JPS62167793A - 核酸配列の検出方法及びそのためのハイブリダイゼ−シヨンプロ−ブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、単鎖核酸、好ましくはＤＮＡを標識する手
段に関する。さらに詳しくは、この発明は。

標識成分を含有するアルキル化剤を使用して標識された
単鎖核酸を農造する方法に向けられ、ここで標識なる用
語は直接的又は間接的に検出され得帛することが意図さ
れる。さらに、この発明は、相補的核酸配列を含有する
標識され之単鎖ハイプリダイゼーションデロープを使用
して遺伝子又はｍＲＮＡのごとき核酸配列の存在を検出
する手段′関す机　　　　　　　　　　　　ヮトイ、。

〔従来の技術〕

生物医学研究及び組換ＤＮＡ技法においては、使用者を
しである量で存在する核酸を検出し、モニターし、位置
決定し又は単離することを可能にする指示グローブ（１
ｎｄｉｅａｔｏｒ　ｐｒｏｂｅ　）を手にすることがし
ばしば有用である。ハイブリダイゼーショングローブは
１例えば、検出されるべき核酸配列又は遺伝子に対して
相補的な核酸配列を含有する。このようなプローブは移
植片拒絶を担当する抗原、例えばヒト白血球抗原＜　Ｈ
ＬＡ　）　、又は遺伝的疾患１例えば錐状赤血球貧血を
コードする遺伝子の存在を検出するために使用されてい
る。例えば、　ｇｏｏｄ等４王胡、７８．６１６−６２
０（１９８１）は、■λ−Ｂ抗原の几めのｃ　ＤＮＡク
ローンの単離を記載している。これらのクローンは、所
望のＩ（ＬＡ抗原をコードするｍ１ＷＡを含有するｍＲ
ＮＡ混合物からｃ　ＤＮＡ金合成し、このｃＤＮＡ　ｔ
ｌ−ベクターに挿入し、細菌宿主を形質転換し、そして
所望のＤＮＡセグメントを含有する形質転換体クローン
を該所望のＤＮＡ配列に対して特異的なオリゴヌクレオ
チＰプローブによりプローブすることにより調製された
。

Ｐｌｏｅｇｈ等、　ＰＮＡＳ、　７７、６０８１−６０
８５（１９８０）もまたＨＬＡ遺伝子配列のためのｃ　
ＤＮＡグローブのクローニングを報告している。さらに
、Ｆａ　ｌｋｏｗ等の米国特許７ｆＬ４，３５８，５３
５は、感染性病原像生物を該病原微生物に含まれる核酸
に対して相補的な標識された核酸プローブを用いて検出
する方法を記載している。最近まで、最も鋭敏でありそ
してそれ故にこの目的の九めに有用である材料は放射性
標識された核酸、例えば、水素（３Ｈ）、リン（３２Ｐ
　）又はヨウ素ＣＩ）等の同位元素により標識された核
酸であり之。Ｂｒｏｗｎ等＋Ｇｅｎｅ。

２０．１３９−１４４（１９８２）はトリメチル！ソラ
レンを用いる放射性ＲＮＡ−ＤＮＡハイプリダイゼーシ
。

ンプロープの安定化を教示している。

しかしながら、このような放射性化合物は、安全のため
の厳重な予防措置を必要とし、装置が高価であり、健康
モニターサービスが必要であり。

廃棄物の処理がやっかいであり、そして材料が不安定で
あるために使用コストが高い等１種々の欠点を有する。

従って、鋭敏なグローブを提供するであろう核酸用の適
当な非放射性標識を検索する強い動機が存在する。

すでに知られている様に、ハゲテンはキャリヤーに結合
した場合忙免疫反応を開始することができ、従って標識
化及び同定のために作用である。

すなわち、例えば、ハゲテンで標識されたＤＮＡは抗体
によシ検出することができる。

細胞上又は細胞中の特定の蛋白質、脂質又は炭水化物の
位＃を視覚的に決定するため、及びＤＮＡを標識するた
めに非放射性ビオチン−アビノン複合体を使用する方法
が開発されている。例えば。

Ｍａｎｎｉｎｇ等、　ＣｈｒｏｍｏｓｏＭａ＋　５３　
＋　１０７　（］　９７５　）は、ハイブリダイゼーシ
ョングローブとして塾払に化学的に架橋されたビオチン
化蛋白質チトクロームＣを用いて電子顕微鏡によりリボ
ゾーム遺伝子の染色体位置を決定した。Ｌａｎｇｅｒ等
＋　Ｐｒｏｃ・Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ、　７８．６６３３−６６３７（１９８１）は、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩを用いてビオチンのごとき官能基を
含有する核酸類似体を酵素的に導入することによりＤＮ
Ａ　ｉ標識する方法を記オチン化核酸によｆｉ　ＤＮＡ
グローブを標識するためＫこの方法を使用している。さ
らに、アセトキシ水銀化反応を用い、これにより共有結
合した水銀原子をピリミジン環の５位、プリン環のＣ−
８位又は７−ｆアザグリン環のＣ−７位に導入すること
によシ化学成物をピリミジン環及びプリン環に付加する
ことが、今やよく知られている。Ｗａ　ｒ　ｄ等のヨー
ロッノ特許出願公開屋０，０６３，８７９は、それ自体
標識であるか又は次に標識化合物と反応することができ
る水銀化中間体が形成される反応によるヌクレオチド誘
導体の調與を記載している。

この誘導体は、プリン又はビリミソンに共有結合により
付加されておシ、そしてアビノン又は抗体のごとき蛋白
質と相互作用するであろうビオチン、イミノビオチン、
リポ酸又は他のラベルを含有する。アビノンがリンクし
た酵素複合体によりビオチンが特異的に結合される場合
１発色性基質における色の変化として検出が行われる。

アビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体を用いてハ
イブリダイゼーション後のビオチン化ＤＮＡプローブを
検出する場合、　Ｐ標識されたグローブを検出するため
に使用されるオートラジオグラフィーの感度に近い感度
が示されている。この方法においては１次に標識化核酸
がＤＮＡに導入され、ＤＮＡグローブが標識される。

さらに、ＤＮＡの分子構造を研究するための方法が存在
する。例えば、単鎖ＤＮＡの存在下で２本鎖ＤＮＡに導
入され得る平らなフロクマリン分子のクラスに属するプ
ソラレン類は、長波長（ン３５０　ｎｍ）紫外線により
活性化され７’（場合、ＤＮＡに共有結合し、そしてこ
れを架橋する。共有結合は２つの工程段階、すなわち（
１）核酸の塩基への平らな構造のグソラレンの最初の非
共有結合によるグソラレンー核酸複合体の形成、及び（
２）この複合体への適当な波長の光の照射によるプソラ
レン分子と核酸鎖の一体取分として存在するピリジンヌ
クレオチドとの間の共有結合の形成を含む。

この共有結合は、ウィルスへの核酸のパッケージングの
ごときＤＮＡの二次構造のインビボ研究を可能にする。

ＤＮＡを共有結合的に結合するための４．５’、８−ト
リメチルプンラレンの４７−アダクトの使用がＨｅａｒ
ｓｔ等の米国特許Ａ４，１２４，５９８に記載されてい
る。Ｈ＠ａｒｓｔ、　Ｒａｐｏｐｏｒｔ等はＤＮＡ及び
ＲＮＡへのプソラレンの導入を広範に研究した。

Ｓｏｎｇ等、　ＡＮＹＡＳ　（１９８０）３５５−６７
　、及びＨｙｄａ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、
　１７（１９７８）１２５１−７は二次構造を研究する
ためのプソラレンの使用を開示している。

Ｓｃｈｗａｒｔｚ等、　Ｃ８ＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　
ＳｙｍｐｏｓｉｕｍＸＬＶＩ［は１種々のグンラレン含
有化合物を用いるＤＮＡ又は蛋白質によるＤＮＡ　メ架
橋を開示している。

５ａｆｆｒａｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓ
ｅｔ、Ｕ、Ｓ、ん。

７９．４５９４−４５９８（１９８２）は、ＤＮＡの構
造的分析を可能にするＤＮＡの部位特異的プソラレン架
橋のためのチオール基を含有するこれらの化合物の１つ
の使用を記載している。この方法においては、グラスミ
ドＩ）ＮＡ分子が制限部位の近傍に導入された水銀化さ
れたヌクレオチドを有し、この結果プソラレンがＨｇ−
８結合を介して塩基に向けられる。反応台底における水
銀化化合物の使用は余分な出費をもたらし、そして水銀
の毒性の観点からの安全の之めの予防措置を必要にする
。

Ｌｅｔ　Ｓｉｎｇｅｒ等の米国特許Ａ４，５４７，５６
９は、おそらく二次構造の決定の念め、ポリヌクレオチ
ド中の特定の部位にマーカー（例えば、螢光グローブ）
を導入するための薬剤としてフェナンスリジクム成分を
含む２官能挿入剤（１ｎｔａｒｃａｌａｔｏｒ　）を記
載している。

核酸の二次構造の研究におけるこれらの使用に加えて、
グソラレン誘導体の商業的用途は、ある種の皮膚疾患の
治療における。及びウィルスを不活性化してワクチンヲ
製造するためのこれらの使用を含む。

ＤＮＡ　ｉラベルする化合物の他の使用は染色体のバン
ド化及び染色における使用である。文献に記′　載され
ている１例は、ｖ、Ｇ、　Ｄｅｖ、等、　Ｌａｎｃｅｔ
（英国）１．１２８５（１９７２年６月１０日）の論文
に記載されているように、染色体のバンド又は領域を分
別染色するためのギームザ（Ｇｉｅｍｓｉ）試薬の使用
である。染色体は特徴的バンド・臂ターンを百するため
、この方法を使用して染色体を識別することができる。

染色体を識別するこの能力は染色体異常の研究において
非常に有用であった。

例えば、個体が染色体２１について三染色体性（ｔｒｉ
ｓｏｍｉｃ）であることを決定することによりダウン症
候群を診断することができる。

ヨーロッ・々特許出願４１３１．８３０は単鎖核酸及び
２本鎖核酸をラベルするためのアルキル化挿入剤の使用
をやや詳細に開示している。１９８５年６月２０日に公
表されたＰＣＴ　ＷＯ３５１０２６２８は。

グローブの単鎖領域と標的分子との開の共有結合架橋を
形成することができる標識され九分子を担持する単鎖ハ
イブリダイゼーシヨンプローブを開示している。米国特
許４４，５８２，７８９　、及び米国特許Ａ４，６１７
，２６１は、この発明において使用てれる標識試薬によ
る部分的２本鎖核酸の２本鎖領域の標識化を開示してい
るが、単鎖核酸の標識化は開示していない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

既存の標識化プローブに関連する欠点を除去するため１
本発明は、水銀化された中間体又は酵素を使用するので
はなく、単鎖核酸に標識取分を導入するために非共有結
合及び共有結合の両者を行うことができる特異的標識化
合物を用いる単純で安定な標識化単鎖核酸ノ１イプリダ
イゼーシ、ン！ロープを輿造するための実施可能な手段
を提供するものである。

他の利点として１本発明の方法は、放射性標識の欠点を
回避するため、単鎖核酸を非放射性標識するために好適
に使用される。

〔問題点を解決するための手段〕

特に、この発明は単鎖核ｇ、を標識する方法でありて。

（＆）単鎖核酸を１次の式： ％式％ 〔式中、Ａはアルキル化成分であり；Ｂは次の式：−Ｙ
−（ＣＨ２）２−０−（（ＣＨ２）ＸＯ）ｙ−ＣＨ２Ｃ
Ｈ２−Ｎ−（式中、ｙＦｉｏ％ＮＨ又はＮ−ＣＨｏであ
り、Ｘは１〜４の数であり、そしてｙは２〜４の数であ
る）で表わされる２側方機成分であり；そしてＬは１価
標識成分であり；ここで、Ｂは前記アルキル化及び標識
流分の部分を含まない〕 で表わされる１又は複数の標識用組成物と接触せしめる
ことにより、該標識用組成物のアルキル化成分と前記核
酸との複合体を形放せしめ；そして（ｂ）　　該複合体
を活性化して前記核酸への前記アルキル化成分の共有結
合を誘導する；段階を含んで放る方法に関する。

アルキル化成分は好ましくは４′−メチレン置換プソラ
レンである。

こうして得られた標識された核酸は、長さ及び特異性を
異にするこのように標識されｆ？：、２棟類以上の核酸
が一緒に混合されれば、マーカー混合物として使用され
得る。

他の観点において、この発明は、相同な核酸配列を検出
する定めの標識された単鎖核酸ノ・イブリダイゼーショ
ンプロープの製造方法であって、（、）　　検出される
べき核酸配列とノ・イブリダイズすることができる単鎖
領域を含んで成る単鎖核酸を、前記の１又は複数の標識
用組成物と接触せしめることにより、該標識用組成物の
アルキル化成分と前記核酸との複合体を形放せしめ；そ
して（ｂ）　　該複合体を活性化して前記核酸への前記
アルキル化成分の共有結合を誘導する：段階を含んで成
る方法に関する。

好ましくは、これらの方法は非放射性標識された試薬を
用いて行われる。

この発明はさらに、ハイプリダイゼーシ冒ンプロープそ
れ自体を含み、このグローブは上記のノ・イブリダイゼ
ーション領域ＩＮする単鎖核酸を含んで成り、ここで、
このグローブは１又は複数のアルキル化成分に共有結合
しており、そしてアルギル化成分は２側方機成分に結合
しており、この有機成分は今度は標識成分に結合してい
る。２側方機成分は次の式二 ■ −ｙ−（ＣＨ２）２−ｏ−（（ＣＨ２）ｘＯ）　ｙ−Ｃ
Ｈ２ＣＨ２−ＦＩＪ−（式中、Ｙは０１ＮＨ又はＮ−Ｃ
Ｈｏであり、Ｘは１〜４の数であり、セしてｙは２〜４
の数である）で表わされる。

他の観点において、この発明はプローブの検出方法を提
供し、この方法は１分析されるべきサンプルの核酸を露
出しそして分離し、この鎖をノ・イブリダイゼーション
グローブと接触せしめ、そしてこのグローブへの相同な
核酸配列のＩ・イブリダイゼーシ、ンが起つ友か否かｔ
−グローブ上の標識取分により検出することを含んで放
る。これは、ハイブリダイゼーションの後にグローブを
グローブの標識成分が同定され得る手段にかけ、そして
適当な同定手段を用りて標識成分を同定することにより
連取される。このような技法の例には、分光的、光化学
的、化学的、免疫化学的又は生化学的手段が含まれ１例
えば、グローブの標識成分と複合体を形成することがで
きるポリペブチビルクチン又は抗体が使用される。好ま
しい生化学的手段が使用される場合、適当な条件下でグ
ローブをこれと複合体を形成することができるポリペグ
チド、レクチン又はラベルと接触せしめることによシ複
合体を形成せしめる。このポリペプチド。

レクチン又は抗体は、複合体が形成されそして該複合体
が適当な技法を用いて検出される場合に検出され得る標
識であることができ、又は標識を含むことができる。

この発明の他の態様においては１又は複数の核酸配列、
好ましくは病原微生物に特徴的であるか、又は増幅され
た発癌遺伝子、ＨＬＡの類別もしくは遺伝的疾患に関連
する配列が検出され、この検出方法は、 （、）　　検出されるべき核酸を含有するサンゾル（こ
のサングルは一般に細胞１体液、又はウィルスサンプル
もしくは組織サンプルから成る）を、該サンプル中の核
酸を露出しく例えば、サングルの細胞、体液、ウィルス
キャプシド、又は組織を開く）そして核酸の鎖を分離す
るのに十分な試薬の有効量と接触せしめ； （ｂ）　　段階（−）の前、この段階中又はその後に、
前記サンプルを不活性支持体忙付着せしめ；（、）　　
前記付着したサンプルを、実質的に単鎖形の前記１又は
複数の核酸を前記支持体に固定するのに十分な試薬の有
効量と接触せしめ；（ｄ）　　前記固定された単鎖形核
酸を前記のハイプリダイゼーシ、ングローブの有効量と
、ハイツリダイゼーシ、ン条件下で接触せしめ；そして
、（、）　　相同な単鎖核酸配列のハイツリダイぜ−シ
１ンを、前記プローブ上の標識成分だよシ検出する； ことを含んで成る。

〔具体的な説明〕

この明細書中に使用される下記の用語は、それぞれ下記
のごとく定義される。

１スイーサーアーム”は、この発明のアルキル化底分及
び標識成分と化学的に非反応性でありそしてこれらの部
分を含有せず、そして次の式：％式％ （式中、ＹはＯ，ＮＨ又はＮ−ＣＨｏであり、Ｘは１〜
４の数であり、セしてｙは２〜４の数である）で表わさ
れる２個有機取分に関する。スペーサーアームの目的１
″：Ｊアルキル化成分と標識成分との間に化学的連結を
与え、標識が抗体、他の検出用ポリペプチド又は化学薬
剤のごとき検出手段と、妨讐ヲ伴わないで容易に相互作
用できるようにすることでちる。スペーサーアームの直
鎖（主鎖）中の原子の数は一般に使用される特定の標識
成分に依存する。鎖は、標識成分への検出複合体の接近
を許容するために、すなわち核酸による妨害を回避する
ために、十分な長さでなければならない。

スペーサーアームの分子量限界（Ｘ及びｙの値）はこれ
に含有される原子のタイプ及び溶解性条件により決定さ
れるであろう。例えば、ポリエチレングリコールの分子
量が増加するに従い、これに由来するス（−サーアーム
は室温において水溶性が低くなり、そして一層ワックス
状になるであろう。従うて、これはこの発明において有
用性が少ない。ス（−サーアームの最大分子量は一般に
、その適当な水溶性及び流動性を保証するため約１００
０である。

″′標Ｒ取分”は、検出可能なシグナルを生成すること
ができる。すなわちシグナルを発生する検出手段により
少量で検出され得る１画成分を意味する。適当なこのよ
うな手段の例には、分光的又もしくは光化学的手段、例
えば螢光もしくはルミネッセンス、あるいは生化学的、
免疫化学的又は化学的手段、例えば、検出分析化合物と
の接触、又は検出可能な複合体を形成するポリペプチド
もしくはポリペプチド／酵素混合物との反応の際の物理
的、生化学的、免疫化学的又は化学的性質の変化が含ま
れる。従って、この明、１−Ｉｉｌ曹において使用する
場合、“標ｍ′なる語は、直接検出され得る面分１例え
ば放射性同位元素又は螢光物質、層び検出可能な生成物
を形成する反応を介して間接的に検出される反応性成分
２例えば基質と反応して分光光度計により検出され得る
生成物を形成する酵素、の両成分を包含する。なお、標
識試薬は放射性同位元素のごとき放射性標識成分を含有
することができるが、しかしこの発明の好ましいハイプ
リダイゼーシ、ンプロープは、放射性化合物の取扱に伴
う欠点を回避するため非放射性標識される。

１体液“は、ヒトもしくは動物の体又は植物に由来し、
そして例えば血清、脳を髄液、羊水等を意味する。

”組織”は、生物学的組織抽出材料を意味し。

定義により細胞性である必要はない。

°”アルキル化成分′は核酸と最初に複合体を形成する
（非共有結合により結合する）成分に関する。活性化の
後、アルキル化成分は核酸単鎖に共有結合するか又はし
ないであろう。このような成分は、挿入（１ｎｔｅｒ　
ｃａｌａｔｉｏｎ　）を伴わないで核酸の塩基と共有結
合を形成することができる。この成分が由来する適当な
アルキル化化合物の例は。

Ｌｏｗｎ等、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、ｓ　
５４＋　１１０ｆｆ（１９７６）に記載されているマイ
トマイシンＣ；Ｌｏｗｎ等、　Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ、、　１
０４．３２１３−３２１４（１９８２）に記載されてい
るカルジノフィリン（ｃａｒｚｌｎｏｐｈｉｌｌｎ　）
　Ａ　：　Ｖｏｌｌｅｙ等。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２２　、３２２６−３２
３１　（１９８３）に記載されている３、５−ジアジド
−５−エチル−６−フエニルフエナンスリジニウム；プ
ソラレン化合物及びその誘導体；並びに複合体の形成を
許容する構造ｔＯＷする。考案し得る他の化合物を包含
する。この発明の好ましい成分は共有結合せず、又は、
もし共有結合すれば、４′−メチレン置換！ソラレン成
分、例えば、カリホルニア、エメリービルの皿Ｉ　Ａｓ
５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃにより販売されそしてその１
９８３年１０月１日の定価表に記載されているプソラレ
ン化合物に由来する成分である。４′−メチレン基はス
ペーサーアームとの連結部として機能する友めに存在す
る。このような適当なプソラレン取分の例には４′−メ
チレン置換グンラレン、４′−メチレン置換−５−メト
キシデンラレン、及び４′−メチレン置換−４，５’、
８−）リメチルグソラレンが包含される。この発明の最
も好ましいプソラレン氏分は４′−メチレン置換−４，
５’、８−トリメチルプソラレンである。

“アルキル化成分と核酸との複合体の活性化“は、核酸
鎖への標識試薬のアルキル成分の共有結合を誘導するた
めに使用される手段を意味する。

例えば、プソラレン成分、及び３．５−ジアジド−５−
エチル−６−フエニルフエナンスリジニウムに由来する
成分は紫外線照射による活性化を必要とする。マイトマ
イシンＣはその還元により活性化される複合体を形成す
るであろう。カルジノフィリンＡはそのプロトン化によ
り活性化される（＃１活性化）複合体を形成するであろ
う。すなわち、試薬のために使用される成分のタイプに
対して適切な任意の手段をこの目的のために使用するこ
とができる。

この発明の＋Ａ４Ａ４系の標識成分は、検出手段により
検出きれ得るシグナルを生成することができる。このよ
うな検出手段の例には１分光法、例えば螢光及びルミネ
ッセンス、光化学、放射能、生化学的手段、免疫化学的
手段、化学的手段等が含まれる。好ましい手段には、ポ
リペプチド、レクチン又は抗体と関連する酵素の存在下
又は非存在下でのポリーｅｆチド、レクチン又は抗体と
の検出可能な複合体の形成が含まれる。使用する標識成
分に依存して、この目的のために有用なポリペプチドの
例は、ビオチンが標識取分である場合に酵素と複合体を
形成するアビジン又はストレプトアビジンである。適当
な抗体は１例えば抗ビオチン抗体、又は標識成分がノニ
トロフェノールである場合には抗ジニトロフェノール抗
体を包含するであろう。糖蛋白質であるレクチンは、標
’Ｂ”１ｔｆｆｉＬ分として炭水化物が使用される場合
に、検出手段として使用されるであろう。

検出手段は、もしそれが抗体、レクチン、又は標識成分
と複合体を形成することができる他のポリペプチドでお
れば、検出可能な変化を生じさせることができる物質と
リンクされるであろう。この様な物質の例には、発色性
基質又は螢光原基質を有するアルカリ性ホスファターゼ
のごとき酵素、又はルミネッセンスを発生することがで
きるルシフェラーゼが含まれるであろう。標識成分は、
上記の検出性を有する任意の基であり、これＫは。

適当な担体Ｉ／ｃ結合し之場合にのみ免疫原性であるが
しかし対応する抗体と反応して検出可能な複合体を生反
することができるハプテンが含まれる。

適当な標識成分の例には次の弐により示されるものが含
まれる。

Ｈ ＮＯ□ 芳香族基を含有する標識成分は核酸中に挿入される傾向
があるため、好ましい標識成分は非芳香族性であり、そ
して最も好まし１標Ｒ成分はピオチンである。

この発明のプローブを調製する友めの好ましい標識試薬
の例には１次のものが含まれる。

以下余白 λ 工 ０＝ＣＪ 一２ 頴 工 ヱ ○ 工 冒 〜 ヱ 匡−Ｚ （式中、Ｒ及びＲ′は独立に−Ｈである。）以上余日 Ｚ　＝　（Ｊ 閏−Ｚ 巴 工 工 薔 工 巴 匡−Ｚ （Ｒ及びＲ′は上に定義し九通りである。）以下余日 完 と ２τ 巴 〇 巴 乏 ＣＪ＝０ 巴 ♂ ２； 巴 Ｏ＝ω Ｚ−閃 己 巴 巴 壱 千 巴 巴 Ｚ−閃 工 ０＝０ ２−平 巴 巴 〇 国 壱 τ 閃 大 。＝巴−壱 匡 ０＝（Ｊ ２−平 匡 閃 〇 工 工 工 工 ○ （上記の式において、ｎは１〜４の整数であり、そして
最も好ましくは２である。） ｎが２である化合物は製造しやすく、そして１１１ＪＡ
への改良され次導入を示すため最も好ましい。

ｎが２である。最後から３番目及び最後に挙げた化合物
が特に好ましい。

上記の試薬は、米国特許４４，５８２，７８９にすでに
記載されているか、又は後の例に記載する種々の方法に
より製造することができる。

最後に挙げた、係属中の出ｗｉＫは具体的に記載されて
いない化合物１−（ビオチニルアミノ）−１３−（４，
５’、８−トリメチルプソラレンー４′−イル）−３，
６，９，１２−テトラオキサ−トリデカンは、テトラエ
チレングリコール又はさらに高級な同族鎖の適当なポリ
エチレングリコールをピリジン中でパラ−トルエンスル
ホニルクロリド°と反応せしめてモノトシレートアルコ
ールヲ得、リチウムアジドと共に加熱することにより対
応するアジ−アルコールを得１次に対応するアミノアル
コールに還元することにより裏遺される。次に、このア
ミノアルコールを、テトラヒドロフラン中でジーｔａｒ
ｔ−プチルジカルゲネートを用いて、モノーｔａｒ’ｔ
−プチルオキシ力ルデニル保３誘導体に転換する。次に
、この保藤された銹導体をクロロメチルトリオキサレン
と反応せしめることにより次のプソラレン誘導体を得る
。

以下余θ ０＝（Ｊ 臣 閑 頴 膚 閤 閤 工 閑 （最初にテトラエチレングリコールが使用すれる場合、
ｎは２である。）この化合物は、暗所にてアセトニトリ
ル中トリフルオロ酢酸の存在下で。

上記のように第１アミン停止前駆体となり、これは次に
例えばビオチン又は他の適当な標識のＮ−ヒドロキシサ
クシンイミドエステルと反応ｆることかできる。

上記の試薬の１つの有用な用途は単鎖核酸の標識化にお
いてである。一般にこの技法Ｆｉ２つの段階、す々わち
（１）核酸を１又は複数の試薬と接触せしめて、そのア
ルキル化成分に前記二者間の複合体の形成を行わせ、そ
して（２）この複合体を活性化して試薬のアルキル化成
分を核酸単鎖に共有結合せしめる段階を用いる。

第１段階は好ましくは、核酸を試薬と共に約０℃〜５０
℃、好ましくは約４℃〜２０℃にて、緩衝剤を含有しそ
して約６〜９、好ましくは約６〜８のｐｌ（を有する媒
体中でインキュベートすることにより行われる。このイ
ンキュベーションは一般に、約１０分間以上な必要とし
ない。緩衝液は、この目的のために有用な任意の緩衝液
、例えば１０　ｍＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣｔ（ＰＨ７，０）
及びｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡから成ることができる。

核酸をアルキル化剤と複合体を形取するために十分な時
間インキュベートし友後、核酸を含有する複合体を、同
じ媒体中で、アルキル化剤に依存して還元、照射、プロ
トン化等の手段により、共有結合を保証するのに十分な
時間及び適当な条件下で活性化する。熟練した実施者は
、そのアルキル化性が従来技術において記載されている
特定の成分が与えられれば、特定の条件が必要であるこ
とを認識するであろう。この成分がグソラレン誘導体で
あれば、この複合体を紫外線により、好ましくは約３５
０〜３９０ｎｍ、そしてさらに好まし再結合を保証する
。

標識成分が例えば分光的、光化学的、化学的。

免疫化学的又は生化学的手段により検出され得るように
、得られた核酸は標識されるであろう。すなわち、標識
された核酸は例えば螢光を刺激するために紫外線にかけ
られ、又は標識試薬中の標識成分に依存してプリー！！
プチド、レクチン又は抗体と接触せしめられるであろう
。さらに、１９８３年１月２６日に公開されたヨーコツ
／４ｆｉ＋許出願黒０．０７０，６８６中及び１９８３
年１月２６日に公開されたヨーロッパ特許出願４０，０
７０，６８５中に記載されているように、検出手段は、
化学ルミネッセンス触媒の存在下で光反応ｆｔ誘導する
ために適当な化学ルばネッセンス試薬との組合わせにお
いて、非放射性エネルギー移行を許容する程十分に相互
に接近している吸収−放射成分と化学ルミネッセンス触
媒との組合せから放ることができる。好ましくは、検出
手段は、放射性グローブに付随する困難を除去するため
非放射性である。

これらの標識試薬の核酸への導入の程度は、実験の部で
記載するように、化合物へのトリチウム原子の導入によ
り測定することができる。トリチウム化され友試薬の核
酸への導入は液体シンチレーション計測により、又はオ
ートラジオグラフィーにより決定することができ、この
検出技法は当業界において知られている。

この技法により標識され得る核酸自体は任意の単鎖核酸
、例えば単鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。好
ましくは、核酸はＤＮＡである。複合体形成及びアルキ
ル化用インキュページ、ン液中には・１より多くのタイ
プの単鎖ＤＮＡが存在することができる。

この発明の方法の特に有用な用途は、核酸配列（ＲＮＡ
及び／又はＤＮＡ　）　、例えば病原微生物に特徴的な
配列又は遺伝性疾患を担当するかもしくはこれに関連す
る配列の検出のための、標識された単鎖核酸ハイブリダ
イゼーショングローブ（好ましくは非放射性標識された
もの）の型造における用途である。病原体には感染性病
原微生物又は食品の腐敗に関与する微生物が含まれる。

グローブは、ハイブリダイゼーションにより所望の核酸
配列を検出するために機能するであろう・・イブリダイ
ゼーシ、ン領域金含有する単鎖Ｍ１３プローブであるこ
とができる。前記のＤＮＡはＢｒｏｗｎ等。

Ｇｅｎｅ、２０，１３９−１４４（１９８２）により記
載され次男法により調製することができ、この方法にお
いては検出されるべき配列に相補的々ハイブリダイゼー
ション領域のＤＮＡ断片が一般に入手可能なＭｌ３とし
て知られているウィルスの２本鎖形に、その中の制限部
位において挿入される。形質転換の後、検出されるべき
配列に相補的なハイブリダイゼーション領域を含有する
Ｍｌ３の単鎖形が調製される。

さらに詳しくは、この方法においては、Ｍ１３７アージ
がピルス（ｐｌｌｕｓ　）　ｔ’介して細菌宿主細胞に
入り、そして単鎖ＤＮＡが一時的なＭ１３複製形（ＲＦ
）２本鎖ＤＮＡに転換され、これがクローニングベクタ
ーとして使用される。ＲＦ　ＤＮＡ’を適当な制限酵素
で開裂せしめた後、任意の由来のＤＮＡ断片、好ましく
はクローン化された外来ＤＮＡ断片ｉＭ　１３　ＲＦ　
ＤＮＡ内のクローン化領域中の適当な制限酵素部位に挿
入する。このような２本鎖挿入部を担持するＭｌ　３　
ＲＦ　ＤＮＡ　を形質転換段階によりＥ、コリ（Ｅ、　
ｃｏｌｔ　）のごとき適当なコンピテント細胞に導入す
る。宿主の増殖により、２本鎖形及び単鎖形（成熟ウィ
ルス）の両者のバイブリド分子が生成する。次に、クロ
ーン化された挿入部を頁する単鎖形を分離培養により分
離し、そして単離する。このクローニング方法は、Ｍｅ
　ｓ　ｓ　ｉ　ｎ　ｇ　＋Ｗａｌｔｏｎ　ｍ　＋エルゼ
ビール、アメルシャム、１４３−１５３頁に詳細に記載
されており、セして“’Ｍｌ　３Ｃ１ｏｎｌｎｇ　ａｎ
ｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ”と称す
るアメルシャム社の出版物（１９８３年５月）の８頁に
要約されてｂる。

この発明のグローブは、このグローブがハイブリダイズ
することができるすべての核酸配列を検出するために使
用することができ、この様な核酸配列には、染色体、固
定化細胞、動物細胞膜、体液、ウィルスサンプル、細菌
細胞壁もしくは膜、又は組織切断のいずれかに存在する
５食品又は臨床サンプルのごときサンプル中の細菌性、
ウィルス性、糸状菌性、酵母性、＠乳類性又は寄生虫性
の特異的ヌクレオチド配列が含まれる。特異的な核酸分
子の存在がグローブによって確認される場合、患者の病
原を診断することができる。この発明のグローブにより
検出され得る生物の例には。

クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌｍｍｙｄｌｍｔｒａ
ｃｈｏｍａｔｉａ　）　、ナイゼリア・ゴノルホエア（
Ｅ、ｃｏｌｉ　）等が含まれる。この発明のグローブは
また、抗生物質耐性を決定するために細菌をスクリーニ
ングする方法を提供する。

この方法はまた、ＨＬＡ−関連疾患、地中海貧血及び鎌
状赤血球貧血のごとき遺伝性疾患を検出する定めに使用
することもできる。その存在又は不存在（幾つかの地中
海貧血の場合）が疾患と関連しているＤＮＡ配列は、こ
の発明のグローブとのハイブリダイゼーションに従って
、適切な検出手段を用いて検出することができる。

さらに、この発明の方法は、増幅された遺伝子、例えば
挾恵の特定の段階と関連する増幅された発癌遺伝子を検
出するために使用することができる。

例えば、　Ｎ−ｍｙｃは、腫瘍が器官又は器官の構造に
限定されているフェーズＩ初期癌段階において検出され
得るであろう。Ｂｒｏｄａｕｒ等ｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　
。

２２４：１１２１−１１２４（１９８４）。

ハイブリダイゼーションはまた父系を決定するために使
用することもできる。さらに、この発明のグローブは遺
伝子工学における研究、例えばインシチュプロッティン
グハイプリダイゼーション法による遺伝子マツピング（
細胞遺伝学）、遺伝子ウオーキング（ｗａｌｋｉｎｇ　
）　、サブクローニング、コロニースクリーニンク及ヒ
ファージスクリーニングのため忙使用することができる
。

さらに、この発明のグローブは、標的核酸、特Ｋ　ＤＮ
Ａ　’（５分析する場合の有用な研究手段である。

このグローブを適用することができるこれら檀々の方法
の詳細はＷａ　ｒ　ｄ等のヨーロッノ母特許出Ｍ＆屋０
．０６３，８７９にさらに記載されている。さらに、こ
れはλライブラリーをスクリーニングするために使用す
ることができる。

核酸配列を検出する方法は、プローブの標識の検出と組
み合わされたハイブリダイゼーションを用いる任意の方
法であることができる。例えば。

検出は、１９８３年１月２６日に公開されたヨーロッパ
特許出願公開４０，０７０，６８７．又は１９８３年１
月２６日に公開されたヨーロッパ特許出願公開＆０．０
７０．６８５中に記載されている液体ハイツリダイゼー
ションアッセイ法忙よることができる。他の方法として
、検出は米国特許屋４．３５８，５３５に記載されてい
る固相ハイブリダイゼーションによることができ、この
方法においては、検出されるべき単鎖核酸配列が支持体
に固定され、そしてグローブとハイブリダイズされる。

この方法がＨＬＡタイプ分けを含む場合、蘭体からのゲ
ノムＤＮＡをＨＬＡ　ＤＮＡの冬型性消化・母ターンを
モタラス制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そして
消化物をグル電気泳動にかける。次に、グル電気泳動の
生成＠を膜のごとき支持体に移し、そして次の一般的方
法を用いる。

いずれの測定法を用いる場合にも、細胞、動物細胞膜、
体版、組織、ウィルスサンプル中のウイルスキャグシド
、又は細菌細胞壁もしくは膜を、細胞膜、組織、キャプ
シド又は細胞壁を開き、そして核酸を露出せしめそして
分離するのに効果的な一定量の試薬と接触せしめる。プ
ローブをハイツリダイゼーシ、ン条件下で露出されたサ
ンプルと接触せしめ、そしてハイツリダイゼーション生
成物を適切な手段、例えば可溶性又は不溶性反応生成物
の形成により検出する。

同相ハイブリダイゼーションを用いる場合、核酸含有サ
ンプルを支持体上に置き、これを栄養源、例えば栄養寒
天と接触せしめて細胞の数を増して明瞭なコロニーを形
成せしめる。鎖を露出しそして分離するための溶解（１
ｙｓｉａ　）及び核酸変性段階を、サンプルを支持体に
付着せしめる前、その間又はその後に行う。すなわち、
例えば、サンプルを支持体に適用した後にサンプルを試
薬で処理することができ、又はサンプルを試薬と混合し
。

そして次に支持体に適用することができ、又は細胞、膜
、体液、ウィルス、細菌もしくは組織サンプルを支持体
に付着せしめる前に、支持体に試薬を含浸せしめるか又
は支持体を試薬上に置くことができる。サンプルが付着
する支持体は、好ましくは水不溶性多孔性支持体、そし
てさらに好ましくはフィルター、ニトロセルロース膜、
又は荷電しているか又は誘導体にされたナイロン膜であ
る。

好ましい支持体は、フィルターを通してのサンプルの通
過を妨害するマイクロフィルターである。

スポット又は塗布によりサンプルをまず支持体に付着せ
しめる場合、試薬を用いる溶解段階は好ましくは、サン
ダルが移動せずそしてそれが付層された支持体上の部位
に固定されて残るように行う。溶解（１ｙａｉａ　）を
達成する１つの方法は、細胞、膜、体液、ウィルス、細
菌又は組織のサンプルを開きそして核酸の鎖を分離する
のに十分な時間九わ之って、単離物を上にして支持体を
、溶解試薬（ｌｙａｉｎｇ　ｒａａｇｅｎｔ　）で飽和
された吸水性支持体上に置く方法である。この発明の好
ましい溶解試薬は塩基であり、さらに好ましくは水酸化
ナトリウムの冷水浴液である。なぜなら、これもま友核
酸を変性するからである。変性を生じさせる他の試薬又
は因子には有機試薬、例えばアルコール、アミド、尿素
、フェノール、スルホキシド等、ある種の無機イオン、
例えばチオシアン酸塩又は過塩素酸塩、及び上昇し次温
度が含まれる。この目的のために使用される試薬の量は
核酸がＤＮＡであるか、　ＲＮＡであるか、又はＤＮＡ
とＲＮＡとのバイブリドであるかに依存するであろう。

固相ハイブリダイゼーションの次の段階において、実質
的に（例えば少なくとも８０％）単鎖形の１又は複数の
核酸を支持体に固定する。しかしながら、固定段階の前
に中和段階を行うのが好ましく、この段階においては一
般に、使用式れる変性及び溶解試薬に主として依存して
、一般にＰＨ６〜８の水性緩衝液により飽和された吸水
性支持体上に不活性支持体を単離物を上にして置く、例
えば、塩基を使用する場合、細胞サンプルを１．０Ｍ〜
４、ＯＭ　ＮａＣＬを含有する約ｐＨ６〜８の中和緩衝
液中に入れて塩基を除去する。１回よシ多くのこのよう
な中和処理を行うことができる。

固定段階において、単鎖形の核酸を、当業界において知
られている任意の手段により支持体上に固定する。１つ
のこのような方法は、支持体を紫外線に又は乾燥溶剤に
、あるいはサンプルを乾燥するために十分な熱、好まし
くは約５０℃〜９０℃に暴露することを含む。支持体か
ら液を除去する友めの乾燥は例えば加熱（ｂａｋｉｎｇ
　）により、又はエタノールで洗浄することにより達成
される。

核酸を固定した後、これをハイブリダイゼーション条件
下でこの発明のハイブリダイゼーショングローブの有効
量と接触せしめることにより測定することができる。好
ましくは、ハイブリダイゼーション段階に先立ってプレ
ーハイブリダイゼーション段階を行い、この段階におい
ては、固定されたサンダルを、使用されるグローブと支
持体との非特異的反応を防止するために効果的外一定社
の試薬と接触せしめる。このプレノ・イブリダイゼーシ
ョン段階においては、支持体を室温又は上昇した温度に
おいて、通常ゆっくり攪拌しながら、支持体と完全に反
応するのに十分な時間にわたり。

ブレハイブリダイゼーション試薬溶液と共にインキュベ
ートする。この目的のために使用される試薬溶液は好ま
しくは約１０〜８０容量４．さらに好ましくは約５０容
量幅の不活性極性有機溶剤を含む。この目的のための好
ましいグレハイツリダイゼーシ、ン浴液の例は、約２５
〜５０４のホルムアミド’、　５　Ｘ　５ＳＰＥ　（５
ＳＰＥは、Ｍａｎｉａｔｉａ等。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク。

１９８２かに記載されている組成のリン酸ナトリウム塩
ＥＤＴＡ、ｌ、０．１〜１．　Ｏｗ／ｖ　’ｉのドデシ
ル硫酸す）　ＩＪウム及び約１５０μｇ／ｍｌの音波処
理された変性ＤＮＡから成るものである。存在すること
ができる任意的取分には約１〜１０重量鴫の約１００〜
１０００にダルトンのデキストラン硫酸ナトリウム、ウ
シ血清アルブミン、オノ譬ルブミン、ポリビニルピロリ
ドン、フィコル、デンハートｔｇ液中０．５〜２重量／
容蒲４グリシン、トランスファーＲＮＡ、ｐｉ（６〜９
のクエン酸又はリン酸緩衝欣中ニシン精子ＤＮＡ又は他
の類似の試薬が含まれる。

！レハイプリダイゼーション段階の後、ｆロープをハイ
ブリダイゼーション溶液に加える。このハイブリダイゼ
ーション溶液は前記のプレハイブリダイゼーション溶液
と本質的に同一であるが。

わずかに異り、そして場合によっては例えば０〜１０％
の硫酸デキストランを含有する。選択される特定のハイ
ブリダイゼーション溶液は使用される特定のハイブリダ
イゼーション条件、例えば温度に主として依存するであ
ろう。溶液中のプローブの量は、標識、サンプルの核酸
に結合することができるグローブの量、及びハイブリダ
イゼーション条件に依存するであろう。一般に、サンプ
ルの核酸に対して理論量より多くのプローブがＩＥする
ことにより、固定された核酸配列にプローブが結合する
速度が上昇する。

ハイブリダイゼーション条件は、所望の最終目的により
異るであろう。ハイブリダイゼーションの条件は、核酸
の再アニーリングを最適化し、そしてパックグラウンド
に影響を与える支持体マトリクスへの非特異的結合を除
去するために選択される。ストリンジエンシーは温度、
プローブの長さ、イオン強度等を調整することにより制
御される。溶液中のホルムアミドの濃度の約２０係から
約５０係への変化は極性を変化せしめ、そしてそれ故に
ハイブリダイゼーションのストリンジエンシーを変化せ
しめる。一般に、ハイブリダイゼーションは約２５℃〜
７５℃、好ましくは３５℃〜６５℃にて％０．２５〜５
０時間、好ましくは１５〜２４時間行われ、これらの条
件は主として特定のプローブ及び使用される核酸サンプ
ルの濃度、並びに媒体中の他の成分の濃度に依存するで
あろう。当業者は条件の適切な調整を行うことができよ
う。条件のストリンジエンシーが大きくなるに従りて、
プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションの
ために必要な相補性が大になる。

ハイブリダイゼーション段階の後、固相ハイブリダイゼ
ーション測定法のための細胞１体液、又はウィルスもし
くは組織サンプルを、洗浄ａを加えることによって洗浄
してハイブリダイズしていないプローブを除去する。典
型的には、況浄液は、ハイブリダイゼーション溶液につ
いて用いた量と類似する量での、塩化ナトリウム、クエ
ン酸ナトリウム、及びあるタイプの洗剤、例えばドデシ
ル硫酸ナトリウム又はドウィイーン２０から成る。

洗浄のための接触時間は溶液のタイプだより異るが、一
般に約５分間〜３時間、又はそれ以上である。次に、サ
ンプルが付着した支持体を室温において、それを検出手
段にかける前に、希クエン酸ナトリウムー塩化ナトリウ
ム溶液ですすぐことができる。

グローブそれ自体は、これを標識成分が検出され得る手
段で処理し、そして適切な検出技法を用いてグローブの
存在を決定することにより検出することができる。検出
手段は標識成分について前記したものであり、そして分
光的手段、光化学的手段、免疫化学的手段、生化学的手
段及び化学的手段を包含する。免疫化学的手段は適当な
条件下でグローブと共に複合体を形成することができる
抗体を包含し、ぞして生化学的手段は適切な条件下テグ
ロープと腹合体を形成することができるポリペプチド又
はレクチンを包含する。抗体、ポリペプチド又はレクチ
ンは検出可能でなければならず、あるいは複合体が形成
された場合に検出され得る成分を含有しなければならな
い。このような含有される検出可能な取分の例には螢光
色素、電子密度試薬、あるいは不溶性反応生成物を沈着
せしめることができるか又は発色検出され得る酵素が含
まれる。通常、抗体、ポリペプチド又はレクチンが、発
色性基質と反応するであろう酵素にカップリングされる
であろう。例えば、ピオチンにより標識され友ハイブリ
ダイズしたグローブを検出するためのアビジン−酵素複
合体又はストレグトアピジンー酵素複合体の使用は、未
反応アビノン−酵素腹合体又はストレプトアビジン−酵
素複合体の洗浄除去、酵素のための発色性基質の添加、
及び生ずる色変化の読み取りを含む。酵素がホースラデ
ィツシュ・パーオキシダーゼであれば、基質は３　＋　
３’　＋　５＋　５’−テトラメチルベンジジンであろ
う。この基質及び他の一ンジノン、例えばメリキノン塩
又は固定化複合体の検出は、１９８６年１０月３日に出
願されたヨーロッ／？特許出願屋８６３０７６７２．５
に一層十分に記載されている。

標識化プローブの検出においては、適切に処理された場
合に発光的となる蛋白質も使用嘔れ得る。

ＨＬＡタイプ分けの友め、未知サンプルの制限断片パタ
ーンを既知サンダルの制限断片ノリーンと比較すること
ができる。制限断片の分子量は分子量マーカーと比較す
ることにより決定することができる。

付加された検出感度のため、この発明のプローブはま几
、標的核酸配列を増幅するためのポリメラーゼ鎖反応と
組合わせて使用することができ、この反応においては、
ｆライマー、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼを使
用してブライマー延長生成物を合放し、この生成物を鋳
型として使用して追加の標的配列を合成する。この技法
は５ａｌｋ１等、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０，１５３
０１５３４（１９８５）によシさらに十分に記載されて
いる。

次に１例によりこの発明の特定の具体例を記載するが、
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。例
中、特にことわらない限り係及び部は重量基準であり、
そして温度は℃で表わす。

正しい元素分析とは、計算値と測定値の間の差が０．４
憾未満であることを示す。

の調製 Ａ、ビス−ｏ　、　ｏ’−トシル−３，６，９−）サオ
キサ−ウンデカン−１，１１−ジオール（化合物Ｉ）の
合成 ５００　ｍｌの乾燥ピリジン中４２ｇのテトラエチレン
ダリコールの冷却した溶液Ｋ１００ｇのｐ−トルエンス
ルホニルクロリドを加えた。この溶液を４℃にて１８時
間攪拌した。この溶液に１００ｄのメタノールを加え、
そしてさらに１時間攪拌を続は次。この混合物ｔ−１ｌ
の氷水に注加した。

水をデカントし、そして油状残渣を３Ｑ□＋Ｊのクロロ
ホルムとｌＱＱｍｊの水との間で分配した。有機相を０
．５Ｎ硝酸（２５０ｍｊ）及び塩水（２５０ｍｌ　）で
洗浄しに０有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、戸遇
しそして濃縮して残渣を得、これを２５．９のシリカグ
ル上に吸着せしめ、セして溶離剤としてクロロホルム／
メタノール（９７：３）を用いてカラム上で分画し次。

生成物を金回する両分をプールし、そして黄色シロッゾ
状に濃縮し次。

Ｂ、１．１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサ−ク
ンデカン（化合物…）の合成 ２５０　ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミドＣＤＭＰ　）
中５０．３．ｆの化合物Ｉの溶ｆｉＶｃ３０．９のりチ
ウムアット０を加えた。この混合物を８０℃にて攪拌し
ながら、シリカグル上でのＴＬＣ（クロロホルム／メタ
ノール９７：３）が出発物質の残留を示さなくなるまで
加熱した。溶剤を真空除去し、セして残渣を５００ｍ１
のエーテルと２５０１７ｆの塩水との間で分配した。エ
ーテル相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そし
て油状に濃縮した。

Ｃ，１，１１〜ノアミンー３．６．９−）リオキサーウ
ンデカン（化合物１１［）の合成２５０１１１７のピリ
シン中２４．４．９の化合物Ｈの冷却され攪拌された溶
液に、８９ｇのトリフェニルホスフィンを加えた。窒素
の泡が生じた。この溶液を氷冷しながら４５分間攪拌し
、そして次に室温に自然加温した。室温にて４５分間置
い友後、ｌＱＱｍｊの濃水酸化アンモニウムを加え、そ
して混合物を一夜攪拌した。この混合物１５００−の０
．５Ｎクエン酸と２５０ｔｎｌのエーテルとの間で分配
した。水相をエーテル（２Ｘ２５０＋ｊ）で洗浄してト
リフェニルホスフィンオキシトを除去した。

水相を塩化ナトリウムで飽和し、セして１−ブタノール
ｃ　４　Ｘ　２５０ｒｎｌ）及びジクｏｏメタ／（４ｘ
２５０ｍｌ）Ｋより抽出し念。−緒にし友アルコール及
びジクロロメタン抽出＃ｉｔ減圧下で濃縮し。

そして残渣を１００ゴのエタノールに入れ次。

１５ｍ１の濃塩酸を加え、そして減圧下で溶剤を除去し
友。残渣をエタノール／エーテルから結晶化した。吸水
性結晶を真空乾燥した。

Ｄ、　、Ｎ−ｔａｒｔ−プチルオギシ力ルポニル−３，
６＃９−トリオキサクンデカン（化合物■）の合成１０
０１ｒＬｌのメタノール中１３．２６．９の化合物■及
び８Ｉ＋Ｉｊのトリエチルアミンの溶液に、１０ｒｎｌ
のメタノール中１２．！７のジーｊｅｒｔ−プチルゾカ
ーゴネートのＣ液を加えた。二酸化炭素の泡が生じ。

そして反応混合物はわずかに発熱的であった。ガスの発
気が終るまで攪拌を続けた。減圧下で溶剤を除去し、セ
して残渣ｔ−２０ｇのシリカゲルに吸着せしめ、セして
ジクロロメタン／メタノール／酢酸（７０：３０：５）
を溶離剤として用いてカラム上で分画した。生成分を含
有する両分を集め、そして濃縮することによりモノ−Ｂ
ＤＣ（ブチルオキシカル−ニル）誘導体をシロップ状物
として得た。

Ｅ、　　Ｎ−（ｔａｒｔ−ブチルオキシカルビニル）。

Ｎ／−（、ｉ／−メチレントリオキサシン）−３，６，
９−トリオキサ−ウンデカン（化合物Ｖ）の合成４　ｍ
ｌの乾燥トルエン中２８０ｒｎｇの化合物■及び１２０
＃Ｉ！７のトリエチルアミンの溶液に２２４１ｎｇのク
ロロメチルトリオキサシンを加えた。混合物を暗中１１
０℃にで一夜加熱した。溶離液としてクロロホルム／メ
タノール（８：１）を用いるシリカゲル上でのＴＬＣは
出発物質の残留を示さなかった。反応混合物を５ｇのシ
リカゲル上に吸着せしめ、そして溶離液としてクロロホ
ルム：メタノール（８：１）ｔ−用いてカラム上で分画
した。生成物を含有する両分（螢光性、ニンヒドリン陽
性）をプールし、そしてシロップ状に濃縮した。このシ
ロップ状物は自然に結晶化した。

Ｆ、　　Ｎ−ビオチニル、Ｎ’−（４’−メチレントリ
オキサシン）−１６８９−）ジオキサ−ウンデカン−１
，１１−ジアミン（化合物Ａ）の合成Ｓ　ａｔの９７係
蟻酸中６００　μｍｏｌｅの化合物■の溶液を室温にて
一装置いた。これによりＢＯＣ保護基が定量的に除去さ
れた。減圧下で溶剤を除去し。

そして残留アミンをさらに精製することなく使用し友。

２５μｌの乾燥ＤＭＦ中２．８６　ｌｉｍｏｌｅのこの
アミンの溶液、及び乾燥）伊中トリエチルアミンのＩ　
ＭｍＫ」Ｏａｌ　′ｔ−ピオチンのＮ−ヒドロキシサク
シンイミドエステル１■に加えた。この溶液を暗所に２
時間室温におき、そして溶剤としてクロロホルム／メタ
ノール（４：］）を用いてシリカゲル上での分取用ＴＬ
Ｃにより精製した。螢光性でありセしてビオチンを含有
する低Ｒｆ生放物バンドを削り取り、そして１　ｍｌの
メタノールで洗浄して生成物である化合物Ａを溶出した
。

Ａ、七ツートルエンスルホニルテトラエチレングリコー
ル（化合物■）の合成 ４℃に冷却し交５０Ｑｕ／の乾燥ピリ・シン中４２、！
ｉ’　（２１６ｍｍｏｌｅ）のテトラエチレングリコー
ルの溶液に５０９　（２６２ｍｍｏｌ＠）のｐ−トルエ
ンスルホニルクロリドを加えた。この溶液を冷中で一夜
攪拌した。ピリジンを蒸発せしめ、そして約３００１ｒ
Ｌｌのトルエンを用いてビリ・ノンを共沸蒸発せしめた
。残渣’ｘ　６０　ｍｌのメタノールに入れ、そして３
０．９のシリカゲルを加えた。溶剤を減圧除去し、セし
て溶離剤としてクロロホルム／メタノール（９７：３）
を用いて残渣をシリカダルカラム上で分画した。得られ
たモノトシレートを次の反応のために直接使用した。

８．１１−アジド−３，６，８−）リオキサーウンデカ
ノール（化合物■）の合成 化合物■を２５０ｍ／の乾燥ジメチルホルムアミドに溶
解し、そして１５９　（３０６ｍｍｏｌｅ）のリチウム
アジドを加えた。この混合物を攪拌し、そして８０℃〜
１００℃に加熱した。数時間後、クロロホルム／メタノ
ール（９７：３）を用いるシリカゲル上での薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）はすべての紫外線吸収物質（リ
チウムトシレート）を原点に示した。溶剤を減圧除去し
、ナして残渣をテトラヒドロフラン中に入れ、そして４
０．９のシリカゲルを加えた。溶剤を除去し、溶離剤と
して酢酸エチルを用いて残渣をシリカダルカラム上で分
画した。生成物を含有する両分をプールしそして濃縮し
た。炭素、水素及び窒素について正しい元素分析が得ら
れた。酢酸エチルを用いるＴＬＣにおｈでシリカゲル上
での生成物バンドのＲｆば０．２１でありた。

０．１１−アミノ−３，６，９−）リオキサーウンデカ
ノール（化合物■）の合成 ＩＱＱｍｔのピリノン中１５．９４ｇ（７２，７ｍｍｏ
ｌｅ）の化合物■の溶液に２９ｇ（１１１ｍｍｏｌｅ）
のトリフェニルホスフィンを加えた。１時間攪拌してガ
スの発生が終り之後、５Ｑｍｌの濃水酸化アンモニウム
水浴液を加え、そして混合物を一夜攪拌した。反応混合
物を真空濃縮し、セして残渣を２００　ｍｌの水と２０
０−のエーテルとの間で分配した（水相ｐＨ２）。水相
ｔ　２００　ｍｌずつのエーテルで２回洗浄した。水相
を固体水酸化ナトリウムにより−１１１に調整し、セし
て１５０１ｄずつのｎ−ブタノールで３回抽出し友。ブ
タノール抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そ
して濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン中に入れ、そ
して濾過した。涙液をシロップ状に蒸発せしめ、これを
トルエンと共に共沸蒸発せしめ友。

Ｄ、１１−　ｔ＠ｒｔ−プチルオキシカルゲニルアミノ
−３，６，９−）リオキサーウンデカノール（化合物■
）の合成 １００ｍ１のテトラヒ）’０７ラン中１２．！ｉ’（６
２，１ｍｍｏ１ｓ）の化合物〜１の懸濁液に、１５ｇ（
６８，７ｍｍｏ　ｌｅ）のノーｔａｒｔ−プチルジカー
ゴネートを加えた。多量のガスが発生した。トリエチル
アミン（１０１４ニア、２６ｇニア　１．３ｍｍｏｌｅ
）を加え、そしてこの混合物を室温にて攪拌した。ガス
の発生が終った時、溶液をメタノールで稀釈し、そして
２０ｇのシリカダルを加え゛た。浴剤を減圧除去し、セ
して残渣をシリカダルカラム上で、溶離剤としてクロロ
ホルム／メタノール（８：１）ｔ−用いて分画し友。生
成物を含有する画分をブールし、そしてシロップ状に濃
縮した。炭素、水素及び窒素について正しい元素分析が
得られた。

Ｅ、　　１−　（ｔａｒｔ−ブチルオキシカルｙ！？ニ
ルアミノ）−１３−（４，５’、８−トリメチルグソラ
シンー４′−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサ
−トリデカン（化合物Ｘ）の合成 ２７７ｍ９（１ｍｍｏｌｅ　）のりｏｏメチルトリオキ
サレシンび１３５ｆｆ＋９（１，０１ｍｍｏｌｅ　）の
ヨウ化リチウムを］Ｑｍｔのテトラヒドロフラン中で混
合した。この混合物を短時間音波処理し７た。この混合
物Ｋ　２９３ｍ；ｌ（１ｍｍｏｌｅ　）の化合物ｒＬを
加えた。

透明な黄色の溶液が生じた。この溶液に１１５ｍ！７（
１，０３ｍｍｏｌ＠）のカリウムｔａｒｔ−ブトキシド
を加えた。沈澱物が生放し、この混合物を暗中で攪拌し
、そして数時間緩和に還流した。反応混合物−１２ｙの
テトラヒドロフランで稀釈し、そして懸濁液を遠心し、
そして上清を０．４５５ミフロンシリンノフイルター通
して濾過した。３滴の氷酢酸を添加することにより涙液
を中和した。溶剤を減圧下で除去し、セして残渣を２ｍ
ｌのメタノール中に再溶解した。この溶液を４枚の２０
　ｃｍ　Ｘ　２Ｑα分取用シリカケ０ルプレートに適用
した。これらのグレートを酢酸エチルにより展開し、そ
して生成物バンドをプレートから削り取り、そして約５
ＱＩｎＪのメタノールに溶解し友。メタノール抽出′ｅ
、全濾過し、濃縮乾固し、１０ｍ１のメタノールに再溶
解し、セして０．７１５ミクロンフィルターを辿してシ
リンジにより濾過した。７９６Ｍ浴敵を得、これを後の
反応に使用した。炭素、水素及び窒素について正しい元
素分析が得られた。Ｒｆは０．２７（シリカダル；酢酸
エチル）である。

Ｆ、１−（ビオチニルアミノ）　−１３−（４、５’。

８−トリメチループソラシンー４′−イル）−３゜６．
９．１２−テトラオキサ−トリデカン（化合物Ｂ）の合
成 １５、４　ｍｌ　（２８，９μｍｏｌｅ　）の化合物Ｘ
を、アセトニトリル中２Ｍ）リフルオロ酢酸１　ｒＩＬ
ｔに入れ、そしてシリカダル上での酢酸エチルを用いる
薄層クロマトグラフィーが出発物質の残留を示さなくな
るまで、暗中室温にて放置した。溶液を減圧蒸発せしめ
、そして残渣ｔ−１００μぎの乾燥ビリノンに溶解した
。この溶液に、１０Ｉη（２９，４μｍｏｌｅ）のビオ
チンＮ−ヒドロキシザクシンイミドエステル（ＮＨ３−
ピオチン）を加えた。この混合物を室温にて暗中に３日
間置き、そして次に乾固し、−Ｆ：して残渣を５００μ
ｌのメタノールに溶解した。混合物を遠心少量の不溶物
を除去した。上ｍを２０（７）×２０筋分取用シリカダ
ルプレートに適用し、（−してプレートを・ジクロロメ
タン／メタノール／酢酸（９０：１０：５）により展開
した。生成物バンドをグレートから取り出し、そしてメ
タノールにより溶出した。抽出物を濾過し、そして乾燥
し友。残渣を高解像質量分析にかけた。

測定値二分子量＝　６８２．２７８１　（Ｃ３３Ｈ４５
Ｎ３０９Ｓ＋Ｎａ　）。

Ｒｔ　＝　０．３３　Ｃシリカグル；ジクロロメタン／
メタノール／酢酸（９０：１０：５））。

ＨＬＡ−ＤＰａＭ１３ハイプリダイゼーシ、ングローブ
と称するヒト白血球抗原（ＨＬＡ　）系のタイグ分は用
グローブを次のようにして調製した。

Ａ、　　ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする友
めのＨＬＡ−ＤＩ軸プローブの調製 ）ＬＡ−ＤＰａクローンを同定する友めにｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするためにＩ（ＬＡ−ＤＲａ
グローブを誠実した。

ＨＬＡ−ＤＲａ抗原の位置１１−１４の既知のＮＨ２−
末端アミノ酸配列（聾ｉ旦、　Ｔｙｒ　、　Ｌａｕ　）
に基いて４ａ［類の１１−ｍａｒオリゴヌクレオチドを
調製した。この４種類のオリゴ９ヌクレオチドの塩これ
らの配列は上記のペプチド配列のコドンに相補的であり
、そして縮重を最小にする友めに選択され次。位置２．
３．６及び９にあいまいさが存在する。位置２及び３０
Ｇは可能性あるミスマツチ塩基の不安定化効果を最小に
するために選択された（ＧはＵと不安定な対を形成する
ことができる）。

４種類のオリゴヌクレオチドはアミノｉ！１ｉｌｌ−１
４のコドンと相補的であるから、　ＨＬＡ−ＤＲａｍＲ
ＮＡ上でのオリゴヌクレオチドでプライムされた　ＤＮ
Ａ合成は約１５０〜２００ヌクレオチドの生成物を生じ
嘔せると予想され友。この予想は７５ヌクレオチドのリ
ーダー配列に基いており、そして７５−１２５ヌクレオ
チドの５′非翻訳領域を仮定する。

４ｆ！ＪＭの１１−ｍａｒのそれぞれをプライマーとし
て使用して、膜結合Ｂ細胞ｍＲＮＡ、遊離Ｂ細胞ｍＲＮ
Ａ及びＴ細胞ｍＲＮＡを鋳型として用いてｃＤＮＡ合成
反応を行うことによりこれらの特異性を比較した。オリ
ゴヌクレオチドＡＧＧＴＡＧＡＡＣＴＣのみが。

Ｂ細胞膜結合ｍＲＮＡ鋳型上での反応において富化され
る１７５ヌクレオチドのｃ　ＤＮＡバンドをプライムし
た。この１１−ｍａｒオリゴヌクレオチドの特異性を、
１種類のノブオキシトリホスフェート及び３ｍ類のデオ
キシトリホスフェートの存在下でのｃ　ＤＮＡ合成反応
においてプライマーを延長することにより確認した。こ
の方法は、ＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡクローンの単離におい
て有効であることが証明されている（　５ｏｏｄ等、工
μｋｓ（１９８１）す：６１６−６２０）。ソデオキシ
ｄＡＴＰの存在下で、予想される１８−ヌクレオチドプ
ライマー延長生成物に対応する少量のｃ　ＤＮＡバンド
が観察された。

他の７１ＦＩＸ類のヌクレオチド°はワンダリング（ｗ
ａｎｄｅｒｉｎｇ　）ス列？ット配列決定技法によりＧ
ＧＣＣＴＧＡであると決定された。次の２つの追加のヌ
クレオチ）’ＡＴがＩｌｅコドンから指定され。

）ＬＡ−ＤＲａ抗原アミノ酸８．９及び１０位に対応す
る９ヌクレオチド配列を与える。

次に、上に決定された配列 （ＡＧＧＴＡＧＡＡＣＴＣＧＧＣＣＴＧＡＡＴ　）を有
する２０−ヌクレオチド断片を、トリエステル法により
合成した。

プライマーとしての２０−ｍａｒの特異性をＢ細胞系か
らのポリ（Ａ”　）ｍＲＮＡ上でのｃＤＮＡ合成反応に
おいて試験した。１７５ヌクレオチド長の大ｃＤＮＡバ
ンドが合成された。溶出されたバンドのヌクレオチＰ配
列は■λ−ＤＲａの予想される配列に対応した。

ハイプリダイゼーショングローブトシての２０−ヌクレ
オチド断片の特異性をポリ（Ａ　）ｍＲＮＡのナサンプ
ロット上で分析した。　Ｐ−標識され之２０−ｍａｒヌ
クレオチドプロープヲ用いて。

１２００〜１３００ヌクレオチドのユニークバンドがＢ
細胞ｍＲＮＡのブロービングから得られ友がＴ細胞ｍＲ
ＮＡからは得られなかった。

前記の２０−ｍｅｒ７’ローブを用いてｃ　ＤＮＡライ
ブチリ−中でＨＬＡ−ＤＲａｃＤＮＡＲａ−ンを次のよ
うにして同定し友。バナジル複合体の存在下でフェノー
ル−クロロホルム抽出を用いて、ヒトーリンパプラスト
イドＢセルラインＣＡから膜結合ＲＮＡ及び遊離ＲＮＡ
を調製した。ポリローセファロースを用いるアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより単離されたぼり（Ａ　）
ＤＮＡ　をインビトロ−ラビット網状細胞系において翻
訳した。特異的ｍＲＮＡの膜結合画分及び遊離画分への
分配を、インビトロ翻訳の５５８−標識生成物の２Ｄｆ
ル分析によりモニターし友。逆転写酵素、ＤＮＡポリメ
ラーゼ■及びＳ１ヌクレアーゼを用いて膜結合ｍＲＮＡ
から２本鎖ｃ　ＤＮＡライブラリーを調製した。ターミ
ナルトランスフェラーゼを用いてｄＣＴＰによりティリ
ングした後、　Ｐｓｔにより消化されセしてｄＧＴＰに
よりティリングされたグラスミドｐ１３Ｒ３２２の調農
物に挿入しそして連結した。

このライブラリーの最初のスクリーニング全欠のように
して行ったｏＧｒｕｎａｔｅｌｎ−）（ｏｇｎｅｓａコ
ロニーフィルターの２つのセラ）（約４．０００クロー
ン／セツト）を調製した。１つのセットを、Ｂセルライ
ンＣＡからのサイズ分画されたｍＲＮＡがら調製されｆ
Ｃ５２Ｐ−ｃＤＮＡによりプローブした。シュークロー
スグラジェント画分をインビトロ−ラビット網状細胞系
において翻訳し、そして３５Ｐ−標識された生成物を２
Ｄｆル電気泳動により分析して適切な両分を決定した。

フィルターの他のセットをＴセルラインＭｏ１ｔ−４か
らのｍＲＮＡから調製された　Ｐ　−ｃ　ＤＮＡにより
プローブした。膜結合Ｂ細胞特異的１２〜１４８　ｍＲ
ＮＡ由来の約１５０クローンのサプセッ）ｆこの最初の
スクリーニングにより決定し友。

それぞれが５つの候補ｃ　ＤＮＡクローンから成る２５
プールからグラスミドＤＮＡを調製し、そして３２ｐ−
標識２０−ヌクレオチドプローブを用いるドツトハイブ
リダイゼーションにより分析した。

ゾール１４グラスミドＤＮＡがプローブと特異的にハイ
ブリダイズした。次に、このプールの１面々の構成員を
試験し、このハイプリダイゼーションデロープに相補的
なｃ　ＤＮＡ配列を１８０７と同定されるクローンに限
定した。

ナサンプロットにおいて、　Ｐ−標ｖｋ１８ｃ７ニツク
トランスレーシヨンデローブは、２０−ヌクレオチドプ
ローブに相補的なパンＰと同じ長さく約１２００〜約１
３００ヌクレオチド）のＢ細胞ｍＲＮＡとハイブリダイ
ズする。ヒト染色体６及び３を含むハムスター−ヒトハ
イブリ）’カラのＤＮＡヲ用いるゲノムプロットにおい
て、１８Ｃ７７’ロープはハムスター親中には存在しな
いユニーク制限断片にハイブリダイズし、１８Ｃ７ＤＮ
Ａ配列は染色体６にマッグされる。

染色体６対の１つの相同体のショートアーム上の特定の
部位に小さい欠失を有するセルライン６．３．６を用い
て、さらに正確なマツピングが可能であった。この欠失
変異体は、１つの染色体６ノ・ロタイブと関連する）Ｉ
ＬＡ−Ａ、　Ｂ、　Ｃ及びＨＬＡ　−ＤＲ特異性を発現
することができない。ゲノムプロットにおいて、　１８
Ｃ７は、族セルラインからの、おそらく２つの染色体６
からの２つの制限断片にノ・イブリダイズする。１つの
げ１片のみが欠失変異体からのＤＮＡ中に観察される。

他の断片はおそらく欠失した染色体に由来する。この結
果は、１８ｃ７クローンに相補的なりＮＡ配列を６．３
．６欠失により定義される染色体部位にマツプする。

ヒトＨＬＡ−Ｄ座はマウスＩ領域に相同である。

■領域においてのみ異る近交系（Ｉｎｂｒｅｄ　１ｉｎ
ｅ）であるマウス同種系（ｃｏｎｇｅｎｉｃ　１ｉｎｅ
　）がらのＤＮＡを用いるゲノムプロットにおいて、　
１８ｃ１７グロープは各同種系について異る制限断片に
ハイブリダイズした。この結果は１８Ｃ７クローンに相
補的なりＮＡ配列をマウスＩ領域にマツプし、そして従
ってヒト）（ＬＡ−ＤｉＫマツプする。

１８Ｃ７クローンは、エンドヌクレアーゼ゛Ｐａｔｌ。

Ｈｉｎｆｌ　ｙ　ＴａｇＩ　ｌ５ａｕ３Ａ　＊　Ａｖａ
ｌ　、及びＢｇｌｌを用いるＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（
１９８０）　６５　：　４９９−５６０）によってその
ＤＮＡ配列を分析することによりＨＬＡ−ＤＲＩｌｌで
あることが確認された。ＨＬＡ−ＤＲａクローンのコー
ド鎖の配列は次の通りである。

ＡＴＣＡＴＡＧＣＴＧ　ＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧ　ＣＣＣ
ＴＣＡＧＧＡＡ　ＴＣＡＴＧＧＧＣＴＡＴＣＡＡＡＧＡ
ＡＧＡ　ＡＣＡＴＧＴＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＧ　
ＡＧＴＴＣＴＡＴＣＴＡＧＣＴＧＧＣＡＡＴ　ＡＴＴＡ
ＣＡＡＴＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＡＧ　ＴＧＡＡＡＧＣＡ
ＧＴＣＡＴＣＴＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＣＣＡＧＣＣＣＴ
ＡＴＡＧＣＣＡ　ＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴ３２Ｐ−標識さ
れた■請−ＤＲａプローブをこのクローンカラニックト
ランスレーションにより調壇し友。

Ｂ、　　ＨＬＡ−ＤＰａのためのハイプリダイゼーシ、
ン！ロープの調製（クローンＰ２９Ｇ８及びｐＤＡ３１
８を使用） 関連するが異るＤＮＡ配列の検出を可能にする低下し次
ストリンジエンシーのノ・イブリダイゼーシ、ｙ条件ｏ
４とでニック−トランスレージ、ンＨＬＡ−ＤＲ，によ
り前記のｃ　ＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことによりＨＬＡ−ＤＰａクローン９２９Ｇ８　ｋ同定
し友。ノ１イプリダイゼーション条件は次の通シであっ
た。

ハイプリダイゼーシ、ン：５０４ホルムアミド。

５　Ｘ　５ＳＰＥ（Ｉ　Ｘ　５ＳＰＢ＝０．１８ＭＮａ
Ｃ２，１０ｍＭＮａＨＰｏ　　、　１　ｍＭＮａ２ＥＤ
ＴＡ　、　　ｐ’７．０　）　、　０．１４ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＯ８）、５％デンノ・−ト（５メデン
ハート＝　０．１　ｗ／ｖ憾ずつのウシ血清アルブミン
、フィコール、ポリビニルピロリドン）。

２００μｇ／ｒｎｌ剪断され変性され之サケ精子ＤＮＡ
中、Ｉ　Ｘ　１０’　ｃｐｍ　”Ｐ−標識ＨＬＡ−ＤＲ
ａプローブ（２×１０８ｃｐｍ／μｇ、ニックトランス
レージ、ンにより標識）により、３７℃にて２４時間。

洗浄：５×５ＳＰＥ　、　０．１係ＳＤＳ中室温にて１
５分間×３゜高ストリンツエンシー（０，Ｉ　Ｘ　５Ｓ
ＰＥにより６５℃にて洗浄）条件下で、ｐ２９Ｇ８　は
それ自体のみと強く反応する。９２９Ｇ８クローンのコ
ード鎖をＭａｘａｍ−Ｇｉ　１ｂｅｒｔ　ｆＥにより配
列決定し友。

ダノムサザンブロントにおいて、９２９Ｇ８グローブば
ＨＬＡ半接合接合体セルライン６．３．６　）からのＤ
ＮＡ　中ＨＬＡ−ＤＲ，グローブにノ）イブリダイズす
る断片とは異るケ０ツム制限断片に７・イブリダイズす
る。

セルラインＴ５−１　＆びそのＨＬＡ半接合誘尋体６．
３．６からのＤＮＡ　’！ｒ用いるケ９ノムプロットノ
２ターンは９２９Ｇ８座がＨＬＡ　領域内にマツプする
ことを示す。このクローンによりコードされているアミ
ノ酸パターンと）ＬＡ−ＤＰａ抗原について公表されて
いるアミノ酸配列データとの比較は、ｐ２９Ｇ８がＨＬ
Ａ−ＤＰａクローンであることを示し几。このクローン
カラニックトランスレーションにより　Ｐ−標識グロー
ブを調製した。

ｐ２９Ｇ８　グローブをＥｃｏＲＩ連結により調製され
之他のｃＤＮＡライブラリーに７１イプリダイズせしめ
友。ペーリンが−マンノ・イムから市販されておりそし
てｐＢＲ３２２と近緑であるｐＢＲ３２８のｐｃｏＲ１
部位にＤＰ−αｅ　ＤＮＡ配列をサブクローニングして
プラスミドｐＤＡ　３１８を得た。このプラスミドを含
頁するＭＭ　２９４宿主は１９８４年１１月８日に、Ａ
３９，９１７としてアメリカン・タイプ・カルチエアー
・コレクションに寄託され念。プラスミドｐＤＡ３１８
はｐ２９Ｇ８より大形であり、セしてｐ２９Ｇ８配列を
含む。ｐＤＡ３１８中のｃＤＮＡ挿入部の配列は次の通
りである。

ＡＧＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＣＧＧＣＣＴ
ＣＡＧＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣ
ＴＣＡＣＡＧＴＣＡＴＣＡＡＴＴＡＴＡＧＡＣＣＣＣＡ
ＣＡＡＣＡＴＣ；ＣＧＣＣＧＡＡＡＴＡＣＴＧＴＡＡＡ
ＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡ
ＧＧＡＣＴＴＡＧＧＡＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣ
ＴＧＣＣＣＴＡＣＡＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣ第１
図は、ｐ　ＢＨ３２２のＢａｍＨ１部位にサブクローニ
ングされ友７キロベースのクラミジア・トラコマチス（
Ｃｈｌａｍｙｈｄｉａ　　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ク
ローン　ｐｃＨＬ２（公家が入手可能）挿入部の制限地
図を示す。この地図は、１５００ｂｐの挿入部を有する
サブクローンＭ１３ｍｐ９ＣＨＬ２．１の由来を示す。

Ｐｓｔｌ及びＸｍａ１部位間のこの１．５ｋｂ断片を酵
素Ｐｓｔｌ及びＸｍａＩにより切り出し、そしてＭ１３
ｍｐ９中のＰａｔＩ及びＸｍａ１部位に連結してサブク
ローンＭ］３ｍｐ９ＣＨＩ、２．１を得友。この制限地
図を第２図に示す。

ファージ株Ｍ１３ｍｐ　１０　（ペーリンガーマンハイ
ムから商業的に入手することができ、そして１９８３年
ＢＲＬカタログの８８−８９頁に記載されている）を用
い念。Ｍ１３ｍｐｌＯは、第３図Ｂに示すそのクローニ
ング領域を除きＭ１３ｍｐ９と同じである。第３図に、
Ｍ１３ｍｐ９及びＭ１３ｍｐｌＯのこれらの領域の差異
を示す。ｐＤＡ３１８のｃ　ＤＮＡ挿入部及びＭｌ　３
ｍｐ　１０　Ｒ，Ｆ、　ＤＮＡの両者を制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ７で切断し、そしてＤＮＡ断片を相互に連結し。

七り、　テＥ、　コリＪＭ１０３株（ペセスダ、メリー
ランドのペセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから入手
できる）に形質転換した。形質転換株の調製のための方
法はＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　（１９８１）　Ｔｈ１ｒ
ｄ−ル、アメルシャム１４３−１５３に記載されている
。制限分析により、培地に分泌された単鎖−二ら論。

Ｍｌ３　　　　　　　　　の１つが所望のｐＤＡ３１８
の１２００塩基挿入部を所望の方向に含有することが確
立てれ友。この１２００塩基挿入ｆ！Ａを含有するＭ１
３ファージを単離し、セしてＤＮＡ　ｔ−抽出し、セし
て精製した。

この単鎖Ｍ１３ファージＤＮＡを、ｌ　ＯＯ４／ｒｎｌ
のこのプローブと３０μＭの化合物Ａ又は３００μＭの
化合物Ｂとを混合することＫより、化合物Ａ（ＢＦ２　
）又は化合物Ｂ（ＢＦ２）により別々に標識した。チュ
ーブを、３６０　ｎｍ　、　３０　ｍＷ／ｃｍ２の紫外
線によｌ’ｌｌＯ分間照射し、そして反応した物質をエ
タノール沈澱により単離し友。（さらに一般的には、導
入の友め、グローブの濃度は１００μＩ／　ｍｌ〜１ｍ
ｙ／ｖｔｌの範囲であることができる。）サザンプロッ
ト上に見られるバンドを同定するためのビオチン化分子
債マーカーを、制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＥＩＩ　
にューイングランドビオラブスから入手できる）により
完全消化されそしてＤＮＡ　ｆローブ標識化について記
載したのと同じ方法によりピオチン化されたバクテリオ
ファー・ソλＤＮＡから調製し念。

トリチウム標識されたビオチン化プソラシンの導入を測
定することによって各グローブへのピオチン標識の導入
の程度を決定した。導入を測定するため、トリチウムを
含有する化合′吻ＡをＤＮＡと複合体を形成せしめ、そ
して反応せしめた。照射段階の後、全反応混合物を０．
３Ｍ酢酸ナトリウム中に入れた。２容量のエタノールを
加え、そして次に混合物をドライアイス／エタノール浴
中で冷却した。沈澱し友物質を約１０，０ＯＯＸ、９に
て１５分間遠心分離してそれをベレット化した。次に、
上清を廃棄し、そしてベシン）ｆ−２０℃の８０４エタ
ノールで洗浄した。ペレットを１０ｍＭＴｒｌｓ−ＨＣ
ｌ　、　１　ｍＭ　）ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，Ｏ）中に再
懸濁した。ＤＮＡ濃度を決定するため、２６０ｎｍにて
光学濃度を測定した。導入された化合物Ａの量を測定す
るため、標跣された物質の小アリコートをシンチレーシ
ョン分光法により計数した。

［１，ＨＬＡ挿入部へのグローブの７１イブリダイゼー
シ、ン ２μｙのヒトＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ■
で消化し、１４アがロースミニグルで電気泳動し、そし
て５ｏｕｔｈｅｒｎ　（（１９７５）　ＪＭＢ　９８：
５０３−５１７）により記載された方法を用いて３枚の
ナイロン膜の１つに移した。幾つかのレーンに、ビオチ
ン化ＤＮＡ分子量マーカー（前記）、及び／又は同じ制
限エンドヌクレアーゼにより消化すれたホモ接合型セル
ラインＷＴ５１　（Ｔｌ　５ａｕｅ　Ａｎ　ｔ　１　ｇ
ｏ　ｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｉｍｐｅｒｉａｌ　Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦｕｎｄ　＋ロンドン、
イングランド）から単離されたｒツムＤＮＡから成る陽
性対照を含めた。膜に移行せしめた後、フィルターに結
合したヒ）　ＤＮＡ　ｉ　。

５ｏｕｔｈｅｒｎ等、前掲により記載されているように
。

塩基、Ｔｒ　ｌ　ａ−ＨＣＬ緩衝液による中和及び真空
オープン中８０℃における１時間以上にわ之るベーキン
グを用いて膜に固定した。次に、膜を蒸留水により１分
間湿らせ、そして封止可能な袋に入れた。

次に、５０係ホルムアミドｙ　５　Ｘ　５ｂＰＥ　ｒ　
Ｏ−５ｗ／ｖ憾ＳＤＳ　、　Ｏ〜１０優（好ましくは５
係）硫酸デキストラン及び１５０μ９７ａｔ変性ニシン
精子ＤＮＡを含む５×デンハート溶液から放るプレハイ
ブリダイゼーション溶液を上記膜に加え友。この膜をこ
の溶液と共に４２℃にて２〜４時間インキュベートした
。次に、５０憾ホルムアミ）’、５ＸＳＳＰＥ。

０．５　ｗ／ｖ４　ＳＤＳ　、　Ｏ〜１０　％硫酸デキ
ストラン。

１５０　ｔｔ９　／ｒｌＬｌ変性ニシン精子ＤＮＡ及び
５０〜２００ｎｊｑ／ｍｌのいずれかのグローブを含む
５メデンハート溶液から成るハイブリダイゼーション溶
液管Ｑ、　ｌ　ｍｌ溶′ｇＪＬ／α２膜の量で前記の膜
に加え、そして膜を一夜（約１４〜１８時間）４２℃に
てインキエペートした。次に膜を、　２　Ｘ　５ＳＰＥ
、　０．５係トウイーン２０中で室温にて振とうしなが
ら５分間ずつ３回、そして０．２〜０．３　ｘ　５ＳＰ
Ｅ　、　０．５憾トウイーン２０中で振とうしながら６
０℃にて５分間ずつ３回洗浄して、グローブがハイブリ
ダイズしたサデンプロットを調製した。

ホースラディツシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ　）の量
ｔ、４０，０００　ｊｉ　／　ｍｏｌｅの仮定分子量、
及び２．５の仮定Ａ４０２　、１ｃｍ、。、１％　から
計算した。ストレグドアピノ７（ＳＡ）のｊｊｌｆ　６
０，０００　ｇ／　ｍｏｌｅの仮定分子量、及び３．０
の仮定Ａ２８０　、１ｃｍ、。、４％から計算しｔｏ １、９　ｍｌの０．１０Ｍリン酸ナトリウム（ｐｉｆ　
７．’５　）中に溶解されそして同じ緩衝液に対して４
℃にて透析された４０ｒｎｇのＨＲＰ　（シグマケミカ
ル社。

ＴｙｐｅＶＩ）に、同じ緩衝液に溶解した１４■／ｄの
ｍａｌ−ｓａｃ−）ＩＮｓＡエステル０．１４　ｒｎｌ
を加えた。

Ｂｈａｔｎａｇａｒ等＊　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　：　５ｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ−８ｔｒｕｃｔｕｒｖ−Ｆｕｎｃｔｌｏ
ｎ、　Ｄ、　Ｒ１ｃｈ等編（ロックフォード：ピアス・
ケミカル・カンパニー。

１９８１　）９７−１００頁は、酸としてＮ−マレイミ
ド−６−アミノカプロン酸を使用してｍａｌｓａｃ　Ｈ
ＮＳＡエステルを調製するために使用され得る。　ＴＮ
Ｐ−８ＡＣエステル及びＤＮＰ　−ＳＡＣエステルの調
製法を記載している。）ＩＮＳＡエステルはまた、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　：　１９８６　）により、”Ｎ
ｏｖｅｌＡｇｅｎｔ　ｆｏｒ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　５ｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓｔｏ　Ｃａｒｒｉｅ
ｒｓ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃｘ口ｏｎ”と題す
る章に記載されている。この混合物を、室温にて１０５
分間インキュベートし、０．０１０Ｍリン酸ナトリウム
、　０．００５　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ６，０）により
平衡化されたセファデックスＧ−２５の１０．５ｍ／の
カラム上で脱塩し、２００１ｄずつの同じ緩衝液に対し
て３回４℃にて透析した。誘導体にされたＨＲＰのマレ
イミド含量を、０，２■を０．５０１ｄの０．１０Ｍリ
ン酸ナトリウム、　０．００５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐｉ−
１７，０）中に溶解し、２０　μｉの０．７４　ｍＭ　
’ｙ　、ｘ。

ティンを添加し、室温にて５分間インキュベートし、４
〜／　ａｔの５．５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香
酸）３３μｌｔ−加え、室温にて２分間インキュペート
シ、そして分光光度計にてＡ４１２　”測定することに
より測定し友。この反応混合物及び蛋白質が添加されて
いない対照混合物間のΔＡ４，２の差を１．３６ＸＩＯ
Ｍ−・備　のΔε４，２で除したものが稀釈されたＨＰ
Ｒ中のマレイミドのモル濃度を与える。

１５〃ηのＳＡを１．５ｄの０．１０Ｍリン酸ナトリウ
ム（ｐ）１８．ｏ）に溶解し、４℃にて２００ｔｊずつ
の同じ緩衝液に対して３回透析し、そして同じ緩衝液中
Ｋ　６　Ｉｎｇ／ｍｌの濃度に稀釈した。Ｓ−アセチ／
Ｌ／　メルカプトコハク酸（ＳＡＭＣＡ　）’ｔ　８．
８　Ｉｎｇ／Ｆｉｌｌの濃度で２メチルホルムアミド９
中に溶解した。１２■の透析されたＳＡに１２５μｌの
このＳ　ＡＭＣＡ溶液を室温にておだやかに攪拌しなが
ら室温にて約１分間添加した。室温にて３０分間のイン
キュベーションの後、０．１０　Ｍ　Ｔｒｉａ−ＨＣｔ
、　０．００５　ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ６，８’）により
平衡化したセファデックスＧ−２５の９ＩＩＬｔのカラ
ム上で、前記反応混合物を脱塩した。プールされ友蛋白
質ｙｋ４℃にて２００ｍ１ずつの同じ緩衝液に対して３
回透析した。透析され誘導体にされたＳＡを室温にて１
０ＩＩｌ！７７ｍ１に、ＹＭＩＯ膜を有する限外濾過装
置において濃縮した。

１０■の濃縮されたＳ　Ａ　’ｋ　、０．１０　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｔ。

０．００５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ６，８）中１．０Ｍヒド
ロキシルアミンＱ、５ｄとおだやかに攪拌しながら混合
し友。室温にて３０分間のインキュページ、ンの後、０
．０１０Ｍリン酸ナトリウム、　０．００５　Ｍ　ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ６，０）により平衡化されたセファデックス
Ｇ−２５の１０．５ｍｊｍツカラム上塩し友。プールさ
れた蛋白質ピークの小アリコートを、０．１０Ｍリン酸
ナトリウム（ｐＨ８，０）中１　ｍＭの濃度に５，５′
−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を加えた後Ａ４１
２の変化を測定することにより反応性チオールについて
測定し次。

ＨＲＰ上のマレイミドの測定及びＳＡ上のチオールの測
定を、これらを混合してカップリング反応を行う直前に
行った。次に、０．６７マレイミド／１（ＲＰを担持す
る１３、Ｏｍ９　／　ｍｌのＨＲＰを３．９４ｍ１゜水
浴中で、９．６６チオール／ＳＡを担持する４、１９■
／ｍＡ！ＳＡの２゜４７ｍと混合した。５℃にて２４時
間のインキュベーションのｉ、ｏ、ｏｌｏＭリン酸ナト
リウム、０．００５ＭＮ凰ＥＤＴＡ　（ｐｉ−１６、Ｏ
）中に溶解し友４．６１η／　ｍｌのＮ−エチルマレイ
ミド０゜４７ｍ１を添加し、そして室温にて３０分間イ
ンキュベートすることにより、未反応チオールをブロッ
クした。

２．５Ｘ８０口刀ラム上、４℃、０．１０Ｍリンを俊ナ
トリウム（ｐＨ６，８）中での、３　ｍｌ　７時の流速
でのダル濾過クロマトグラフィーにより１反応混合物を
異る平均ＨＲＰ／ＳＡモル比の接合体プールに分画し、
未反応ＨＲＰから分離した。接合体プールの組織を、Ａ
４０２／Ａ２８０比から分光光度法により推定し、そし
てニュクレア・ファースト・グリーン染色６〜２０４グ
ラジエント５Ｏ８−ＰＡＧＥ　）ｒ”ｋ　（還元条件下
で移動）のデンシトメータースキャンニングにより正確
に定量し念。約１０■の２−ｍｅｒ及び３−ｍ＠ｒ混合
物（２ＨＲＰ：ＳＡ及び３　ＨＲＰ　：　ＳＡを含有す
るもの）並びに５■の純粋な１−ｍｅｒｉｒルｐ過から
回収し友。検出可能なカップリングしていないＳＡ又は
）（ＲＰを含有しないこれらの接合体プールを４℃にて
数ケ月間貯蔵し次が、蛋白質及びＨＲＰ触媒活性の喪失
はほとんど起らなかった。ヒトグノムーサデンプロット
にハイブリダイズするピオチン化ＤＮＡプローブの検出
において２−ｍａｒ及び３−ｎｏｒの混合物が優先的に
使用されたが、１−ｍ＠ｒもほとんど同じ染色強度を与
えた。

すべての操作を室温にて行った。この例のセクション■
からの、グローブとハイブリダイズしたサザンプロット
を、　０．１　Ｍ　ＮａＣ２及び５係のトリトンＸ−１
００が添加されたリン酸緩衝化塩浴液（２，７ｍＭ　Ｍ
Ｃ１、１３６，９ｍＭ　Ｎ＆Ｃ１、１，５ｍＭＫＨ２Ｐ
Ｏ４及び８　ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４）　（緩衝液Ａ）３
５ｄ中で１回すすいだ。５分間おだやかに攪拌した後、
すすぎ浴剤を、　ＨＲＰ成分が０．３μｉ／＝ＩＬｌで
存在するような濃度でＨＲＰ　−ＳＡ　’ｅ金含有る緩
衝液Ｂで置き換えた。緩衝液Ａ＋ＨＲＰ−８Ａの量は膜
ｍ２当り０．５〜ｌ　ｍｌであった。接合体を膜と共に
２０分間、攪拌を伴って又は伴わないでインキ−ベート
Ｌ７’ｃ。

次に、膜を清浄な４トリ皿に取り出し、そして０．１５
Ｍの１，１−ノエチル尿素が添加された４５ｍｔずつの
緩衝ｒＬＡで５回すすいだ。次Ｋ。

０．１■／ｒｎｌのＴ′ＭＢｔ−含有する０、１０Ｍク
エン酸ナトリウム、５係エタノール（ｐＨ５，０）（緩
衝液Ｃ）中でおだやかに攪拌しながら５分間洗浄した。

この時点で、膜を、　０．１　ｍ９７ｍ１の薗及び０．
０００７壬のＨ２Ｏ２を含有する５０ｍ１の緩衝液Ｃ中
で、攪拌しないでインキ−ベートした。１５〜６０分間
の後、膜上のビオチン化ＤＮＡが位置するすべての場所
、すなわち分子量標準として使用されたビオチン化λＤ
ＮＡ断片又は標的ＤＮＡにノ・イブリダイズしたピオチ
ン化グローブが位置する場所において、暗青色のバンド
が出現した。満足なコントラストが得られた時、基質溶
液を膜から除去し、この膜を５０ｒＩ！／の水で５分間
ずつ４回、おだやかに攪拌しながらすすいだ。洗浄した
膜を、密封した試験管又はプラスチック・ぐラグ中水中
に、暗所に、室温、４℃、又は−２０℃にて貯蔵した。

この結果は、米国特許Ａ４，６１７，２６１中に記載さ
れている部分的に２本鎖のグローブを使用した場合に比
べてパックグラウンドは高いが、両単鎖プローブは単コ
ピー遺伝子標的を適切に検出した。さらに、化合物Ｂは
、化合物Ａに比べて同じハイツＩＪ　／イゼーション条
件に対して感受性が低いことが見出された。

なお、単鎖ハイブリダイゼーション領域を含む単鎖核酸
を得る几めのＭｌ３法は、Ｌｅａｒｙ等、前掲、及びＷ
ａ　ｒ　ｄ等のＥＰｏ、０６３，８７９．前掲、により
教示されるＤＮＡにピオチンを導入する方法において必
要とされるＤＮＡポリメラーゼＩのごトキ比較的高価な
酵素の使用を含まない。さらに、上記の係続中の出願中
に記載されているように部分的に２本鎖のグローブがグ
ソラシン化される場合のごとく、ギャップのある環状体
を造成する必要がない。この発明のプローブは研究のた
め１例えばｃＤＮＡについてλライブラリーをスクリー
ニングするために特に有用である。なぜなら、この技法
は実施し、そして検出する友めに迅速だからである。

ＭＭ　２９４宿主中のグラスミドｐＤＡ３１８Ｆｉ、ア
メリカン・タイグ・カルチュアー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）とシタスコーポレーションとの契約に基き、１９
８４年１１月８日に扁３９，９１７として米国ＭＤ２０
８５２．ロックビル、　ＡＴＣＣに寄託さＦした。Ａｒ
ＣＣとの契約は、このグラスミド含有宿主の子孫の永久
的な入手可能性を、公家に対して１本寄託全記載しそし
て特定している米国特許の発行の後、又は米ｌもしくは
外国の時計出願の公家への公告もしくは公開の後、いず
れが先に到来するにしても、そしてこの宿主の子孫の入
手可１毛性を、３５　ＵＳＣＳ　Ｉ　２２及びこれに基
く長官規則（８８６０Ｇ６３８への特定の言及を伴う３
７　ＣＦＲ５１，１４ｔ−含む）に従って米国特許商標
局長官によりその資格があると決定された者に与える。

本件出願人は、寄託されている宿主が適切な東件下で培
養された場合に死滅し、失われ又は破損した場合に１通
知の後、同じ宿主の生存培養物により迅速に置き換える
ことを承諾する。

要約すれば、この発明は、核酸配列を含有すると予想さ
れるサンプル中の核酸配列の存在を検出するためのハイ
ブリダイゼーションにおいて使用することができる検出
可能なプローブを提供する。

さらに、この発明はプローブのｌ遣方法、及び試験サン
プル中の核酸の検出方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、　ｐＣ）Ｌ２、すなわちｐＢＲ３２２のＢａ
ｍＨ１部位だクローニングされたクラミジア・トラコマ
チス（Ｃｈｌａｍｙｄｌａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｌｓ）
ｆラスミドの制限地図を示す。ｐＣＨＬ２のＭｌ　３ｍ
ｐ９ＣＨＬ２．１サブクローンは、示されているように
Ｘｍａｌ及びＰｓｔｌ制限部位間の約１５００塩基対の
挿入部である。 第２図は、プラスミドｐＣ）Ｌ２からの挿入部を含有す
るＭｌ　３ｍｐ９ＣＨＬ２．ｌの制限地図を表わす。 第３図は、　Ｍ１３ｍｐ９　（第３図Ａ）のクローニン
グ領域及びＭｌ　３ｍｐ　ｌ　Ｏ（第３図Ｂ）のクロー
ニング領域を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、単鎖核酸を標識する方法であって、 （ａ）核酸を、次の式： 〔Ａ〕−〔Ｂ〕−Ｌ 〔式中、Ａはアルキル化成分であり；Ｂは次の式：▲数
   式、化学式、表等があります▼ （式中、ＹはＯ、ＮＨ又はＮ−ＣＨＯであり、ｘは１〜
   ４の数であり、そしてｙは２〜４の数である）で表わさ
   れる２価有機成分であり；そしてＬは１価標識成分であ
   り；ここで、Ｂは前記アルキル化及び標識成分の部分を
   含まない〕 で表わされる１又は複数の標識用組成物と接触せしめる
   ことにより、該標識用組成物のアルキル化成分と前記核
   酸との複合体を形成せしめ；そして（ｂ）該複合体を活
   性化して前記核酸への前記アルキル化成分の共有結合を
   誘導する；段階を含んで成る方法。 ２、相同な核酸配列を検出するための標識された単鎖核
   酸ハイブリダイゼーションプローブの製造方法であって
   、 （ａ）検出されるべき核酸配列とハイプリダイズするこ
   とができる単鎖領域を含んで成る単鎖核酸を、次の式： 〔Ａ〕−〔Ｂ〕−Ｌ 〔式中、Ａはアルキル化成分であり；Ｂは次の式：▲数
   式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｙは０、ＮＨ又はＮ−ＣＨＯであり、ｘは１〜
   ４の数であり、そしてｙは２〜４の数である）で表わさ
   れる２価有機成分であり；そしてＬは１価標識成分であ
   り；ここで、Ｂは前記アルキル化及び標識成分の部分を
   含まない〕 で表わされる１又は複数の標識用組成物と接触せしめる
   ことにより、該標識用組成物のアルキル化成分と前記核
   酸との複合体を形成せしめ；そして（ｂ）該複合体を活
   性化して前記核酸への前記アルキル化成分の共有結合を
   誘導する；段階を含んで成る方法。 ３、前記核酸がＤＮＡであり、そして前記ラベル化成分
   が非放射性である、特許請求の範囲第１項又は第２項に
   記載の方法。 ４、相同なＤＮＡ配列を検出するための標識された単鎖
   ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの製造方法であ
   って、 （ａ）検出されるべき配列に相補的な配列を含有するＤ
   ＮＡ断片をバクテリオファージＭ１３のゲノムにその中
   の制限部において挿入しそして該ファージから前記ＤＮ
   Ａ断片を含有する環状単鎖ＤＮＡを調製し； （ｂ）段階（ａ）からのＤＮＡを、次の式：〔Ａ〕−〔
   Ｂ〕−Ｌ 〔式中、Ａはアルキル化成分であり；Ｂは次の式：▲数
   式、化学式、表等があります▼ （式中、ＹはＯ、ＮＨ又はＮ−ＣＨＯであり、ｘは１〜
   ４の数であり、そしてｙは２〜４の数である）で表わさ
   れる２価有機成分であり；そしてＬは１価標識成分であ
   り；ここでＢは前記アルキル化及び標識成分の部分を含
   まない〕 で表わされる１又は複数の標識用組成物と接触せしめる
   ことにより該標識用組成物のアルキル化成分と前記核酸
   との複合体を形成せしめ；そして（ｃ）該複合体を活性
   化して前記単鎖ＤＮＡへの前記アルキル化成分の共有結
   合を誘導する；ことを含んで成る方法。 ５、前記標識用化合物のＡが次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、そして前記活性化段階（ｂ）を、紫外線により
   前記複合体を照射することにより行う、特許請求の範囲
   第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法。 ６、相同な核酸配列を検出するための標識された単鎖核
   酸ハイブリダイゼーションプローブであって、検出され
   るべき核酸配列とハイブリダイズすることができない単
   鎖領域に隣接して検出されるべき核酸配列とハイブリダ
   イズすることができる単鎖領域を含んで成り、このプロ
   ーブは少なくとも１個のアルキル化成分に共有結合して
   おり、このアルキル化成分は今度は次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＹはＯ、ＮＨ又はＮ−ＣＨＯであり、ｘは１〜
   ４の数であり、そしてｙは２〜４の数である）で表わさ
   れる２価有機成分に結合しており、この有機成分は今度
   は１価標識成分に結合しており、ここで前記２価有機成
   分は前記アルキル化及び標識成分の部分を含まない、前
   記プローブ。 ７、特許請求の範囲第６項に記載のプローブと、このプ
   ローブの標識成分と共に複合体を形成することができる
   ポリペプチド、レクチン又は抗体とを含んで成る複合体
   。 ８、１又は複数の核酸配列を含有すると予想されるサン
   プル中の１又は複数の核酸配列の存在を検出するための
   方法であって、 （ａ）サンプルを、該サンプルの細胞、動物細胞膜、体
   液、ウイルスキャプシド、細菌細胞壁、細菌膜又は組織
   を開きそしてサンプル中の１又は複数の核酸の鎖を露出
   せしめそして分離するのに十分な試薬の有効量と接触せ
   しめ； （ｂ）前記の露出されそして分離された鎖を特許請求の
   範囲第６項に記載の有効量のハイブリダイゼーションプ
   ローブと、ハイブリダイゼーション条件下で接触せしめ
   ；そして、 （ｃ）プローブへの相同な核酸のハイブリダイゼーショ
   ンが起ったか否かを、該プローブ上の標識成分により検
   出する； ことを含んで成る方法。 ９、１又は複数の核酸配列を含有することが予想される
   サンプル中での１又は複数の核酸配列の存在を検出する
   ための方法であって、 （ａ）サンプルを、該サンプルの細胞、動物細胞膜、体
   液、ウイルスキャプシド、細菌細胞壁、細菌膜又は組織
   を開き、そしてサンプル中の１又は複数の鎖を露出せし
   めそして分離するのに十分な試薬の有効量と接触せしめ
   ； （ｂ）段階（ａ）の前、この段階中又はその後に、前記
   サンプルを不活性支持体に付着せしめ； （ｃ）前記付着したサンプルを、実質的に単鎖形の前記
   １又は複数の核酸を前記支持体に固定するのに十分な試
   薬の有効量と接触せしめ； （ｄ）前記固定された単鎖形核酸を特許請求の範囲第６
   項に記載のハイブリダイゼーションプローブの有効量と
   、ハイブリダイゼーション条件下で接触せしめ；そして
   、 （ｅ）相同な単鎖核酸配列のハイブリダイゼーションを
   、前記プローブ上の標識成分により検出する； ことを含んで成る方法。 １０、ＨＬＡのタイプ分けを行う方法であって、（ａ）
   個体からのゲノムＨＬＡ　ＤＮＡを、ＨＬＡ　ＤＮＡの
   多型性消化パターンを生成する制限酵素により消化し； （ｂ）この消化生成物をゲル電気泳動にかけ；（ｃ）段
   階（ｂ）からのサンプルを膜に移行せしめ；（ｄ）前記
   サンプルを、該サンプル中の核酸を露出しそしてこのサ
   ンプル中の１又は複数の核酸の鎖を分離するのに十分な
   塩基の有効量と接触せしめ；（ｅ）前記サンプルを中和
   し； （ｆ）前記サンプルを紫外線、乾燥溶剤又は熱に暴露し
   て、このサンプル中の実質的に単鎖形の前記１又は複数
   の核酸を、このサンプルが付着した前記膜上の位置とお
   よそ同じ膜上の位置に固定し；（ｇ）前記固定された単
   鎖ＤＮＡサンプルを、前記膜と使用されるべきプローブ
   との非特異的反応を回避する試薬の有効量と接触せしめ
   ； （ｈ）前記固定された単鎖ＤＮＡサンプルを、ハイブリ
   ダイゼーション領域として単鎖ＨＬＡ遺伝子を含有する
   特許請求の範囲第６項に記載のハイブリダイゼーション
   プローブの有効量と接触せしめ；（ｉ）前記サンプルを
   洗浄してハイブリダイズしていないプローブを除去し； （ｊ）サンプル中に存在する１又は複数の相同な単鎖核
   酸配列のハイブリダイゼーションをプローブ上の標識成
   分により検出し；そして、 （ｋ）段階（ｊ）からの検出された生成物を既知サンプ
   ルの制限断片パターン及び／又は分子量マーカーと比較
   する； ことを含んで成る方法。 １１、長さ及び特異性を異にする２以上の単鎖核酸の混
   合物を含んで成るマーカー混合物であって、この単鎖核
   酸が少なくとも１個のアルキル化成分に共有結合してお
   り、今度はこのアルキル化成分が次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＹはＯ、ＮＨ又はＮ−ＣＨＯであり、ｘは１〜
   ４の数であり、そしてｙは２〜４の数である）で表わさ
   れる２価有機成分に結合しており、この有機成分が今度
   は１価標識成分に結合しており、ここで前記２価有機基
   は前記アルキル化及び標識成分の部分を含まない、前記
   マーカー混合物。