JP2613203B2 - ポリヌクレオチド配列の検出のための溶液相単一交雑アツセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、試験試料中の特定の核酸の存在を決定する
試験を実施する新規な方法およびそのために有用な新規
なプローブに関する。

交雑（hybridization）のための２つの重複しないDNA
プローブの応用は、PCT特許出願第83/01459号、欧州特
許出願第0070687号同第0070685号に開示された。欧州特
許出願第0070687号同第0070685号は、試験試料中の特定
のポリヌクレオチド配列の検出のために２つの重複しな
い交雑プローブを使用することを開示している。プロー
ブの一方は交雑前に固体の支持体に固定される。この方
法は交雑前の核酸の電気泳動分離の問題を解決するが、
この方法は不均質相を利用するために遅い。

欧州特許出願第0070685号は、非反応性転移法を使用
する均質相の２つのプローブのアッセイを開示してい
る。この方法は交雑を監視するために複雑な装置を必要
とする。多少非特異性のブラウン運動のために、そして
溶液中に存在する使用結合しないプローブが交雑したプ
ローブに比較して常に非常に高いために、バックグラウ
ンドを排除することができない。

一方が固定化されている、２つのプローブを含む不均
質系は、1986年１月21日に提出された現在係属中の米国
特許出願第815,694号、およびランキ（Ranki）ら、遺伝
子（Gene）、21、77−85に記載されている。プローブは
DNA、RNA、混合核酸またはオリゴヌクレオチドであるこ
とができる。例えば、試料を２つのプローブと接触させ
ることにより、特定の核酸配列、例えば、鎌型赤血球貧
血を示す配列について試験することは開示されている。
本発明プローブは、そうでなければ分離プローブと識別
され、支持体、例えば、ニトロセルロース上に固定化さ
れる。他方のプローブは、検出プローブとして識別さ
れ、究極のアッセイための標識を有する。両者のプロー
ブは、異なる核酸断片を含み、両者は、存在する場合、
試験試料中の試験配列の異なる部分に対して相補的であ
る。試料およびプローブを混合し、交雑条件に暴露し、
そして、試料が正確な配列を含有する場合、その核酸は
２つのプローブの間の架橋として働くである。これによ
り、標識されたプローブの標識は固体の支持体に取り付
けられるようになる。この支持体を取り出し、次いで標
識の存在について「読み取る」。

プローブは、固体の支持体上の標識は検出すべき条件
に関して陽性または陰性を示すようなものであることが
できる。鎌型赤血球貧血に加えて、他の遺伝的状態、例
えば、サラセミア、テイザックスなどについてであるこ
とができる。同一の手順を、また、試験試料中のバクテ
リアまたはウイルスの検出のために用いることができ
る。

このような方法は満足すべき結果を生成するが、前述
の均質な２つのプローブのアッセイを実施するという欠
点なしに、診断法を加速することが望まれた。

２つのプローブを含む均質系は欧州特許出願公告第01
92168号に記載された。この方法は２つの重複しないプ
ローブを使用し、それらの一方は検出のために標識され
ており、他方は雑種の分離のためのものである。このア
ッセイは均質溶液中で実施し、そして雑種は引続いて固
体の支持体および分離プローブとの固定化反応によって
分離される。

オーストラリア特許出願40,310/85号は、プローブを
標識するためのアジド基の使用に関する。このオースト
ラリア特許明細書は単一のアッセイに含まれる２つのプ
ローブの使用に関する。

本発明の目的は、１つのみのプローブを使用すること
によって、特定の核酸配列についてのアッセイを急速に
実施することである。

本発明の他の目的は、純粋なプローブおよび試料を必
要としないで、アッセイを実施することである。

これらの目的および他の目的および利点は、本発明に
従い実現され、本発明によれば雑種分離系（hybrid se
paration SYSTem）を結合した均質交雑法（homogeneou
s hybridization）が提供される。この手順は交雑を急
速に起させ、そして雑種を溶液から選択的に分離するこ
とによってバックグラウンドの問題を排除する。この方
法は後交雑（post hybridization）生成物をアッセイ
するために、普通の実験室の装置のみを必要とするだけ
である。

診断法は均質に、すなわち、溶液中で実施する。その
上、交雑の方法の効率は不均質系におけるよりも溶液中
において高い。

上の事実は、工程： （ａ）試験試料中の核酸を、核酸の交雑可能性を支持す
る方法で、化学的に変性して、標識または反応性部位を
導入し、 （ｂ）交雑条件下に、化学的に変性した試料の核酸を交
雑可能な核酸プローブと接触させ、前記プローブは、試
料の標識を導入するように核酸が変性されたとき、反応
性部位を有するか、あるいは試料の核酸が反応性部位を
導入するように変性されたとき、標識され、 （ｃ）工程（ｂ）から得られる溶液を反応性部位に対し
て固定化された形態（immoblized form）の反応相手と
接触させて、それぞれ、試料の核酸上の反応性部位また
はプローブと安定な結合を形成し、 （ｄ）得られる固定化された分画（fraction）を残留す
る溶液から分離し、そして （ｅ）分離した固定化された分画中の標識の存在または
残留する溶液中の標識の減少を決定する、 を含んでなることを特徴とする試験試料中の特定の核酸
配列の存在を決定する方法によって達成される。

この化学的変性は、標識または反応性部位を含む光化
学的に反応性の試薬（例えば、核酸結合配位子）との反
応におよって達成することができる。

プローブの濃度は好ましくは試料より大きい。例え
ば、プローブは反応を前進させるために試料より少なく
とも1,000倍だけ過剰でることができる。

好ましくは、プローブ中の反応性基（反応性部位）は
結合部位、例えば、ビオチン（biotin）またはハプテン
の部分であり、これらの結合部位は反応相手の役目をす
る結合物質、例えば、アビジンまたはアビジン誘導体と
特異的な非共有結合を行うことができる。

固定化された形態中の反応性基は、固体の支持体、例
えば、セファデックス（Sephadex）ゲル、アガロース、
ニトロセルローシ紙およびプラスチックに取り付けられ
るようなものである。

試料またはプローブの標識付けは、放射性、蛍光性、
酵素性（enzymatic）などであることのできる検出可能
な化学的基の使用によって達成することができる。好ま
しくは、標識のためあるいは基質反応性基の導入のため
の、試料の核酸の化学的な変性は光化学的手段によって
達成される。

プローブを試験試料と希薄水溶液中で一緒にする。イ
オン強度、pHおよび温度の適当な条件を利用することに
より、適切な成分が存在する場合、交雑は非常に急速に
起こるであろう。次いで、固定化された反応性基を導入
しおよび、反応性基と標識試料とを相互反応させるため
の適切な時間が経過した後、固定性の相または分画を取
り出し、洗浄し、そして欧州特許出願公告第0130515号
に記載されるように、アッセイを実施する。

プローブは、検出すべき配列に対して実質的に相補的
であるかあるいはそれと相同（homologous）である少な
くとも１つの一本鎖塩基配列を含むであろう。しかしな
がら、このような塩基配列は単一の連続的ポリヌクレオ
チドセグメントである必要はないが、相同ではない配列
によって中断された２またはそれ以上の個々のセグメン
トから構成することができる。さらに、プローブの相同
区域は３′−および５′−末端において非相同配列、例
えば、増殖のために相同配列が挿入されたベクターのDN
AまたはRNAからなるものによってフランキング（flanki
ng）されていることができる。いずれの場合において
も、分析用試薬として提供されたプローブは１または２
以上の点において問題の試料の核酸と検出可能な交雑を
示すであろう。直線または円形の一本鎖ポリヌクレオチ
ドをプローブの要素として使用することができ、その主
要部分または小部分は相補的なポリヌクレオチドの１ま
たは２以上の鎖の二重らせんをもち、ただし重要な相同
の１または２以上のセグメントは一本鎖の形態であり、
そして試料のDNAまたはRNAとの交雑に利用できる。プロ
ーブはDNAまたはRNAを含むことができ、そして50〜数K
b、例えば、10K塩基の範囲の任意の便利なあるいは所望
の長さをもつことができ、そして約４〜50塩基のオリゴ
ヌクレオチドを包含する。特定のアッセイのために適当
なプローブの調製は、この分野においてよく知られてい
る。

場合に応じて、プローブまたは試料の核酸中の支持体
反応性基および固定相上の対応する反応相手を、ここで
「反応性部位／反応相手の対」と呼ぶ。

本質的に任意の対の物質をこの反応性部位／反応相手
の対の機能のために使用することができ、この対は相互
作用のために適切な親和性を示して安定な結合、すなわ
ち、引続くアッセイの工程、主として分離および検出の
工程の間に実質的に無傷にとどまる２つの間の結合を形
成する。形成される結合は共有結合または非共有結合の
相互作用であることができ、ことに選択性または特異性
の程度によって特徴づけられるとき、後者は好ましい。
このような好ましい結合の形成の場合において、反応性
部位は結合部位と呼び、そして反応性基は結合物質と呼
び、この物質とそれは共有結合、非共有結合、普通に特
異的な結合（bondまたはlinkage）を形成する。

このような好ましい実施態様において、結合部位はプ
ローブの一本鎖の交雑可能な部分中にまたは一本鎖もし
くは二本鎖の交雑可能な部分中に存在することができる
か、あるいはプローブまたは試料の核酸の化学的な変性
の結果として存在することができる。ヌクレオチド配列
中に存在する結合部位の例は、プローブがプロモーター
蛋白質（例えば、バクテリオファージのプロモーター、
RNAのプロモーター）によって結合可能なプロモーター
配列（例えば、lac−プロモーター、trp−プロモータ
ー）からなるか、あるいはリプレッサー蛋白質（例え
ば、lacリプレッサー）により結合可能なオペレーター
配列（例えば、lacオペレーター）からなるか、あるい
は特異的抗体によって結合可能な稀な抗原性ヌクレオチ
ドまたは配列（例えば、５−ブロモまたは５−ヨードデ
オキシウリジン、Ｚ−DNA）からなる場合である（英国
特許明細書2,125,964号も参照）。プローブまたは試料
のポリヌクレオチドの化学的な変性によって導入される
結合部位は、とくに有用であり、そして通常特異的結合
対の１つの構成員をプローブまたは試料の核酸に結合す
ることを含む。選択ために有用な結合対は、ビオイチン
／アビジン（卵白アビジンおよびストレプトアビジンを
包含する）、ハプテンおよび抗原／抗体、炭水化物／レ
クチン、酵素／阻害剤などを包含する。結合対が蛋白質
の構成員および蛋白質以外の構成員から成る場合、蛋白
質以外の構成員をプローブまたは試料の核酸へ結合する
ことが通常好ましい。なぜなら、蛋白質の構成員は交雑
の変性条件下に不安定であることがあるからである。好
ましい系はプローブまたは試料の核酸をビオチンまたは
ハプテンと結合し、そしてそれぞれ固定化したアビジン
または抗ハプテン抗体試薬を使用することを含む。

抗体試薬は、ハプテンまたは抗原で変性したプローブ
または試料の核酸を固定化するための手段として、前述
のように本発明において使用することができる。ここで
使用するとき、抗体試薬は抗体結合活性を有する免疫学
的に誘導された結合物質を呼び、そして普通のポリクロ
ーナルまたはモノクローナル変種の全抗体またはその断
片、またはそれらの凝集体または接合体であることがで
きる。全抗体の形態にあるとき、それは既知の免疫グロ
ブリン、例えば、IgG、IgMなどのクラスおよびサブクラ
スに属することができる。結合部位または含まれるプロ
ーブに対する特異的結合親和性を保持する、任意のこの
ような抗体の断片、例えば、IgGの断片、従来Fab、Ｆ
（ab′）およびＦ（ab′）_２として知られている断片を
使用することができる。さらに、免疫グロブリンまたは
それらの断片の凝集体、ポリマー、誘導体および接合体
を、適当ならば、使用することができる。抗体試薬のた
めの免疫グロブリン減は、任意の利用可能な方法、例え
ば、普通の抗血清およびモノクローナル技術において得
ることができる。抗血清は動物、例えば、マウス、ウサ
ギ、モルモットまたはヤギを適当な免疫原で免疫化を含
むよく確立された技術によって得ることができる。免疫
グロブリンは、また、体細胞の交雑技術によって得るこ
とができ、ここで普通にモノクローナル抗体と呼ばれる
ものが得られ、また適当な免疫原の使用を含む。

核酸の試料またはプローブは、次の反応性残基を有す
るように変性することができる： −NH₂、 −SH、 −COOH、 −OH。

これは既知の方法で達成することができる。５−アリ
ルアミノUTPまたは８−ヘキシルアミノATPおよび末端デ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TDT）を使
用して、−NH₂残基を核酸の試料またはプローブの３′
末端に導入することができる。４−チオUTPまたは５−
カルボキシメチルUTPおよびTdTを使用して、−SHおよび
−COOHを導入することができる。変性された塩基は、ま
た、ニック翻訳により導入することができる。あるい
は、配位子を核酸に共有結合することができる。配位子
は反応の部位であることができる。例えば、−NH₂をも
つプソラレン、アンゲリシンまたはアジドエチジウムを
核酸の試料またはプローブへ光化学的に共有結合させ、
次いで配位子中の反応性部位を介して変性することがで
きる。制限酵素で消化した断片は、通常、５′−ホスホ
リル化末端を生成する。カルボニル残基は、末端リボー
ス残基の酸化により生成することができる（TdT反応に
より導入することができる）。すべてのこれらの部位は
核酸の試料またはプローブにつき１つまたは多数の単位
で存在することができる。いったんこれらの残基が利用
可能となると、既知の反応を用いて、これらの残基と固
定化媒体、例えば、次の残基を有する支持体、例えば、 −OH残基を有する固体の粒状支持体、 SH−固体の支持体、または OHC−固体の支持体、 との間に基有結合、例えば、 次の基を形成することができる： −Ｓ−Ｓ−、 −Ｓ−Ｃ−、 すべてのこれらの活性化された固体の支持体は、既知
の反応によって作ることができる。

反応相手は本発明のアッセイにおいて固定化された形
態で使用し、この固定化された形態は、反応相手および
交雑および／または核酸試料またはプローブとの結合の
形成によって反応相手と会合するようになった反応混合
物の成分を、引続いて保留する混合物から、例えば、遠
心、濾過、クロマトグラフィーまたはデカンテーション
によって単離または分離することができるようにする。
固定化された反応相手の種々の組成および形状は、こう
して明らかであり、およびこの分野の研究者に入手可能
である。

反応相手が共有結合または非共有結合により取り付け
られるかあるいは固定される固体の支持体を使用するこ
とが特に好ましく、非共有結合は適当に安定な強い取り
付けを提供する吸着法を包含する。固体の支持体は種々
の形状および組成を取ることができ、それらの例は球形
粒子、ビーズ、多孔質および不透過性のストリップおよ
び膜、反応器、例えば、試験管の内表面およびマイクロ
タイタープレートなどである。所望の反応相手を選択し
た固体の支持体へ取り付けるための手段は、この分野に
おいてよく知られている。

例えば、反応相手が蛋白質物質、例えば、アビジン、
抗体試薬、または他の結合蛋白質をプローブまたは試料
の核酸上の結合部位のための結合物質として使用すると
き、このような物質を固体の支持体上に固定化するため
の多数の種類の方法が文献中に記載されている［メソッ
ズ・イン・エンジモロジー（Methods in Enzymolog
y）、Vol.44（1976）参照］。蛋白質は共有結合あるい
は非共有結合により普通に固定化される。頻繁に用いら
れる非共有結合は、ポリスチエンビーズまたは微小粒子
に対しておよびポリ塩化ビニルの表面に対して非特異的
吸着である。多くの共有結合法が使用されており、そし
てわずかの方法は臭化シアン活性化アガロースおよびデ
キストラン；グルタルアルデヒド活性化ナイロンおよび
ポリアクリルアミド；およびアクリルおよび他の支持体
上のエポキシドを含む。IgGクラスの抗体を、また、固
定化された形態のプロテインＡへの結合によって固定化
することができる。ポリスチレンラテックス粒子上への
非特異的吸着を用いることもできる。

本発明において、分離した固定化分画中あるいは残留
する反応溶液中の標識試料または標識プローブ中の存在
を決定して、アッセイを完結するための種々の方法が存
在する。検出プローブと固定化相中の検出すべき配列と
の間の交雑の発生、あるいは反応混合物中のその存在の
減少を検出するために、任意の普通の手段を選択するこ
とができる。一般に、検出工程は、標識した形態の試料
またはプローブの使用、問題の配列と独特に検出可能な
雑種を形成するプローブの使用、あるいは交雑が起こる
ときにのみ実施できる二次反応、例えば、プライマー延
長反応を介することに基づくであろう。

試料またはプローブのための標識は、ポリヌクレオチ
ド、あるいは検出可能な物理的、化学的または電気的性
質を有する物質の特有の特性であろう。検出可能な標識
物質を導入するとき、それは、例えば、試料またはプロ
ーブへの共有結合により直接結合することができ、ある
いは、例えば、マイクロカプセルまたはリポソーム中に
究極的に検出可能な物質を組込み、次いでそれを試料ま
たはプローブに結合することによって間接的に結合する
ことができる。標識は光化学的方法によって実施するこ
とがとくに好ましい。

標識物質は免疫アッセイにおいてよく開発されてお
り、そして一般に、このような方法において有用なほと
んどの標識を本発明において応用することができる。と
くに有用なものは次の通りである：酵素的に活性な基、
例えば、酵素、［クリニカル・ケミストリー（Clin. C
hem.），（1976），22,1232;米国再発行特許第31,006号
および英国特許第2,019,408号参照］、酵素基質（米国
特許第4,492,751号参照）、補酵素（米国特許第4,230,7
97号および同第4,238,565号参照）および酵素阻害剤
（米国特許第4,234,792号参照）；蛍光性物質［クリニ
カル・ケミストリー（Clin. Chem.），（1979），25,3
53］；発色団；発光性物質、例えば、化学発光性物質お
よび生物発光性物質（米国特許第4,380,580号参照）；
特異的に結合性の配位子、例えば、ビオチン（欧州特許
明細書63,879号参照）またはハプテン（PCT発行83−228
6号参照）；および放射性同位元素、例えば、³H、³⁵S、
³²P、¹²⁵Iおよび¹⁴C。このような標識はそれら自身の物
理的性質（例えば、蛍光性物質、発色団および放射性同
位元素）またはそれらの反応性および結合性（例えば、
配位子、酵素、基質、補酵素および阻害剤）に基づいて
検出される。例えば、コファクター標識種は、酵素（ま
たはサイクル系を用いる場合複数の酵素）（前記酵素の
ための標識はコファクターおよび前記酵素のための１ま
たは２以上の基質）を添加することによって検出するこ
とができる。ハプテンまたは配位子（例えば、ビオチ
ン）で標識した種は、検出可能な分子で標識した配位子
に結合する蛋白質（例えば、アビジン）またはハプテン
に対する抗体を添加することによって検出できる。この
ような検出可能な分子は測定可能な物理的性質をもつ分
子あるいは酵素反応に参加する物質（例えば、上をリス
トを参照）であることができる。例えば、基質に作用し
て測定可能な性質をもつ生成物を生成する酵素を使用で
きる。後者の例は、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカ
リ性ホスファターゼおよびペルオキシダーゼを包含する
が、これらの限定されない。

本発明の方法において使用する標識試料または標識プ
ローブを調製する方法は、先行技術から容易に得られ
る。試料またはプローブを標識するとき、標識試料また
は標識プローブの交雑への参加能力を実質的に妨害しな
いで核酸を変更するために有効な合成アプローチを用
い、そして交雑に使用する条件下で十分に安定であっ
て、引続く検出を可能とする標識を選択する。

例として、次のアプローチを試料またはプローブの標
識つけに使用できる。放射線標識したヌクレオチドをDN
Aの試料またはプローブの中に、例えば、ニック翻訳お
よび末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを
使用する末端標識つけのような方法により組込むことが
できる。放射線標識したヌクレオチドは、生体外合成の
間に、プロメガ・バイオテク（Promega Biotec）、米
国ウイスコンシン州マジソン、からの「リボプローブ
（RIBOPROBE）」鋳型系を使用してバクテリオファージS
P6からのDNA依存性RNAポリメラーゼを用いてRNAの試料
またはプローブ中に組込むことができる。ランガー（La
nger）らの方法［プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc. Natl.
Acad. Sci.）、78、6633、（1981）］を用いて、５−
（３−アミノ）−アリルウリジンの第一アミンおよびデ
オキシウリジントリホスフェート類にビオチンを結合す
ることができる。これらのビオチニル化ヌクレオチドは
ニック翻訳により二本鎖DNA中に組込むことができ、あ
るいは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
を使用して３′−OH末端に付加することができる。ビオ
チンは、また、ポリアミン［ブロウカー（Broker）、ん
T.R.、核酸の研究（Nucl. Acids Ｒ es.）、４、3
63、（1978）］およびサイトクロームＣ架橋［ソウジャ
（Sodja）、A.およびデイビドソン（Davidoson）、N.、
核酸の研究（Nucl. Acids Res.）、５、385、（197
8）］を通してRNAの３′−OH末端に取り付けることがで
きる。試料またはプローブへの蛋白質標識の直接の結合
は、レンズ（Renz）の方法［エンボ・ジャーナル（EMBO
Journal）、２、817、（1982）］により達成すること
ができ、ここで彼は¹²⁵I−ヒストン類を変性DNAへグル
タルアルデヒドで結合した。酵素、例えば、ペルオキシ
ダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを、同様な化学
的手段によって、DNAの試料またはプローブへ結合する
ことができる［レンズ（Renz）およびクルズ（Kurz）、
核酸の研究（Nucl. Acids Res.）、12、3435（198
4）］。DNAの試料またはプローブを末端標識する他の化
学は、エシャグポウア（Eshaghpour）ら［核酸の研究
（Nucl. Acids Res.）、７、385、（1979）］が記載
したものを包含する。１または２以上の４−チオウリジ
ン残基をDNAの３′−OH末端に導入することができ、そ
してチオールを種々の親電子性低分子量試薬と反応させ
ることができる。この化学を用いて種々のハプテンをDN
Aの試料またはプローブへ取り付けることができる。ハ
プテンＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオ
レンを使用する標識付けはチェン（Tchen）ら［プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ（Proc. Natl. Acad. Sci.）、81、346
6、（1984）］により記載された。DNAおよびRNAの試料
またはプローブをＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルア
ミノフルオレンと反応させて、グアニンの８−に取り付
けられたＮ−アセチルアミノフルオレン残基を有する付
加物を生成することができる。共有結合的に変性された
DNAはＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオ
レンに対してレイズ（raise）された抗体を使用して検
出することができる。フー（Hu）およびメッシング（Me
ssing）、遺伝子（Gene）、17、217、（1982）の方法を
用いて、一本鎖M13ベクター中にクローニングされたプ
ローブに標識を付加することができる。区域５′ないし
クローニング部位に対して相補的な汎用プライマーは、
プローブ配列より下流のM13鎖に対して相補的なDNA合成
を示す。DNAポリメラーゼはヌクレオチドトリホスフェ
ートおよびビオチン５−（３−アミノアリル）デオキシ
ウリジントリホスフェートを新しいストランド（鎖）中
に組込むであろうから、それらの標識をプローブ配列よ
り離れたところにおいてベクターに取り付けることがで
きる。二本鎖部分を、また、８−アジドエチジウムとの
反応によって変性することができる。

検出工程に対する特に好ましいアプローチはプローブ
系の使用を包含し、ここで問題のポリヌクレオチド配列
とプローブとの間で形成した雑種をその個々の一本鎖か
ら抗原的に区別される。こうして、交雑したプローブを
含有する固定化分画中のプローブの存在は、このような
雑種の結合に対して選択的である前述の抗体試薬を添加
することによって検出することができる。好ましい抗体
試薬は、一本鎖核酸よりも二本鎖核酸の結合について選
択的であるもの、例えば、（ｉ）DNA・RNA雑種またはRN
A・RNA雑種あるいは（ii）インターカレイション複合体
（intercalation complex）を選択的に結合するもので
ある。最初の場合において、DNA、RNA雑種を選択的に結
合する抗体試薬は、検出すべき試料および配列の一方が
DNAでありかつ他方がRNAである場合に有用であり、そし
て、もちろん、いずれの場合においても、プローブは検
出すべき配列と同一のRNAまたはDNAであろう。RNA・DNA
雑種を見出すために選択的である抗体試薬を使用するこ
とができ、ここでプローブおよび問題の配列の両者はRN
Aであり、そしてプローブはDNAである。インターカレイ
ション複合体の場合において、プローブおよび問題の配
列の間で形成した雑種がインターカレイション複合体の
形態でそれに結合した核酸インターカレイターを含むよ
うに、アッセイは設計されるであろう。

RNA・DNA雑種に対して特異的な抗体を刺激するための
免疫原は、ホモポリマーまたはヘテロポリマーのポリヌ
クレオチド二重らせんからなることができる。可能なホ
モポリマーの二重らせんのうちで、ポリ（rA）・ポリ
（dT）はとくに好ましい［キタガワ（Kitagawa）および
ストラー（Stollar）、分子免疫学（Mol. Immuno.）、
19、413（1982）］。しかしながら、一般にヘテロポリ
マーの二重らせんを使用することが好ましく、そしてそ
れらは種々の方法で、例えば、φX174ビリオンDNAをRNA
ポリメラーゼで転写することによって調製することがで
きる［ナカザト（Nakazato）、バイオケミストリー（Bi
ochem.）、19、2835（1980）］。選択したRNA・DNA二重
らせんは、メチル化蛋白質へ吸着させるか、あるいはそ
うでなければ普通の免疫原担体物質、例えば、ウシ血清
アルブミンへ結合し、そして所望の雑種動物へ注入する
［メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods in Enz
ymology）、70、（1980）］。RNA・RNA二重らせんに対
する抗体は、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたは
なかでもテンセイを感染するフィジー（Fiji）病ウイル
スからの二本鎖RNAに対してレイスすることができる。
また、ホモポリマーの二重らせん、例えば、なかでも、
ポリ（rI）・ポリ（rC）またはポリ（rA）・ポリ（rU）
を上の免疫化に使用することができる。

インターカレイション複合体に対する抗体は免疫原に
対して調製することができ、通常陽イオン性の蛋白質ま
たは蛋白質誘導体（例えば、メチル化ウシ血清アルブミ
ン）と免疫イオン性インターカレイター−核酸複合体と
の間のイオン複合体からなるであろう。理想的には、イ
ンターカレイターは二本鎖核酸へ共有結合される。ある
いは、インターカレイター−核酸接合体（conjugate）
は担体の蛋白質に共有結合させることができる。免疫原
の核酸部分はアッセイの雑種中に見出される特異的対の
配列からなることができるか、あるいは抗体の特異性は
一般に含まれる特定の塩基配列に依存しないので、任意
の他の所望の配列からなることができる。

インターカレイション複合体について選択的である抗
体試薬を検出において使用する他の場合において、種々
のインターカレイター化合物を含めることができる。一
般に、インターカレイターＸは好ましくは低分子量の、
平らな、通常芳香族であるが、時には、二本鎖核酸、例
えば、DNA・DNA、DNA・RNAまたはRNA・RNA二重らせん
と、通常塩基対の挿入により、結合することのできる多
環式分子であると言うことができる。主な結合機構は通
常非共有結合であり、共有結合は第２段階として起こ
り、ここでインターカレイターは挿入された（intercal
ated）二重らせん鎖の一方または双方上の隣接する化学
的基との共有結合を形成するであろう、反応性または活
性化された化学的基を有する。インターカレイションの
結果は、隣接する塩基対が約２倍のそれらの正常分離距
離へ広がり、二重らせんの分子の長さを増大することで
ある。さらに、約12〜36個の二重らせんの巻戻しが起こ
ってインターカレイターを収容しなくてはならない。一
般的概観およびそれ以上の情報は、次の文献から得るこ
とができる：ラーマン（Lerman）、J.、分子生物学（Mo
l. Ｂ ｉ ol.）、３、18（1961）；ブルームフィー
ルド（Bloomfield）ら、「核酸の物理化学（Physical
Chemistry of Nucleic Acids）」、７章、429−476
ページ、ハーパー・アンド・オウウイ、ニューヨーク
（1974）；ワーリング（Waring）、ネイチャー（Natur
e）、219、1320（1968）；ハートマン（Hartmann）ら、
アンゲバンデ・ヘミー（Angew. Chem.）、英語編、
７、693（1968）；リッパード（Lippard）、アカウンツ
・オブ・ケミカル・リサーチ（Accts. Chem. Re
s.）、11、（1978）；ウイルソン（Wilson）、インター
カレイション化学（Intercalation Chemistry）、（19
82）、445;およびバーマン（Berman）ら、Ann. Rev.
Biophs. Bioeng.、20、87（1981）。インターカレイタ
ーの例は、アクリジン色素類、例えば、アクリジンオレ
ンジ、フェナントリジン類、例えば、エチジウム、フェ
ナジン類、フロクムマリン類、フェノチアジン類、およ
びキノリン類である。

インターカレイション複合体はアッセイ媒質中でプロ
ーブを使用することによる交雑の間に形成され、ここで
このプローブは、交雑の間にインターカレイション複合
体が形成するように、その相補的一本鎖区域において、
化学的に結合したインターカレイターを有するように、
変性されている。本質的に任意の便利な方法を使用し
て、このような結合を形成することができる。通常、こ
の結合は反応性の、好ましくは感光性インターカレイタ
ーを用いるインターカレイション（またはインターカレ
ーション）を実施し、次いで結合反応を行うことによっ
て形成される。とくに有用な方法はアジドインターカレ
イターを含む。紫外線または可視光線に露出すると、反
応性ニトレン類は容易に発生する。アリールアジド類の
ニトレン類はそれらの転位生成物よりも挿入反応を好む
［ホワイト（White）ら、チメソッズ・イン・エンジモ
ロジー（Methods in Enzymology）、46、644（197
7）］。代表的なアジドインターカレイターは、３−ア
ジドアクリジン、９−アジドアクリジン、エチジウムモ
ノアジド、エチジウムジアジド、エチジウム二量体アジ
ド［ミッチェル（Mitchell）ら、JACS、104、4256（198
2）］、４−アジド−７−クロロキノリン、および２−
アジドフルオレンである。他の有用な光反応性インター
カレイターは、ピリジン残基と（２＋２）環式付加物を
形成するフロクマリンである。アルキル化剤、例えば、
ビスクロロエチルアミン類およびエポキシド類またはア
ジリジン類、例えば、アフロトキシン類、多環式炭化水
素エポキシド類、マイトマイシンおよびノルフィリンＡ
を使用することもできる。次いで、インターカレイター
変性二重らせんを、変性された一本鎖プローブを生成す
るように変性する。

検出プローブと問題の配列との間で形成した抗原的に
識別できる雑種へ結合する抗体試薬の検出は、任意の普
通の方法において進行させることができる。例えば、前
述したような任意の化学的基で標識した抗体試薬を使用
することができる。標識しが抗体の調製は文献中に広く
記載されている。¹²⁵Iの組込みはボルトン（Bolton）お
よびハンター（Hunter）の方法［バイオケミカル・ジャ
ーナル（Biochem.J.）、133、529（1972）］によって達
成することができる。イシカワ（Ishikawa）ら、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol.）、４、209
（1982）は、種々の酵素を抗体に結合する、いくつかの
異なる方法を概説している。ヨシタケ（Yoshitake）
ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー（Eur. J. Biochem.）、101、395（1979）は、マ
レイミド類を使用してグルコースオキシダーゼ類を抗体
に結合する方法を記載した。アルカリ性ホスファターゼ
類を抗体にグルタルアルデヒドで結合することができる
［ボラー（Voller）ら、Bull. World Health Orga
n.、53、55（1976）］。抗体は、ブレイクスリー（Blak
eslee）およびバインス（Baines）、ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソッズ（J. Immunol. Method
s）、13、305（1976）の方法によって、フルオレセイン
で標識することができる。化学発光体の標識は、シュレ
ーダー（Schroeder）ら、クリニカル・ケミストリー（C
lin. Chem.）、27、1378（1981）の方法によって導入
することができる。あるいは、抗体試薬は自然の性質、
例えば、それ自体の抗原性に基づいて検出できる。固定
化した抗（抗体）抗体は主要な抗体試薬に結合し、ここ
で第２抗体のための標識は上の任意の普通の標識であ
る。さらに、抗体は相補的固定により、あるいは標識プ
ロテインＡ、ならびに抗体の検出についてこの分野にお
いて知られている他の技術を用いて検出することができ
る。

アッセイすべき試験試料は、問題の任意の媒質である
ことができ、そして通常、医学的、獣医学的、環境的、
栄養的、または工業的の意味を有する液状試料であろ
う。とくに、ヒトおよび動物の検体および体液、例え
ば、尿、血液（血清または血漿）、乳、脳脊髄液、唾
液、糞便物質、肺の吸出された物質、喉のスワブ、性器
のスワブおよび滲出物、腸のスワブ、および鼻咽頭の吸
出された物質を本発明の方法によってアッセイすること
ができる。患者または試験すべき他の源から得られた試
験試料は種として二本鎖核酸、例えば、細胞中に含有さ
れていた前記核酸、を含有する場合、この試料を処理し
て核酸を変性し、そして必要に応じて、まず、細胞から
酸を開放する。

本発明の他の面は、試験試料中の核酸類を標識する
か、あるいはそれらを化学的に変性して、全細胞、リゼ
イト、または精製された核酸の中に、引続く固定化のた
めの反応性部位を導入する。本発明の他の驚くべき面
は、全細胞の効率よい標識または反応性部位の変性であ
る。標識または反応性部位の変性の１つの方法は、検出
可能な標識のための担体としてDNA結合性配位子を使用
する光化学的反応である。臨床的試料を、例えば、尿ま
たは血液の遠心によって、感染性細胞を分離するために
処理し、次いで光化学的試薬を添加し、そしてこの混合
物を照射して、場合に応じて、標識したまたは反応性部
位変性した試験試料を生成する。

核酸は光化学的手段により、感光性核酸結合性配位
子、例えば、インターカレイター、例えば、フロクマリ
ンまたはフェナントリジン化合物あるいはインターカレ
イター以外の化合物、例えば、ネトロプシン、ジスタマ
イシン、ヘキスト（Hoechst）33258およびビス−ベンズ
イミダゾールを使用して標識または変性して、標識（こ
れを普通の方法で、例えば、フルオレセインの検出によ
り「読む」かあるいはアッセイすることができる）に、
または反応性部位（これは前述のように引続く固定化の
ための手段であることができる）に結合する。こうし
て、最終生成物は、（ａ）核酸成分、（ｂ）核酸成分に
光化学的結合したインターカレイターまたは他の核酸結
合性配位子、および（ｃ）（ｂ）に化学的に結合した標
識または反応性部位からなる、標識または変性された核
酸プローブである。

この新規な光化学的方法は、生化学的に感受性の物質
のための通常の化学的結合法よりも、好適な反応条件を
提供する。照射のために適切な波長を使用することによ
って、DNA、RNAおよび蛋白質を、これらのポリマーの固
有の構造に影響を及ぼさないで、変性することができ
る。核酸結合性配位子（以後インターカレイターによっ
て例示する）、標識または反応性部位を、まず、結合
し、次いで核酸と光化学的に反応させるか、あるいは核
酸を、まず、インターカレイターと光化学的に反応さ
せ、次いで標識または反応性部位に結合することができ
る。核酸、例えば、二本鎖DNAを標識または反応性部
位、例えば、ハプテンに結合する一般的方法は次の通り
である： 核酸の交雑可能な部分が二本鎖の形態である場合、次
いでこのような部分を変性して交雑可能な一本鎖部分を
生成する。あるいは、特異的な効率よい光化学的生成物
を生成するために、核酸成分および光反応性インターカ
レイター化合物を特別な方法で暗所で反応させる。

核酸への結合のため、アミノメチルプソラレン、アミ
ノメチルアンゲリシンおよびアミノアルキルエチジウム
またはメチジウムアジド類はとくに有用な化合物であ
る。それらは二本鎖核酸に結合し、そして複合体のみが
光付加物を生成する。標識または反応性部位変性した二
本鎖核酸を変性して交雑可能な一本鎖区域を生成しなく
てはならない場合、核酸の２本の鎖と単一の光付加物と
の同時の相互作用を防止するような条件を用いる。プロ
ーブまたは試料の交雑可能な一本鎖部分に沿った変性の
頻度は実質的に交雑を妨害するほど大きくないことが必
要であり、それゆえ25、より通常50、好ましくは100ヌ
クレオチド塩基につき１以下の変性部位が存在すること
が好ましい。アンゲリシン誘導体はモノ付加物の形成の
ためにはプラソレン化合物よりもすぐれる。一本鎖核酸
をある余分の二本鎖核酸に共有的に取り付ける場合、フ
ェナントリジウム化合物およびプソラレン化合物は暗所
で二本鎖核酸と特異的に相互作用するので、これらの化
合物を使用することが望ましい。標識のため核酸を変更
するための結合した試薬を合成する化学は、すべての場
合について類似し、後に詳述する。

核酸化合物は一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAまた
はそれらの断片、例えば、制限酵素により生産されるも
のあるいは比較的短いオリゴマーであることさえでき
る。

核酸成分を標識または反応性部位へ結合するために使
用する本発明の核酸結合性配位子は、既知の核酸結合性
配位子の任意の適当な光反応性形態であることができ
る。とくに好ましい核酸結合性配位子は、次の通りであ
る：インターカレイター化合物、例えば、フロクマリン
類、例えば、アンゲリシン（イソプソラレン）またはプ
ソラレンまたは核酸と光化学的に反応するそれらの誘導
体、例えば４′−アミノメチル−4,5′−ジメチルアン
ゲリシン、４′−アミノメチルトリオキシサラン（４′
−アミノメチル−4,5′,8−トリメチル−プソラレン、
３−カルボキシ−５−または−８−または−ヒドロキシ
−プソラレン）、ならびにモノ−またはビス−アジドア
ミノアルキルメチジウムまたはエチジウム化合物。種々
の他のインターカレイターの光反応性形態を、また、使
用することができ、それらの下表に例示する： このような挿入剤（intercalating agets）のとくに
有用な光反応性の形態はアジドインターカレイターであ
る。それらの反応性ニトレン類は長い波長の紫外線また
は可視光線で容易に発生し、そしてアリールアジド類の
ニトレン類はそれらの転位生成物よりも挿入反応を好む
［ホワイト（White）ら，メソッズ・イン・エンジモロ
ジー（Methods in Enzymology），64,644（1977）参
照］。代表的なアゾインターカレイターは３−アジドア
クリジン、９−アジドアクリジン、エチジウムモノアジ
ド、エチジウムジアジド、エチジウム二量体アジド［ミ
ッチェル（Mitchell）ら，JACS，104,4265（1982）］、
４−アジド−７−クロロキノリンおよび２−アジドフル
オレンである。他の有用な光反応性インターカレイター
は、ピリジン残基と［２＋２］シクロ付加物を形成する
フロクマリン類である。アルキル化剤、例えば、ビスク
ロロエチルアミン類およびエポキシド類またはアジリジ
ン類、例えば、アフラトキシン類、多環式炭化水素のエ
ポキシド類、ミトマイシンおよびノルフィリンＡを使用
することもできる。

標識または反応性基はインターカレイター化合物への
直接の化学的結合、例えば、共有結合を服結合により、
あるいは間接結合、例えば、マイクロカプセルまたはリ
ボソーム中に標識または反応性基を組込み、次いでこれ
らをインターカレイター化合物に結合することによって
結合される。標識または反応性基をインターカレイター
化合物へ結合する方法はこの分野において本質的に知ら
れており、そして任意の便利な方法を用いて本発明を実
施することができる。

有利には、インターカレイター化合物は、まず、標識
または反応性基と化学的に結合し、その後核酸成分と結
合する。例えば、ビオチンはカルボキシル基を有するの
で、それをフロクマリンと、フロクマリンの光化学的反
応性またはビオチンの生物学的活性を妨害しないで、ア
ミドまたはエステルの形式によって、例えば、次のよう
にして結合することができる： またはビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド＋PNH₂ ビオチン−ｐ−ニトロフエニルエステル 例えば 他のアミノメチルアンゲリシン、プソラレンおよびフェ
ナントリジウム誘導体を同様に反応させることができ、
また同様にハロゲン化フェナントリジウムおよびそれら
の誘導体、例えば、塩化アミノプロピルメチジウム、す
なわち、 を反応させることができる［ヘルツバーグ（Hertzber
g）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイアティ（J.Amer.Chem.Soc.）、313、（1982）参
照］。

あるいは、二官能性試薬、例えば、ジチオビススクシ
ジニルプロピオネートまたは1,4−ブタンジオールジグ
リシジルエーテルを、及び溶媒、比率および反応条件に
関して既知の方法で、使用して光化学的に反応性の分子
を標識と直接結合することができ、ここで反応成分はア
ルキルアミノ残基を有する。ある種の二官能性試薬、多
分グルタルアルデヒド、は結合するが、核酸を変性し、
こうしてアッセイを妨害することがるので、適当でない
ことがある。日常の予備的注意を払ってこのような困難
を防止することができる。

標識または反応性部位変性した核酸を作るときの特定
の配列は変更することができる。こうして、例えば、ア
ミノ置換プソラレンを、まず、核酸と光化学的に結合さ
せ、ここで生成物はアミノ側基を有し、この基によって
それを標識または反応性部位へ結合させることができ
る。あるいは、プソラレンを、まず、標識または反応性
部位に結合し、次いで核酸に結合させることができる。

核酸結合性配位子と標識または反応性部位との間のス
ペーサーの鎖長は、炭化水素またはペプチドを介して延
長することができる。典型的な例は、J.L.デコート（De
Cout）およびJ.ローメ（Lhomme）、光化学的光生物学
（Phtochemistry Photobiology）、37、155−161（198
3）に記載されている方法に従い、８−ヒドロキシプロ
ソラレン誘導体をハロゲン化アルキルで延長することを
包含する。次いで、W.A.サッフラン（Saffran）ら、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA、
79、4594（1982）に記載されているように、ハロアルキ
ル化誘導体をチオールまたはアミンと反応させて、反応
性残基を生成する。

標識が酵素であるとき、例えば、生成物は究極的には
適当な媒体上の配置され、そして触媒反応の程度を決定
する。こうして、酵素がホスファターゼであるとき、媒
体はニトロフェニルホスフェートを含有することがで
き、そして発生したニトロフェノールの量を色の観測に
より監視する。酵素がベータ−ガラクトシダーゼである
とき、媒体は同様にニトロフェノールを遊離するｏ−ニ
トロフェニル−Ｄ−ガラクト−ピラノシドを含有するこ
とができる。

核酸の変性は、好ましくは、沸騰水中の加熱により、
あるいはアルカリ処理（例えば、0.1Nの水酸化ナトリウ
ム）処理によって達成され、このアルカリ処理は、必要
に応じて、細胞を溶解するために同時に使用することが
できる。また、核酸の開放は、例えば、機械的崩壊（凍
結／融解、摩耗、超音波処理）、物理的／化学的崩壊
［洗浄剤、例えば、「トリトン（TRITON）」、「ツイー
ン（TWEEN）」、ドデシル硫酸ナトリウム、アルカリ処
理、浸透圧ショック、または熱）、または酵素的溶解
（リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ペプシン）によって
実現することができる。選ばれる試験媒体は核酸を一本
鎖の形態で含有し、次いでこれを本発明の交雑法に従っ
てアッセイすることができる。さらに、特定の所望のア
ッセイ、例えば、点突然変異を特異的エンドヌクレアー
ゼ処理および引続く二重交雑制限により検出するアッセ
イを実施するために、核酸を特異的または非特異的に断
片化することができる［例えば、米国特許出願第511,06
3号参照］。

技術的に知られているように、種々の交雑条件をこの
アッセイにおいて用いることができる。典型的には、交
雑はわずかに高温、例えば、約35〜75℃および通常65℃
付近において溶液中で進行させ、ここで溶液はpH約６〜
８の緩衝液からなり、適当なイオン強度（例えば、５×
SSC、ここで１×SSC＝0.15モルの塩化ナトリウムおよび
0.015モルのクエン酸ナトリウム、pH7.0）を有し、そし
て必要に応じて蛋白質、例えば、ウシ血清アルブミン、
および変性した異質DNA、例えば、子牛胸腺またはサケ
精子からのDNAを含有する。より低い交雑温度が望まし
い場合、水素結合性試薬、例えば、ジメチルスルホキシ
ドおよびホルムアミドを含めることができる。交雑を起
こすために要求される試料とプローブとの間の相補性の
程度は、条件の過酷さに依存する。過酷さを決定する因
子はこの分野において知られている。

通常、交雑のために選択される温度条件は、形成した
雑種への抗体試薬の結合および標識の応答の菌株と不敵
合性であろう。したがって、抗体試薬の結合工程および
標識検出工程は、交雑工程の完結後に進行するであろ
う。反応混合物を通常約３℃〜約40℃の範囲の温度に
し、次いで結合および検出の工程を実施する。塩および
／またはホルムアミドの濃度が高過ぎて抗体試薬を有意
に妨害するとき、および塩および／またはホルムアミド
の濃度が高過ぎて抗体結合反応を妨害するとき、抗体試
薬の添加前の交雑混合物を希釈することが望ましい。標
識結合性相手または標識した抗体試薬を使用してプロー
ブの交雑を検出することを含むアッセイの場合におい
て、アッセイの工程の順序は一般に次のように進行す
る。交雑反応を、まず、普通前述にように予備処理した
試験試料を使用して実施する。

本発明は、さらに、試薬系、すなわち、所望のアッセ
イ法を実施するために要求される必須の要素のすべてを
含む、試薬の組み合わせまたは手段を提供する。試薬系
は商業的に包装された形態で、試薬の適合性が許す場
合、生物または混合物として、試験装置の形態で、また
はより通常キットとして、すなわち、必要な試料を保持
し、かつ通常アッセイを実施するための書かれた説明を
含む、１または２以上の容器の包装された組み合わせな
どとして提供される。本発明の試薬系は、ここに記載す
る種々の交雑フォーマットを実施するための、すべての
立体的配置および組成物を包含する。

この系の試験キットの形態は、さらに、補助的化学物
質、例えば、交雑溶液および試験試料中の前記核酸を一
本鎖の形態に転化できる変性試験の成分を含むことがで
きる。このキットは、また、上の成分を保持するための
１または２以上の容器を含むことができる。

従来の方法のあるものは有用な結果を生成するが、こ
れらの方法は３つの成分系または反応速度的に遅い手順
を使用する。本発明は均質法の改良である。本発明の交
雑は溶液中の成分系を使用して実施され、そして交雑は
固体の基質との反応により分離される。分離は反応性部
位／反応相手系により実施される。好ましくは、プロー
ブまたは試験試料中のこのような反応性部位は結合部位
であることができ、このような結合部位は、反応相手の
役目をする結合物質、例えば、アビジンまたは抗体と特
異的非共有結合をすることのできるビオチンまたはハプ
テンの部分である。反応相手は固定化された形態で、例
えば、固体の支持体へ取り付けられた形態で提供され
る。したがって、交雑後、溶液を固定化された反応相手
と接触させて、核酸中の反応性部位と安定な結合が形成
できるようにし、固定化された反応相手を溶液から分離
し、そして得られる固定化された分画または残留溶液あ
るいは両者を検出標識の存在についてアッセイする。

反応性部位およびその固定化された反応相手の１つの
殊に有用な組み合わせは、アビジンまたはストレプトア
ビジン−ビオチン成分を含む。こうして、この対の一方
をプローブのDNAまたは試料へ取り付け、そして他方を
固体の支持体へ取り付け、両者は、例えば、現在係属中
の欧州特許出願公告第０ 130 523号に記載されている
ような既知の方法で実施する。固体の支持体としての限
定されない例は、「セファデックス（SEPHADEX）」ゲ
ル、アガロース、ナイロン、ポリスチレンビーズ、セル
ロースビーズ、セルロース紙、ニトロセルロース紙およ
びプラスチックを包含する。

好ましくは、検出標識は検出可能な化学的基であり、
これらは放射性、蛍光性、酵素の基などであることがで
き、そして欧州特許出願公告第０ 130 523号に記載さ
れているもののいずれも適当である。

核酸（試験試料またはプローブ）は、互いに組み合わ
せることのできる希薄な水溶液として使用する。イオン
強度、pHおよび温度の適当な条件を使用することによっ
て、適切な成分が存在する場合、交雑は非常に急速に起
こるであろう。次いで、固定化された反応相手を導入し
そして、適当な時間を経過させて反応相手と反応性部位
とを相互作用させた後、不動の層または分画を、欧州特
許出願公告第０ 130 515号に記載されている既知の方
法で、取り出し、洗浄し、そしてアッセイを実施する。

本発明を図面を参照して説明する。図面において、同
様な部分は参照数字で表示されている。

図面において、核酸11を標識または反応性部位12と反
応させて、標識されたまたは反応性部位で変性された核
酸（Ｐ）13を形成する。標識12が検出のためのものであ
りかつ反応性部位が分離のためのものであるとき、試験
試料の核酸21を、それぞれ、反応性部位または標識22と
反応させて、反応性部位で変性されたあるいは標識され
た核酸（Ｔ）23を形成する。

生成物（Ｐ）13および（Ｔ）23を水溶液中で交雑す
る。次いで、得られる生成物（PT）31を固体支持体32と
の反応により分離し、これは、場合に応じて、標識また
は反応性部位12または22と強感染相互作用を生成する。
33を洗浄して未反応の核酸を除去した後、部分33を含有
する固体の支持体上で標識の程度を検出するか、あるい
は残留溶液中の標識の量を決定する。この検出は洗浄液
中でも実施することができる。標識12および22の種類を
相互に交換することができ、すなわち、11を22で標識す
ることができ、そして21を12で標識することができ、こ
こでこの方法への悪影響は存在しない。

本発明を次の非制限的実施例を参照しながら説明す
る。

実施例１ pBR322DNAの既知の試料［インターナショナル・バイ
オテロジック・インコーポレーテッド（International
Biotechnologic,Inc.）、米国コネチカット州ニュー
ヘブン、から商業的に入手可能］を、直線化のためpst
I制限酵素で消化する。この直線化した核酸試料を10ミ
リモルのホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8）に対して透析
する。この溶液の濃度を１μg/μｌに維持する。このDN
A溶液に、４′−アミノメチル−4,5′−ジメチルアンゲ
リシンを1:5のモル比（標識：配位子）で添加する。こ
の溶液を346nmで30分間照射する。この反応した核酸
（Ａ）溶液を同一の緩衝液に対して透析して未反応の配
位子を除去する。次いで、この溶液を２つの半分に分け
る。１つの半分を、10倍過剰量の反応性Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドビオチンの添加により、このビオチン誘
導体と反応させる。このビオチニ化pBR322（Ｂ）を同一
緩衝液に対する透析により精製する。

試料（Ａ）および（Ｂ）を沸騰水中で５分間加熱する
ことによって変性し、次いで氷冷する。

１μｇ〜0.1ngの範囲の試料（Ａ）（上のようにして
変性した）の５つのアリコートを、氷冷した試験管に別
々に入れる。この溶液の体積を前記ホウ酸塩緩衝液の添
加により同一（1ml）にする。各試験管も。１μｇの等
価物（Ｂ）（水中10μｌ）を添加し、65℃で５分間イン
キュベーションし、次いでそれらを氷冷する。これらの
氷冷した溶液に、2mlのNHS−活性化アガロース［“AFFI
GEL−10"、バイオラド（Biorad）、米国カリフォルニア
州］を添加する。このゲルの概算体積は200μｌであ
る。インキュベーションを０℃で30分間実施する。

この活性化ゲルは（Ａ）におよび（Ａ）（Ｂ）雑種に
共有結合するであろう。雑種結合したビーズのみはビオ
チンの存在を示すであろう。

これらのビーズを室温においてホウ酸塩緩衝液（２
回）で洗浄し、次いでBSA（1mg/ml）を含有するホウ酸
塩緩衝液で洗浄し、FITC標識アビジンを添加し、そして
同一緩衝液で洗浄する。これらの蛍光性ビーズを蛍光顕
微鏡のもとで視的に検出する。ビオチンの検出を、ま
た、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda
Research Laboratories）、米国マリイランド州、から
入手可能なストレプトアビジン−アルカリ性リン酸塩系
の添加により実施する。

実施例２ アルファ−サラセミアについての出生前試験 実施例2A プローブのバックグラウンド、病気およびプローブの
調製は、E.M.ルビン（Rubin）およびY.W.カン（Kan）、
ザ・ランセット（The Lancet）、Jan.12、1985、75ペ
ージに記載された。

試料のDNAをニトロセルロース紙に固定化する［M.ル
ビン（Rubin）ら、上を参照に記載されている）代わり
に、核酸の試料を実施例１の（Ｂ）におけるようにビオ
チンで光化学的に標識する。このプローブを、実施例１
の（Ｂ）におけるように、４′−アミノメチル−4,5′
−ジメチルアンゲリシンで光化学的に標識する。交雑お
よび検出の手順は実施例１と同一である。

実施例2B 実施例2Bは実施例2Aと同一の方法で実施したが、ただ
し次の点で相違した:DNA試料を実施例１に記載するよう
にしてアミノアンゲリシンで標識し、そしてプローブを
実施例１に記載するようにしてビオチンで標識する。

実施例３ 試料中の微生物についての試験 工程1: 写真標識試薬の合成 化合物１〜６、それらの式は次の通りである、を核酸
試料の標識に使用した： 化合物２および３を使用するとき、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドビオチンとの第２反応を実施してビオチン
を核酸に結合した。化合物１はブレサ（BRESA）、オー
ストラリア、から商業的に入手した。化合物２および３
は米国特許第4,542,102号に記載されている。化合物４
（４′−ビオチニルアミド−4,5′,8−トリメチルプソ
ラレン）は、次のようにして製造した:166mgの４′−ビ
オチニルアミド−4,5′,8−トリメチルプソラレン（0.6
5ミリモル）および110μｌのトリチルアミン（80mg、1.
1ミリモル）を含有する溶液を、40℃において275mgのＮ
−スクシニミジルビオチン（0.8ミリモル）で処理し
た。生ずる溶液を40℃において３時間撹拌した。次い
で、得られる反応混合物をSiO₂上に蒸発させ、60gのSiO
₂（230〜400メッシュ）を使用するフラッシュクロマト
グラフィーにかけ、次いで9:1のCHCl₃−CH₃OH溶媒混合
物で溶離した。この生成物をエタノールから再結晶化す
ると、101mgの白色固体が、55℃、0.1mmで乾燥後に得ら
れた（32％の収率）。

分析:C₂₅H₂₉N₃O₅S・1/2H₂Oについて計算 計算値:C、60.96;H、6.14、Ｎ、8.53 実測値:C、60.52;H、6.01、Ｎ、8.24 化合物５および６の調製は、１−アミノ−17−Ｎ−
（ビオチニルアミド）−3,6,9,12,15−ペンタオキサヘ
プタデカンを必要とした。これは次の４つの工程により
達成した： （１）3,6,9,12,15−ペンタオキサヘプタデカン（Ｘ）
−1,17−ジオールジトシレートを合成した。

（２）（Ｘ）の1,17−ジフタルイミド誘導体を調製し
た。

（３）（Ｘ）の1,17−ジアミノ誘導体を調製した。

（４）（Ｘ）の１−アミノ−17−ビオチニルアミド誘導
体を調製した。

3,6,9,12,15−ペンタオキサヘプタデカン−1,17−ジオ
ールジトシレートの調製 ０℃の400mlのCH₂Cl₂中に50gのヘキサエチレングリコ
ール（0.177モル）および64mlのトリエチルアミン（39.
36g）を含有する撹拌した溶液に、400mlのCH₂Cl₂中に7
3.91gのｐ−トルエンスルホニルクロライド（0.389モ
ル）を含有する溶液を2.5時間かけて滴々添加した。次
いで、この混合物を濾過し、そして濾液を真空濃縮し
た。生ずる不均質残留物を500mlの酢酸エチル中に懸濁
し、そして濾過した。次いで、濾液を真空濃縮すると、
黄色油が得られ、これを250mlの部分のあたたかいヘキ
サンで８回粉砕して、未反応のｐ−トルエンスルホニル
クロライドを除去した。次いで、得られる油を高真空下
に濃縮すると、108.12gの黄色油が得られた（定量的収
率）。

分析:C₂₆H₃₈O₁₁S₂について計算 計算値:C、52.87;H、6.48 実測値:C、52.56;H、6.39 1,17−フタルイミド−3,6,9,12,15−ペンタオキサヘプ
タデカンの調製 108gの3,6,9,12,15−ペンタオキサヘプタデカン−1,1
7−ジオールジトシレート（0.183モル）、74.57gのカリ
ウムフアタルイミド（0.403モル）および700mlのジメチ
ルアセタミドを含有する撹拌した懸濁液を160〜170℃に
２時間加熱し、次いで完全に冷却した。沈殿を濾過し、
そして水およびアセトンで洗浄すると、53.05gの生成物
が白色粉末として得られ、これを55℃（0.1mm）で乾燥
した。融点125−126℃。

生成物の第２収穫物をジメチルアセタミドの濾液から
真空蒸発により得、そして生ずる沈殿を酢酸エチル、水
およびアセトンで順次に洗浄した。得られる白色粉末を
55℃（0.1mm）で乾燥すると、追加の9.7gの生成物が得
られた。融点125.4−126.5℃。生成物の合わせた収量は
62.82g（68％の収率）であった。

分析：（第１収穫物） C₂₈H₃₂N₂O₉・1/2H₂Oについて計算 計算値:C、61.19;H、6.05;N、5.09 実測値:C、61.08;H、6.15;N、5.05 分析：（第２収穫物） C₂₈H₃₂N₂O₉について計算 計算値:C、62.21;H、5.97;N、5.18 実測値:C、61.78;H、6.15;N、5.13 1,17−ジアミノ−3,6,9,12,15−ペンタオキサヘプタデ
カンの調製 60gの1,17−フタルイミド−3,6,9,12,15−ペンタオキ
サヘプタデカン（0.118モル）、14.8gのヒドラジン水和
物（0.296モル）および500mlのエタノールを含有する溶
液を機械的に撹拌しながら100℃の油浴中で３時間加熱
した。次いで、この混合物を冷却し、次いで濾過した。
濾過ケークを300mlの部分のエタノールで４回洗浄し
た。合わせた濾液を濃縮すると、32.35gの黄色の不透明
のガラス状油が得られた。150−200℃（0.01mm）で蒸発
的蒸留を行なうと、22.82gの淡黄色油が得られた（69％
の収率）。

分析:C₁₂H₂₈N₂O₅・1/2H₂Oについて計算 計算値:C、49.80;H、10.10;N、9.68 実測値:C、50.36;H、 9.58;N、9.38 ［W.ケルン（Kern）、S.イワバチ（Iwabachi）、H.サト
ー（Sato）およびV.ボーマー（Bohmer），高分子化学
（Makrol. Chem.），180,2539（1979）］。

１−アミノ−17−Ｎ−（ビオチニルアミド）−3,6,9,1
2,15−ペンタオキサヘプタデカンの調製 75mlのDMF中に7.2gの1,17−ジアミノ−3,6,9,12,15−
ペンタオキサヘプタデカン（25ミリモル）を含有する溶
液を、アルゴン雰囲気の下で、3.41gのＮ−スクシニル
ビオチン（10ミリモル）の1.0時間にわたる少しずつの
添加により処理した。生ずる溶液を周囲温度で４時間撹
拌した。ジメチルアミノシンナムアルデヒドのスプレー
試薬で可視化したTLC（SiO₂、70:10.1のCHCl₃−CH₃OH−
濃NH₄OH）は、新規生成物へのきわめて優れた転化を示
した（Rf＝0.18）。得られる混合物を半分に分け、各半
分をSiO₂上に吸収させ、そして500gのSiO₂−60（230−4
00メッシュ）のフラッシュ−クロマトグラフィーにか
け、70:10.1のCHCl₃−CH₃OH−濃NH₄OH溶媒混合物で溶離
した。生成物を含有する分画をプールし、そして濃縮す
ると、2.42gのゼラチン状ワックス状固体が得られた。
生成物をイソプロパノール−エーテルから固体として沈
殿させ、ヘキサンで洗浄し、そして55℃（0.1mm）で乾
燥すると、1.76gの白色粉末が得られた（35％の収
率）。

分析:C₂₂H₄₂N₄O₇S・3/2H₂Oについて計算 計算値:C、49.51;H、8.50;N、10.49 実測値:C、49.59;H、8.13;N、10.39 質量分析（FAB）m/e:507.3（Ｍ＋１、56％） ４′−（ビオチニル−PEG）−トリオキシサレン（AMT−
PEG−ビオチン）（化合物５）の調製 3mlのDMF中の380mgの１−アミノ−17−Ｎ−（ビオチ
ニルアミド）−3,6,9,12,15−ペンタオキサヘプタデカ
ン（0.75ミリモル）の溶液を、アルゴン雰囲気の下に、
146mgのN,N−カルボニルジイミダゾール（0.9ミリモ
ル）で処理した。TLC（SiO₂、4:1のCHCl₃−CH₃OH、ジメ
チルアミノシンナムアルデヒドのスプレー試薬で可視化
した）は、ビオチニルアミン（Rf＝0.1）がイミダゾ尿
素（Rf＝0.5）に完全に転化したことを示した。次い
で、この反応混合物を193mgの４′−アミノメチル−4,
5′,8−トリメチル−プソラレン（HRI、米国カリフォル
ニア州、から商業的に入手可能である）（0.75ミリモ
ル）および2.7μｌのトリエチルアミン（1.57ミリモ
ル）で処理した。次いで、得られる混合物を60℃に一夜
加熱した。TLC（SiO₂、4:1のCHCl₃−CH₃OH）はイミダゾ
リドが新規生成物（Rf＝0.52）に転化したことを示し、
そしてこの生成物はUV蛍光生でありかつジメチルアミノ
シンナムアルデヒドのスプレー試薬で陽性として試験さ
れた。溶媒を真空除去すると、ゼラチン状油が得られ、
これをCH₃OH中に溶解し、SiO₂上に吸収させた。次い
で、含浸した固体を60gのSiO₂−60（230−400メッシ
ュ）のフラッシュ−クロマトグラフィーにかけ、9:1のC
HCl₃−CH₃OH溶媒混合物で溶離した。部分的に精製され
た生成物を含有する分画をプールし、次いで60gのSiO₂
のクロマトグラフィーに再びかけ、同一溶媒系で溶離し
た。

融点：ゆっくり分解、129.5℃−149.5℃． 分析:C₃₈H₅₅N₅O₁₁S・H₂Oについて計算 計算値:C、56.49;H、7.11;N、8.67 実測値:C、56.58;H、7.16;N、8.53 質量分析（FAB）m/e:790.3（Ｍ＋１、30％） ４′−（ビオチニル−PEG）−4,5′−ジメチルアンゲリ
シン（化合物６）の調製 1mlのDMF中の203mgの１−アミノ−17−Ｎ−（ビオチ
ニルアミド）−3,6,9,12,15−ペンタオキサヘプタデカ
ン（0.4ミリモル）の溶液を、アルゴン雰囲気の下に、7
8mgのN,N−カルボニルジイミダゾール（0.48ミリモル）
で処理した。生ずる混合物を４時間撹拌し、次いで55mg
の４′−アミノメチル−4,5′−ジメチルアンゲリシン
塩酸塩［F.ダル’アクア（Dall'Acqua）、D.ベダルディ
（Vedaldi）、S.カフィーリ（Caffieri）、A.グイオッ
ト（Guiotto）、P.ロジグヒエロ（Rodighiero）、F.バ
ッシチェッチ（Baccichetti）、F.カルラッサレ（Carla
ssare）およびF.ボーディン（Bordin）、ジャーナル・
オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Che
m.、24、178（1981）］（0.3ミリモル）、140μｌのジ
イソプロピルエチルアミンおよび100μｌのDMFで処理し
た。生ずる混合物を50℃で一夜撹拌した。次いで、この
混合物をSiO₂上に真空蒸発させ、そして含浸した固体を
60gのSiO₂−60（230−400メッシュ）のフラッシュ−ク
ロマトグラフィーにかけ、次いで1.5リットルの７％のC
H₃OH（CHCl₃）で、次いで１リットルの10％のCH₃OH（CH
Cl₃）で溶離した。生成物を含有する分画をプールし、
そして濃縮すると、72mgのガラス状固体（47％の収率）
が得られた。

工程2: 細胞のDNAの標識のための試験試料の処理 例えば、尿の試料［しかし、次のものを同等に適用で
きる：淋病の疑いのあるスワブ（swab）、髄膜炎の疑い
のある脳脊髄液、汚染の疑いのある水の試料などからの
物質の懸濁液］を遠心または濾過して洗浄しかつ試料中
に存在するかも知れないバクテリアを濃縮した。次い
で、バクテリアを、（ｉ）2mg/mlのリゾチームまたはリ
ソスタフィンに暴露し、次いでほぼ90℃の熱に暴露する
か、あるいは（ii）0.2NのNaOHに暴露するか、あるいは
（iii）１％のNaドデシル硫酸塩に暴露することによっ
て溶菌した。（ii）NaOH後、細胞のリゼイトの溶液を標
識前に中和し；（iii）洗浄剤の溶菌後、DNA標識付けの
前に氷上で0.5モルのＫ酢酸塩でSDSを除去する。化合物
１〜６は無傷の細胞に浸透することができるので、DNA
標識付けは細胞の溶菌の前に実施することができる。こ
のその場での標識付けは、アルカリ性または洗浄剤のリ
ゼイトを交雑溶液中に直接混入することができるので、
抽出手順を簡素化する。また、驚くべきことには、溶菌
前に、全細胞を標識試薬で混合し、そして照射を実施す
ることによって、全細胞を標識付けすることが可能であ
る。

交雑前に、標識した試料を変性し、そしてそれを短い
一本鎖長さに減少して、適当な標識しないプローブのDN
Aとの特別のアニーリングを促進することが、また、好
ましいであろう。変性法はこの分野において知られてい
る。これらの方法は、水酸化ナトリウム、有機溶媒、加
熱、酸の処理およびそれらの組み合わせを包含する。断
片化は、制御した方法で、NaOH中でほぼ80℃に決定した
時間の長さの間加熱することによって達成することがで
き、これは、もちろん、DNAを変性する。

工程3: 工程２の生成物の標識付け （ｉ）約10mlの尿の試験試料は、10⁴以上の感染性因子
を含有するであろう。遠心または洗浄による分離後、予
備処理した細胞のリゼイト（工程２）を、0.2mlの10ミ
リモルのホウ酸塩緩衝液（pHほぼ８）中に再懸濁する。
この懸濁液に、エタノール中に溶解（10mg/ml）した10
μｇの光標識試薬を添加し、そして泡型撹拌機で浸透す
ることによって混合した。次いで、この混合物を、長い
波長に設定したUVGL25装置で、365nmにおいて30分間照
射する。このUVGL装置は、UVPインコーポレーテッド（I
nc.）、米国カリフォルニア州91778、サン・カブリエル
・5100ウォールナット・グローブ・アベニュー、POボッ
クス1501、から販売されている。

（ii）この試料は、また、Ｎ−（４−アジド−２−ニト
ロフェニル）−Ｎ′−（Ｎ−ｄ−ビオチニル−３−アミ
ノプロピル）−Ｎ′−メチル−1,3−プロパンジアミン
［ブレサ（BRESA）、オーストラリアから商業的に入手
可能］で、フォースター（Forster）ら、核酸の研究（N
ucl. Acids Res.）、13、745（1985）にDNAについて
記載されている手順に従って標識することができる。

（iii）溶菌しない細胞を使用するとき、0.2mlの10ミリ
モルのホウ酸塩中の細胞の懸濁液を、照射前に、光試薬
とともに１時間インキュベーションする。

工程4: 工程２および３の生成物の交雑および検出 工程２および３の生成物の交雑およびDTは、実施例１
に記載される方法によって実施する。

この明細書および実施例は例示を目的とし、本発明を
限定するものではなく、そして本発明の精神および範囲
内の他の実施態様は当業者にとって明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による方法の線図的表示である。 11……核酸 12……標識または反応性部位 13……標識されたまたは反応性部位で変性された核酸
（Ｐ） 22……反応性部位または標識 23……反応性部位で変性されたあるいは標識された核酸
（Ｔ） 31……生成物（PT） 32……固体の基質 33……部分

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）標識または反応性部位を導入するた
   めに、全細胞、細胞溶解物およびそれらの混合物から本
   質的に構成される未精製試料中の核酸を化学的に変性す
   る工程であって、前記変性を標識または反応性部位を含
   有する光化学的な反応性試薬との反応によってそれぞれ
   行う工程、 （ｂ）交雑を行う工程、 （ｃ）交雑条件下に、化学的に変性した試料の核酸を交
   雑可能な核酸プローブと接触させる工程であって、該プ
   ローブは、試料の核酸が標識を導入するように変性され
   たときには、反応性部位が導入されているか、あるいは
   試料の核酸が反応性部位を導入するように変性されたと
   きには、標識されているものである、工程、 （ｄ）工程（ｃ）から得られる溶液を、試料の核酸また
   はプローブに対する固定化された形態の反応性相手とそ
   れぞれ接触させる工程、 （ｅ）得られる固定化された分画を残存する溶液から分
   離する工程、ならびに （ｆ）分離した固定化された分画中の標識の存在または
   残存する溶液中の標識の減少を測定する工程、 を含んでなる細胞を含有する試料中の特定の核酸配列の
   存在の測定方法。
2. 【請求項２】前記光化学的な反応性試薬が核酸結合性配
   位子である特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】前記固定化された形態の反応性相手が反応
   性基が取り付けられた固体支持体からなる特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
4. 【請求項４】前記反応性部位が特異的な非共有結合を行
   いうる結合部位である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
5. 【請求項５】前記結合部位がビオチンまたはハプテンで
   あり、そして前記固定化された形態の反応性相手が、そ
   れぞれ固定化された形態のアビジンまたは抗ハプテン抗
   体試薬である特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. 【請求項６】前記標識が酵素的に活性の基、蛍光体、発
   色団（luminescer）、発光体（lumineser）、特異的結
   合性の配位子および放射性同位元素から成る群より選択
   される特許選択範囲第１項記載の方法。
7. 【請求項７】前記標識が特異的結合性の配位子であり、
   そしてその存在がそれに対する標識された結合性相手と
   の結合性によって測定される特許請求の範囲第１項記載
   の方法。