JPS60144662A - 核酸プローブ、ポリヌクレオチド配列およびその抗体を検出するための試験方法および試薬系 - Google Patents

核酸プローブ、ポリヌクレオチド配列およびその抗体を検出するための試験方法および試薬系

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JPS60144662A
JPS60144662A JP59260990A JP26099084A JPS60144662A JP S60144662 A JPS60144662 A JP S60144662A JP 59260990 A JP59260990 A JP 59260990A JP 26099084 A JP26099084 A JP 26099084A JP S60144662 A JPS60144662 A JP S60144662A
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JP59260990A
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ナニブフシヤン・ダツタグプタ
ピーター・エム・エム・レイ
ウイリアム・ジエイ・ノウルズ
ドナルド・エム・クロザーズ
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MOREKIYURAA DAIAGUNOSUTEITSUKUSU Inc
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝的構成に関・する分析的および診断的目
的に適する標識付は核酸プローブに関し、そしてとくに
特定のポリヌクレオチド配列を検出するための交雑形成
アッセイ（ｈＶｂｒｉｄｉ−ｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ
）に適用することができる。
核酸の交雑形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ　ｉ　−ｏｎ）
の評価は、通常、ＤＮＡ　：　ＤＮＡ９種中に相補的な
ポリヌクレオチドの対の１つの構成員を経て導入された
放射能を検出することにより達成される（標識付けされ
た構成員はプローブと表示される）。プローブの放射線
標識付けは、前駆物質が３７（，１４Ｃ１１２５Ｉまた
は２２ｐで同位兎素により標識付けされる条件下で、Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡの生体内または生体外の重合により実
施されるが、ポリヌクレオチドを合成後に１２Ｓｉまた
は”　２　Ｐ−ＡＴＰで標識付けすることも可能である
。各種類の放射線標識付は方法は、検出の感度、同位元
素の半減期および危険のような制限を有し、そしてプロ
ーブの標識付けは放射能に頼らないで達成することが高
度に望ましい。
現在存在する別の方法は、（ｉ）ハプテン、例えば、ビ
オチンを核酸前駆物質へ結合する方法、および（ｉ　ｉ
）酵素をオリゴヌクレオチドま゛たはポリヌクレオチド
の配列のプローブへ結合する方法であり、（ｉ）の場合
においてプローブを標識付けし、次いで雑種中のビオチ
ニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）プローブの存在を
検出するために２以上の工程を経てポリヌクレオチドの
合成を生体外で実施することが必要であり、そして（ｉ
　ｉ）の場合において、雑種は基質を光学的にまたは化
学的に区別することができる生成物へ転化する能力によ
り検出される。放射能を利用しないこれらの別法は、プ
ローブの化学構造における適度な変化ないし実質的な変
化を含むので、交雑への定性的および／または定量的な
作用が、実際に起こらないにしても、起こる可能性があ
る。
交雑形成アッセイは、本明細書において後述するように
、既知および未知の核酸試料および核酸含有検出プロー
ブを使用して実施する。有利には、既知の試料、分離プ
ローブ（ｓｅｐａｒａ−ｔｉｏｎ　ｐｒｏｂｅ）、を周
体の支持体上に固定しくｉｍｍｏｂｉ　ｌ　ｔｚｅ）、
そして未知の核酸および本発明の標識付は検出プローブ
と接触させる。未知の核酸の部分は固定化プローブと交
雑する。未知の核酸が検出プローブのヌクレオチド配列
と相補的なヌクレオチドをも含有するとき、第２すなわ
ち二重の交雑形成が次いで起こり、それにより検出プロ
ーブは固体の支持体へ結合するようになる。未知の核酸
が特定の相補的ヌクレオチド配列に欠けるとき、検出プ
ローブはそれと交雑形成しない。したがって、ＭＳ２の
交雑の程度は、標識付けの程度により示され、未知の核
酸中の問題の特定のヌクレオチド配列の存在の指示手段
である。
それゆえ、第２の交雑形成がどれだけ起こったか、すな
わち、検出プローブのどれだけが固定化支持体上に存在
するか、を決定することが必要になってくる。
検出プローブは、特定の結合活性、蛍光または酵素活性
を測定する系において検出可能な種々の標識を用いて標
識付けすることができる。このような標識は、放射性同
位元素、蛍光性基、酵素およびハプテンを包含する。蛍
光団（ｆｌｕｏｒ。
ｐ、ｈｏｒｅ）の場合におけるように多過ぎる標識が提
供される場合、標識は第２の交雑形成を妨害することが
ある。他方において、少な過ぎる標識が存在する場合、
アッセイは感度に劣る。
したがって、本発明の目的は、放射能の欠点をもたずか
つ交雑形成を妨害しうるプローブの成分の化学的変更を
含まないでアッセイにおいて使用することができる検出
プローブ（または標識を有するプローブ）を提供するこ
とである。
本発明の他の目的は、多数の読むことができる標識でプ
ローブを標識付けし、これにより、交雑形成を妨害しな
いで、比較的高い感度を生ずる手段を提供することであ
る。
これらの目的および他の目的および利点は、本発明に従
い実現される。
本発明によれば、非交雑形成性の（ｎｏｎ−ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｂｌｅ）、−・末鎖または二本鎖の核酸部分と
結合した、未知の核酸と交雑形成することができる、核
酸の交雑形成性の（ｈｙｂｒｉｄｆｚａｂｌｅ）−水銀
部分からなり、非交雑形成性部分が特定のタンパク質の
ための認識部位または結合部位を含むことを特徴とする
核酸検出プローブが提供される。ＪＩＥ文Ｍ形成性部分
が二本鎖であるとき、鎖の一方は交雑形成性部分と連続
であることができ、すなわち、会合（ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅ）していることができる。
核酸の交雑形成性部分は、遺伝病に関係するもの、例え
ば、鎌型赤血球貧血の原因となるゲノム配列に相補的で
ある核酸配列、のいずれであることもできる。
核酸の非交雑形成性部分は、１種または２種以上のタン
パク質のための高度に特異的なｌまたは２以上の部位を
含有する自然のＤＮＡ配列または合成のオリゴヌクレオ
チドであることかでさる。
種々の核酸の結合部位／結合タンパク賀の対を本発明に
おいて使用することができる。有用な結合タンパク質の
１つの部類は、生物学的系において特定のポリヌクレオ
チド配列を認識するもの、例えば、リプレッサータンパ
ク質である。他の部類は、免疫原伯に変更した核酸に結
合することができる抗体である。
好ましい実施態様において、非交雑形成性部分はオペレ
ーターの遺伝子座へ結合するラクトース（以後上１匹と
呼ぶ）リプレッサータンパク質に対して特異性であるこ
とができ、前記オペレーターは、好ましくは交雑形成後
に、二本鎖でなくてはならない。なぜなら、交雑形成は
オペレーターとリプレッサーとの間の結合を切り離すで
あろうからである。したがって、現在の固定化していな
い検出プローブはｌａｃリプレッサータンパク質を含有
する溶液と接触すると、そのタンパク質は選択的に溶液
から除去され、モしてｌａｃオペレーターへ結合するで
あろう。交雑した試料中の非特異性ＤＮＡの濃度が１０
００倍を超えるとき、非特異性配列へめ結合は無視する
ことができる。生きている細胞におい・て、リプレッサ
ータンパク質はそれらの対応するオペレーター配列へ結
合して遺伝子の転写を調節する。オペレーター配列が他
の配列に共有結合しているとき、リプレッサータンパク
質の結合はなおオペレーターに対して特異的である。
他の好ましい実施態様において、プローブの非交雑形成
性部分は、例えば、非交雑形成性部分中に触性の抗原性
決定因子を導入する修飾化合物（ｍｏｄｉｆｉｅｒ　ｃ
ｏｍｐｏｕｎｄ）ｃＦ）相互作用により、化学的および
／または物理的に修飾されてタンパク質認識部位をつく
る。このような修飾化合物は、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａ
ｌａｔ　−ｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）および白金含有配位子
により例示される。挿入剤は二本鎖核酸と、塩基対の間
に非共有結合的に挿入されるようになることにより、相
互作用する。このような挿入は、らせん軸に沿って巻き
戻されかつ伸ることにより、らせんの第３構造を変化さ
せる。得られる挿入複合体（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏ
ｎ　ｃｏｍｐｌ−ｅｘ）は、新しく形成した抗原性決定
因子により特徴づけられる。前記抗原性決定因子は、挿
入された化合物と二重らせんのそれぞれの鎖の再配向さ
れたホスホジェステラーゼ主鎖とからなると理解される
。有用な挿入剤は一般に平担な、芳香族・有機分子であ
り、アクリジン色素類、例えｊｆ、アクリジンオｌ／ン
ジ、フエナントリジン類、例えば、エチジウム、フェナ
ジン類、フロクマリン類、フェノチアジンジン類、およ
びキノリン類本こより例示される。−末鎖または二本鎖
の核酸へ結合して免疫原変化を誘発させる木質的にｌ、
Ｎかなる化合物を修飾化合物として使用することもでき
る６　′ 本発明は、すべての普通の交雑形成アッセイの７　＊−
マ”）　ｌ−（Ｌｏ　ｒ　ｍ　ａ’ｔ　）に適用可能で
ある。とくに、本発明の独特の検出プローブｔ−ｈ溶液
および固相の交雑形成フォーマットにおｔｚ’て使用す
ることができる。後者のフォーマットは、試料またはプ
ローブの核酸の固定化を含むフォーマットおよびサンド
イツ、チ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）のフッオーマットを包含
する。一般に、本発明は、■程： ’　ａ）　試験蝋質を核酸検出プローブと、検出すべき
配列とプローブ中の相補的な交雑形成性配列の間の交雑
形成に好都合な条件下で一緒にし、その際前記核酸検出
プローブは検出すべき配列に対して実質的に相補的であ
る少なくとも１つの交雑性の一末鎖塩基配列と、特定の
タンパク質による結合のための認識部位を有する非交雑
形成性の二本鎖部分とからなり、 ｂ）　交雑形成したプローブを支持する固体の支持体を
交雑形成していないプローブから分離し、そして Ｃ）　分離した交雑形成プローブを支持する固体の支持
体に、プローブの非交雑形成性部分上の認識部位と結合
する特定のタンパク質を添加し、そして固体の支持体へ
結合するようになるクンバク質を快定する、 からなることを特徴とする一本鎖の核酸を含有する試験
媒質中の特定のポリヌクレオチド配列の検出方法を提供
する。
試料中の特定の核酸ヌクレオチド配列の存在についての
１つのこのようなアッセイにおいて、試料または分離プ
ローブ（ｓｅｐａｒａｔ　１ｏｎｐｒｏｂｅ）を支持体
」二に固定化し、そして、前述の検出プローブを使用し
て交雑形成させ、これにより非交雑形成性部分を支持体
へ付加（ａｆｆｉｘ）する。タンパク質はタンパク質認
識部位へ結合し、これにより支持体へ結合する。
タンパク質は、結合の前または後のいかなる段階におい
ても標識付けされ、そして最後に標識をアッセイする。
他のアッセイにおいて、タンパク質を結合さぜ、そして
物質の残部から支持体を分離した後、支持体を処理して
タンパク質を交雑した検出プローブから解離させ、次い
で解離したタンパク質を、例えば、その上の標識を読む
ことによりアッセイする。その標識はいかなる前の段階
において適用されていてもよい。
本発明に従う交雑形成およびアッセイの概略フローシー
トである添付図面を参照しながら、本発明をさらに説明
する。
図面を詳しく参照すると、未知のＤＮＡ（処理すべき）
を、例えば、制限酵素を使用する消化、′心気泳動によ
る分離、サウザーン・トランスファー（ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）および／または簡単な変性によ
り処理する。すでに固定化されている場合、ＤＮＡを固
体の支持体（例えば、ニトロセルロース紙）、Ｌへ、直
接にあるいは交雑形成により分離プローブへ吸着させる
。固定化されたＤＮＡを既知のプローブと交雑する。既
知のプローブ（Ｐ）は２つの区域を有する。区域ｐｓは
一本鎖でありかつ検出すべき特定の遺伝子（ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ　ｇｅｎｅ）に対して相補的であり、そして区域
ｐｄは標識付は反応が検出される標識を支持する１片の
二本鎖または−）Ｋ鎖の、ノＶ相同ＤＮＡである。ｐｃ
ｔ区域は、特定のタンパク質と結合する二本鎖のＤＮＡ
の特定の配列であることができる。例えば、二本鎖のＤ
ＮＡは１ａｃｌプロモ一ター／オペレーター配列である
ことができ、そのときクンバク質は↓３Ｃリプレッサー
である。ｐｄ区域はまた特定の抗体に対する結合部位で
あることもできる。ｐｃｔ区域はまた特定の−・末鎖の
、免疫原ポリヌクレオチド配列配列またはポリ［ｄ　（
Ｇ−Ｃ）］であることもでき、これらは、高い塩（ｈｉ
ｇｈ　５ａｌｔ）で処理すると、その構造を変化させ、
Ｚ型の免疫原となる。また、ｐｄ部分は挿入剤または白
金含有ＤＮＡ結合配位子で修飾して免疫原部位を生成す
ることもできる。
ｐｃｉがｌａｃプロモーター／オペレーター配列である
とき、ｐｄは交雑形成後±３エリブレッサータンパク賀
と結合するであろう。次いでタンパク質は抗体によりあ
るいは直接標識付けによりアッセイすることができる。
二本鎖ｐｄ部分は、また、ハブテン、例えば、ビオチン
で修飾することができる。次いで、ビオチニル化された
雑種は、既知の方法で検出することができる。また、ｐ
ｄ部分はある数の蛍光発生体（ｆｌｕｏｒｏ−ｆｈｏｒ
ｅ）で修飾し、そして直接アッセイすることができる。
ｌａｃオペレーターーリプレンサー系を含む特定の実施
態様において、前記方法は次の少なくとも４つの工程を
含む： 工程　：バクテリアを生長させ、そしてＩａｃリプレッ
サータンパク賀を分離する； 工程　二検出プローブを−Ｌ」工９オペレーターＤＮＡ
へ共有結合し、そしてこの付加物をクローン化（ｃｌｏ
ｎｅ）して大きい量の試料をイ１するようにする； 工程　：１エＸリプレッサー−ＦＩＴＣまたはりプレッ
サーーβ−ガラクトシダーゼ付加物または抗１ａｃリプ
レッサー抗体を調製する；工程　二交雑形成およびｌａ
ｃリプレッサー上の標識を介する上ａＣオペレーターの
検出。
その後、結合した上ａＣリブレッサータジバク質の量を
種々の方法でアッセイする。例えば、それに対する抗体
を、結合したｌａｃリプレッサーと接触させ、そしであ
る酵素と複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ｌ、たタンパク質
Ａを前記抗体へ結合させることができる。次いで、結合
した酵素の量を、慣用の方法で、その基質の酵素の触媒
反応により決定することができる。
酵素の量は上３エリプレッサーの量を示し、その量は、
順次に、初めに起こった交雑形成の量を示す、別法とし
て、上ａＣリプレッサータンパク質を、蛍光的に標識付
けするか、あるいは酵素で標識付けし、普通の方法で読
むことができる。
検出プローブの二本鎖区域は、また、ガラクトースリプ
レッサータンパク質、ラムダリプレッサータンパク質、
カタボライト遺伝子活性化タンパク質（ｃａｔａｂｏｌ
ｉｔｅ　ｇｅｎｅａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｐｏｔｅｉｎ）
、ＣＡＰ。
Ｃｒｏタンパク質などについて特異性であることもでき
る。結合したｌａｃリプレッサータンパク賀のアッセイ
についての前述の説明は、これらのタンパク質の存在に
ついてのアッセイに等しく適用される。このようなタン
パク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔの菌株か
ら精製することができる。これらのタンパク質が結合す
るＤＮＡ配列は、組み換えＤＮＡ技術により同定されか
つ分離されてきた。ｌａｃリプレッサー結合部位を含有
するＥ、ｃｏｌｉＤＮＡのセグメント（ｌ　ａｃプロモ
ーターオペレーター区域）は、ヒトＤＮＡのセグメント
、例えば、ヘモグロビンを符合化する遺伝子の部分を含
む組み換えプラスミドへ転移される。これらは、それ以
上遺伝子工学に付さないで、ある数の血球素病、例えば
、ある海洋貧血（ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｓ）および鎌
状赤血球血球素血症（ｓｉｃｋｌｅ−ｃｅｌｌｈｅｍｏ
ｇ　ｌ　ｏ　ｂ　ｉ　ｎｅｍｉ　ａ）（１）試験に使用
することができる。あるいは、二重交雑形成のもくろみ
においそ、２つのプラスミドを使用して、ヒト被検者か
らのＤＮＡの試料が鎌状赤血球血球素血症の原因となる
遺伝子状態を含有するかどうかを決定するための使用す
る。一方のプラスミドを分離プローブと表示する。それ
は２形性制限酵素の切り離し部位の一方のフランク（ｆ
ｌａｎｋ）であるＤＮＡを含有する；それは固体支持体
上に一本鎖分子として固定化され、そして標識付けされ
ない。第２のプラスミドは検出プローブと表示される。
それは工形性制限部位の他方のフランクであるＤＮＡを
含有し、そしてｌａｃプロモーター／オペレーター区域
を含有するＥ、ｃｏｌｉＤＮＡのセグメントを含有する
ようのまた作られている。適当な酵素を使用することに
より、検出プラスミドは、β−グロブリン遺伝子配列が
交雑形成に有効であり、一方１ａｃリプレッサー認識部
位が二本鎖にとどまりかつタンパク質の結合に有効であ
る程度に部分的な一本鎖をもつようにされる。
含まれるＩａｃリプレッサータンパク質の読み出しくｒ
ｅａｄ　ｏｕｔ）は、検出プローブの存在の高度に特異
性の認識を提供する。それはまた　。
溶液相の読み出しのための新しい組の可能性を開く。な
ぜなら、β−ガラクトシド、例えば、イソプロピルチオ
−ガラクトシドの添加によるオペレーターＤＮＡからリ
プレッサー−抗体複合体を開放することが可能であるか
らである。
前述の説明において、二本鎖核酸は最初からの゛タンパ
ク質認識部位を含有した。しかしながら、それがこのよ
うな部位を最初から含有しなかった場合、ＤＮＡを修飾
して反応および検出に容易なタンパク質または抗体認識
部位をつることが可能である。
このような修飾は、挿入剤、例えば、フロクマリン（ｆ
ｕｒｂｃｏｕｍａｒｉｎ）類１例えば、アングリシン類
、プソラレン類などを、欧州特許出願第８４１０７６２
４．３号中により詳しく記載されているように、接触さ
せることにより実施することができる。白金含有配位子
を同様に使用することができる。試薬は非交雑形成性核
酸部分をタンパク質により認識できるようにする。非交
雑形成性部分が免疫原性とされる場合、このようなタン
パク質は、抗体、すなわち、イムノグロブリン、例えば
、モノクロナル抗体であることができる。抗体は、タン
パク質認識部位をつくるフロクマリンの量に相当する量
で、非交雑形成性部分に結合することができる。抗体認
識部位は、また、ｐｄがポリ［ｄ　（Ｇ−Ｃ）］配列を
含有し、そしてプローブが高い塩の濃度にさらされると
き、つくられることもできる。
修飾化合物が挿入剤である場合、このような化合物は好
ましくは、通常塩基対の間の挿入により、二本鎖核酸と
結合することができる低分子楚の、乎担な、通常芳香族
であるが１時には多環式である分子１例えば、ＤＮＡ／
ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、またはＲＮＡ／ＲＮＡ二重ら
せんである。１次の結合機構は、通常非共有的であり、
共有５結合は第２工程として起こり、ここで挿入剤は反
応性または活性化可能な化学的基を有し、挿入された（
ｉｎｔｅｃａｌａｔｅｄ）二重らせんの鎖の一方または
双方上の隣接する化学的基と共有結合を形成する。挿入
の結果により、隣接する塩基対はそれらの正常の分離距
離のほぼ２倍に広がり、これにより二重らせんの分子長
さを増加する。さらに、約１２〜３６度の二重らせんの
巻き戻しが起こって挿入剤を収容しなくてはならない、
一般的な概説およびそれ以上の情報は、次の文献から得
ることができる：Ｌｅｒｍａｎ、Ｊ。
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、３：１８　（１９６１）；Ｂｌｏｏ
ｍｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、”Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ”
、Ｃｈａｐｔｅｒ　７．ｐｐ。
４２９−４７６、ＨａｒｐｅｒおよびＲｏｗｅ　。
ＮＹ　（１９７４）　；Ｗａｒｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ２
１９：１３２０　（１９６８）；Ｈａｒｔｍａｎｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、Ａｎｇｒｅｗ、Ｃｈｅｍ、。
Ｅｎｇｌ、Ｅｄ、７：６９３　（１９６８）；Ｌｉｐｐ
ａｒｄ、Ａｃｃｔｓ、Ｃｈｅｍ、Ｒｅｓ、１１：２１１
　（１９７８）　；Ｗｉ　１ｓｏｎ、Ｉｎｔｅｒｃａｌ
ａｔｉｏｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２）、４４５
．およびＢｅｒｍａｎ　ｅｔａｌ　、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉ　。
ｅｎｇ、１０　：　８７　（１９８１）。
広範な種類の挿入剤を、本発明において使用することが
できる。これらの挿入剤のいくつかの部類および特定の
化合物の例を、次の表に記載する： 挿入剤の部類および代 一−゛・化　文 Ａ、アクリジン色素　Ｌｅｒｍａｎ、Ｊ、ｓｕプロフラ
ビン、ア　ｐｒａ；Ｂｌｏｏｍｆｉクリジンオレ７　ｅ
ｌｄ　ｅｔ　ａｌ、ｓジ、キナクリン、ｕｐｒａ；Ｍｉ
ｌｌｅｒアクリフラビン　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｐｏｌｙ
ｍｅｒｓ　１９： ２０９１　（１９８０） Ｂ、フェナントリジン　Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄエチジウ
ム　ｅＬ　ａｌ、５ｕｐｒａ コラリｙ　；Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ ａｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈ ｅｍ−１９：”１２６１ （１９７６） エリブチシン、ｘ　Ｆｅ５ｔｙ　６ｔ　ａリプチシンカ
チオ　Ｉ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔンおよび誘導体　ｅｒｓ
　１７：３２１（１９７１）；Ｋｏｈｎ ｅｔ　ａｌ、Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅ５−３５：７ １　（１９７６）　：ＬｅＰ ｅｃｑ　ｅｔ　ａｌ、Ｐ ＮＡＳ　（ＵＳＡ）７１　： ５０７８　（１９７４）　； Ｐｅ１ａｐｒａｔ　ｅｔ ａｔ、１５ａｌ、Ｊ。
Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、２３ ：１３３０　（１９８０） Ｃ、フェナジン　Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ５−メチル７　
ｘ、す　ｅｔ　ａｌ、５ｕｐｒａジンカチオン Ｄ、フェノチアジン　１ｂｉｄ クロプラマジン Ｅ、キノリン　１ｂｉｄ クロロキン キこン Ｆ、アフラトキシン　ｉｂｉづ Ｇ、多環式炭化水素お　１ｂｉｄ よびそれらのオキシラ イ誘導体 ３．４−ベンゾビ　Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ。
レン、゛ベンゾピＩｙ　Ｂｆｏｃｈｅｍ、Ｂｉ。
ンジオールエボキ　ｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、ｃ。
シト、ｌ−ビレ＝　ｍｍ、８２：９２９　（１ルオキシ
ラン　９７８） ペンズアントラセ　Ａｍｅａ　ｅｔ　ａｌ。
′５・６−１−ｔ−５ｃｉｅｎｃｅ　１７６シド　：４
７（１９７２） Ｈ、アクチノマイシ７　Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄアクチノ
マイシン　、ｅＨｔ　ａ、ｌ　、５ｕｐｒａ！、アント
ラサイクリ　ｊｂｉｄ ノン β−ローダマイシ ンＡ ダウナマイシン Ｊ、チアキサンテノン　１ｂｉｄ ミラシルＤ Ｋ、アントラマイシン　１ｂｉｄ Ｌ、ミドマイシン　Ｏｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌ
、Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、、５ｐｅ ｃ、Ｐｕｂｌ、３ニア９ （１９’７７）；Ａｋｈｔ ａｒｅｔａｔ、Ｃａ ｎ、Ｊ　、Ｃｈｅｍ−５３ ：２８９１　（１９７５） Ｍ、白金錯体　Ｌ　ｉ　ｐ　ｐ　ａ　ｒ　＋１　、　Ａ
　ｃ　ｃｔｓ、ｃｈｅ’ｍ、Ｒｅ ｓ、１１：２１１　（１９ ７８） Ｎ、ポリ挿入剤（ｐｏ　Ｗａｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌｙｉ
ｎｔｅｃａｒａ　ｌ、Ｎａｔｕｒｅ　２５ｔｏｒ）　’
　２：６５３　（１９７’４）ヱキノマイシｙ　；Ｗａ
ｋｅｌｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　、１５７ ：７２１　（１９７６） キノマイシン”Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｂトリオスチン　
ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１７ＢＢＭ９２８Ａ　３：１１５（
１９７８）タンデム　；Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａ ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ９：５５３７　（１９８ ０）：Ｖｉｓｗａｍｉｔ ｒａ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａ ｔｕｒｅ　２８９：８１ ７（１９８１） ジアクリジｙ　ＬｅＰｅｃｑ　ｅｔ　ａｌ　、ＰＮＡＳ
　（ＵＳＡ） ７２：２９１５　（１９７ ５）ＨＣａｒｒｅｌｌａ ｋｆｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｂ ｉ　ｏｃｈｅｍ、Ｂｉ　ｏｐ ｈｙｓ、Ａｃｔａ　４１ ８　：　２７７　（１９７６） ；Ｗａｋｅｌｉｎ　ｅｔ ａｌ　、Ｂｉ　ｏｃｈｅ ｍ、１７　：　５０５７　（１ ９７８）；Ｗａｋｅ　ｌ　ｉ ｎ　ｅｔ　ａｌ、ＦＥＢ Ｓ　Ｌｅｔｔ、１０４： ２６１　（１９７９）；Ｃ ａｐｅｌｌｅ　ｅｔ　ａ １、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ８　：　３３５４　（１９７ ９）；Ｗｒｉｇｈｔ　ｅ ｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、１９　：　５８２５　（１ ９８０）　；Ｂｅｒｎｉｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉ。
ｃｈｅｍ、Ｊ　、１９９　： ４７９　（１９８１）　；Ｋ ｉｎｇ　ｅＬ　ａｌ、Ｂ ｉｃｈｅｍ、２１：４９ ８２（１９８２） エチジウムニ量　Ｇａｕｇａｉｎ　ｅｔ体　ａｌ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。
１７　：　５０７８　（１９７ ８）：Ｋｕｈｌｍａｎ ６ｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌ。
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、５ ：　２６２９　（１９７８） ；Ｍａｒｌｃｏｖｉｔｓ ｅｔ　ａｌ、Ａｎａ １、Ｂ’ｉｏｃｈｅｍ、９ ４：　２５９　（１９７９） ；Ｄｅｒｖａ　ｅｔ　ａ １、ＪＡＣＳ　１００： １９６８　（１９７８）； １ｂｉｄ　１０１：３６ ６４（１９７９） エリブチセフ　二ＪＩ　Ｄ　ｅ　ｂ　ａ　ｒ　ｒ　ｅ　
ｅ　を体および類似体　ａｌ、Ｃｏｍｐｔ、Ｒｅｎｄ、
Ｓｅｒ、’Ｄ、２８ ４：８１　（１９７７）； Ｐｅ１ａｐｒａｔ　ｅｔ ａｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃ ｈｅｍ、２３：１３３６ （１９８０） ヘテロ、ニムを体　Ｃａ１ｎ　ｅｔ　ａｌ。
Ｊ　、　Ｍ　ｅ　ｄ　、　Ｃｈ　ｅ　ｍ　。
２１　：　６５８　（１９７ ８）　；Ｇａｕｇａｉｎ ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、１７：５０７８ （１９７８） 三景体　Ｈａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａ ｌ、ＪＣＳ　Ｃｈｅｍ。
Ｃｏｍｍ、１６２　（１９ ８３）　；Ａｔ　ｎｅ　ｌ　ｌ ｅＬ　ａｌ、ＪＡＣＳ １０５：２９１３　（１９ ８３） ０、ノルフィリンＡ　Ｌｏｕｎ　ｅｔ　ａｌ。
ＪＡＣＳ　１０４：３２ １３（１９８２） Ｐ、フルオレンおよび　Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄフルオレ
ノン　ｅｔ　ａｌ、ｓｕｐｒａフルオレノジアミ　；Ｗ
ｉｔｋｏｗｓｋｉン　ｅｔ　ａｌ、Ｗｉｓｓ。
Ｂｅ１ｔｒ、−Ｍａｒｔ ｉ　ｎ−Ｌｕｔ　ｈｅ　ｒ−Ｕ ｎｉｖ、Ｈａｌｌｅ　Ｗ ｉｔｔｅｎｂｅｒｇ、１ １　（１９８１） Ｑ、　２ルオクマリン アンゲリシン　Ｖｅｎｅｍａ　ｅｔ　ａｌ、ＭＧＧ、Ｍ
ｏ１．Ｇ ｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１７ ９　：　１　（９８０） ４．５′−ジメチ　Ｖｅｄａｌｄｉ　ｅｔルアンゲリシ
ン　ａｌ、Ｃｈｅｍ、−Ｂｉｏｌ、Ｉｎｔｅｒａｃ ｔ、３６：２７５（１９ ８１） プソラレン　Ｍａｒｃｉａｎｉ　ｅｔ ａｌ、Ｚ、Ｎａｔｕｒ ｆｏｒｓｃｈ　Ｂ　２７ （２）　：１９６　（１９７ ２） ８−メトキシプン　Ｂｅｌｏｇｎｚｏｖ　ｅラレン　ｔ
　ａｌ、ＭｕＬａｔ。
Ｒｅｓ、８４：１１　（１ ９８１）　；５ｃｂｔｔ ｅｔ　ａｌ、ｐｈｏｔ。
ｃｈｅｍ、Ｐｈｏｔ　ｏｂ ｉｏｌ、３４：６３（１ ９８１） ５−アミノメチル　Ｈａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａ−８−メト
キシプ　ｌ、Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ。
ソラレン　２２　：１８４７　（１９８１） ４．５．８−１すＢｅｎ−Ｈｕｒｅｔ メチルプソラレ　ａｌ　、Ｂｉ　ｏｃｅｍ、Ｂン　１ｏ
ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ ３３１　：１８１　（１９ ７３） ４′−アミノメチ　ｌ５ｓａｃｓ　ｅｔ　ａルー４，５
．８−　１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１トリメチルブソラ　６
：１０５８　（１９７レン　７） キサントキシン　Ｈｒａｄｅｃｍａ　ｅｔａｌ、Ａｃｔ
ａ　Ｖｔ ｒｏｌ、（Ｅｎｇ、Ｅ ｄ、）２６　：　３０５　（１ ９８２） ケリン　ＢｅａｕｍｏｎＬ　ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉ　ｏｐｈｙｓ、Ａｃｔ ａ　６０８：１８２９ （１９８０） Ｒ，ペンゾジビロ７　Ｍｕｒｘ　ｅｔ　ａｌ。
Ｊ、Ｈｅｔ、Ｃｈｅｍ。
１２：４１７（１９７ ５）；Ｈｏｒｔｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、ＰｈｏＬｏｃ ｈｅｍ、Ｐｈｏｔｏｂｉ ｏｌ、２０：４０７（１ ９７４） Ｓ、−ＥノストラＪＬ／　４　Ｊ　ｕ　＆　ｒ　ｒ　ａ
　ｎ　Ｚ　ｅ　ｔ７７スト・ブルー　ａｌ、Ａｃｔａ　
Ｈ３ｓｔｏｃｈｅｍ、７０： １３０　（１９８２） 望ましい場合あるいはとくに有利である場合、挿入剤は
、例えば、共有結合により、挿入複合体中の相補的類の
一方または双方へ化学的に結合することができる０本質
的にいかなる有効な方法を使用して、このような結合を
達成することもできる。好ましくは、結合は光反応性挿
入剤で挿入を実施し、次いで光化学的結合反応を行なう
ことにより形成される。とくに有用な方法はアジド挿入
剤の使用を包含する０反応性二トレン（ｎｔｒｅｎｅ）
類は長波長の紫外線または可視光線により容易に発生し
、そしてアリールアジド類のニトレン類は転位生成物よ
りも挿入反応に好ましい［Ｗｈｆｔｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、４６：６４４（１
９７７）参照］。代表的なアジド挿入剤は、３−アジド
アクリジン、９−アジドアクリジン、エチジウムモノア
ジド、エチジウムジアジド、エチジウムモノアジド［Ｍ
ｉｔｃｈｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、ＪＡＣ３１０４：４２６
５（１９８２）１．４−アジド−７−クロロ−キノリン
および２−アジドフルオレンである。他の有用な光反応
性挿入剤は、フロクマリン類であり、これらはピリミジ
ン残基をもつ［２＋　２］環式付加物を形成する。アル
キル化剤、例えば、ビス−クロロエチルアミン類および
エポキシド類またはアジリジン類、例えば、アフラトキ
シン類、多環式炭化水素のエポキシド類、ミドマイシン
、そしてノルフィリンＡを使用することもできる。
あるいは、タンパク質認識部位は核酸それ自体以外の非
交雑形成性部分のセグメント上に存在することができる
。例えば、核酸の非交雑形成性部分は、フロクマリンの
ような構ＩＩｔ員により化学基、例えば、ビオチンへ結
合することができ、このビオチンはタンパク質認識部位
を構成する。
ビオチンは普通の方法、例えば、アビジン（ａｖｉｄｉ
ｎ）または抗ハブテン抗体でアッセイすることができる
。フロクマリンは蛍光団へ結合することができ、この蛍
光団はその後蛍光についてアッセイされる。
前述のタンパク質を使用する標識付けは、二本鎖核酸の
修飾の前または後に、好ましくは後に実施することがで
きる。
塩類を、また、非交雑形成性部分を修飾してそれをタン
パク質認識性とする手段として使用することができるＣ
例、ポリ［ｄ　（Ｇ−Ｃ）］またはポリ［ｄ　（Ｇ−Ｃ
）］はＺ型に変化する）。
適当な塩類は、ナトリウム塩化物、鉱酸の他のアルカリ
金属またはフルカリ上類金属のＩＪｆ溶性塩類、スペル
ミンまたはスペルミジン類を包含し、有利には少なくと
も約１重量％の濃度で使用する。有利には、溶媒は水で
ある。塩修飾核酸およびフロクマリン修飾核酸の両者は
、抗原性であり、例えば、普通の方法でアッセイするこ
とができる特異性抗体を結合することができる。例えば
、前述のように、タンパク質Ａは、引き続くアッセイに
おいて標識として機能する酵素と複合することができる
。
プローブは、検出すべき配列に対して実質的に相補的で
あるかあるいはそれと相同性である一本鎖塩基配列の少
なくとも１種からなるであろう。
しかしながら、このような塩基配列は、単一の連続のポ
リヌクレオチドのセグメントである必要はなく、非相同
配列により中断された２以りの個々のセグメントから構
成されることができる。これらの非相同配列は、直線で
あごとができるか、あるいは自己相補的でありかつヘパ
リンのループを形成することができる。さらに、プロー
ブの相同区域は、非相同配列、例えば、相同配列が伸長
のため挿入されているベクトル（ｖｅｃｔｏｒ）のＤＮ
ＡまたはＲＮＡからなるものにより、３′−および５′
−末端においてフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）され
ることができる。いずれの場合においても１分析試薬と
して提供されるプローブは、問題の核酸を抽出するｌま
たは２以上の点において検出可能な交雑形成を示すであ
ろう。直線または円形の一本鎖のポリヌクレオチドをプ
ローブとして使用することができ、重要な相同の１また
は２以上のセグメントが一本鎖の形でありかつ試料のＤ
ＮＡまたはＲＮＡとの交雑形成に有効であるかぎり、大
部分または小部分は相補的なポリヌクレオチドの１また
は２以上の鎖と二重らせんとされる。相同プローブ配列
が本質的に一本鎖の形のみである直線または円形のプロ
ーブはとくに好ましい［とくに、ＨｕおよびＭｅｓｓｉ
ｎｇ＊Ｇｅｎｅ　１７：２７７　（１９８２）参照］。
本発明における特定のタンパク質試薬の交雑形成生成物
への結合は、いかなる普通の方法によっても検出するこ
とができる。有利には、結合するタンパ、り質は検出可
能な化学基でそれ自体標識材は可能である。このような
検出可能な化学基は、検出可能な物理的性質または化学
的性質を有するいかなる物質であることもできる。この
ような物質は免疫アッセイの分野においてよく開発され
てきていおり、そして本発明において適用することがで
きる。酵素的に活性な基（ｇｒｏｕｐ）、例えば、酵素
（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、（１９７６）２’２：１２４３
参照）、酵素基質（英国特許明細書１，５４８，７４１
号参照）、補酵素（米国特許第４．２３０．７９７号お
よび米国特許第４゜２３８．５６５号参照）、および酵
素阻害剤（米国特許第４，１３４，７９２号参照）；蛍
光発光体（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、（１９７９）２５：３
５３参！＠）：発色団；、冷光発光体、例えば、化学冷
光発光体および生物冷光発光体（Ｃｈｉｎ。
Ｃｈｅｍ、（１９７９）２５　：　５１２および１ｂｉ
ｄ、１５３１）；特異的に結合性の配位子；および放射
性同位元素、例えば、３Ｈ１３５Ｓ、３２ｐ、１２ＳＩ
および１４Ｃはとくに有用である。このような標識およ
び標識対はそれを自体の物理的性質（例えば、蛍光発光
体、発色団および放射性同位元素）またはそれらの反応
性または結合性（例えば、酵！、基質、補酵素および阻
害剤）を基準にして検出される。例えば、コファクター
標識粘合性タンパク質は、標識が酵素のコファクターお
よび基質である酵素を添加することにより検出すること
ができる。ハブテンまたは配位子（例えば、ビオチン）
標識結合性タンパク質は、検出可能な分子で標識付けさ
れた配位子と結合するハプテンまたはタンパク質へ抗体
を添加することにより検出することができる。このよう
な検出可能な分子は、測定可能な物理的性質（例えば、
蛍光または吸収）をもつある分子または酵素反応に参加
する物質（例えば、上に列挙したものを参照）であるこ
とができる０例えば、基質へ作用して測定可能な物理的
性質をもつ生成物を生成する酵素を使用することができ
る。後者の例は、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホ
スファターゼおよびペルオキシダーゼを包含するが、こ
れらの限定されない。現場の交雑形成の研究のため、理
想的には、最終生成物は水不溶性である。他の標識付け
の方法は、当業者にとって明らかである、う。
あるいは、結合性タンパク質は本来の性質、例えば、そ
れ自体の抗原性に基づいて検出することができる。標識
付けした抗（結合性タンパク質）抗体は、抗体の標識が
前述の慣用の標識である１次タンパク質試薬へ結合する
であろう。さらに、結合性タンパク質が抗体である場合
、それは相補的固定（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｆｉｘａ
ｔｉ。
ｎ）または標識付けしたタンパク質Ａの使用により、な
らびに抗体を検出する分野において知られている他の技
術により検出することができる。
標識は、直接の化学的結合、例えば、共有結合を包含す
る結合により、あるいは間接的結合により、例えば、マ
イクロカプセルまたはリポソーム中に標識を混入し、次
いでそれを結合性タンパク質へ結合することにより、結
合性タンパク質へ結合されるであろう。標識付は技術は
この分野においてよく知られており、そしていかなる便
利な方法を本発明において使用することもできる。
結合性タンパク質が抗体であるとき、このような試薬は
完全な抗体、抗体断片、多機能性抗体凝集体から成るこ
とができ、あるいは一般に抗体からの１または２以上の
特異性結合部位を含むいかなる物質から成ることもでき
る。完全な抗体の形であるとき、それは既知のイムノプ
ロブリン類、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの部類および
下位の部類にいずれかに属することができる。プローブ
の認識部位のための特異的結合性親和性を保持するこの
ような抗体の断片、例えば、普通にＦａｂ、Ｆ（ａｂ’
）およびＦ（ａｂ’）　として知られているＩｇＧの断
片のいずれをも使用することができる。さらに、イムノ
グーロブリンの凝集体、ポリマーおよび複合またはそれ
らの断片を適当ならば使用することができる。
抗体試薬のためのイムノグロブリン源は、現存の方法で
、例えば、普通の抗血清およびモノクロナル技術により
得ることができる。抗血清は、動物、例えば、マウス、
ウサギ、モルモットまたはヤギを適当な免疫原で免疫化
することを包含する、よく確立された技術により得るこ
とができる。免疫原は通常カチオン性のタンパク質また
はタンパク質誘導体（例えば、メチル化したウシの血清
アルブミン）と修飾核酸との間のイオン性複合体からな
る。あるいは、修飾核酸をキャリヤーのタンパク質へ共
有結合することができる。イムノグロブリンは、また、
体細胞の交雑形成技術により得ることができ、例えば、
普通にモノクロナル抗体として呼ばれるものにおいて得
られたものであることができる。ハイブリドーマの形成
に導く１次感染のための使用される免疫原は前述のとお
りである。
アッセイすべき試験試料は、いかなる問題の媒質である
こともでき、通常、医学、獣医学、環境、栄養、または
工業において意味のある液体の試料であろう。人間およ
び動物の標本およびとくに体液、例えば、尿、血液（血
清または血漿）、乳、脳を髄液、糞便物質、肺の呼吸物
質、のどのスワブ（ｓｗａｂ）、性器のスワブ゛および
分泌物、直腸のスワブ、および鼻咽頭の呼吸物質を、本
発明の方法によりアッセイすることができる。
患者または他の源から得られる試験すべき試料が、例え
ば、細胞中に含有されるような、二本鎖核酸を主として
含有する場合、試料を処理して核酸を変性し、そして必
要に応じて、まず核酸を細胞から開放する。核酸の変性
は好ましくは梯騰水中の加熱またはアルカリ処理（例え
ば、０．ＩＮの水酸化ナトリウム）により達成され、必
要に応じて、アルカリ処理は細胞を溶解するために同時
に使用することができる。また、核酸の開放は、例えば
、機械的破壊（凍結／融解、摩耗、超音波処理）、物理
的／化学的破壊（洗浄剤、例えば、トリトン、ツイーン
、ドデシル硫酸ナトリウム、アルカリ処理、浸透圧衝撃
、または熱）、または酵素の溶解（リソチーム、プロテ
イナーゼＫ、ペズシン）により実施することができる。
得られる試験媒質は一本鎖の形の核酸を含有し、次いで
それを本発明の交雑形成方法に従いアッセイすることが
できる。
この分野において知られているように、種々の交雑形成
条件をこのアッセイにおいて用いることができる。典型
的には、交雑形成はわずかに高い温度、例えば、約３５
〜７０．２５℃、通常はぼ６５．２５℃において、ｐＨ
約６〜８を有し、かつ適当なイオン強度（例えば、２Ｘ
ＳＳＣ１ここでｌＸ５ＳＣ＝０．１５Ｍの塩化ナトリウ
ムおよび０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，
０）の、タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン、Ｆ
　ｉ　ｃｏ　ｌ　Ｉ　（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａＦｉｎ
ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａ’ｗａｙ　、
ＮＪ）から販売されているスクロースとエビクロロヒド
リンとのコポリマーを示す商標）、ポリビニルピロリド
ン、および変性された異質のＤＮＡ、例えば、子牛胸腺
またはサケ精子からのものを含む溶液中で進行するであ
ろう６交雑形成を起こさせるために必要な試料およびプ
ローブの釦の間の相補性の程度は、条件の厳格さに依存
する。交雑形成の程度および特異性は、次の主な条件に
より影響を受ける： １、核酸調製物の純度。
２、プローブ−Ｇ−Ｃ塩基対の基本組成は、Ａ−Ｔ塩基
対よりも大きい熱安定性を示すであろう。こうして、よ
り高いＧ−Ｃ含量を含む交雑形成は、より高い温度にお
いて安定であろう。
３、相同塩基配列め長さ一塩基の短い配列（例えば、６
ｊＪｉ基より小）は、多くの核酸中に存在する可能性が
高い、こうして、このような短い配列を含む交雑形成に
おいて特異性はほとんどあるいは全く達成されえない０
本発明の相同プローブ配列は、少なくともｌＯ塩基、通
常２ｏ塩基以上、好ましくは１００塩基より大きいであ
ろう、実際的観点から、相同プローブ配列はしばしば３
００〜１ｏｏｏのヌクレオチドの間であろう。
４、イオン強度−再アニーリング速度は、インキュベー
ション溶液のイオン強度が増加するにつれて増加する。
５、インキュベーション温度−最適な再アニーリングは
所定の二重らせん（ｄｕｐｌｅｘ）についての溶融温度
（Ｔ　ｍ　）より約２５〜３０℃だけ低い温度において
起こる。最適な温度゛よりも有意に低い温度におけるイ
ンキュベーションは、それほど関係がない塩基対を交雑
させる。
６、核酸濃度およびインキュベーション時間−通常、反
応を交雑形成に向けて進行させるために、交雑形成性試
料の核酸の１つは、過剰に１通常１００倍以上に存在す
るであろう。
７、変性試薬（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｒ
）−水素結合破壊剤、ホルムアミドおよび尿素の存在は
交雑形成の厳格さを増加する。
８、インキュベーション時間−インキュベーション時間
が長いほど交雑形成はより完結するであろう。
９、容量排除剤（ｖｏｌｕｍｅ　ｅｘｃｌｕｓｔｏｎ　
ａｇｅｎｔ）−これらの容量排除剤、例えば、デキスト
ランおよび硫酸デキストランは交雑形成要素の濃度の効
果的に増加し、これにより得られる交雑形成速度を増加
すると考えられる。
本発明の分析法の実施は、特定の交雑形成フォーマット
に限定されない、任意の普通の交雑形成技術を使用する
ことができる。改良がなされ、そして結局新しいフォー
マットが開発されたので、このようなものは本発明の方
法の実施に容易に適用することができる。とくに有用で
ある普通の交雑形成フォーマットは、試料の核酸を固体
の支持体上へ固定化するもの（固相の交雑形成）および
ポリヌクレオチド種がすべて溶液中に存在するもの（溶
液の交雑形成）を包含する。
固相の交雑形成のフォーマットにおいて、試料のポリヌ
クレオチドを適当な方法でそれらの一本鎖の形にいて固
体の支持体へ固定する。有用な固体の支持体はこの分野
においてよく知られており、そして核酸を共有的にある
いは非共有的に結合するものを包含する。一般に疎水性
の結合を含むと理解される非共有結合の支持体は、自然
に産出するおよび合成のポリマー材料、例えば、フィル
ターまたは固体のシートのような種々の形態の、ニトロ
セルロース、誘導されたナイロン、およびフッ化ポリ炭
化水素を包含する。共有結合は、また、有用であり、そ
して化学的に反応性の１または２以上の基を有する物質
、例えば、ジクロロトリアジン、ジアザベンジルオキシ
メチルなどからなり、ポリヌクレオチド配列への結合の
ために活性化することができる。
典型的な固相の交雑形成技術は、試料の核酸を支持体上
へ一本鎖の形態で固定化することにより開始する。この
初期の工程は、試料からの相補的類の再アニールリング
を本質的に防止し、そして試料物質を支持体上において
濃縮して検出性を増大するための手段として使用するこ
とができる。
次いで、ポリヌクレオチドのプローブを支持体と接触さ
せ、そして交雑形成を前述のように検出する。固体の支
持体は、交雑形成したプローブと会合した標識付けされ
た試薬を、会合しないままにある試薬から分離するため
の手段を提供する。
興味ある他の方法はサンドイッチ交雑形成技術であり、
この技術において、プローブの相同配列の２つの相互に
排他的な断片の一方を固定化し、そして他方を標識付け
する０問題のポリヌクレオチド配列の存在は、固定化さ
れかつ標識付けされたセグメントへの二重の交雑形成を
生じ、再び支特休会合挿入複合体の同一の究極の測定を
用いる。それ以上の詳細については、次の文献を参照：
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５：４６８　（１９８０）お
よびＧｅｎｅ　２１　：　７７−８５　（１９−８３）
。
本発明は、また、非交雑形成性部分が修飾されてタンパ
ク質認識部位を、例えば、フロクマリンで、非交雑形成
性二本鎖または一本鎖の成分とタンパク質認識部位（こ
れはハプテンまたは配位子であることができる）との間
の結合として、結合されている検出プローブを含むアッ
セイに拡張される。固定化された分離プローブまたは試
験試料を、そのように修飾されてタンパク質を結合しか
つ標識を有する検出プローブの存在下に交雑形成条件に
暴露し、そして標識をアッセイする。
別法として、タンパク質は、タンパク質を形式的に標識
付けしないで、普通の方法で、抗体を構成し、免疫原的
に７フセイすることができる。他の別法として、ハプテ
ンまたは配位子がタンパク質認識部位に存在するとき、
その存在をアッセイすることができる。また、フロクマ
リンは蛍光団を結合し、そしてこの蛍光団をアッセイ可
能な要素として利用することができる。
前述のように作りかつ使用する検出プローブは、直接に
プローブ分子を標識付けするとき可能であるよりも、−
水銀核酸ブローブ分子当りの標識の数がはるかに大きい
ので、従来よりも大きい感度を示す。
本発明は、さらに、所望のアッセイ法を実施するために
必要な必須要素のすべてからなる、試薬系、すなわち、
試薬の組み合わせまたは手段を提供する。試薬系は、商
業的に包装された形態で、試薬の相溶性が許す組成物ま
たは混合物として、試験装置の形状において、あるいは
通常の試験キット、すなわち、必要な試薬を保持しかつ
通常アッセイを実施するための指示を含む、１または２
以上の容器、装置などの包装された組み合わせとして、
提供される。
すべての場合において、試薬系は、（１）ここに記載す
るプローブおよび（２）、好ましくはまたここに記載す
る検出可能な化学基で標識付けされた、結合性タンパク
質試薬からなる。この系は、さらに、試験媒質から一本
鎖の核酸を固定化する固体の支持体を含む、サンドイッ
チのフォーマットについて、前述の第２の分離プローブ
がこの系中に含まれる。試験キットの形の系は、さらに
、補助化学物質、例えば、交雑形成の成分および試験試
料中の二本鎖核酸を一本鎖の形に転化することができる
変性剤を含む、好ましくは、試料を処理して一本鎖核酸
をそれから開放するために、化学的溶解剤（ｌｙｓｉｎ
ｇ　ａｇｅｎｔ）および変性剤、例えば、アルカリが含
められる。
次の実施例によシ、本発明をさらに説明する。
実施例において、特記しないかぎシ、すべての部は重量
による。
ｇ、ｃｏｌｉ株ＢＭＨ４６１（本菌株はＢｉｏ−ｍｅｄ
ｉ−ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　
全体で広く使用されており、Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙから入手したものである）： Δ（ｌａｃ　ｐｒｏ）（λＣ１８５７ｔ６８ｄ　１ａｃ
ｉｑｚ”ｙ−）／（Ｆ”　ｌａｃ　ｉｑｚ＋ｙ−ｐｒｏ
＋）　、開発＝Ｍｕｌｌｅｒ−（（ｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ
、　）はｌａｃリプレッサ遺伝子をもつ熱的に誘発性の
ラムダ溶原体（ｌｙｓｏ−ｇｅｎ　）を有し、そして野
生型株に比較して１０００倍でタンパク質を過剰に生産
する。（他のＥ。
ｃｏｌｉ株をタンパク質の分離に使用することもできる
）。この株を、次のように、実質的にＭｕｌｌｅｒ−Ｈ
ｌｌｌ　ｅｔ　ａｌ、およびＰｌａｔｔ　ｅｔ　ａ、ｌ
　が記載するようにして生長させる（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈ
目ｌ″ｅｔａ１．、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、、　５９．　１２５９（１９６８）；Ｐｌａｔ
ｔ　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ　Ｅｘｐ、　ｉｎ　Ｍｏ１Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ　（ｅｄ、、　Ｊ、Ｍｉｌｌｅｒ）　Ｃ
８Ｈ，ｐｐ。
３６３−３９３（１９７２））： ３チのバクトトリプトｙ　（Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎ
ｅ）、胞を３２℃において３のＯＤ　５５０に生長させ
る。
次いで、温度を４４℃に２０分間上昇させて５時間作用
させる。細胞を培養物から６００Ｏｒｐｍにおける遠心
によ部分離し、−８０℃において凍結させて貯蔵する。
細胞の１００ｔを融解し、ワーリング（Ｗａｒｉｎｇ）
プレンダー内で配合し、遠心後の上澄みを０．２　Ｍの
Ｔｒｉｓ　ＨＣＬ　ｐＨ６，９，０，２ＭのＫＣＩ、　
１０　ｍＭのアセテート、０．１ｍＭのジチオスレイト
ール、５　＊　（Ｖ／Ｖ　）のグリセロールからなる緩
衝液で１ＱＱａｌにし、０．２３ｆ／’の硫酸ナトリウ
ムの添加によシ沈殿させる。沈殿を１０．００　Ｏｒｐ
ｍにおける遠心によシ集め、５ｍの前記緩衝液中に再溶
解□し、０．１２Ｍのリン酸カルシウム（ｐＨ７，４）
、０．１　ｍＭのジチオスレイトール、５　％　（Ｖ／
Ｖ　）のグリ、セロールおよび２　％　（Ｖ／Ｖ　）の
硫酸ジメチルからなる溶液に対して高度に透析させて脱
塩する。
ｌａｃ　リプレッサー溶出液を、ホスホセルロースのカ
ラムのクロマトグラフィーにかけ、上のリン酸−緩衝液
を使用し、リン酸カッｖｙウメの□６．１２〜０．２４
の直線の勾配を用いることによシ、最終的、に、精製す
る。
ｌａｃ　リプレ、ツサー含有分画の純度は、５ＤＳ−ポ
リアクリル、アミドゲルの電気泳動によシ検査する。ｌ
ａｃ　リプレッサータンパク質の活性を、既知の方法で
オペレーター含有ＤＮＡを結合するその能力によシ測定
する。このタンパク質を使用するまで一８０℃において
貯蔵する。
工程「−検出プローブのｌａｃオペレーターＤＮＡの共
有結合　゛　。
多数のｌａｃ　ＩＪプレツサータンパク質結合部のコピ
ー（ｌａｃオペレーター）およびβ−へモグロービン遺
伝子の部分の両者を有するプラスミドの調ｊ！！！（八
４ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ（ｎｇ、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ　ｅｔａｌ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。
□１９８２参照）。
１、ｐＨＷ１０４は、ｌａｃ　リブＬ／７−９−−結合
部位ヲ含有するｌａｃオペロンの２０３　ｂｐの１（ａ
ｅ旧セゲメントの４−５のコピーを有するｐＢＲ３２２
の誘導体である。このセグメントをＥｃ。
ＲＩ　リンカ−（ｌｉｎｋｅｒ）でティリング（ｔａｉ
ｌｉｎｇ）し、そして直列のコピーをＡｐ　＋Ｃベクト
ルｐＨ’Ｗ　１　（Ｈａｅ　ｎ消化によシ配列２３６〜
２３５２を欠失させて調製されたｐＢＲ３２２の誘導体
）□ にＥＣＯＲｉ　部位においてそう人する。
２、ｐＳＳ７３７は、約０．５ｋｂの遺伝子と約０．２
５ｋｂの上流のフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列
を含有するヒトβ−グロブリン遺伝子の７３７　ｂｐの
Ａｌｎ１セグメントを有するｐＢＲ３２シの誘導体そあ
る。このセグメントをＥＣ０ＲＩ　リンカ−でティリン
グし、ｐＢＲ３２２の？　、　′ Ｅｃｏ　Ｒｉ部位へそう人する。
＋の１ケ士び２におけるように単一のプラスミド中にｌ
ａｃリプレッサー結合部位およびβ−グロブリン遺伝子
を入れる手順は次の通シである：ａ、ｐ’ＨＷ１０４を
Ｈ４ｎｄ　Ｉで直線化し、７／ｌ／カリ性ホスフアター
ゼで処理して、工程Ｃにおける再環化を防止する。
ｂ、Ｉ）ＳＳ７３７をＨｉｎｄＭプラスＦｎｕＤＩ［で
消化し、０．７６ｋｂより大きいセグメントを分取用（
ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）アガロースゲルから集める。
Ｃ８工程ａおよびｂの生成物を結合し、次いでＤＮＡポ
リメラーゼのフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）　断片およヒテ
オキシリボヌクレオチドトリホスフェートを使用して、
遊離Ｈｉｎｄｌ［端を充填する。
ｄ、（ｃ）分子をプラント（ｂｌｕｎｔ）端結合して円
形のプラスミドを作り、次いでＩｉＣ，ｃｏｌｉ　細胞
をアンピシリン抵抗性に形質転換する。
ｅ、ある数のＡｐＲコロ＝−を集め、少量のプラスミド
のミニリゼート（ｍｉｎ　ｉ　１ｙｓａｔｅ　）生産の
ため細胞を生長させる。
工、制限酵素の消化によシブラスミドを組成について検
査する。所望のプラスミドは、グロブリン遺嵌子そり人
体の配向に依存して、次の特性を有する： １、単一の）（ｉｎｄ　Ｍ部位； ｉｉ　、　２．２．０．７４および０．２１ｋｂのＥｃ
ｏ　ＲＩ上セグメント ｉｆｉ、Ｍｓｔｌｌによる消化性； １ｖ、望ましくは約０．７５　ｋｂ　ｃＤＣｌａ　１セ
グメント。
鎌型赤血球の欠失の二重交雑形成分析のための分離およ
び検出プローブは、現在係属中の１９８３年７月５日出
願米国特許出願第５１１，０６３号に詳しく開示されて
いる。
３、多数の１ａｃｌＪブレツサ一結合部のコピーおよび
β−ヘモグロビン部位の部分の両者を有するプラスミド
の交雑形成プローブとしての使用：ＤＮＡ試料中のβ−
グロブリン遺伝子配列の検出のためにこのプラスミドを
有用なプローブとするには、プラスミドのグロブリン遺
伝子部分は一本鎖であシ、これによシ引き続く試験にお
いて、変性されたＤＮＡの試料に対して交雑形成するこ
とができなくてはならず、そしてＩａｃオペレーター区
域は二本鎖であってｌａｃ　リプレッサータンパク質の
結合を許さなくてはならない。
これを達成するために、（２）のプラスミド生成物を）
ｌｆｎｄ　［の使用によシ直線化し、次いでエキソヌク
レアーゼ璽による制限された消化に付す（λエキソヌク
レアーゼまたはＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼを同様
に使用することができる）。このような処理はグロブリ
ン遺伝子部分のほとんどあるいは全部を一本鎖にし、リ
ゾオペレーター区域のコピーを含むプラスミドの残部の
大部分を二本鎖のままに残す。
別法として、ｐＥＭＢＬプラスミドの対（ｌｉ：ｕｒｏ
−ｐｅａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
）（ｅｆｄｅｌｂｅｒｇから入手可能）を使用できる。
これらのプラスミドはＦ、ファージのゲノムの一部分を
含有するので、−末鎖ＤＮＡ分子の生産においてファー
ジＭ１３のように挙動する。しかしながら、Ｍ１３と異
シ、ｐＥＭＢＬ　ゲノムの２１部分を２本の鎖において
単に異なる配向にさせることによシ、ｐ　ＥＭＢ　Ｌ　
を使用してプラスミドの両者の相補的鎖を純粋な形で集
めることができる。
プラスミドＤＮＡの２本の鎖のいずれを感染したバクテ
リアから一本鎖のＤＮＡファージとして選択するかを決
定するのは、プラスミド中のＦヨ遺伝子の配向である。
・　例えば、１つのプラスミド、ｐＥＭＢＬ８（＋）を
工作してυ１ｃｌＪプレツサー結合部位の直線のコピー
とβ−ヘモグロビン遺伝子の部分とを含有するようにさ
せる；他のプラスミド、ｐＥＭＢＬ８（−）は、ｌａｃ
　リプレッサー結合部位の直線のコピーだけを含有する
。ｐＥＭＢＬ　８←）の−末鎖ＤＮＡを未知のＤＮＡの
試料に対して交雑形成し、そしてプ四−プのグロブリン
遺伝子部分と試料中の相補的配列との間の配列の相同性
によ）接触を行う。プローブのｌａｃオペレータ一部分
は、ｐＥＭＢＬ８（−）をＰＥＭＢＬ８（＋）−試料Ｄ
ＮＡ複合体にアニーリングすることによシ、υ駐結合に
ついて二本鎖とする。
このような反応はＭ１３の複＃！（シかし一本鎖のファ
ージ）型ならびに任意のプラスミドＤＮＡを用いて実施
することが可能であるが、相補的鎖を分離しなくてはな
らないか、あるいはそれらが望ましくないほどに自己ア
ニーリング性でありうる、交雑形成混合物中にプラスミ
ドの鎖を存在させることによシ、交雑形成の効率はかな
シ低下する。
織材は フルオレセインインチオシアネート（ＦＩＴＣ）をエタ
ノール中に溶かす（５ηの固体／―）。（１）からの５
キ／−１のタンパク質溶液の２ｍｌに、０．５ｍの炭酸
塩緩衝液（１モルのＮａＨＣＯ，−Ｎａ、　Ｃｏ。
の緩衝液、Ｉ）Ｈ９）を加え、次いで５０μｔのＦＩＴ
Ｃ溶液を加える。この混合物をよく振シ、遊離のＦＩＴ
Ｃをクロマトグラフィーによシセファデツクス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ）　Ｇ　５０カラム上に結合した分子から１
０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ。
５０ｍＭのＫＣＩからなる緩衝液、ｐ）１７．４で分離
する。標識付けされたタンパク質を空隙体積中に集める
。
■からの１ａｃｌＪプレツサータンパク質およびβ−ガ
ラクトシダーゼ（１：１モル比）（アルカリ性ホスファ
ターゼ、ワサビのペルオキシダーゼは同様に反応する）
をリン酸塩緩衝液中で混合し、そしてゲルタロアルデヒ
ドを最終濃度０．２％に加える。反応を４時間進行させ
る。仁のタンパク質混合物を（ａ）におけるのと同一の
’ｌ’ｒｉｓＥＤＴＡ緩衝液に対して透析する。　・ 識による検出 分離プローブを固体の支持体へ固定する丸め、それを０
．１ＭのＮａＯＨで５分間処理し、次いで氷、中で冷却
する。試料を等容量の０．ＩＮのＨＣＩ、！０．９　Ｍ
ＯＮａＣｌ　、　０．０９モルのクエン酸ナト、リウム
で中和し、次いで０．９ＭのＮａ０１％０．０９モルの
クエン酸ナトリウム（６ＸＳＳＣ，Ｉ　Ｘ標準塩水（ｓ
ａｌｉｎｅ）　クエン酸塩＝０．１５ＭのＮａＣ１％０
．０１５Ｍのクエン酸ナトリ１．ウム）中で前もって・
　ソーキングしであるニトロセ次ロースフィルター（例
えば、５ａｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｅｌからのＢ
ｉ１２）に通しておだやかな吸引のもとにＦ遇する。次
いでフィルターを６ＸＳ８Ｃで、次いで７０チのエタノ
ールで洗浄し、８０℃において数時間真空下にベーキン
グするか、あるいは真空を用いないで６５℃に訃いて一
夜ベーΦノグする。
この時点において、フィルターは交雑形成手順に使用で
きる状態にあるが、それを乾燥状態で多数刃にわたって
貯蔵することができる。
分離プローブをアルカリ処理する目的は、ＤＮＡを変性
することである。これによｊｊ）ＤＮＡは、ニトロセル
ロースへ結合できるようになる（自然ＤＮＡは結合する
ことができない）と同時に他の一本鎖ＤＮＡと引き続い
て交雑形成することができるようになる。変性されたＤ
ＮＡを酸で中和しかつ塩（６ＸＳＳＣとして）を添加す
ると、変性されたＤＮＡのニトロセルロースの結合が促
進され、そして低温は分離プローブがニトロセルロース
上へ装入される間、の分離プローブの再アニーリングを
阻止する。フィルターの）÷ング（ｂａｋ　ｉｎｇ）は
ＤＮＡを最終的に固定化する０ 交雑形成は、検出プローブとして、ｌａｃ　リプレッサ
ータンパク質結合部位である非相同ＤＮＡを有するＨに
おいて製造されたプローブを用いて実施する。
交雑形成手順は一本鎖ＤＮＡを含むので、分離プローブ
が固定化されるニトロセルロースのフィルターは予備処
理して、未知のＤＮＡおよび検出プローブが区別不可能
にそれへ結合しないようにしなくてはならない。このよ
うな処理は、通常、ある塩および緩衝液（例えば、６Ｘ
ＳＳＣ，０，１Ｍの’ｌ’ｒｉｓ、　ｐＨ８）に加えて
、水中の０．２％のウシ血清アルブミン、Ｆｉｃｏｌｌ
およびポリビニルピロリドンからなる混合物（１）ｅｎ
ｈａｒｄｔの溶液として知られている）中でタンノ（り
質および多糖類で飽和することを含み、フィルターを交
雑形成に用いる温度（例えば、６５℃）において数時間
ソーキングする。次いで、予備ノーキング溶液を、変性
試料（未知）のＤＮＡおよび変性検出プローブを含む交
雑形成培地と置換し、そしてＤＮＡのアニーリングを数
時間進行させる。２つの代表的な交雑形成条件は、次の
通シである：　（１）Ｅ　Ｘ　ＳＳＣ。
０、１　Ｍの’ｌ’ｒｉｓ、　ｐｌ）（ｓ、６５℃、Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔの溶液の添加は任意である；　（Ｉｔ）
４　Ｘ　ＳＳＣ，４０チのホルムアルデヒド、４０℃、
＋　／−Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液。
液体の必要体積を最小とするために、かつ蒸発を防正す
るために、交雑は平らに圧縮されかつ密封されたプラス
チックの袋中でしばしば実施される。
交雑形成後、固体の支持体を実姉例１の工程ａ（ａ）に
おけるように１％（Ｗ／Ｖ）の’ｐｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩
衝液中のＢＳＡ溶液で洗浄し、次いで工程（１）（ａ）
、ω）または（ｅ）におけるように標織材したｌａｃリ
プレッサーを加える。結合したリプレッサーを光学的に
（螢光標識リプレッサーの試料において）あるいは酵素
的に（酵素標識リプレッサーの試料において）アッセイ
する。
実施例２ １ａｃリプレツサータンパク質を支持する実施例１の交
雑形成した試料は、次のようにして免疫化学的にアッセ
イすることができる： ａ）　実施例１からの精製したｌａｃ　リプレッサータ
ンパク質を、７０インド（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュ
バントと１＝１で混合し、マウス（後足および足裏に２
５μ２のタンパク質）またはウサギ（皮下に５００μｆ
）に注射する。１月後、ポリクロナル抗体の応答を測定
し、そして強い応答を示す動物からの抗愈清を集め、免
疫アッセイに使用する。
ｂ）　実施例１のリリリブレッサータンパク質を含有す
る雑種複合体（ｈｙｂｒｉｄ　ｃｏｒｎｐｌｅｘ）に、
（ａ）の抗血清の特異的希釈物を室温において１時間イ
ンキュベーションする。結合しない抗体を、５ｍＭのＮ
　ａ　Ｈｔ　Ｐ　Ｏａ、１５ｍＭのＮａＣ１（ｐＨ７，
４）および０．０４％の’ｐｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００か
らなる緩衝溶液で３回洗浄する。ＰＨ８中でｉ：ｓｏｏ
。
に希釈したワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）のペルオ
キシダーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｃａｌ　Ｃｏ、　ｐ
８６５１　）へ共有結合したタンパク質Ａを、実施例１
の雑種複合体とともに３０分間室温においてインキュベ
ーションし、前述の緩衝液で３回洗浄した。Ｈ２Ｏ。
を含有するクエン酸緩衝液ｐＨ５，６、中の基質のＯ−
フ二二レンジアミンを加え、そして酵素反応生成物を４
９　’；ｌ　ｎｍにおいて測定する。結合したリプレッ
サーの量を、積重の定量曲線との比較により決定する。
実施例２Ａ ５０〜のＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを２ｄ
のジメチルスルホキシド中に溶かす（溶液Ａ）。１０〜
の４′−アミノメチルトリオキサレン（または他のアミ
ノアルキル化合物）を１０−の水性緩衝液（例えば、１
０ｍＭのナトリウムテトラボレート、ＨＣｌでｐＨを調
節）、ｐＨ約８中に溶かす（溶液１３）。、溶液（Ａ）
および（Ｂ）を１：１０の容量比および１０：１の重量
比で混合し、これによシ活性化されたハプテンが大過剰
量で存在するようにする。反応を３５℃において１時間
進行させる。反応の程度を薄層クロマトグラフィー（シ
リカゲル板、螢光指示薬を含む、１／１／８のメタノー
ル／酢酸／クロロホルムの溶媒）により監視する。これ
らのＴＬＣ条件下に、反応しないアミンメチルトリオキ
サレンは溶媒とともに動くが、これに対して生成物はよ
シ祁い移動度を有する。ビオチンは螢光を示さないが、
付加物はトリオキサレンのために螢光を発する。新しい
螢光のスポットの生長およびもとの螢光のスポットの消
失は、生成物の形成の程度を示す。活性化されたビオチ
ンは大過剰量で存在するので、反応の完結後、出発物質
に対応する螢光がＴＬＣ上で消失する。過剰の活性ビオ
チンはクリシル−グリシンまたはリジンと反応する。ア
ミノ酸ビオチン生成物の存在は、プソランービオチン化
合物とＤＮＡとの光化学反応を妨害しない。それゆえ、
上の反応後の精製工程は必須ではない。
実施例３ 実施例１の検出プローブの二本鎖部分は、次のよう（し
て特異性抗体を結合するように修飾する９とができる： 検出プローブを１０ｍＭのトリス−１ｍＭＱＥＤＴＡｉ
ｌ衝液中に溶解し、そして実施例２人に記載するような
ビオチンープンラレン付加物と混合する。この混合物を
３６０　ｎｍの光で室温において４０分間照射する。反
応後、試料を実施例１の交雑形成緩衝液に対して透析し
て、未反応のビオチンープソラレン付加物を排除する。
次いで、ビオチン含有検出プローブを工程Ｎにおけるよ
うに交雑形成させ、゛そして雑種をＦＩＴＣ標識アビジ
ンを用いる既知の方法でビオチンの存在についてアッセ
イする。　・ 共有結合したエチジウム−ＤＮＡ複合体を、次のように
して調製する：約２５０ｑのサケ精子ＤＮＡ　（Ｓｉｇ
ｍａ　（：ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕ
ｉｓ。
ＭＯ）を４０１１１の５０　ｎＭのＺｎＣ１ｔ中に溶か
し１．２５ゲージの對を５回通過させることによシ剪断
する。剪断したＤＮＡを２５０−容のフラスコへ入れ、
追加の１６・Ｑｄの緩衝液で希釈する。１４５ミクロリ
ツトル（１４５μｔ）のＳｌ−ヌクレアーゼ、２００．
０００単位／’ｌｊ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｐ　−Ｌ
　Ｂｉｏｃｈｅ　ｍ　１ｃａｌｓ、　ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ、　ＮＪ　）を加え、この混合物を３７℃疼おいて
５０分間インキュベーションする。
次いで、この反応混合物をフェノール：クロロホルムで
２回、クロロホルムで１回抽出し、そしてＤＮＡをエタ
ノールで２回沈殿させ＋（Ｍａｎ　ｉ　−ａｔｉｓ　ｅ
ｔ　ａｌ　（１９８２）−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、ＣＣ１
ｏ−ｎ１ｎ”、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）ｏ最終の沈殿を７０＋ｊの２
０ｍＭの’ｌ’ｒｉｓ塩酸塩緩衝液、ｐＨ１８，０中に
溶解する。　。
このＤＮＡを８−アジドエチジウムと次の条件゛　下に
反応させる。反応混合物は３３＠ｔｆ）２．．７＋ｑの
ＤＮＡ／ｄ％１１５７の４．９５　ｍＭの８−、アジド
エチジウム、１３．５１Ｖｇの０．２　ＭＯＴｒ　ｉ　
ｓ−塩酸塩緩衝液、ｐ　Ｈ８，０，２ＭのＮａＣ１およ
び７６ｍの水から調製する。この混合物を２・２℃に維
持した水ジャケット付きの２５０ゴ容のビーカーへ入れ
る。この混合物をかきまぜ、１５０ワツトのスポットラ
イトで１０ｃＩｎの距離において６０分間照明する。こ
の光分解を同一反応混合物を用゛いて反復する。
光分解反応混合物を合わせ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸
塩緩衝液、ｐＨ８，０，０，２ＭのＮａＣ１で飽和しｆ
ｃｎ−ブタノールの各同等体積で１０回抽出する。抽出
されたＤＮＡ溶液を、２３ｄの４．９５ｍＭの８−アジ
ドエチジウムおよび７７ｒｎｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ−
塩酸塩緩衝液、ｐＨ８，０，０，２ＭのＮａＣ１と一緒
にする。この溶液を水ジャケット付きビーカー中でかき
まぜ、９０分間光分解する。
反応生成物を前述のように緩衝液飽和ブタノ−ルで１０
回抽出し、そしてＤＮＡをエタノールで沈殿させる。沈
殿を１０ｍＭの’ｐｒｉｓ−塩酸塩緩衝液、ｐＨ８，０
，１ｍＭのＥＤＴＡ中に溶解し、２６０　ｎｍおよび４
９　Ｈｍにおける吸収を記録する。上の実施例ＩＡに記
載するようにして行った計算は、１エチジウム残留物が
４．５ＤＮＡ塩基対につき組み込まれていることを示す
。
メチル化チログロブリンは次のようにして調製する：１
００ｍ１のウシのテログロブリン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を
１０ゴの無水メタノールおよび４００μｔの２．５５Ｍ
のＨＣＩメタノール溶液と一緒にする。　この混合物を
ロータリーミキサー内で室温において５日間かきまぜる
。沈殿を遠心により集め、メタノールで２回、エタノー
ルで２回洗浄する。次いで、それを−夜真空乾燥する。
約８２■の乾燥粉末が得られる。
共有結合エチジウム−ＤＮＡに対する抗血清を酵素標識
免疫吸着アッセイによシカ価決定する。
ポリヌクレオチドをポリスチレン微小力価板（ｍｉｃｒ
ｏｔｉｔａ　ｐｌａｔｅ）の壁土へ吸着させ、次いでウ
サギ抗体を結合させる。最後に、抗体をペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ　で検出する。
５μｆ／ｍｌのポリヌクレオチドを１５ｍＭのクエン酸
ナトリウム、ｐＨ７，０，０，１５ＭのＮａＣ１中に含
有する溶液の５０μｔのアリコートをイムｏ　ン（ｉｍ
ｍｕｌｏｎ）　ｌ徽小力価板（］）ｙｎａｔｅｋ。
Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ　）の壁中へ分散させ、
室温においておだやかに振とりする。次いで、壁を空に
し、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４，
０，１５ＭのＮａＣ１，０，５％のウシ血清アルブミン
および０．５係のＴｗｅｅｎ２０　（ＰＢＳ／ＢＳ　Ａ
　／　Ｔｗｅ・・■）で洗浄する。
ウサギ抗血清を１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７，
４，０，１５ＭのＮａＣ１，０，５％のＢＳＡ中に希釈
し、５０μｔのアリコートを壁に加え、３０分間静置す
る。壁をＰ　Ｂ　Ｓ　／　Ｂ　Ｓ　Ａ　７１”ｗｅＪで
３回洗浄する。ヤギ抗つサギエｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｏｃｈｒａｎｖｊｌｌ
ｅ、　ＰＡ）へ共有結合したペルオキシダーゼを１０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４，０，１５Ｍ（７）
ＮａＣＩＸＯ，５チのＢＳＡ中で５００倍に希釈し、５
０μｔのアリコートを６壁へ加える。この溶液を壁中に
おいて室温で３０分間静置し、次いでＰＢＳ／ＢＳＡ／
Ｔｗｅｅｎ■ア、工やオ、。
１００μＭの臭化エチジウムを、共有結合していないエ
チジウム−ＤＮＡ複合体を含有するウェル（ｗｅｌｌ）
およびエチジウム対照のウェルの希釈した抗血清中に含
める。すべての洗浄溶液およびこれらのウェルを処理す
るための前述の試薬は、１００μＭのエチジウムを含有
する。
ペルオキシダーゼ基質溶液は次の成分を用いて調製する
： ２０１１９のＯ−フェニレンジアミン ５１１９の０．５ＭのＮａＨＰＯ４ １２７の０．１Ｍのクエン酸ナトリウム１３ａｊの水 ２０μの３０俤の過酸化水素 ７５μｔ（７５微小力価）の基質溶液をく埋みにつき加
え、室温において１０分間反応させる。
反応を５０μｔの２．５Ｍの硫酸の添加によシ停止させ
る。次いで、４８８ｎｍにおける吸収をアーチツク（Ａ
ｒｔｅｋ）　２１０型ミクロリツトル板のフォトメータ
ー（Ｄｙｎａｔｅｋ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、ＶＡ）で
記載する。
正常のウサギ血清を対照として使用し、そしてウサギ抗
血清について説明したようにして処理する０ 結果を表Ａに記載する。結果から明らかなように、対照
のウサギ血清中の抗体は被覆したウェルまたは被覆しな
いウェルのいずれに対しても有意なレベルで結合しない
。それは−末鎖に対して弱い抗体力価を有するであろう
。
共有結合したエチジウム−ＤＮＡに対する抗血清は、共
有結合したエチジウム−ＤＮＡに対して非常に高い力価
を有する。これらの抗体の一部分は、リン酸塩リポース
鎖へ共有結合したエチジウムへ多分結合しているであろ
う。この結論は、共有結合していないエチジウム−ＤＮ
Ａ複合体に対する力価が非常に低いという観察に基づく
（表Ａ参照）。
これらの結果が明らかに示すように、抗体は自然−末鎖
または二本鎖の核酸と有意に交差反応しないエチジウム
−ＤＮＡ挿入挿入複合体イレイズａｉｓｅ）されうる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の方法の概略フローシートである。 特許出願人　モレキュラー・ダイアグノスティックス・
インコーボレーテッ ド 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号優先権主
張　０１９８力目０月１９日［相］米国（Ｕ　Ｓ）０６
６２８５８０発　明　者　ウィリアム・ジエイ・　アメ
リカ合衆国ノウルズ　フグジャ４フフ ０発　明　者　ドナルド・エム・クロ　アメリカ合衆国
ザーズ　レイドライブ コネチカット州０６５１８／１ムデン・スリーピトドラ
イブ　１０１

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ｌ、非交雑形成性の一本鎖または二本鎖の核酸部分と結
    合した核酸の交雑形成性の一木鎖部分からなり、非交雑
    形成性部分が特定のタンパク質による結合のための認識
    部位を含むことを特徴とする核酸検出プローブ。 ２、交雑形成性部分が非交雑形成性部分の鎖の１つと連
    続していることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の検出プローブ。 ３、非交雑形成性部分がラクトースリプレッサー、ガラ
    クト−スリプレッサー、ラムダリプレッサー、カタボラ
    イト遺伝子活性化タンパク質およびＣｒｏタンパク質か
    ら成る群より選択されるタンパク質のための認識部位を
    含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の検出
    プローブ。 ４、非交雑形成性部分が独特の抗原性決定因子を非交雑
    形成性部分に導入する修飾化合物との接触または反応に
    よりタンパク質の認識部位をつくるように修飾されてお
    り、修飾化合物は好ましくは挿入剤、白金含有配位子ま
    たは塩であることを特徴とする特許請求の範囲第１〜３
    項のいずれかに記載の検出プローブ。 ５、非交雑形成性部分のタンパク質特異性部位へ結合し
    た特定のタンパク質を含み、前記タンパク質は好ましく
    は酵素的に活性な基、蛍光発生体、発色団、冷光発生体
    、特異的に結合性の配位子、または放射性同位元素から
    選択される標識を有することを特徴とする特許請求の範
    囲第１〜４項のいずれかに記載の検出プローブ。 ６、前記タンパク質は抗体またはその断片であることを
    特徴とする特許請求の範囲第５項記載の検出プローブ。 ７、工程： ａ）　試験媒質を核酸検出プローブと、検出すべき配列
    とプローブ中の相補的な交雑形成性配列どの間の交雑形
    成に好都合な条件下で一緒にし、その際前記核酸検出プ
    ローブは検出すべき配列に対して実質的に相補的である
    少なくとも１つの交雑性の一本鎖塩基配列と、特定のタ
    ンパク質による結合のための認識部位を有する非交雑性
    の二本鎖部分とからなり、 ｂ）　交雑形成したプローブを交雑していないプローブ
    から分離し、そして Ｃ）　分離した交雑形成したプローブに、プローブの非
    交雑形成性部分上の認識部位と結合する特定のタンパク
    質を添加し、そして固体の支持体へ結合するようになる
    タンパク質を決定する、 からなることを特徴とする一本鎖の核酸を含有する試験
    媒質中の特定のポリヌクレオチド配列の検出方法。 ８、試験媒質からの一本鎖核酸を固体の支持体上に固定
    し、そして固体の支持体と会合するタンパク質を決定す
    る固相交雑形成技術であるか、あるいは試験媒質を第１
    および第２の核酸プローブと一緒にし、各プローブは検
    出すべき配列の相互に排他的な部分に対して実質的に相
    補的である少なくとも１つの交雑性の一本鎖塩基配列か
    らなり、そしてプローブの一方が固体の支持体−Ｌに固
    定され、かつ他方が前記タンパク質認識部位を有する前
    記非交雑形成性部分を有する固相サンドイッチ交雑形成
    技術である特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、ａ）特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の
    核酸検出プローブ、および ｂ）検出プローブ上の前記認識部位へ結合することがで
    きる、好ましくは標識を有する前記特定のタンパク質、 からなることを特徴とする試験媒質中の特定のポリヌク
    レオチド配列を検出するための試薬系。 ｌＯ、タンパク質が抗体′ま・たはその断片であり、酵
    素的に活性な基、蛍光発生体、発色団、冷光発生体、特
    異的に結合性の配位子、または放射性同位元素で標識付
    けされていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載・の試薬系。 １１、二本鎖核酸とあ□る核酸との間で形成された挿入
    複合体と結合することができ、そして好ましくは一本鎖
    核酸と実質的に結合することができない抗体、またはそ
    の断片、′□ １２、検出可能な基、例えば、酵素的に活性な基、蛍光
    発生体、発色団、冷光発生体、特異的に結・合性の配位
    子、または□放射□性同位元素で標識付けされているこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の抗体また
    はその断片。
JP59260990A 1983-12-12 1984-12-12 核酸プローブ、ポリヌクレオチド配列およびその抗体を検出するための試験方法および試薬系 Pending JPS60144662A (ja)

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