JPS62265999A - 核酸含有試料中の微生物の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物の検出および同定、および核酸含有試
験試料中の特定の原核または真核生物のＤＮＡ源の検出
および同定に関する。

なおさらに、本発明は全細胞の溶解（ｌｙｓｉＳ）の方
法に関する。

Ａ、監土惣匁諌遇 微生物の混合物を含有する試料中の微生物の種の同定を
、試料からのＤＮＡを固定化し、そしてそれを標識した
検体の種−既知の微生物からの特異的ＤＮＡと交雑させ
、そして固定化ＤＮＡと標識検体との間で交雑が起こっ
たかどうかを観察することによって、実施することは、
ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ　８３１０１０２９号に
開示された。

交雑後に核酸、例えば、ＤＮＡを検出するための最も効
率よくかつ感度のある方法は、放射線標識したＤＮＡを
必要とする。オートラジオグラフィーおよび酵素の使用
は、アッセイの時間を延長させ、そして経験を要する技
術を必要とする。

ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）らへの米国特許第４．３５
８．５３５号は、特性病原性生成物の暗号を指定する核
酸に対して相補的な標識ヌクレオチドプローブを使用す
る伝染病の診断を記載している。

Ｂ、特異的真核　物の配列の検出 真核生物の核酸試料中の特異的配列の変更の同定は、試
料からのＤＮＡを固定化し、そしてそれを標識したオリ
ゴヌクレオチドと交雑させ、そして固定化ＤＮＡと標識
検体との間で交雑が起こったかどうかを観察することに
よって、実施することは、現在係属中の１９８６年１２
月２３日提出の欧州特許出願第８６　１１７　９７８号
に記載されている。

特異的遺伝子の発現は人間の生理学的状態を決定するこ
とが知られている０例えば、第６アミノ酸位置における
ＧＡＧ−ＧＴＧのベーターグロブリン遺伝子の解読配列
の変化は、鎌型−ベーターグロプリンを生成し、溶液ホ
モジネートは鎌型赤血球貧血として知られている病気を
有することがある。同様に、アルファーグロブリンまた
はベーターグロブリンの遺伝子からの特定の配列の欠失
はサラセミアを起こすことがある。最近の概観、ａｔ　
ｈｅｒａｌ　１）、ザ・ナフィールド・プロピンシアル
・ホスピタル・トラスト（Ｔｈｅ　　Ｎｕｆｆｉｅｌｄ
　　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　　Ｔ
ｒｕｓｔ）、（１９８２）、２章は、遺伝病の頻度およ
び臨床的スペルトルを記載している。

遺伝的疾患に関連する問題は、核酸配列の情報によって
診断することができる。このような配列の情報を検出す
る最も容易な方法は、既知の配列の特異的プローブと交
雑させる方法を使用することである。

ウィルソン（Ｗｉ　ｌ　ｓ　ｏ　ｎ）らへの米国特許第
４．３９５，４８６号は、制限エンドヌクレアーゼアッ
セイを用いて鎌型赤血球貧血をＰ接分析する方法を記載
している。

ニドワード（Ｅｄｗａｒｄ）Ｍ、ルピン（Ｒｕｂｉｎ）
およびイエット・ワイ・カン（Ｙ　ｕ　ｅ　ｔＷａｉ　
　Ｋａｎ）、「α−サラセミアにより引き起こされるハ
イドロプス・フェタリスについての簡単な感受性胎児の
試験（Ａ　　ＳｉｍｐｌｅＳｅｎｓｉｔｉｖｅ　　Ｐｅ
ｎａｔａｌ　　Ｔｅ５ｔｆｏｒ　　Ｈｙｄｒｏｐｓ　　
Ｆｅｔａｌｉｓ　　Ｃａｕｓｅｄ　　Ｂｙ　　ａ−Ｔｈ
ａｌａｓｓａｅｍｉａ）」、ザ番ランセット（Ｔｈｅ　
　Ｌａｎｃｅｔ）、１９８５年１月１２日、７５−７７
ページは、ホモＪＭ合体α−サラセミアの遺伝子型とヘ
モグロビン−Ｈ病およびα−サラセミアの特性の遺伝子
型とを区別するためのドラ）−プロット分析を記載して
いる。

交雑後に核酸、例えば、ＤＮＡを検出するための最も効
率よくかつ感度のある方法は、放射線標識したＤＮＡを
必要とする。オートラジオグラフィーおよび酵素の使用
は、アッセイの時間を延長させ、そして経験を要する技
術を必要とする。

最近、ＤＮＡを標識する非放射線的方法は。

ワード（Ｗａｒｄ）ら、欧州特許出願筒６３，８７９号
に記載された。ワード（Ｗａｒｄ）らは、ニック翻訳を
使用して、ビオチニル化Ｕ（ウラシル）残基をＤＮＡ中
に導入し、Ｔ（チミジン）を買換している０次いで、ビ
オチン残基を抗ビオチン抗体またはアビジン含有系で７
フセイする。この場合における検出はオートラジオグラ
フィーよりも速いが、ニック翻訳法は高度に熟練した人
員を必要とする。その上、ビオチニル化ＵＴＰ　（ウリ
ジントリホスフェート）を使用するビオチニル化は、チ
ミジン含有ポリヌクレオチドについてのみ有効である。

他のヌクレオシドトリホスフェートの使用は、ビオチン
を使用するＡ（アデニン）またはＧ（グアニン）または
Ｃ（シトシン）（−ＮＨ２を含有する）の化学的誘導体
化は、訓練した有機化学者を技能を必要とする。

Ｃ１細胞の溶解 本発明は、また、全細胞のＤＮＡを開放し、そして光化
学的に利用できるようにする、全細胞を効率よく溶解す
る方法を提供する。多細胞の動物から誘導される真核生
物の細胞は比較的穏和な条件下に容易に溶解されるが、
単細胞の真核生物および原核生物、ことにグラム陽性原
核生物は、化学的性質が複雑でありかつそれらの細胞壁
の架橋の程度のために、溶解がより困難である。化学的
−酵素的または物理的な手段によって、これらの耐性の
有機体を効率よく溶解する方法は実際に存在するが、こ
れらの方法はしばしば複雑であり、時間を消費し、そし
てＤＮＡの一耐性を保存するためには不敵切である。

したがって、本発明の目的は核酸含有試料中の微生物を
検出する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、ｌより多い核酸配列の存在につい
て同時に７ツセイする方法を提供することである。

他の目的は、特定の原核生物または真核生物のＤＮＡ配
列を同定する方法および個々の遺伝子のアレルを区別す
る方法を提供することである。

本発明の他の目的は、未知の試験試料を標識する簡単な
光化学的方法を提供することである。

本発明のほかの目的は、プローブを固定化した未知の標
識しない試験試料とプローブを交雑させるとき、交雑お
よび洗炸後残留する標識の型が未知の試料中に存在する
核酸配列の型を決定するように、異なる種類の標識でプ
ローブを標識することである。

本発明のなお多の目的は、プローブおよび／または試験
試料として全染色体核酸を使用することである。

また、本発明は固定化されたプローブとしてオリゴヌク
レオチドを使用することに関する。

これらの目的および他の目的および利点は、本発明に従
い、核酸含有試験試料中の核酸配列を検出する方法につ
いて実現される。

この方法は、工程： ａ）試験試料を準備し、この準備は試験試料中の有機体
または細胞または細胞破片の核酸をを標識することを含
み、 ｂ）　１種または２種以上の既知の微生物または真核生
物源、または特定の遺伝子またはそれらのアレル（ａ　
１１　ｅ　１）を表わす配列を固定化することによって
、１または２以上のプローブを調製し。

Ｃ）交雑条件下に、標識した一本鎖の試料の核酸および
固定化したオリゴヌクレオチドまたは一本鎖（プローブ
）の核酸または固定化したオリゴヌクレオチドを接触さ
せて、交雑した標識核酸を形成し、そして ｄ）標識を検出することによって、交雑した核酸につい
てアッセイする、 を含んでなることを特徴とする。

この方法は、さらに、工程（ａ）からの標識された核酸
を変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）して標識され変性された核
酸を形成することをさらに含む。

本発明によれば、標識された核酸の試験試料をいくつか
の異なる型のＤＮＡプローブと交雑のために同時に接触
させる。核酸の試験試料を標識し、そしていくつかの標
識されない固定化プローブと交雑させる。プローブの位
置を固定し、そして交雑径検出される標識されたプロー
ブは、試験試料が対応するプローブに対して相補的な核
酸配列を宥することを示すであろう。

いくつかの微生物学的系または１種または２種以上遺伝
子の異なるアレルのための核酸プローブは、固体の支持
体、例えば、ニトロセルロース紙上の別々に固定化する
ことができる。試験試料の核酸は標識され、そして溶液
中に残留する。固定化されたプローブを含有する固体の
物質を、交雑条件下に、標識された試験核酸溶液と接触
させる。固体の物質を洗浄して交雑しない核酸を除去し
、そして標識をアッセイする６　１種または２種以上の
プローブもつ標識の存在は、試験試料がそれらのプロー
ブに対して実質的に相補的な核酸を含有し、それゆえ、
例えば、特定の微生物学的系による感染から由来するこ
とを示す。

標識付けは生きている全細胞または細胞リゼイト（ｌｙ
ｓａｔｅ）中で達成することができ、そして非アイソト
ープ的であることができる。

本発明は、また、グラム陽性バクテリアおよびダラム陰
性バクテリアの両者から核酸を開放させる特別の溶解条
件に関する。

本発明は、さらに、 ａ）１種または２種以上の既知の微生物または真核生物
源の一本鎖ＤＮＡをその上に固定化して含有する固体の
支持体、例えば、既知の微生物または真核生物のドツト
またはスポットを含有するストリップ、 ｂ）試験試料の核酸を標識するための試薬、Ｃ）試験試
料中の核酸を変性するための試薬、および ｅ）交雑試薬、 を含んでなることを特徴とする試験試料中の微生物また
は真核生物を検出するためのキットに関する。

交雑した核酸の化学発光の検出のために、キットは化学
発光検出のための試薬をさらに含む。

上に記載いたキットにおいて、標識付けのために試薬は
標識についての説明するとき下に記載する。

ＤＮＡを開放しかつ変性するための試薬は、水酸化ナト
リウムおよび溶解剤、例えば、洗浄剤およびリゾチーム
を包含する。

典型的な交雑試薬は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリ
ウム、ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）、ウシ血清
アルブミン、脱脂乳または硫酸デキストランおよび必要
に応じてホルムアミドの混゛　　合物を含む。

核酸は、好ましくは、光化学的に、光反応性フロクマリ
ンまたはツェナトリジン化合物を使用して核酸を標識に
結合することによって標識され。

そして標識は普通の方法で、例えば、蛍光検出により「
読む」かあるいはアッセイすることができる。

こうして、最終生成物は、（ａ）核酸成分、（ｂ）核酸
成分に光化学的結合したインター力レイター（ｉｎｔｅ
ｒｃａｌａｔｏｒ）または他のＤＮＡ結合性配位子、お
よび（ｃ）（ｂ）に化学的に結合した標識からなる、標
識された核酸プローブである。

この光化学的方法は、生化学的に感受性の物質のための
通常の化学的結合法よりも、好適な反応条件を提供する
。インター力レイターおよび標識を、まず、結合し１次
いで核酸と光化学的に反応させるか、あるいは核酸を、
まず、インター力レイターと光化学的に反応させ、次い
で標識に結合することができる。

核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを標識または反応性部位、
例えば、ハブテンに結合する一般的方法は次の通りであ
る： 標識 ＋ 光反応性 インター力レイター ハプテン変性された 光反応性 インター力レイター ↓　　二本鎖ＤＮＡ ハプテン変性されたＤＮＡ 核酸の交雑可能な部分が二本鎖の形態である場合、次い
でこのような部分を変性して交雑可能な一木鎖部分を生
成する。あるいは、標識されたＤＮＡが一本鎖形態です
でに存在する交雑可能な部分からなるとき、このような
変性を必要に応じて回避することができる。あるいは、
検出すべき配列の存在下にのみ二本鎖Ｄ’ＮＡを発生す
る交雑フォーマットを使用して交雑が起こった後、前記
ＤＮＡを本発明のアプローチによって標識することがで
きる。

特異的な効率よい光化学的生成物を生成するために、核
酸成分および光反応性インター力レイター化合物を特別
な方法で暗所で反応させることが望ましい。

ＤＮＡへの結合のため、アミンメチルプソラレン、アミ
ノメチルアンゲリシンおよびアミノアルキルエチジウム
またはメチジラムアジド類はとくに有用な化合物である
。それらは二本１ＤＮＡへ結合し、そして複合体のみが
先付加物を生産する。標識した二本鎖ＤＮＡを変性して
交雑可能な一本鎖区域を生成しなくてはならない場合、
ＤＮＡの２木の鎖と単一の先付加物との同時の相互作用
を防止するような条件を用いる。プローブまたは試料の
交雑可能な一本鎖部分に沿った変性の頻度は交雑に交雑
を妨害するほど大きくないことが必要であり、それゆえ
２５、より通常５０、好ましくは１００ヌクレオチド塩
基につき１以下の変性部位が存在することが好ましい、
アンゲリシン誘導体はモノ付加物の形成のためにはプソ
ラレン化合物よりもすぐれる。一本鎖ＤＮＡをある余分
の二本ｆｉＤＮＡに共有的に取り付ける場合、フエナン
トリジウム化合物およびプソラレン化合物は暗所で二本
鎖ＤＮＡと特異的に相互作用するので、これらの化合物
を使用することが望ましい。

標識のためＤＮＡを変更するための結合した試薬を合成
する化学は、すべての場合について類似し、後に詳述す
る。

ＤＮＡ化合物は一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮ
Ａまたはそれらの断片、例えば、制限酵素により生産さ
れるものあるいは比較的短いオリゴマーであることだえ
できる。

核酸成分を標識へ結合するために使用する本発明のＤＮ
Ａ結合性配位子は、既知のＤＮＡ結合性配位子の任意の
適当な光反応性形態であることができる。とくに好まし
いＤＮＡ結合性配位子は。

次の通りである：インター力レイター化合物、例えば、
フロクマリン類、例えば、アンゲリシン（イソプソラレ
ン）またはプソラレンまたはＤＮＡと光化学的に反応す
るそれらの誘導体、例えば、４′−７ミノメチルー４，
５゛−ジメチルアンゲリシン、４°−アミノメチルトリ
オキシサラン（４°−アミノメチル−４，５’、８−）
リメチルーブソラレン、３−力ルポキシ−５−または−
８−または−ヒドロキシープソラレン）、ならびに七ノ
ーまたはビス−アジドアミノアルキルメチジラムまたは
エチジウム化合物。

コノような挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ　　ａ
ｇｅｔＳ）のとくに有用な光度応性の形態はアジドイン
ター力レイターである。それらの反応性二トレン類は長
い波長の紫外線または可視光線で容易に発生し、そして
アリールアジド類の二トレン類はそれらの転位生成物よ
りも挿入反応を好む［ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら、メン
ツズφイ乞働エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　土工
　旦ｎｚ　　ｍｏｌｏｇ　　）、６４，６４４（１９７
７）参照］０代表的なアゾインター力レイターは３−ア
ジドアクリジン、９−アジドアクリジン、エチジウムモ
ノアジド、エチジウムジアジド、エチジウムモノアジド
［ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）ら、ＪＡＣ５，１０
４，４２６５（１９８２）１．４−アジド−７−クロロ
キノリンおよび２−アジドフルオレンである。特異的核
酸結合性アジド化合物はフォースター（Ｆｏｒｓｔｅｒ
）ら、駿改ｎ璽叉（Ｎ　ｕ　ｃ　１　、　　Ａ　ｃ　ｉ
　ｄ　５Ｒｅｓ、）、１３１、　（１９８５）、７４５
に記載されている。このような化合物の構造は１次の通
りである： 他の有用な光反応性インター力レイターは、ピリジン残
基と［２＋２］シクロ付加物を形成するフロクマリン類
である。アルキル化剤、例えば、ビスタロロエチルアミ
ン類およびエポキシド類またはアジリジン類、例えば、
アフラトキシン類、多環式炭化水素のエポキシド類、ミ
ドマイシンおよびノルフィリンＡを使用することもでき
る。

インター力レイター化合物の非制限的例は、アクリジン
色素、フエナントリジン類、フェナジン類、フロクマリ
ン類、フェノチアジン類およびキノリン類を包含する。

本発明による核酸成分に結合した標識は、検出可能な物
理的または化学的性質を有する任意の化学的基または残
基であることができ、すなわち、標識付けは化学的反応
または物理的吸着によって実施することができる。標識
はインター力レイター化合物へ化学的に結合できる機能
的化学的基を有するであろう、このような標識物質は免
疫アッセイにおいてよく開発されており、そして一般に
、このような方法において有用なほとんどの標識を本発
明において応用することができる。

とくに有用なものは次の通りである：酵素的に活性な基
、例えば、酵素［クリニカルΦケミスト！ｊ−（ＣＩｉ
ｎ、　　Ｃｈｅｍ、）、（１９７６）、且、１２３２；
米国再発行特許ｌＧ３１゜００６号および英国特許！２
，０１９，４０８号参照］、酵素基質（米国特許第４，
４９２，７５１号参照）、補酵素（米国特許第４，２３
０，７９７号および同第４，２３８，５６５号参照）お
よび酵素阻害剤（米国特許第４．２３４，７９２号参照
）；蛍光性物質［クリニカル・ケミスト工二（ＣＩｉｎ
、　　Ｃｈｅｍ、）、（１９７９）、且ゑ、３５３］、
発色団；発光性物質、例えば、化学発光性物質および生
物発光性物質（米国特許第４，３８０，５８０号参照）
；特異的に結合性の配位子、例えば、ビオチン（欧州特
許明細書６３．８７９号参照）またはハプテン（ＰＣＴ
発行８３−２２８６号参照）；および放射性同位元素、
例えば、３　Ｈ，３５ｓ、　３２　ｐ、　Ｉ　２　ＳＩ
および１４Ｃ０このような標識はそれら自身の物理的性
質（例えば、蛍光性物質、発色団および放射性同位元素
）またはそれらの反応性および結合性（例えば、配位子
、酵素、基質、補酵素および阻害剤）に基づいて検出さ
れる０例えば、コファクター！！ｓ識種は、酵素（また
はサイクル系を用いる場合複数の酵素）（前記酵素のた
めの標識はコファクターおよび前記酵素のための１また
は２以上の基質）を添加することによって検出すること
ができる。ハプテンまたは配位子（例えば。

ビオチン）で標識した種は、検出可能な分子で標識した
配位子に結合する蛋白質（例えば、アビジン）またはハ
プテンに対する抗体を添加することによって検出できる
。抗原を標識として使用することもできる。このような
検出可能な分子は測定可能な物理的性質（例えば、蛍光
または吸収）をもつ分子あるいは酵素反応に参加する物
質（例えば、上をリストを参照）であることができる６
例えば、基質に作用して測定可能な性質をもつ生成物を
生成する酵素を使用できる。後者の例は、ベーターガラ
クトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびペルオ
キシダーゼを包合するが、これらの限定されない、その
場の交雑の研究のために、理想的には、最終生成物は水
不溶性である。

他の標識、例えば、色素は、当業者にとって明らかであ
る。

標識はインター力レイター化合物、例えば、アクリジン
色素、フェネントリジン類、フェナジン類、フロクマリ
ン類、フェノチアジン類およびキノリン類へ直接の化学
的結合、例えば、共有結合を服結合により、あるいは間
接結合、例えば、マイクロカプセルまたはリポソーム中
に標識を組込み、次いでこれらをインター力レイター化
合物に結合することによって結合される。標識をインタ
ー力レイター化合物へ結合する方法はこの分野にお９い
て本質的に知られており、そして任意の便利な方法を用
いて本発明を実施することができる。

有利には、インター力レイター化合物は、まず、標識と
化学的に結合し、その後核酸成分と結合する０例えば、
ビオチンはカルボキシル基を有するので、それをフロク
マリンと、フロクマリンの光化学的反応性またはビオチ
ンの生物学的活性を妨害しないで、アミドまたはエステ
ルの形成によって１例えば、次のようにして結合するこ
とができる： またはビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド十　Ｐ
ＮＨ２ビオチン−ｐ−ニトロフェニルエステルビオチン
十Ｒｏｌｌ　　　　　　　　：　　ビオチンＣｏ　ＯＲ
例えば 他のアミノメチルアンゲリシン、ブソラレンおよびフエ
ナントリジウム誘導体を同様に反応させることができ、
また同様にハロゲン化フエナントリジウムおよびそれら
の誘導体、例えば、塩化アミノプロビルメチジラム、す
なわち、 を反応させることができる［ヘルツバーブ（Ｈｅ８２）
参照］。

あるいは、二官能性試薬、例えば、ジチオビススクシジ
ニルプロビオネートまたは１．４−ブタンジオールジグ
リシジルエーテルを、再び溶媒、比率および反応条件に
関して既知の方法で、使用して光化学的に反応性の分子
を標識と直接結合することができ、ここで反応成分はア
ルキルアミノ残基を有する。ある種の二官能性試薬、多
分グルタルアルデヒド、は結合するが、核酸を変性し。

こうしてアッセイを妨害することがあるので、適当でな
いことがある。日常の予備的注意を払ってこのような困
難を防止することができる。

標識した核酸を作るときの特定の配列は変更することが
できる。こうして、例えば、アミノ置換プソラレンを、
まず、核酸と光化学的に結合させ、ここで生成物はアミ
ン側基を有し、この基によってそれを標識または反応性
部位へ結合させることができる。あるいは、プンラレン
を、まず、標識、例えば、酵素に結合し、次いで核酸に
結合させることができる。

係属中の１９８５年１２月１８日提出の欧州特許出願第
８５　１１６　１９９．２号に記載されているように、
本発明は、また、（ａ）核酸成分、（ｂ）核酸成分に光
化学的結合した核酸結合性配位子、あ（Ｃ）標識、およ
び（ｄ）（ｂ）および（Ｃ）を化学的に結合するスペー
サーからなる、標識された核酸を包含する。

有利には、スペーサーは約４０原子まで、好ましくは約
２〜２０原子の鎖を含み、前記原子は炭素、酸素、窒素
およびイオウから成る群より選択されから選択される。

このようなスペーサーは、ペプチド、炭化水素、ポリア
ルコール、ポリエーテル、ポリアミン、ポリイミンおよ
び炭水化物、例えば、−グリシル−グリシル−グリシル
−および他のオリゴペプチド、カルボニルジペプチド、
およびオメガ−アミノ−アルカン−カルボニル残基、例
えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）　ｓ　−Ｃｏ−、スペルミン
またはスペルミン基、アルファ、オメガ−アルカンジア
ミン基、例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ　　ＮＨ−また
は−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨなどから成る群より選
択される構成員の多官能性基であることができる。糖、
オリエチレンオキシド基、グリセリル、ペンタエリスリ
トールなどの基は、また、スペーサーの役目をすること
ができり。

これらのスペーサーは核酸結合性配位子および／または
標識に直接結合することができるか、あるいは結合はカ
プラー、例えば、ジチオビススクシニミジルプロピオネ
ート、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、
ジシソシアネート、カーポジイミド、グリオキサール、
グルタルアルデヒドなどの二価の基を含むことができる
。

スペーサーはプローブをつくる方法の任意の段階で組込
むことができる。

ａ−ｂ−ｄ−ｃ 上に定義した。こうして、配列は次の任意のものである
ことができる： ａ＋ｂ＋ｄ＋ｃ。

ｂ＋ｄ＋ｃ＋ａ、 ｄ＋ｃ＋ｂ＋ａ。

ｂ＋ｄ＋ａ＋ｃ、など。

個々の工程のための条件は化学においてよく知られてい
る。

標識が酵素であるとき１例えば、生成物は究極的には適
当な媒体上の配置され、そして触媒反応の程度を決定す
る。こうして、酵素がホスファターゼであるとき、媒体
はニトロフェニルホスフェートを含有することができ、
そして発生したニトロフェノールの量を色の観測により
監視する。酵素がベーターガラクトシダーゼであるとき
、媒体は同様にニトロフェノールを遊離する０−ニトロ
フェニル−Ｄ−ガラクト−ピラノシドを含有することが
できる。

本発明の標識した核酸はすべての普通の交雑アッセイの
フォーマットに適用可能であり、そして一般に、多分標
識された核酸を含む交雑生成物または凝集物の形成に基
づく任意のフォーマットに適用することができる。とく
に、本発明の独特の標識核酸は溶液および固相の交雑フ
ォーマットにおいて使用することができ、後者のフォー
マットに場合において、試料またはプローブの核酸を含
むフォーマットおよびサンドイッチのフォーマットが包
含される。

核酸のプローブは、検出すべき配列に対して実質的に相
補的でる。あるいはそれと相同の少なくとも１種の一本
鎖塩基配列を含むであろう、しかしながら、このよな配
列は単一の連続のポリヌクレオチドセグメントである必
要はなく、非相同配列によって中断された２またはそれ
より多い個々のセグメントから構成されることができる
。これらの非相同配列は直線であるか、あるいは自己相
補性でありそしてヘヤピンのループを形成することがで
きる。さらに、プローブの相同区域は３゛−および５°
−末端において、非相同配列、例えば、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡあるいは伸長のために相同配列が挿入されているベ
クターによってフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）され
ていることができる、いずれの場合においても、分析試
薬として提供されるプローブは問題の試料の核酸で１ま
たは２以上の点において検出可能な交雑を示すであろう
、線状または環状の一本鎖ポリヌクレオチドをプローブ
の要素として使用することができ、主要部分または小部
分はポリヌクレオチドの１または２以上の鎖と相補的で
る二重らせんであり、ただだし重要な相同の１または２
以上のセグメントは一本鎖の形態であり、そして試料の
ＤＮＡまたはＲＮＡとの交雑に利用可能でなくてなはな
らに、有用なプローブは環状プローブであり、ここで相
同プローブの配列は木質的に唯一の一本鎖の形態である
［とくに、ツー（Ｈｕ）およびメッシング（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ）、ｉｌｆ＋（Ｇｅｎｅ）、１７：２７１　（１９
８２）参照］、。

本発明の核酸プローブは普通の交雑技術において使用す
ることができる。改良がなされかつ概念的に新規なフォ
ーマットが開発されたので、これらは本発明に容易に適
用することができる。とくに有用な慣用の交雑フォーマ
ットは、試料の核酸またはポリヌクレオチドプローブを
固体の支持体に固定化されるもの（固相交雑）およびポ
リヌクレオチド種がすべれ溶液中に存在するもの（溶液
交雑）を包含する。

固相交雑のフォーマットにおいて、交雑に酸化するポリ
ヌクレオチド種の１つを適当な方法でその一本鎖の形態
で固体の支持体へ固定する。有用な固体の支持体はこの
分野においてよく知られており、そして共有結合または
非共有結合により核酸と結合するものを包含する。一般
に疎水性結合を包含する非共有結合の支持体は、天然に
産出するポリマー物質および合成ポリマー物質、例えば
、ニトロセルロース、誘導化ナイロンおよびフッ化ポリ
炭化水素を包含し、これらは種々の形態、例えば、フィ
ルター、ビーズまたは固体のシートの形態である。共有
結合する支持体（ちょうど上に述べたフィルター、ビー
ズまたは固体のシートの形態）は、また、有用であり、
そして化学的に反応性の１または２以上の基を有する物
質、例えば、ジクロロトリアジン、ジアゾベンジルオキ
シメチルなどからなり、それらはポリヌクレオチドへの
結合のために活性化することができる。

オリゴヌクレオチドの非共有結合の固定化は固体の支持
体、例えば、ニトロセルロース紙の上では無効であるこ
とが知られている０本発明は、また、オリゴヌクレオチ
ドの固定化の新規な方法を記載する。これはオリゴヌク
レオチドをポリヌクレオチドキナーゼによってホスホリ
ル化することにより、あるいは５′−ホスホリル化オリ
ゴヌクレオチドを結合して、固定化を行うことのできる
マルチ−オリゴヌクレオチド分子を生成することによっ
て達成される。キナーゼおよび結合の反応のための条件
は、標準の教科書１例えば、立上２０−ニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉｎ１）　、　Ｔ　、マニア
チス（Ｍａｎｉ　ａｔ　ｉ　ｓ）、Ｅ、Ｆ、ｙリチシュ
（Ｆｒｉｒｓｃｈ）およびＪ、サンプルツク（Ｓａｎｂ
ｒｏｏｋ）、：Ｉ　−ルド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−１（１９８２）、１−１２３ページに記載さ
れている。

典型的な固体の支持体交雑技術は、支持体に試料の核酸
を一本鎖の形態で固定化して開始する。

この初期の工程は試料からの相的鎖の再アニーリングを
木質的に防止し、そして検出可脂性を造作居するために
試料の物質を支持体上に濃縮する手段として使用するこ
とができる０次いで、ポリヌクレオチドプローブを支持
体と接触させ、そして交雑をここに記載するようにして
標識をの測定により検出する。固体の支持体は検出すべ
き配列に対して交雑した標識されたプローブを交雑しな
かったプローブから分離するための便利な手段を提供す
る。

問題の他の方法はサンドインチ技術であり、ここでプロ
ーブの相同配列の２つの相互に排他的な断片の一方を固
定化し、そして他方を標識する。

問題のポリヌクレオチド配列の存在は、固定化されかつ
標識されたプローブのセグメントの二重の交雑を生ずる
。それ以上の詳細については、４ヱヱＸＩＩヱヱ・エン
ジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ土ｎ　　Ｅｎｚ　　ｍｏｌ
ｏ　　ｙ）、６５：４６８（１９８０）および３ｊＬｆ
Ａユ（Ｇｅｎｅ）、２１；７７−８５　（１９８３）参
照。

本発明にとって、交雑系の移動相は既知の種類および／
または変性されたＤＮＡの１系列またはマトリックスの
スポットであることができる。これは適当な小さい体積
の自然ＤＮＡを乾燥ニトロセルロースまたはナイロンの
シート上に沈殿させ、このシートを水酸化ナトリウム溶
液上に浮かばさせてＤＮＡを変性し、このシートを中和
溶液中ですすぎ１次いでこのシートをベーキングしてＤ
ＮＡを固定することによって、最も簡単に調製される。

ＤＮＡ：ＤＮＡの交雑前に、交雑の間に付加されたＤＮ
Ａの非特異的結合を阻止する溶液とシートを通常接触さ
せる。

本発明は全ゲノムＤＮＡ、細胞中に存在する全核酸、全
細胞リゼイト、または溶解されない全細胞を包含する。

標識された物質がいったん調製されると、それは検出の
ために、すなわち、特異的核酸交雑アッセイによりある
種の特異的ゲノム配列の存在または不存在を検出するた
めに使用できる。

本発明による１つの方法はヒト試料からの細胞の分離を
含むか、あるいはヒト試料を光化学的に反応性の核酸結
合性インターカレイテイング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉ
ｎｇ）配位子との混合によって直接処理する。この混合
物を試料の型に依存してインキュベーションする。試料
が溶解した細胞である場合、それは数滴〜５分の期間の
間インキュベーションし、そして全細胞または部分的に
溶解した細胞を使用するとき、２分〜３時間の間のイン
キュベーションを用いる。混合およびインキュベーショ
ン後、試料混合物全体を特定の波長で光化学的に反応性
のＤＮＡ結合性配位子と試験試料との間の共有インター
力レイシ、ンのために照射する０次いで、この標識物質
を特定の交雑条件下に特異的プローブと交雑させる。

交雑後、反応しなく交雑しない標識された試験試料を洗
浄によって除去する。洗浄後、雑種は試験試料が支持す
る標識を介して検出され、これは特異的プローブと特異
的に交雑される。

本発明は驚ろくべきものである。なぜなら、ヒトゲノム
試料において、単一のコピー遺伝子の量は非常に低く、
例えば、１０００塩基対の制限断片が交雑の区域である
場合、全ヒトゲノム試料中のこのような配列の確立は１
００万分の１であるからである。この結論は、ヒトゲノ
ム試料が３×１０９塩基対を有し、モして１００塩基対
がその数のｌ／３．０００．０００であろうという文献
から推定することによって誘導された。自動的に、はぼ
５〜１０ＩＬｇの核酸を含有すると）ＤＮＡの試料にお
いて、対応する配列のわずかに５〜ｌＯピコグラムが有
効であり、そして非特異的ＤＮＡのほとんど大部分は真
の信号より多くのバックグラウンドを生成するであろう
、しかし反応後、結果は特異的であるばかりでなく、か
つまた予期されないほどに高い感度を有するということ
は、驚くべきことである 操作可能性の特定の理論に拘束されたくないが、予期さ
れない感度についての理由は特異的プローブへ結合した
非特異的核酸雑種の網状組織が形成し、こうして試料の
量を増幅したためであろう、典型的な実施例において示
すように、プラスミドを含有する１９ヌクレオチド長さ
の特異的配列を固定化し、そして、光化学的に標識され
た試験試料の５７Ｌｇ当量と交雑させ、そしてこのよう
な雑種から得られた信号を非常に容易°に検出する。標
識材は方法に関連する問題のために、これはいかなる技
術によっても達成されなかった。

本発明は新規な交雑技術に関し、ここでプローブを固定
化し、モして真核生物の核酸を標識し、そして固定化さ
れた標識されないプローブと交雑させる０本発明の１つ
の驚くべき特徴は、試験試料を標識することによって単
一または多数のコピー遺伝子の欠損を検出することであ
る。過剰の標識された交雑配列についての要件は存在し
ないので１本発明の方法はより特異的である０本発明に
おいて、異なる遺伝子の欠損の同時の検出を特異的プロ
ーブの固定化によって容易に実施することがマきる。

例えば、本発明を用いることによって、置型赤血球貧血
に関係づけられた遺伝子欠陥について特異的なオリゴヌ
クレオチドプローブおよびアルファーサラセミアについ
て特異的なプローブをニトロセルロース紙上に固定化し
、試験試料を標識し、そして標識された試験試料を固定
化されたプローブと交雑することができる。部分的に精
製したあるいは精製しない核酸試料（細胞のリゼイトま
たは全細胞）を、特異的交雑可能性に影響を及ぼさない
で、感受性分子で光化学的に標識することができるとい
うことは、驚くべきことである。

本発明は、また、高等有機体、例えば、動物またはヒト
からの試料中の真核生物（原生生＃！Ｉ）を検出するこ
とに関する。

真核生物は、藻類、原生生物、菌・カビ類および粘菌を
包含する。

用語「藻類」は一般にクロロフィル含有原生生物を意味
し、その説明は次の文献に記載されている：Ｇ、Ｍ、ス
ミス（Ｓｍｉ　ｔ　ｈ）　、クリプトガミツク・ボタ＝
−（Ｃｒｙｔｏｇａｍｉｃ　　Ｂ。

ｔａｎｙ）、第２版、Ｖｏ　ｌ　、　１．藻類および菌
・カビ類（Ａｌｇａｅ　　ａｎｄ　　Ｆｕｎｇｉ）、マ
クグロー−ヒル、　（１９５５）。

本発明による真核生物の配列は、バクテリアおよびウィ
ルスを除外して、すべての病気の配列を包含する。した
がって、例えば、遺伝病は本発明にまた包含される。こ
のような遺伝病の非制限的例は次の通りである： 影響領域　　　　　　　　　旌思 代謝　　　　急性間欠的ポルフィリン症班紋状ポルフィ
リン症 アルファｌ−抗トリプシン欠乏症 細胞性線維症 フェニルケトン尿症 テイザックス症 ムコポリサツカリド−シス（Ｍｕｃ ｏｐｏ　１ｙｓａｃｃｈａｒｉ　ｄｏｓｉｓ）Ｉ ムコポリサツカリド−シスＩＩ ガラクトセミア（Ｇａｌａｃｔｏｓ ａｅｍｉａ） ホモシスチヌリア（Ｈｏｍｃｙｓｔ ｉｎｕｒｉａ） シスチヌリア（Ｃｙｓｔｉｎｕｒｉ ａ） メタクロＳツク参ロイコジストロ フィー　（Ｍｅｔ　ａｃｈｒｏｍｉ　ｃｌｅｕｃｏｄｙ
ｓｔｒｏｐｈｙ） 神経系　　　ハン≠ングトンのコレア（Ｈｕｎ、ｔｉｎ
ｇｔｏｎ’ｓ　　　ｃ　　ｈ　　ｏ　　ｒ　　ｅａ） ネウロフィブロマトーシス（Ｎｅｕ ｒｏｆｆｂｒｏｍａｔｏＳｆｓ） ミオトニック・ジストロフィー（Ｍ ｙｏｔｏｎｉｃ　　ｄｙｓｔｒｏｐｈ チューベロス・スクレロシス（Ｔｕ ｂｅｒｏｕｓ　　５ｃｌｅｒｏｓｉ Ｓ） ネウロジエニツクφムスクラー〇ア トロ７４−ス（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉ ｃ　　ｍｕｓｃｕｌａｒ　　ａｔｒｏｐｈｉｅｓ） 血液　　　　置型赤血球貧血 べ一ターサラセミア コンフェニタル・スフェロサイトー シス（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　　５ｐ ｈｅｒｏｃｙｔｏｓｉｓ） ヘモフィリア（Ｈａｅｍｏ　ｐ　ｈ　ｉ　１ｉａ）Ａ 腸　　　　　ボリポシス・コリ（Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ　
　ｃｏｌｉ） 腎　　　　　ポリシスチック病（Ｐｏｌｙｃｙｓし　ｉ
　　ｃ　　　　ｄ　　ｅ　　ｓ　　ｅ　　ａ　　ｓ　　
ｅ）眼　　　　　優性盲 網膜芽腫 耳　　　　　優性早期子供おしくＤｏｍｉｎａｎｔ　　
ｅａｒｌｙ　　ｃｈｉｌｄｈｏ。

ｄ　　ｄｅａｆｎｅｓｓ） ドミナント拳オトスレロシス（Ｄ。

ｍ１ｎａｎｔ　　ｏｔｏｓｃｌｅｒ。

５ｉｓ） 循環系　　　単性過コレステロール血症歯　　　　　デ
ンチノゲニシスΦインパーフェクタ（Ｄｅｎｔｉｎｏｇ
ｅｎｉｓｉｓ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ） アメロゲニシス・インパーフェクタ （Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｓｉｓ　　ｉｍ ｐｅｒｆｅｃｔａ） 骨格　　　　ダイアフィジカル・アクラシア（Ｄｉａｐ
ｈｙｓｉｃａｌ　　ａｃｌａｓ ｉａ） タナトホリック魯ドワーフィズム （Ｔｈａｎａｔｏｐｈｏｒｉｃ　　　ｄｗａｒｆｉｓｍ
） オスレオゲネスーインパーフェクタ （Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓ　　ｉｍｐｅ ｒｆｅｃｔａ） マルファン症候群（Ｍａｒｆａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ） アコンドロプラシア（Ａｃｈｏｎｄ ｒｏｐｌａｓｉａ） ニーレース−ダンロス症候群（Ｅｈ ｅｒＳ−Ｄａｎｌｏｓ　　５ｙｎｄｒ ｏ　ｍ　ｅ　） オステオペロシス・タルダ（Ｏｓｔ ｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ　　ｔ　　ａ　ｒ　ｄａ） クレット・す７プ／パレイト（Ｃ１ ｅｆｔ　　ｔｉｐ／ｐａｌａｔｅ） 皮膚　　　　イチシオシス（ＩｃｈｔｈｙｏｓｉＳ） 運動　　　　筋肉ジストロフィ一 本発明による核酸プローブは、試験試料の配列を決定す
る配列である。プローブは通常ＤＮＡ。

ＲＮＡ、リポ−およびデオキシリポ核酸の混合コポリマ
ー、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド
の残基を含有するオリゴヌクレオチドあるいはそれらの
変性された形態である。このようなプローブの配列は試
験配列に対して相補的であるべきである。相補的性質の
程度は、交雑に形成される二重らせんの安定性を決定す
るであろう、プローブは、また、共有結合した非相補的
核酸を有することができる。それらは標識反応の部位と
してはたらくことができる。

核酸は、好ましくは、光化学的手段によって標識され、
ここで標識に核酸を結合する光反応性ＤＮＡ結合性フロ
クマリンまたはフエナントリジン化合物を使用し、前記
標識は普通の方法で、例えば、蛍光検出によって「読む
」かあるいはアッセイすることができる。

本発明の１つの用途は、生物学的流体中のバクテリア種
の同定である。１つの用途において、尿道の感染を有す
るか、あるいはそれが疑われる患者からの尿の試料は標
識されたＤＮＡまたはＲＮＡの調製のための物質を提供
することができ、一方円体の支持体のストリップ、例え
ば、ニトロセルロースまたはナイロンから作られたスト
リップは、感染の原因であると思われる。いくつかのバ
クテリアの各々からの変性し精製したＤＮＡの既知量の
個々のドツトまたはスポットを含有することができる。

標識された未知プローブおよび標識されないプローブの
フォーマットは、標準の方式と逆であり、ある数の可能
性のうちで、単一の標識でもってのみ試料中の右機体の
種の同定を可能とする。

それは、また、試料中の１つより区別可能なバクテリア
の種の存在を同時に識別できるようにする（混合物中の
ＤＮＡは標識手順において識別されないと仮定する）、
シかしながら、それは、簡単な方法で、混合試料中のＤ
ＮＡの量（それゆえ、バクテリアの濃度）の推定以上の
ことを可能としない、このような定量のために、試料の
ＤＮＡを標準ＤＮＡのスポットと一緒に１系列の希訳ス
ポットにおいて固定化す、そしてプローブのＤＮＡを標
識する。

尿道の感染は、はとんど常に１次の６種類の微生物の１
つのモノクローナル生長のためである二大腸菌（ＵＴＩ
の６０〜９０％）、プロテウス種（ＵＴＩのＰｒｏｔｅ
ｕｓ　　ｓｐｐ、）（ＵＴＩの５〜２０％）、クレブシ
ェラ＠（ＵＴＩのに１ｅｂｓｆｅｌｌａ　　ｓｐｐ、）
（ＵＴＩの５〜２０％）、スタフィロコッカス種（Ｓｒ
ａｐｈｙｌＯＣＯＣＣｕＳ　　Ｓｐｐ、）（ＵＴＩの４
〜２０％）、ストレプトコッカス１ｉ（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ　　ｓｐｐ、）（ＵＴＩの２〜５％）。

シュードモナス（ＰＳｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびいく
つかの他のダラム陰性かん軟菌（ｒｏｄ）類は一緒にな
ってＵＴＩに低い百分率を説明する。不適切な試料の収
集のしるしである尿の試料のふうつの汚染はラクトバシ
ルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である。

尿の試料中の感染を定めるバクテリアの濃度は、約１０
５７ｍ１である。

尿道の感染に適用可能な標識しないプローブの交雑のフ
ォーマットは、上の種のリストからのＤＮＡのヤトリッ
クスを有することであり、これらは変性され、支持体、
例えば、ニトロセルロースの上の固定化され、そして標
識されない未知の試料中に期待することのできるバクテ
リアのＤＮＡの濃度に適切な量の範囲内にある。

ビオチニル化全ゲノムＤＮＡプローブとの標準の交雑は
、５〜１０ｍ１において、約ｏ、ｘＩＬｇ／ｌのプロー
ブ濃度で起こり、約ＬｏｎＨの変性ＤＮＡを含有するス
ポットへのプローブの交雑は容易に検出可能である。約
５　ｆ　ｇ／バクテリア細胞のＤＮＡが存在するので、
試料についてＩＪＬｇの標識されたＤＮＡを含有するた
めには、２×ｌＯ８のバクテリアを集めることが必要で
ある。感染がほぼ１０５バクテリア／　ｍ　ｌを有する
尿を生成する場合、試料から標識すべきバクテリアＤＮ
Ａは２０００ｍ１から濃縮される。１０ｎｇより多い１
例えば、１１００ｎまたはＩｇｇの標識されないプロー
ブＤＮＡをドツト中に固定化する場合、あるいは交雑体
積を減少させる場合、標識された未知の調製に要求され
る尿の体積はほぼ数十分の１ｍｌである。

固定化され、変性され、標識されないプローブのＤＮＡ
を含有するドツトのストリップは、次の構成を有する： ｌｎｇ　　Ｌｏｎｇ　　１００ｐ！ 大膓菌　　　　　　ｏ　　　　ｏ　　　　　　。

プロテウス　　　　ｏ　　　　ｏ　　　　　　。

クレブシェラ　　　ｏ　　　　ｏ　　　　　　。

スタフィロコッ カス　　　　　　　０　　　０　　　　　０ストレプト
コツ カス　　　　　　　０　　　０　　　　　０シユードモ
ナ ス　　　　　　　　　　　　　　ＯＯＯラクトバクシル ス　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　０　　　
　　　　　０この手順は１組成細胞ロゼイト中のＤＮＡ
またはＲＮＡの標識付けを包含する。理想的には、標識
した試料のＤＮＡまたはＲＮＡの調製は次の点を収容す
る： （１）バクテリアを流体試料から遠心または濾過によっ
て濃縮する： （２）バクテリアを問題の有機体の最も無反応性のもｃ
ｒ）（ｒｅｆ　ｒａｃｔ　ｏ　ｒｙ）から核酸を開放す
るために十分な条件下に溶解する；（３）標識付けのプ
ロトコールは、組込まれない先駆体からの標識した核酸
の精製を必要とせず、かつまた標識前の核酸の精製を必
要としない（４）標識付はプロトコールはＤＮＡおよび
／または絵核酸に対して十分に特異的であって、調製物
中の蛋白質、脂質および多糖類は交雑を妨害せず、また
読取りを妨害しないであろう。

本発明において、グラム陽性バクテリアを包含する全細
胞を効率よくかつ急速に溶解する方法をか提供される。

この方法は細胞、例えば、全細胞をアルカリ、例えば、
０．１〜１．６Ｎの水酸化ナトリウムまたは水酸化カリ
ウムの溶液と接触させることを含む。

本発明の溶解のプロトコールの重要な面は、それが比較
的簡単でありかつ速度が速いということである。それは
特別の貯蔵条件を必要としない普通の化学物質を使用し
かつグラム陽性有機体を高い効率で溶解すると同時に、
光化学的Ｈ：ａ付は法における引続く工程のために重要
であるＤＮＡの性質を保存する。

本発明にとって、交雑系の移動相は既知の種類および／
または変性されたＤＮＡの１系列またはマトリックスの
スポットであることができる。

これは適当な小さい体積の自然ＤＮＡを乾燥ニトロセル
ロースまたはナイロンのシート上に沈殿させ、このシー
トを水酸化ナトリウム溶液上に浮かばさせてＤＮＡを変
性し、このシートを中和溶液中ですすぎ１次いでこのシ
ートをベーキングしてＤＮＡを固定することによって、
最も簡単に調製される。ＤＮＡ　：　ＤＮＡの交雑前に
、交雑の間に付加されたＤＮＡの非特異的結合を阻止す
る溶液とシートを通常接触させる。

本発明・を次の非制限的実施例によりさらに説明する。

これらの実施例において、部は特記しないかぎり重量に
よる。

標識化合物の調製は、ｌ−アミノ−１７−Ｎ−（ビオチ
ニルアミド）−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ
ヘプタデカンを必要とした。これは次の４つの工程によ
り達成した： （１）３，６，９，１２．１５−ペンタオキサヘプタデ
カン１．１７−シオールジトシレートを合成した。

（２）３，６，９，１２．１５−ペンタオキサヘプタデ
カンの１．１７−ジフタルイミド誘導体を調製した。

（３）３．６，９，１２．１５−ペンタオキサヘプタデ
カンの１．１７−ジアミノ誘導体を調製した。

（４）３．６，９，１２．１５−ペンタオキサヘプタデ
カンの１−アミノ−１７−ビオチニルアミド誘導体を調
製した。

型 Ｏ℃ｃｙ）　４００　ｍ　ｌのＣ８２Ｃｌ　２中に５０
ｇ（７）ヘキサエチレングリコール（０，１７７モル）
および６４　ｍ　ｌのトリエチルアミン（３９，３６ｇ
）を含有する攪拌した溶液に、４００　ｍ　ｌのＣＨ２
Ｃｌ□中に７３．９１ｇのＰ−トルエンスルホニルクロ
ライド（０，３８９モル）を含有する溶液を２．５時間
かけて滴々添加した０次いで、この混合物を濾過し、モ
して濾液を真空濃縮した。生ずる不均質残留物を５００
ｍ１の酢酸エチル中に懸濁し、そして濾過した０次いで
、濾液を真空濃縮すると、黄色油が得られ、これを２５
０ｍ１の部分のあたたかいへキチンで８回粉砕して、未
反応のｐ−）ルエンスルホニルクロライドを除去した０
次いで、得られる油を高真空下に濃縮すると、１０８．
１２ｇの黄色油が得られた（定量的収率）。

分析：Ｃ２ａＨ３ｓＯｔ　ＩＳ２について計算計算値：
Ｃ１５２，８７，Ｈ１６，４８実測値：Ｃ１５２，５６
，Ｈ１６，３９ＰＭＲ：　　　（６０ＭＨｚ、ＣＤＣ１
３）δ：２゜４５（Ｓ、６Ｈ）；３．４−３．８　（ｍ
、２０Ｈ）；４．２　　（ｍ、４Ｈ）８７．８（ＡＢ四
重線、Ｊ＝８Ｈｚ、８ Ｈ）。

ＩＲ：　　　　（純粋）ｃｍ−’　　：２８７０．１６
１０、１３６０、１１８５、１１０５． １０２０．９３０．８３０、７８５． ６７０゜ 実施例１　（ｂ）　　： １０８ｇの３．６，９，１２．１５−ペンタオキサヘプ
タデカン−１，１７−シオールジトシレート（０，１８
３モル）、７４．５７ｇのカリウムファタルイミド（０
，４０３モル）および７００ｍ１のジメチルアセタミド
を含有する攪拌した懸濁液を１６０〜１７０℃に２時間
加熱し、次いで室温に冷却した。沈殿を濾過し、モして
水およびアセトンで洗浄すると、５３．０５ｇの生成物
が白色粉末として得られ、これを５５℃（０゜１ｍｍ）
で乾燥した。融点１２５−１２６℃。

生成物の第２収穫物をジメチルアセタミドの濾液から真
空蒸発により得、そして生ずる沈殿を酢酸エチル、水お
よびアセトンで順次に洗浄した。

得られる白色粉末を５５℃（０，１ｍｍ）で乾燥すると
、追加の９．７ｇの生成物が得られた。融点１２５．４
−１２６．５℃、生成物の合わせた収量は６２．８２ｇ
（６８％の収率）であった。

分析：　（第１収穫物） Ｃ２８Ｎ３２　Ｎ２　ｏ９・１／２Ｈ２０について計算 計算値：Ｃ１６１，１９，Ｎ１６．０５．Ｎ、５．０９ 実測値、：Ｃ１６１，０８，Ｎ１６．１５．Ｎ、５．０
５ 分析：　（第２収穫物） Ｃ２Ｂ　Ｎ３２　Ｎ２０ｇ　ｋ−ツイテ計算計算値：Ｃ
１６２，２１；Ｎ１５．９７．Ｎ、５．１８ 実測値：Ｃ１６１，７８；Ｎ１６．１５；Ｎ、５．１３ ＰＭＲ：　　　（６０ＭＨｚ、ｄｍｓｏ−ｄｓ）　　δ
：３．５（ｓ、８Ｈ）；３．６　　（ｓ、８Ｈ）；３．
８　　（ｂｔ、Ｊ＝８Ｈｚ、８Ｈ）；８．１（Ｓ、８Ｈ
）。

ＩＲ：　　　　（ＫＢｒ）ｃｍ−’　　：２８９０．１
７８５、１７３０、１４００、　■１００．７３５゜ 実施例１　（ｃ）　　： ６０ｇの１．１７−フタルイミド−３，６゜９．１２．
１５−ペンタオキサヘプタデカン（０，１１８モル）、
１４．８ｇのヒドラジン水和物（０、２９６％／ｌ／）
および５００ｍ１のエタノールを含有する溶液を機械的
に攪拌しながら１００℃の油浴中で３時間加熱した０次
いで、この混合物を冷却し、次いで濾過した。濾過ケー
クを３００ｍ１の部分のエタノールで４回洗浄した。

合わせた濾液を濃縮すると、３２．３５ｇの黄色の不透
明のガラス状油が得られた。１５０−２００℃（０，０
１ｍｍ）で蒸発的蒸留を行なうと、２２．８２ｇの淡黄
色油が得られた（６９％の収率）。

ＰＭＲ：　　　（６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）δ：１゜７
７（Ｓ、４Ｈ，ＮＨ２）、２．８５ （ｔ、Ｊ＝５Ｈｚ、４Ｈ）；３，５３ （ｔ、Ｊ＝５Ｈｚ、４Ｈ）、３．６７ （ｍ、１６Ｈ）。

ＩＲ：　　　　（ＣＨＣ１３）ｃｍ−’　　：　３６４
０．３３６０．２８６０．１６４０．１５ ８５．１４６０、■３５０．１２５０ ．１１００．９４５．９２０．８７０ ５！を量分析：　　　　（ＥＩ）ｍ／ｅ＝２８１．２（
０，１％、Ｍ＋１）。

（ＦＡＢ）ｍ／ｅ＝２８１．２ （１００％、Ｍ＋１）。

分析：　Ｃ１２Ｈ２ａ　Ｎ２０Ｓ　・１／２Ｈ２０につ
いて計算 計算値：Ｃ１４９，８０，Ｈｌｌｏ、１０；Ｎ、９．６
８ 実測値：Ｃ１５０，３６，Ｈ１９，５８，Ｎ、９．３８ ［Ｗ、ケル７　（Ｋｅ　ｒｎ）　、　Ｓ　、イワバチ（
Ｉｗａｂａｃｈｉ）、Ｈ，サトー（Ｓａｔｏ）および■
、ポーーｙ　−（Ｂ　ｏ　ｈｍｅ　ｒ）　　、高分子化
学（ｙａｋｒｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、）、よ８０．２５３
９（１９７９）］。

タデカンの調製 ７５　ｍ　１　Ｃ７）ＤＭＦ中に７．２ｇの１．１７−
ジアミツー３．６，９，１２．１５−ペンタオキサヘプ
タデカン（２５ミリモル）を含有する溶液を、アルゴン
雰囲気の下で、３．４１ｇのＮ−スクシニルビオチン（
１０ミリモル）の１．０時間にわたる少しずつの添加に
より処理した。生ずる溶液を周囲温度で４時間攪拌した
。ジメチルアミノシンナムアルデヒドのスプレー試薬で
可視化しｔ−ＴＬＣ（Ｓ　ｉｏ２．７０　：　１０．１
（７）ＣＨＣｌ　３−　ＣＨ３０Ｈ−ＨＮ　Ｈ４０Ｈ）
　ｆｆ、新規生成物へのきわめて優れた転化を示した（
Ｒｆ＝０゜１８）。得られる混合物を半分に分け、各半
分を５ｉ０２上に吸収させ、そして５００ｇの５ｉ０２
−６０　（２３０−４００メツシユ）のフラッシュ−ク
ロマトグラフィーにかけ、７０：１０゜１（７）ＣＨＣ
ｌ３　　ＣＨ３０ＨＷＮＨ４０Ｈ溶溶媒台物で溶離した
。生成物を含有する分画をプールし、そして濃縮すると
、２．４２ｇのゼラチン状ワックス状固体が得られた。

生成物をインプロパノ−ルーエーテルから固体として沈
殿させ、ヘキサンで洗浄し、そして５５℃（０，１ｍｍ
）で乾燥すると、１．７６ｇの白色粉末が得られた（３
５％の収率）。

分析：　Ｃ２２Ｈａ　２　Ｎａ　Ｏｙ　Ｓφ３／２Ｈ２
０について計算 計算値：Ｃ，４９，５１；Ｈ２Ｓ、５０．Ｎ。

１０　、４９ 実測値：Ｃ１４９，５９；Ｈ２Ｓ、１３；Ｎ。

１０．３９ ＰＭＲ：　　　（９０ＭＨｚ、ｄｍｓｏ−ｄｓ）δ：１
．１−１．７（ｍ、６Ｈ）； ２．６２　（ｔ、Ｊ＝４Ｈｚ、ＩＨ）；２．７４　（ｔ
、Ｊ＝４Ｈｚ、ＩＨ）；３．０−３．４（ｍ、１４Ｈ）
。

３．５０　（Ｓ、１４Ｈ）、４．１４　（ｍ、ＩＨ）；
４．３０　（ｍ、ＩＨ）；６．３５　Ｃｄ、Ｊ＝４Ｈｚ
、ＩＨ）；７．８０　（ｍ、ＩＨ）。

ＣＭＲ：　　　（２２，５ＭＨｚ、ｄｍｓｏ−ｄ６）δ
：２５．２．２８．０．３５．１． ４０．６．５５．３．５９．２．６１ ．１．６９．６、６９．８、７１．２ 、　１６２．７、１７２．１゜ ＩＲ：　　　　（ＫＢｒ）　　Ｃｍ−’　　：２９００
．２８５０、１６９０、１６４０、１５４０ 、　１４５０、１１００゜ 質量分析（ＦＡＢ）　ｍ／　ｅ　：　５０７　、３　（
Ｍ＋１．５６％）。

実］１殊ニー：　　′−ビ　　ニ　−Ｐ　Ｇ−アルゴン
雰囲気下のＤＭＦ１ｍｆ中の１−アミノ−１７−Ｎ−（
ビオチニルデミド）−３，６，９゜１２．１５−ペンタ
オキサヘプタデカン２０３ｍｇ　（０，４ミリモル）の
溶液を、Ｎ、Ｎ−カルポニルジミダゾール（０，４８ミ
リモル）７８ｍｇで処理した。得られる混合物を４時間
撹拌し、次いで４′−アミノメチル−４，５′−ジメチ
ルインゲリシン塩酸塩５５ｍｇ　（０，２ミリモル）、
ジイソプロピルエチルアミン１４０μ！及びＤＭＦｌｏ
ｏＪ、Ｌｌで処理した。得られる混合物を５０℃で一夜
撹拌した０次いで混合物を減圧でＳｉＯ２上に蒸着させ
、得られる含浸された固体フラッシュをＳｉＯ２（２３
０−４００メツシユ）６０ｇ上にクロマトグラフィーに
かけ、７％のＣＨ。

−ＣＨＣ１３１，５リツトルで、続いて１０％ＣＨ，０
Ｈ−ＣＨＣ１，１リツトルで溶出した。生成物を含有す
るフラクションをプールし、濃縮してガラス状固体７２
ｍｇを得た（４７％収率）。

Ｐ　Ｍ　Ｒ：（９０Ｍ　Ｈｚ、　　ｄ＋ａｓｏ−ｄｓ）
：δ１．１−１．８（ｍ、６Ｈ）；２．０４（ｂｔ、Ｊ
　＝７Ｈｚ、２８Ｇ２．５（ｓ、８Ｈ）：２．５６ｉａ
、ＩＨ）；２，７４（ｂｄ、　Ｊ　＝４Ｈｚ、　　ＩＨ
）；２、Ｌ３．４（ｍ、　　１４Ｈ）：３．４０（ｍ、
　　１４Ｈ）：４．１４（ａｓ　　ＬＨ）；４，２５（
Ｉｌ、　　ＩＨ）：４．４０（ｂｄ、　　Ｊ　＝６Ｈｚ
１２Ｈ）；６，５（ｍ、ＩＨ）；６，３５（ｓ、ＩＨ）
；７．０２（９、ＩＨ）ニア、４５（ｄ％　　Ｊ　　＝
８Ｈｚ、　　　ＩＨ）；７．６２（ｄ％Ｊ　＝８Ｈｚ１
１Ｈ）；７，８０（ｍ、　　ＩＨ）。

ＣＭ　Ｒ：（２２，５ＭＨｚ、ｄ＋＊５ｏ−ｄａ）δ：
１１．９．１８．９．２５．３．２８．２．２８．３．
３３．４．３５．２．５５．４．５９．２．６１．０．
６９．２．　８９．６．６９．８．７０．０．８９．０
，１０７．８．１１２，０．１１３．１．１１４．３．
１２０．６．１２１．６．１５３，６．１５４．４．１
５５．６．１５７．９、１５９，５、１６２，７、１フ
２．１゜参考文献：エフ、ダル′アクア、デー、ペダル
ディ、ニス、カフィエリ、ニー、ギイオット、ピー、ロ
ジグヒーロー、エフ、バッキケッティー、エフ、カーラ
ッサーレ及びエフ、ボーディン、ジャーナル、オブ、メ
ディシナル、ケミストリー３，２−先、１７８　（１９
８１）　（Ｆ、Ｄａｌｌ’＾ｃｑｕａ、　Ｄ、　Ｖｅｄ
ａｌｄｉ、　Ｓ、　Ｃａｆｆ１ｅｒｉ、＾、Ｇｕｉｏｔ
ｔｏ、　Ｐ、　Ｒｏｄｉｇｈｉｅｒｏ。

Ｆ、Ｂａｃｃｉｃｈｅｔｔｉ、　Ｆ、Ｃａｒｌａｓｓａ
ｒｅ　ａｎｄ　Ｆ、　Ｂｏｒｄｉｎ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　ＣｈｅＩＩｌ、、　２４．１７８　（
１９８１））　。

ビオチニル化ハイブリッドの比色分析検出を、ベテスダ
リサーチラボラトリーズ（ＢＲＬ）　、ゲイザースバー
グ、マリ−ランド２０８７７、ニーニスニー（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅ
ｓ（ＢＲＬ）。

Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０
８７７、　Ｕ、Ｓ、＾、）により開発された方法及びキ
ットにより行った。その方法は、゛核酸検出のための製
品°”、゛ＤＮＡ検出システムーｆンストラクションマ
ニュアル゛°、カタログ番号８２３９　Ｓ　Ａ　（”Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｏｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ａｉｄ　Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ”、　”ＤＮＡ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａ
ｌ”、　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ、　８２３９Ｓ＾）
と題するＢＲＬによりキットと共に提供されたマニュア
ルに記載されている。

１　３（ｂ　　：イ学ルミネッセンス検出ビオチニル化
ハイブリッドの化学ルミネッセンス検出は上記の方法に
同一である：ハイブリッドを有するろ紙を、３％ＢＳＡ
（ウシ血清アルブミン）中に４２℃で２０分間浸漬する
ことにより、該ろ紙をＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で
飽和させる。このろ紙を容器から取り出しそして２枚の
ろ紙間でブロッティングすることにより過剰のＢＳＡを
除去する。次いでろ紙をストレプトアビジン（Ｓｔｒｅ
ｐｔａｖｉｄｉｎ）を含有する溶液（０，２５ｍｇ／ｍ
１．３．０ｍｌ全容量）中で、室温で２０分間インキュ
ベーションする。次いでそれを、Ｏ，ＬＭ）リス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７，５，０，１ＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＣ１ｚ
、０．０５％”　ト！Ｊ　トンＸ　−１００”　（ＴＲ
ＩＴＯＮ　Ｘ−１００）ヲ含Ｗする緩衝液で３回洗浄す
る。次ぎにろ紙をビオチニル化セイヨウワサビパーオキ
シダーゼ（ｂｉｏｔｉｎｙｆａｔｅｄ　ｂｏｒｓｅｅｒ
ａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）　（０，１０ｍｇ
／ｍ１）と共に室温で１５分間インキュベーションする
。この後、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，０，
１ＭＮａＣ１，２ｍＭＭｇＣ１，及び０．０５％トリト
ンＸ−１００で３回洗浄し、そして１０ｍＭトリス（ｐ
Ｈ８，０）緩衝液で１回洗浄する。化学ルミネッセンス
活性化は２つの方法で行う、（１）スポットをパンチで
打ち抜きそしてＤＮＡを含有するディスクを両側を黒く
塗られているウェルを持ったマイクロタイタープレート
に入れる。打ち抜いた円形紙をマイクロタイタープレー
トウェルに入れ、４０ｍＭトリス及び４０ｍＭ酢酸アン
モニウム（ｐＨ８，Ｌ）を含有する緩衝液０．８ｍｌを
各ウェルに加える０次いで３９ｍＭルミノール（Ｌｕｍ
ｉｎｏｌ　）　　（Ｄ　Ｍ　Ｆ中）及び３０　ｍ　Ｍ　
Ｈ２０ｔ　（水中）の１：１混合物を加える。゛ポラロ
イド”インスタントフィルムをフィルムホールダーにお
いて直接露光させることにより、発光（ｌｉｇｈｔ　ｅ
ｍｉｓｓｉｏｎ）を°゛ポラロイドパインスタンドフイ
ルム記録する。別法として（ｂ）、ろ紙を０．５ｍＭル
ミノール及びＨ２Ｏ２の１＝１混合物を含有する溶液中
に浸け、そして透明な゛サランラップ’　（ＳＡＲＡＮ
　ＷＲＡＰ）で包む０発光は上述の如くして゛ポラロイ
ド゛°フィルムに記録される。

患者のサンプルからの高分子ｊｔＤＮＡを米国特許第４
，３９５，４８６号（ウィルソン他）に記載の方法によ
り単離する。核酸を１０ｍＭホウ酸塩Ｍ衝液（ｐＨ８，
０）中に溶解して、最終濃度約２０μｇ／ｍｌとする。

この核酸溶液に、水溶液中の“アンゲリシンーベグービ
オチン゛’　（”ａＢｅｌｉｃｉｎ−ｐｅｇ−ｂｉｏｔ
ｉｎ”）を加えて最終濃度約１０Ｊｉｇ／ｍ１とする０
次いで混合物を、ブラックレイＵＶＬ５６ランプ（ｂｌ
ａｃｋ　ｒａｙ　ＵＶＬ　５６　ｌａｍｐ）を使用して
約６０分間長波長照射で照射する。生成物は精製するこ
となくハイブリダイゼーションする用意がてきている。

しかしなが、生成物は、核酸にっいて通常行なわれる如
く透析又はアルコール沈でん（べ第４．３９５．４８６
号）により精製することができる。

核酸の代わりに、全細胞溶解物（ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌ
　１ｙｓａｔｅ）を同じ方法に従ってラベルすることも
できる。溶解は細胞をＯ，ＩＮ水酸化ナトリウムと共に
煮沸し、続いて塩酸で中和することにより行なわれる。

全細胞が使用される場合には、゛″ベグーアンダービオ
“ＰＥＧ−ａｎｇ−ｂｉｏ”及び細胞の混合物を、リガ
ンドの有効な輸送のため照射に先立ち少なくとも６０分
間インキュベーションする。上述の方法の多くの異なる
変法をラベリングのために採用することができる。

え１１１： α−サラセミア（＾Ｉｐ）Ｆａ−ｔｂａｌａｓｓｅｍｉ
ａ）は遺伝子欠失と関連している。ドツト／スロットプ
ロットフォーマット（ｄｏｔ／５ｌｏｔ　ｂｌｏｔ　ｆ
ｏｒｍａｔ）におけるハイブリダイゼーションによる遺
伝子欠失の検出は、サンプルの全量及びそのハイブリッ
ド形成能力（ｆｙｂｒｉｄｉｚａｂｉｌｉｔｙ）が正確
に知られていることが必要である。β−グロビン遺伝子
（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ　ｇｅｎｅ）はシングルコピ
ー遺伝子（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｐｙ　ｇｅｎｅ＞である
ので、β−グロビン及びα−グロビンを有するサンプル
の同時的ハイブリダイゼーション及びそれらの相対的量
はサンプルについてのα−グロビンの量を示すであろう
。

フォーマット及びハイブリダイゼーション条件はプロー
ブを除いては、前述のルピン及びカン（Ｒｕｂｉｎ　ａ
ｎｄ　Ｋａｎ）と同じであり、試＠ＤＮＡは固定化され
ていない。ハイブリダイゼーション条件も同様である。

検出は、ＢＲＬの明細に従って前述のＢＲＬキットを使
用することによりなされる。

ハイブリダイゼーション検出プロセスは下記の３工程で
行なわれる： 工程１ニブローブの固定化 前述のルピン及びカンに記載の如く、α２グロビン遺伝
子（ａｌｐｈａ２ｇｌｏｂｉｎ　ｇｅｎｅ）を含有する
１゜５ｋｂＰｓｔＩフラグメントをα−サラセミアのた
めのプローブとして使用し、そしてβ−グロビン遺伝子
についてはｐＢＲβＰｓ　ｔ　（ｐＢＲｂｅｔａ　Ｐｓ
しＨ４，４ｋｂ）の消化により生成した７３７塩基対プ
ローブを使用する。β−グロビン遺伝子プローブは米国
特許第４，３９５，４８６号（４欄）に記載されている
。α−サラセミアに関連した遺伝子欠失の検出のために
、出発核酸の量、ハイブリダイゼーション効率及び対照
サンプルが必要である。本発明は、同様な量のプローブ
が並んで固定化されている場合には、シングルコピー必
須遺伝子（ｓｉｄｌｅ　ｃｏｐｙ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
　ｇｅｎｅ）（たとえは′、β−グロビン遺伝子）との
同時的ハイブリダイゼーションによりこれらの問題を回
避し、ラベルされたサンプルはハイブリダイズされ、シ
グナル強度（ｓｉｇｎａｌ　１ｎｔｅｎｓｉｔｙ）の相
対的強度はサンプルに存在する遺伝子量の相対的量の目
安である。

プローブ（０，５，１，３，および５μｇ／１００μｍ
）を、３Ｍ水酸化ナトリウム２０μｌで変性された１０
ｍＭ）リスＨＣＩ　　（ｐＨ７＞中に１゜０℃で５分間
再懸濁させ、当容量の２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５，
０を加えて溶液を中和し、中和の直後に、スクライヘル
アンドシュエル（Ｓｃｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈ
ｕｅｌｌ）、〔キーニ、ニューハンプシャイア−、ニー
ニスニー（Ｋｅｅｎｉ、　ＮｅｗＨａｍｐｓｈｉｒｅ、
　Ｕ。

Ｓ、八、）から購入した、スロットプロットマニホルド
（ｓｌｏｔ　ｂｉｏｔ　ｍａｎｉｆｏｌｄ）中の真空下
のニトロセルロースろ紙に、β−及びα−グロビン遺伝
子のためのプローブが平行列で施される。次いでろ紙を
真空中で８０℃で６０分間乾燥する０次いで、それは、
５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）４５ｍＭクエン酸
ナトリウム、４５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０％（Ｖ／
Ｖ）ホルムアミド、各々０゜２％（Ｗ／Ｖ　）のポリビ
ニルピロリドン、“フィコール４００’（“ＦＩＣＯＬ
Ｌ　４００°′）及びウシ血清アルブミン、及び０．２
’ｍｇ／ｍ１のアルカリ煮沸サケ精子ＤＮＡ及び０．１
５ｍｇ／ｍｊ！の酵母ＲＮＡ、を含有する混合物中で４
時間プレハイブリダイズされる。

工程２：　試験サンプルのラベリング これについては前述した。

固定化されたプローブを含有するニトロセルロー２．、
ト１ノッ、・をプラスチックバッグ〔例えば、“ジ−ル
ーア−ミール”（”　Ｓ　Ｅ　Ａ　Ｌ−＾−ＭＥＡＬ”
）、゛°リシールンドセーブ（”５ＥＡＬ　ａｎｄ　５
ＡＶＥ”、等］中でラベルされた試験サンプルとハイブ
リダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション溶液
はプレハイブリダイゼーション溶液＋１０％デキストラ
ンサルフェートと同じである。ハイブリダイゼーション
は４２°Ｃで１６時間なされる。ハイブリダイゼーショ
ンの後、ビオチンの検出は、ベテスダリサーチラボラト
リーズ（ＢＲＬ）　、マリ−ランド、ニーニスニー（Ｂ
ｅｔｂｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｌａｔｏ
ｒｉｅｓ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　、　Ｕ、Ｓ、＾２）（カタログ番号
８２３９ＳＡ）により提供されたキット及び方法によっ
て行う。α−グロビン遺伝子の欠失の程度を評価するた
めに、α−及びβ−領域の相対強度が使用される： α−グロビン側にシグナル無し：４つのα−グロビン遺
伝子はすべて欠けている。

α−グロビン側のシグナルが対応するβ−側のシグナル
の半分の強度である＝３つのα−グロビン遺伝子が欠け
ている。

α及びβ側のシグナルが等しい＝　２つのα−グロビン
遺伝子が欠けている。

α側のシグナルが対応するβ側のシグナルより強い（２
α＝３β）＝１つのα−グロビン遺伝子が欠けている。

オリゴヌクレオチドは単一の吸着プロセスによってはニ
トロセルロース紙上に容易に固定化され得ないことが知
られている。本発明は、吸着能力のある大きい分子にオ
リゴヌクレオチド配列を編入ための３つの異なった方法
を包含する。

方法１：　１つは４３マーでありもう１つは１６マーで
ある２つのオリゴヌクレオチドを、ホスホールアミダイ
ト法（ｐｈｏｓｐｈｏｒａ＋ＩｌｉｄｉＬｅ−ｍｅｔｈ
ｏｄ）により自動化合成装置〔アプライドバイオシステ
ム３８０　Ｂ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
　３８０Ｂ）においてｆヒ学的に合成し、そしてマニア
チス等、モレキュラークローニング、１２２頁（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、　Ｍｏ±ヌクレオチドキナー
ゼ介在プロセス（Ｔ４−ｐｏ　ｌ　ｙｎｕｃ　１ｅｏｔ
ｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐｒｏｃｅ
ｓｓ）により５′端でリン酸化された。これらのオリゴ
ヌクレオチドは鎌状赤血球貧血（ｓｉｃｋｌｅ　ｃｅｌ
ｌ　ａｎｅｍｉａ）と関連した突然変異の検出に特異的
な１つヌクレオチド長さの配列のセグメントを含有する
。

４３マーＡ　＆　Ｓ　（４３ｍｅｒ＾＆５）（Ａ＝＝常
グロビン遺伝子、Ｓ＝鎌状状グロビン遺伝子は、２つの
別々の反応、１つは”Ｐ−ＡＴＰとのそして１つは放射
性ラベルを持たないＡＴＰとの反応において、マニアチ
ス等、モレキュラー　クローニン乙、１２２頁（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩ
ｏｎｉｎｇ、　ｐａｇｅ　１２２）に従ってキナーゼ処
理された（ｋｉｎａｓｅｄ）、０．４μｇ３２Ｐ　　４
３マー及び０．６ｍｇ放射能のない４３マー（ｃｏｌｄ
　４３ｍｅｒ）を混合しそしてスパンカラム〔ＴＥ（ト
リスＥＤＴＡ［［ｉ液）中のＧ−２５ｍｅｄｌ上で精製
して、最終容量４０μｌとした。２つの希釈物を、５０
及び０，５ｎｇでＳ＆Ｓ　Ｃシュライヘル及びシュエル
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌ）］ニトロセ
ルロース及びナイトラン（ｎｙｔｒａｎ）　（ナイロン
）股上にスポットした。

方法２：方法１のリン酸化されたオリゴヌクレオチド生
成物を、リガーゼ介在プロセスにより配列のマルチマー
（ｍｕ　Ｉ　ｔ　ｉｍｅｒ）をつくることにより更に伸
長させた。原理は下記の如く説明される。

３′５′ ＋ 木 生成物がオリゴヌクレオチドよりも高い分子量であるな
らば、それはニトロセルロース紙への吸着により固定化
されるであろう。

′３２Ｐ４３７−４μｇ及び１６マーリンカー（Ｘ＞３
．７μｇを含有する水性溶液を混合し、そして真空下に
乾燥した。放射能のないキナーゼ処理４３マー（ｃｏｌ
ｄ　ｋｉｎａｓｅｄ　４３ｍｅｒ）　６　ｍ　ｇを加え
そしてサンプルを５５℃に加熱し、そして０℃にゆっく
りと冷却してアニーリングした。連結反応（Ｉｉｇａｔ
ｉｏｎ）は、２０μ！全反応容量で８００単位のりガー
ゼ〔ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）　］により
１５°Ｃで４時間行った。スパンカラム上で１ｍｇ　（
２μｍ）を精製して４０μｍ（７）最終容量とした。２
つの希釈物を５０及び０．５ｎｇでニトロセルロースナ
イロン膜上にスポットした。

方法３：方法２と同じであるが、連結反応は行わなかっ
た。連結反応の代わりに、インターカレーター（ｉｎｔ
ｅｒｃａｌａｔｏｒ）により架橋を行って２本鎖領域を
無傷に（ｉｎｔａｃｔ＞保った。この故に、架橋された
分子は相互に共有結合した幾つかのオリゴヌクレオチド
配列を有するであろう。

コ２Ｐ４３マー（配列Ｐ−５０のための）２μｇを１６
マー（配列Ｐ−５０のための）リンカ−２゜９ｍｇに加
え、そしてスパンカラム（ＴＥ中の０２５ｍｅ　ｄ　）
上で精製して４０μｌの最終容量とした。キナーゼ処理
した４３７−６ｍｇを加え、サンプルを５５℃に加熱し
、そして０℃にゆっくりと冷却してアニーリングした。

インターカレーション化合物アミノメチルトリオクサレ
ン（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｔｒｉｏｘＳａｌｅｎ）　
２５　μｍを加え、サンプルを全部で５００ｕｅの１０
ｍＭホウ酸塩＆Ｉ衝液ｐ８８゜２中の氷上で長波ＵＶラ
ンプモデル（ＵＶＬ−２１、λ−３６６ｎＭ）で３０分
間照射した。

すべての３つの方法により修正されたプローブを、次い
でニトロセルロース及びナイロン紙上に固定化し、そし
てラベルされたオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼー
ションした。結果は、配列が固定化されることができそ
してハイブリダイゼーション忠実度（ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ　ｆｉｄｅｌｉｔｙ）はそのままであること
を示す。

方法１乃至３の生成物の２つの希釈物を、５０及び０．
５ｎｇｓでニトロセルロース及びナイロン膜上にスポツ
ティングした。

全体のろ紙を真空オーブン中で８０℃で３０分間ベーキ
ングし、そして５０℃のオーブンで３０分間プロット（
ｂｌｏｔｔｏ）　（５％脱脂牛乳、６ＸＳＳＣ１２０ｍ
ＭＮａ−ピロホスフェート）中でプレハイブリダイゼー
ションした。

ハイブリダイゼーションは、ブライマー延長１９’　Ａ
＆　１９　Ｓ’　（ｐｒｉｍｅｒ　ｅｘｔｅｎｄ　１９
’　＆１９Ｓ”　）を使用して５０℃で１時間行った（
３ストリツプ／プローブ）。

ろ紙は、借かに撹拌しながら６ＸＳＳＣ中で室温にて１
５分間及び５７℃で２×１０分間ストリンジエンドリー
に（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔｌｙ）洗浄した。

空気乾燥したろ紙をホワットマンろ紙上に置きそして一
７０℃で一夜オートラジオグラフイーにかけた。

驚くべきことに、第１図に示された結果は、オリゴヌク
レオチドプローブを固定化することにより特異的なハイ
ブリダイゼーションが得られることを示す。

ヒト正常ゲノム（Ｘ　Ｘ　）　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｈｕｍａ
ｎ　ｎｏｒｍａｌＨｅｎｏｍｉｃ　（ＸＸ）　ＤＮＡ）
を、“ビオチン−ＰＥＧ−アンゲリシン”（ＢＰＡ）に
より、１０ｍＭホウ酸塩Ｍ街液ｐＨ８，２中で、０．３
対１（ＢＰＡ：ＤＮＡ）の重量比で、長波ＵＶランプ　
モデルＵＶＬ−２１、λ＝３６６ｎｍを使用して、氷上
で１５分間フォトラベルした（ｐｈｏＬｏｌａｂｅｌｅ
ｄ）。精製は必要ない。

ターゲットＤオリゴヌクレオチドを、下記の濃度で１μ
ｌアリコートにおいてＳ＆Ｓニトロセルロース上に直接
固定化し、次いで真空オーブン中８０℃で３０分間ベー
キングした０種々の異なる固定化されたプローブの量は
下記のとおりである４３−ｍａｒ　（＾）−キナーゼ処
理された（方法１）　　２００ｎｇ４３−ｍｅｒ　（＾
）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＺＯＯｎｇ
４３−ｍｅｒ　（Ｓ）−キナーゼ処理された（方法１）
　　２００ｎｇ４３−ｍｅｒ　（Ｓ）　　　　　　　　
　　　　　　　２００ｎｇＭ　１３１９　Ａ　ｓｓ　　
　　　　　　　　　　　　　　５０ｎｇＭ　１３１９Ｓ
　ｓｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　５０ｎｇＭ　１３７３７　Ａ　ｓｓ
　　　　　　　　　　　　　　　５０１１ｇＢＲＬ市販
のビオチニル化　Ｄ　Ｎ　Ａ　　　　２００ｐｇｐｕｃ
１９　　　　　　　　　　　　　　　　　５０Ｂ４Ｌ　
マー　　Ａ　：５’　　　ＣＴＣ；ＣＴ４＾＾’ｒｃＴ
ＴＡＡＧＧＡＴ、　八Ａ’ｒ　４ＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡ
ＧＡＡ（、ＴＣＴＧＣＴ、ＡＡＴＣＴＴＡＡ５．ＧＧＡ
’ｒ、　八ＡＴ　４Ｃ丁　　３′ ４３−マー影では・＝Ｔ １６−マー（Ａ及びＳの両者に共通） ろ紙を４５℃Ｈ２０洛中でプロット（５％脱脂乾燥牛乳
、６ＸＳＳＣ１２０ｍＭＮａ−ピロホスフェート）にお
いてプレハイブリダイゼーションした。

４つのストリップのすべてを、正常β−グロビン遺伝子
を含有する２μｇのラベルされたＸＸＤＮＡを含有する
溶液（ハイブリダイゼーション溶液は１０％ＰＥＧを有
するプロットであった）２ｍｌ中で、ＨｔＯ浴中４５℃
で２時間ハイブリダイゼーションした。

ストリンジエンシー洗浄（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｗａ
ｓｈ）は下記の如く行った： ６ＸＳＳＣ中で室温にてｌＸ２０’　、第２図に示され
た温度で２Ｘ２０’、 非常に僅かに撹拌。

高められた温度には５０ｍ１の遠心分離管を使用した。

結果を第２図に示す。

ハイブリッド中のビオチンの検出は、ベテスダリサーチ
ラボラトリー、ベテスダ、マリ−ランド、ニーニスニー
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　Ｂｅｔｂｅｓｄａ　、　Ｍａｒｙｌａｎｄ
、　Ｕ、Ｓ、＾、）のマニュアルに従って、ビオチン検
出キットを使用して行った。結果は特異的ハイブリダイ
ゼーションを示した。

発酵槽培養物から回収したバクテリア細胞から下記の方
法で、数１０ミリグラム乃至グラムの量のＤＮＡを調製
した。ニュー　ブルンスウイックサイエンティフィック
　マイクロファーム　ファーメンタ−（Ｎｅｗ　Ｂｒｕ
ｎｓｅｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｎ１ｃｒｏｆｅ
ｒ鴎Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）中で増殖した１０１の普通ブ
イヨン培養！Ｐ５（ｎｕＬｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ　ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ）からの遠心分離により、バクテリアを
集めた。一般に、濃厚懸濁液中の細胞を、ＳＤＳ　（ド
デシル硫酸ナトリウム）の如きイオン性洗剤にさらすこ
とにより溶解し、次いでフェノール及び／又はクロロホ
ルムでの抽出によりタンパク質及び脂質から核酸を精製
した〔ジュー。マーマー、ジャーナル、オブ、モレキュ
ラー、バイオロジー１．β−１２０８−２１８，１９６
１（Ｊ、　Ｍａｒｍａｒ、　Ｊ、　＋ｉｏｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、、　Ｌ、　２０８−２１８、１９６１）］　、ＤＮ
Ａ溶液を３７℃で０．２ｍｇ／ｍ１リボヌクレアーゼで
処理することにより、核酸調製物からＲＮＡを除去し、
次いで２容量のエタノールの添加により溶液から核酸を
沈でんさせた。ＴＥ　（１０ｍＭトリス−ＭＣＩ、ｐＨ
７，５，１ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　２　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）の
如き低塩緩衝液中で沈でん物から再溶解したバクテリア
ＤＮＡは、純度濃度及び分子寸法について特性付けられ
、次いで約１μｇのアリコートを変性しそしてハイブリ
ダイゼーションのためにニトロセルロース又はナイロン
膜上にスポットとして固定化した〔カファトス等、、ヌ
クレイツクアシッド　リサー　、Ｌ、１５４１−１５５
２　（１９７９）（Ｋａｆａｔｏｓ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　７．１５４
１−１５５２．　（１９７９）］　。

変性は、約０．ｌＮＮａＯＨにＤＮＡをさらすことによ
り達成された。変性の後、溶液を中和し、次いで膜をＮ
ａＣ１／トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７゜５、中で洗浄しそし
て乾燥した。

Ｋ凰鮭１：細　ＤＮＡラベリングのためのニート脅−％
／−ｆ＋Ｌ／７’ｌ！ＪｒＬ＄１１１〔以下のことは淋
病の疑いのあるスワブ（ｇｏｎｏｒｒｈｅａ−ｓｕｓｐ
ｅｃｔ　ｓｗａｂ）、髄膜炎の疑いのある脳を髄液（ｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｓ−ｓｕｓｐｅｃｔ　ｃｅｒｅｂｒｏ
ｓｐｉｎａｌ　ｆ！ｕｉｄ）、汚染水サンプル等からの
物質の懸濁液にも等しく当てはまるけれども］例えば尿
のサンプルを、遠心分離し又はろ過して洗浄しそしてサ
ンプル中のバクテリアを濃縮する０次いで、バクテリア
は、（ｉ）２ｍｇ／ｍ１のリゾチーム又はリソスタフィ
ンにさらし次いで約９０℃の熱にさらすこと、（ｉｉ）
０．１乃至１．６ＮＮａＯＨ１又は（ｉｉｉ）１％ドデ
シル硫酸ナトリウム、により溶解される。（ｉｉ）Ｎａ
ＯＨの後、細胞溶解物溶液はラベリングの前に中和され
、（ｉｉｉ　）洗剤溶解の後、ＤＮＡラベリングの前に
、氷上の５Ｍ酢酸カリウムによりＳＤＳが除去される。

ＤＮＡラベリングが細胞溶解の前に達成されるように、
アンゲリシンは無傷の細胞を透過することができなけれ
ばならない、このその場のラベリングは抽出工程を簡単
にする。

その理由は、アルカリ又は洗剤溶解物はハイブリダイゼ
ーション溶液に直接導入されうるからである。

ハイブリダイゼーションの前に、ラベルされたサンプル
は変性され、そしてそれは好ましくは、適当なラベルさ
れていないプローブＤＮＡとの特異的アニーリングを促
進するために短い１本鎖の長さに減少させられるべきで
もある。変性の方法は当業界では知られている。これら
の方法には、水酸化ナトリウム、有機溶媒、加熱、酸処
理及びそれらの組み合わせによる処理が包含される。フ
ラグメント化は、ＤＮＡをＮａＯＨ中で所定の時間約８
０℃に加熱することにより制御された方法で達成するこ
とができ、これは、もちろんＤＮＡを変性する。

実１巨Ｉよ」−：方例９の生成物のラベリング（ｉ）約
１０ｍ１の尿の試験サンプルは、約１０４個又はそれよ
り多くの感染物質を含有するであろう、遠心分離及び洗
浄の後、予備処理した細胞溶解物（工程２）は、１０ｍ
Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ約８）０．２ｍｆｆ１
中に再懸濁させた。この懸濁液に、エタノールに溶解し
たフォトラベリング試薬（ｌｏｍｇ／ｍｊり１０μｇを
加え、ポルテックスミキサー上で振とうすることにより
混合した０次いで、長波長設定でＵＶＧＬ２５装置によ
り３６５ｎｍで３０分間混合物を照射した。このＵＶＧ
Ｌ装置は、Ｕ　Ｖ　Ｐ社、、５１００ウオルナツト　グ
ローブ　アブニュー、ビー。

オー、ボックス１５０１、サンガブリエル、シーニー９
１７７８、ニーニスニー（ＵＶＰ　Ｉｎｃ、、　５１０
０Ｗａｌｎｕｔ　Ｇｒｏｖｅ　Ａｖｅｎｕｅ、　Ｐ、　
Ｏ，Ｂｏｘ　１５０１．　Ｓａｎ　Ｇａｂｒｉｅｌ、　
Ｃへ９１７７８．　Ｕ、Ｓ、＾、）により販売されてい
る。

（ｉｉ）ＤＮＡについてのフォースター等（１９８５）
、、ｉｔ、により記載の方法に従って、Ｎ−（４−アジ
ド−２−二トロフェニル）　−Ｎ’−（Ｎ−ｄ−ビオチ
ニル−３−アミノプロピル）−Ｎ′−メチル−１，３−
プロパンジアミン〔ブレサ、ジー、ビー、オー、ボック
ス４９８、アデライーデ、南オーストラリア５００１、
オーストラリア（ＢＲＥＳ＾、　に、Ｐ、０．　ＢＯＸ
４９８．＾ｄｅｌａｉｄｅ、　５ｏｕｔｂ　Ａｕ５ｔｒ
ａｌｉａ　５００１．＾ｕｓｔｒａｌｉａ）から入手可
能であるコによってもサンプルはラベルされた。

（ｉｉｉ　＞溶解されていない細胞が使用される場合に
は、１０ｍホウ酸塩０．２ｒｒ＋ｊ！中の細胞懸濁液は
、照射の前にフォト試薬と共に１時間インキュベーショ
ンされた。

ハイブリダイゼーションの前に、変性されたラベルされ
ていないプローブＤＮＡのスポットを有する膜を、“プ
レハイブリダイゼーション”溶液で２時間までの期間処
理して、ハイブリダイゼーションプローブに結合するこ
とができる膜自体の部位をブロックした。変性されたラ
ベルされたサンプルＤＮＡも含有していたこの及びハイ
ブリダイゼーション溶液は、約０．９ＭＮａ”　、０．
１％ＳＤＳ、０．１−５％ウシ血清アルブミン又は脱脂
乾燥乳及び場合によりホルムアミドから成っていた。５
０％ホルムアミドでは、プレハイブリダイゼーション及
びハイブリダイゼーション工程は約４２℃でなされ、ホ
ルムアミドがない場合にゼーションされた膜はしばらく
の間貯蔵することができる。ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョンは約１０分間又はそれより長く行わせ、次いで、結
合していないラベルされたＤＮＡは、不十分な塩基対の
ハイブリッドを解離する、０．０１８ＭＮａ”（０，ｌ
Ｘ５ＳＣ）、０．１％ＳＤＳ、６８°Ｃ１の如き条件下
に膜から洗浄された。ハイブリダイゼーション後の洗浄
の後、膜は、ハイブリダイゼーション検出工程を予想し
て、洗剤なしの低塩溶液中で洗浄された。

アフィニティー単離ヤギ抗ビオチン抗体（ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉｂｉｏＬ
ｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　（ザイメッドラボラトリー
ズ、サンフランシスコ、カリフォルニア、ニーニスニー
（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ
、　　Ｕ、Ｓ、＾、）から購入した］をコロイドゴール
ド（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ）　（２Ｏｒ＞ｍ）
上に、その供給者〔ジャンセンインストラクションパン
フレット、ジャンセン　ライフサイエンス　プロダクト
、ビス力タウエー、ニューシャーシー、ニーニスニー（
Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｂｏｏｋｌ
ｅｔ、　Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｄｅｓ
　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。

ＰｉｓｃａＬａｗａｙ、　Ｎｅｗ　ｊｅｒｓｅｙ、　Ｕ
、Ｓ、＾、）コによって記載された方法に従って吸着さ
せ、そして比色法における如くしてブロッキングの後ハ
イブリダイズドビオチニル化Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚｅｃｌ　ｂｉｏｔｉｎｙｌａＬｅｄＤＮ八）と反
応させた。シグナルは、ジ　インセン［：Ｂ２３４０、
ビールス、ベルギー（Ｂ２３４０　ＢＥＥＩＩＳＥ、　
Ｂｅｌｇｉｕｍ）］シルバーエンハンスメントキット（
Ｓｉ１ｖｅｒ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｋｉｔ）及び
プロトコルを使用してシルバーエンハンスされた。

及１匠Ｌ１：　　尿サンプル中の尿道感染の検出病院で
微生物学的方法により分析された尿サンプルを病院から
集め、そして結果はハイブリダイゼーション診断が行な
われるまで秘密にされた。

次いでそれらを比較してハイブリダイゼーションの結果
の確実性を確かめる。

ＵＴＩ感染の疑いのある臨床サンプル（尿）１ｍ２を、
ブリンクマンマイクロ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　
ｍ１ｃｒｏｃｅｔ＋Ｌｒｉｆｕｇｅ）で５分間遠心分離
した３次いで１．２Ｎ水酸化ナトリウムＯ，１ｍｌを加
え、懸濁液を１００°Ｃに加熱して細胞を溶解させた。

次いで懸濁液を１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液ｐ　［
−Ｉ　８で１ｍｌに希釈し、塩酸で中和してｐＨ７にし
た。溶液に、５０μｇ“ビオチン−ＰＥＧ−アンゲリシ
ン′°（実施例２参照）を加え、混合物をＵＶＬ５６長
波長Ｕ■ランプで１５分間照射した。照射されたサンプ
ル（０、１ｍｊりを０．２ｍＭビロリン酸ナトリウムを
伴う５％脱脂乾燥乳１０％ＰＥＧの３ＸＳＳＣ３ｍｌに
加え、そしてニトロセルロース紙に固定化されたプロー
ブ（全ゲノムＤＮＡ）とのハイブリダイゼーションを６
８℃で５分乃至−夜行った。ハイブリダイゼーションの
後、実施例３又は１２に従って検出を行い、試験サンプ
ル中の特異的バクテリアの存在について、スポット又は
写真を視察により解釈した。ヒトＤＮＡのスポットは白
血球の検出のためのニトロセルロース紙にも存在してい
た。白血球の存在は゛ロイコスティックス“（“ＬＥＵ
ＫＯＳＴＩＸ’”）〔マイルスラボラトリース、ニルカ
ート、インディアナ、ニーニスニー（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｅｌｋｈａｒｔ、　■１ｄｉ
ａｎａ、　Ｕ、Ｓ、Δ、）コを使用する普通の方法によ
って更に証明された。

典型的な結果（表１及び２）は、ハイブリダイゼーショ
ン診断は対応する微生物学的アッセイよりも短い時間に
同様な結果を生じることを示す。

本発明は、種同定に関する情報を与えるのみならず臨床
サンプルの白血球含有率も与える。

表−二Ｌ ／Ｉ　　（ＮＥに）　　　　　／／　　（ＮＥＣ）　　
　　　　　　　　（ＧＯＬＤ）／Ｉ　　（ＮＥＣ）　　
　　　／／　　（ＮＥＧ）　　　　／Ｉ　　　　　　（
ＧＯＬＤ）Ｓ＋、Ｃ−Ｅ、Ｃ，−Ｓ、Ｋ１．−Ｍ　　／
Ｉ　　　　　（Ｃ）ＩＥ旧）Ｓ＋、Ｃ−／／　　（ＮＥ
Ｃ）　　　　／Ｉ　　　　　（ＧＯＬＤ）Ｓ＋、Ｃ−／
Ｉ　　（ＮＥＧ）　　　　／Ｉ　　　　　　（ＧＯＬＤ
）Ｓ＋、Ｃ−Ｅ、Ｃ，−ＶＷ　　　／／　　　　　（に
０ＬＤ）Ｃ＋１＋−紙刃ＣＮＦ［：）　　　　　　　　
　　　　　（にＯＬＤ）Ｓ＋、Ｃ−Ｅ、Ｃ，−ＶＷ　　
　ＩＩ　　　　　（に０ＬＤ）Ｓ＋、Ｃ−無視（ＮＥＣ
）　　　　ＩＩ　　　　　（ＧＯＬＤ）”　　（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）　Ｅ、Ｃ，−ＶＳ、Ｋｌ、−Ｓ　　ｉｔ　　　
（ＣＨＥ旧）〃（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｅ、Ｃ，−Ｓ、Ｋｌ
、−Ｓ　　　／／　　　　（ＣＩＩＥＭＩ）１００ｗＯ
ＯＯ／ｍＬ 本寒天プレート上で尿をｍ、＊培養しくＳｔｒｅａｋｉ
ｎｇ）そして感染微生物が増殖できるような条件下にプ
レートを処理することにより行なわれた診断木本エンテ
バクター／カンジグプローブはハイプリグイゼーション
アツセイには含まれておらず、故に負の結果は驚くには
あたらない； アッセイに使用された高いストリンクエンシー　（Ｓｔ
ｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件が与えられた場合には、エンテ
ロバクタ−に関連した種とのクロスハイプリグイゼーシ
ョン（ｃｒｏｓＳ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は検
出されなかった。

略記号：ＶＳ＝非常に強い、ｓ＝強い、８＝中程度、−
＝弱い、ＶＷ＝非常に弱いハイブリダイゼーションシグ
ナル。

ゴールド比色法（ＧＯＬＤ）＝’％Ｅ施例１２に従う検
出方法化学ルミネッセンス（ＣＨＥＭ［）＝実施例３（
ｂ）に従う化学ルミ冬ッセンス検出、 本発明のハイブリダイゼーションの結果は検出後に得ら
れたハイブリダイゼーションシグナルの強度の主観的な
解釈の結果を表す、２欄に記載された生物からのＤＮＡ
はハイブリダイゼーションシグナルが得られた唯一の生
物である。ハイブリダイゼーションにしようされるＤＮ
Ａのパネルには、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　（”Ｅ、
Ｃ，”）、クレブシェラ九２　（Ｓｔｎ　ｂ　Ｉｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ｅ　ｉｄｅｒｍａｔｉｓ）（”ＳＥ”）、左
と含される。

煮−コし ３＋Ｓ　　　　　　　　／／　　　（ＣＨＥＭＩ）３＋
　　　　　　　　　　　Ｍ　　　　　　　　　　／Ｉ　
　　（ＣＨＥＭＩ）３＋　　　　　　　　　　　Ｍ　　
　　　　　　　　／Ｉ　　　（ＣＩＩＥＭＩ）３＋　　
　　　　　　　　　Ｓ　　　　　　　　　　／ｌ　　　
　（ＧＯＬＤ）３＋　　　　　　　　　　　ＶＳ　　　
　　　　　　　／／　　　　（ＧＯＬ［ｌ）３＋　　　
　　　　　　　　ＶＳ　　　　　　　　　　ｏ　　　　
（ＧＯＬＤ）３＋　　　　　　　　　　ＶＳ　　　　　
　　　　　ｉｔ　　　　（に０ＬＤ）２＋　　　　　　
　　　　　Ｓ　　　　　　　　　　／Ｉ　　　（ＣＨＥ
ＭＩ）Ｚ＋Ｓ　　　　　　　　／／　　　（（ＪＥＭＩ
）２＋Ｓ　　　　　　　　ｉｔ　　　（ＣＨＥＭｒ）２
＋Ｓ　　　　　ゴールド比色法 （ＧＯＬＤ） ２＋Ｓ　　　　　　　　Ｎ　　　　（ＧＯＬＤ）Ｚ＋Ｓ
　　　　　　　　　／／　　　　（ＧＯＬＬ））２＋　
　　　　　　　Ｓ　　　　　　　／／　　　（ＧＯＬＤ
）（にＯＬＤ＞ １＋　　　　　　　　　　　　　　ＶＳ　　　　　　　
　　　　　　ｔｔ　　　　　　（ＧＯＬＤ）１＋　　　
　　　　　　　　　　　ＶＷ　　　　　　　　　　　　
　／Ｉ　　　　　（ＧＯＬＤ）／／　　（Ｔ　ＲＡ　Ｃ
Ｅ　）　　　Ｖ　Ｓ　　　　　　　　／／　　　（ＣＦ
Ｉ　Ｅ旧）／／　　（ＴＲＡＣＥ）　　　Ｗ　　　　　
　　／／　　　（ＧＯＬＤ）／／　　（ＮＥＣ）　　　
　　Ｓ　　　　　　　／／　　　（ＣＩＩＥＭｒ）／／
　　（ＮＥＣ）　　　　　　　Ｎ　　　　　　　　　／
Ｉ　　　（ＣＩＩＥＭＩ）ｔｔ　　（ＮＥ［；）　　　
　　　ＶＷ　　　　　　　　　／／　　　　（ＧＯＬＤ
）ｔｔ　　（ＨＥ（：）　　　無視（ＮＥに）　　　　
　＃　　　（ＧＯＬＤ）ｏ　　（ＮＥＣ）　　　　　ｕ
　　（ＮＥＣ；）　　　　　　　’／　　　　（に０Ｌ
Ｄ）／／（ＮＥＧ）　　　　　　　Ｗ　　　　　　　　
　　／／　　　　（ＧＯＬＤ）／／　　（ＮＥＣ）　　
　　　　　舅　　　　　　　　／／　　　　（ＧＯＬＤ
）／／ＮＥＧ　　　　　　　　　　　Ｗ　　　　　　　
　　　　　　ｌ／　　　　　　ＧＯＬＤ表２の２ｉに要
約されたハイブリダイゼーションの結果は、表１に記載
のラベルされた尿サンプルをゲノムヒトＤＮＡとハイブ
リダイゼーションさせた場合に得られたハイブリダイゼ
ーションシグナルの強度の主観的解釈を表す。

゛ロイコスティックス°°アッセイは、比色試薬ストリ
ップアッセイである。試薬ストリップ上の発色はアッセ
イ試薬ストリップで与えられたチャートと比較され、そ
して負（発色なし）から３＋（非常に強い発色）までの
範囲にある。

実施例１４：　細胞の溶解 細胞懸濁液のアリコート１．ｏｍｆｆｉを遠心分離し、
そして細胞ペレットを緩衝化されていないＮａ○トＩ溶
液１００μ！中に再懸濁させた。次いでサンプルひ短い
時間高温にさらし、次いで１０ｍＭホウ酸塩２１ｍ液を
使用して初めの容量に希釈した。次いで溶液のｐＨをＨ
ＣＩで中性に調節した。

表４は、６８°Ｃ又は１００°Ｃで種々のＮａＯＨ濃度
での、２種の異なる球苗、スタフィロコッカス　エビデ
ルミゾイス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉ剌及びストレプトコッカス　ファエ力リスの溶
解の効率を示す。この実施例においては、遠心分離の前
に６００ｎｍでの１０ｍｆアリコートの吸光度を記録し
た。遠心分離の後、細胞ペレットを種々の濃度のＮａ０
Ｈ（１００μｍ）に再懸濁させ、そして各々の二重サン
プルを６８℃に１０分間又は１００℃に５分間さらした
。次いで各サンプルを１．０ｍｊ！に希釈し、再び６０
０ｎｍでの吸光度を記録した。初めの容量及び終わりの
容量は同じであるので、６００ｎｍでの初めの吸光度及
び終わりの吸光度は溶解効率の直接の目安を与える。

グラム陰性生物は０．１ＮＮａＯＨという低いＮａＯＨ
濃度で効率良く溶解したが、表４は、効率的な溶解が、
インキュベーション温度が減少するにつれてより高いＮ
ａＯＨ濃度が必要とされるような、ＮａＯＨ濃度及び温
度の両者の関数であることを明白に示す、１００°Ｃ（
１気圧で最大温度）では、スタフィロコッカス　エピデ
ルミーイ？工及びストレプトコッカス　ファエ力リスの
効率的な溶解のためには、少なくとも１．６ＮａＯＨの
濃度が必要である。より低い温度が望ましいか又は必要
である場合には、溶解効率を維持するためにはより高い
ＮａＯＨの濃度が必要である。

本発明は限定ではなく例示として説明されてきたが、種
々の変更及び修正がなされうろことは理解されるであろ
う。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヘモグロビン突然変異に特異的なオリゴヌク
レオチド配列の固定化の結果のオートラジオグラフを示
す。 第２図は非放射性検出のためのラベルされたゲノムＤＮ
Ａとのハイブリダイゼーションの結果の写真である。 特許出願人　モレキュラー・ダイアグノスティックス・
インコーホレーテッド 第１図 ＾憂　フ“ローブ８１１′ロ　グ Ｎｃ　　ＮＹ　　　　　　　　ｔ＝ｗ　　ＮＹ２　　　
　　・　壷１１ ４つ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： ａ）核酸含有試験試料を調製し、この調製は試験試料中
   の核酸を標識することを含み、 ｂ）オリゴヌクレオチドまたは１種または２種以上の既
   知の微生物の一本鎖核酸または真核生物源からの配列一
   本鎖核酸を固定化することによって、１または２以上の
   プローブを調製し、 ｃ）交雑条件下に、標識した一本鎖の試料の核酸および
   固定化したオリゴヌクレオチドまたは一本鎖の核酸を接
   触させて、交雑した標識核酸を形成し、そして ｄ）標識を検出することによって、交雑した核酸につい
   てアッセイする、 を含んでなることを特徴とする核酸含有試験試料中の１
   種または２種以上の微生物または真核生物源からのポリ
   ヌクレオチド配列を検出する方法。 ２、標識した核酸を変性して標識した一本鎖核酸を形成
   する工程をさらに含む特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３、前記真核生物源は、藻類、原生動物、粘菌および哺
   乳動物の遺伝的疾患、例えば、アルファーサラセミアお
   よび鎌型赤血球貧血から成る群より選択される特許請求
   の範囲第１または２項記載の方法。 ４、標識は生きている全細胞または細胞のリゼイトの中
   で実施する特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載
   の方法。 ５、細胞のリゼイトは細胞をアルカリと接触することに
   よって調製する特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、標識は、蛋白質結合性配位子、ハプテン、抗原、蛍
   光化合物、色素、放射性同位元素および酵素から成る群
   より選択される特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに
   記載の方法。 ７、固定化は化学的反応または物理的吸着によって実施
   する特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法
   。 ８、プローブは固体の支持体のストリップ上のドットの
   形態で固定化された２種またはそれより多い既知の微生
   物または真核生物源からの配列である特許請求の範囲第
   １〜７項のいずれかに記載の方法。 ９、前記標識は核酸結合性配位子を試験試料中の核酸と
   光化学的に反応させることによって実施する特許請求の
   範囲第１〜８項のいずれかに記載の方法。 １０、１または２以上の容器内に、 ａ）１種または２種以上の微生物または真核生物源から
   のポリヌクレオチド配列をその上に固定化して含有する
   固体の支持体、 ｂ）試験試料の核酸を標識するための試薬、ｃ）試験試
   料中の核酸を変性するための試薬、および ｅ）交雑試薬、 を含んでなることを特徴とする試験試料中の１種または
   ２種以上の微生物または真核生物源からのポリヌクレオ
   チド配列を検出するためのキット。