JP3705975B2 - ミスマッチ認識分子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、正常な塩基対を形成することができない塩基の対において、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法、そのための試薬、それを含有するキット、その化合物、及びその方法を用いたＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列の異常を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸がハイブリダイズして２本鎖となる場合には、対をなす塩基が決まっている。例えば、グアニン（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）にはチミン（Ｔ）という具合になっている。そして、通常は全ての塩基がこのような対を形成してハイブリダイズしているのであるが、ときとして塩基配列の中の一部にこのような対を形成することができない場合がある。
例えば、あるＤＮＡと他のＤＮＡをハイブリダイズし得る条件下においた場合に、大部分の塩基はこのような対を形成することができるが、１個又は数個の一部の塩基はこのような対を形成することができない場合がある。このような通常の塩基対を形成することができない塩基対のことを、以下ではミスマッチという。
【０００３】
一方、最近１個又は２個以上の塩基が異なることに起因する各種の遺伝病についての研究が行われてきている。例えば、１個の塩基が通常のものとは異なる遺伝子（ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism））を有する遺伝病などがあり、係る遺伝病の解明が注目されてきている。このような遺伝子を正常な遺伝子とハイブリダイズさせると、大部分の塩基は正常な塩基対を形成し得ることができるためにハイブリダイズすることはするが、１個の塩基対についてミスマッチが起こることになる。
現在、このようなミスマッチを検出する方法は、２本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション効率を比較する手法が一般的である。しかし、この方法を用いるためにはミスマッチを含むＤＮＡの塩基配列をあらかじめ知っておかなければならないために多大な労力が必要となり、多くの検体を処理する方法としては不適当である。また、ＭｕｔＳ等のＤＮＡの修復蛋白が遺伝子損傷箇所に選択的に結合することを利用する手法もあるが、タンパクの活性を維持することが難しい。
【０００４】
このように、ハイブリダイズしたＤＮＡなどにおける一部のミスマッチを検出する方法は大変難しく、またその感度も不十分なものであり、これを簡便に且つ高感度で検出できる方法の確立が求められている。
ところで、本発明者らは、２本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子を開発してきた（特願平１１−２６２２０５号）。このバルジ認識分子は、不対塩基と水素結合をするだけでなく、バルジ塩基の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションし、安定化されているものである。
本発明者らは、このような周辺の塩基の存在によるスタッキング効果を利用した不対塩基に対する作用についてさらに研究を行ってきたところ、塩基対のミスマッチが生じている箇所においても、塩基と対を形成し得る分子種を２個有する化合物がこのようなスタッキング効果により比較的安定に取り込まれる得ることを見出した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような塩基対のミスマッチを簡便でしかも高感度で検出しうる方法を提供するものである。
より詳細には、２本鎖ＤＮＡ鎖中に存在するミスマッチを高感度でしかも簡便に検出しうる方法及びそのための検出試薬を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、正常な塩基対を形成することができない塩基の対において、
次の一般式（Ｉ）、
Ａ−Ｌ−Ｂ （Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示す。）
で表される、その各々の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ａ及び化学構造部分Ｂ、並びに当該化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー部分Ｌを有する化合物を用いて、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法に関する。
【０００７】
また、本発明は、前記の正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための次の一般式（Ｉ）、
Ａ−Ｌ−Ｂ （Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示す。）
で表される化合物からなる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための試薬に関する。
本発明は、前記した本発明の試薬、及び検出、同定用の資材からなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するためのキットに関する。
【０００８】
また、本発明は、次の一般式（II）、
【０００９】
【化４】
【００１０】
（式中、Ｒ、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、
Ｒ２は、炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基を示す。）
で表される化合物又は当該化合物がプレートや機器分析用の検出装置などに固定化され得る化学構造に修飾された固定化物に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、検体となる１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡと、それに対応する正常な塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡとをハイブリダイズさせ、次いで当該ハイブリダイズしたＤＮＡ又はＲＮＡにおける正常な塩基対を形成することができない塩基の対を次の一般式（Ｉ）、
Ａ−Ｌ−Ｂ （Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示す。）
で表される、その各々の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ａ及び化学構造部分Ｂ、並びに当該化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー部分Ｌを有する化合物を用いて、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定することからなるＤＮＡ又はＲＮＡにおける塩基配列の異常を検出する方法に関する。
なお、以下の説明においては、前記した「正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分（一般式（Ｉ）におけるＡ及びＢの部分）」のことを単に「塩基認識部位」ということもある。
【００１２】
本発明者らは、２本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子を開発してきた（特願平１１−２６２２０５号）。このバルジ認識分子は、バルジ塩基の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションし、安定化されているものであるが、本発明者らはこのようなバルジ認識分子を２分子、リンカーのような結合鎖で結合させることにより各々のバルジ認識分子が、塩基対のミスマッチ部分においてバルジ塩基と同様な塩基対を形成し、しかもこれらのバルジ認識分子の両者が２本鎖を形成しているＤＮＡやＲＮＡの鎖の中に比較的安定に取り込まれることを見出した。このような比較的大きな分子種がＤＮＡやＲＮＡの鎖の中に比較的安定に取り込まれることは驚くべきことであり、かつこのような特性を利用することにより、ハイブリダイズしている核酸の中で塩基対がミスマッチを生じている箇所を簡便に特定し得ることを見出した。
【００１３】
例えば、グアニンと水素結合を形成し、かつ周囲の塩基とスタッキング効果により安定化され得る１，８−ナフチリジン誘導体を用いて、これをリンカーにより結合させた次式（III）で示される二量体を合成した。
【００１４】
【化５】
【００１５】
この化合物は、１，８−ナフチリジン部分においてグアニンと対を形成する。グアニンがバルジ塩基となっている場合には、当該グアニンと１，８−ナフチリジン誘導体とが対を形成するための空間が充分にあるので、この１，８−ナフチリジン誘導体とバルジ塩基との対の形成は両者の安定性を検討すれば足りるのであるが、ミスマッチの場合には、対を形成するための場所に他の塩基が既に存在していることから空間的な余裕が充分ではなく、塩基と隣接する塩基との僅かな空間にこのような比較的大きな分子種が安定に入り込めるか否かが大きな問題となる。
したがって、核酸の２本鎖中においてグアニン−グアニンのミスマッチが存在している場合において、このような１，８−ナフチリジン部分を２個有する化合物がミスマッチしている各々のグアニンと対を形成して核酸の鎖の中に取り込まれるか否かを検討した。
【００１６】
２本鎖のＤＮＡ中にＧＣ塩基対、ＧＡミスマッチ塩基対、及びＧＧミスマッチ塩基対を有する５’−３２Ｐでラベルした５２マー（mer）の２本鎖ＤＮＡを調製した。その該当する部分の部分配列を次に示す。
上記の２本鎖ＤＮＡにおいて、＊１で示した部分は正常なＧ−Ｃの塩基対であり、＊２で示した部分はＧ−Ａのミスマッチ部分であり、＊３の部分はＧ−Ｇのミスマッチの部分である。
【００１７】
この２本鎖のＤＮＡを用いて、種々の濃度における式（III）の化合物の存在下における、ＤＮａｓｅＩ（ＤＮＡ加水分解酵素）フットプリンティング滴定により、ＤＮａｓｅＩによるＤＮＡの切断の阻害場所を調べた。
この結果を図１に示す。図１は、電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
図１の左から右に行くに従って、式（III）の化合物の濃度が０から５００μＭまで徐々に高くなっている。ＤＮａｓｅＩ（ＤＮＡ加水分解酵素）によって切断された場合には黒く示され、ＤＮａｓｅＩによる切断が阻害されたところが白くなって見えている。
【００１８】
例えば、Ｇ−Ｃの正常な塩基対である場合には、式（III）の化合物の濃度を高くしていっても黒いまま、即ちＤＮａｓｅＩによって切断が生じていることが示される。ところが、Ｇ−Ｇのようなミスマッチのサイトでは、式（III）のナフチリジン誘導体の濃度を高くしていった場合に、次第に白く、即ちその切断が阻害されてきていることがわかる。このような変化は、Ｇ−Ａミスマッチのサイトにおいても高濃度の部分において生じてきていることもわかる。
このようなＤＮＡ加水分解酵素に対するＤＮＡの切断阻害作用は、式（III）の化合物の存在（濃度を含めて）に依存しており、式（III）の化合物による特異的な作用であると考えられる。
【００１９】
図１における切断バンドの強度と加えたナフチリジンの濃度との関係をグラフにしたものが図２である。図２の縦軸は切断バンドの強度から得られた切断の阻害比であり、０．０はほぼ完全に切断されている状況であり、１．０はほぼ完全に切断が阻害されて状況を示している。図２の横軸は加えられた式（III）の化合物の濃度（Ｍ）を示している。図２のグラフ中の黒丸印（●）はＧ−Ｇのミスマッチサイトのものであり、黒三角印（▲）はＧ−Ａのミスマッチサイトのものである。
この図２のグラフからも明らかなように、式（III）の化合物によるＧ−Ｇのミスマッチサイトに対する切断阻害作用は比較的低濃度から生じ、約１０−５Ｍの濃度以上でほぼ完全にＧ−Ｇミスマッチに対する切断が阻害されていることがわかる。また、Ｇ−Ａミスマッチサイトにおいても、約１０−６Ｍの濃度付近から切断の阻害作用が始まり、５×１０−３Ｍ（５００μＭ）付近では約９０％の切断阻害が生じていることがわかる。
【００２０】
この結果、式（III）の化合物のＧ−Ｇのミスマッチへの結合常数（Ｋａ（ＧＧｍｉｓ））は、１．１３Ｘ１０７Ｍ−１と求められ、同様にＧ−Ａのミスマッチへの結合常数（Ｋａ（ＧＡｍｉｓ））は、１．６３Ｘ１０４Ｍ−１と求められた。
両者の結合常数の比（（Ｋａ（ＧＧｍｉｓ））／（Ｋａ（ＧＡｍｉｓ）））は、６９６であり、式（III）がＧ−Ｇミスマッチに対して特異的に作用していることがわかる。また、式（III）の化合物のＧ−Ｇミスマッチ塩基対に対する結合常数が１０７のオーダーと比較的大きいということは、式（III）の化合物が想像以上に安定にＧ−Ｇミスマッチ塩基対部分に取り込まれていることを示している。
そして、ＤＮＡの２本鎖に取り込まれた本発明のミスマッチ塩基認識分子は、比較的安定な対を形成し、このような対の形成により天然の酵素が認識することができない塩基の配列を新たに形成していると考えられる。
【００２１】
本発明の一般式（Ｉ）で示される化合物（ミスマッチ認識分子）が比較的安定に塩基のミスマッチ部分に取り込まれる様子を模式的に示したものが図３である。
図３の左側は、２本鎖のＤＮＡにおいてＧ−Ａのミスマッチがある部分を示している。他の箇所では正常な塩基対が形成されており、Ｇ−Ａの部分においてミスマッチがあるにもかかわらず全体としてはハイブリダイズしているＤＮＡである。これに、ＮＡ−ＮＧで示される本発明のミスマッチ認識分子が加えられると、図３の右側のような状態になるものと考えられる。即ち、ミスマッチしている塩基のグアニン（Ｇ）はミスマッチ認識分子のグアニン認識部位（ＮＧ）と対を形成し、ミスマッチしている他方の塩基のアデニン（Ａ）はミスマッチ認識分子のアデニン認識部位（ＮＡ）と対を形成し、そしてミスマッチ認識分子のグアニン認識部位（ＮＧ）とアデニン認識部位（ＮＡ）とは、適当な長さでかつ適当な自由度のあるリンカー（−）で結合されており、２本鎖のＤＮＡの鎖の中にほぼ他の正常な塩基対と同様な形で取り込まれていると考えられる（図３の右側参照）。
【００２２】
そして、本発明のミスマッチ認識分子が２本鎖のＤＮＡの鎖の中に比較的安定に取り込まれるもうひとつの大きな理由は、ミスマッチ認識分子の塩基認識部位（例えば、先程の例におけるグアニン認識部位（ＮＧ）やアデニン認識部位（ＮＡ））が、前後の塩基によるスタッキング効果（塩基同士間の分子間力のようなもの）により安定化されているということである。図３の右側における点線はこのような塩基によるスタッキング効果を示している。このようなスタッキング効果が生じる要因のひとつとして、π電子系の相互作用（パイスタッキング効果）が考えられることから、前後の塩基の種類によりスタッキングの効果には程度の差が生じることもあるが、本発明の分子とミスマッチサイトの結合を極端に低下させることはない。
したがって、本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位（一般式（Ｉ）におけるＡ及びＢの化学構造部分）は、単に目的の塩基と水素結合ができるということのみではなく、前後又は周囲の塩基によるスタッキング効果が得られる化学構造であることが必要である。
【００２３】
このように、本発明は、２個の塩基認識部位を適当な長さでかつ適当な自由度を有するリンカーで結合させた化合物が、２本鎖の核酸における塩基対のミスマッチ部分に特異的にかつ安定に対を形成するということを見出したことを基本的なコンセプトとするものであり、前記したＧ−Ｇミスマッチに限定されるものではない。
前記した例では、グアニン（Ｇ）−グアニン（Ｇ）のミスマッチを例に取り、グアニン塩基と安全な水素結合を形成する１，８−ナフチリジン誘導体を塩基認識部位に用いたミスマッチ認識分子を示したが、ミスマッチの認識はＧ−Ｇミスマッチに限定されるものではない。本発明にミスマッチ認識分子における塩基認識部位は、ミスマッチの塩基の片方を認識し当該塩基とワトソン−クリック（Watson-Crick）型の塩基対を形成することができ、周囲の塩基によるスタッキング効果を得られる分子種を選択することにより、例示したグアニンに限らず、各種の塩基と塩基対を形成し得るものであればよい。
例えば、ミスマッチの塩基がシトシンの場合には、塩基認識部位として２−アミノナフチリジン−４−オン又はその誘導体などが、ミスマッチの塩基がアデニンの場合には、２−キノロン誘導体、例えば３−（２−アミノエチル）−２−キノロン又はその誘導体などが、また、ミスマッチの塩基がチミンの場合には、２−アミノナフチリジン−７−オン又はその誘導体などが用いられる。
【００２４】
特定のミスマッチの塩基に特異的に認識される本発明のミスマッチ認識分子における塩基認識部位は、水素結合を形成するための水素結合部位と、近傍の塩基にスタッキングされるための平面構造を有している複素環式芳香族基を有するものが好ましいが、さらに、塩基に対する選択性を増強するためにある程度の立体障害を有する置換基を有する複素環式芳香族基が好ましい。
このような置換基としては、例えば、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基からなるアルコキシ基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基でモノ又はジ置換されているモノ若しくはジアルキルアミノ基などが挙げられる。
これらのアルキル基、アルコキシ基又はモノ若しくはジアルキルアミノ基における１個又はそれ以上の炭素原子は、酸素原子又は窒素原子で置換されていてもよい。
【００２５】
また、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物におけるリンカー部Ｌとしては、２個の塩基認識部位を適当な長さで適当な自由度を与えるものであれ特に制限されるものではないが、例えば、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１２の直鎖状又は分枝状の飽和又は不飽和のアルキル基であって、当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基が挙げられる。好ましいリンカーとしては、前記した式（III）の化合物のように両端がアミド結合の部分を有し、中央部に窒素原子を有するものが挙げられる。
このリンカー部分は、２個の塩基認識部位を結合させるだけでなく、このリンカー部分から担体に固定化するための枝を結合させることもできる。例えば、リンカー中央部付近の窒素原子の箇所からさらに末端に担体と結合するための官能基などを有するアルキレン基のような枝を延ばして、必要に応じて担体に固定化することもできる。
【００２６】
本発明の一般式（Ｉ）における塩基認識部位Ａ又はＢとリンカー部Ｌとの結合は、炭素−炭素結合であってもよいが合成の簡便さから官能基による結合が好ましい。官能基による結合としては、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、リン酸による結合など種々のタイプのものを選択することができるが、アミド結合が好ましい。
本発明のミスマッチ塩基認識分子における、Ｇ−Ｇミスマッチに対する好ましい一般式（Ｉ）の化合物として、次の一般式（II）、
【００２７】
【化６】
【００２８】
（式中、Ｒ、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、
Ｒ２は、炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基を示す。）
で表される化合物又はその固定化物が挙げられる。ここにおける「固定化物」とは、前記した化合物が担体に固定化されている状態のもの又は固定化され得るように前記した「枝」をのばした状態の化合物をいう。
なお、Ｒ２におけるアルキル基は、一般式（II）に示されているように２価のアルキル基である。
【００２９】
また、本発明のミスマッチ塩基認識分子はこれを単独で使用することもできるが、分子中の適当な位置に、例えばリンカー部分やリンカーから固定化のためなどのための延ばされた枝などに、放射性元素を導入したり、化学発光又は蛍光を発する分子種を導入するなどして、標識化して使用することもできる。なお、測定手段としての標識化は、検出対象のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸部分の標識化によることもできる。
さらに、本発明のミスマッチ塩基認識分子の適当な位置においてポリスチレンなどの高分子材料と直接又はアルキレン基などを用いて結合させて、これを固定化して使用することもできる。
【００３０】
本発明のミスマッチ塩基認識分子は低分子有機化合物であり、通常の有機合成法により適宜製造することができる。例えば、前記した１，８−ナフチリジン誘導体は、２−アミノ−１，８−ナフチリジン又は２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジンをＮ−保護−４−アミノ−酪酸の反応性誘導体、例えば酸塩化物を反応させて、２位のアミノ基をアシル化した後、アミノ基を保護基を脱保護して製造することができる。この際の保護基としては、塩酸塩やアシル基やアルコキシカルボニル基などのペプチド合成において使用されるアミノ保護基を使用することができる。
このようにして得られた塩基認識部位を、両末端にカルボキシル基又はその反応性誘導体基を有するリンカー用の化合物と反応させることにより目的のミスマッチ塩基認識分子を得ることができる。この際に、リンカー用化合物の分子中に窒素原子などの反応性の基が存在している場合には、前記した保護基などで適宜保護して使用することができる。
【００３１】
本発明のミスマッチ塩基認識分子は、これをミスマッチの塩基の対の検出するための試薬又は検出剤として使用することができ、また、適当な担体と組み合わせることによりミスマッチの塩基の対を検出するための組成物とすることができる。また、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための塩基対生成剤として使用することもできる。ここに、「擬似的な塩基対」というのは、天然に存在する塩基の対とは異なる塩基の対であるという意味であり、塩基対の強度を意味するものではない。なお、本明細書において使用される「正常な塩基対」とは天然に存在する塩基の対であって、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｔ、又はＡ−Ｕの塩基対をいう。
本発明は、さらに前記した本発明のミスマッチ塩基認識分子、及び検出、同定用の資材、例えば化学発光や蛍光のための試薬や緩衝液などの資材からなる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するためのキットを提供するものである。
さらに、本発明は、本発明のミスマッチ塩基認識分子又は標識化若しくは固定化された本発明のミスマッチ塩基認識分子を使用して、ＤＮＡ中のミスマッチしている塩基の対を検出、同定又は定量するための方法を提供するものである。
【００３２】
本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位を用いることにより、１個又は２個以上のミスマッチの塩基の対を有するＤＮＡにおいて、特定のミスマッチの塩基の対、例えば、Ｇ−Ｇミスマッチ、Ｇ−Ａミスマッチなどの特定のミスマッチをしている塩基と水素結合を形成させてこれを安定化させるのみならず、近傍、好ましくは隣接する塩基対にスタックされ、ミスマッチの塩基の対が存在しているにもかかわらず比較的安定なＤＮＡを得ることができる。
したがって、本発明は、本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位が、特定のミスマッチの塩基の対における当該塩基の各々と水素結合を形成し、当該塩基の近隣に存在する塩基対にスタックされることによりミスマッチの塩基の対が安定化されたミスマッチ塩基対を含有するＤＮＡを提供するものである。
本発明のこのＤＮＡは、ミスマッチの塩基の対が本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位と水素結合により塩基対と同様な「対」（擬似的な塩基対）を形成し、かつミスマッチの塩基と「対」を形成している本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位が近傍、好ましくは隣接の塩基対を形成している塩基にサンドイッチ状に挟まれてスタックされていることを特徴とするものである。
【００３３】
本発明のミスマッチ認識分子を用いることにより、従来の技術では達成できないミスマッチの塩基の対を高感度でかつ簡便に検出、同定又は定量することが出来、ミスマッチの塩基の対に特異的でかつ安定なＤＮＡを形成することから、ＤＮＡ損傷に伴う各種疾患の治療、予防又は診断に応用することも可能である。
また、本発明のＤＮＡは、ミスマッチの塩基の対を有した状態で比較的安定に存在することができることから、ミスマッチの塩基の対を含有するＤＮＡの安定化や、ミスマッチの発生原因やミスマッチの修復機構の解明などの研究材料として利用することも可能である。
【００３４】
また、本発明は、検体となる１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡと、それに対応する正常な塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡとをハイブリダイズさせ、次いで当該ハイブリダイズしたＤＮＡ又はＲＮＡにおける正常な塩基対を形成することができない塩基の対を前記した本発明のミスマッチ認識分子を用いて、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定することからなるＤＮＡ又はＲＮＡにおける塩基配列の異常を検出する方法を提供するものでもある。この方法は、遺伝子の異常の有無を調べたいときなどに利用することができる。
例えば、異常の可能性があるＤＮＡ又はその転写産物であるＲＮＡを採取し、これと正常な塩基配列を有する相補的なＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせて２本鎖の核酸を生成させる。もし、採取した遺伝子の塩基配列に異常があれば、当該異常の箇所の塩基において塩基の対にミスマッチが生じることになる。このミスマッチが生じている２本鎖の核酸に本発明のミスマッチ認識分子を加えることにより前記してきた擬似的な塩基の対が形成され、この新たな対が形成された分子の有無を測定することにより採取された遺伝子の異常を簡便かつ高感度で検出、同定することができる。
【００３５】
前記した新たな対（本発明のミスマッチ認識分子とミスマッチの塩基との対）を測定するための手段としては、化学発光や蛍光、放射性同位体などの標識化によっても行うことができる。本発明のミスマッチ認識分子は低分子有機化合物であり、新たな対を形成した場合にはこの分子が核酸中に取り込まれるので、未反応の本発明のミスマッチ認識分子と核酸類の両者を比較的簡便に分離することができる。
また、前記したように本発明のミスマッチ認識分子を担体に固定化して使用することもできる。例えば、本発明の各種のミスマッチに特異的なミスマッチ認識分子をタイタープレートなどのプレートに固定化し、これに前記の２本鎖の核酸、好ましくは標識化された核酸を加え、数分間インキュベートした後、核酸類を除去すると本発明のミスマッチ認識分子と特異的に反応した核酸は固定化された本発明のミスマッチ認識分子にトラップされ、標識により検出、同定することができることになる。
【００３６】
また、本発明のミスマッチ認識分子を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の検出用チップの金属薄膜上に固定化することも可能である。このＳＰＲによる場合には、前記の２本鎖の核酸を含有する試料液を検出用チップの表面に流すだけで、ミスマッチの有無を特異的に検出することが可能となる。
さらに、他のおおくの検出手段に本発明のミスマッチ認識分子を応用することも可能であり、本発明はこれらの特定の検出手段に限定されるものではない。
【００３７】
【実施例】
次に、具体的な試験例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
実施例１（式（III）の化合物の合成）
次式に示す化学反応に従って標記の化合物を合成した。
【００３８】
【化７】
【００３９】
（式中のＢｏｃは、ｔ−ブトキシカルボニル基を示す。）
Ｎ−Ｂｏｃ化ジカルボン酸のスクシンイミジルエステル（３１３ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１５ｍＬ）に溶かし、２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジン（２９４ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４８時間反応後、後処理によりＢｏｃ化ジナフチリジンアミドを得た。これを４Ｎの塩酸を含む酢酸エチルに溶解し、室温で２時間反応すると、標記のジナフチリジンアミドが通算収率１３％で得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ：
8.26(d,2H,J=8.8Hz), 8.14(d,2H,J=8.8Hz), 8.11(d,2H,J=8.0Hz),
7.34(d,2H,J=8.0Hz), 3.20(t,4H,J=6.0Hz), 2.84(t,4H,J=6.0Hz),
2.68(s,6H)；
【００４０】
実施例２
５’端を３２Ｐでラベルした５２塩基のＤＮＡをＧ−Ｇ及びＧ−Ａのミスマッチが生じるようにハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡとした（図１の右側参照）。
この２本鎖のＤＮＡに種々の濃度の実施例１で得られた化合物を加えて、ＤＮａｓｅＩフットプリンティング滴定により調べた。
即ち、この２本鎖のＤＮＡ（＜４ｎＭストランド濃度）を、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（５ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．６）で種々の濃度に調整した実施例１で得られた化合物と共に、４℃で１２時間インキュベートした。これに、０．２ＵのＤＮａｓｅＩ（ＤＮＡ加水分解酵素）を加え、２５℃で８分間インキュベートした。その後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、これを、１２％ポリアクリルアミド及び７Ｍ尿素を含有するゲルを用いて電気泳動した。
この結果を図１に示す。
【００４１】
【発明の効果】
本発明のミスマッチ認識分子を用いることにより、従来の技術では達成できないグアニン−グアニンミスマッチなどのミスマッチしている塩基の対を高感度でかつ簡便に検出することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のミスマッチ認識分子によるミスマッチ部位の、ＤＮａｓｅＩによる切断の阻害効果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明のミスマッチ認識分子を用いた場合のＤＮａｓｅＩによる切断の阻害効果をしめすグラフである。
【図３】図３は、本発明のミスマッチ認識分子のミスマッチ部分における作用を模式的に示したものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、正常な塩基対を形成することができない塩基の対において、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法、そのための試薬、それを含有するキット、その化合物、及びその方法を用いたＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列の異常を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸がハイブリダイズして２本鎖となる場合には、対をなす塩基が決まっている。例えば、グアニン（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）にはチミン（Ｔ）という具合になっている。そして、通常は全ての塩基がこのような対を形成してハイブリダイズしているのであるが、ときとして塩基配列の中の一部にこのような対を形成することができない場合がある。
例えば、あるＤＮＡと他のＤＮＡをハイブリダイズし得る条件下においた場合に、大部分の塩基はこのような対を形成することができるが、１個又は数個の一部の塩基はこのような対を形成することができない場合がある。このような通常の塩基対を形成することができない塩基対のことを、以下ではミスマッチという。
【０００３】
一方、最近１個又は２個以上の塩基が異なることに起因する各種の遺伝病についての研究が行われてきている。例えば、１個の塩基が通常のものとは異なる遺伝子（ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism））を有する遺伝病などがあり、係る遺伝病の解明が注目されてきている。このような遺伝子を正常な遺伝子とハイブリダイズさせると、大部分の塩基は正常な塩基対を形成し得ることができるためにハイブリダイズすることはするが、１個の塩基対についてミスマッチが起こることになる。
現在、このようなミスマッチを検出する方法は、２本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション効率を比較する手法が一般的である。しかし、この方法を用いるためにはミスマッチを含むＤＮＡの塩基配列をあらかじめ知っておかなければならないために多大な労力が必要となり、多くの検体を処理する方法としては不適当である。また、ＭｕｔＳ等のＤＮＡの修復蛋白が遺伝子損傷箇所に選択的に結合することを利用する手法もあるが、タンパクの活性を維持することが難しい。
【０００４】
このように、ハイブリダイズしたＤＮＡなどにおける一部のミスマッチを検出する方法は大変難しく、またその感度も不十分なものであり、これを簡便に且つ高感度で検出できる方法の確立が求められている。
ところで、本発明者らは、２本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子を開発してきた（特願平１１−２６２２０５号）。このバルジ認識分子は、不対塩基と水素結合をするだけでなく、バルジ塩基の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションし、安定化されているものである。
本発明者らは、このような周辺の塩基の存在によるスタッキング効果を利用した不対塩基に対する作用についてさらに研究を行ってきたところ、塩基対のミスマッチが生じている箇所においても、塩基と対を形成し得る分子種を２個有する化合物がこのようなスタッキング効果により比較的安定に取り込まれる得ることを見出した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような塩基対のミスマッチを簡便でしかも高感度で検出しうる方法を提供するものである。
より詳細には、２本鎖ＤＮＡ鎖中に存在するミスマッチを高感度でしかも簡便に検出しうる方法及びそのための検出試薬を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、正常な塩基対を形成することができない塩基の対において、
次の一般式（Ｉ）、
Ａ−Ｌ−Ｂ （Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示す。）
で表される、その各々の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ａ及び化学構造部分Ｂ、並びに当該化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー部分Ｌを有する化合物を用いて、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法に関する。
【０００７】
また、本発明は、前記の正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための次の一般式（Ｉ）、
Ａ−Ｌ−Ｂ （Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示す。）
で表される化合物からなる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための試薬に関する。
本発明は、前記した本発明の試薬、及び検出、同定用の資材からなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するためのキットに関する。
【０００８】
また、本発明は、次の一般式（II）、
【０００９】
【化４】
（式中、Ｒ、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、
Ｒ２は、炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基を示す。）
で表される化合物又は当該化合物がプレートや機器分析用の検出装置などに固定化され得る化学構造に修飾された固定化物に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、検体となる１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡと、それに対応する正常な塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡとをハイブリダイズさせ、次いで当該ハイブリダイズしたＤＮＡ又はＲＮＡにおける正常な塩基対を形成することができない塩基の対を次の一般式（Ｉ）、
Ａ−Ｌ−Ｂ （Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示す。）
で表される、その各々の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ａ及び化学構造部分Ｂ、並びに当該化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー部分Ｌを有する化合物を用いて、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定することからなるＤＮＡ又はＲＮＡにおける塩基配列の異常を検出する方法に関する。
なお、以下の説明においては、前記した「正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分（一般式（Ｉ）におけるＡ及びＢの部分）」のことを単に「塩基認識部位」ということもある。
【００１２】
本発明者らは、２本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子を開発してきた（特願平１１−２６２２０５号）。このバルジ認識分子は、バルジ塩基の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションし、安定化されているものであるが、本発明者らはこのようなバルジ認識分子を２分子、リンカーのような結合鎖で結合させることにより各々のバルジ認識分子が、塩基対のミスマッチ部分においてバルジ塩基と同様な塩基対を形成し、しかもこれらのバルジ認識分子の両者が２本鎖を形成しているＤＮＡやＲＮＡの鎖の中に比較的安定に取り込まれることを見出した。このような比較的大きな分子種がＤＮＡやＲＮＡの鎖の中に比較的安定に取り込まれることは驚くべきことであり、かつこのような特性を利用することにより、ハイブリダイズしている核酸の中で塩基対がミスマッチを生じている箇所を簡便に特定し得ることを見出した。
【００１３】
例えば、グアニンと水素結合を形成し、かつ周囲の塩基とスタッキング効果により安定化され得る１，８−ナフチリジン誘導体を用いて、これをリンカーにより結合させた次式（III）で示される二量体を合成した。
【００１４】
【化５】
この化合物は、１，８−ナフチリジン部分においてグアニンと対を形成する。グアニンがバルジ塩基となっている場合には、当該グアニンと１，８−ナフチリジン誘導体とが対を形成するための空間が充分にあるので、この１，８−ナフチリジン誘導体とバルジ塩基との対の形成は両者の安定性を検討すれば足りるのであるが、ミスマッチの場合には、対を形成するための場所に他の塩基が既に存在していることから空間的な余裕が充分ではなく、塩基と隣接する塩基との僅かな空間にこのような比較的大きな分子種が安定に入り込めるか否かが大きな問題となる。
したがって、核酸の２本鎖中においてグアニン−グアニンのミスマッチが存在している場合において、このような１，８−ナフチリジン部分を２個有する化合物がミスマッチしている各々のグアニンと対を形成して核酸の鎖の中に取り込まれるか否かを検討した。
【００１６】
２本鎖のＤＮＡ中にＧＣ塩基対、ＧＡミスマッチ塩基対、及びＧＧミスマッチ塩基対を有する５’−３２Ｐでラベルした５２マー（mer）の２本鎖ＤＮＡを調製した。その該当する部分の部分配列を次に示す。
【００１７】
この２本鎖のＤＮＡを用いて、種々の濃度における式（III）の化合物の存在下における、ＤＮａｓｅＩ（ＤＮＡ加水分解酵素）フットプリンティング滴定により、ＤＮａｓｅＩによるＤＮＡの切断の阻害場所を調べた。
この結果を図１に示す。図１は、電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
図１の左から右に行くに従って、式（III）の化合物の濃度が０から５００μＭまで徐々に高くなっている。ＤＮａｓｅＩ（ＤＮＡ加水分解酵素）によって切断された場合には黒く示され、ＤＮａｓｅＩによる切断が阻害されたところが白くなって見えている。
【００１８】
例えば、Ｇ−Ｃの正常な塩基対である場合には、式（III）の化合物の濃度を高くしていっても黒いまま、即ちＤＮａｓｅＩによって切断が生じていることが示される。ところが、Ｇ−Ｇのようなミスマッチのサイトでは、式（III）のナフチリジン誘導体の濃度を高くしていった場合に、次第に白く、即ちその切断が阻害されてきていることがわかる。このような変化は、Ｇ−Ａミスマッチのサイトにおいても高濃度の部分において生じてきていることもわかる。
このようなＤＮＡ加水分解酵素に対するＤＮＡの切断阻害作用は、式（III）の化合物の存在（濃度を含めて）に依存しており、式（III）の化合物による特異的な作用であると考えられる。
【００１９】
図１における切断バンドの強度と加えたナフチリジンの濃度との関係をグラフにしたものが図２である。図２の縦軸は切断バンドの強度から得られた切断の阻害比であり、０．０はほぼ完全に切断されている状況であり、１．０はほぼ完全に切断が阻害されて状況を示している。図２の横軸は加えられた式（III）の化合物の濃度（Ｍ）を示している。図２のグラフ中の黒丸印（●）はＧ−Ｇのミスマッチサイトのものであり、黒三角印（▲）はＧ−Ａのミスマッチサイトのものである。
この図２のグラフからも明らかなように、式（III）の化合物によるＧ−Ｇのミスマッチサイトに対する切断阻害作用は比較的低濃度から生じ、約１０−５Ｍの濃度以上でほぼ完全にＧ−Ｇミスマッチに対する切断が阻害されていることがわかる。また、Ｇ−Ａミスマッチサイトにおいても、約１０−６Ｍの濃度付近から切断の阻害作用が始まり、５×１０−３Ｍ（５００μＭ）付近では約９０％の切断阻害が生じていることがわかる。
【００２０】
この結果、式（III）の化合物のＧ−Ｇのミスマッチへの結合常数（Ｋａ（ＧＧｍｉｓ））は、１．１３Ｘ１０７Ｍ−１と求められ、同様にＧ−Ａのミスマッチへの結合常数（Ｋａ（ＧＡｍｉｓ））は、１．６３Ｘ１０４Ｍ−１と求められた。
両者の結合常数の比（（Ｋａ（ＧＧｍｉｓ））／（Ｋａ（ＧＡｍｉｓ）））は、６９６であり、式（III）がＧ−Ｇミスマッチに対して特異的に作用していることがわかる。また、式（III）の化合物のＧ−Ｇミスマッチ塩基対に対する結合常数が１０７のオーダーと比較的大きいということは、式（III）の化合物が想像以上に安定にＧ−Ｇミスマッチ塩基対部分に取り込まれていることを示している。
そして、ＤＮＡの２本鎖に取り込まれた本発明のミスマッチ塩基認識分子は、比較的安定な対を形成し、このような対の形成により天然の酵素が認識することができない塩基の配列を新たに形成していると考えられる。
【００２１】
本発明の一般式（Ｉ）で示される化合物（ミスマッチ認識分子）が比較的安定に塩基のミスマッチ部分に取り込まれる様子を模式的に示したものが図３である。
図３の左側は、２本鎖のＤＮＡにおいてＧ−Ａのミスマッチがある部分を示している。他の箇所では正常な塩基対が形成されており、Ｇ−Ａの部分においてミスマッチがあるにもかかわらず全体としてはハイブリダイズしているＤＮＡである。これに、ＮＡ−ＮＧで示される本発明のミスマッチ認識分子が加えられると、図３の右側のような状態になるものと考えられる。即ち、ミスマッチしている塩基のグアニン（Ｇ）はミスマッチ認識分子のグアニン認識部位（ＮＧ）と対を形成し、ミスマッチしている他方の塩基のアデニン（Ａ）はミスマッチ認識分子のアデニン認識部位（ＮＡ）と対を形成し、そしてミスマッチ認識分子のグアニン認識部位（ＮＧ）とアデニン認識部位（ＮＡ）とは、適当な長さでかつ適当な自由度のあるリンカー（−）で結合されており、２本鎖のＤＮＡの鎖の中にほぼ他の正常な塩基対と同様な形で取り込まれていると考えられる（図３の右側参照）。
【００２２】
そして、本発明のミスマッチ認識分子が２本鎖のＤＮＡの鎖の中に比較的安定に取り込まれるもうひとつの大きな理由は、ミスマッチ認識分子の塩基認識部位（例えば、先程の例におけるグアニン認識部位（ＮＧ）やアデニン認識部位（ＮＡ））が、前後の塩基によるスタッキング効果（塩基同士間の分子間力のようなもの）により安定化されているということである。図３の右側における点線はこのような塩基によるスタッキング効果を示している。このようなスタッキング効果が生じる要因のひとつとして、π電子系の相互作用（パイスタッキング効果）が考えられることから、前後の塩基の種類によりスタッキングの効果には程度の差が生じることもあるが、本発明の分子とミスマッチサイトの結合を極端に低下させることはない。
したがって、本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位（一般式（Ｉ）におけるＡ及びＢの化学構造部分）は、単に目的の塩基と水素結合ができるということのみではなく、前後又は周囲の塩基によるスタッキング効果が得られる化学構造であることが必要である。
【００２３】
このように、本発明は、２個の塩基認識部位を適当な長さでかつ適当な自由度を有するリンカーで結合させた化合物が、２本鎖の核酸における塩基対のミスマッチ部分に特異的にかつ安定に対を形成するということを見出したことを基本的なコンセプトとするものであり、前記したＧ−Ｇミスマッチに限定されるものではない。
前記した例では、グアニン（Ｇ）−グアニン（Ｇ）のミスマッチを例に取り、グアニン塩基と安全な水素結合を形成する１，８−ナフチリジン誘導体を塩基認識部位に用いたミスマッチ認識分子を示したが、ミスマッチの認識はＧ−Ｇミスマッチに限定されるものではない。本発明にミスマッチ認識分子における塩基認識部位は、ミスマッチの塩基の片方を認識し当該塩基とワトソン−クリック（Watson-Crick）型の塩基対を形成することができ、周囲の塩基によるスタッキング効果を得られる分子種を選択することにより、例示したグアニンに限らず、各種の塩基と塩基対を形成し得るものであればよい。
例えば、ミスマッチの塩基がシトシンの場合には、塩基認識部位として２−アミノナフチリジン−４−オン又はその誘導体などが、ミスマッチの塩基がアデニンの場合には、２−キノロン誘導体、例えば３−（２−アミノエチル）−２−キノロン又はその誘導体などが、また、ミスマッチの塩基がチミンの場合には、２−アミノナフチリジン−７−オン又はその誘導体などが用いられる。
【００２４】
特定のミスマッチの塩基に特異的に認識される本発明のミスマッチ認識分子における塩基認識部位は、水素結合を形成するための水素結合部位と、近傍の塩基にスタッキングされるための平面構造を有している複素環式芳香族基を有するものが好ましいが、さらに、塩基に対する選択性を増強するためにある程度の立体障害を有する置換基を有する複素環式芳香族基が好ましい。
このような置換基としては、例えば、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基からなるアルコキシ基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基でモノ又はジ置換されているモノ若しくはジアルキルアミノ基などが挙げられる。
これらのアルキル基、アルコキシ基又はモノ若しくはジアルキルアミノ基における１個又はそれ以上の炭素原子は、酸素原子又は窒素原子で置換されていてもよい。
【００２５】
また、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物におけるリンカー部Ｌとしては、２個の塩基認識部位を適当な長さで適当な自由度を与えるものであれ特に制限されるものではないが、例えば、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１２の直鎖状又は分枝状の飽和又は不飽和のアルキル基であって、当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基が挙げられる。好ましいリンカーとしては、前記した式（III）の化合物のように両端がアミド結合の部分を有し、中央部に窒素原子を有するものが挙げられる。
このリンカー部分は、２個の塩基認識部位を結合させるだけでなく、このリンカー部分から担体に固定化するための枝を結合させることもできる。例えば、リンカー中央部付近の窒素原子の箇所からさらに末端に担体と結合するための官能基などを有するアルキレン基のような枝を延ばして、必要に応じて担体に固定化することもできる。
【００２６】
本発明の一般式（Ｉ）における塩基認識部位Ａ又はＢとリンカー部Ｌとの結合は、炭素−炭素結合であってもよいが合成の簡便さから官能基による結合が好ましい。官能基による結合としては、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、リン酸による結合など種々のタイプのものを選択することができるが、アミド結合が好ましい。
本発明のミスマッチ塩基認識分子における、Ｇ−Ｇミスマッチに対する好ましい一般式（Ｉ）の化合物として、次の一般式（II）、
【００２７】
【化６】
（式中、Ｒ、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、
Ｒ２は、炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基を示す。）
で表される化合物又はその固定化物が挙げられる。ここにおける「固定化物」とは、前記した化合物が担体に固定化されている状態のもの又は固定化され得るように前記した「枝」をのばした状態の化合物をいう。
なお、Ｒ２におけるアルキル基は、一般式（II）に示されているように２価のアルキル基である。
【００２９】
また、本発明のミスマッチ塩基認識分子はこれを単独で使用することもできるが、分子中の適当な位置に、例えばリンカー部分やリンカーから固定化のためなどのための延ばされた枝などに、放射性元素を導入したり、化学発光又は蛍光を発する分子種を導入するなどして、標識化して使用することもできる。なお、測定手段としての標識化は、検出対象のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸部分の標識化によることもできる。
さらに、本発明のミスマッチ塩基認識分子の適当な位置においてポリスチレンなどの高分子材料と直接又はアルキレン基などを用いて結合させて、これを固定化して使用することもできる。
【００３０】
本発明のミスマッチ塩基認識分子は低分子有機化合物であり、通常の有機合成法により適宜製造することができる。例えば、前記した１，８−ナフチリジン誘導体は、２−アミノ−１，８−ナフチリジン又は２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジンをＮ−保護−４−アミノ−酪酸の反応性誘導体、例えば酸塩化物を反応させて、２位のアミノ基をアシル化した後、アミノ基を保護基を脱保護して製造することができる。この際の保護基としては、塩酸塩やアシル基やアルコキシカルボニル基などのペプチド合成において使用されるアミノ保護基を使用することができる。
このようにして得られた塩基認識部位を、両末端にカルボキシル基又はその反応性誘導体基を有するリンカー用の化合物と反応させることにより目的のミスマッチ塩基認識分子を得ることができる。この際に、リンカー用化合物の分子中に窒素原子などの反応性の基が存在している場合には、前記した保護基などで適宜保護して使用することができる。
【００３１】
本発明のミスマッチ塩基認識分子は、これをミスマッチの塩基の対の検出するための試薬又は検出剤として使用することができ、また、適当な担体と組み合わせることによりミスマッチの塩基の対を検出するための組成物とすることができる。また、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための塩基対生成剤として使用することもできる。ここに、「擬似的な塩基対」というのは、天然に存在する塩基の対とは異なる塩基の対であるという意味であり、塩基対の強度を意味するものではない。なお、本明細書において使用される「正常な塩基対」とは天然に存在する塩基の対であって、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｔ、又はＡ−Ｕの塩基対をいう。
本発明は、さらに前記した本発明のミスマッチ塩基認識分子、及び検出、同定用の資材、例えば化学発光や蛍光のための試薬や緩衝液などの資材からなる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するためのキットを提供するものである。
さらに、本発明は、本発明のミスマッチ塩基認識分子又は標識化若しくは固定化された本発明のミスマッチ塩基認識分子を使用して、ＤＮＡ中のミスマッチしている塩基の対を検出、同定又は定量するための方法を提供するものである。
【００３２】
本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位を用いることにより、１個又は２個以上のミスマッチの塩基の対を有するＤＮＡにおいて、特定のミスマッチの塩基の対、例えば、Ｇ−Ｇミスマッチ、Ｇ−Ａミスマッチなどの特定のミスマッチをしている塩基と水素結合を形成させてこれを安定化させるのみならず、近傍、好ましくは隣接する塩基対にスタックされ、ミスマッチの塩基の対が存在しているにもかかわらず比較的安定なＤＮＡを得ることができる。
したがって、本発明は、本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位が、特定のミスマッチの塩基の対における当該塩基の各々と水素結合を形成し、当該塩基の近隣に存在する塩基対にスタックされることによりミスマッチの塩基の対が安定化されたミスマッチ塩基対を含有するＤＮＡを提供するものである。
本発明のこのＤＮＡは、ミスマッチの塩基の対が本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位と水素結合により塩基対と同様な「対」（擬似的な塩基対）を形成し、かつミスマッチの塩基と「対」を形成している本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位が近傍、好ましくは隣接の塩基対を形成している塩基にサンドイッチ状に挟まれてスタックされていることを特徴とするものである。
【００３３】
本発明のミスマッチ認識分子を用いることにより、従来の技術では達成できないミスマッチの塩基の対を高感度でかつ簡便に検出、同定又は定量することが出来、ミスマッチの塩基の対に特異的でかつ安定なＤＮＡを形成することから、ＤＮＡ損傷に伴う各種疾患の治療、予防又は診断に応用することも可能である。
また、本発明のＤＮＡは、ミスマッチの塩基の対を有した状態で比較的安定に存在することができることから、ミスマッチの塩基の対を含有するＤＮＡの安定化や、ミスマッチの発生原因やミスマッチの修復機構の解明などの研究材料として利用することも可能である。
【００３４】
また、本発明は、検体となる１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡと、それに対応する正常な塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡとをハイブリダイズさせ、次いで当該ハイブリダイズしたＤＮＡ又はＲＮＡにおける正常な塩基対を形成することができない塩基の対を前記した本発明のミスマッチ認識分子を用いて、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定することからなるＤＮＡ又はＲＮＡにおける塩基配列の異常を検出する方法を提供するものでもある。この方法は、遺伝子の異常の有無を調べたいときなどに利用することができる。
例えば、異常の可能性があるＤＮＡ又はその転写産物であるＲＮＡを採取し、これと正常な塩基配列を有する相補的なＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせて２本鎖の核酸を生成させる。もし、採取した遺伝子の塩基配列に異常があれば、当該異常の箇所の塩基において塩基の対にミスマッチが生じることになる。このミスマッチが生じている２本鎖の核酸に本発明のミスマッチ認識分子を加えることにより前記してきた擬似的な塩基の対が形成され、この新たな対が形成された分子の有無を測定することにより採取された遺伝子の異常を簡便かつ高感度で検出、同定することができる。
【００３５】
前記した新たな対（本発明のミスマッチ認識分子とミスマッチの塩基との対）を測定するための手段としては、化学発光や蛍光、放射性同位体などの標識化によっても行うことができる。本発明のミスマッチ認識分子は低分子有機化合物であり、新たな対を形成した場合にはこの分子が核酸中に取り込まれるので、未反応の本発明のミスマッチ認識分子と核酸類の両者を比較的簡便に分離することができる。
また、前記したように本発明のミスマッチ認識分子を担体に固定化して使用することもできる。例えば、本発明の各種のミスマッチに特異的なミスマッチ認識分子をタイタープレートなどのプレートに固定化し、これに前記の２本鎖の核酸、好ましくは標識化された核酸を加え、数分間インキュベートした後、核酸類を除去すると本発明のミスマッチ認識分子と特異的に反応した核酸は固定化された本発明のミスマッチ認識分子にトラップされ、標識により検出、同定することができることになる。
【００３６】
また、本発明のミスマッチ認識分子を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の検出用チップの金属薄膜上に固定化することも可能である。このＳＰＲによる場合には、前記の２本鎖の核酸を含有する試料液を検出用チップの表面に流すだけで、ミスマッチの有無を特異的に検出することが可能となる。
さらに、他のおおくの検出手段に本発明のミスマッチ認識分子を応用することも可能であり、本発明はこれらの特定の検出手段に限定されるものではない。
【００３７】
【実施例】
次に、具体的な試験例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
実施例１（式（III）の化合物の合成）
次式に示す化学反応に従って標記の化合物を合成した。
【００３８】
【化７】
（式中のＢｏｃは、ｔ−ブトキシカルボニル基を示す。）
Ｎ−Ｂｏｃ化ジカルボン酸のスクシンイミジルエステル（３１３ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１５ｍＬ）に溶かし、２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジン（２９４ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４８時間反応後、後処理によりＢｏｃ化ジナフチリジンアミドを得た。これを４Ｎの塩酸を含む酢酸エチルに溶解し、室温で２時間反応すると、標記のジナフチリジンアミドが通算収率１３％で得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ：
8.26(d,2H,J=8.8Hz), 8.14(d,2H,J=8.8Hz), 8.11(d,2H,J=8.0Hz),
7.34(d,2H,J=8.0Hz), 3.20(t,4H,J=6.0Hz), 2.84(t,4H,J=6.0Hz),
2.68(s,6H)；
実施例２
５’端を３２Ｐでラベルした５２塩基のＤＮＡをＧ−Ｇ及びＧ−Ａのミスマッチが生じるようにハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡとした（図１の右側参照）。
この２本鎖のＤＮＡに種々の濃度の実施例１で得られた化合物を加えて、ＤＮａｓｅＩフットプリンティング滴定により調べた。
即ち、この２本鎖のＤＮＡ（＜４ｎＭストランド濃度）を、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（５ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．６）で種々の濃度に調整した実施例１で得られた化合物と共に、４℃で１２時間インキュベートした。これに、０．２ＵのＤＮａｓｅＩ（ＤＮＡ加水分解酵素）を加え、２５℃で８分間インキュベートした。その後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、これを、１２％ポリアクリルアミド及び７Ｍ尿素を含有するゲルを用いて電気泳動した。
この結果を図１に示す。
【００４１】
【発明の効果】
本発明のミスマッチ認識分子を用いることにより、従来の技術では達成できないグアニン−グアニンミスマッチなどのミスマッチしている塩基の対を高感度でかつ簡便に検出することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のミスマッチ認識分子によるミスマッチ部位の、ＤＮａｓｅＩによる切断の阻害効果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明のミスマッチ認識分子を用いた場合のＤＮａｓｅＩによる切断の阻害効果をしめすグラフである。
【図３】図３は、本発明のミスマッチ認識分子のミスマッチ部分における作用を模式的に示したものである。
Claims (8)
- 正常な塩基対を形成することができない塩基の対において、
次の一般式（II）、
Ｒ２は、炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基を示す。）
で表される化合物を用いて、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に疑似的に塩基対を形成させ、当該疑似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法。 - 一般式（ II ）で表される化合物が担体に固定化されている請求項１に記載の方法。
- 一般式（ II ）で表される化合物が標識化されている請求項２に記載の方法。
- 請求項１−３のいずれかに記載の正常な塩基対を形成することができない塩基の対に疑似的に塩基対を形成させ、当該疑似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に疑似的に塩基対を形成させるための次の一般式（ II ）
Ｒ ２ は、炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基を示す。）
で表される化合物からなる試薬。 - 試薬が、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に疑似的に塩基対を形成させるための塩基対生成剤である請求項４に記載の試薬。
- 請求項４に記載の試薬、及び検出、同定用の資材からなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対に疑似的に塩基対を形成させ、当該疑似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するためのキット。
- 次の一般式（II）、
Ｒ２は、炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基を示す。）
で表される化合物又はその固定化物。 - 一般式（II）で表される化合物が次の一般式（III）、
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