JP2004261083A

JP2004261083A - ミスマッチ認識分子およびミスマッチ検出方法、並びにその利用

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Publication number: JP2004261083A
Application number: JP2003054700A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Nakatani; 和彦中谷; Tetsuo Kobori; 哲生小堀
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2004-09-24

Abstract

【課題】少なくともシトシン−シトシンのミスマッチを有効に認識する化合物と、これを用いたミスマッチの検出方法、当該方法に用いられるキット、並びに塩基配列の異常の検出方法とを提案する。
【解決手段】次に示す一般式（Ｉ）
【化８】

（ただし、式中ＸはＮまたはＣＨを、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３はＨまたは炭素数１〜１０のアルキル基を、Ｒ_４およびＲ_５はＨまたは炭素数１〜５のアルキル基を示し、各アルキル基では、炭素原子が窒素原子、硫黄原子や酸素原子で置換されたり、アミノ基やカルボキシル基を含んだりしてもよい。）
で表される化合物は、少なくともシトシン−シトシンのミスマッチにおいて、擬似的な塩基対を形成することができる。そのため、この擬似的な塩基対の生成を検出または測定することで、上記ミスマッチの検出が可能となる。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、一本鎖の核酸がハイブリダイズして二本鎖を形成した場合に、正常な塩基対を形成することができない塩基対（以下、ミスマッチと称する）が生じたとき、当該ミスマッチに特異的に結合することが可能な化合物と、その利用方法に関するものであり、特に、シトシン−シトシンの間に擬似的に塩基対を形成することが可能な化合物（ミスマッチ認識分子）と、この化合物を用いたミスマッチの検出方法、当該方法に用いられるキット、並びに当該方法を用いたＤＮＡまたはＲＮＡにおける塩基配列の異常の検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸（ポリヌクレオチド）がハイブリダイズして二本鎖となる場合には、対をなす塩基が決まっている。具体的には、グアニン（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）にはチミン（Ｔ）が対をなす。それゆえ、核酸がハイブリダイズしている状態では、通常は、全ての塩基が上記のような対を形成しているが、状況によっては、当該核酸の塩基配列の一部が、このような対を形成することができない場合がある。
【０００３】
例えば、あるＤＮＡと他のＤＮＡをハイブリダイズし得る条件下においた場合に、これらＤＮＡ同士が全く相補的な塩基配列を有するものであれば、全ての塩基において上記のような対が形成される。これに対して、これらＤＮＡ同士は、ほぼ完全に相補的な塩基配列を有するものであれば、大部分の塩基はこのような対を形成することができるが、１個または数個の一部の塩基はこのような対を形成することができない。このように、通常の塩基対を形成することができない塩基対のことを、本発明ではミスマッチと称する。
【０００４】
ところで、最近、ゲノムの塩基配列中における微細な違い（１個または２個以上の塩基が異なること、多型）についての研究が行われてきている。上記多型の代表的な例としては、１個の塩基が通常のものとは異なっている多型、すなわち一塩基多型（ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、略称ＳＮＰ）が挙げられる。このような多型は、各種遺伝病の原因となり得ることが明らかにされており、さらには、各生物の個体差を生じさせる要因の一つとなるとも考えられている。したがって、このような多型について研究することはポストゲノムシークエンスにおいて、非常に重要なものとなっている。
【０００５】
ここで、例えば、上記ＳＮＰを含む遺伝子を正常な遺伝子とハイブリダイズさせると、大部分の塩基は正常な塩基対を形成し得ることができるために、ハイブリダイズして二本鎖の状態を形成することは可能である。しかしながら、上記ＳＮＰの部分については、ミスマッチが生じることになる。
【０００６】
上記ミスマッチを検出する方法としては、従来から、様々な技術が提案されており、近年では、（１−１）二本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション効率を比較する手法が一般的である。また、（１−２）ＭｕｔＳ等のＤＮＡの修復タンパク質（ミスマッチ認識酵素）が遺伝子損傷箇所に選択的に結合することを利用する手法も知られている。しかしながら、これらの方法は、それぞれ課題を抱えているため実用性に欠ける場合がある。
【０００７】
具体的には、（１−１）の方法では、ミスマッチを含むＤＮＡの塩基配列をあらかじめ知っておかなければならないために多大な労力が必要となり、多くの検体を処理する方法としては不適当である。また、この方法では、ミスマッチを検出する感度が実用的に十分ではない場合がある。さらに、（１−２）の方法では、ミスマッチの種類を区別して認識することが可能であるが、熱安定性を維持したり、酵素活性を維持する構造（フォールディング）を維持したりすることが難しく、使用上の制約が多い。
【０００８】
ところで、本発明者らは、以前に、次に示す各化合物を開発し、これら化合物を用いることで、ミスマッチやバルジ塩基に擬似的な塩基対を形成する技術を提案している。
（２−１）二本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子（特許文献１参照）。
（２−２）Ａ−Ｌ−Ｂの一般式で表され、Ａが正常な塩基対を形成することができない塩基の対における片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂが正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌが上記ＡおよびＢの化学構造部分を結合するリンカー構造を示すミスマッチ認識分子（特許文献２参照）。
【０００９】
上記（２−１）の化合物を用いれば、バルジ塩基の検出が可能となり、（２−２）の化合物を用いれば、ミスマッチ塩基の検出が可能となる。また、（２−２）の技術を応用することで、例えば、テロメアの一本鎖部分において安定なヘアピン構造を形成させ、染色体末端におけるテロメア領域の伸長反応を阻害することも提案している（特許文献３参照）。
【００１０】
【特許文献１】
特開２００１−８９４７８公報（平成１３（２００１）年４月３日公開）
【００１１】
【特許文献２】
特開２００１−１４９０９６公報（平成１３（２００１）年６月５日公開）
【００１２】
【特許文献３】
特開２００２−３００９４公報（平成１４（２００２）年１月２９日公開）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、遺伝子のＳＮＰを検出することは、ポストゲノムシークエンスにおいて一大トピックとなっているため、様々な方法が提案されているが、何れも十分な実用性を発揮できるレベルまで達していない。これに対して、上記（２−２）の化合物をミスマッチに結合する低分子リガンドとして用いる技術は、使用条件の制約も小さく、ミスマッチを簡便かつ高感度に検出することが可能となる。
【００１４】
ここで、上記（２−２）の化合物（低分子リガンド）としては、これまでミスマッチとしてグアニン−グアニンを認識する化合物と、グアニン−アデニンを認識する化合物とが開発されているが、他のミスマッチを有効に認識する化合物は未だ開発されていなかった。
【００１５】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、少なくともシトシン−シトシンのミスマッチを有効に認識する化合物を提案するとともに、この化合物を用いたミスマッチの検出方法、当該方法に用いられるキット、並びに当該方法を用いたＤＮＡまたはＲＮＡにおける塩基配列の異常の検出方法とを提案することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を鑑み鋭意検討した結果、特定の構造を有するウレイドナフチリジンダイマーまたはウレイドキノリンダイマーが、特にシトシン−シトシンのミスマッチにおいて擬似的な塩基対を形成して十分に安定化し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明にかかるミスマッチ認識分子は、上記の課題を解決するために、次に示す一般式（Ｉ）
【００１８】
【化３】

【００１９】
（ただし、式中ＸはＮまたはＣＨを示し、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は水素原子または炭素数１〜１０のアルキル基を示し、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３のアルキル基は炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよく、アミノ基および／またはカルボキシル基を含んでいてもよく、Ｒ_４およびＲ_５は水素原子または炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｒ_４およびＲ_５のアルキル基は炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよく、アミノ基および／またはカルボキシル基を含んでいてもよい。）
で表される化合物であり、正常な塩基対を形成することができない塩基の対であるミスマッチに、疑似的に塩基対を形成する化合物であることを特徴としている。
【００２０】
上記ミスマッチ認識分子においては、擬似的な塩基対を形成可能とする上記ミスマッチが、シトシン−シトシン、シトシン−チミン、シトシン−アデニンのうちの少なくとも一つであり、中でも、シトシン−シトシンのミスマッチにおいて最も安定した擬似的な塩基対を形成する。
【００２１】
また、本発明にかかるミスマッチ検出方法は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物を用いて、ハイブリダイズされた核酸に含まれる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対であるミスマッチに疑似的に塩基対を形成させる工程と、当該ミスマッチに形成された疑似的な塩基対を検出する工程とを含むことを特徴としている。
【００２２】
上記ミスマッチ検出方法においては、上記一般式（Ｉ）に示す化合物が、担体に固定化されて用いられてもよいし、上記一般式（Ｉ）で表される化合物が、標識化されて用いられてもよい。
【００２３】
さらに、本発明の利用方法の一例としては、ミスマッチ検出キットが挙げられる。このミスマッチ検出キットは、例えば、少なくとも、正常な塩基対を形成することができない塩基の対であるミスマッチを検出するために用いられ、上記のミスマッチ認識分子を、擬似的な塩基対を生成させる擬似塩基対生成剤として用いるものであればよい。
【００２４】
あるいは、本発明の利用方法の他の例としては、塩基配列の異常の検出方法が挙げられる。この検出方法は、例えば、検体となる一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡと、それに対応する正常な塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程と、上記ミスマッチ検出方法を用いて、上記ＤＮＡまたはＲＮＡにミスマッチが含まれるか否かを検出する工程とを含むものであればよい。
【００２５】
上記構成または方法によれば、例えば、ＳＮＰ等の多型といった遺伝子の個人的な相違を迅速かつ安価に検出することが可能となる。その結果、本発明は、遺伝子科学（ゲノムサイエンス）、遺伝子タイピング技術、ＳＮＰタイピング技術等に有効に用いることができるという効果を奏する。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明における実施の一形態について図１ないし図３に基づいて説明すれば以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
本発明にかかるミスマッチ認識分子（ミスマッチ検出分子）は、特に、シトシン−シトシンのミスマッチ（以下、説明の便宜上、Ｃ−Ｃミスマッチと略す）に結合して、擬似的な塩基対を安定して形成するウレイドナフチリジンダイマーまたはウレイドキノリンダイマーであり、例えば、このミスマッチ認識分子を用いて蛍光強度変化等を測定することで、Ｃ−Ｃミスマッチを簡便に検出することが可能となる。
【００２８】
なお、上記「擬似的な塩基対」とは、天然に存在する塩基対とは異なる塩基対を指すものであって、塩基対の結合強度の程度を指すものではない。すなわち、「擬似的な塩基対」とは、塩基対そのものの種類を示すものであって、「塩基対の結合強度が低く正常な塩基対を形成しているとは言いがたいが、塩基対を形成しているとみなすことができる」というような状態を示すものではない。
【００２９】
また、上記「擬似的な塩基対」に対応する「天然に存在する塩基対」とは、正常な塩基対であり、具体的には、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）、アデニン−チミン（Ａ−Ｔ）あるいはアデニン−ウラシル（Ａ−Ｕ）の各塩基対を指す。
【００３０】
また、本発明においては、「ハイブリダイズされた核酸」とは、互いに相補的な塩基配列を含んでおり、これら相補的な塩基配列によって一本鎖の核酸が二本鎖またはそれ以上の状態になっていることを指すものとする。上記核酸には、ＤＮＡもＲＮＡも含まれる。
【００３１】
＜ウレイドナフチリジンダイマー・ウレイドキノリンダイマー＞
本発明にかかるミスマッチ認識分子は、次に示す一般式（Ｉ）
【００３２】
【化４】

【００３３】
で表される化合物であり、正常な塩基対を形成することができない塩基の対であるミスマッチに、疑似的に塩基対を形成する化合物である。なお、式中ＸはＮまたはＣＨを示す。また、式中Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は水素原子または炭素数１〜１０の有機基を示す。同様に、式中Ｒ_４およびＲ_５は水素原子または炭素数１〜５の有機基を示す。
【００３４】
上記Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３の有機基は、例えばアルキル基等を挙げることができるが、このアルキル基では、炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよいし、アミノ基および／またはカルボキシル基を含んでいてもよい。同様に、上記Ｒ_４およびＲ_５の有機基も、例えばアルキル基等を挙げることができるが、このアルキル基も、上記と同様に、炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよく、アミノ基および／またはカルボキシル基を含んでいてもよい。例えば、Ｒ_１〜Ｒ_５の少なくとも何れかの有機基に硫黄原子が含まれている場合、すなわち上記一般式（Ｉ）の構造に−ＳＨ構造が含まれている場合、この構造を用いて、当該化合物を金属面に固定化することが可能となる。
【００３５】
この化合物は、Ｘ＝Ｎである場合には、ナフチリジン環とウレイド基とを含む構造を有している化合物（便宜上、ウレイドナフチリジンと称する）が二量体（ダイマー）を形成している。一方、Ｘ＝ＣＨである場合には、キノリン環とウレイド基とを含む構造を有している化合物（便宜上、ウレイドキノリンと称する）が二量体（ダイマー）を形成している。
【００３６】
そのため、本発明では、説明の便宜上、上記一般式（Ｉ）に示す化合物のうち、Ｘ＝Ｎである場合には、ウレイドナフチリジンダイマーと称し、Ｘ＝ＣＨである場合には、ウレイドキノリンダイマーと称し、これらをまとめて示す場合は、ミスマッチ認識分子と称する。
【００３７】
なお、ウレイドナフチリジンダイマーの構造の一例（式中のＲ_１がメチル基であり、Ｒ_２およびＲ_３が−Ｃ_２Ｈ_４−であり、Ｒ_４およびＲ_５がメチル基である場合）を次の式（Ｉ−１）に示し、ウレイドキノリンダイマーの構造の一例（式中のＲ_１がメチル基であり、Ｒ_２およびＲ_３が−Ｃ_２Ｈ_４−であり、Ｒ_４およびＲ_５が水素原子である場合）を次の式（Ｉ−２）に示す。
【００３８】
【化５】

【００３９】
【化６】

【００４０】
上記ミスマッチ認識分子の製造方法は特に限定されるものではないが、例えば、図１に示す２段階の合成ステップを経る製造方法を挙げることができる。なお、図１では、上記式（Ｉ−１）に示すウレイドナフチリジンダイマーの合成例を挙げるが、ウレイドキノリンダイマーも同様の方法で合成することができる。
【００４１】
具体的には、図１に示すように、まず、２−アミノ−７−メチルナフチリジン（図中、化合物１）をフェニルクロロフォルメイトと反応させ、２−アミノ−７−メチルナフチリジンにおける２位のアミノ基にフェニルクロロフォルメイトを導入した化合物（図中、化合物２）を合成する（図中（ａ）の矢印）。
【００４２】
次に、ビス（２−アミノエチル）メチルアミンと上記化合物２とを反応させることにより、ビス（２−アミノエチル）メチルアミンをリンカー構造とする化合物２の二量体構造を有するウレイドナフチリジンダイマー（図中、化合物３）を合成する（図中（ｂ）の矢印）。
【００４３】
ここで、化合物２を二量体構造にする過程で、リンカー部となる化合物の種類を変えることで、得られるウレイドナフチリジンダイマーにおけるリンカー部の長さ（すなわち、一般式（Ｉ）における−Ｒ_２−Ｎ（Ｒ_１）−Ｒ_３−の長さ）を任意に変えることができる。
【００４４】
もちろん、本発明にかかるミスマッチ認識分子の製造方法はこれに限定されるものではなく、当該技術分野で公知の方法を用いることができる。また、上記製造方法における各種の条件についても特に限定されるものではなく、好ましい条件を適宜選択して用いることができる。なお、代表的な条件の一例については、後述する実施例にて詳細に説明する。
【００４５】
上記ミスマッチ認識分子は、少なくとも、Ｃ−Ｃミスマッチにおいて擬似的な塩基対を安定して形成することが可能となっている。ただし、上記ミスマッチ認識分子は、後述する実施例からも明らかなように、上記Ｃ−Ｃミスマッチだけでなく、シトシン−チミン、シトシン−アデニンの各ミスマッチ（それぞれ、説明の便宜上、Ｃ−Ｔミスマッチ、Ｃ−Ａミスマッチと称する）とも擬似的な塩基対を安定して形成する。ただし、これらミスマッチにおける擬似的な塩基対の安定の程度は、Ｃ−Ｃミスマッチが最も高く、Ｃ−ＴおよびＣ−ＡミスマッチについてはＣ−Ｃミスマッチの安定化の程度よりも低いものとなっている（後述する実施例参照）。
【００４６】
＜擬似的な塩基対の形成＞
本発明にかかるミスマッチ認識分子が、比較的安定にミスマッチに取り込まれる状態を、図２に模式的に示す。図２の左側では、二本鎖のＤＮＡにおいてＣ−Ｃミスマッチがある部分を示している。このＣ−Ｃミスマッチ以外の箇所では正常な塩基対が形成されており、全体として見れば、それぞれのＤＮＡがハイブリダイズした状態にある。
【００４７】
これに、本発明にかかるミスマッチ認識分子（図中Ｎ_Ｃ−Ｎ_Ｃで示す）が加えられると、図２の右側に示すように、ミスマッチを形成しているシトシン（図中Ｃで示す）は何れも、ミスマッチ認識分子のシトシン認識部位（図中Ｎ_Ｃで示す）と対を形成する。
【００４８】
このとき、それぞれのシトシン認識部位は、適当な長さでかつ適当な自由度のあるリンカー部（図中−で示す）で結合されており、二本鎖のＤＮＡにおける鎖の中に、ほぼ他の正常な塩基対と同様な形で取り込まれていると考えられる。さらに、上記ミスマッチ認識分子における２つのシトシン認識部位は、前後の塩基によるスタッキング効果（塩基同士間の分子間力のようなもの）により安定化されているため、二本鎖のＤＮＡおける鎖の間に比較的安定に取り込まれると考えられる。
【００４９】
このような擬似的な塩基対の形成の機構は、本発明者らが以前に提案した前記特許文献２の発明における化合物と同様である。ここで、本発明にかかるミスマッチ認識分子は、図３に示すように、シトシンと相補的な水素結合が２ヶ所生成する（ただし、図３では、前記一般式（Ｉ）中のＲ_１がメチル基であり、Ｒ_２およびＲ_３が−Ｃ_２Ｈ_４−である場合のミスマッチ認識分子を例示している）。これにより、ハイブリダイズした二本鎖のＤＮＡに含まれるＣ−Ｃミスマッチに結合して安定化することが可能となる。
【００５０】
特許文献２では、本発明にかかるミスマッチ認識分子と類似した化合物が開示されているが、これら各化合物を比較すると、リンカー部が長くなっており、かつ枝分かれしている構造となっているか否かが大きく相違する点となっている。
【００５１】
本発明にかかるミスマッチ認識分子では、特許文献２に開示されている化合物に比べて、リンカー部にウレイド構造が含まれることとリンカー部が長いことから、塩基認識部位における水素結合の位置関係が微妙に異なり、その結果、図３に示すように、グアニン（あるいはアデニン）ではなく、シトシンと相補的な水素結合が２ヶ所生成すると考えられる。
【００５２】
したがって、本発明では、類似する構造において別の構造を有するリンカー部を採用することで、塩基認識部位がグアニンでなくシトシンを認識できるという、特許文献２に示される化合物からは容易に想到できない作用を得ることが可能となっている。この点は、特許文献２に、「ミスマッチの塩基がシトシンの場合には、塩基認識部位として２−アミノナフチリジン−４−オン又はその誘導体などが用いられる」と記載されていることからも明らかである。
【００５３】
＜ミスマッチ検出方法＞
本発明にかかるミスマッチ検出方法は、ハイブリダイズされた核酸に擬似塩基対生成剤を加えて、これにより形成された擬似的な塩基対を検出する方法であって、上記擬似塩基対生成剤として、上記ミスマッチ認識分子を少なくとも用いる方法であればよい。より具体的には、本発明にかかるミスマッチ検出方法は、少なくとも、擬似塩基対形成工程と、擬似塩基対検出工程とを有していればよい。
【００５４】
上記擬似塩基対形成工程は、ハイブリダイズされた核酸に擬似塩基対生成剤を加えて、当該核酸に含まれるミスマッチに擬似的な塩基対を形成させる工程であればよく、本発明では、上記擬似塩基対生成剤の主成分の一つとして、上記ミスマッチ認識分子（ウレイドナフチリジンダイマーまたはウレイドキノリンダイマー）を用いればよいが、本発明はこれに限定されるものではない。すなわち、本発明では、上記ウレイドナフチリジンダイマーまたはウレイドキノリンダイマーに加えて、他の低分子リガンドを擬似塩基対生成剤として併用してもよい。
【００５５】
本発明において擬似塩基対生成剤として用いることが可能な低分子リガンドとしては、前述した（２−２）の化合物（特許文献２に開示されている、式（ＩＩ）で表される化合物）を用いることができる。このような化合物としては、具体的には、例えば、次に示す式（ＩＩ）
【００５６】
【化７】

【００５７】
で表される化合物（特許文献２に開示されている、式（ＩＩＩ）で表される化合物）を挙げることができる。この化合物は、以下の説明では、便宜上、ナフチリジンダイマーと称する。
【００５８】
上記ナフチリジンダイマーは、本発明者らが以前に開発した化合物であって、グアニン−グアニンおよびグアニン−アデニンのミスマッチ（それぞれ、説明の便宜上、Ｇ−Ｇミスマッチ、Ｇ−Ａミスマッチと称する）に擬似的な塩基対を安定して形成する（詳細については、特許文献２参照）。
【００５９】
もちろん、本発明において擬似塩基対生成剤として用いられる化合物は、上記ミスマッチ認識分子や上記ナフチリジンダイマーに限定されるものではなく、Ｇ−ＧミスマッチやＧ−Ａミスマッチ以外のミスマッチを認識する他の化合物を用いてもよいことは言うまでもない。また、同じＣ−Ｃミスマッチを認識する化合物であっても、安定化の程度の相違に応じて、異なる種類の化合物を用いても構わない。
【００６０】
上記擬似塩基対検出工程は、ハイブリダイズされた核酸のミスマッチに、上記ミスマッチ認識分子により形成された擬似的な塩基対を検出する工程であればよく、その具体的な検出方法等については特に限定されるものではない。具体的には、例えば、上記ミスマッチ認識分子を標識化して用いることにより、擬似的な塩基対を検出する方法が挙げられる。
【００６１】
上記標識化の具体的な方法は特に限定されるものではないが、例えば、上記一般式（Ｉ）で表される化学構造の適当な位置に、放射性元素を導入したり、化学発光または蛍光を発する分子種を導入したりする方法が挙げられる。また、上記化学構造の適当な位置としては、例えば、リンカー部や、当該リンカー部から固定化のためなどのために延ばされた枝（後述）等を挙げることができる。あるいは、上記標識化としては、本発明にかかるミスマッチ認識分子やナフチリジンダイマー等の低分子リガンドを標識化するのではなく、ミスマッチの検出対象となる核酸（ＤＮＡやＲＮＡ等）の核酸部分を標識化する方法であってもよい。
【００６２】
上記ミスマッチの検出は、上記標識化のレベルを測定することにより達成されるが、上記標識化、すなわち放射線強度や発光または蛍光の強度の測定方法は特に限定されるものではなく、公知の方法や装置を用いて放射線強度や発光または蛍光強度を測定し、その強度の変化からミスマッチの有無を検出すればよい。
【００６３】
また、本発明にかかるミスマッチ認識分子と、上記従来のナフチリジンダイマーとを併用する場合、あるいは他の低分子リガンドと併用する場合には、各化合物における標識の種類を変えておけばよい。このように標識の種類を変えておけば、擬似塩基対生成剤として、例えば、本発明にかかるミスマッチ認識分子とナフチリジンダイマーを併用したとしても、それぞれの標識の種類が異なるため、本発明にかかるミスマッチ認識分子の標識からＣ−Ｃミスマッチの有無を検出することができ、ナフチリジンダイマーの標識からＧ−Ｇミスマッチの有無を検出することが可能となる。
【００６４】
なお、本発明にかかるミスマッチ検出方法では、上記擬似塩基対形成工程および擬似塩基対検出工程以外の工程が含まれていてもよい。
【００６５】
＜ミスマッチ認識分子の固定化＞
本発明にかかるミスマッチ認識分子の使用方法は特に限定されるものではなく、前記一般式（Ｉ）の化学構造のままで用いてもよいし、修飾された化学構造を有するもの（例えば、上述したように、リンカー部等に化学発光または蛍光を発する分子種を導入したもの等）であってもよいが、さらには、担体に固定化されて用いられてもよい。
【００６６】
ここで言う「固定化」とは、上記ミスマッチ認識分子が、担体となる任意の化合物に固定化されている状態であればよいが、具体的には、例えば、担体となる化合物と化学的に結合した状態等を挙げることができる。
【００６７】
上記担体としては、特に限定されるものではないが、例えば、ポリスチレン等の高分子（樹脂）材料を挙げることができる。化学的な結合としては、担体と直接に共有結合した状態となっていてもよいし、リンカー部から固定化のためなどのために延ばされた枝を介して結合させてもよい。このような「枝」としては特に限定されるものではないが、例えば、アルキレン基等を用いることができる。
【００６８】
固定化のより具体的な例としては、本発明にかかるミスマッチ認識分子をタイタープレートなどのプレートに固定化する。この場合、例えば、上記プレートに二本鎖の核酸、好ましくは標識化された核酸を加え、数分間インキュベートした後、核酸類を除去すると、変異を含む核酸はプレート上のミスマッチ認識分子と擬似的な塩基対を形成するため、プレート表面にトラップされることになる。しかも、核酸が標識されていれば、容易に変異を検出・同定することが可能となる。
【００６９】
＜ミスマッチ検出キット＞
本発明には、上述したミスマッチ検出方法だけでなく、該検出方法を実施するための検出キットが含まれる。具体的には、上述したミスマッチ認識分子を擬似塩基対生成剤として用いる構成であればよいが、さらに、上記ナフチリジンダイマーのような他の擬似塩基対生成剤を併用してもよい。これら複数の擬似塩基対生成剤を併用する場合、各擬似塩基対生成剤は、前述したように異なる標識化がなされていることが好ましい。
【００７０】
さらに、上記検出キットには、標識化のレベルを測定するための薬剤や、標識化のレベルのコントロールとなる比較用の標本（核酸等）類や、各種バッファー等が含まれていてもよい。
【００７１】
上記何れの構成であっても、前述したミスマッチ検出方法を実施するために好ましい薬剤や標本等が含まれている。そのため、上記検出キットを用いることで、本発明にかかるミスマッチ検出方法を容易かつ簡素に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【００７２】
＜塩基配列の異常の検出方法＞
本発明の代表的な利用方法としては、例えば、塩基配列の異常の検出方法を挙げることができる。この方法の具体的な構成は特に限定されるものではないが、例えば、ハイブリダイズ工程とミスマッチ検出工程とを含んでいればよい。
【００７３】
上記ハイブリダイズ工程は、検体となる一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡと、それに対応する正常な塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程である。
【００７４】
上記検体となる一本鎖のＤＮＡやＲＮＡとは、ＳＮＰ等の変異の有無を検査したい遺伝子（ＤＮＡ）またはその転写産物（ｍＲＮＡ）、あるいはｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡであればよい。この遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）は全長配列であってもよいし、一部の配列であってもよい。また、上記検体となる一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの具体的な状態は、特に限定されるものではないが、例えば、取り扱いやすいように、二本鎖の状態で任意の制限酵素で消化して適当な長さに切断してから、一本鎖に解離させてもよい。また、物理的に切断してから一本鎖にしてもよい。
【００７５】
上記正常な塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡとは、検体となるＤＮＡまたはＲＮＡの野生型の塩基配列（多型等の変異の無い塩基配列）と相補的な塩基配列を有するものであればよいが、例えば、５０塩基程度のオリゴマーを挙げることができる。このようなオリゴマーを用いることで、より効率的なハイブリダイズが可能となる。このとき、検体となるＤＮＡやＲＮＡも５０塩基程度に切断したものであってもよい。
【００７６】
また、ハイブリダイズの条件も特に限定されるものではなく、従来公知の条件（各核酸の混合、加熱、冷却等の操作）でハイブリダイズさせればよい。このようにハイブリダイズさせることにより、検体となるＤＮＡやＲＮＡに多型等の変異が含まれていれば、ハイブリダイズされた二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡにミスマッチが生じる。
【００７７】
上記ミスマッチ検出工程は、前述したミスマッチ検出方法を用いて、上記ＤＮＡまたはＲＮＡにミスマッチが含まれるか否かを検出する工程である。前段のハイブリダイズ工程により、得られる二本鎖のＤＮＡやＲＮＡにＣ−Ｃミスマッチが含まれていれば、当該ミスマッチに、本発明にかかるミスマッチ認識分子を加えることで、ミスマッチを検出することが可能となる。なお、ミスマッチ検出工程については、＜ミスマッチ検出方法＞にて詳細に説明したので、ここではその説明を省略する。
【００７８】
このように、本発明では、上記ミスマッチ認識分子を加えることにより、ミスマッチに擬似的な塩基対が形成されるため、このような擬似的な塩基対が形成された分子の有無を測定することにより、採取された遺伝子にＳＮＰ等の変異が存在するか否かを簡便かつ高感度で検出・同定することができる。また、標識化のレベル（放射線量や発光・蛍光の程度）から、ＳＮＰ等の変異を定量することも可能となる。
【００７９】
＜本発明のその他の利用方法＞
さらに、本発明にかかるミスマッチ認識分子は、低分子の有機化合物であり、擬似的な塩基対を形成した場合にはこの分子が核酸中に取り込まれるので、未反応のミスマッチ認識分子と核酸類とを比較的簡便に分離することができる。
【００８０】
加えて、本発明を用いれば、ハイブリダイズされた核酸にミスマッチが含まれている場合であっても、本発明にかかるミスマッチ認識分子とミスマッチを形成する各塩基との間に水素結合が形成される。その結果、ミスマッチ認識分子がミスマッチ間で安定化されるのみならず、ミスマッチの近傍、好ましくは隣接する塩基対にスタックされる。そのため、ミスマッチが存在している場合でもあって、比較的安定な二本鎖の核酸を得ることができる。したがって、本発明には、ミスマッチが安定化された状態にある、ハイブリダイズされた核酸が含まれていてもよい。
【００８１】
また、本発明を用いれば、従来の技術では達成できないミスマッチの塩基の対を高感度でかつ簡便に検出、同定または定量することができる。そのため、本発明は、ＤＮＡ損傷に伴う各種疾患の治療、予防又は診断に応用することも可能である。さらに、本発明では、ミスマッチを有する状態でもハイブリダイズした状態を比較的安定に存在させることができるため、ミスマッチを含有するＤＮＡの安定化を図る用途や、ミスマッチの発生原因やミスマッチの修復機構の解明等といった研究の材料として利用することも可能である。
【００８２】
あるいは、本発明にかかるミスマッチ認識分子を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の検出用チップの金属薄膜上に固定化することも可能である。この場合、二本鎖の核酸を含有する試料液を検出用チップの表面に流すだけで、ミスマッチの有無を特異的に検出することが可能となる。
【００８３】
以上、本発明の具体的な実施の形態について詳細に説明したが、本発明は上記実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明は、公知の多くの検出手段に応用することが可能である。そのため、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲内で、当業者が有する知識に基づいて、種々の改良、変更、修正を加えた態様で実施することができる。
【００８４】
【実施例】
以下、実施例および比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下の実施例では、本発明にかかるミスマッチ認識分子の一例として、前記式（Ｉ−１）で示すウレイドナフチリジンダイマーの結果のみを示すが、ウレイドキノリンダイマーの結果もほぼ同様である。
【００８５】
〔実施例１：ウレイドナフチリジンダイマーの合成〕
まず、フェニルクロロフォルメイト（ｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）２．４７ｍＬ（２１ｍｍｏｌに相当）を、２−アミノ−７−メチルナフチルピリジン（２−ａｍｉｎｏ−７−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ）１．５９ｇ（１０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）３．３４ｍＬ（２４ｍｍｏｌに相当）とのクロロフォルム−ピリジン溶液１００ｍＬ（１：１ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）に０℃で加えた。その後、この混合物を室温で２時間反応させた。
【００８６】
溶媒を留去した後、得られた粗生成物を重曹水、食塩水で洗浄し、その後、乾燥、濃縮した。得られた生成物をジイソプロピルエーテルから再結晶して化合物２（図１参照）を１．９８ｇ（７１％）得た。なお、このときのプロトンＮＭＲの結果を次に示す。
【００８７】
^１ＨＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，４００ＭＨｚ） δ８．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），７．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．８２（ｓ，３Ｈ）．
次に、ビス（２−アミノエチル）メチルアミン（ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１３μＬ（０．１ｍｍｏｌに相当）の溶液に、上記化合物２のクロロフォルム溶液を５６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌに相当）滴下した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成して、化合物３（図１参照）すなわちウレイドナフチリジンダイマーを３３ｍｇ（６８％）得た。なお、このときのプロトンＮＭＲの結果を次に示す。
【００８８】
^１ＨＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，４００ＭＨｚ） δ８．４２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．６１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．１３（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），３．９６（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），３．４６（ｓ，３Ｈ）２．９５（ｓ，６Ｈ）．
〔実施例２：ウレイドナフチリジンダイマーが認識するミスマッチの確認〕
次の各塩基配列を有し、ミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡを準備し、これら二本鎖ＤＮＡを１００ｍＭの食塩を含むカコジル酸バッファー（ｐＨ７．０）溶液として調製した。二本鎖ＤＮＡの濃度は、１００μＭ（塩基濃度）とした。なお、次の配列における（Ｘ，Ｙ）の塩基は、それぞれ、（Ｃ，Ｃ）、（Ｃ，Ａ）、（Ｃ，Ｔ）、（Ｇ，Ｇ）、（Ｇ，Ａ）、（Ｇ，Ｔ）、（Ａ，Ａ）または（Ｔ，Ｔ）とした。
【００８９】
５’−ＣＴＡＡＣＸＧＡＡＴＧ−３’
５’−ＣＡＴＴＣＹＧＴＴＡＧ−３’
上記二本鎖ＤＮＡ溶液に、上記ウレイドナフチリジンダイマーを１００μＭ加え、温度変化に対する２６０ｎｍの吸光度の変化を測定し、変曲点から融解温度Ｔｍ（ｄｒｕｇ（＋））を算出した。次に、ウレイドナフチリジンダイマーを加えない場合についても同様にして、融解温度Ｔｍ（ｄｒｕｇ（−））を測定し、これら融解温度の差（ΔΔＴｍ＝ｄｒｕｇ（＋） − ｄｒｕｇ（−））を求めた。
【００９０】
さらに、上記二本鎖ＤＮＡにおいて、ミスマッチを含まない完全に相補的な配列のもの（ＦｕｌｌＭａｔｃｈ）を準備し、上記と同様にして二本鎖ＤＮＡ溶液を調製した。すなわち、上記塩基配列において、（Ｘ，Ｙ）が（Ａ，Ｔ）または（Ｇ，Ｃ）のものについて二本鎖ＤＮＡ溶液を調製した。そして、これら二本鎖ＤＮＡ溶液について、上記と同様にして、融解温度を測定し、その差を求めた。結果を次の表１に示す。
【００９１】
【表１】

【００９２】
上記表１の結果から明らかなように、ウレイドナフチリジンダイマーはＣ−Ｃミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡを最も安定化し、次にＣ−ＡミスマッチおよびＣ−Ｔミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡを弱く安定化することが分かった。これに対して、他のミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡや、ＦｕｌｌＭａｔｃｈの二本鎖ＤＮＡは全く安定化しなかった。つまり、本発明にかかるミスマッチ認識分子は、Ｇ−Ｇ、Ｇ−ＡまたはＧ−Ｔミスマッチとは結合を形成せず安定化しなかった。
【００９３】
このように、本発明にかかるミスマッチ認識分子はＣ−Ｃミスマッチを特異的に認識するものであり、本発明者らが先に開発したナフチリジンダイマー（式（ＩＩ）参照）のようにＧ−Ｇミスマッチを認識しない。したがって、特許文献２に開示されているミスマッチ認識分子と本発明にかかるミスマッチ認識分子とは、安定化するミスマッチの種類が決定的に異なっていることが分かる。
【００９４】
【発明の効果】
以上のように、本発明では、特に、Ｃ−Ｃミスマッチに結合して、擬似的な塩基対を安定して形成するウレイドナフチリジンダイマーまたはウレイドキノリンダイマーをミスマッチ認識分子として用い、ハイブリダイズされた核酸中におけるミスマッチを検出するものである。それゆえ、本発明を利用すれば、例えば、ＳＮＰ等の多型といった遺伝子の個人的な相違を迅速かつ安価に検出することが可能となる。その結果、本発明は、遺伝子科学（ゲノムサイエンス）、遺伝子タイピング技術、ＳＮＰタイピング技術等に有効に用いることができるという効果を奏する。
【００９５】
したがって、本発明は、ポストゲノムシークエンスに関わる各種研究用の試薬類等を生産または製造する産業に適用できるだけでなく、ＳＮＰ等の多型を原因とする遺伝病の検査や、ハイブリダイズした核酸の安定化による各種疾患の治療等といった医薬品産業等にも適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかるミスマッチ認識分子の一例であるウレイドナフチリジンダイマーの合成経路を示す図である。
【図２】本発明にかかるミスマッチ認識分子がミスマッチにおいて擬似的な塩基対を形成する作用を模式的に示す図である。
【図３】本発明にかかるミスマッチ認識分子がシトシン塩基と擬似的な塩基対を形成する状態を化学構造に基づいて模式的に示す図である。

Claims

次に示す一般式（Ｉ）

（ただし、式中ＸはＮまたはＣＨを示し、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は水素原子または炭素数１〜１０のアルキル基を示し、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３のアルキル基は炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよく、アミノ基および／またはカルボキシル基を含んでいてもよく、Ｒ_４およびＲ_５は水素原子または炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｒ_４およびＲ_５のアルキル基は炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよく、アミノ基および／またはカルボキシル基を含んでいてもよい。）
で表される化合物であり、正常な塩基対を形成することができない塩基の対であるミスマッチに、疑似的に塩基対を形成する化合物であることを特徴とするミスマッチ認識分子。
上記ミスマッチが、シトシン−シトシン、シトシン−チミン、シトシン−アデニンのうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載のミスマッチ認識分子。
上記ミスマッチが、シトシン−シトシンであることを特徴とする請求項２に記載のミスマッチ認識分子。
次に示す一般式（Ｉ）

（ただし、式中ＸはＮまたはＣＨを示し、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は水素原子または炭素数１〜１０のアルキル基を示し、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３のアルキル基は炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよく、アミノ基および／またはカルボキシル基を含んでいてもよく、Ｒ_４およびＲ_５は水素原子または炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｒ_４およびＲ_５のアルキル基は炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよく、アミノ基および／またはカルボキシル基を含んでいてもよい。）
で表される化合物を用いて、ハイブリダイズされた核酸に含まれる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対であるミスマッチに疑似的に塩基対を形成させる工程と、
当該ミスマッチに形成された疑似的な塩基対を検出する工程とを含むことを特徴とするミスマッチ検出方法。
上記一般式（Ｉ）に示す化合物は、担体に固定化されて用いられることを特徴とする請求項４に記載のミスマッチ検出方法。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、標識化されて用いられることを特徴とする請求項４または５に記載のミスマッチ検出方法。
少なくとも、正常な塩基対を形成することができない塩基の対であるミスマッチを検出するために用いられ、
請求項１、２または３に記載のミスマッチ認識分子を、擬似的な塩基対を生成させる擬似塩基対生成剤として用いることを特徴とするミスマッチ検出キット。
検体となる一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡと、それに対応する正常な塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程と、
請求項４、５または６に記載のミスマッチ検出方法を用いて、上記ＤＮＡまたはＲＮＡにミスマッチが含まれるか否かを検出する工程とを含むことを特徴とする塩基配列の異常の検出方法。