DK160107B - Fremgangsmaade til detektering af en bestemt enkeltstrenget polynucleotidsekvens i et testmedium indeholdende enkeltstrengede nucleinsyrer og reagenssystem til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK h u '1 U / B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til detektering af en bestemt enkeltstrenget polynucleotid-sekvens ved hybridisering i et testmedium indeholdende enkeltstrengede nucleinsyrer samt et reagenssystem til an-5 vendelse ved denne fremgangsmåde.

Princippet for nucleinsyre-hybridiserings-bestemmelser er blevet udviklet af forskere på rekombinant-DNA-området som et middel til bestemmelse og isolering af bestemte polynucleotid-basesekvenser, der har interesse. Det har 10 vist sig, at enkeltstrengede nucleinsyrer, f.eks. DNA og RNA, således som de opnås ved denaturering af deres dobbeltstrengede former, vil hybridisere eller rekombi-nere under passende betingelser med komplementære enkeltstrengede nucleinsyrer. Ved mærkning af sådanne komple-15 mentære sonde-nucleinsyrer med en let detekterbar kemisk gruppe er det dernæst blevet gjort muligt at detektere tilstedeværelsen af enhver polynucleotidsekvens af interesse i et testmedium indeholdende prøve-nucleinsyrer på enkeltstrenget form.

20 Foruden på rekombinant-DNA-området kan den analy tiske hybridiseringsteknik anvendes til detektering af vigtige polynucleotider inden for områderne human og veterinær medicin, landbrug og næringsmiddelvidenskab samt andre områder. I særdeleshed kan teknikken anvendes til 25 detektering og identifikation af etiologiske midler såsom bakterier og vira, til screening af bakterier for antibiotisk resistens, til hjælp ved diagnose af genetiske sygelige tilstande, f.eks. seglcelleanæmi og thalassemia samt til detektering af cancerceller. En generel 30 oversigt over teknikken og dens nuværende og fremtidige signifikans foreligger i Biotechnology (August 1983), side 471-478.

Teknikkens stade med hensyn til nucleinsyre-hybri-diserings-bestemmelsesmetoder omfatter kemisk modifika-35 tion af enten sonde-nucleinsyren eller prøve-nucleinsyrer med det formål at mærke og detektere. Nødvendigheden af kemisk modifikation af nucleinsyrer begrænser i alvorlig 2 Π k" Α- ' η ί ί > ^ ο U W : ιί υ / υ ο grad den praktiske anvendelighed af teknikken, eftersom den kræver fremstilling i stor skala af mærkede jsonder, hvilket medfører komplicerede og dyre syntese- og rensningsprocedurer eller in situ-syntese af mærkede prøve-5 -nucleinsyrer, udført af den, der anvender analysen. I særdeleshed skal det resulterende, mærkede polynucleotid bibeholde evnen til at hybridisere effektivt med dets komplementære prøve- eller sondesekvens. Et sådant krav begrænser alvorligt tilgængeligheden af anvendelige synte-10 tiske metoder til mærkningsmodifikation af polynucleoti-der, der tænkes anvendt ved hybridiseringsbestemmelser.

De tidlige hybridiseringsmetoder involverede anven- 3 32 125 delsen af radioaktive mærkninger såsom Η, P og I.

Mærkede sonder syntetiseres enzymatisk ud fra radioaktivt 15 mærkede nucleotider og et polynucleotid ved sådanne metoder som nick-translation, ende-mærkning, syntese af anden streng, omvendt transkription og transkription. Det er således et yderligere krav til sådanne enzymatiske metoder, atde modificerede eller mærkede nucleotider skal 20 tjene som effektive substrater for de polymerase-enzymer, der er involveret i samlingen af det mærkede polynucleotid. Direkte kemisk modifikation af polynucleotidet er også mulig, men en sådan metode er imidlertid ret ineffektiv ved inkorporering af mærkninger i polynucleotidet og 25 kan påvirke evnen hos polynucleotidet til at undergå hy-bridisering.

På grund af ulemperne ved håndtering og opbevaring af radioaktivt mærkede materialer er der blevet udfoldet betydelige, vedvarende beskræbelser på at udvikle anven-30 delige ikke-radioisotopiske mærkningsmetoder. Sådanne mærkninger har omfattet lysemitterende molekyler, f.eks. fluorescerende og kemiluminescerende midler samt ligandmolekyler, der er i stand til specifikt at blive bundet af modparts-bindemidler, som igen mærkes med detekterba-35 re kemiske grupper, f.eks. fluorescerende midler og enzy-

3 DK 'hiC 1 ϋ7 B

O

mer. Eksempler på ligand-mærkninger er haptener, der specifikt bindes af antistoffer, og andre små molekyler, for hvilke der eksisterer specifikke bindingsproteinér, f.eks. biotin, som bindes af avidin.

5 I britisk patentskrift nr. 2.019.408 beskrives der polynucleotid-sonder, der er mærket med biotin gennem cytochrom C-forbindende grupper, og som dernæst er detek-terbare ved hjælp af enzym-mærket avidin. En alternativ metode til mærkning af sonder med ligander med lav molekyl-10 vægt, f.eks. biotin, er beskrevet i den europæiske patentansøgning nr. 63.879. Ved denne teknik kondenseres 5-al-lylamin-deoxyuridin-triphosphat-derivater (dUTP) med den ønskede ligand-mærkning, og det således modificerede nu-cleotid inkorporeres ved hjælp af standard-enzymatiske πιει 5 toder i den ønskede sonde. Anvendelsen af lysemitterende mærkninger er foreslået i de europæiske patentansøgninger nr. 70.685 og nr. 70.687. Anden repræsentativ patentlitteratur, der vedrører hybridiseringsbestemmelser, er US patentskrift nr. 4.302.204, der vedrører anvendelsen af 20 visse vandopløselige polysaccharider til accelerering af hybridisering på en fast fase. Endvidere angår US patentskrift nr. 4.358.535 detekteringen af pathogener i kliniske prøver, og US patentskrift nr. 4.395.486 vedrører detekteringen af seglcelleanæmi-egenskaber under anvendelse af en 25 syntetisk oligonucleotid-sonde.

Metoder til direkte detektering af det polynucleo-tid-duplex, der dannes som hybridiseringsproduktet mellem prøve- og sonde-nucleotiderne, hvorved der kan ses bort fra den kemiske mærkning af det ene eller det andet poly-30 nucleotid, har i almindelighed ikke været heldige. Forsøg på at danne antistoffer, der selektivt vil binde dobbeltstrengede DNA/DNA-hybrider over enkeltstrenget DNA, er mislykket, jfr. Parker og Halloran, "Nucleic Acids in Immunology", ed. Plescia og Braun, Springer-Verlag, NY (1969), 35 side 18 ff. Nogen succes er blevet opnået ved frembringelse o 4 nix' < ' O -> 11 *' π

U i\ i 5) u i i.* / U

af antistoffer, der vil binde RNA/DNA-blandede hybrider og har lav affinitet for de enkeltstrengede polynucleotider, jfr. Rudkin og Stollar, Nature, 265, 472 (1977), Stuart el al., PNAS (USA), 78, 3751 (1981), Reddy og Sofer, Biochem.

5 Biophys. Res. Commun., 103, 959 (1981) og Nakazato, Biochem., 19, 2835 (1980), men sensitiviteten af disse metoder har ikke nået de niveauer, der kræves til kliniske hybridiserings-forsøg, og man har måttet anvende RNA-sonder, om hvilke det er velkendt, at de er ret instabile.

10 Der foreligger således et fastslået behov for en tek nik til detektering af hybridisering uden krav om kemisk modifikation af polynucleotider eller involvering af en mærkningsmetode med relativ enkelhed. Endvidere bør en sådan teknik kunne benyttes under anvendelse af en lang række mærk-15 ninger, især af den ikke-radioisotopiske type. Tilvejebringelsen af en nucleinsyre-hybridiserings-bestemmelsesmetode og et reagenssystem, der har disse og andre fordele, er hovedformålet med den foreliggende opfindelse.

I US patentskrift nr. 4.257.774 beskrives der en me-20 tode til detektering af forskellige forbindelser, der reagerer med nucleinsyrer, navnlig forbindelser, der er mistænkt som mulige mutagener eller carcinogener, ved måling af sådanne forbindelsers evne til at inhibere bindingen af indskudsforbindelser, f.eks. acridin-orange, til nuclein-25 syrer. M.C. Poirier et al., (1982), PNAS, 79, 6443-6447, beskriver fremstillingen af et monoklonalt antistof, der er selektivt for visse cis-platin/dobbeltstrengede DNA--komplekser i forhold til den fri cis-platinforbindelse og dobbeltstrenget DNA.

30 Det har nu vist sig, at hybridisering, der forekom mer mellem prøve-nucleinsyre og sonden ved nucleinsyre--hybridiserings-bestemmelser, kan detekteres med fordel ved hjælp af et antistof eller et egnet bindingsfragment deraf, der er i stand til at bindes til indskudskomplekser,

35 der dannes i forbindelse med den hybridiserede sonde. I

5

DK 1601ϋ 7 B

det væsentlige detekteres en bestemt enkeltstrenget poly-nucleotidsekvens i et testmedium indeholdende enkeltstrengede nucleinsyrer ved dannelse af et hybridiseringsaggregat eller -produkt, der omfatter hybridiseret sonde og en nucleinsyre-5 indskudsforbindelse bundet til dobbeltstrenget nucleinsyre i form af indskudskomplekser. Antistoffet eller fragmentet deraf anvendes derpå til detektering af indskudskomplekser i hybridiseringsaggregatet.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til detek-10 tering af en bestemt enkeltstrenget polynucleotidsekvens i et testmedium indeholdende enkeltstrengede nucleinsyrer, omfattende kombination af testmediet med (i) mindst en nu-cleinsyre-sonde indeholdende i det mindste én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til den 15 sekvens, der skal bestemmes i testmediet, under betingelser, der er favorable for hybridisering mellem den sekvens, der skal detekteres, og den komplementære sekvens i sonden, og bestemmelse af hybridiseret sonde, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der også tilsættes en nucleinsyre-20 -indskudsforbindelse, der er i stand til binding til dobbeltstrenget nucleinsyre i form af indskudskomplekser, og den hybridiserede sonde detekteres ved tilsætning af et antistof eller et fragment deraf, der er i stand til at bindes til indskudskomplekser i det resulterende hybridise-25 ringsprodukt, hvorpå antistoffet eller fragmentet deraf, der bliver bundet til sådanne komplekser, bestemmes.

Opfindelsen angår desuden et reagenssystem til detektering af en bestemt enkeltstrenget polynucleotidsekvens i et testmedium til brug ved den ovennævnte fremgangsmåde, 30 omfattende en nucleinsyre-sonde indeholdende i det mindste én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til den sekvens, der skal detekteres, og dette system er ejendommeligt ved, at det yderligere indeholder en nucleinsyre-indskudsforbindelse samt et antistof eller 35 et fragment deraf, der er i stand til binding med indskudskomplekser omfattende dobbeltstrenget nucleinsyre kompleks- 6 ) / ·' .· * f'< " M'? 1¾ U|\ ;s u / ‘-j bundet med indskudsforbindelsen.

Anvendelsen af nucleinsyre-hybridisering som et analytisk værktøj er fundamentalt baseret på DNA's dobbelt-strengede duplex-struktur. Hydrogenbindingerne mellem pu-5 rin- og pyrimidin-baserne af de respektive strenge i dobbeltstrenget DNA kan reversibelt afbrydes. De to komplementære enkeltstrenge af DNA, der er resultatet af denne sammensmeltning eller denaturering af DNA, vil forbindes (hvilket også betegnes som gendannelse eller hybridisering) 1° til gendannelse af duplex-strukturen. Som det nu er velkendt i teknikken, vil kontakt mellem en første enkeltstren-get nucleinsyre, enten DNA eller RNA, der indeholder en basesekvens, som er tilstrækkeligt komplementær til, dvs. "homolog med", en anden enkeltstrenget nucleinsyre under pas-15 sende opløsningsbetingelser, resultere i dannelsen af DNA/-DNA-, RNA/DNA- eller RNA/RNA-hybrider, alt efter tilfældet.

Den foreliggende opfindelse gør det muligt at detektere dannede hybrider ved at inducere en immunogen modifikation af dobbeltstrenget nucleinsyre i området af hy-20 bridiseringen eller i flankerende områder. Det resulterende produkt kan dernæst detekteres ved konventionelle bestemmelsesmetoder, baseret på bindingen af specifikt antistof til epitoperne eller antigene determinanter, der dannes på hybridiseringsproduktet. Den fornødne immunoge-25 ne modifikation af dobbeltstrenget nucleinsyre udføres i princippet ved binding af et molekyle, almindeligvis en lavmolekylær forbindelse, til duplexet. En sådan binding resulterer i dannelsen af en antigen determinant, der skelner dobbeltstrenget nucleinsyre fra både enkeltstrenget 30 nucleinsyre og det frie, ubundne modificerende molekyle. Dette udføres ved anvendelse af en modificerende forbindelse, der i det væsentlige ikke er i stand til at blive bundet til enkeltstrenget nucleinsyre, og som danner et bindingskompleks med dobbeltstrenget nucleinsyre, der 35 ændrer den normale spiral-relation mellem de to komplementære strenge i duplexet.

Ul\ ! ν’ \ V. . L-) 0 7

Et sådant modificerende molekyle som her beskrevet er en nucleinsyre-indskudsforbindelse, der fortrinsvis vil reagere med den normale nucleinsyre-spiral ved en ik-ke-covalent indsætning mellem basepar. Sådan indsætning 5 bevirker, ved denne foretrukne reaktion, at den tertiære struktur af spiralen ændres ved oprulning og forlængelse langs spiralaksen. En skematisk fremstilling af denne foretrukne indskuds-reaktion er vist på tegningen i fig. 1.

Det resulterende indskudskompleks er karakteriseret ved 10 nydannede antigene determinanter, der forstås at omfatte den indskudte modificerende forbindelse de genorienterede phosphodiesterase-grundstrukturer af de respektive strenge af duplexet.

Fortrinsvis er indskudsforbindelsen et af de gene-15 relt plane, aromatiske, organiske molekyler, der vides at danne indskudskomplekser med dobbeltstrenget nuclein-syre. Sådanne forbindelser kan eksemplificeres ved acri-dinfarvestofferne, f.eks. acridin-orange, phenanthridiner-ne, f.eks. ethidium, phenazinerne, furocoumariner, pheno-20 thiaziner eller quinoliner, jfr. også den følgende nærmere beskrivelse. Det bør forstås, at selv om den foreliggende opfindelse i det følgende beskrives under særlig henvisning til sådanne indskudsforbindelser, omfatter opfindelsen også anvendelsen af ækvivalente modificerende 25 molekyler, der som ovenfor beskrevet vil bindes til dobbeltstrenget nucleinsyre til frembringelse af en immunogen ændring i duplexet.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse kan indskudsforbindelsen kombineres med testmediet og derved bli-30 ve udsat for de dobbeltstrengede nucleinsyrer, der er til stede i og/eller dannes i hybridiserings-reaktionsblan-dingen, som en særskilt, fri forbindelse og bindes ikke-co-valent til sådanne dobbeltstrengede nucleinsyrer til dannelse af indskudskomplekser. Alternativt kan indskudsforbin-35 delsen passende bindes ved hjælp af kemiske bindinger, fortrinsvis covalente bindinger, til sonden. I det førstnævn- ο ’"W 'i λ' η ί η 7 ρ L/i\ ! U U ! U / b δ te tilfælde tilvejebringes der med den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til udførelse af en hybridiserings-bestemmelse, uden at der er behov for kemisk at modificere enten prøve- eller sonde-polynucleotidet til detekte-5 ring af hybridisering. I det sidstnævnte tilfælde tilvejebringes der en enkel, syntetisk simpel metode til mærkning af polynucleotider eller hybridiserings-aggregatet gennem anvendelsen af fotoreagerbare former af indskudsforbindelsen.

10 I alle udførelsesformer tilvejebringes der med den foreliggende opfindelse en i høj grad alsidig, sensitiv og specifik metode til detektering af hybridisering, baseret på antistof-binding til indskudskomplekserne i det dannede aggregat. Naturligvis kan passende fragmenter og polyfunk-15 tionelle former af antistoffet anvendes, således som dette er beskrevet nærmere i det følgende, og det vil forstås, at når udtrykket "antistof" anvendes i den foreliggende beskrivelse, menes der hermed også antistoffets fragmenterede og polyfunktionelle former, medmindre andet er angi-20 vet. Bestemmelse af bindingen af antistof til indskudskomplekser kan udføres på en lang række konventionelle måder og omfatter fortrinsvis anvendelsen af antistof mærket med en detekterbar kemisk gruppe, f.eks. en enzymatisk aktiv gruppe, et fluorescerende stof, et luminescerende stof, en 25 ligand, der kan bindes specifikt, eller en radioisotop.

Opfindelsen kan anvendes i forbindelse med alle konventionelle hybridiseringsbestemmelser, og den kan generelt anvendes i forbindelse med alle metoder, der er mulige, baseret på dannelsen af et hybridiseringsprodukt eller -aggre-30 gat indeholdende dobbeltstrenget nucleinsyre. I særdeleshed kan den enestående detekteringsmetode ifølge opfindelsen anvendes i opløsning og ved fast fase-hybridisering, derunder i det sidstnævnte tilfælde ved metoder, der omfatter immobilisering af enten prøve- eller sonde-nucleinsyrer og 35 sandwich-produkter.

o 9

DK -;C1U7B

Det hybridiseringsprodukt eller -aggregat, der dannes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, indeholder hybridiseret sonde og indskudsforbindelse bundet til dobbeltstrenget nucleinsyre i form af indskudskomplek-5 ser. Indskudskomplekserne kan omfatte dobbeltstrengede regioner dannet ved hybridisering mellem prøve- og sonde--nucleinsyrer. Alternativt kan sådanne dobbeltstrengede regioner være indeholdt i selve sonden, og i et sådant tilfælde kan de yderligere indskydes forud for anvendelsen af 10 sonden ved bestemmelsen. De detekterbare indskudskomplekser kan således dannes in situ under bestemmelsen eller kan være eksisterende i sonde-reagenset som præsenteret til testmediet. Endvidere kan indskudskomplekserne være kemisk bundet til en eller flere af strengene af indskuds-duplexet.

15 I almindelighed kan enhver variation følges, forudsat at hybridiseringsproduktet til slut indeholder indskudskomplekser, der kan detekteres ved hjælp af antistof-bindings--fænomenet, som er det underliggende grundlag ifølge den foreliggende opfindelse.

20 Med opfindelsen tilvejebringes der således en for delagtig nucleinsyre-hybridiseringsmetode og et reagenssystem. Der tilvejebringes desuden et nyt antistof-reagens, der er i stand til at danne binding med indskudskomplekser.

Fordelene ved den foreliggende opfindelse er mange 25 og signifikante. Opfindelsen kan anvendes i forbindelse med et meget stort antal ikke-radioaktive detekteringsmetoder. Endvidere er mærkningen af nucleinsyrer enkel, og der anvendes let syntetiserbare reagenser. Mærkning med indskudsforbindelsen kræver ikke dyre polymeraser, og mærk-30 nings-densiteten af indskudsforbindelsen kan let reguleres.

Visse foretrukne udføreIsesformer har andre fordele. I de udførelsesformer, hvor indskudsforbindelse-nucleinsyre-kom-plekset dannes in situ, kræves der ingen forudgående syntese af komplekset, og denne metode kan anvendes ved en ud-førelsesform, hvor en sonde immobiliseres på en fast bærer og neddyppes i en opløsning indeholdende prøven af nuclein- o ίο DK 1 ώ 01u 7 3 syre. I den'udførelsesform, hvor indskudsforbindelsen er covalent koblet til nucleinsyren, knyttes indskudsforbindelsen til sonden under fremstillingsprocessen, hvilket resulterer i et reguleret niveau af mætning. Ved denne me-5 tode nedsættes også brugerens udsættelse for et indskudsmiddel til et minimum, idet mange af disse midler kan være potentielt farlige.

På tegningen viser fig. 1 som allerede anført en skematisk fremstilling af den foretrukne interaktion mel-10 lem indskudsforbindelse og dobbeltstrenget nucleinsyre, som resulterer i et indskudskompleks, der kan detekteres ved hjælp af antistof.

På tegningen viser fig. 2-5 skematiske diagrammer for fire foretrukne hybridiseringer til anvendelse i for-15 bindelse med opfindelsen.

Indskudsforbindelse

Som beskrevet ovenfor er indskudsforbindelsen fortrinsvis et lavmolekylært, plant, sædvanligvis aromatisk, 20 men til tider polycyclisk molekyle, der kan bindes til dobbeltstrengede nucleinsyrer, f.eks. DNA/DNA-, DNA/RNA-eller RNA/RNA-duplexer, almindeligvis ved indsætning mellem basepar. Den primære bindingsmekanisme vil sædvanligvis være ikke-covalent, idet covalent binding forekommer 25 som et .andet trin, når indskudsforbindelsen har reaktive eller aktiverbare kemiske grupper, der vil danne covalen-te bindinger med nabostillede kemiske grupper på én eller begge de indskudte duplex-strenge. Resultatet af indskud er en spredning af tilstødende basepar til ca. det dob-30 belte af deres normale adskillelsesafstand, hvilket fører til en forøgelse i molekyllængden af duplexet. Endvidere skal der ske en afvikling af dobbeltspiralen på fra ca.

12 til ca. 36°, således at indskudsforbindelsen kan rummes. Generelle oversigter og yderligere information kan 35 fås fra Lerman, J. Mol. Biol., 3, 18 (1961), Bloomfield et al., "Physical Chemistry of Nucleic Acids", chapter 7, 11 o

DK 1 60 1 0 7 B

side 429-476, Harper og Rowe, NY (1974), Wering, Nature, 219, 1320 (1968), Hartmann et al., Angew. Chem.,_ Engl.

Ed., 7, 693 (1968), Lippard, Accts. Chem. Res., 11, 211 (1978), Wilson, Intercalation Chemistry (1982), 445 samt 5 Berman et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10, 87 (1981).

Et stort antal forskellige indskudsmidler kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Nogle klasser af disse midler og eksempler på specifikke forbindelser fremgår af den følgende tabel: 10

Klasser af indskudsforbindelser og repræsentative forbindelser Litteraturhenvisninger A. Acridin-farvestoffer Lerman, supra; Bloom field et al., supra; proflavin, acridin-orange, Millet et al., Bio- quinacrin, acriflavin polymers, 19, 2091 (1980) 1 δ B. Phenanthridiner Bloomfield et al., supra;

Miller et al., supra ethidium coralyn Wilson et al., J. Med.

Chem., 19, 1261 (1976) 20

ellipticin, ellipticin- Festy et al., FEBS

-kation og derivater Letters 17, 321 (1971);

Kohn et al., Cancer Res., 35, 71 (1976); LePecq et al., PNAS (USA) 71, 5078 (1974); Pelaprat et al., J. Med. Chem., 25 23, 1330 (1980) C. Phenaziner Bloomfield et al., supra 5-methylphenaz in-kation D. Phenothiaziner ibid.

chlorpromazin 30 e. Quinoliner ibid.

chloroquin quinin F. Aflatoxin ibid.

35

O

i 12

DK H<0107 B

G. Polycycliske carbonhydrider ibid.

og deres oxiranderivater 3,4-benzpyren benzopyren-diol- Yang et al., Biochem.

-epoxid, 1-pyrenyl- Biophys. Res. Coirtm., 5 oxiran 82, 929 (1978) benzanthracen-5,6-oxid Amea et al., Science 176, 47 (1972) H. Actinomycener Bloomfield et al., supra i

actinomycin D

1Q I. Anthracyclinoner ibid.

β-rhodomycin A daunomycin J. Thiaxanthenoner ibid.

miracil D

K. Anthramycin ibid.

15 L. Mitomycin Ogawa et al., Nucl.

Acids Res., Spec.

Publi., 3, 79 (1977),

Akhtar et al., Can. J.

Chem., 53, 2891 (1975) M. Platinkomplekser Lippard, supra.

20 n. Polyindskudsforbindelser echinomycin Waring et al., Nature, 252, 653 (1974)j Wakelin, Biochem., J., 157, 721 (1976)

Lee et al., Biochem. J., 25 tSostin 173' 115 <1378) i Huang BBM92Ra et a1·' Biochem., 19, tandem 5551(^80), Viswamitra et al., Nature 289, 817 (1981). 1 35 ο 13 Π Ι/’ * Π'· > ; - Ώ »-M \ ί V.,I V : Ο . ϊ_)

diacridiner LePecq et al., PNAS

(USA), 72, 2915 (1975); Carrellakis et.al.,

Biochem. Biophys.

Acta, 418, 277 (1976);

Wakelin et al., Bio- 5 chem, 17, 5057 (1978);

Wakelin et al., FEBS Lett., 104, 261 (1979);

Capeile et al., Bio. chem., 18, 3354 (1979);

Wright et al., Biochem., 19, 5825 (1980); Bernier 10 et al., Biochem. J., 199, 479 (1981); King et al., Biochem., 21, 4982 (1982) ethidium-dimer Gaugain et al., Bio chem., 17, 5078 (1978);

Kuhlman et al., Nuel.

15 Acids Res., 5, 2629 (1978); Marlcovits et al., Anal. Biochem., 94, 259 (1979); Dervan et al., JACS, 100, 1968 (1978); ibid., 101, 3664 (1979) 20 ellipticen-dimere Debarre et al., Compt.

og analoge Rend. Ser., D 284, 81 (1977); Pelaprat et al., J. Med. Chem., 23, 1336 (1980) heterodimere Cain et al., J. Med.

Chem., 21, 658 (1978); 25 Gaugain et al., Bio chem., 17, 5078 (1978)

trimere Hansen et al., JCS

Chem. Comm., 162 (1983);

Atnell et al., JACS, 105, 2913 (1983) 0. Norphillin A Loun et al., JACS, 104, 3213 (1982) 35 o 14

DK 160107 B

P. Fluorener og fluorenoner Bloomfield et al., supra, fluorenodiaminer

Witkowski et a*l.,

Wiss. Beitr.-Mårtin-Luther-Univ. Halle Wittenberg, 11 (1981) 5 Q. Furocoumariner angelicin Venema et al., MGG,

Mol. Gen. Genet., 179, 1 (1980) 4,5'-dimethylangelicin Vedaldi et al., Chem.-

Biol. Interact., 36, 10 275 (1981)

Psoralen Marciani et al., Z.

Naturforsch, B 27(2), 196 (1972) 8-methoxypsoralen Belognzov et al., Mutat.

Res., 84, 11 (1981);

Scott et al., Photochem.

15 Photobiol., 34, 63 (1981) 5-aminomethyl-8- Hansen et al., Tet. Lett., methoxypsoralen 22, 1847 (1981) 4,5,8-trimethylpsoralen Ben-Hur et al.,

Biochem. Biophys.

Acta, 331, 181 (1973) 20 4,-aminomethyl-4,5,8- Issacs et al., Biochem., trimethylpsoralen 16, 1058 (1977) xanthotoxin Hradecma et al., Acta

Virol., (Engl. Ed.), 26, 305 (1982) khellin Beaumont et al., 25 Biochim. Biophys.

Acta, 608, 1829 (1980) R. Benzodipyroner Murx et al., J. Het.

Chem., 12, 417 (1975);

Horter et al., Photochem. Photobiol., 20, 407 (1974) 30 S. Monostral Fast Blue Juarranz et al., Acta

Histochem., 70, 130 (1982).

35 15 DK ':·>ϋ';ϋ7Β

Flere udførelsesfonner for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse involverer den kemiske, f.eks. co-valente binding af indskudsforbindelsen til den ene af eller begge de komplementære strenge af et duplex. I det væsentlige 5 kan enhver bekvem metode anvendes til frembringelse af en sådan binding. På bekvem måde dannes bindingen ved gennemførelse af indskud med en reaktiv, fortrinsvis fotoreaktiv indskudsforbindelse, efterfulgt af bindingsreaktionen. En særlig nyttig metode omfatter anvendelsen af azido-indskuds-10 forbindelser. De reaktive nitrener frembringes let ved ultraviolet lys med lang bølgelængde eller synligt lys, og nitrenerne af arylazider foretrækker indsætnings-réaktioner i forhold til deres omlejringsprodukter, jfr. White et al., Methods in Enzymol., 46, 644 (1977). Repræsentative azido-15 -indskudsforbindelser er 3-azidoacridin, 9-azidoacridin, ethidion-monoazid, ethidium-diazid, ethidium-dimer-azid, jfr. Mitchell et al., JACS, 104, 265 (1982), 4-azido-7--chlorquinolin og 2-az ido fluor en. Andre anvendelige foto-reagerbare indskudsforbindelser er furocoumarinerne, der 20 danner [2+2]-cycloadditionsprodukter med pyrimidinrester. Alkylerende midler kan også anvendes, f.eks. bis-chlor-ethylaminer og epoxider eller aziridiner, f.eks. aflatoxi-ner, polycycliske carbonhydridepoxider, mitomycin og nor-phillin A.

25 Afhængigt af den hybridiseringsmetode, der anven des, kan der, som det vil blive beskrevet i det følgende, anvendes kemisk bundne indskudskomplekser på en lang række forskellige måder i forbindelse med opfindelsen. De kan dannes in situ i hybridiserings-reaktionsblandingen eller 30 i et efterfølgende fremgangsmådetrin, eller der kan være tale om et trin i syntesen af en mærket sonde- eller prø-ve-nucleinsyre. I det sidstnævnte tilfælde vil der, når indskud finder sted i området for komplementaritet mellem sonde- og prøve-nucleinsyrerne, dannes mono-bindinger, ef-3® terfulgt af denaturering af et sådant område til dannelse

DK 16 G ϊ ϋ 7 B

O

16 af enkeltstrenget nucleinsyre med kemisk bundet indskudsforbindelse orienteret således, at den forbundne, indskudsforbindelse ved hybridisering vil antage en indskuds-stilling.

5

Hybridiseringsmetoder og -sonder

Sonden vil omfatte i det mindste én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til eller homolog med den sekvens, der skal detekteres. Imidler-10 tid behøver en sådan basesekvens ikke at være et enkelt, kontinuerligt polynucleotidsegment, men kan være sammensat af to eller flere individuelle segmenter, afbrudt af ikke-homologe sekvenser. Disse ikke-homologe sekvenser kan være lineære, eller de kan være selv-komplementære og dan-15 ne hårnålespiraler. Desuden kan det homologe område af sonden ved 3'- og 51-terminalerne være flankeret af ikke-homologe sekvenser, f.eks. de, der indeholder DNA eller RNA af en vektor, i hvilken den homologe sekvens er blevet indsat til propagering. I alle tilfældene vil sonden som præ-20 senteret som et analytisk reagens udvise detekterbar hybridisering ved et eller flere punkter med prøve-nucleinsyrer, der har interesse. Lineære eller cirkulære, enkeltstrengede polynucleotider kan anvendes som sonde-elementet, idet væsentlige eller mindre væsentlige dele kan danne duplex 25 med en komplementær polynucleotid-streng eller -strenge, forudsat, at det kritiske homologe segment eller de kritiske homologe segmenter er på enkeltstrenget form og tilgængelige for hybridisering med prøve-DNA eller -RNA. Særligt foretrukne er lineære eller cirkulære sonder, hvori 30 den homologe sonde-sekvens er i det væsentlige kun på enkeltstrenget form, se navnlig Hu og Messing, Gene, 17, 271-277 (1982).

Når sonden anvendes ved en hybridiseringsmetode, der kræver anvendelse af en med indskudsforbindelse mær-35 ket sonde, kan en sådan sonde, som det fremgår af det føl- DK 1 60 1 07 3 17

O

gende, have en lang række forskellige former, f.eks. et fuldstændig enkeltstrenget polynucleotid med indskudsforbindelse kemisk bundet dertil, hvorved hybridiseringen resulterer i dannelse af indskudskomplekser. Alternativt 5 kan sonden indeholde en dobbeltstrenget portion eller dobbeltstrengede portioner, der er blevet indskudt, eventuelt med covalent binding af indskudsforbindelsen til en eller flere strenge i duplexet.

Med hensyn til hybridiseringsmetoder er den fore-10 liggende opfindelse navnlig rettet på dannelsen af et hybridiseringsaggregat indeholdende den hybridiserede sonde og indskudsforbindelsen bundet til duplexer i form af de antistof-detekterbare indskudskomplekser. Hybridise-ringsbegivenheden er således forbundet med dannelsen af 15 de detekterbare indskudskomplekser. Fundamentalt kan de resulterende indskudskomplekser i aggregatet befinde sig i regionen for hybridisering mellem prøve- og sonde-nu-cleinsyrerne eller kan være i en dobbeltstrenget region, der befinder sig fjernt fra hybridiseringsregionen. I det 20 sidstnævnte tilfælde kan den indskudte region dannes under bestemmelsen eller kan befinde sig i den indskudte tilstand, når bestemmelsen foretages, f.eks. covalent bundet eller ikke-covalent indskudte dobbeltstrengede regioder, der tjener som mærkninger for sonden.

25 Den praktiske udførelse af den omhandlede analyti ske metode er ikke begrænset til nogen bestemt form for hybridisering. Der kan således anvendes en vilkårlig konventionel hybridiseringsteknik. Efterhånden som der gøres forbedringer, og der udvikles nye metoder, kan sådanne 30 let anvendes ved udførelsen af den omhandlede metode. Konventionelle hybridiseringsmetoder, der er særligt anvendelige, omfatter de, hvor prøve-nucleinsyrer eller polynu-cleotid-sonden immobiliseres på en fast bærer (fast fase-hybridisering) og de, hvor polynucleotid-arterne alle er 35 i opløsning (opløsnings-hybridisering).

18 o

DK 160107B

Ved hybridisering i fast fase fikseres en af de po-lynucleotid-arter, der deltager i hybridiseringen, på en egnet måde i dens enkeltstrengede form på en fast bærer. Anvendelige faste bærere er velkendte i teknikken og om-5 fatter de, der binder nucleinsyrer enten covalent eller ikke-Covalent. Ikke-covalente bærere, der generelt forstås at involvere hydrofob binding, omfatter naturligt forekommende og syntetiske polymere materialer, f.eks. nitrocellulose, derivatiseret nylon og fluorerede polycarbonhy-10 brider, i en lang række forskellige former, f.eks. som filtre eller faste ark eller plader. Bærere til covalent binding kan også anvendes og omfatter materialer, der har en kemisk reaktiv gruppe eller grupper, såsom dichlortria-zin eller diazobenzyloxymethyl, der kan aktiveres til bin-15 ding til polynucleotider.

En typisk hybridiseringsteknik i fast fase begynder med immobilisering af prøve-nucleinsyrer på bæreren i enkel tstrenget form. Dette indledende trin hindrer i det væsentlige genforstærkning af komplementære strenge fra prø-20 ven og kan anvendes som et middel til koncentrering af prøvematerialet på bæreren til opnåelse af forøget detekter-barhed. Polynucleotid-sonden bringes dernæst i kontakt med bæreren, og hybridisering detekteres ved antistof-binding som beskrevet i denne beskrivelse. Den faste bærer udgør 25 et bekvemt middel til adskillelse af antistof, der bindes til indskudskomplekser associeret med hybridiseret sonde, fra materiale, der ikke bindes på sådan måde.

En anden metode, der har interesse, er sandwich-hy-bridiseringsteknikken, ved hvilken et ud af to indbyrdes 30 forskellige fragmenter af den homologe sekvens af sonden im-mobiliseres, medens det andet mærkes. Nærværelsen af den polynucleotidsekvens, der har interesse, resulterer i dob-belthybridisering til de immobiliserede og mærkede sonde--segmenter, igen med den samme endelige måling af bæreasso-35 cierede indskudskomplekser, jfr. Methods in Enzymology, 65, 0 19

DK oC Ur/ B

468 (1980) samt Gene, 21, 77-85 (1983), hvori yderligere enkeltheder kan findes.

Til bedre illustration kan det nævnes, at de følgende hybridiseringsmetoder i fast fase er særligt velegnede 5 i forbindelse med opfindelsen. Skematiske diagrammer af disse grundlæggende metoder foreligger på tegningen.

Metode af type 1

Ved denne metode, der er illustreret i fig. 2, im-10 mobiliseres først de enkeltstrengede nucleinsyrer fra det flydende testmedium på en fast bærer. Der dannes derpå en hybridiserings-reaktionsblanding ved tilvejebringelse af kontakt mellem de immobiliserede prøve-nucleinsyrer (S) med sonden (P), der i dette tilfælde ud over den komplementære, 15 enkeltstrengede portion omfatter mindst én dobbeltstrenget portion, der er kemisk forbundet med indskudsmaterialet (I) i form af indskudskomplekser. En særlig anvendelig form for sonden er den cirkulære form, der er beskrevet af Hu og Messing, jfr. ovenfor. Det resulterende hybridiseringsag-20 gregat omfatter det immobiliserede polynucleotid, der har interesse, hybridiseret med sonden, som har en covalent forbundet, indskudt dobbeltstrenget region. Den faste bærer, der bærer immobiliserede duplexer, adskilles dernæst præferentielt fra den resterende af reaktionsblandingen.

25 Antistoffet (Ab) tilsættes, fortrinsvis mærket med en de-tekterbar gruppe, og det resulterende immobiliserede antistof bundet til indskudskomplekser i aggregatet adskilles fra resten af reaktionsblandingen. Det antistof, der er bundet til bæreren, bestemmes derpå til fuldstændiggørelse 30 af bestemmelsen. Alternativt kan antistoffet i den fraskilte opløsning bestemmes, omend dette almindeligvis vil være mindre foretrukket, eftersom der normalt anvendes et stort overskud af antistof.

En variation af denne metode går ud på at anvende en 35 sonde som ovenfor nævnt, men uden covalent forbundet ind-

O

20

DK 160107 B

skudsmateriale bundet til den dobbeltstrengede region. I stedet sættes indskudsmaterialet til det immobiliserede aggregat, hvilket resulterer i dannelsen af indsJcudskom- plekser i både den dobbeltstrengede portion af sonden og ! j 5 duplex-regionen, der dannes ved hybridisering.

j

Metode af type 2

Dette er en sandwich-metode, der er illustreret i ’ j fig. 3. En reaktionsblanding dannes blandt testmediet in-10 deholdende den sekvens, der har interesse (S), og den første og anden sonde, der hver omfatter respektive i det mindste én basesekvens, der er komplementær til en derfra forskellig del af den sekvens, der har interesse. Den første sonde (P^ immobiliseres på en fast bærer, og den 15 anden sonde (P2) mærkes med covalent bundne indskudskomplekser som ved metoden af type 1, der er beskrevet i det foregående. Det fremkomne hybridiseringsaggregat indeholder den sekvens, der har interesse, hybridiseret til både den immobiliserede første sonde og den med indskudskom-20 pleks mærkede anden sonde. Antistoffet tilsættes, fortrinsvis på mærket form, og det resulterende immobiliserede antistof bundet til indskudskomplekser i aggregatet skilles fra resten af reaktionsblandingen. Der foretages bestemmelse af det bundne antistof, hvorefter bestemmelsen fuldstæn-25 diggøres.

Der findes flere nyttige variationer af denne metode. For det første, som i tilfælde af variationen af metoden af type 1, kan man anvende en sonde, der ikke indeholder covalent bundet indskudsforbindelse, idet man i ste-30 det kan sætte fri indskudsforbindelse til det immobiliserede aggregat, hvilket resulterer i dannelse af indskudskomplekser med alle tilgængelige dobbeltstrengede regioner. Som et alternativ til anvendelse af en anden sonde med en dobbeltstrenget portion kan man også anvende en sonde af ude-35 lukkende enkeltstrenget nucleinsyre med indskudsforbindelse

DK 'ί 6 01 ϋ '7 B

21

O

kemisk forbundet dertil således, at der ved hybridisering dannes indskudskomplekser, eller med indskudsforbindelse tilsat således, at der forekommer indskud mellem'de duple-xer, der dannes mellem de to sonder og den sekvens, der 5 skal detekteres.

Metode af type 3

Fig. 4 illustrerer en yderligere, foretrukken metode, der udføres i fast fase. Prøve-nucleinsyrerne brin-10 ges i kontakt med immobiliseret sonde, og de resulterende immobiliserede duplexer skilles fortrinsvis fra den resterende del af reaktionsblandingen. Ved denne metode befinder sonden sig på enkeltstrenget form. Det fremkomne hybri-diseringsprodukt indeholder den immobiliserede sonde hybri-15 diseret med den sekvens, der har interesse. Denne metode tillader også signifikant genforstærkning mellem komplementære regioner af prøve-nucleinsyre, der kan finde sted på det immobiliserede aggregat. Sådan genforstærkning medvirker til fordel for bestemmelsen, eftersom den tilveje-20 bringer yderligere dobbeltstrenget nucleinsyre til påfølgende indskud. Det næste trin i bestemmelsen er tilsætning af indskudsforbindelse og antistoffet, igen fortrinsvis på en mærket form. Bestemmelsen fuldstændiggøres ved adskillelsestrin og antistof-bestemmelsestrin som ved de 25 tidligere omtalte metoder.

Metode af type 4

Ved denne metode, der er illustreret i fig. 5, bringes de enkeltstrengede prøve-nucleinsyrer i kontakt med im-30 mobiliseret sonde, idet i dette tilfælde en sådan sonde er kemisk forbundet, f.eks. covalent, til indskudsmaterialet, således at duplex-dannelse i regionen af forbundet indskudsforbindelse resulterer i dannelse af indskudskomplekser. Dette er en i høj grad fordelagtig metode derved, at det er den 35 eneste kendte teknik, hvor sonden er både immobiliseret og o 7~S\S A r” (\ i 22 UK j [ u / b mærket, og hvor der ikke kræves noget immobiliserings- eller mærkningstrin, som skal udføres ved bestemmelsestidspunktet. Det resulterende aggregat indeholder covalent forbundne indskudskomplekser i området af hybridisering 5 mellem prøve- og sonde-nucleinsyrer og i alle genforstærkede prøve-regioner. Der tilsættes derefter antistof, og bestemmelsen gøres færdig som ved de tidligere metoder.

Denne metode tilvejebringer den fordel, at man eliminerer behovet for, at den, der foretager analysen, skal håndte-10 re opløsninger af den frie indskudsforbindelse, der i nogle tilfælde kan være potentielt farlig. En enkel variation af denne teknik består i at immobilisere prøve-nu-cleinsyrer i stedet for den mærkede sonde og gå frem på. normal måde. Dette er noget mindre fordelagtigt, men er en 15 praktisk metode at gå frem på.

En variant af fast fase-hybridiseringsmetoder kan også anvendes i forbindelse med opfindelsen. Sådanne metoder er karakteriseret ved det træk, at hybridiseringstrinet involverer opløselige former af både prøve-nucleinsyrerne og 20 af sonden. Dette kan resultere i signifikant hurtigere hy-bridiseringer, eftersom de kinetiske forhold er meget hurtigere, når begge strenge er i opløsning, sammenlignet med det tilfælde, hvor én af dem er immobiliseret. Normalt gøres de resulterende hybrider efter hybridiseringstrinet im-25 mobile af detekteringshensyn. En sådan immobilisering kan udføres på en række forskellige måder. Konventionelt er det kendt selektivt at immobilisere duplexer ved udsættelse for adsorbenter, f.eks. hydroxyapatit- og nitrocellulose-membraner .

30 En særlig anvendelig metode til immobilisering af hybrider, dannet ved en opløsningsfase-hybridisering, involverer anvendelsen af en sonde, der indeholder et bindingssted for et bindingsstof. Efter hybridiseringstrinet kan man dernæst tilsætte en immobiliseret form af bindingsstoffet, 35 der effektivt vil binde og immobilisere hybriderne ved hjælp

O

23 DK16C1U7B

af bindingsstedet på sonden. Et sådant bindingssted kan være til stede i en enkeltstrenget hybridiserbar portion af sonden eller kan være til stede som et resultat af en kemisk modifikation af sonden. Eksempler på bindingsste-5 der, der eksisterer i nucleotid-sekvensen, er dér, hvor sonden indeholder en promotor-sekvens, f.eks. lac-promo-tor eller trp-promotor, der kan bindes med et promotor--protein, f.eks. bakteriophag-promotorer eller RNA-polyme-rase, eller indeholder en operator-sekvens, f.eks. lac-ope-10 rator, der kan bindes ved hjælp af et repressor-protein, f.eks. lac-repressor, eller indeholder sjældne, antigene nucleotider eller sekvenser, f.eks. 5-brom- eller 5-iod--deoxyuridin, Z-DNA, der kan bindes med specifikke antistoffer, jfr. også britisk patentskrift nr. 2.125.964.

15 Bindingssteder indført ved kemisk modifikation af sonden er særligt anvendelige og involverer normalt forbindelse af et medlem af et specifikt bindingspar til sonde-nuclein-syren. Anvendelige bindingspar, hvorfra der kan vælges, omfatter biotin/avidin, haptener og antigener/antistoffer, 20 carbonhydrater/lactiner og enzymer/inhibitorer. Når bindingsparret består af et proteinholdigt materiale og et ikke-proteinholdigt materiale, foretrækkes det at forbinde det ikke-proteinholdige materiale til sonden, eftersom det proteinholdige materiale kan være instabilt under denature-25 ringsbetingelserne for hybridisering af sonden. Foretrukne systemer involverer forbindelse af sonden med biotin eller et hapten og anvendelse af henholdsvis immobiliseret avi-din eller anti-hapten-antistof. Fremstilling af anvendelige ligand-mærkede sonder er kendt fra litteraturen, jfr.

30 Langer et al., (1981), Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 6633,

Broker (1978), Nucl. Acids Res., 5, 363, Sodja et al., (1978), Nucl. Acids Res., 5, 385, Tchen et al. (1984),

Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 3466. Immobilisering af bindingsstoffet kan ske under anvendelse af konventionelle 35 metoder.

O

24

DK 160107 B

Der kendes et stort antal metoder til immobilisering af proteiner på faste bærere, og disse metoder kan anvendes til immobilisering af bindingsstoffet, jfr. Methods in En-zymology, Vol. 44 (1976). Antistoffer immobiliseres f.eks.

5 enten ved covalent kobling eller ved ikke-covalent adsorption. Ikke-covalente metoder, der hyppigt anvendes, er adsorption til polystyrenkugler eller mikropartikler og til polyvinylchlorid-overflader. Der anvendes mange covalente metoder til immobilisering af proteiner, og nogle få om-10 fatter cyanogenbromid-aktiverede agaroser og dextraner, glutar aldehyd-aktiverede nylonstoffer og polyacrylamider samt epoxider på acryliske og andre bærere.

De ovenfor beskrevne, illustrerende metoder foretrækkes især, men opfindelsen er imidlertid ikke begrænset til 15 nogen bestemt hybridiseringsmetode. Der kan anvendes enhver bestemmelsesmetode, forudsat, at der resulterer detek-terbare indskudskomplekser i forbindelse med hybridisering af sonde-nucleinsyren. Eksempelvis kan man udover de ovennævnte metoder anvende en hybridiseringsmetode i opløsnings-20 fase, hvor et fast-fase-antistof til indskudskomplekser anvendes til immobilisering af hybridiseret sonde. Der vil dannes tilstrækkeligt med indskudskomplekser i hybridise-ringsproduktet mellem prøve- og sonde-nucleinsyrer, idet de sidstnævnte befinder sig i det væsentlige kun på enkelt-25 strenget form, således at både fast fase-antistof og mærket antistof kan bindes. Mængden af mærkning, der er asso= cieret med den faste fase, måles dernæst og relateres til nærværelsen af den sekvens, der skal bestemmes.

30

Antistof-reagens og detekteringsmetoder

Et fundamentalt princip ved den foreliggende opfindelse er evnen til først at binde et antistof eller et fragment eller et andet ækvivalent deraf til hybridiserings-35 aggregatet omfattende hybridiseret sonde og dernæst at de-

O

25

DK 16 O Ί ϋ 7 B

tektere en sådan antistof-binding. Som anført ovenfor kan antistof-reagenset bestå af hele antistoffer, anjtistof--fragmenter, polyfunktionelle antistof-aggregater eller i almindelighed ethvert stof, der indeholder et eller flere 5 indskudskompleks-specifikke bindingssteder fra et antistof.

Når der er tale om en form af helt antistof, kan dette tilhøre enhver af klasserne og underklasserne af kendte immu-noglobuliner, f.eks. IgG eller IgM. Ethvert fragment af ethvert sådant antistof, der bibeholder specifik bindingsaf-10 finitet for indskudskomplekser, kan også anvendes, f.eks. fragmenterne af IgG, der konventionelt kendes som Fab, F(ab') og F(ab')2· Desuden kan der, når det findes passende, anvendes aggregater, polymere og konjugater af immuno-globuliner eller deres fragmenter.

15 Immunoglobulin-kilden for antistof-reagenset kan fås på enhver tilgængelig måde, f.eks. ved hjælp af konventionelle antiserum- og monoklonale metoder. Antiserum kan fås ved velkendt teknik, der involverer immunisering af et dyr, f.eks. en mus, en kanin, et marsvin eller en ged, med et 20 egnet immunogen. Immunogenet vil almindeligvis indeholde et ionisk kompleks mellem et kationisk protein eller proteinderivat, f.eks. methyleret okseserumalbumin, og det anioni-ske indskuds-nucleinsyre-kompleks. Ideelt set bør indskudsmaterialet være covalent koblet til den dobbeltstrengede 25 nucleinsyre. Alternativt kan indskuds-DNA-konjugatet være covalent koblet til et bæreprotein. Immunoglobulinerne kan også fås ved somatiske cellehybridiseringsmetoder, idet disse resulterer i, hvad der almindeligvis betegnes som monoklonale antistoffer. Det immunogen, der anvendes til primæ-30 re injektioner, der fører til dannelse af hybridomer, vil være som ovenfor beskrevet.

Antistof-reagenset vil være karakteriseret ved dets evne til binding med et indskudskompleks dannet mellem en udvalgt indskudsforbindelse og dobbeltstrenget nucleinsyre 35 i almindelighed under hensyn til de specifikke basesekvenser, o 26 DK16Ciu73 der befinder sig nær ved stedet for indskud. Det vil endvidere i det væsentlige være ude af stand til binding til enkeltstrengede nucleinsyrer eller til fri indskudsforbindelse. Som et resultat heraf vil antistof-binding kun forekom-5 me ved indskudskomplekser, som ved passende udformning af bestemmelsesmetoden vil være signifikant til stede kun i association med hybridiseret sonde.

Bindingen af antistof-reagenset til hybridiserings-aggregatet ved den her omhandlede metode kan detekteres ved 10 hjælp af enhver bekvem teknik. Med fordel vil antistofreagenset selv være mærket med en detekterbar kemisk gruppe.

En sådan detekterbar kemisk gruppe kan være ethvert materiale, der har en detekterbar fysisk eller kemisk egenskab. Sådanne materialer er veludviklede inden for området for 15 immunobestemmelser, og i almindelighed kan de fleste af sådanne mærkninger, der kan anvendes ved disse metoder, også anvendes i forbindelse med opfindelsen. Særligt anvendelige er enzymatisk aktive grupper, f.eks. enzymer, jfr. Clin.

Chem. (1976), 22, 1243, enzymsubstrater, jfr. britisk pa-20 tentbeskrivelse nr. 1.548.741, coenzymer, jfr. USA-patenter-ne nr. 4.230.797 og 4.238.565, og enzyminhibitorer, jfr. USA-patent nr. 4.134.792, fluorescerende midler, jfr. Clin.

Chem. (1979), 25, 353, chromophorer, luminescerende stoffer, f.eks. kemilumineserende stoffer og bioluminescerende stof-25 fer, jfr. Clin. Chem. (1979), 25, 512 samt ibid., 1531, ligander, der kan bindes specifikt, proximalt med hveran- 3 35 32 dre reagerende par samt radioisotoper såsom °H, S, P, *^1 og "^C. Sådanne mærkninger og mærkningspar detekteres på basis af deres egne fysiske egenskaber, f.eks. fluor-30 escerende midler, chromophorer og radioisotoper, eller deres reaktive eller bindingsegenskaber, f.eks. enzymer, substrater, coenzymer og inhibitorer. Eksempelvis kan et med cofaktor mærket antistof detekteres ved tilsætning af det enzym, for hvilket mærkningen er en cofaktor,og et substrat 35 for enzymet. Et antistof, der er mærket med et hapten eller

O

27

DK 160107 B

en ligand, f.eks. biotin, kan detekteres ved tilsætning af et antistof til haptenet eller et protein, f.eks,. avidin, der binder liganden, udstyret med et detekterbart molekyle. Et sådant detekterbart molekyle kan være et molekyle 5 med en målelig fysisk egenskab, f.eks. fluorescens eller absorbans, eller en deltager i en enzymreaktion, se f.eks. den ovenstående liste. Eksempelvis kan der anvendes et enzym, som indvirker på et substrat til frembringelse af et produkt med en målelig fysisk egenskab. Eksempler på sidst-10 nævnte omfatter, men er ikke begrænset til β-galactosidase, alkalisk phosphatase og peroxidase. Til studier af hybridi-sering in situ er slutproduktet ideelt set vanduopløseligt. Mærkninger, der er proximalt reagerende eller forbindende, kendes også på immunobestemmelsesområdet, jfr. Clin. Chem., 15 27, 1797 (1981) og VS patentskrifterne nr. 3.996.345 og 4.233.402, og kan anvendes ved den her omhandlede metode ved anvendelse af to forskellige populationer af antistoffer, den ene mærket med et medlem af parret, og den anden mærket med det andet medlem af parret. Eksempelvis mærkes en første del 20 af antistoffer til indskudskomplekser med et fluorescerende middel, og en anden del mærkes med et undertrykkende middel. Tilstedeværelsen af indskudskomplekser indikeres ved undertrykkelse af fluorescens på grund af proximal binding af antistoffer fra første og anden portion langs med det 25 indskudte nucleinsyre-duplex. Ligeledes kan der anvendes første og anden enzym-mærkninger, når produktet af €n er et substrat for den anden. Nærværelsen af komplekser indikeres dernæst ved forøget udbytte af det andet enzym på grund af en proximal enzym-kanaliseringseffekt. Andre mærk-30 ningsmetoder vil være åbenbare for enhver fagmand på området.

Alternativt kan antistoffet detekteres på basis af en nativ egenskab, f.eks. dets egen antigenicitet. Et mærket anti-(antistof)-antistof vil bindes til primære anti-35 stofreagens, når mærkningen for det andet antistof er en- o 28 DK 1^01075 hver konventionel mærkning som ovenfor beskrevet. Endvidere kan antistof detekteres ved komplement-fiksering, eller ved anvendelse af mærket protein A, samt ved andre metoder, der kendes inden for teknikken til detektering af antistoffer.

5 Når antistoffet er mærket, hvilket er foretrukkent, forbindes mærknings-delen og antistof-reagenset eller forbindes til hverandre ved direkte kemisk binding, f.eks. involverende covalente bindinger, eller ved indirekte binding, f.eks. ved inkorporering af mærkningen i en mikrokapsel el-10 ler et liposom, som igen er forbundet til antistoffet. Mærkningsmetoder er velkendte i teknikken, og enhver bekvem metode kan anvendes i forbindelse med nærværende opfindelse.

Reaktionsblanding 15 Den testprøve, der skal bestemmes, kan være ethvert medium af interesse og vil sædvanligvis være en flydende prøve af medicinsk, veterinær, miljømæssig, ernæringsmæssig eller industriel betydning. Især humane og animalske prøver og legemsvæsker kan bestemmes ved hjælp af den her omhand-20 lede metode, herunder urin, blod (serum eller plasma), mælk, cerebrospinalvæske, spyt, fækalt materiale, lungeaspirater, svælgtamponer, genitaltamponer og -exudater, rektaltamponer og nasopharnygale aspirater.

Som det er kendt i teknikken, kan der til bestemmel-25 sen anvendes forskellige hybridiseringsbetingelser. Hybri-disering vil typisk foregå ved svagt forhøjede temperaturer, f.eks. mellem ca. 35 og ca. 70°C og almindeligvis omkring 65°C, i en opløsning indeholdende puffer ved en pH-værdi mellem ca. 6 og ca. 8 og med passende ionstyrke, 30 f.eks. 2XSSC, hvor 1XSSC = 0,15 M natriumchlorid og 0,015 M natriumcitrat, pH = 7,0, protein såsom okseserumalbumin,

Ficoll (et varemærke, der identificerer en copolymer af sucrose og epichlorhydrin, forhandlet af Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), polyvinylpyrrolidoner, og en 35 denatureret, fremmed DNA, f.eks. fra kalvethymus eller

O

29 DK 16C1U7 8 laksesperma. Graden af komplementaritet mellem prøve- og sonde-strengene, der kræves til, at hybridisering kan finde sted, afhænger af betingelsernes strenghed. Graden og specificiteten af hybridisering påvirkes af de følgende 5 principielle betingelser: 1. Renheden af nucleinsyrepræparatet.

2. Basesammensætningen af sonde-G-C-basepar vil udvise større termisk stabilitet end A-T-basepar. Hybridise-ringer, der involverer højere G-C-indhold, vil således væ- 10 re stabile ved højere temperaturer.

3. Længden af homologe basesekvenser. Enhver kort sekvens af baser, f.eks. mindre end 6 baser, har en høj grad af sandsynlighed for at være til stede i mange nuclein-syrer. Der kan således opnås liden eller ringe specificitet 15 ved hybridiseringer, der involverer sådanne korte sekvenser.

Den omhandlede homologe sonde-sekvens vil være mindst 10 baser, sædvanligvis 20 baser eller flere, og fortrinsvis mere end 100 baser. Set fra et praktisk synspunkt .vil den homologe sonde-sekvens ofte ligge mellem 300 og 1000 nucleotider.

20 4. Ionstyrke. Graden af genforstærkning forøges, når ionstyrken af inkuberingsopløsningen forøges. Den termiske stabilitet af hybrider forøges også.

5. Inkubationstemperatur. Optimal genforstærkning sker ved en temperatur på fra ca. 25 til ca. 30°C under 25 smeltetemperaturen (Tm) for et givet duplex. Inkubering ved temperaturer væsentligt under det optimale tillader mindre relaterede.basesekvenser at hybridisere.

6. Nucleinsyrekoncentration og inkubationstid. Til forskydning af reaktionen i retning af hybridisering vil 30 normalt en af de hybridiserbare prøve-nucleinsyrer eller sonde-nucleinsyrer være til stede i overskud, sædvanligvis et overskud på 100 gange eller større.

7. Denatureringsreagenser. Nærværelsen af midler, der opbryder hydrogenbindinger, f.eks. formamid og urin- 35 stof, forøger strengheden af hybridisering.

0 .00 I U / D 30 8. Inkubationstid. Jo længere inkubationstiden er, desto mere fuldstændig vil hybridiseringen være..

9. Volumeneksklusionsmidler. Nærværelsen af disse midler, f.eks. dextran og dextransulfat, antages effektivt 5 at forøge koncentrationen af de hybridiserende elementer, hvorved graden af resulterende hybridisering forøges.

Normalt er antistof-reagenset og indskudsforbindelsen i tilfælde af metoder, hvor den tilsættes som en fri forbindelse, ikke til stede i hybridiseringsopløsningen.

10 Dette er imidlertid ikke udelukket, når det er ønskeligt, og når hybridiseringsbetingelserne er gunstige for antistof-binding og indskudsdannelse. I det sædvanlige tilfælde detekteres indskudskomplekser, der er associeret med hybridiseret sonde, efter adskillelse af hybridiseret son-15 de fra hybridiseringsopløsningen. Når indskudsforbindelsen tilsættes i form af en fri forbindelse, vil dens koncentration normalt vælges således, at den er tilstrækkelig til mætning af indskudskomplekserne, der er til stede, men ikke er så stor, at der forekommer en signifikant, f.eks.

20 større end 10%, selv-opstabling af indskudsforbindelse. Betingelserne for indskud vil almindeligvis være milde, f.eks. ved en pH-værdi mellem ca. 6 og ca. 8, moderat ionstyrke (2*1), stuetemperatur, ingen nødvendig udstrakt inkuber ing, dvs. mindre end 15 minutter i det almindelige 25 tilfælde.

Til detektering af indskudskompleks tilsættes antistof til komplekset i overskud og får lov at inkubere i den tid, der er nødvendig til dannelse af et detekter-bart produkt, f.eks. fra 5 minutter til 24 timer, under be-30 tingelser for neutral pH-værdi, f.eks. mellem 6 og 8, moderat ionstyrke (<1) og moderat temperatur (20-40°C). Overskud af (ubundet) antistof fjernes derpå ved vaskning under lignende betingelser.

Det kan være nødvendigt eller ønskeligt at modifi-35 cere den ovennævnte procedure ved inkludering af en indskudsforbindelse i vasketrinet til opretholdelse af

O

31

DK ;Κ: uDB

mætning af nucleinsyre-indskuds-komplekset. Om ønsket kan også nogle eller alle i ovennævnte trin kombineres, og f.eks. kan man tilsætte indskudsmidlet og antistof samtidig.

5

Reagenssystem

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der som nævnt yderligere et reagenssystem, dvs. en reagenskombination eller et reagensmiddel, der omfatter alle de essentielle 10 bestanddele, der kræves til gennemførelse af den ønskede bestemmelsesmetode. Reagenssystemet anvendes i en kommercielt pakket form, f.eks. en komposition eller blanding, når foreneligheden af reagenserne tillader det, i form af en testmaterialekonfiguration eller mere almindeligt i form 15 af et testsæt, dvs. en pakket kombination af en eller flere beholdere* materialer eller lignende, der indeholder de nødvendige reagenser og sædvanligvis omfatter skrevne instruktioner for udførelse af bestemmelserne. Reagenssystemer ifølge opfindelsen omfatter alle konfigurationer og kom-20 positioner til udførelse af de forskellige hybridiserings-metoder, der her er beskrevet, især de fire metodetyper, der specielt er illustreret ovenfor og på tegningen.

I alle tilfælde vil reagenssystemet omfatte (1) en sonde, (2) en nucleinsyre-indskudsforbindelse som beskrevet 25 i det foregående og (3) antistof-reagenset, fortrinsvis mærket med en detekterbar kemisk gruppe, der også er beskrevet i det foregående. Systemet kan yderligere omfatte en fast bærer til immobilisering af enkeltstrengede nucleinsyrer fra testmediet. Alternativt kan sonde-elementet være til 30 stede i immobiliseret form på en sådan. Endvidere kan indskudsforbindelsen være til stede i reagenssystemet som en særskilt, fri forbindelse, i det væsentlige uden kompleksdannelse med nucleinsyrer, eller den kan være bundet til sonden enten i form af indskudskomplekser, når sonden om-35 fatter en dobbeltstrenget region, og eventuelt covalent eller på anden måde kemisk bundet til én eller begge stren-

O

32

DK 160107 B

gene, eller ved kemisk binding, f.eks. covalent binding, til en enkeltstrenget sonderegion således, at duplexdannelse i en sådan region resulterer i dannelsen af indskudskomplekser. I tilfælde af sandwich-metoden inkluderes der en anden 5 sonde som ovenfor beskrevet i systemet. En testsæt-form for systemet kan yderligere omfatte hjælpekemikalier såsom be- .

standdelene af hybridiseringsopløsningen og denaturerings-midler, der er i stand til at omdanne dobbeltstrengede nu-cleinsyrer i en testprøve til den enkeltstrengede form.

10 Fortrinsvis inkluderes der et kemisk lyse-middel og denatureringsmiddel, f.eks. alkali, til behandling af prøven til frigørelse af enkeltstrenget nucleinsyre derfra.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

15

Eksempler I. Materialer A. Fremstilling af tufA-sonde med covalent indskudt dobbeltstrenget portion 2Q Nucleinsyre-sonden er en modificeret M13mp9-vektor (Messing og Vieria (1982), Gene, 19, 269, kommercielt tilgængelig fra New England Biolabs, Beverly, MA) indeholdende en 800 bp-indsats mellem Hine II og EcoRI-restriktions-endonuclease-stederne af RFM13mp9. 800-Base-indsatsen er et 25 fragment af 1190 base-tufA-sekvensen fra E. coli og er den del af sonden (der omfatter vektor og indsats) som faktisk vil hybridiseres til prøve-nucleinsyren. Indsatsen vil blive refereret til som tufA-indsatsen. Den modificerede M13mp9-bakteriophag betegnes M13-10 og er tilgængelig gen-30 nem American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC 39403-Bl).

Den E. coli-basisorganisme, der anvendes til propagering af M13-10 phagen, er JM103 [ ( Alac pro), supE, thi, strA, endA, sbcB, hsdR~, F'traD36, proAB, laclq, ΖΔΜ15], 35 der er kommercielt tilgængelig fra Bethesda Research

Laboratories, Gaithersburg, MD, E. coli JM103 transforme- o 33 DK ;-:0107 8 res med M13-10-DNA, og en kultur af JM103 inficeres derpå med den transformerede JK103. Den enkeltstrengede form af Ml3-10 isoleres fra de phag-partikler, der udskilles i mediet af den inficerede E. coli. Phag-partiklerne indhøstes, 5 og den enkeltstrengede M13-10-DNA isoleres under anvendelse af standardmetoder, jfr. Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res., 9, 309.

Under anvendelse af en oligonucleotid-primer, der er komplementær til Ml3mp9-vektoren på 5'-terminalen af 10 tufA-indsatsen, deoxynycleosid-triphosphater og E. coli- -DNA-polymerase (Klenow-fragment), syntetiseres der en anden DNA-streng. Denne anden streng syntetiseres med begrænsende mængder af deoxynucleosid-triphosphater således, at den ikke udstrækker sig til tufA-indsatsen, fordi denne ind-15 sats skal forblive i det væsentlige enkeltstrenget med det formål, at sonden kan anvendes ved en hybridiseringsbestem-melse. Denne teknik er blevet beskrevet i litteraturen (Hu og Messing (1982), Gene 17, 271-277), og oligonucleotid-pri-meren (sekvens CACAATTCCACACAAC) er kommercielt tilgængelig 20 fra New England Biolabs, Beverly, MA.

Den mængde dobbeltstrenget DNA, der er til stede i M13-10-sonden, kan anslås ved anvendelse af et radioaktivt mærket nucleotid-triphosphat ved den anden strengs syntese eller ved S^-nucleasedigestion, efterfulgt af en fluorescens-25 bestemmelse med ethidiumbromid.

Den dobbeltstrengede region af M13-10-sonden, der er fremstillet som ovenfor beskrevet, indskudsbehandles og bindes covalent med ethidium ved en fotoaffinitetsreaktion under anvendelse af et fotomærket ethidiumderivat, 8-azido-30 ethidium. Dette fotoreaktive indskudsmateriale fremstilles og isoleres som beskrevet i litteraturen, jfr. Graves et al. (1977), Biochim. Biophys. Acta, 479, 98-104. Dets binding til dobbeltstrenget DNA har vist sig at være en efterligning af binding af dets grundforbindelse, ethidiumbromid, jfr.

35 Bolton og Kearns (1978), Nucl. Acids Res., 5, 4891, Garland et al., (1980), Biochem., 19, 3221, idet undersøgelser vi-

O

34 DK 1 60107 δ ser, at denne procedure giver en blanding af 3-azido- og 8-azido-ethidium-isomere. Eftersom 8-azidoethidum er fotoreaktiv, må der træffes standforholdsregler ved håndteringen til hindring af sønderdeling. Arbejde i mørke i nærværel-5 se af et rødt fotografisk sikkerhedslys har vist sig at være tilfredsstillende. Opløsninger af 8-azidoethidium kan opbevares frosne i mørke ved -70°C i det mindste i én måned.

Ved fotolyse med synligt lys emdannes azido-delen i 8-azi-doethidium til en kemisk reaktiv nitren, der hurtigt vil 10 reagere med tilgængelige nucleofiler til dannelse af kovalente ethidium-additionsprodukter, jfr. Knowles (1971) Acc.

Chem. Res., 5, 155. Såfremt 8-azidoethidium indskydes mellem baseparrene af DNA, når der foregår fotolyse, foregår der en covalent kobling af ethidium til DNA med høj effek-15 tivitet, jfr. Bolton og Kearns (1978), Nucl. Acids Res., 5, 4891.

Ethidium kobles covalent til den dobbeltstrengede region af M13-10 ved fotolyse af en opløsning indeholdende ca. 1 mM DNA-basepar og 0,5 mM 5-azidoethicium i en egnet 20 puffer som f.eks. 20 mM tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (tris-HCl), 200 mM natriumchlorid (NaCl) med en pH-værdi på 8,0. Fotolysen udføres med en 150 watt udendørs spotlight, idet den omrørte reaktionsblanding befinder sig i en afstand af fra 5 til 20 cm fra lyskilden. Til hindring 25 af, at fotolysereaktionen udsættes for overophedning, og til blokering af mulig kortbølget udstråling, dvs. mindre end 300 nm, omgives fotolysereaktionsblandingen af et glasvandbad, der er forbundet til en vandcirkulator med temperaturregulering. Efter en passende inkuberingsperiode, 30 f.eks. 60 minutter, fjernes ethidiumgrupper, der ikke er covalent bundet til DNA, ved en række, f.eks. 10, successive ekstraktioner med et lige så stort rumfang vandmættet n-butanol. Der tilsættes yderligere 8-azidoethidium (slut-kontration i området omkring 0,4 mM), og fotolyse- og eks-35 traktionstrinene gentages. Den mængde ethidium, der er forbundet med DNA, anslås under anvendelse af extinktionskoef-

O

35

DK 16 C10 7 B

O 1 i ficient-værdier af £490 4 x 10J M~ cm for fotolyseret ethidiumazid, relationen mellem &26Ο °9 ^490 ^or-fotolyseret ethidium bundet til DNA (A26_ = (A49Q x 3,4)-^,011), og - fsj 4 —1 «*1 C. 260 - lf32 x 10 M cm for koncentrationen af DNA-base-5 par af en given DNA, der mærkes. Fortrinsvis mættes sonden med ethidium således, at der findes én ethidiumdel for hver 2 DNA-basepar i den dobbeltstrengede region af sonden. Fotolysereaktionen og ekstraktionerne gentages, indtil der opnås den ønskede mærknings-densitet.

10 B. Fremstilling af adenovirus-sonder til sandwich-hybridi-sering

Sandwich-hybridiseringer er beskrevet i litteraturen, jfr. Dunn og Hassell (1977), Celle 12, 23, Dunn og Sambrook 15 (1980), Methods in Enzymology, 65, 468, Ranki et al., (1983),

Gene, 21, 77, Ranki et al., (1983), Curr. Topics in Microbiology and Immunol., 104, 307-310.

Denne metode kræver to nucleinsyre-sonder, der hver er komplementær til en unik region af den nucleinsyre, der te-20 stes i en prøve. En af sonderne er immobiliseret på en fast bærer, medens den anden er mærket på en eller anden måde og oprindelig er i opløsning med prøve-nucleinsyrerne. Disse sonder vil i det følgende blive betegnet som henholdsvis sonden i fast fase og sonden i opløsning.

25 Sonderne i fast fase og i opløsningsfase fremstilles ud fra restriktions-endonuclease-digestioner af DNA fra adinovirus-type 2 (Ad2) som beskrevet af Ranki et al., (1980), Gene, 21, 77-85. Sonden i fast fase er sammensat af BamHl--fragmenterne C eller D, jfr. Tooze (1980), "The Molecular 30

Biology of Tumor Viruses", anden udgave, del 2: DNA Tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, side 933-934, af Ad2-DNA indsat i en pBR322-vektor. Disse sonder er blevet betegnet henholdsvis pkTH1201 og pkTH1202.

Sonden i opløsningsfase er sammensat af en BamHl- og Bglll-35 -restriktions-endonuclease-digestion af pkTH1201, i hvilken fragmenter er "shotgun"-klonede i BamHl-restriktions-endo- o 36

DK 160107 B

nuclease-stedet af M13mp7, jfr. Messing et al., (1981), Nuc. Acids Res., 9, 309. Den modificerede M13mp7, der. som indsats indeholder et fragment af Ad2 C-fragmentet,'betegnes mkTH2306.

5 Opløsnings-sonden mkTH1206 gøres delvis dobbeltstren get som beskrevet under I-A ovenfor, og den dobbeltstrengede region mærkes med et indskudsmiddel, f.eks. ethidium, ligeledes som beskrevet under I-A ovenfor.

10 C. Fremstilling af HCMV-sonde

EcoRI-restriktions-endonuclease-fragmentet O fra human cytomegalovirus (HCMV) stamme AD169, jfr. Tamashiro et al., (1982), J. Virol., Maj, 547-556, Chou og Merigan 15 (1983), New Engl. J. of Med., 308, 921, klones ind i pBR- 322-derivatet pACYC184, der anvendes til transfektion af E. coli-stamme HB101 Rec A~ som beskrevet af Tamashiro et al. Efter propagering og rensning ved det indsats-bærende pACYC184, fordøjes plasmidet med restriktions-endonuclea-2Q se EcoRI, og 6,8 kb O-fragmentet af HCMV renses ved præparativ elektroforese i 0,8%’s agarosegeler under anvendelse af standardmetoder, jfr. Maniatis et al., (1982), "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

25 D. Fremstilling af indskuds-mærket HCMV-sonde

Det rensede, dobbeltstrengede O-fragment fra afsnit I-C ovenfor mærkes dernæst kovalent med ethidium ved anvendelse af det fotolabile ethidiumderivat, 8-azidoethi-30 dium, som beskrevet i afsnit I-A ovenfor.

E. Fremstilling af indskudskompleks-immunogen

Kalvethymus- eller laksesperma-DNA overskæres ved gentagen passage gennem en kanyle, behandles med S^-nuclea-35 se til fjernelse af enkeltstrengede regioner (Maniatis (1982), "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, NY) og skilles fra de resulterende nu- o 37 DK '.o :'i i,7 3 cleotider ved en vilkårlig af et antal standardmetoder, f.eks. ethanolfældning, gel-eksklusionschromatografi eller ionbytningschromatografi.

Den rensede, dobbeltstrengede DNA kobles derpå ko-5 valent til det fotolabile ethidiumderivat 8-azidoethidium ved fotolyse som beskrevet i afsnit I-A ovenfor. Der fremstilles et bæreprotein ved methylering af carboxylsyrerester, jfr. Mandell og Hershey (1960), Anal. Biochem., 1, 66, hvorpå der kombineres med den indskuds-mærkede DNA til dan-10 nelse af et elektrostatisk associeret nucleinsyre-protein--kompleks som beskrevet af Poirier et al., (1982), PNAS, 79, 6443.

F. Fremstilling af polyklonalt antiserum til indskudskom-15 plekset

Polyklonalt antiserum mod indskuds-DNA-komplekser fremkaldes hos kaniner ved anvendelse af immuniseringsmetoder og -skemaer som beskrevet i litteraturen, jfr. Stollar (1980), Methods in Enzymology, 70, 70. Det pågældende anti-20 serum screenes v.ed en bestemmelse i fast fase, der svarer til den, som anvendes til monoklonale antistoffer, f.eks. som beskrevet af Lange et al., (1976), Clin. Exp. Immunol., 25, 191, og Pisetsky et., (1981), J. Immun. Methods, 41, 187. Det indledende screenings-kriterium vil være bindin-25 gen til indskuds-DNA-komplekset.

IgG-Fraktionen af de antisera, der indeholder antistoffer, isoleres fra andre serumproteiner ved ammoniumsul fat-fældning, efterfulgt af chromatografi på DEAE-cellulose, jfr. Livingson (1974), Methods in Enzymology, 34, 30 7 2 3.

IgG-fraktionen af de pågældende antisera renses yderligere ved affinitetschromatografi på en søjle indeholdende en harpiks, hvorpå DNA-indskudskomplekset im-mobiliseres, jfr. Stollar (1980), Methods in Enzymology, 35 70, 70. Efter påføring af IgG-fraktionen på søjlen fjernes ikke-specifikt bundet protein ved vaskning, og de specifik-

DK 16 01ϋ 7 B

O

38 ke antistoffer elueres med 2 M eddikesyre i kulden, jfr.

Stollar (1980), ibid.

De rensede antistoffer screenes mere grundigt til bestemmelse af deres anvendelighed ved hybridiseringsbe-5 stemmeisen. Antistofferne skal binde indskuds-DNA-komplek-set med høj affinitet (fortrinsvis 10^® M-^) og krydsreaktivitet med fri indskudsforbindelse eller enkelt-strenget DNA er ikke acceptabel. Afhængigt af bestemmelsesmetoden er nogen krydsreaktivitet af antistofferne med dob-10 beltstrenget DNA acceptable.

G. Fremstilling af monoklonale antistoffer til indskudskomplekset

Under anvendelse af det indskuds-DNA-immunogen, der 15 er fremstillet som ovenfor beskrevet, fås der muse-monoklo-nale antistoffer til indskuds-DNA-komplekset under anvendelse af standardmetoder, jfr. Galfre og Milstein (1981),

Methods in Enzymology, 73, 1. De monoklonale antistoffer screenes under anvendelse af en modifikation af de metoder, 20 der er beskrevet i litteraturen, f.eks. Lange et al., (1976), Clin. Exp. Immunol., 25, 191 og Pitsctsky et al., (1981), J. Immun. Methods, 41, 187. For at være anvendelig ved bestemmelsen til detektering af DNA-indskudskomplekser, bør et monoklonalt antistof bindes til DNA-indskudskomplekset med 25 høj affinitet (fortrinsvis KA> 10^ M”^·) , men kan ikke bindes til enkeltstrenget DNA eller frit indskudsmiddel. Krydsreaktivitet med dobbeltstrenget DNA kan være acceptabel ved nogle af disse bestemmelsesmetoder.

Monoklonalt muse-antistof renses ved en totrinsmeto-30 de. Den rene ascitesvæske påføres en søjle af Affi-Gel Blue--harpiks (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), ækvilibreret med 10 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH = 8,0, og elueres med den samme puffer. Ved dette trin fjernes albumin, som tilbageholdes på søjlen. Det afsluttende trin i rensningen er 35 påføring på DEAE-sepharose (Pharmacia Fine Chemicals,

O

39 DK u>?b

Piscataway, NJ) og eluering med en lineær gradient af 10 mM tris-HCl, pH = 8,0, til 10 mM tris-HCl, 200 mM NaCl. Dette giver et renset monoklonalt muse-antistof, der er frit for kontaminerende serumproteiner såsom albumin og transferrin.

5 H. Fremstilling af β-galactosidase-antistof-konjugat β-Galactosidase (30.000 enheder, kvalitet VIII, kommercielt tilgængelig fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) opløses i 2 ml af en pufferopløsning sammensat af 10 0,1 M N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre (HEPES), 0,09 M NaCl, pH = 7,0. Derved fås en (3-galacto-sidaseopløsning indeholdende 37,7 mg protein (70 nmol) i I, 84 ml. En portion på 3,5 mmol (et 50 ganges molært overskud) af dithiothreitol (DTT) sættes til denne opløsning, 15 og blandingen får lov at henstå ved stuetemperatur i 4 timer.

DTT fjernes fra enymopløsningen ved chromatografe-ring af blandingen på en 2,5 cm x 80 cm søjle af Sepharose 6B*Cl-harpiks (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), 20 idet der som elueringsmiddel anvendes den ovenfor beskrevne HEPES/NaCl-puffer. Proteinholdige fraktioner slås sammen, hvorved der fås et samlet rumfang på 15 ml. Under an- 1% vendelse af en E280 = ^0,9 (Worthington Enzyme Manual (1977), Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ, side 195), 25 bestemmes β-galactosidase-koncentrationen til at være 9,62 mg/ml. Antallet af sulfhydrylgrupper på enzymet bestemmes til 11,0 under anvendelse af Ellman's reagens, jfr. Ellman (1959), Arch. Biochem. Biophys., 82, 70. Typisk giver denne fremgangsmåde 9-15 frie sulfhydrylgrupper pr. (3-galacto-30 sidasemolekyle.

Det heterobifunktionelle koblingsreagens succinimi-dyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-l-carboxylat (SMCC, tilgængelig fra Pierce Chemical Co., Rockford, IL) anvendes til kobling af β-galactosidase til et antistof. Dette 35 koblingsreagens indeholder en maleimidogruppe, der selektivt reagerer med sulfhydryl-dele, og en N-hydroxysuccin- o 40

DK 160107 B

imidester til kobling til aminogrupper. Koblingsproceduren omfatter to trins omsætning af SMCC med antistoframinogrup-per, efterfulgt af kobling af det derivatiserede antistof til β-galactosidase ved omsætning af maleimido-delen med 5 β-galactosidase-sulfhydrylgrupper.

En portion på 5,3 mg SMCC opløses i 250 pi vandfrit Ν,Ν-dimethylformamid (DMF). Den faktiske koncentration af reaktive maleimidgrupper i denne opløsning bestemmes ved omsætning med en kendt mængde glutathion, efterfulgt af be-10 stemmelse af mængden af glutathion-sulfhydrylgrupper under anvendelse af Ellman's reagens jfr. ovenfor. Eksempelvis fortyndes 40 pi af DMF-opløsningen til 3 ml med HEPES/-0,015 M NaCl-puffer. Et rumfang på 25 pi af denne vandige opløsning af SMCC-opløsning kombineres derpå med 825 pi 15 HEPES/NaCl-puffer og 100 pi 1 mM glutathion. Efter hen stand ved stuetemperatur i 15 minutter bestemmes mængden af uomsat glutathion under anvendelse af Ellman's reagens jfr. ovenfor, og de pågældende standarder, dvs. uomsat glutathion og en blindprøve uden glutathion. Der foretages 20 adskillige bestemmelser for hver SMCC-opløsning, og gennemsnittet af resultaterne beregnes. Ved denne metode vises det, at DMF-opløsningen af SMCC, fremstilles som beskrevet ovenfor, er 52 mM med hensyn til reaktive maleimidgrupper.

En portion på 6,0 mg (40 pmol) af et monoklonalt 25 muse-antistof kanbineres med 400 pmol SMCC i et slutrumfang på 533 pi HEPES/O,15 M NaCl og får lov at reagere i 1 time ved 30°C. Reaktionsblandingen påføres derpå en 1 cm x 24 cm-kolonne af Bio-Gel P-2-harpiks (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) og elueres med HEPES/O,15 M NaCl. Alle pro-30 teinholdige fraktioner slås sammen. Proteinkoncentrationen bestemmes under anvendelse af metoden ifølge Sedmack og Grossberg, jfr. Anal. Biochem., 79, 544 (1977), og antallet af maleimidgrupper bestemmes som ovenfor beskrevet. Disse bestemmelser viser en antistofkoncentration på 1,98 mg/-35 ml med 1-2 maleimider pr. antistofmolekyle.

O

41

DK 160107 B

En portion på 28 mg af antistof-maleimid-konjugatet kombineres med 10 mg DTT-behandlet β-galactosidase (slut-rumfang 2,45 pi) og får lov at reagere i 4 timer ved stuetemperatur. Blandingen påføres derpå en 2,5 cm x 80 cm-søj-5 le af Sepharose 6B*C1 (Pharmacia, Piscataway, NJ) og elue-res med HEPES/0,15 M NaCl ved 4°C. Strømningshastigheden er 4 ml pr. time, og der opsamles fraktioner på 3 ml. Fraktionerne bestemmes med hensyn til β-galactosidase-aktivitet og kapacitet til antistofbinding. Fraktionerne nr. 39-42 10 har begge egenskaber og slås sammen.

J. Fremstilling af biotin-mærkede antistoffer

Rensede antisera behandles med N-hydroxysuccinimid-esteren af biotin (kommercielt tilgængelig fra Sigma Chemi-15 cal Co., St. Louis, MO eller Biosearch, San Rafael, CA) under anvendelse af i litteraturen beskrevne metoder, jfr.

Oi et al., (1982), J. Cell. Biol., 93, 981, Heitzmann et al., (1974), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3537 og Green (1975), Adv. Protein Chem., 29, 85.

20 K. Fremstilling af radioaktivt mærkede antistoffer

Renset antistof mærkes radioaktivt under anvendelse af i litteraturen angivne metoder. Radioaktiv iodering ud- 125 føres ved omsætning af antistofferne med I-mærket 3-(4-25 -hydroxyphenyl)-propionsyre-N-hydroxysuccinimid-ester (kommercielt tilgængelig fra New England Nuclear, Boston, MA), idet der anvendes metoden ifølge Bolton og Hunter,

Biochem. J., 133, 529 (1973). Alternativt kobles antistoffraktionen covalent med bifunktionelt cheleringsmiddel, 30 jfr. Yeh et al., (1979), Anal. Biochem., 100, 152, og mærkes derpå med en passende radioaktiv metalion. Denne sidstnævnte metode har den fordel, at opbevarings-levetiden for antistoffraktionen ikke er begrænset af halveringstiden for en radioaktiv isotop.

35

O

42 DK 16011/78 L. Fremstilling af alkalisk phosphatase-biotin-avidin-kom-pleks

Et alkalisk phosphatase-biotin-avidin-kompleks fremstilles som beskrevet af Leary et al. (Proc. Natl. Acad.

5 Sci. USA, 80, 4045 (1983)). Alkalisk phosphatase fra kalveindvolde tværbindes først ved omsætning med disuccimidyl--suberat og kobles derpå med N-hydroxysuccinimidesteren af biotinyl-£-aminocapronsyre. Efter rensning mærkes det alkaliske phosphatase-biotin-kompleks med avidin (der 10 har fire biotin-bindingssteder pr. avidinmolekyle) ved kombination af det alkaliske phosphatase-biotin-kompleks med et lille molært overskud af avidin. Enten avidin eller en bakteriel analog til avidin, steptavidin,(Hofmann et al.,(1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4666-4668, 15 kommercielt tilgængelig fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) kan anvendes i dette sidste trin.

Det detekteringssystem, der anvendes til det alkaliske phosphatase-biotin-avidin-kompleks, er sammensat af nitroblåt-tetrazolium og 5-brom-4-chlor-3-indolyl-phos- 20 phat som beskrevet af Leary et al., j fr. ovenfor.

II. Metoder A. Detektering af gram-negative bakterier i urin (metode af type 1) under anvendelse af fast fase, prøve-immo- 25 biliseret hybridiseringsmetode med tufA-sonde med en covalent, indskudt dobbeltstrenget region, styret med enzymmærket antistof, jfr. fig. 2

Eftersom dens sekvens er i høj grad bevaret, kan tufA-sekvensen fra E. coli anvendes til detektering af 30 nærværelsen af gramnegative bakterier i urinprøver. Kliniske urinprøver klares ved centrifugering i et kort tidsrum, f.eks. 5 minutter, ved en lav centrifugalkraft, f.eks. ved 8.000 omdr./minut med en Sorvall GLC-3-centrifuge. Bakterieceller i den ovenstående væske udsættes for lyse, og 35 bakteriegenomet denatureres ved at gøre urinprøven 0,5 M med hensyn til natriumhydroxid i 10 minutter ved en for-

DK 16 G1G 7 B

O

43 højet temperatur på 65°C. Alternativt kan dette gøres ved opvarmning af urinen til 90°C og opretholdelse af denne temperatur i 10 minutter. Efter lyse og denaturering fortyndes urinprøven og neutraliseres med et lige så stort 5 rumfang af 20XSSPE (3,6 M NaCl, 0,2 M NaP04, 20 mM EDTA, pH = 7,7). Urinprøven filtreres derpå øjeblikkeligt gennem en nitrocellulosemembran under mildt vakuum. Den immobilise-rede bakterielle DNA fikseres dernæst til nitrocellulosemembranen ved bagning i vakuum ved 80°C i 2 timer. Filte-10 ret indeholdende den immobiliserede prøve-DNA behandles med for-hybridiseringsopløsning (0,1% efter vægt pr. rumfang af Ficoll (Pharmacia), polyvinylpyrrolidon og BSA i 5XSSPE, 100-200 pg/ml denatureret, heterolog DNA) i 1-3 timer ved 65°C. Der anvendes et rumfang på 50-100 pi af for-15 -hybridiseringsopløsning pr. cm2 filter. Efter for-hybridi-seringsbehandlingen sættes den med ethidium mærkede sonde, der er fremstillet som under I-A ovenfor, til for-hybridi-seringsopløsningen, og hybridisering får lov at foregå (1-72 timer). De ovennævnte metoder er alle standardmeto- 20 der, der findes i litteraturen, jfr. Maniatis et al., (1982), "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Efter hybridiseringen vaskes filteret til fjernelse af overskud af sonde-DNA. Filteret neddyppes derpå i 25 en opløsning indeholdende β-galactosidase-mærkede antistoffer til indskuds-DNA-komplekset og inkuberes i fra 5 minutter til 12 timer. Overskud af antistof fjernes ved vaskning, og den mængde β-galactosidase, der er associeret med filteret, bestemmes ved tilsætning af et fluorogent 30 substrat af enzymerne, f.eks. 4-methylumbelliferon-3-ga-lactosid, og måling af fluorescens-intensiteten efter et tidsrum. Eftersom den mængde enzym, der er til stede, sandsynligvis er forholdsvis lav, tilsættes det fluorogene substrat i en koncentration, der er større end eller lig 35 med dets Michaelis-konstant (Km) for β-galactosidase. Standarder med en defineret mængde sonde immobiliseret på filteret kan anvendes samtidig, således at hybridisering kan kvantiseres.

O

44

DK 1601G7B

B. Detektering af adenovirus (metode af type 2). Sandwich--hybridiseringsbestemmelse med mærket sonde med en covalent indskudt dobbeltstrenget region, styret med enzymmærket antistof, jfr. fig. 3 5 Denne metode er baseret på den sandwich-hybridise- ringsbestemmelse, der er beskrevet af Ranki et al. til detektering af adenovirus-type 2 (Ad2)-DNA i kliniske prøver, jfr. Ranki et al.f (1983), Gene, 21, 77, Ranki et al., (1983), Current Topics in Microbiology and Immunology, 104, Sprin-10 ger-Verlag, NY, side 307. Sonden i fast fase med betegnelsen pKTH1202, jfr. afsnit I-B ovenfor, denatureres, nick--behandles og immobiliseres på nitrocellulosefiltre. Efter fiksering (varmebehandling i vakuum ved 80°C i 2 timer) behandles filtrene med for-hybridiseringsopløsning i 1 time 15 ved 65°C. DNA fra kliniske prøver og den indskuds-mærkede opløsningshybridiseringssonde mkTH1206, fremstillet som beskrevet i afsnit I-B ovenfor, sættes til for-hybridise-ringsopløsningen, og hybridisering af sonderne med prøve--DNA får lov at foregå i 1-72 timer. Efter hybridisering 20 fjernes overskud af opløsningssonde (mkTH1206) ved vask-ning.

Graden af hybridisering kvantiseres under anvendelse af β-galactosidase-mærket antistof til indskuds-DNA-kom-plekset som beskrevet i afsnit II-A ovenfor.

25 C. Detektering af human cytomegalovirus i urin (metode af type 3). Fast fase, sonde-immobiliseret hybridiserinqs-bestemmelse, styret med biotinmærkede antistoffer og en-zyromærket avidin, jfr. fig. 4 30 Denne metode anvendes til detektering af human cyto megalovirus (HCMV) i kliniske urinprøver. Den rensede sonde (EcoRl 0-fragment af HCMV-stamme AD169 som beskrevet i afsnit I-C ovenfor) denatureres ved opvarmning til 90°C i 10 minutter, hvorpå der hurtigt køles på is (til hindring af 35 renaturering) og kombineres med et lige så stort rumfang DK ό: i c 7 b

O

45 af 20XSSPE (3,6 M NaCl, 0,2 M NaP04, 20 mM EDTA, pH = 7,7).

Den enkeltstrengede sonde-DNA immobiliseres derpå og fikse-res på en nitrocellulosemembran under anvendelse‘af standardmetoder. Membranen behandles derpå med en for-hybridise-5 ringsopløsning, fortrinsvis en sådan, der ikke indeholder heterolog DNA. En for-hybridiseringsopløsning, der kan anvendes, er den, der er beskrevet af New England Nuclear til

TM

deres Gene Screen Plus -membraner. Denne opløsning er sammensat af 1% SDS, 1 M NaCl og 10% dextransulfat. Til hin-10 dring af ikke-specifik binding af antistoffet ved de afsluttende trin af detekteringsmetoderne, kan det være ønskeligt at inkludere BSA i for-hybridiseringsopløsningen.

Den kliniske urinprøve, der skal testes, fremstilles på en måde, der svarer til den, der er beskrevet af 15 Chou og Merigan, jfr. New Engl. J. Med., 308, 921 (1983).

Efter klaring af prøven og koncentrering af HCMV-phag-par-tiklerne ved centrifugering, gensuspenderes de i et minimalt rumfang af 0,5 M NaOH og får lov at henstå i 15 minutter. Efter neutralisation med et minimalt rumfang af 20 20XSSPE sættes de denaturerede kliniske prøver til filteret i 1% SDS, 1 M NaCl, 10% dextransulfat og 100 jug/ml denatureret laksesperma-DNA. Hybridisering får lov at foregå ved 65°C i 1-72 timer, hvorpå filtrene vaskes i 2XSSPE.

Filtrene neddyppes i et minimalt rumfang af en op-25 løsning indeholdende den udvalgte indskudsforbindelse, f.eks. ethidiumbromid i en submillimolær koncentration. Biotinyleret antistof til DNA-indskudskomplekset (afsnit I-J ovenfor) tilsættes derpå og får lov at bindes (1-24 timer). Overskud af antistof fjernes ved vaskning. I nog-30 le situationer kan det være nødvendigt at inkludere indskudsmidlet i disse vasketrin for at holde den dobbeltstrengede DNA mættet.

Et streptavidin-biotin-alkalisk phosphatase-kom-pleks (afsnit I-L ovenfor) tilsættes derpå og får lov at 35 binde til det biotinylerede antistof, der er associeret

DK 16 01U 7 B

46 o med DNA'en, jfr. Ward et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 4045 (1983). Efter bortvaskning af overskud af alkaliske phosphatase-konjugater, bestemmes nærværelsen af kon-jugat, der er associeret med filteret,ved tilsætning af et 5 kolometrisk substrat for alkalisk phosphatase som beskrevet af Ward, jfr. ovenfor. Dette er et direkte mål for nærværelsen af HCMV-DNA i den kliniske urinprøve.

D. Detektering af human cytomegalovirus i urin (metode af 10 type 4). Fast fase, indskuds-mærket sonde-immobiliseret hybridiseringsbestemmelse, styret med radioaktivt mærket andet antistof til indskudskompleks-antistof, jfr. fig. 5

Denne metode svarer til metoden ifølge afsnit II-C 15 ovenfor, men med den undtagelse, at sonden allerede er mærket med indskudsmiddel, og at det afsluttende trin i detekteringsmetoden kræver et andet, isotopisk mærket antistof.

Sonden, ethidium-mærket Eco Ri-fragment O af HCMV (fremstillet som beskrevet i afsnit I-D ovenfor) denature-20 res, immobiliseres og fikseres på en nitrocellulosebærer som beskrevet i forbindelse med metoden ifølge afsnit II-C ovenfor. Viral DNA isoleres fra urinprøver, denatureres og hybridiseres til den immobiliserede sonde, ligeledes som beskrevet i afsnit II-C ovenfor, men med den undtagelse, at 25 tilsætning af fri indskudsforbindelse er unødvendig.

Efter vaskning af filteret med den hybridiserede DNA tilsættes der overskud af monoklonalt muse-antistof til indskuds -DNA-komplekset, jfr. afsnit I-G ovenfor, og får lov at bindes til det hybridiserede DNA-indskudskompleks (fra 30 30 minutter til 6 timer). Overskud af muse-antistof fjer nes ved vaskning, og der tilsættes overskud af radioaktivt mærket kanin-anti-(museIgG), jfr. afsnit I-K. Efter en in-kubering på fra 30 minutter til 6 timer fjernes overskud af antistof igen ved vaskning. Hybridisering kvantiseres ved 35 autoradiografi eller gammatælling.

DK 16 C10 7 B

O

47 III. Påvisning af antigenicitet af indskudskomplekser A. Fremstilling af covalente ethidium-DNA-komplekser

Ca. 250 mg laksesperma-DNA (Sigma Chemical Company,

St. Louis, MO) opløses i 40 ml 50 roM NaCl og opskæres ved 5 fem passager gennem en 23 gauge-nål. Den opskårne DNA anbringes i en 250 ml kolbe og fortyndes med yderligere 160 ml puffer. 145 pi S^nuclease, 200.000 enheder/ml (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway, NJ) tilsættes, og blandingen inkuberes ved 37°C i 50 minutter.

10 Reaktionsblandingen ekstraheres derpå to gange med en blanding af phenol og chloroform og én gang med chloroform, og DNA'en udfældes to gange med ethanol, jfr. Mania-tis et al., (1982), "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Den endelige fældning 15 opløses i 70 ml 20 mM tris-hydrochlorid-puffer med en pH--værdi på 8,0.

Denne DNA omsættes med 8-azidoethidium under følgende betingelser. Reaktionsblandingen fremstilles med 33 ml af 2,7 mg DNA pr. ml, 13,5 ml af 4,95 mM 8-azidoethidium, 20 13,5 ml af 0,2 N tris-hydrochlorid-puffer med en pH-værdi på 8,0, 0,2 M NaCl og 76 ml vand. Blandingen anbringes i et 250 ml bæreglas med en vandkappe, der holdes ved 22°C. Blandingen omrøres og belyses i 60 minutter med en 150 watt spotlight i en afstand af 10 cm. Denne fotolyse gentages 25 med en identisk reaktionsblanding.

De fotolyserede reaktionsblandinger kombineres og ekstraheres ti gange med et lige stort rumfang hver gang af n-butanol mættet med 20 mM tris-hydrochlorid-puffer med en pH-værdi på 8,0 og 0,2 M NaCl. Den ekstraherede 30 DNA-opløsning kombineres med 23 ml af 4,95 mM 8-azidoethidium og 77 ml af 20 mM tris-hydrochlorid-puffer med en pH-værdi på 8,0 og 0,2 M NaCl. Denne opløsning omrøres i det med vandkappe forsynede bæreglas og fotolyseres i 90 minutter. Reaktionsprodukterne ekstraheres ti gange med 35 puffermættet butanol som ovenfor beskrevet, og DNA'en fæl-

DK 16 0 i ϋ 7 B

48 o des med ethanol. Fældningen opløses i 10 mM tris-hydrochlo-rid-puffer med en pH-værdi på 8,0 og 1 mM EDTA, og absor-banserne ved 260 og 490 nm bestemmes. Beregninger foretages som beskrevet i eksempel 1A ovenfor viser, at der in-5 korporeres 1 ethidiumrest pr. 4,5 DNA-basepar.

B. Fremstilling af methyleret thyroglobulin 100 mg Oksethyroglobulin (Sigma Chemical Company,

St. Louis, MO) kombineres med 10 ml vandfri methanol og 10 400 pi 2,55 M HC1 i methanol. Denne blanding omrøres på en roterende blander ved stuetemperatur i 5 dage. Fældningen opsamles ved centrifugering og vaskes to gange med methanol og to gange med ethanol. Fældningen tørres dernæst natten over under vakuum, og der fås ca. 82 mg af et tørt pul-15 ver.

C. Fremstilling af covalent ethidium-DNA-methyleret thyro-globulin-kompleks 55 mg Methyleret thyroglobulin opløses i 10 ml vand, 20 og der tilsættes 11,3 ml af en 2,2 mg pr. ml covalent ethi-dium-DNA-opløsning. Der dannes øjeblikkeligt en fældning, og suspensionen fortyndes med 5,0 ml 1,5 M NaCl og 24,6 ml vand.

25 D. Immunisering af kaniner 2 ml Af en blanding sammensat af 2,5 ml af det cova-lente ethidium-DNA methylerede thyroglobulin-kompleks, 2,5 ml 0,15 M saltopløsning og 5,0 ml komplet Freunds-adju-vans injiceres på fire subcutane steder på en hvid New 30 Zealand-kanin. 3 Uger senere indgives der en lignende immunisering med ufuldstændigt Freunds-adjuvans, efterfulgt af yderligere immuniseringer med intervaller på 4 uger. 14 Uger efter den oprindelige immunisering opsamles der blod til fremstilling af antiserum.

35 Ο 49 ΟΚ'όΟΙϋ/Β

Ε. Titrering af antistof til ethidium-DNA

Antistof til covalent ethidium-DNA titreres ved en enzym-mærkningsimmunosorbansbestemmelse. Polynucleotider adsorberes på væggene af polystyren-mikrotiterplader, og 5 dernæst får kanin-antistoffet lov at bindes. Endelig de-tekteres antistoffet med peroxidase-mærket gede-anti-ka-nin-IgG.

Lige store portioner på 50 pi af opløsninger indeholdende 5 pg polynucleotid pr. ml i 15 mM natriumcitrat, to pH = 7,0, og 0,15 M NaCl anbringes i brønde af Immulon II--mikrotiterplader (Dynatek, Alexandria, VA) og omrystes forsigtigt ved stuetemperatur i 2 timer. Dernæst tømmes brøndene og vaskes med 10 mM natriumphosphatpuffer, pH = 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% okseserumalbumin og 0,5% Tween 20 15 (PBS/PSA/Tween).

Kanin-antiserum fortyndes i 10 mM natriumphosphat, pH = 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% BSA, og aliquoter på 50 pi sættes til brøndene og får lov at henstå i 30 minutter. Brøndene vaskes tre gange med PBS/BSA/Tween. Peroxidase, der 20 er covalent koblet til gede-anti-kanin-IgG (Cappel Laboratories, Cochranville, PA) fortyndes 500 gange i 10 mM natriumphosphat, pH = 7,4, 0,15 M NaCl og 0,5% BSA, og aliquoter på 50 pi sættes til hver brønd. Denne opløsning får lov at henstå i brøndene i 30 minutter ved stuetempe-25 ratur, hvorpå brøndene vaskes tre gange med PBS/BSA/Tween.

100 pM Ethidiumbromid inkluderes i det fortyndede antiserum i brønde indeholdende ikke-covalent ethidium--DNA-kompleks og i ethidium-kontrolbrøndene. Alle vaskeopløsninger og reagenser, der er beskrevet ovenfor til 30 behandling af disse brønde, indeholder 100 pM ethidium.

Der fremstilles en peroxidasesubstratopløsning med følgende indhold: 20 mg o-phenylendiamin 5 ml 0,5 M NaHP04 35 12 ml 0,1 M natriumcitrat 0 50

DK 160107 B

13 ml vand 20 μΐ 30%'s hydrogenperoxid.

75 jil Af substratopløsningen tilsættes pr» brønd og får lov at reagere i 10 minutter ved stuetemperatur. Reak-5 tionsblandingerne undertrykkes derpå ved tilsætning af 50 ^il 2,5 M svovlsyre. Dernæst bestemmes absorbanserne ved 488 nm med en Artek model 210-mikroliter pladefotometer (Dunatek, Alexandria, VA).

Normalt kaninserum anvendes som en kontrol og be-10 handles som beskrevet for kanin-antiserum.

F. Resultater

Resultaterne fremgår af den følgende tabel A og viser, at antistof i kontrol-kaninserum ikke bindes i signi-15 f ikante niveauer til hver af de overtrukne eller xaovertrukne brøn de. Det kan have en svag antistof-titer til enkeltstrenget DNA.

Antiserumet til den covalente ethidium-DNA har en meget høj titer til den covalente ethidium-DNA. En del af 20 disse antistoffer bindes formentlig til ethidiumrester, der er koblet covalent til phosphatribosekæden. Denne konklusion er baseret på den iagttagelse, at titerne til det ikke-covalente ethidium-DNA-kompleks er meget lavere, jfr. tabel A.

25 Disse resultater viser, at antistoffer kan frembrin ges til ethidium-DNA-indskudskomplekset, hvilke antistoffer ikke krydsreagerer signifikant med nativ enkelt- eller dobbeltstrenget nucleinsyre.

30 35 51 DK 6 : i; n 8

+J

Φ

C

Φ „ Η ro Tf Tf in r-i o -P < 00 00 Γ' f oo o

WZfNHH CN H rH

|J Q ^ ^ ^ * o o o o o o Φ c w

E EP

G rH *d 2 Φ -H 0 σ\ Η Ό nt^io ft ·Η > T3 H Tf CN rH N Η Η Ό 0

•Η -P O O O OOO <-H

X! G > - *· » « * Z · X! <C

+>0OOO OOO Q ® +> Z

ω λ: · g φ q

Φ +> P I

C Φ Φ S m +) φ tx> tr a_ 2

C < Ό c c E

φ Z C Φ -P O >

-—' ri Q Φ P G O rC

E flimr- iHvoin ^ +) Μ H +> 5 > E N m O η η h XJto«i Φ 0 D oo m ro OOO · -M —* i-> >

00 O ·ιΗ » * · φ Md rI ft Id rH

co I Ό O O O OOO G ft Φ 0 XI fd

Tf φ ·Η Φ X) Φ X

< X A Ό < X) .* G

XI +> G Z 0 W Φ +> r-iJ-ΙΗΦ ·& Q Ό (ΰ E Φ Φ Φ Ρ I > Ρ X) to Λ ω μ ·> Φ (dC-p 2 2 cn φ ρ

Eh <d φ »id Ε Ε 0 G 2 XI Cn ft > > Φ +>

Μ C Λ Λ I fl IH

οφ c+i+jwcc CO Η ΙΟ 00 r· rH CN Tf ζ φ φ C -β. Φ Χ5 4J < η νο ιο cnooin Q > > Φ Ρ Ό

< w Ζ rH Ο Ο OOO Η Η tP Λ I

+jQfcvc» * * * φ td td cd ·Φ h ooo ooo ΜΜχίΦ·ΛΦε φ x P ft c 5-1 XI -H P U U (d X Φ (d -ri < φ > 0 P TI A Z Cn

Q φ rH g Q G U

Ό o <2 -η td

rH X z -ri Φ C A

rij 0 Φ Q Td X to Z Λ Ό I -u X O. <

-P Q Φ S έ Λ Ή ri Z

Cl Ό Ή 3+J ft Q

Φ6 N N IN Γ0 Tf Tf C Ή φ H o H 3 * > * mTrro -η rtj Ό (d φ Φ φ

(d-rlrHi—lr—I OOO Z Ή S rC ,¾ 'O C

> Ό Λ Λ A * » * G Q XI 2. CO φ Φ 0-H OOO Φ +* rH (d tX>T)

ϋΛ rH-P®O0>CC

+J Η φ O Ρ Φ ·&

φ 0 6n+>rH+Jt7'PP

P G G C O -P Λ •P φ Φ tr> o w rH G P rH 0 Μ I -P <xd li O Is n in oo m r' O-Pid i to ih ft φ Ih vo ro cn ro cn rH to > Φ E C Φ

MhhJOOO OOO I +J 0 2 2 Φ Ai +> M-l C ».·.*. ·.·.·. Ild UUlrltPC® 20000 OOO φ Φ I Ό Ό td Φ .ft ft AS ft XI φ G -Η Φ ,ft

ft X .ft ·& XI P G G

2 0 X P +* Φ P

E ftQHXW-WQ+>

Qn 3 I C P rH r-s. ,_' ____, ·___ p -ri ΦΟΟΟ OEOOO ·· rH CN ro Tf in

ΟΌ tomOOP2mOO P

ft c -Η cn oo 4-) P cn oo Φ >i+i G Φ +> +> G 0 W 0

< ft Z

Claims (18)

1. Fremgangsmåde til detektering af en bestemt enkelt-strenget polynucleotidsekvens i et testmedium indeholdende 5 enkeltstrengede nucleinsyrer, omfattende kombination af testmediet med (i) mindst en nucleinsyre-sonde indeholdende i det mindste én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til den sekvens, der skal bestemmes i testmediet, under betingelser, der er favorable for hybri- 10 disering mellem den sekvens, der skal detekteres, og den komplementære sekvens i sonden, og bestemmelse af hybridise-ret sonde, kendetegnet ved, at der også tilsættes en nucleinsyre-indskudsforbindelse, der er i stand til binding til dobbeltstrenget nucleinsyre i form af indskudskom- 15 plekser, og den hybridiserede sonde detekteres ved tilsætning af et antistof eller et fragment deraf, der er i stand til at bindes til indskudskomplekser i det resulterende hybri-diseringsprodukt, hvorpå antistoffet eller fragmentet deraf, der bliver bundet til sådanne komplekser, bestemmes. 20

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at indskudsforbindelsen kombineres med testmediet som en særskilt, fri forbindelse og ikke-covalent bindes med dobbeltstrenget nucleinsyre til dannelse af indskudskomplek- 25 ser.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at indskudsforbindelsen bindes kemisk til sonden i den enkeltstrengede komplementære region af sonden, hvorved der 30 ved hybridisering dannes de nævnte indskudskomplekser i en sådan region.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at antistoffet eller fragmentet deraf mærkes med en 35 detekterbar kemisk gruppe, der fortrinsvis er en enzymatisk 53 DK 163107 B aktiv gruppe, et fluorescerende middel, en chromophor, et luminescerende middel, en specifikt bindelig ligand eller en radioaktiv isotop.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at der anvendes en fast fase-hybridiseringstek-nik, ved hvilken enten sonden eller den enkeltstrengede nucleinsyre fra testmediet, der skal bestemmes, immobiliseres på en fast bærer, og ved hvilken antistoffet, der associeres 10 med den faste bærer, bestemmes.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en fast fase-sandwich-hybridi-seringsteknik, ved hvilken testmediet kombineres med første 15 og anden nucleinsyre-sonder, der hver omfatter i det mindste én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til en derfra forskellig del af den sekvens, der skal detekteres, og ved hvilken en af sonderne er mærket, og den anden er (a) enten immobiliseret på en fast bærer 20 eller (b) indeholder et bindingssted for et specifikt bindingsstof, således at en sådan sonde efter hybridisering samt det resulterende hybridiseringsprodukt kan immobiliseres ved tilsætning af bindingsstof, der immobiliseres på en fast bærer. 25

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en opløsningsfase-hybridise-ringsteknik, ved hvilken sonden indeholder et bindingssted for et bindingsstof, og ved hvilken der efter hybri- 30 diseringstrinet tilsættes en immobiliseret form for et sådant bindingsstof.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at indskudsmaterialet er valgt blandt acri- 35 dinfarvestoffer, phenanthridiner, phenaziner, furocouma-riner, phenthiaziner og quinoliner. » DK Ί 601ϋ7 B 54

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at testmediet indeholder en biologisk prøve, der er blevet underkastet betingelser til frigørelse og denaturering af nucleinsyrer, der er til stede deri. 5

10. Reagenssystem til detektering af en bestemt enkeltstrenget polynucleotidsekvens i et testmedium til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1, omfattende en nuclein-syre-sonde indeholdende i det mindste én enkeltstrenget 10 basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til den sekvens, der skal detekteres, kendetegnet ved, at systemet yderligere indeholder en nucleinsyre-indskuds-forbindelse samt et antistof eller et fragment deraf, der er i stand til binding med indkudskomplekser omfattende 15 dobbeltstrenget nucleinsyre kompleksbundet med indskudsforbindelsen.

11. Reagenssystem ifølge krav 10, kendetegnet ved, at antistoffet eller fragmentet deraf er mær- 20 ket med en detekterbar kemisk gruppe, der fortrinsvis er en enzymatisk aktiv gruppe, et fluorescerende middel, en chromophor, et luminescerende middel, en specifikt bindelig ligand eller en radioaktiv isotop.

12. Reagenssystem ifølge krav 10, kendeteg net ved, at det yderligere omfatter en fast bærer til immobilisering af enkeltstrengede nucleinsyrer fra testmediet.

13. Reagenssystem ifølge krav 10, kendeteg net ved, at sonden er immobiliseret på en fast bærer.

14. Reagenssystem ifølge krav 10, kendetegnet ved, at sonden indeholder et bindingssted for et 35 bindingsstof, og at reagenssystemet yderligere indeholder en immobiliseret form af et sådant bindingsstof. O 55 DK 1601G7B

15. Reagenssystem ifølge krav 10, kendetegnet ved, at indskudsforbindelsen er en særskilt, fri forbindelse, i det væsentlige ikke-kompleksbundet med nu-cleinsyrer. 5

16. Reagenssystem ifølge krav 10, kendetegnet ved, at indskudsforbindelsen er kemisk bundet til en enkeltstrenget region af sonden således, at duplex-dannel-se i en sådan region resulterer i dannelsen af indskuds- 10 komplekser.

17. Reagenssystem ifølge krav 10 til anvendelse ved en sandwich-hybridiseringsmetode, omfattende en anden nu-cleinsyre-sonde, idet henholdsvis den første og den anden 15 sonde indeholder i det mindste én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til en derfra forskellig del af den sekvens, der skal detekteres, og hvor enten en af sonderne er mærket med en detekterbar kemisk gruppe, og den anden er immobiliseret, eller en af 20 sonderne er mærket med en detekterbar kemisk gruppe, og den anden omfatter et bindingssted for et bindingsstof, idet reagenssystemet yderligere omfatter en immobiliseret form for et sådant bindingsstof.

18. Reagenssystem ifølge krav 10, kendeteg net ved, at indskudsforbindelsen er valgt blandt acri-dinfarvestoffer, phenanthridiner, phenaziner, furocoumari-ner, phenthiaziner og quinoliner. 30 35