(16.89mmol、84%)が得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 8.01 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.50 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 5.41 (s, 1H, CH); 3.93 (s, 3H, -CO-O-CH3); 3.29 (s, 6H, -O-CH3)。
化合物25(3.1g;14.8mmol)を、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン16ml(73mmol)を溶かす。得られた溶液を、140〜150℃に2時間加熱した。次いで、混合物を、DCM(ジクロロメタンまたはCH2Cl2)100mlに溶かし、水10mlで6回洗浄する。有機相をMgSO4上で乾燥させ、オイルが得られるまで、蒸発させる。このオイルを、ペンタンで3回洗浄し、続いてデカンテーションし、次いで、DCMおよびH2Oで新たに抽出する。MgSO4上で乾燥させ、蒸発させた後に、生成物26が、収率63%(9.27mmol)で単離される。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 7.78 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.46 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 5.39 (s, 1H, CH); 3.62-3.47 (m, 14H, H7',8',10',11'およびH5', 13'およびH3'); 3.29 (s, 6H, -O-CH3); 2.72 (m, 2H, H15') 1.87 (m, 2H, H4'); 1.64 (m, 2H, H14'); 1.30 (ブロード s, 2H, NH2)。
ビオチン(500mg;2.05mmol)を、DMF10mlに懸濁させ、次いで、CDI365mg(2.25mmol)を加える。この溶液を室温で30分間攪拌し続け、化合物26(900mg;2.26mmol)を、DMF1mlに溶かし、次いで、少量ずつ前述の溶液に加える。こうして得られた混合物を、室温で1時間攪拌し続ける。蒸発の後に、カラム(直径20mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、MeOH-DCM6% 250mLで、次いでMeOH-DCM7% 200ml、最後にMeOH-DCM8% 200mlで実施する。生成物27に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、オイル1.00gが、50%と推測される収率で得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 9.50 (ブロード s, 1H, NHイミダゾール); 7.80 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.64 (s, 1H, Hイミダゾール); 7.46 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5および1H, NH2'); 7.05 (s, 2H, Hイミダゾール); 6.76 (t, 1H, NH16'), 6.20 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.44 (ブロード s, 1H, NH B3); 5.37 (s, 1H, CH); 4.42 (m, 1H, HB6a); 4.24 (m, 1H, HB3a); 3.59-3.44 (m, 14H, H7',8',10',11'およびH5',13'およびH3'); 3.29 (m, 8H, H15'および2-O-CH3); 3.07 (m, 1H, HB4); 2.84および2.66 (ABX系, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.13 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.85 (m, 2H, H4'); 1.66 (m, 2H, H14'); 1.40-1.37 (m, 6H, HB7, B8, B9)。
アセタール27を、クロロホルム50mlに溶かし、次いで、2NのHCl20mlを加える。2相の混合物を激しく、15分間攪拌する。有機相を回収し、無水NaHCO3上で乾燥させる。これを濾過し、蒸発させると、化合物28が、ペースト(495mg;0.855mmol)の形で、ビオチンからの全体収率42%で得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 10.05 (s, 1H, CHO); 7.98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.92 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 7.58 (t, 1H, NH2'); 6.46 (t, 1H, NH16'), 6.02 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.19 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.46 (m, 1H, HB6a); 4.27 (m, 1H, HB3a); 3.66-3.56 (m, 10H, H7',8',10',11'およびH5'); 3.50-3.29 (m, 4H, H3',13'); 3.28 (m, 2H, H15'); 2.95 (m, 1H, HB4); 2.84および2.71 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.15 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.89 (m, 2H, H4'); 1.72-1.63 (m, 6H, H14', HB7, B9); 1.23 (m, 2H, HB8)。
アルデヒド28(495mg;0.855mmol)を、無水エタノール10mlに溶かす。ヒドラジン(350μl;7.20mmol)を加え、次いで、反応混合物を還流下に1時間加熱する。蒸発後に得られたオイルを、無水EtOHに溶かして、再び蒸発させる。次いで、発泡物質が得られ、これを、ペンタンとともに砕く。生成物29(511mg;0.862mmol)に対応するペーストが、収率100%で得られた。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 7.76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.72 (s, 1H, CH); 7.56 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 7.34 (t, 1H, NH2'); 6.45 (t, 1H, NH16'), 5.98 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.78 (ブロード s, 2H, NH2); 5.18 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.44 (m, 1H, HB6a); 4.26 (m, 1H, HB3a); 3.62-3.56 (m, 10H, H7',8',10',11'およびH5'); 3.48-3.45 (m, 4H, H3',13'); 3.27 (m, 2H, H15'); 3.07 (m, 1H, HB4); 2.84および2.68 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.11 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.86 (m, 2H, H4'); 1.72-1.59 (m, 6H, H14', HB7, B9); 1.21 (m, 2H, HB8)。
ヒドラゾン29(357mg;0.602mmol)を、DMF17.5mlに溶かす。次いで、MnO2(700mg;7.7mmol)を加える。室温で12分間攪拌した後に、混合物を、セライトを含有するミリポア(厚さ: 2cm)および3Å(0.5cm)の粉末分子ふるいで濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させる。得られた残留オイルを、エーテルで連続して3回洗浄する。化合物30(290mg、0.491mmol)が、ややピンク色の固体の形で収率82%で得られる。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 8.28 (t, 1H, NH2'); 7.77 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.74 (t, 1H, NH16'); 7.00 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 6.38 (ブロード s, 1H, NH B1); 6.32 (ブロード s, 1H, NH B3); 5.80 (s, 1H, CH-N2); 4.27 (m, 1H, HB6a); 4.11 (m, 1H, HB3a); 3.51-3.44 (m, 10H, H7', 8', 10', 11'およびH5'); 3.37 (m, 2H, H15'); 3.32 (m, 4H, H3',13'); 3.05 (m, 1H, HB4); 2.79および2.58 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.02 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.69 (m, 2H, H4'); 1.59-1.48 (m, 6H, H14', HB7, B9); 1.25 (m, 2H, HB8)。
このタイプの分子、即ち、ポリエチレングリコールベースの連結アームを有するPDAM誘導体の主な利点は、ジアゾ官能基とビオチンとを離しておくことができ、可溶性が、最終分析では、これらの分子の反応性が、増大することである。
PCR10μlに、パラ-Bio-EG3-PDAM(DMSO中100mM)およびDNアーゼ/Rnアーゼを含まない水77μlを加える。溶液は均質で、沈殿物は有さない。この溶液を、95℃で10分間インキュベーションし、0.1MのHCl3μlを加え、溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。
PCR10μlに、メタ-Bio-PDAM(DMSO中100mM)およびDNアーゼ/Rnアーゼを含まない水77μlを加える。この生成物の合成は、実施例1.1に記載されている。溶液は、僅かな沈殿物を有する。この溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。次いで、0.1MのHCl3μlを加え、溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。
実施例22.1: メタ-Bio-EG3-PMDAMの合成
3-アミノアセトフェノン(14.5g、107mmol)を、無水DMF50mlに溶かす。無水コハク酸(10.7g、107mmol)を加え、混合物をアルゴン下に室温で攪拌し続ける。6時間後、溶液を真空濃縮し、メタノール50mLを加える。得られた沈殿物を濾過し、メタノールおよびエーテルで洗浄する。生成物68 19.4(81%)がこうして、オフホワイト色の粉末の形で得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 2.5-2.6 (m, 7H); 7.45 (t, 1H); 7.64 (d, 1H); 7.83 (d, 1H); 8.19 (s, 1H); 10.16 (s, 1H); 12.12 (s, 1H)。
化合物68 5.07g(22mmol)をアルゴン下に、無水DMF10mlに溶かす。混合物を氷の上に置き、カルボニルジイミダゾール5.00g(32mmol)を加える。20分後に、4,7,10-トリオキサトリデカンジアミン(EG3)20ml(94.6mmol)を徐々に加える。室温での3時間の反応の後に、DMFを蒸発させ、残留物を、CH2Cl2100mlに入れる。飽和NaHCO3およびH2Oで抽出を実施し、そのあと、有機相を無水Na2SO4を用いて乾燥させ、溶剤を蒸発させる。こうして、生成物69 4.34g(46%)が得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 1.59 (m, 2H); 1.87 (m, 2H); 2.16 (s, 3H); 2.40 (m, 2H); 2.55 (m, 2H); 3.08 (m, 2H); 3.45 (m, 16H); 7.30 (t, 1H); 7.42 (d, 1H); 7.70 (d, 1H); 7.83 (t, 1H); 7.97 (s, 1H); 10.00 (s, 1H)。
D-ビオチン(1.0g、4.1mmol)を、アルゴン下に無水DMF10mlに溶かす。混合物を、氷の上で冷やし、無水DMF10ml中のカルボニルジイミダゾール(CDI)(0.665g、4.1mmol)を加える。15分後に、無水DMF2ml中の化合物69(1.8g、4.1mmol)を加える。反応を放置して、35℃で3時間進行させ、次いで、DMFを蒸発させ、残留物を、CH2Cl2100mlに入れる。飽和NaHCO3およびH2Oで抽出を実施し、そのあと、有機相を無水Na2SO4を用いて乾燥させ、溶剤を蒸発させる。こうして得られた生成物のNMR特性により、生成物70および遊離EG3の混合物が得られたことが分かる。合成を継続する前に、他の精製ステップを実施する。
3-ニトロアセトフェノン33g(0.20モル)を、トルエン400mlに溶かし、次いで、エチレングリコール40ml(0.717モル)およびパラ-トルエンスルホン酸(PTSA)600mg(3.15mmol)を加えた。ディーンスターク系にマウントする。溶液を130℃に3時間加熱する。溶液を室温にもどした後に、酢酸エチル400mlを加え、次いで、溶液を飽和NaHCO3溶液8mlで洗浄する。有機相をMgSO4上で乾燥させる。蒸発の後に、淡黄色の固体13(39.72g;0.190モル)が収率95%で得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 7.11 (t, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 6.87-6.78 (m, 2H, Ar-H); 6.59 (dd, 1H, J = 6.5 Hz, Ar-H); 4.00 (m, 2H, H 2Cアセタール); 3.79 (m, 2H, H 2Cアセタール); 1.61 (s, 3H, CH3)。
化合物13(39.7g、0.190モル)を、EtOH500mlに溶かし、次いで、炭素に担持された10%パラジウム1gを加える。混合物を加熱して、全体を溶かし、次いで、溶液を放置して室温に戻す。真空を適用し、溶液をH2下に置いた後に、これを激しく5時間攪拌し続ける。次いで溶液を温時ろ過し、次いで、蒸発させる。生成物14を、ペンタンで洗浄し、固体(34g;0.189モル)の形で収率99%で単離する。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 7.14 (t, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 6.85 (m, 2H, J = 7.5 Hz, Ar-H); 6.79 (s, 1H, Ar-H); 6.59 (dd, 1H, J = 6.5 Hz, Ar-H); 4.00 (m, 2H, H 2Cアセタール); 3.77 (m, 2H, H 2Cアセタール); 1.61 (s, 3H, CH3)。
アミン14(12.3g;68.7mmol)およびトリエチルアミン(7g;69mmol)をアルゴン下に、DCM150mlに溶かす。DCM150mlに溶かされた臭化ブロモアセチル13.8g(60mmol)の溶液を-5℃で滴加する。添加の終了時に、水性の1NのNaHCO3100mlを加える。有機相を水性NaHCO3で連続して2回洗浄し、MgSO4上で乾燥させる。蒸発乾燥の後に、化合物15に対応する茶色のオイル22.6gが得られ、これをそのまま、次の反応で使用する。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 8.29 (ブロード s, 1H, NH); 7.62 (dt, 1H4, J = 5 Hz, Ar-H); 7.47 (s, 1H, Ar-H2); 7.38-7.19 (m, 2H, Ar-H5,6); 4.00 (m, 2H, Br-CH 2); 3.75 (m, 4H, H 2C-H 2Cアセタール); 1.61 (s, 3H, CH3)。
水素化ナトリウム(3.3g;82.5mmol)を、ペンタンで3回洗浄し、次いで、THF150mlに懸濁させ、次いで、テトラエチレングリコール(50ml;0.29モル)を室温で加える。反応を、15分間攪拌し続け、次いで、溶液を-5℃に冷却する。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 8.86 (ブロード s, 1H, NH); 7.71 (d, 1H, J = 7.5 Hz, Ar-H4); 7.51 (s, 1H, Ar-H2); 7.29-7.24 (m, 2H, Ar-H5,6); 4.09 (m, 2H, CO-CH 2-O); 3.99 (m, 2H, H 2Cアセタール); 3.72-3.53 (m, 20H, O-CH 2-CH 2-O, H 2CアセタールおよびHO-CH 2); 1.61 (s, 3H, CH3)。
アルコール16(4.13g;10.0mmol)を、ピリジン5mlに溶かす。次いで、塩化トシル2.0g(10.5mmol)を室温で加える。混合物をアルゴン下に10時間攪拌する。これを、DCM100mlで希釈し、有機相を、水性の1NのNaHCO320mlで3回洗浄し、次いでこれを、MgSO4上で乾燥させ、その後、トルエンと共に同時蒸発させる。カラム(直径50mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、MeOH-DCM2% 500mlで、次いでMeOH-DCM3% 500ml、最後にMeOH-DCM4% 500mlを用いて実施する。生成物17に対応する分画を合わせ、蒸発乾燥させると、オイル3.68g(6.48mmol)が65%と推測される収率で得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 8.86 (ブロード s, 1H, NH); 7.76 (d, 4H, J = 5.5 Hz, Ar-Hトシル); 7.60 (d, 1H, J = 7.5 Hz, Ar-H4); 7.50 (s, 1H, Ar-H2); 7.32-7.22 (m, 2H, Ar-H5,6); 4.10 (m, 2H, CO-CH 2-O); 4.00 (m, 2H, H 2Cアセタール); 3.73-3.54 (m, 20H, O-CH 2-CH 2-O, H 2CアセタールおよびHO-CH 2); 2.42 (s, 3H, Ar-CH3); 1.61 (s, 3H, CH3)。
トシレート17(3.68g;6.48mmol)を、DBU(1,8-ジアゾビシクロ[5.4.0]ウンデセン)1.52g(10.0mmol)で溶かし、次いで、フタルイミド(1.47g;10mmol)を加える。こうして得られた溶液を85〜90℃に17時間加熱し、次いで、蒸発させる。生成物を、アセトン-DCM15%1l、次いでアセトン-DCM20%1lを用いるシリカカラム(直径50mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。化合物18に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、生成物3.15g(5.8mmol)が収率90%で得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 8.73 (ブロード s, 1H, NH); 7.79 (m, 2H, Ar-Hフタルイミド); 7.99 (m, 2H, Ar-HフタルイミドおよびAr-H4); 7.49 (s, 1H, Ar-H2); 7.27-7.18 (m, 2H, Ar-H5,6); 4.10 (m, 2H, CO-CH 2-O); 4.00 (m, 2H, H 2Cアセタール); 3.69-3.56 (m, 20H, O-CH 2-CH 2-O, H 2CアセタールおよびNフタルイミド-CH 2); 1.61 (s, 3H, CH3)。
還流下に75〜80℃に加熱することにより、生成物18を、無水EtOH20mlに溶かす。次いで、ヒドラジン(1.07ml;22.1mmol)を加え、反応を1時間15分攪拌し続ける。得られた沈殿物を焼結ガラスで濾過し、エタノール相を蒸発させる。次いで、白色の沈殿物をDCMで洗浄し、DCM相を蒸発させる。アセタールを脱保護するためのステップの間に除去することができるイミダゾールを含有していても、得られた黄色のオイル(2.3g;5.57mmol)をそのまま、次の反応のために使用する。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 8.83 (ブロード s, 1H, NH); 7.69 (d, 1H, J = 7.5 Hz, Ar-H4); 7.51 (s, 1H, Ar-H2); 7.30-7.19 (m, 2H, Ar-H5,6); 4.10 (m, 2H, CO-CH 2-O); 4.00 (m, 2H, H 2Cactal); 3.69-3.56 (m, 20H, O-CH 2-CH 2-O, H 2CアセタールおよびH2N-CH 2); 1.61 (s, 3H, CH3)。
D-ビオチン(1.05g;4.32mmol)を、無水DMF10mlに溶かす。カルボニルジイミダゾール(CDI)790mg(4.87mmol)をアルゴン下に加える。10分攪拌した後に、DMF5ml中で希釈されたアミン19を加える。溶液を40分間攪拌し続け、次いで、蒸発させ、その後、カラムでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 8.80 (ブロード s, 1H, NH); 7.66 (m, 3H, Ar-H4およびHイミダゾール); 7.54 (s, 1H, Ar-H2); 7.28-7.24 (m, 2H, Ar-H5,6); 7.07 (s, 2H, Hイミダゾール), 6.59 (t, 1H, NH15'); 6.06 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.19 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.45 (m, 1H, HB6a); 4.27 (m, 1H, HB3a); 4.10 (s, 2H, H3'); 4.00 (m, 2H, H 2Cアセタール); 3.75-3.49 (m, 18H, O-CH 2-CH 2-OおよびH 2Cアセタール); 3.36 (m, 2H, H14'); 3.09 (m, 1H, HB4); 2.85および2.66 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.16 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.61 (s, 3H, CH3); 1.59-1.3 (m, 6H, HB9, B8, B7)。
アセタール20を、クロロホルム80mlに溶かし、次いで、2NのHCl30mlを加える。混合物を激しく45分間攪拌し続ける。有機相を回収し、次いで、無水NaHCO3上で乾燥させる。濾過の後に、溶液を蒸発させ、得られたオイルを、ペンタンで洗浄すると、生成物21(1.48g;2.48mmol)が収率99%で得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 8.99 (ブロード s, 1H, NH); 8.07 (s, 1H, Ar-H2); 7.98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H4); 7.66 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H6); 7.42 (t, 2H, J = 8 Hz, Ar-H5); 6.38 (t, 1H, NH15'); 5.78 (ブロード s, 1H, NH B1); 4.96 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.47 (m, 1H, HB6a); 4.29 (m, 1H, HB3a); 4.13 (s, 2H, H3'); 3.76-3.37 (m, 16H, O-CH 2-CH 2-O); 3.32 (m, 2H, H14'); 3.11 (m, 1H, HB4); 2.89および2.75 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.59 (s, 3H, CH3); 2.16 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.64-1.40 (m, 6H, HB9, B8, B7)。
ケトン21を、無水EtOH20mlに溶かす。混合物を還流下に75〜80℃で加熱する。次いで、ヒドラジン816μl;16.81mmolを加え、混合物を3時間攪拌し続ける。濾過の後に、混合物を蒸発乾燥させ、粘稠性の白色の発泡物質が得られるまで、残留物をエタノールに再溶解させる。第2の場合には、この発泡物質を、クロロホルム50mlに溶かし、次いで、飽和NaHCO3溶液20mlを加える。混合物を十分に洗浄し、次いで、有機相を回収する。これを、無水Na2CO3上で乾燥させ、濾過の後に、蒸発乾燥させると、新たな粘稠性の発泡物質が得られる。後者は、生成物22(842mg;1.38mmol)に対応し、収率66%で得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 8.81 (ブロード s, 1H, NH); 8.82 (s, 1H, Ar-H2); 7.64 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H4); 7.32 (m, 4H, Ar-H5,6); 6.43 (t, 1H, NH15'); 5.89 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.46 (ブロード s, 2H, NH2); 4.99 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.44 (m, 1H, HB6a); 4.27 (m, 1H, HB3a); 4.11 (s, 2H, H3'); 3.70-3.37 (m, 16H, O-CH 2-CH 2-O); 3.32 (m, 2H, H14'); 3.08 (m, 1H, HB4); 2.87および2.67 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.11 (m, 5H, CH3およびHB10); 1.64-1.40 (m, 6H, HB9, B8, B7)。
ヒドラゾン22(100mg;0.164mmol)を、アルゴン下にDMF1mlに溶かす。活性化MnO280mgを加え、混合物を激しく30分間攪拌し続ける。混合物を、セライト(3cm)-粉末分子ふるい(1cm)混合層で濾過する。次いで溶液を、蒸発乾燥させる。蒸発の終了時に得られたオイルを、化合物23(78mg;0.128mmol;78%)に対応するピンク色の粉末が得られるまで粉砕する。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 9.60 (ブロード s, 1H, NH); 7.89 (s, 1H, Ar-H2); 7.76 (t, 1H, NH15'); 7.35-7.25 (m, 4H, Ar-H5,6); 6.64 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H4); 6.36 (ブロード s, 1H, NH B1); 6.32 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.28 (m, 1H, HB6a); 4.08 (m, 1H, HB3a); 4.06 (s, 2H, H3'); 3.55-3.31 (m, 16H, O-CH 2-CH 2-O); 3.17 (m, 2H, H14'); 3.08 (m, 1H, HB4); 2.80および2.59 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.13 (m, 5H, CH3); 2.13 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.99-1.30 (m, 6H, HB9, B8, B7)。
4-アセチル安息香酸(1g;6.1mmol)を、塩化トリメチル(TMSCl、10g;92mmol)のMeOH5ml溶液に溶かす。混合物を、90℃に一晩加熱する。蒸発の後に、化合物31(1.21g;5.75mmol)に対応する白色の固体を単離し、NMRにより同定し、そのまま、次の反応のために使用する。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 8.08 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.59 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 3.18 (s, 6H, -O-CH3); 1.53 (s, 3H, CH3)。
化合物31(1.21g;5.75mmol)を、Dowex 50WX8-100(0.3g)の存在下に、オルトギ酸トリメチル5mlに溶かす。混合物を60℃に一晩加熱し、次いで、濾過し、蒸発させると、化合物32(1.19g;5.3mmol)が収率87%で得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 8.00 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.54 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 3.89 (s, 1H, CO-O-CH3); 3.16 (s, 6H, -O-CH3); 1.51 (s, 3H, CH3)。
化合物32(1.17g;5.22mmol)を、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン5ml(22.7mmol)に溶解させる。得られた溶液を、140℃に4時間加熱する。次いで混合物を、DCM30mlに溶かし、水10mlで3回洗浄する。有機相をMgSO4上で乾燥させ、次いで、蒸発させると、生成物33(1.44g;3.49mmol)に対応するオイルが収率67%で得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 7.76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.51 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 3.62-3.47 (m, 14H, H7',8',10',11'およびH5',13'およびH3'); 3.15 (s, 6H, -O-CH3); 2.73 (m, 2H, H15') 1.88 (m, 2H, H4'); 1.65 (m, 2H, H14'); 1.38 (ブロード s, 2H, NH2)。
ビオチン(780mg;3.19mmol)を、DMF13mlに懸濁させる。次いで、CDI590mg(3.60mmol)を加える。この溶液を室温で30分間攪拌し続ける。化合物33を、DMF1mlに溶解させ、次いで、前述の溶液を少量ずつ加える。次いで、混合物を室温で1時間攪拌し続ける。DMFを蒸発させた後に、カラム(直径35mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、MeOH-DCM6%500ml、次いで、MeOH-DCM8%250ml、最後にMeOH-DCM8%250mlを用いて実施する。生成物34に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、オイル1.05gが推測される収率30%で得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 8.49 (ブロード s, 1H, NHイミダゾール); 7.79 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.66 (s, 1H, Hイミダゾール); 7.50 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 7.38 (t, 1H, NH2'); 7.11 (s, 2H, Hイミダゾール); 6.67 (t, 1H, NH16'), 5.99 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.15 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.46 (m, 1H, HB6a); 4.27 (m, 1H, HB3a); 3.61-3.45 (m, 14H, H7',8',10',11'およびH5',13'およびH3'); 3.28 (m, 2H, H15'); 3.15 (s, 6H, -OCH3); 2.85 (m, 1H, HB4); 2.85および2.69 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.14 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.86 (m, 2H, H4'); 1.69 (m, 2H, H14'); 1.49 (s, 3H, CH3); 1.42-1.39 (m, 6H, HB7, B8, B9)。
アセタール34を、クロロホルム45mlに溶解させ、次いで、2NのHCl10mlを加える。2相混合物を5分間激しく攪拌する。有機相を回収し、無水NaHCO3上で乾燥させる。これを濾過し、蒸発させると、化合物35が、薄い黄色の固体(504mg;0.87mmol)の形で、ビオチンからの全体収率27%で得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 7.97 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.91 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 7.51 (t, 1H, NH2'); 6.50 (t, 1H, NH16'), 6.05 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.23 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.45 (m, 1H, HB6a); 4.27 (m, 1H, HB3a); 3.62-3.56 (m, 10H, H7' 8',10',11'およびH5'); 3.48-3.46 (m, 4H, H3',13'); 3.27 (m, 2H, H15'); 3.10 (m, 1H, HB4); 2.85および2.71 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.60 (s, 3H, CH3); 2.14 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.89 (m, 2H, H4'); 1.72-1.61 (m, 6H, H14', HB7 B9); 1.40 (m, 2H, HB8)。
ケトン35(500mg;0.864mmol)を、無水EtOH11mlに溶かす。ヒドラジン(335μl;6.911mmol)を加え、次いで、反応混合物を還流下に1時間加熱する。蒸発の後に得られるオイルを、全体EtOHに溶かして、再び蒸発させる。すると、生成物36(488mg;0.823mmol)に対応する粘稠性の発泡物質が、収率95%で得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 7.76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.67 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 7.29 (t, 1H, NH2'); 6.46 (t, 1H, NH16'), 5.98 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.55 (ブロード s, 2H, NH2); 5.14 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.45 (m, 1H, HB6a); 4.24 (m, 1H, HB3a); 3.62-3.51 (m, 10H, H7', 8',10',11'およびH5'); 3.47-3.45 (m, 4H, H3',13'); 3.27 (m, 2H, H15'); 3.07 (m, 1H, HB4); 2.84および2.69 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.11 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10およびs, 3H, CH3); 1.86 (m, 2H, H4'); 1.72-1.59 (m, 6H, H14', HB7, B9); 1.21 (m, 2H, HB8)。
ヒドラゾン36(200mg;0.337mmol)を、DMF5mlに溶解させる。次いで、MnO2(450mg;5.17mmol)を加える。室温で15分間攪拌した後に、混合物をセライトを含有するミリポア(厚さ: 2cm)および3Å(0.5cm)粉末分子ふるいで濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させる。得られた残留オイルを、エーテルで連続して3回洗浄して、粉末を得る。化合物37(290mg、0.491mmol)が、ピンク色の固体の形で収率93%で得られる。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 8.33 (t, 1H, NH2'); 7.83 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H2,6); 7.73 (t, 1H, NH16'); 6.98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H3,5); 6.39 (ブロード s, 1H, NH B1); 6.33 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.30 (m, 1H, HB6a); 4.12 (m, 1H, HB3a); 3.51-3.45 (m, 16H, H7',8',10',11'およびH5'およびH15'およびH3',13'); 3.07 (m, 1H, HB4); 2.79および2.58 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.14 (s, 3H, CH3); 2.04 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.77 (m, 2H, H4'); 1.62-1.48 (m, 6H, H14', HB7, B9); 1.31 (m, 2H, HB8)。
Dowex 50WX8-100樹脂(2g)、H2N-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3- 25mlのMeOHおよび25mlのトリメチルo:CH2-NH2を次いで、15分間攪拌し続ける。デカンテーションの後に、樹脂をMeOH20mlで連続して2回洗浄する。次いで、この樹脂をMeOH100mlに入れ、CH(OMe)350mlおよび3-ホルミル安息香酸メチル7.12g(43.4mmol)を加える。溶液を、15分間攪拌し続け、次いで、プリーツ型の紙で濾過し、その後、蒸発させる。生成物39(9g;43.1mmol)が、薄い黄色の液体の形で収率99%で単離される。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 8.10 (s, H, Ar-H2); 7.9 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H4); 7.63 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H6); 7.42 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H5); 5.40 (s, 1H, CH); 3.90 (s, 3H, -CO-O-CH3); 3.31 (s, 6H, -O-CH3)。
化合物39(2g;9.5mmol)を、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン10.4ml(47.6mmol)を溶解させる。得られた溶液を165℃に2時間加熱する。次いで、混合物をDCM80mlに溶かし、水20mlで4回洗浄する。MgSO4上で乾燥させ、蒸発させた後に、生成物40が収率60%(2.27g;5.69mmol)で単離される。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 7.84 (s, H, Ar-H2); 7.75 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H4); 7.53 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H6); 7.39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H5); 5.38 (s, 1H, CH); 3.64-3.43 (m, 14H, H7',8',10',11'およびH5',13'およびH3'); 3.29 (s, 6H, -O-CH3); 2.72 (m, 2H, H15'); 1.87 (m, 2H, H4'); 1.64 (m, 2H, H14'); 1.30 (ブロード s, 2H, NH2)。
D-ビオチン(344mg;1.40mmol)を、DMF4mlに懸濁させ、次いで、CDI250mg(1.54mmol)を加える。溶液を、室温で30分間攪拌し続ける。化合物40(616mg;1.54mmol)を、DMF2mlに溶かし、次いで、前述の溶液を少量ずつ加える。こうして得られた混合物を室温で50分間攪拌し続ける。蒸発させた後に、カラム(直径30mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、MeOH-DCM10%750ml、次いで、MeOH-DCM15%250mlを用いて実施する。生成物41に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、オイル740mgが推測される50%の収率で得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ = 7.87 (s, H, Ar-H2); 7.78 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H4); 7.65 (s, 1H, Hイミダゾール); 7.53 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H6); 7.39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H5); 7.07 (s, 2H, Hイミダゾール); 6.65 (t, 1H, NH16'), 5.95 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.38 (s, 1H, CH); 5.15 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.43 (m, 1H, HB6a); 4.27 (m, 1H, HB3a); 3.59-3.44 (m, 14H, H7',8',10',11'およびH5',13'およびH3'); 3.29 (m, 8H, H15'および2-O-CH3); 3.07 (m, 1H, HB4); 2.84および2.66 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.13 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.85 (m, 2H, H4'); 1.66 (m, 2H, H14'); 1.40-1.37 (m, 6H, HB7, B8, B9)。
アセタール41を、クロロホルム20mlに溶かし、次いで2NのHCl5mlを加える。2相混合物を15分間激しく攪拌する。有機相を回収し、無水NaHCO3上で乾燥させる。これを濾過し、蒸発させると、化合物42が、黄色のオイル(593mg;1.02mmol)の形で、ビオチンからの全体収率87%で得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 10.04 (s, 1H, CHO); 8.34 (s, H, Ar-H2); 8.16 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H4); 7.96 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H6); 7.72 (t, 1H, NH2'); 7.39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H5); 6.51 (t, 1H, NH16'); 6.00 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.30 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.46 (m, 1H, HB6a); 4.27 (m, 1H, HB3a); 3.66-3.56 (m, 10H, H7',8',10',11'およびH5'); 3.50-3.29 (m, 4H, H3',13'); 3.28 (m, 2H, H15'); 2.95 (m, 1H, HB4); 2.84および2.71 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.15 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.89 (m, 2H, H4'); 1.72-1.63 (m, 6H, H14', HB7, B9); 1.23 (m, 2H, HB8)。
アルデヒド42(593mg;1.02mmol)を、無水エタノール10mlに溶かす。ヒドラジン(400μl;8.19mmol)を加え、次いで、反応混合物を還流下に50分間加熱する。蒸発の後に得られた黄色のオイルを、エーテルと共に粉砕すると、生成物43(404mg;0.68mmol)に対応するベージュ色の粉末が収率66%で得られる。次いで、カラム(直径15mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、サンプル150mg(0.253mmol)で、MeOH-DCM20%200mlを用いて実施する。分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、生成物43 144mgが収率76%で得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 7.95 (s, H, Ar-H2); 8.16 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H4); 7.76 (s, 1H, CH); 7.96 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H6); 7.38 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H5); 6.45 (t, 1H, NH16'); 5.98 (ブロード s, 1H, NH B1); 5.72 (ブロード s, 2H, NH2); 5.18 (ブロード s, 1H, NH B3); 4.44 (m, 1H, HB6a); 4.26 (m, 1H, HB3a); 3.62-3.56 (m, 10H, H7',8',10',11'およびH5'); 3.48-3.45 (m, 4H, H3',13'); 3.27 (m, 2H, H15'); 3.07 (m, 1H, HB4); 2.84および2.68 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.11 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.86 (m, 2H, H4'); 1.72-1.59 (m, 6H, H14', HB7, B9); 1.21 (m, 2H, HB8)。
ヒドラゾン43(100mg;0.187mmol)を、DMF4mlに溶かす。次いで、MnO2(200mg;2.3mmol)を加える。室温で13分間攪拌した後に、混合物を、セライトを含有するミリポア(厚さ: 2cm)および3Å(0.5cm)の粉末分子ふるいで濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させる。得られた残留オイルを、エーテルで連続して3回洗浄する。化合物44(290mg、0.491mmol)が、オレンジ色の固体の形で収率83%で得られる。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 8.39 (t, 1H, NH2'); 7.78 (t, 1H, NH16'); 7.39-7.34 (m, Ar-H); 7.09 (d, Ar-H); 6.38 (ブロード s, 1H, NH B1); 6.32 (ブロード s, 1H, NH B3); 5.78 (s, 1H, CH-N2); 4.27 (m, 1H, HB6a); 4.11 (m, 1H, HB3a); 3.51-3.44 (m, 10H, H7',8',10',11'およびH5'); 3.37 (m, 2H, H15'); 3.32 (m, 4H, H3',13'); 3.05 (m, 1H, HB4); 2.79および2.58 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, HB6); 2.02 (t, 2H, J = 8 Hz, HB10); 1.69 (m, 2H, H4'); 1.59-1.48 (m, 6H, H14', HB7, B9); 1.25 (m, 2H, HB8)。
実施例2で既に述べたように、ビオチンは、Cy5などの他のマーカーに代えることができる。この実施例により、PDAMにより担持されているジアゾ官能基は、ポリエチレングリコール連結アームを介して、このCy5マーカーにも連結しうることが分かる。
一塩酸モノアルデヒドビス(フェニルイミン)45(13g;50.2mmol)、NaOAc(6.0g;69.7mmol)および1,2,3,3-テトラメチル[3H]インドリウムヨウ化物46(3.01g;10mmol)からなる無水酢酸(50ml)中の混合物を、100℃に正確に20分間加熱する。冷却した後に、エーテル(350ml)を加え、茶色の固体沈殿物を濾過し、エーテル(3×100ml)で洗浄する。固体をCH2Cl2150mlに再溶解させ、濾過し(無機塩の除去)、次いで、エーテル350mlで沈殿させると、茶色の固体(3.54g、54%)が得られる。
1H NMR (CDCl3): δ = 8.64 (d; 1H; J = 12 Hz; 1-H); 8.14 (t; 1H; J = 16; 12 Hz; 3-H); 7.63-7.19 (m; 9H); 6.90 (d; 1H; J = 15 Hz; 4-H); 5.82 (t; 1H; J = 12; 13 Hz; 2-H); 4.06 (s; 3H; NCH3); (2.16 (s; 3H; -COCH3); 1.74 (s; 6H; CH3)。
2,3,3-トリメチルインドール48(10.0g;62.8mmol)および6-ブロモヘキサン酸49(12.3g;62.8mmol)を、溶剤を用いずに混合し、アルゴン下に110℃に12時間加熱する。赤紫色のペースト状の反応混合物を酢酸エチル(2×60ml、ペーストをスパチュラで粉砕し、上澄みをデカンテーション除去する)で、次いでアセトン(50ml、ペーストが凝固する)で洗浄する。ピンク色の固体を濾過し、次いで、真空乾燥させる(16.0g;73%)。
ヨウ化物47(2.5g;5.3mmol)、臭化物50(1.87g;5.3mmol)およびNaOAc(1.08g;12.1mmolからなる無水酢酸(11ml)中の混合物を、120℃に25分間加熱する。冷却した後に、エーテル(200ml)を加え、沈殿物を濾過し、エーテル(3×50ml)で洗浄する。生成物50'に対応する固体を、CH2Cl2100mlに溶かし、次いで蒸発させる。次いで、酢酸15mlに溶かし、120℃で30分間攪拌する。すると、エーテル200mlを加え、焼結ガラスで濾過した後に、生成物51に対応する沈殿物が、収率84%(2.71g;4.44mmol)で得られる。
1H NMR (CDCl3): δ = 8.03 (t; 2H; J = 10; 11 Hz, 2-H, 4-H); 7.38-6.91 (m; 9H; Ar-H, 3-H); 6.41 (d; 1H; J = 14 Hz; 1-H); 6.31 (d; 1H; J = 13 Hz; 5-H); 4,07 (t; 2H, J = 7; 7 Hz; -CH2); 3.68 (s; 3H; NCH3); 2.47 (t; 2H, J = 7; 7 Hz; -CH2); 1.71 (m; 18H; CH3, ,および-CH2)。
Cy5COOH51(1.5g;2.46mmol)のCH2Cl215ml溶液に、N-メチルモルホリン(NMM、405μl;3.68mmol)を加える。溶液を、氷浴で冷却し、アルゴン下に入れ、次いで、クロロギ酸イソブチル(494μl;3.81mmol)を加える。10分間攪拌した後に、CH2Cl28ml中で希釈されたアミン26(1.86mg;4.67mmol)を加える。混合物を室温で1時間30分攪拌し続ける。CH2Cl220mlを加え、混合物をNaHCO3(1N)25mlで連続して3回洗浄する。Na2CO3上で乾燥させた後に、溶液を濾過して、ジクロロメタン相を回収し、これを蒸発させる。
アセタール52'を、DCM10mlに溶かし、次いで、2NのHCl10mlを加える。溶液を3時間30分激しく攪拌し続ける。DCM20mlを加えた後に、ジクロロメタン相を回収し、次いで、NaHCO3上で乾燥させる。蒸発の後に得られる生成物をエーテルで洗浄すると、アルデヒド53が収率90%(1.18g;1.46mmol)で得られる。
アルデヒド53(200mg;0.247mmol)を、無水エタノール1mlに溶かし、ヒドラジン一水和物(15.6μl;0.321mmol)を加える。溶液を室温で30分間攪拌する。エーテル8mlを加え;混合物をエーテルで、3回連続してデカンテーションすることにより洗浄し、ついで、真空乾燥させる。ヒドラジン54 172mg(0.209mmol;収率85%)が得られ、冷凍庫に貯蔵する。
ヒドラゾン54 20mg(0.243mmol)のDMF2ml溶液に、MnO2100mgを加え、混合物をアルゴン下に室温で5分間激しく攪拌する。懸濁液を、セライト(厚さ: 2cm)および粉末分子ふるい3Å(0.5cm)からなる層で濾過し、DMFで洗浄する。溶液を蒸発させ、次いで、残留物をエーテルで粉砕する。こうして得られた固体を乾燥させる。ジアゾ55 18mg(0.185mmol;76%)が得られる。
実施例23で既に述べたように、ビオチンを、他のマーカーに代えることができる。この実施例により、PMDAMにより担持されているジアゾ官能基を、ポリエチレングリコール連結アームを介して、このフルオレセインマーカーにも連結しうることが分かる。
イソチオシアン酸フルオレセイン(250mg、0.64mmol)を、無水DMF1.6mlにピリジン2%と共にアルゴン下に溶かす。無水DMF1.6mlに溶けている生成物69(0.356g、0.81mmol)を加える。混合物を放置して、室温で3.5時間反応させ、次いで、DMFを蒸発させ、残留物をH2O25mlに入れる。次いで、3回の抽出を、CH2Cl250mlを用いて行い、水相を蒸発させる。生成物72 255mg(48%)が得られる。
化合物72(255mg、0.31mmol)を、還流下にエタノール1.5mlに溶かす。エタノール1.5ml中のp-トルエンスルホニル-ヒドラジン(69.2mg、0.37mmol)を加え、混合物を放置して、6時間反応させる。混合物を蒸発乾燥させ、固体をCH2Cl2、H2Oおよびエーテルで洗浄する。生成物75 18.5mg(74%)が、オレンジ色の粉末の形で得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 1.6-1.8 (m, 4H); 2.13 (s, 1H); 2.28 (s, 1H); 2.36 (s, 1H); 2.80 (m, 1H); 3.07 (m, 2H); 3.46 (m, 12H); 6.5-6.7 (m, 6H); 7.1-8.3 (m, 9H)。
ヒドラゾン75(176mg、0.18mmol)を、10%KOHの無水メタノール溶液720μlに溶かす。溶液を、還流下に3時間維持する。溶液を放置して冷却させ、沈殿物を生成する。溶液を濾過し、蒸発乾燥させる。残留物をエーテルで洗浄し、乾燥させる。
マーカーR2を担持しているジアゾメチル標識試薬での直接的な標識ではなく、間接的な標識で2段階で処理することが有利である。この場合、ジアゾメチル官能基を有する標識試薬は、予め予備官能化されていると言うことができる。即ち、これは、直接的または間接的マーカーと後で反応させることができる化学的官能基を含む。反応性共有官能基を、直接的または間接的マーカーの抗反応性共有官能基と反応しうる標識試薬に導入することにより、予備官能化を行うことができる。これらの官能基は、求電子性有機化学官能基および求核性有機化学官能基またはその逆からなる。
実施例26.1: [Bio-EG3]2-PDAMなどのビス-ビオチン化マーカーの合成:
トリエステル56(12.6g;50.0mmol)を、THF100mlに溶かし、次いで、LiBH41.1g(50.5mmol)を室温で加える。アルゴン下に攪拌しながら、赤い溶液を、40〜45℃に1時間加熱する。冷却(氷)の後に、過剰の水素化物を、水(200ml)、次いで2NのHCl(30ml)を加えることにより、慎重に分解する(H2の放出)。明るい黄色への色変化が観察される。この溶液を、CH2Cl2(100ml、次いで50mlで3回)で抽出し、有機相を無水NaHCO3で洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、次いで、溶剤を蒸発させると、オイル(11.1g)が得られる。シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー(直径=40mm、溶離剤: 酢酸エチル/シクロヘキサン=1/1)を使用すると、アルコール57(6.38g、57%)が得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 8.53 (t, 1H, J = 2 Hz); 8.18 (d, 2H, J = 2 Hz); 4.76 (s, 2H); 3.91 (s, 6H); 2.30 (s, 1H)。
アルコール57(5.86g;26.1mmol)を、THF100mlに溶かし、次いで、MnO240.0gを少量ずつ、室温で5分かけて加える。溶液を、アルゴン下に一晩攪拌し続ける。溶液を、セライト545の層を備えたブフナー漏斗で濾過し、CH2Cl2で洗浄し、次いで、溶剤を蒸発させる。粗製の固体(4.4g)を、シリカカラム(直径=50mm、溶離剤: 酢酸エチル/シクロヘキサン 3/7)でのフラッシュクロマトグラフィーにより生成する。アルデヒド58 3.44g(59%)が得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 10.11 (s, 1H); 8.89 (t, 1H, J = 1 Hz); 8.69 (d, 2H, J = 1 Hz); 3.98 (s, 6H)。
アルデヒド58(3.21g;14.4mmol)を、メタノール30mlに溶かし、次いで、TMSCl6.0mlに加える。溶液を、アルゴン下に室温で1時間攪拌し続ける。溶液を、CH2Cl2200mlで希釈し、1MのNaHCO3(100ml)と共に攪拌する(CO2の放出に注意)。2相を分け、水相をCH2Cl2(25ml)で3回抽出し、有機相を合わせ、MgSO4上で乾燥させ、次いで、溶剤を蒸発させる。アセタール59 3.55g(92%)が得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 8.63 (t, 1H, J = 2 Hz); 8.29 (d, 2H, J = 2 Hz); 5.45 (s, 2H); 3.93 (s, 6H); 3.32 (s, 6H)。
ジエステル59(3.18g;11.9mmol)を、THF10mlに溶かし、次いで、KOH(2.0g、ペレット85%)のメタノール10ml溶液を加える。室温で15分の後に、溶剤を蒸発させる。残留物をH2O(50ml)に溶かす。H3PO4(約2.5ml、85%)を加えてpH3にし、白色の沈殿物を焼結ガラス(#3)で濾過し、水で洗浄し、真空乾燥させる。二酸60 2.59g(91%)が得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 8.43 (t, 1H, J = 1 Hz); 8.15 (d, 2H, J = 1 Hz); 5.53 (s, 1H); 3.27 (s, 6H)。
ジアミン61(66g;0.30モル)を、CH2Cl2250mlに溶かし、次いで、トリフルオロ酢酸エチル(11.8ml、0.10モル)を、アルゴン下に攪拌しながら、10℃で5分かけて滴加する。室温での15分の後に、溶液を分離漏斗に移し、H2O(3×100ml)で洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、溶剤を蒸発させる。約85%の純度(19F NMRにより決定)を有するモノアミド62 22.4g(71%)が得られる。この化合物を、-20℃で貯蔵し、精製することなく使用する。
1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.5-3.6 (m, 12H); 3.42 (t, 2H, J = 6 Hz); 2.75 (t, 2H, J = 6 Hz); 1.81 (四重線, 2H, J = 6 Hz); 1.67 (四重線, 2H, J = 6 Hz); 1.30 (ブロード s, 2H)。
19F NMR (190 MHz, CDCl3): δ = -76.3。
D-ビオチン(6.39g;26.2mmol)のDMF50ml懸濁液に、カルボニルジイミダゾール(CDI,6.32g、80%、31.2mmol)を加える。混合物を、アルゴン下に攪拌しながら55〜60℃に30分間加熱する。物質の完全な溶解が初めに観察され、続いて、白色の固体の沈殿を伴って、一塊に集まる(CO2放出)。アミン(オイル)を、すすぎのためのCH2Cl25mlを用いて加え、混合物を55〜60℃に3時間加熱する。真空(<1mmHg)下にDMFを蒸発させ、残留物をCH2Cl2(700ml)および2NのHCl(100ml)と共に攪拌する。セライト545の層で2相を濾過した後に、相を分離し、水相をCH2Cl2(15×100ml)で抽出し、有機相を合わせ、無水NaHCO3およびMgSO4の上で乾燥させ、次いで、溶剤を蒸発させる。油性の残留物をエーテル150mlと共に砕くと、懸濁液が得られる。ペースト状の固体は、濾過するのが難しい。上澄みをデカンテーション除去し、エーテルでの洗浄を繰り返す。真空下に乾燥させた後に、化合物63 9.13g(64%)が得られる。
1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.5-3.6 (m, 12H); 3.42 (t, 2H, J = 6 Hz); 2.75 (t, 2H, J = 6 Hz); 1.81 (四重線, 2H, J = 6 Hz); 1,67 (四重線, 2H, J = 6 Hz); 1.30 (ブロード s, 2H)。
化合物64:
化合物63の水性アンモニア溶液(100ml、22%水溶液)を、隔膜を備えた250ml丸底フラスコ中で、55〜60℃で2時間加熱する。冷却の後に、溶剤を蒸発させる。残留物をメタノール(20ml)に溶かし、Dowex 21Kアニオン-交換樹脂に通過させる[高さ12cm×直径35mm、1NのNaOH(1.5l)、次いでH2O(1.5l)、次いでメタノール(1.5l)での先行する洗浄により得られるOH-形]。トリフルオロアセテートイオンを含有しない化合物64を、第1の分画にメタノール200mlと共に通過させる。蒸発の後に、残留物をエーテル50mlと共に砕き、次いで、これをデカンテーション除去する。エーテルでの洗浄を、連続して5回繰り返す。乾燥の後に、化合物64(6.43g、86%)が得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 6.77 (t, 1H, J = 4 Hz); 6.32 (s, 1H); 5.52 (s, 1H): 4.45 (m, 1H); 4.28 (m, 1H), 3.50-3.68 (m, 12H); 3.30 (m, 2H), 3.11 (m, 1H); 2.86 (dd, 1H, J = 13および5 Hz), 2.75 (t, 2H, J = 13 Hz), 2.68 (d, 1H, J = 13 Hz); 2.16 (t, 2H, J = 7 Hz); 1.60-1.85 (m, 8H); 1.41 (m, 2H)。
二酸60(120mg;0.500mmol)のジクロロエタン(5ml)懸濁液に、カルボニルジイミダゾール(225mg、90%、1.25mmol)を加え、混合物を、アルゴン下に攪拌しながら55〜60℃に30分間加熱する。アミン64(550mg;1.23mmol)を加え、溶液を55〜60℃に6時間加熱する。蒸発の後に、残留物をシリカカラムに通過させる(直径: 25mm、溶離剤: CH2Cl2中メタノール15〜30%)。化合物65 413mg(75%)が得られる。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 8.34 (s, 1H); 8.06 (s, 2H); 7.87 (m, 2H); 6.85 (m, 2H); 6.60 (s, 2H); 5.93 (s, 2H): 5.40 (s, 1H); 4.45 (m, 2H); 4.27 (m, 2H), 3.43-3.68 (m, 24H); 3.31 (s, 6H); 3.25 (m, 4H), 3.08 (m, 2H); 2.83 (dd, 2H, J = 13および5 Hz), 2.70 (t, 2H, J = 13 Hz); 2.13 (t, 4H, J = 7 Hz); 1.89 (五重線, 4H, J = 7 Hz); 1.55-1.70 (m, 12H); 1,37 (m, 4H)。
メタノールに溶かしたアセタール65(413mg;0.376mmol)を、2NのHCl(0.5ml)で処理する。蒸発させ、エーテルで洗浄した後に、アルデヒド66(0.37g、90%)が得られる。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 10.11 (s, 1H); 8.82 (t, 2H, J = 6 Hz); 8.62 (s, 1H); 8.47 (s, 2H); 7.73 (t, 2H, J = 5 Hz); 4.30 (m, 2H); 4.11 (m, 2H), 3.30-3.60 (m, 24H); 3.06 (m, 6H); 2.80 (dd, 2H, J = 12および5 Hz), 2.56 (t, 2H, J = 12 Hz); 2.03 (t, 4H, J = 7 Hz); 1.78 (五重線, 4H, J = 7 Hz); 1.35-1.60 (m, 12H); 1.28 (m, 4H)。
アルデヒド66を、ジアゾメタン(実施例1)を調製するために使用された方法に従い、ジアゾメタン67に変える。
3,6,9-トリオキサ-1,11-ウンデカンジオ酸(undecanedioic acid)(EG3、12.64ml、74mmol)を、無水DMF80mlにアルゴン下に溶かし、氷浴上で冷却させた。次いで、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、11.45g、55.5mmol)を無水DMF20mlに溶かし、徐々に加える。30分後に、3-アミノアセトフェノン(5.0g、37mmol)を加え、反応を放置して、アルゴン下に室温で1時間進行させる。次いで、DMFを真空下に蒸発させ、CH2Cl270mlを加える。溶液を濾過し、1%酢酸3×25mlで抽出する。水相を合わせ、CH2Cl225mlで洗浄する。有機相を混合し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾燥させる。生成物を、MeOH: H2O対から再結晶させる。こうして、生成物76 8.74g(70%)が得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 2.55 (s, 3H); 3.5-3.7 (m, 8H); 4.0 (s, 2H); 4.1 (s, 2H); 7.45 (t, 1H); 7.65 (d, 1H); 7.90 (d, 2H); 8.2 (s, 1H); 9.8 (s, 1H)。
生成物76(120mg、0.35mmol)を、アルゴン下に無水DMF15mlに溶かし、氷上で冷却し、ついで、DCC(110mg、0.53mmol)を加える。30分後に、この溶液を、市販のデンドリマー"Starburst PAMAM Dendrimer,Generation 1"(Aldrich,St Quentin Fallavier)の溶液(1g、0.71mmol、メタノール中5ml)の上に、激しく攪拌しながら徐々に加える。反応を放置して、室温で1時間進行させ、混合物を蒸発させる。残留物をCH2Cl210mlに入れ、1%酢酸30mlで2回抽出する。
D-ビオチン(1.73g、7.08mmol)を、アルゴン下に無水DMF80mlに溶かし、溶液を氷の上で冷却する。N-メチルモルホリン(NMM、856μl、7.7mmol)およびクロロギ酸イソブチル(1022μl、7.7mmol)を連続して加える。30分後、生成物77(1.13g、0.7mmol、メタノール5ml中)を加え、反応を放置して、氷の上、アルゴン下に、3時間進行させる。混合物を真空下に濃縮して50mlにし、CH2Cl2100mlを加える。沈殿物が生じ、これを濾過し、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥させる。78 1.3gが、白色の粉末の形で得られる。
化合物78(300mg、0.09mmol)を、無水エタノール10mlに還流下に溶かす。ヒドラジン一水和物(20ml、0.40mmol)を加え、反応を放置して、還流下に3時間進行させる。冷却の後に、沈殿物が生じ、これを濾過し、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥させる。こうして、生成物79 109mg(36%)が白色の粉末の形で得られる。
ヒドラゾン79(100mg、0.03mmol)を、無水DMF5mlに70℃で溶かす。混合物を放置して、室温に戻し、MnO2(31mg、0.36mmol)を加える。反応を放置して10分間進行させ、セライト(0.5cm)および粉末分子ふるい(0.5cm)を備えた焼結ガラスで濾過することにより、酸化マンガンを除去する。濾液を蒸発乾燥させ、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥させる。こうして、生成物80 78mg(78%)が得られる。
実施例5に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。2つの標識反応を実施した。
PCR10μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)10μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水77μlを加える。溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。次いで、0.1MのHCl3μlを加え、溶液を95℃で10分間インキュベーションする。
PCR10μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)10μl、0.1MのHCl5μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水75μlを加える。溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。
実施例5に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。3つの標識反応を実施した。
PCR50μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)75μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水102.5μlを加える。溶液を、95℃で25分間インキュベーションする。次いで、0.1MのHCl22.5μlを加え、溶液を95℃で5分間インキュベーションする。
PCR50μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)75μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水52.5μlを加える。溶液を、95℃で25分間インキュベーションする。次いで、0.1MのHCl22.5μlを加え、溶液を95℃で5分間インキュベーションする。
PCR50μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)75μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水2.5μlを加える。溶液を、95℃で25分間インキュベーションする。
実施例5に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。2つの標識反応を実施した。
PCR10μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)10μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水80μlを加える。溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。次いで、精製を、実施例9に記載のプロトコルに従い実施する。精製された標識増幅産物の溶液に、0.1MのHCl6μlを加える。溶液を95℃で10分間インキュベーションする。予め95℃に10分間予備加熱されたハイブリダイゼーション緩衝液400μlを加える。
PCR10μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)10μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水77μlを加える。溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。
2,4-ジニトロベンズアルデヒド5g(25.5mmol)を、トルエン250mlに溶かし、エチレングリコール20mlおよびパラ-トルエンスルホン酸150mgを加える。混合物を、還流下に加熱し、水を、ディーンスターク系で6時間回収する。混合物をEtOAc150mlおよびH2O100mlで処理する。溶液を、酢酸エチルで2回抽出し、有機相をMgSO4上で乾燥させ、ついで、蒸発させる。生成物100に対応する得られたオイルを、次の反応に使用する。
1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 8.70 (d, 1Haro, J = 2 Hz, H3); 8.44 (dd, 1Haro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H5); 8.02 (d, 1Haro, J = 8 Hz, H6); 6.49 (s, 1H, CH); 4.12-4.06 (m, 4H, CH2-CH2)。
保護された2,4-ジニトロベンズアルデヒド(6.4g;25.5mmol)を、エタノール-水(6/1)混合物に溶かし、次いで、Na2S九水和物2当量(12.3g;51.1mmol)を加える。次いで、反応混合物を30分間加熱する。蒸発、次いでジクロロメタンを使用する抽出を実施する。乾燥させ、濾過した後に、反応媒体を蒸発させると、オイルが得られ、これを、シリカカラム(シクロヘキサン/酢酸エチル 60/40)で直接精製する。化合物101が、収率45%で単離される。
化合物101: 融点58-60℃。- 1H NMR (200 MHz, CDCl3): 7.49 (d, 1Haro, J = 2 Hz, H3); 7.09 (d, 1Haro, J = 2 Hz, H6); 6.80 (dd, 1Haro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H5); 6.27 (s, 1H, CH); 3.99-3.97 (m, 4H, CH2-CH2)。
D-ビオチン(1.0g;4.1mmol)を、無水DMF20mlおよびN-メチルモルホリン600μlに可溶化させる。クロロギ酸イソブチル(700μl;5.5mmol)をアルゴン下に加え、その間、氷浴上で冷却する。混合物を5分間攪拌し続け、次いで、化合物101 1g(4.75mmol)およびN-メチルモルホリン500μlを加える。溶液を、室温で4時間攪拌し続け、次いで、蒸発乾燥させる。得られたオイルを、溶離剤としてMeOH-DCM7%、次いで10%を用いるシリカカラムに直接通過させる。生成物102(1.1g;2.52mmol)が、収率62%で得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 10.40 (s, 1H, NH-CO); 8.31 (d, 1Haro, J = 2 Hz, H3); 7.77 (dd, 1Haro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H5); 7.68 (d, 1Haro, J = 2 Hz, H6); 6.43 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.36 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.23 (s, 1H, CH); 4.28 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.92 (s, 4H, CH2-CH2); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.85および2.76 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1.61-1.39 (m, 6H, (CH2)3)。
生成物102(768mg;1.76mmol)を、THF25mlに懸濁させる。2NのH2SO44mlを加えた後に、全体を溶かす。混合物を2時間攪拌し続ける。これを蒸発させ、次いで、焼結ガラスの上で水を用いてすすぎ、洗浄する。化合物103(694mg)が、黄色の粉末の形で、収率90%で得られる。
融点165℃。- 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 10.69 (s, 1H, NH-CO); 10.09 (s, H, CHO); 8.43 (d, 1Haro, J = 2 Hz, H3); 7.91 (s, 2Haro, H5およびH6); 6.42 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); δ = 6.23 (s, 1H, CH); 4.29 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.84および2.78 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1.61-1.39 (m, 6H, (CH2)3)。
アルデヒド103を、エタノールに懸濁させ、この懸濁液を、80℃に加熱する。ヒドラジンを加えると、全体が溶け、この溶液は直ちにオレンジ色を呈する。5分後に沈殿物が生じる。混合物を、攪拌しながら1時間加熱する。これを、焼結ガラスで濾過し、次いで、沈殿物を乾燥させる。生成物104(700mg;690mmol)が、収率98%で得られる。
融点169℃。- 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 10.31 (s, 1H, NH-CO); 8.31 (d, 1Haro, J = 2 Hz, H3); 7.96 (s, H, CHO); 7.87 (d, 1Haro, J = 2 Hz, H6); 7.68 (dd, 1Haro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H5); 7.31 (s, 2H, NH2); 6.42 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.34 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.29 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.84および2.78 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1.61-1.39 (m, 6H, (CH2)3)。
化合物104(200mg;0.492mmol)を、DMF8mlに溶かす。MnO2400mgを加える。混合物を激しく10分間攪拌する。セライト(厚さ: 2cm)および粉末分子ふるい3Å(0.5cm)を含有するミリポアで濾過する。これを蒸発乾燥させ、次いでエーテルで洗浄する。混合物を再びミリポアで濾過する。化合物105(180mg;0.445mmol)が、オレンジ色の粉末の形で、収率98%で得られる。
融点155℃。- 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ = 10.21 (s, 1H, NH-CO); 8.60 (d, 1Haro, J = 2 Hz, H3); 7.77 (d, 1Haro, J = 6 Hz, H5); 7.22 (d, 1Haro, J = 6 Hz, H6); 6.60 (s, H, CH-N); 6.41 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.33 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.29 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4.13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.84および2.78 (ABX系, 2H, 2JAB = 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2.29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1.61-1.39 (m, 6H, (CH2)3)。
実施例30に記載の反応スキームに従い、2-ニトロ-パラ-BioPDAM誘導体を得た。実施例5に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。2つの標識反応を実施した。
PCR10μlに、2-ニトロ-パラ-BioPDAM2μl(DMSO中100mM)、0.1MのHCl5μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水83μlを加える。この溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。
PCR10μlに、メタ-bioPMDAM2μl(DMSO中100mM)、0.1MのHCl5μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水83μlを加える。この溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。
この目的は、芳香族構造のジアゾメチル(DAM)官能基を隔離して、ホスフェートをアルキル化する間、さらに標識された核酸とその相補的な配列とのハイブリダイゼーションの間の立体障害の作用を低減することである。
ジアゾメチル基を有する樹脂の反応性を、核酸を結合するその能力を決定するために研究した。
樹脂10mgを、実施例5に記載のように、PCR50μlと共に、パラ-Bio-EG3-PDAM5μlを添加した精製水(Sigma)400μl中、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、この樹脂をPBSツイーン緩衝液500μl(キットの色0 HLA試薬、PBS pH7.0;1%ツイーン、BND0.2g/l;シプロフラキサシン(Ciproflaxacin)0.01g/l)で洗浄する。次いで樹脂を、PBSツイーン100μlおよび1/10000希釈されたストレプトアビジンHRP(S-911、MOLECULAR PROBES,EUGENE,OR,USA)を添加したストレプトアビジンハイブリダイゼーション緩衝液250μl(PBS pH7.0 0.5%ツイーン)に再懸濁させる。反応混合物を室温で30分間インキュベーションする。次いで樹脂を、PBSツイーン緩衝液500μlで3回洗浄し、これを、発色試薬(1色1錠、オルト-フェニレンジアミン塩酸塩、色2緩衝液5mlで希釈、100mMのリン酸ナトリウム、50mMのクエン酸、0.03%H2O2)の存在下に、室温でインキュベーションする。暗所で20分間インキュベーションした後に、反応をH2SO4(1.8Nの色3試薬)50μlでブロックする。次いで、上澄みをピペットし、マイクロプレートに置いて、492nmでの反応媒体の吸収を読み取る。
樹脂10mgを、パラ-Bio-EG3-PDAM5μlを添加した精製水(Sigma)425μl中、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、この樹脂をPBS緩衝液500μlで洗浄する。次いでサンプルを、実施例33.1に記載の手順と同様に処理する。
前記のゲノムDNAの容量の代わりに精製水25μl容量を用いて行われるPCR50μlと共に、樹脂10mgを、パラ-Bio-EG3-PDAM5μlを添加した精製水400μl中、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、この樹脂をPBS緩衝液500μlで洗浄する。次いでサンプルを、実施例33.1に記載の手順と同様に処理する。
樹脂10mgを、PCR50μlと共に精製水400μl中、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、この樹脂をPBS緩衝液500μlで洗浄する。次いで、サンプルを実施例33.1に記載の手順と同様に処理する。
樹脂10mgを、パラ-Bio-EG3-PDAM5μlを添加した精製水400μlと共に、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、この樹脂を、PBSツイーン緩衝液500μlで洗浄する(キットの色0 HLA試薬、PBS pH7.0;ツイーン1%、BND0.2g/l;シプロフラキサシン0.01g/l)。次いで、この樹脂を、PBSツイーン100μlおよび1/10000希釈されたストレプトアビジンHRPを添加したストレプトアビジンハイブリダイゼーション緩衝液250μlに再懸濁させる。この試料に、次のように調製されたDNA試料50μlを加える:
パラ-Bio-EG3-PDAM5μlおよび精製水70μlを、実施例5の記載のように調製されたPCRから得られたDNA25μlに加える。この混合物を、60℃で30分間インキュベーションし、次いで、過剰のマーカーを、メーカーが推奨するプロトコルに従いQIAquickカラム(Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Germany)で試料を精製することにより除去し、容量50μlで最終溶離を実施する。
ジアゾメチル官能基を有する1タイプのみの分子でDNA分子を標識して、マイクロプレートの上で、単一ステップでこの核酸を捕捉し、検出することができることを、この実施例では示す。
実施例5に記載されているようなPCR増幅により得られたDNA10μlを、パラ-Bio-EG3-PDAM10μlを添加した精製水(Sigma)80μl中、60℃で30分間インキュベーションすることにより標識する。標識の後に、DNAを、メーカーが推奨するプロトコルに従いQIAquickカラム(Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Germany)で精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μl(10mMのトリスEDTA、pH8.5)に集める。この溶離液20μlを、1/10000希釈されたストレプトアビジンHRP(S-911、MOLECULAR PROBES,EUGENE,OR,USA)を添加したPEG緩衝液180μl(0.1MのNaPO3;0.5MのNaCl;0.65%ツイーン20;サケ精液DNA(Gibco)0.14mg/ml;2%PEG4000)で希釈する。次いで、この試料100μlを、ストレプトアビジン被覆Combiplate8(参照95029263、Labsystem,Helsinki,Finland)のウェル中で、またはMaxisorb strip(Nunc,Denmark)からの対照ウェル中で、37℃で1時間インキュベーションする。
対照を、次の方法で同時に調製する:
A- DNAを伴わない標識対照:
パラ-Bio-EG3-PDAM10μlを添加した精製水90μlを、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、反応混合物を、実施例34.1で前記した手順と同様に処理する。
実施例5の記載と同様にPCR増幅により得られたDNA10μlを、精製水90μl中、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、反応混合物を、実施例34.1で前記した手順と同様に処理する。
1ステップで、ジアゾメチル官能基を有する2種の分子でDNA分子を標識し、これをマイクロプレート上で捕捉および検出することができることを、この実施例では示す。
1-ピレニルジアゾメタン(PDAM)および
パラ-Bio-EG3-PDAM
は、PCRにより生じた核酸と同時に反応する。
重炭酸緩衝液100μl(0.05M pH9.6)中で希釈されたpf抗ピレン抗体1.1μlの溶液100μlを、室温で一晩インキュベーションすることにより、抗ピレン抗体を、8ウェルMaxisorpストリップの上に吸着させた。ウサギ抗ピレンと称されるこのような抗体(参照: YSRT-AHP236)は、Accurate Chemical & Scientific (Westbury, New York, United States of America)から入手することができる。勿論、これを、他の市販の抗体を用いて実施することもできるであろうし、この実施例で得られる結果と比較して異なる結果も生じないであろう。
次の方法で、対照を同時に調製した:
A- パラ-Bio-EG3-PDAMのみで標識するための対照:
実施例5の記載のようにPCR増幅により得られたDNA10μlを、パラ-Bio-EG3-PDAM10μlを添加した精製水90μl中、60℃で30分間インキュベーションすることにより標識する。標識の後に、DNAを、QIAquickキットを使用して精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μlに集めた。この溶離液20μlを、1/10000希釈されたストレプトアビジンHRPを添加したPEG緩衝液180μlで希釈する。次いで、この試料100μlを、吸着Maxisorpストリップウェル中で、または非吸着対照ウェル中で、37℃で1時間インキュベーションする。
実施例5の記載のようにPCR増幅により得られたDNA10μlを、PDAM2μlおよびDMSO38μlを添加した精製水90μl中、60℃で30分間インキュベーションすることにより標識する。標識の後に、DNAを、QIAquickキットを使用して精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μlに集めた。この溶離液20μlを、1/10000希釈されたストレプトアビジンHRPを添加したPEG緩衝液180μlで希釈する。次いで、この試料100μlを、吸着Maxisorpストリップウェル中で、または非吸着対照ウェル中で、37℃で1時間インキュベーションする。
実施例5の記載のようにPCR増幅により得られたDNA10μlを、精製水100μl中、60℃で30分間インキュベーションする。標識の後に、DNAを、QIAquickキットを使用して精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μlに集めた。この溶離液20μlを、1/10000希釈されたストレプトアビジンHRPを添加したPEG緩衝液180μlで希釈する。次いで、この試料100μlを、吸着Maxisorpストリップウェル中で、または非吸着対照ウェル中で、37℃で1時間インキュベーションする。
この実験により、DNAを特異的に検出することができ、DNAのホスフェート基に対するジアゾメチル官能基の反応性を用いて、前記のDNAは固体表面の上で捕捉されることを証明することができる。
PCR増幅により得られたDNA10μlの標識を、パラ-Bio-EG3-PDAM20μlと共に60℃で30分間インキュベーションすることにより重複して実施する。標識の後に、DNAを、メーカーが推奨するプロトコルに従いQIAquickカラム(Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Germany)で精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μl(10mMのトリス-HCl、pH8.5)に集める。これらの溶離液からなる混合物85μlを、試薬R4(2NのNaOH)8.5μlを用いて室温で5分間変性し、次いで、溶液を、試薬R5(2Nの酢酸)8.5μlで中和する。ハイブリダイゼーション緩衝液850μl(R6-10mMのトリス-HCl、pH7.0、BND0.2g/l、シプロフラキサシン0.01g/l)および検出オリゴヌクレオチド85μl(R7-4mMのリン酸ナトリウム、1mMのリン酸カリウム、pH7.0、ウシ血清アルブミン0.1%、フェノール0.5%)を混合物に加える。この試薬100μlを、キットに備えられたストリップR1の陽性対照(増幅遺伝子のコンセンサス配列による捕捉)の上に、またはストレプトアビジン被覆Combiplate8プレートの上に(参照95029263、Labsystem,Helsinki,Finland)の上に、または対照Maxisorpプレート(Nunc,Denmark)の上に堆積させる。
対照を、次の方法で同時に調製した:
A- HLA-DRキットとの比較:
実施例5の記載のようにPCR増幅により得られたDNA10μlを、パラ-Bio-EG3-PDAM20μlと共に、60℃で30分間インキュベーションする。標識の後に、DNAを、QIAquickカラムで精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μlの容量で集める。この溶離液45μlを、試薬R4 4.5μlを用いて室温で5分間変性し、溶液を、試薬R5 4.5μlで中和する。ハイブリダイゼーション緩衝液R6 450μlおよび検出オリゴヌクレオチド45μlを混合物に加える。この試料100μlを、キット(増幅遺伝子のコンセンサス配列とハイブリダイゼーション)に備えられたストリップR1の陽性対照の上に、またはストレプトアビジンCombiplate8プレートの上に、または対照Maxisorpプレートの上に堆積させる。
実施例5の記載のようにPCR増幅により得られたDNA10μlを、パラ-Bio-EG3-PDAM20μlと共に、60℃で30分間インキュベーションする。次いでサンプルを、実施例Aで前記した手順と同様に処理する。
試薬R6(ハイブリダイゼーション緩衝液)10μlおよび試薬R7(検出オリゴヌクレオチド)100μlを、キットに備えられたストリップR1の陽性対照の上に、またはストレプトアビジンプレートの上に、またはMaxisorpタイプの対照プレートの上に堆積させる。
この実施例により、核酸のホスフェートに対するジアゾメチル官能基の反応性に基づく、捕捉を使用して細菌DNAを捕捉および増幅することができることが分かる。
Dynalビーズ90μlを、Free精製水(Sigma)200μlで2回洗浄し、PEG緩衝液200μl(0.1MのNaPO4、pH7;0.5MのNaCl;0.65%ツイーン20;ニシン精液DNA(参照15634-017, GibcoBRL)0.14ml;2%PEG4000)に入れ、37℃で30分間インキュベーションする。次いでこれを、ツイーン20 0.5%を含有する1×PBS緩衝液200μlで2回洗浄し、最後に、同じ緩衝液90μlに入れる。
次いで、メーカーにより記載されたプロトコルに従い、Picogreen(P-7589;Molecular Probes,Eugene,OR,USA)により、PCR産物を定量する。この方法は、DNA分子の内部に位置する時だけ(塩基の間にインターカレーションされることにより)、蛍光になるという特徴を有する分子(Picogreen)を使用することに基づく。このインターカレーションの非常に特異的な特性により、さらに、生じる蛍光シグナルが、媒体中に存在するDNAの量と正比例するので、サンプル中に存在する核酸の濃度を非常に正確にアッセイすることができる。次いで、シグナルをrfuで表現する(相対蛍光単位)。
この実施例から、ホスフェート基へのジアゾメチル官能基の反応性により、捕捉されたDNAを複数回、別のターゲットで増幅することができることが分かる。
Dynalビーズ90μlを、Free精製水(Sigma)200μlで2回洗浄し、PEG緩衝液200μl(0.1MのNaPO4、pH7;0.5MのNaCl;0.65%ツイーン20;サケ精液DNA(GibcoBRL)0.14ml;PEG4000 2%)に入れ、37℃で30分間インキュベーションする。次いでこれを、ツイーン20 0.5%を含有する1×PBS緩衝液200μlで2回洗浄し、最後に、同じ緩衝液90μlに入れる。
次いで、実施例8に記載のプロトコルに従い、得られたPCR産物を、DNAチップを使用して分析する。
PCRにより増幅する目的で、ジアゾメチル基を担持するように活性化されたナイロン膜を使用して、細菌DNAを捕捉する。
3'-アミノアセトフェノン(14.5g、107mmol)を、無水DMF50mlに溶かす。無水コハク酸(10.7g、107mmol)を加え、混合物をアルゴン下、室温で攪拌し続ける。6時間後、溶液を真空濃縮し、メタノール50mlを加える。得られた沈殿物を濾過し、メタノールおよびエーテルで洗浄する。こうして、生成物68 19.4g(81%)が、オフホワイト色の粉末の形で得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 2.5-2.6 (m, 7H); 7.45 (t, 1H); 7.64 (d, 1H); 7.83 (d, 1H); 8.19 (s, 1H); 10.16 (s, 1H); 12.12 (s, 1H)。
化合物68 5.07g(22mmol)を、アルゴン下に無水DMF10mlに溶かす。溶液を、氷の上に置き、カルボニルジイミダゾール5.00g(32mmol)を加える。20分後に、4,7,10-トリオキサトリデカンジアミン(EG3)20ml(94.6mmol)を徐々に加える。室温で3時間反応させた後に、DMFを蒸発させ、残留物をCH2Cl2100ml中に入れる。飽和NaHCO3およびH2Oを使用して、抽出を実施し、その後、有機相を無水Na2SO4を用いて乾燥させ、溶剤を蒸発させる。こうして、生成物69 4.34g(46%)が得られる。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 1.59 (m, 2H); 1.87 (m, 2H); 2.16 (s, 3H); 2.40 (m, 2H); 2.55 (m, 2H); 3.08 (m, 2H); 3.45 (m, 16H); 7.30 (t, 1H); 7.42 (d, 1H); 7.70 (d, 1H); 7.83 (t, 1H); 7.97 (s, 1H); 10.00 (s, 1H)。
4cm2長方形を、Biodyne Cフィルター(参照 60314; Pall Gelman Laboratory; Ann Arbor; Michigan; USA)から切り出し、ボトルに装入し、氷の上、アルゴン下で、激しく攪拌しながら、無水DMF3ml中のカルボニルジイミダゾール(CDI)0.97g(6mmol)と接触させる。20分間攪拌した後に、溶液を除去し、フィルターをDMFで洗浄する。次いで、無水DMF3ml中の生成物68 0.53g(1mmol)量を加え、室温で一晩反応させる。次いで、溶液を除去し、エタノールでフィルターをすすぎ、真空下に乾燥させ、アルゴン下に保持する。
修飾されたフィルター91を、ヒドラジン水和物(2mmol)97mlの無水エタノール4ml溶液に入れる。溶液を5時間再還流させる。放置して冷却した後に、H2O、エタノールおよびエーテルでフィルターを洗浄し、真空下に乾燥させ、アルゴン下に置く。次いで、無水DMF4mlおよびMnO286mg(1mmol)を加え、激しく攪拌しながら、混合物を反応させる。20分後に、溶液を捨てて、DMFおよびエーテルでフィルターをすすぐ。ジアゾメチル修飾されたフィルター92をアルゴン下に、温度-19から-31℃で貯蔵する。
活性化された膜を、2mm2の小さい断片に切り、これを、実施例37においてと同様の技術および同じ最終濃度を使用して、機械的溶解により調製された結核菌細菌溶解産物25μlおよび精製水(Sigma)375μl中、室温で30分間インキュベーションする。
非修飾Biodyne C膜(膜A)、
記載の手順に従い化学的に修飾されているが、無水DMFおよびMnO2では処理されていないBiodyne膜;この対照により、ジアゾメチル基の不在下での膜の特性を確認することができる(膜B)および
修飾されていないが、激しく攪拌しながら、無水DMFおよびMnO2で20分間処理されているBiodyne C膜;この対照により、後者の膜が、膜に対するDNAの吸着を修飾しないことを確認することができる(膜C)。
Claims (29)
- 一本鎖または二本鎖デオキシリボ核酸(DNA)を標識化および断片化する方法において、次のステップ:
酸性水性媒体の作用により前記のDNA上に少なくとも1つの非塩基性部位を生成することにより、DNAを断片化するステップと、
標識試薬を用いて、断片の少なくとも1個にマーカーを結合し、その際、前記試薬は共有結合により主に、前記断片の少なくとも1個のホスフェートに連結するステップとを含み、
前記酸性水性媒体がギ酸ナトリウム緩衝液である、方法。 - 断片化および標識を2つのステップで実施する、請求項1に記載の方法。
- 断片化および標識を1つのステップで実施する、請求項1に記載の方法。
- 酸性媒体のpHが5未満である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 酸性媒体のpHが4未満である、請求項4に記載の方法。
- 酸性水性媒体が約3のpHのギ酸ナトリウム緩衝液である、請求項5に記載の方法。
- DNAが、非塩基性部位を生じうる少なくとも1つの修飾された塩基を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 非塩基性部位を生じうる修飾された塩基を、8-ブロモプリン誘導体から選択する、請求項7に記載の方法。
- 標識試薬が、反応性官能基として、次の化合物:
ジアゾメチル;アルキルハロゲン化物;ニトロソウレア;スピロシクロプロパン;アジリジン;エポキシド;トリフルオロメタンスルホネート
から選択されるモチーフを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の標識化および断片化方法。 - 前記の標識試薬が5-(ブロモメチル)フルオレセインである、請求項9に記載の方法。
- R2が蛍光化合物またはハプテンである、請求項13および14のいずれかに記載の方法。
- 前記の標識試薬が水混和性溶剤に可溶性である、請求項9から15のいずれか一項に記載の方法。
- 一本鎖または二本鎖ターゲットデオキシリボ核酸(DNA)を検出する方法において、次のステップ:
請求項1から16に記載の方法のいずれかに従い、前記のDNAを断片化および標識するステップと、
ターゲット核酸に対して十分に特異的な少なくとも1個の核酸プローブに、標識された断片をハイブリダイゼーションするステップと、
マーカーを使用して、生じたハイブリッドを検出するステップ
を含む方法。 - 加えて、断片化および標識の後に変性ステップを含む、請求項17に記載の二本鎖ターゲットデオキシリボ核酸(DNA)を検出する方法。
- 断片化、標識および変性を、単一のステップで実施する、請求項18に記載の方法。
- ターゲット核酸を検出する方法において、次のステップ:
多数の二本鎖DNA増幅産物を生成するために、ターゲット核酸を酵素的に増幅するステップと、
請求項1から16に記載の方法のいずれかに従い、前記のDNA増幅産物を断片化および標識するステップと、
ターゲット核酸に対して十分に特異的な少なくとも1個の核酸プローブに、標識された断片をハイブリダイゼーションするステップと、
マーカーを使用して、生じたハイブリッドを検出するステップ
を含む方法。 - 断片化および標識の後に更に変性ステップを含む、請求項20に記載の方法。
- 断片化、標識および変性を単一のステップで実施する、請求項21に記載の方法。
- ターゲット核酸に分布している多型性を、前記ターゲット核酸の配列中の複数の欠失および/または挿入および/または突然変異の存在により検出する方法において、次のステップ:
調査対象の多型性全体を含むターゲットDNAを得るステップであって、前記のDNAを場合によって、酵素増幅技術により生成するステップと、
請求項1から16のいずれか一項に記載の方法により、前記DNAを断片化および標識するステップと、
複数の核酸プローブに、前記断片をハイブリダイゼーションするステップであって、複数の核酸プローブが、固体支持体に結合し、複数の核酸プローブがその全体で、少なくとも調査対象の多型性を対象とするステップと、
マーカーを使用して、標識された断片と少なくとも一部の核酸プローブとの間に生じたハイブリッドを検出し、それからターゲットDNAの多型性を推測するステップ
を含む方法。 - 断片化および標識ステップの後に更に変性ステップを含む、請求項23に記載の方法。
- 断片化、標識および変性を単一のステップで実施する、請求項24に記載の方法。
- 固体支持体が、異なる配列からなる少なくとも10個の核酸プローブを含む、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
- 固体支持体が、異なる配列からなる少なくとも400個の核酸プローブを含む、請求項26に記載の方法。
- 固体支持体が、異なる配列からなる少なくとも1000個の核酸プローブを含む、請求項27に記載の方法。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載の方法によって標識された核酸断片を得た後に、ターゲット核酸を検出するためのプローブとして、当該核酸断片を使用する方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0106039A FR2824335A1 (fr) | 2001-05-04 | 2001-05-04 | Procede de marquage et de fragmentation d'adn |
PCT/FR2002/001542 WO2002090584A2 (fr) | 2001-05-04 | 2002-05-03 | Procédé de marquage et de fragmentation d'adn |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010007289A Division JP2010075211A (ja) | 2001-05-04 | 2010-01-15 | Dnaを標識化および断片化する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004527258A JP2004527258A (ja) | 2004-09-09 |
JP4554159B2 true JP4554159B2 (ja) | 2010-09-29 |
Family
ID=8863020
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002587643A Expired - Fee Related JP4554159B2 (ja) | 2001-05-04 | 2002-05-03 | Dnaを標識化および断片化する方法 |
JP2010007289A Ceased JP2010075211A (ja) | 2001-05-04 | 2010-01-15 | Dnaを標識化および断片化する方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010007289A Ceased JP2010075211A (ja) | 2001-05-04 | 2010-01-15 | Dnaを標識化および断片化する方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1383925B1 (ja) |
JP (2) | JP4554159B2 (ja) |
CN (1) | CN1325659C (ja) |
AT (1) | ATE340269T1 (ja) |
AU (1) | AU2002313026B2 (ja) |
CA (1) | CA2444926C (ja) |
DE (1) | DE60214840T2 (ja) |
ES (1) | ES2272723T3 (ja) |
FR (1) | FR2824335A1 (ja) |
HK (1) | HK1062033A1 (ja) |
WO (1) | WO2002090584A2 (ja) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003279697A1 (en) * | 2002-05-17 | 2004-02-16 | Nugen Technologies, Inc. | Methods for fragmentation, labeling and immobilizaton of nucleic acids |
PT1694859E (pt) * | 2003-10-29 | 2015-04-13 | Bioarray Solutions Ltd | Análise de ácidos nucleicos multiplexada através de fragmentação de adn de cadeia dupla |
EP1711591A4 (en) * | 2003-12-29 | 2010-04-28 | Nugen Technologies Inc | METHODS FOR ANALYZING THE STATE OF METHYLATION OF NUCLEIC ACIDS AND METHODS FOR FRAGMENTING, MARKING AND IMMOBILIZING NUCLEIC ACIDS |
EP1564306B1 (en) * | 2004-02-17 | 2013-08-07 | Affymetrix, Inc. | Methods for fragmenting and labeling DNA |
FR2868071B1 (fr) | 2004-03-26 | 2006-06-09 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
FR2873388B1 (fr) * | 2004-07-23 | 2012-04-06 | Biomerieux Sa | Procede de marquage et de purification d'acides nucleiques d'interet presents dans un echantillon biologique a traiter dans un unique recipient reactionnel |
FR2881437B1 (fr) | 2005-01-31 | 2010-11-19 | Biomerieux Sa | Procede pour le diagnostic/pronostic d'un syndrome septique |
FR2881363B1 (fr) | 2005-02-02 | 2008-03-14 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif d'analyses biologiques avec detecteur integre |
FR2917090B1 (fr) * | 2007-06-11 | 2012-06-15 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage portant des fonctions diazo et nitro, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
FR2934595B1 (fr) * | 2008-07-29 | 2013-04-05 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage ayant un noyau pyridine portant une fonction diazomethyle, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
US9422598B2 (en) | 2010-06-04 | 2016-08-23 | Biomerieux | Method and kit for the prognosis of colorectal cancer |
US9110079B2 (en) | 2010-09-29 | 2015-08-18 | Biomerieux | Method and kit for establishing an in vitro prognosis on a patient exhibiting SIRS |
WO2012129758A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Biomerieux | Method and kit for determining in vitro probability for individual to suffer from colorectal cancer |
CA2852949A1 (en) | 2011-10-19 | 2013-04-25 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing |
GB2513793B (en) | 2012-01-26 | 2016-11-02 | Nugen Tech Inc | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation |
EP2861787B1 (en) | 2012-06-18 | 2017-09-20 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences |
US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
US9822408B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-21 | Nugen Technologies, Inc. | Sequential sequencing |
CN105849264B (zh) | 2013-11-13 | 2019-09-27 | 纽亘技术公司 | 用于鉴别重复测序读数的组合物和方法 |
WO2015131107A1 (en) | 2014-02-28 | 2015-09-03 | Nugen Technologies, Inc. | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors |
JP6803327B2 (ja) | 2014-08-06 | 2020-12-23 | ニューゲン テクノロジーズ, インコーポレイテッド | 標的化されたシークエンシングからのデジタル測定値 |
CN104862302B (zh) * | 2015-05-05 | 2020-12-15 | 华南师范大学 | 一种dna片段化的方法及实现该方法的装置 |
US11099202B2 (en) | 2017-10-20 | 2021-08-24 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent delivery system |
CN113636931B (zh) * | 2021-08-05 | 2024-02-13 | 康龙化成(宁波)科技发展有限公司 | 基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上的应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990008838A1 (en) * | 1989-01-10 | 1990-08-09 | Research Corporation Technologies, Inc. | Labeling of nucleic acids with fluorescent markers |
JPH10179179A (ja) * | 1996-11-08 | 1998-07-07 | Kyowa Medex Co Ltd | 特定遺伝子配列の定量方法及び定量試薬 |
FR2780059B1 (fr) * | 1998-06-17 | 2002-10-11 | Bio Merieux | Procede de marquage d'un acide ribonucleique et fragments d'arn marques ainsi obtenus |
FR2824323B1 (fr) * | 2001-05-04 | 2008-04-25 | Bio Merieux | Reactif de marquage et procede de detection de molecules biologiques |
-
2001
- 2001-05-04 FR FR0106039A patent/FR2824335A1/fr active Pending
-
2002
- 2002-05-03 ES ES02738211T patent/ES2272723T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-03 CA CA2444926A patent/CA2444926C/fr not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-03 AT AT02738211T patent/ATE340269T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-05-03 WO PCT/FR2002/001542 patent/WO2002090584A2/fr active IP Right Grant
- 2002-05-03 AU AU2002313026A patent/AU2002313026B2/en not_active Ceased
- 2002-05-03 JP JP2002587643A patent/JP4554159B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-03 DE DE60214840T patent/DE60214840T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-03 EP EP02738211A patent/EP1383925B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-03 CN CNB028114922A patent/CN1325659C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-07-13 HK HK04105111A patent/HK1062033A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-01-15 JP JP2010007289A patent/JP2010075211A/ja not_active Ceased
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1325659C (zh) | 2007-07-11 |
WO2002090584A3 (fr) | 2003-09-25 |
AU2002313026B2 (en) | 2007-06-28 |
FR2824335A1 (fr) | 2002-11-08 |
CN1639356A (zh) | 2005-07-13 |
ES2272723T3 (es) | 2007-05-01 |
EP1383925B1 (fr) | 2006-09-20 |
JP2010075211A (ja) | 2010-04-08 |
WO2002090584A2 (fr) | 2002-11-14 |
JP2004527258A (ja) | 2004-09-09 |
EP1383925A2 (fr) | 2004-01-28 |
CA2444926A1 (fr) | 2002-11-14 |
CA2444926C (fr) | 2011-03-22 |
DE60214840D1 (de) | 2006-11-02 |
DE60214840T2 (de) | 2007-09-06 |
HK1062033A1 (en) | 2004-10-15 |
ATE340269T1 (de) | 2006-10-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4554159B2 (ja) | Dnaを標識化および断片化する方法 | |
JP2009137954A (ja) | 標識試薬、このような試薬の合成方法および生体分子の検出方法 | |
JP4975905B2 (ja) | 複合生物試料における核酸の単工程調製及び検出 | |
US9228225B2 (en) | Xanthene dyes | |
US7060441B2 (en) | Method for fragmenting and labeling DNA involving abasic sites and phosphate labeling | |
JP2509574B2 (ja) | 標識付けした核酸 | |
JP6243013B2 (ja) | 5−ホルミルシトシン特異的な化学標識法及びその利用 | |
JP4712814B2 (ja) | 特定の塩基配列の標的核酸類を検出する方法、及び検出のための核酸類セット | |
US7338805B2 (en) | Labeling reagents, methods for synthesizing such reagents and methods for detecting biological molecules | |
JP3705975B2 (ja) | ミスマッチ認識分子 | |
JPH06509707A (ja) | 選択可能な開裂部位を用いるポリヌクレオチド確認法 | |
JP5114705B2 (ja) | ビピリジン修飾ヌクレオシド又はヌクレオチド、及びそれを用いたメチルシトシンの検出法 | |
JPH06209798A (ja) | 化学蛍光標識遺伝子プローブおよび遺伝子プローブ試験におけるその使用 | |
JP4467930B2 (ja) | ヌクレオチド標識試薬およびそれが導入されたオリゴヌクレオチド誘導体 | |
JP2003259899A (ja) | ミスマッチ検出分子 | |
WO2023034969A1 (en) | Hybridization probes containing fluorinated carbon chains and related methods | |
JP2003259873A (ja) | バルジ塩基検出分子 | |
JP2004325074A (ja) | ミスマッチ検出分子及びそれを用いたミスマッチの検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050204 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080610 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080808 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080815 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081204 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090915 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100115 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100208 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100518 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100521 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100615 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100714 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130723 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |