JPS6036497A - 特定のヌクレオチド配列についてｄｎａ試料を試験する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、植物または動物の組織または流体の試料中の
細胞の特定の交ＩＪ：する核酸構成成分により１．（１
明されるように、このような試本）中の特定の遺伝的状
態の存在または不存在を決Ｗするための方法および装置
に関する。この状態は、この試験におけるその存在また
は検出されるｉ＋Ｊ能セＦについて臨床的に必ずしも表
わされるとはかぎらない問題のｙ、し者の組織１例えば
、全血Ｍ１！胞中のＤＮＡを試験することにより、漬り
、曲状１八〇、例えば、鎌状赤血球貧面について決定す
るための技術が存在する。現在構成されているような試
験は、時間を消費し、かつ試験の実施および結果の解釈
において極端な扶植を要求する。それらは、また、経費
を必要とし、そして不精確である。

本発明の目的は、試験ＤＮＡ標本中の特定の核酸配列の
存在または不存在についての簡単な、比較的安価なかつ
信頼性のある高い解像力の試験を提供することである。

これらの目的および他の目的および利点は、本発明によ
り実現される。本発明によれば、］−程： ａ）試験試料から核酸を抽出し、 ｂ）抽出された核酸を制限酵素で消化し、これにより、
制限酵、もの認識部位が試験ＤＮＡ中の配列中に精確に
存在するか台かに依存して、制限を行いあるいは１１わ
ず、 Ｃ）（ｂ）の生成物を処理して一木鎖核酸を形成し、 ｄ）（Ｃ）において生成された一本鎖の核酸を第１およ
び第２のポリヌクレオチドのプローブと接触させ、前記
第１　′８よびＭＳ２のポリヌクレオチドのプローブは
検出すべき前記配列のそれぞれ第１および第２の部分と
相補的であり、前記２つの部分は問題の制限部位と重複
せずかつそれにすぐの隣接し、このような接触は前記検
出すべき配列への前記第１および第２のプローブの交雑
に対して好適な条件下で実施し、前記プローブの両者を
用いる試験分子への交雑は−［程（ｂ）において制限が
起こらなかったかに依存し、前記第１プローブは区別ｉ
ｊ）能な標識を組み込んでおり、ｅ）前記第２プローブ
により、（ｉ）両者の前記標識付けされた第１プローブ
および第２のプローブへ交雑された検出すべき前記核酸
からなる得られたニー重交雑（ｄｕａｌ　ｈｙｂｒｉｄ
ａｔｉ。

ｎ）生成物を、（ｉ　ｉ）交雑しない単一に交雑化（ｓ
ｉｎｇｌｙ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）標識第１プローブ
から分離し、そして ｆ）前記標識により、存在しうる前記分離された二重交
雑生成物を検出する、 からなることを特徴とする試験試料中に含有されるＤＮ
Ａが特定の核酸配列を含むかどうかを決定する方法、が
提供される。

また、（１）試験試料の核酸中に存在する核酸配列を各
々が含む第１および第２のプローブ、第１プローブは区
別可能な標識を支持しかつ決、定が実施される液体中に
ｎ（溶性であり、第２プローブは固体の支持体−にに固
定されている、および（２）第１および第２のプローブ
に対して相補的な配列を分離する点において、特定の核
酸配列が存在するかあるいは存在しないかに依存して試
験試料を切り離すかあるいは切り離さない制限酵素から
なり、これにより陽性の決定試験試料（前記点において
切り離しが存在しない）は両者の第１および第２のプロ
ーブと交雑することができ、こうして標識を固体の支持
体へ引き統〈読取りのために固定する、ことを特徴とす
る前記試験を実施するためのキット、が提供される。

第１および第２のプローブは、それら自体特別の方法に
より形成される。例えば、クローニングされたβ−ヘモ
グロビン遺伝子を制限酵素により消化する。１１０記制
限酵素は前記遺伝子をある数の断片に細分割する。鎌状
赤血球貧血の検出の場合において、問題の２つは３４０
ｂｐ　（塩基対）単位およびｚｏｔｂｐ単位である。断
片をサブクローこ〉′グにより互いに分離し、そしてそ
れらの−力、すなわち、３４０ｂｐＮｉ位の断片を固体
の支持体、例えば、ニトロセルロースのシーｉ・または
ディスクへ固定し、固定されたプローブを構成する。他
方の断片を放射性基、あるいは化学的に検１１障り能な
ノ、（、例えば、変性された塩基または視的に検出可能
な基、例えば、蛍光を発するかあるいは紫外線または赤
外線を吸収する特性をもつもので標識付けする。

このＬ順の重要な点は、影響を受けた試験試料と受けな
い試験試料との間の差において、それらの一方が、制限
酵素で処理したとき、固定されたプローブおよび標識付
けされたプローブの両者と交雑することができるように
各プローブより長１．）断片が存在し、これに対して他
方はこのように長い単位をもたず、それゆえ両者と交雑
することができないということである。二重交雑は、一
方の試験試料を介するが、他方の試験試料を介しなＩ／
）で標識を固体の支持体へ結合することに対して重要で
あり、このような支持体は標識の存在につ（／１て究極
的に分析されるものである。

１例として鎌状赤血球貧血では、正常のヘモグロビン遺
伝子を使用して３４０および２０　Ｌ　ｂ　ｐのプロー
ブをつくることができ、そして銹状赤血ｆ＋、貧血ヘモ
グロビンＤＮＡは、消化すると、２つを力／ヘーシかつ
二重交雑をすることができる長し１断片を有し、これに
対し同様に処理した正常のＤＮＡはこのような断片をも
たないであろう。

プローブを生成しおよび／または試験試料を処理するた
めにＤＮＡ物質を酵素的の消化する方法は、種々の分離
法と同様に、この分野において知られている。

本発明をとくに器状赤血球貧血を参照して説明するが、
本発明は存在をＤＮＡの特定の分子の変化に関連させる
ことが可能な他の遺伝的疾患に同様によく適用すること
ができる。特定の制限酵素を見つことのみを必要とする
。この制限酵素は、影響を受けた遺伝子または受けない
遺伝子の一力のみを分解して、プローブをつくるのに必
要とする断片を形成する。次いで、このプローブは、影
響を受けた試験試料または受けない試験試料の一方また
は他方が両者のプローブと二重交雑をすることができる
長い断片を形成する」二うな方法で、予備処理された前
記試料を区別することができる。

本発明を添付図面を参照しながらさらに説明する。

とくに図面を参照すると、第１図において、Ａはβ−一
・モグロビンを暗号化する遺伝子の開始、ならびに表現
されない側面に位置するＤＮＡ　（左への細い線）の地
図である。太い部分は、β−ヘモグロビンへ翻訳される
メツセンジャーＲＮＡの前駆物質であるＲＮＡに転写さ
れるＤＮＡを定め、そしてこれは図面の左を過ぎて連続
する。ぬりつぶした区域はタンパク質のアミノ酸配列を
実際に暗号化するものである；３つの空白の区域は、左
から右に、ｍ　ＲＮ　Ａ中に存在する翻訳されないリー
ダー（ｌｅａｄｅｒ）配列、短い介在配列、および長い
介在配列であ°る。２つの介在配列はグロブリンｍＲＮ
Ａに対するＲＮＡ前駆物質中に存在するが、ｍＲＮＡ自
体において欠けている；それらはｍ　ＲＮ　Ａ成熟過程
の一部分である分子内の切り継ぎの結果除去される。線
の−にの記号は制限酵素の切り離し部位を示し、そして
鎌状赤ｍ１球遺伝子において特別に欠けているＤｄｅＩ
／Ｍ　ｓ　１１部位が示されている。クローニングされ
たプラスミドｐＳＳ７３７中に表わされた０、７４ｋｂ
のＡｌｕＩセグメントも示されている。

Ｂは、二重交雑試験においてプローブとして使用できる
β−グロブリン遺伝子のサブクローニングされたセグメ
ントの例を示す。２形成りｄｅ　Ｉ／　Ｍ　ｓ　ｔ　１
１部位の上流のＨｉ　ｎｆ　Ｉ部位５塩基対が存在し、
そしてこれはプラスミドベクトル（ＰＢＲ３２２）を経
てクローニングされた０、３４ｋｂのＨｉｎｆｌセグメ
ントの１端が存在する。

２形成りｄｅＩ部位自体はＰＢＲと配列を共有しないフ
ァージベクトル（Ｍ１３　ＭＰ８）を経てサブクローニ
ングされた０、２０ｋｂのＤｄｅ　Ｉセグ、メントの１
端である。相互（ｒｅｃｉｐｒ。

ｃａｌ）クローニングをまた実施した。図面において、
均一な線はクローニングされたヒ）ＤＮＡセグメントで
あり、そしてジグザグな線はベクトル配列の隣接部分で
ある。隣接ＤｄｅＩセグメントが弔にサブクローニング
されなかった理由は、０．１７５ｋｂ（７）ＤｄｅＩ（
！グメント（下のＣ参照）が不必要に短いことにある。

隣接するＭｓｔＩ＋セグメント（０，１４ｋｂの長さの
１つ；Ｃ参照）がサブクローニングされなかった理由は
、Ｍｓ　ｔ　ＩＩで処理されたＤＮＡが結合されえない
ことにある。

Ｃは正常のβ−グロブリンのアレル（ａ　ｌ　ｌ　ｅｌ
ｅ）を含有するヒトＤＮＡおよび紐状赤血球のアレルを
含有するＤＮＡを、Ｄｄｅ　ＩまたはＭｓｔ　ＩＩで消
化して得られた関連生成物を比較する。

細状赤血球の体質をもっ人（＋／ｓ）がらのＤＮＡは両
者の組のＤＮＡセグメントをもつであろう。

第２図において、左および右において、前述のように分
離プローブおよび検出プローブを用いて開始する。変性
された分離プローブを固体の支持体へ結合する。検出プ
ローブを標識付けし、変性する。

未知の検体を処理してそのＤＮＡを抽出し、これを消化
し、変性する０次いで、プローブおよび処理したＤＮＡ
を交雑条件下で混合する。次いで、二重に交雑した物質
を結合して有する固体を、標識についてアンセイする。

以下の例示的実施例により、本発明をさらに説明する。

これらの実施例中において、すべての部は、特記しない
かぎり１重量による。

川 ■、必ＩＬケ」し刈ム： 二組交雑の利用についての簡単な実施例について、プラ
スミドｐＢＲ３２２βＰｓｔまたはプラスミドＰＳＳ７
３７　［両者は、ジョン争ウィルソン博士（Ｄｒ、Ｊｏ
ｈｎ　Ｗｉ　１ｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ　ＣｏＣｏ１１
ｅ　ｏｆ　Ｇｅｏｒｇｉａ）から人手し、そしてＧｅｅ
ｖｅｒ、ｅｔａｌ、、（１９８１）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅＵ
、Ｓ、Ａ、Ｌ下、５０５８−５９８５　に記載されてい
る］、入手可能な、他のいくつかのヒトβ−ヘモグロビ
ン遺伝子を、それからサブクローニングされたセグメン
］・（下の２を参照）と−諸に使用するだけでよい。鎌
状赤血球血色素血症への応用性（および制限部位の多形
成を含む他の疾患への拡張性）の実施例について、＋／
＋およびＳ　／　Ｓの個体からのＤＮＡをも必要とする
。

２、プローブのサブクローニング プラスミドｐｓｓ７３７は、β−ヘモグロビン遺伝子を
含む０．７４ｋｂのＰｓｔＩセグメントを含有する（第
１図参照）。クローン中の問題の制限部位は、遺伝子の
コドン５〜７を含むＤｄｅＩ　／　Ｍ　ｓ　ｔ　ＩＩで
ある。なぜなら紐状赤血球アレルにおいて、酵素の認識
７′切り離し部位を変更する弔・のＡ〜Ｔ変化が存在す
るからでる（ＤｄｅｌについてＣＴＮＡＧ；ＭｓｔＩＩ
についてＣＣＴＮＡＧＧ）。サブクローニングの１」的
は、クローニングされた野生型遺伝子をこの点において
切り裂いて、隣接する（または、一般に、はぼ隣接する
）および重ならない配列をもつ２つのプローブをつくる
ことである。１つのプローブ、分離プローブと表示する
、はマトリックス結合しかつ一本鎖であり、そして未知
のＤＮＡを交雑により不動化するであろう。他方のプロ
ーブ、検出プローブと表示する、は標識付けされ、また
−末鎖であり、そして溶液中で未知のＤＮＡと交雑する
であろう。未知のＤＮＡは制限部位ＤｄｅＩおよび／ま
たはＭ　ｓ　ｔ　ＩＩで処理されており、そして問題は
、検出プローブが分離プローブへの架橋を介して不動化
されうるか否かということである。この架橋は未知のＤ
ＮＡにより提供される。未知のＤＮＡがβ−グロブリン
遺伝子に関して野生型である場合、ＤｄｅＩまたはＭ　
ｓ　ｔ　ＩＩの消化はこのような架橋を排除するであろ
う。しかしながら、紐状赤血球アレルはこれらの酵素に
対して関連する部位において不感受性であるので、Ｓ／
ＳまたはＳ／＋であるゲノムＤＮＡはある検出プローブ
の不動化を許すであろう（ゲノムＤＮＡの消化および検
出プローブの標識付けについて３および４を参照）。

サブクローニングは、次のように進行するニブローブｐ
ＳＳ７３７を精製し、そして１つの試料をＤｄｅＩで完
全に消化する；他の試１シをＨｉｎｆＩで消化する（第
１図参照）。得られるＤＮＡセグメントを調製用の低融
点アガロースゲル中の電気泳動により大きさに従って分
離する。このゲルを臭化エチジウムで着色して、ＵＶ透
過により可視化させ、そしてＨｉｎｆＩ消化からの０．
３４ｋｂおよびＤｄｅＩ消化から（７）０．２０ｋｂの
ＤＮＡの帯を切除する。ゲルの切片中の７ガロースをフ
ェノール抽出およびエタノール沈殿により精製する。こ
れらのＤＮＡを水中に再溶解させる。この吟点において
、（１３４ｋｂのＨ１ｎｆ工消化生成物は、次の構造を
有する： ５　’ＡＮＴＣ，，，，，Ｇ Ｇ、、、、、ＣＴＮＡ５” そして０．２０ｋｂのＤｄｅ　Ｉ消化生成物は、次の構
造を有する： ５　’ＴＮＡＧＧ、、、、ＣＣ ＣＣ、、、、ＧＧＡＮＴ５　’ セグメントのクローニングは、それぞれＨｉｎｆ■およ
びＤｄｅＩ／ＭｓｔＩＩの部位が大端において保持され
るように実施することが望ましく、そしてこれを実施す
る実際的方法は酵素で直線化されたベクトルへ前記セグ
メントをプラント末端結合する（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ　
ｌｉｇａｔｅ）ことであり、前記酵素は、クローニング
すべきセグメントと融合（ｆｕｓｉｏｎ）したとき、酵
素切り離し部位の修復を構成する末端を与える。とくに
、ＨｉｎｆＩセグメントはＣ１ａＩで消化されたｐＢＲ
３２２巾に挿入してＨｉｎｆＩ切り離し部位を修復する
；ＤｄｅＩ　（ＭｓｔＩＩ）　セグメントは、Ｎａｅｌ
で消化されたｐＢＲ３２２中へ、あるいはＳｍ　ａ　Ｉ
で消化されたファージＭ　１３　ＭＰｇ　ＤＮＡ中へ挿
入することができる。

Ｃ１ａＩはｐＢＲ３２２を部位 、、、ＡＴ　ＣＧＡＴ、、、。

、、、、ＴＡＧＣＴＡ、、。

で切り離す。Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼの大き
い（Ｋｌｅｎｏｗ）断片による改なる末端の充填（ｆｉ
ｌｌｉｎｇ−ｉｎ）は１ 、、、ＡＴＣＧ　ＣＧＡＴ、、。

、、、ＴＡＧＣＧＣＴＡ、、。

を生成する。サブクローニングすべきＨｉ　ｎｆ　Ｉセ
グメントの末端の充填は、 ＡＮＴＣ、、、、、ＧＡＮＴ ＴＮＡＧ　、、、、、ＣＴＮＡ を生成し、そしてこれをベクトルと結合すると、配列 、、、ＡＴＣＧＡＮＴＣ、、、、、ＧＡＮＴＣＧＡＴ、
− 、、、ＴＡＧＣＴＮＡＧ　、、、、、ＣＴＮＡＧＣＴＡ
、、。

が生成し、これはＨｉｎｆＩ部位［複数のオーバーライ
ン（ｏｖｅｒｌｉｎｅ）］を保持する。

β−グロブリン遺伝子の０．２０ｋｂのＤｄｅＩ　（Ｍ
　ｓ　ｔ　ＩＩ）セグメントを、次の末端を与える酵素
で直線化されたベクトルの末端へ結合する： 、、、ＣＣＧＧ、、。

、、、ＧＧ　ＣＣ，、。

１つのこのような酵素はＳｍａＩ　（ＣＣＣＧＧＧ）で
°あり、そしてこれは、弔−のＳ　ｍ　ａ　Ｉ部位を有
するＥ、ｃｏｌｉの；７ｒ−ジ　Ｍ　１３　Ｍ２Ｓへの
クローニングに使用することができる。

他のこのような酵素はＮａｅＩ（ＧＣＣＧ　ＧＣ）であ
り、コレはＰＢＲ３２２を４回、４゜ｌ、１２８２およ
びそれらの間の他の２つの部位において切り離す。プラ
スミドは１２８２および４０１の間において無傷で残り
、そして崩壊される唯〜の機能はテトラサイクリン抵抗
性をり゛・える能力である。ｚｏｔｐｂのＤｄｅＩセグ
メントのクローニングのため、ベクトルの調製は、Ｎａ
ｅＩによるｐＢＲ３２２の消化、および生成物をアルカ
リ性ホスファターゼで処理して末端ホスフェートを除去
することを含む（これは引き統〈結合のｔｍの単純なベ
クトルの環状化を失わせる）。大きいベクトルのセグメ
ントは、調製用ゲルの電気泳動により精製される。プラ
ント末端の結合を達成するために、β−グロブリンのＤ
ｄｅ１セグメントの末端を充填してそれらを１ｉ−らに
（ｆｌｕｓｈ）する。上に示唆したように、これはセグ
メントをＥ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎ
ｏ断片および４種のデオキシリポヌクレオシトトリホス
ペード類で処理することにより実施する。これらの断片
およびＮａｅＩ処理ベクトルの混合物をＴ４およびＡＴ
Ｐとともにインキュベーションし、次いで使用してバク
テリア細胞を形質転換してこの細胞に裸のＤＮＡを取り
−Ｌげる能力をもたせることができる。前記細胞を培地
」二に配置する。この培地は、細胞により取りヒげられ
るプラスミドにより抵抗性を授与される抗生物質を含有
する（例えば、ｐＢＲ３２２の場合においてアンピシリ
ン）。

個々の形質転換体のコロニーを、問題のプラスミドにつ
いてスクリーニングする。このスクリーニングは、多少
の細胞を小体積の液体中で生長させ、次いで細胞を溶解
してプラスミドＤＮＡを解放することによって実施する
。ＤＮＡを精製し、所９の挿入体（ｉｎｓｅｒｔ）のプ
ラスミド中の存在についてセグメントの診断をり−える
指示された制限酵素で処理し、次いでＤＮＡはアガロー
スゲル中で大きさに従って表示される。いったん適右な
縮み換えプラスミドが同定されると、それらが生１７た
コロニーを使用して大きい培地を接種し、前記培地から
プラスミドの数〔１の微生物が調製される。また、コロ
ニーはぺ１・り皿上に維持し　後の使用のために凍結し
て保存される。

β−ヘモグロビン遺伝子の鎌状赤血球変異型の検出のた
めのプラスミドのプローブを発生させる特定の場合にお
いて、１つのプラスミドは０．３４ｋｂのＨｉ　ｎｆ　
Ｉセグメントを含有し、そし−Ｃ他のものは隣接の（１
２０ｋｂのＤｄｅＩセグメントを含有する。二重交雑法
においてベクトルの交雑が誤った陽性の結果を与える可
能性が少なくとも存在するので、２つのプローブが無関
係のベクトル中に支持されることが望ましい。これは一
方のプローブについてＥ　、　ｃ　ｏ　ｌ　ｉ宿主／ベ
クトル系を使用し、そして他方についてＢ、ｓｕ、ｂｔ
ｉｒｉｓ宿主／ベクトル系を使用することによって最も
明瞭になされる。あるいは、一方のプローブをＥ、ｃｏ
ｌｉプラスミド例えばｐＢＲ３２２中に存在させ、そし
て他方をＥ、ｃｏｌｉファージ例えばＭ１３中に存在さ
せることができる。

分離プローブ、例えば、ｐＢＲ３２２の０．３４ｋｂの
ＨｉｎｆＩセグメントを含有するプラスミド（第１図）
を、０．１モルのＮａＯＨで５分間処理し、次いで水中
で冷却する。この試＞’＋を等体積の０．１ＮＨＣＩ、
０．９モルのＮａＣ１，０，０９モルのＮａクエン酸塩
で中和し１次いモニトロセルロースのフィルター（例え
ば、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１か
ら入ｆｎｆ能なりＡ　８５）を通しておだやかな吸引の
もとに濾過する。この体フィルターは、０．９モルのＮ
ａＣ１，０，０９モルノＮａクエンＭｌｂで予備ソーキ
ングされている（６×ＳＳＣ；ＬＸ標準クエン酸塩食塩
水＝０．１５モルのＮａＣ１，０，０１５モルのＮａク
エン酸塩）。次いで、濾液を６ＸＳＳＣで、次いで７０
％エタノールで洗浄し、そして８０°Ｃにおいて数１１
′１−間減圧下にあるいは６５℃で〜夜ｆＬ空の不存在
下にベーキングする。この時点において、フィルターは
交雑手順に使用可能な状態にあるが、数か月間乾燥状態
で貯蔵することができる。

プラスミドのアルカリ処理の目的は、ＤＮＡを変性する
ことである。これはＤＮＡのニトロセルロースへの結合
をｏ（能としく自然ＤＮＡは結合しない）かつ他の一本
鎖ＤＮＡとの引き続く交雑に有効とする。変性されたＤ
ＮＡ溶液を酸で中和し、そして塩を添加する（例えば、
６ＸＳＳＣ）と、変性ＤＮＡのニトロセルロースへの結
合が促進され、そして低温はプラスミドがニトロセルロ
ース上へ適用される間のプラスミドの再アニーリングを
阻［［−する。フィルターのベーキングは最終的にＤＮ
Ａを不動化する。

検出プローブの例えば３２ｐによる標識伺けは、いくつ
かの方法で達成することができ・それらの方法のすべて
は標準法である：制限エンド〆クレアーゼの作用により
直線とされたプラスミドの末端を、次の方法により標識
付けすることができる：ポリヌクレオチドキナーゼがγ
３２ｐ　ＡＴＰの末端ホスフェートをＤＮＡ分子の５゛
へ付加する反応；ある制限酵素により発生されたくぼん
だ（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）３’末端を、Ｅ、ｃ。

１ｉのＤＮＡポリメラーゼの大きい断片（Ｋｌｅｎｏｗ
）およびα３２ｐ−標識デオキシリポヌクレオシトトリ
ホスフェート類の使用による充填：または末端デオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼの作用による標識ヌ
クレオチド類の末端伺加の作用による、標識ヌクレオチ
ド類の３′末端伺加。より高度のプローブの標識付けは
、ファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼの使用により、ある
いはＥ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ、標識トリホス
フェ−Ｉ・類、およびデオキシリボヌクレアーゼ■によ
り不規則に切り込まれて多数の合成プライマー部位を生
成したプラスミドを使用する銀置換ＤＮＡ合成（「切り
込み翻訳（ｎｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）Ｊ）に
より達成することができる。放射能を含まない他の標識
付は法も可能である。

４、　未知のＤＮＡの試゛Ｌの１ 一゛１重交雑を利用する最も筒中な実施例において、ｐ
ＢＲ３２２またはｐ　Ｓ　Ｓ　７３７　（ｆｔＳ２図）
を使用することがヤきる。ただし、サブクローニングさ
れた検出プローブが「未知のもの」の不存在で不動化性
セレクターサブクローン（ｓｅｌｅｃｔｏｒ　５ｕｂｃ
ｌｏｎｅ）と交雑しないことが保証されなくてはならな
い（モデルの目的に対して、検出体は「未知のもの」と
グロブリンセグメントの相同性およびベクＩ・ルの相同
性の［Ｊ４　Ｊに：より交雑できることは重要ではない
）。Ｐｓｔおよび５Ｓ７３７のセグメントはすでにｐＢ
Ｒ３２２中に存在するので、２つのプローブを構成する
最良の方法はセレクタープローブ（０，２０ｋｂのＤｄ
ｅＩセグメント、（２）において述べた）をＢ、５ｕｂ
ｔｉｌｉｓベクトル中に、あるいはＥ、ｃｏｌｉのファ
ージＭ１３中に入れ、そして検出プローブをｐＢＲ３２
２中に入れることである。ｐＢＲ３２２Ｐｓｔ、有用な
未知のもの、をつくるために、１つのアリコートを、Ｍ
　ｓ　ｔ　ＩＩおよび／またはＤｄｅ　Ｉで消化し、そ
してこれは野生型グロブリン遺伝子を含有するＤＮＡを
表わす、ｐＳＳ７３７をＤｄｅＩで処理することができ
る。プラスミドの第２のアリコートを問題の区域の外側
を切り離す酵素により直線化するが、理想的には０．３
８ｋｂのＤｄｅ　Ｉセグメントより大きすぎず、かつグ
ロブリン遺伝子の鎌状赤血球アレルを含有するＣＮＡの
消化から生ずる１、３４ｋｂのＭ　ｓ　ｔ　ＩＩより大
きすぎない長さをもつセグメントを発生させる。このよ
うな踵状赤血球ＤＮＡの模倣体（ｍｉｍｉｃ）は、ｐＢ
Ｒ３２２βＦｓｔを２形成りｄｅＩ／Ｍｓｔｌ！で消化
し、中央に２形成りｄｅＩ／ＭｓｔＩＩをもつ０．７４
ｋ　ｂのセグメントを形成することにより、得ることが
できるであろう。同一の結果はｐｓｓ７３７をＥｃｏＲ
Ｉで処理する場合に得られる。なぜなら、５Ｓ７３７は
合成ＥｃｏＲＩリンカ−（Ｉｔｎｋｅｒ）を経てｐｓｓ
７３７ｃ７）ＥｃｏＲＩ部位中へ挿入された同一のＡＩ
ｕＩセグメントをもつからである。

Ｓ　／　ｓおよび＋／＋からのゲノムＤＮＡを使用する
実施例について、ＤＮＡは１０〜５０ｍ１の血液から、
ＲＢＣからの分離、高濃度の塩および洗浄剤中の白血球
の溶解、フェノールを用いる抽出およびエタノール沈殿
により、次のようにして、最も容易に調製される： ＤＮＡの急速調製 １）　血液（または羊水、尿または分散された／くイオ
ブシ−（ｂｔｏｐｓｙ））の試料に、１／４容１＆ノ０
　、２５モルノＴ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ、ｐＨ７，８
，０、５モル（７）Ｎ、ａ　２ＥＤＴＡ、１％のＮｏｎ
１ｄｅｔ　Ｐ−４０を添加する。おだやかであるが、完
全に混合する。

２）　核の粗製調製物を、円錐形の管中に低速遠心によ
り集める。核を０．５ｍｌの０．０５モルのＴｒ　ｉ　
Ｓ、０　、１モルのＥＤＴＡ中の懸局させる。

３）　０．５ｍｌのＮａＣ１，２％の５ａｉｋ。

ｓｙｌを添加し、激しくかつ完全に混合する。１ｍｌの
フェノール／クロロホルム［１：１、フェノール（飽和
ｗ／ｌｒｉｓ−ＥＤＴＡ）およびクロロホルム］を添加
し、乳化する。５分間激しく振盪し、次いで高速遠心す
る。

４）　水相（Ｊ、、）を集め、有機相および変性された
タンパク質の帯が乱れないで残る。他の５ｍｌの管へ溶
液を移し、次いで２．５ｍｌの９５％のエタノールを添
加する。よく混合し、次いで高速遠心する。

５）　十澄みをデカンテーションし、次いで３ｍｌの７
０％のエタノールを管に添加する。激しく（渦）混合し
て沈降物を懸濁させ、次いで高速遠心する。エタノール
をデカンテーションし、次いで７０％のエタノールの洗
浄を反復する。遠心およびデカンテーション後、３ｍｌ
の９５％のエタノールを添加し、混合し、次いで高速遠
心する。デカンテーションし、管を乾燥する。

６）　沈降物を０　、１　ｍ　ｌの制限酵素の消化緩衝
液中に溶解させ、次いで０　、０１　ｍ　ｌの制限酵素
を添加する。３７℃において１時間以上インキュベーシ
ョンする。

リボヌクレアーゼおよびアミラーゼの上程を含めること
ができ、そしてＤＮＡの純度を確保するために、核酸を
ＣｓＣ１浮力密度平衡勾配中で遠心することができる。

ＤＮＡを勾配分画から３容量の７０％のエタノールで沈
殿させることにより集め、沈殿を７０％および９５％の
エタノールで洗浄する。沈殿を乾燥し、次いでＤＮＡを
ＴＥ（１０ミリモルのＴｒ　ｉ　５−ＨＣ１，ｐＨ７。

６．１ミリモルのＮａ２　ＥＤＴＡ）または水中の溶解
する。

ゲノムＣＮＡを未知のものとして使用するとき、最良の
実施例およびこの分野における場合のように、制限酵素
の消化は完結に近づげゝるかあるいはそれに密接に近づ
けることが重要である。とくに、野生型ＤＮＡ中に存在
するが、鎌状赤面球の遺伝子中に存在しないＤ　ｄ　ｅ
　Ｉ　／　Ｍ　ｓ　ｔ　！１部位は、鎌状赤血球アレル
をもたないＤＮＡの試料中で切り離されなくてはならな
い。商業的に入手可能なＭ　ｓ　ｔ　ＩＩは高度には活
性でないので、消化ができるだけ完結するように注意し
なくてはならいない。このような注意は、理論的に要求
されるよりは１桁多い酵素の使用を含む。それは、また
、鎌状赤血球の特別な場合において、過剰のＭｓｔＩＩ
およびＤｄｅ　Ｉを使用するＤＮＡの消化を含むことが
できる（この場合において、問題の鎌状赤σ１球のＤＮ
Ａセグメントは１．３４ｋｂ（７）長さよりも０．３８
ｋｂだけ長いが１これは非常に重要であるというわけで
はない）。消化の時間を長く干ることは、多くの酵素が
１時間以内に消化混合物中に希釈されるので、好ましく
ない。

５、ダ暮 交雑手順は一本鎖ＤＮＡ類を含むので、セレクタープロ
ーブがその」；で不動化されるニトロセルｔ１−スのフ
ィルターを予備処理して、未知のＤＮＡおよび検出プロ
ーブがそれに無差別に結合しないようにしなくてはなら
ない。このような処理は、通常、フィルター−ヒに存在
する部位をタンパク質および多糖でデンハル）（Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ）の溶液として知られている混合物（水中の
各０．２％のウシ血ン古アルブミン、フィニルおよびポ
リビニルピロリドン）中で飽和させることを含み、ここ
で、多少の塩および緩伊１液（例えば、６ｘｓｓｃ、０
　、１モル（７）Ｔｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ８）とともに、フ
ィルターを交雑に用いる温度（例えば、６５℃）におい
て数時間ソーキングする。次いで予備ソーキング溶液を
、変性試料（未知）および変性検出プローブを含む交雑
媒質と置換し、そしてＤＮＡのアニーリングを数時間進
行させる。

２つの代表的な交雑条件は、次の通りである：（ｉ）６
ＸＳＳＣ，０，１モル（７）ＴｒｉＳ、ｐＨ８，６５°
Ｃ、デンハルト溶液の添加は任意である；　（ｉ　１）
４ＸＳＳＣ１４０％のホルムアミド、４０℃、士デンハ
ルト溶液。液体の必要祉を最小とし、かつ蒸発を防止す
るために、交雑はプレスされかつシールされたプラスチ
ックのバッグ中でしばしば実施される。

交雑後、セレクタープローブへ対して正確に塩基対とな
らなかったＤＮＡ類をフィルターから、溶液中で１連の
フィルターのソーキングにより、洗浄除去する。これは
雑種の安定性を維持するために広範なアニーリングを必
要とする。例えば、フィルターを大きい容量の０．２Ｘ
ＳＳＣで６５°Ｃにおいてソーキング溶液を交換して２
回ソーキングしく低いｉ１Ｘ濃度において塩基対の程度
に劣る雑種は解離する）、次いで大きい容にの０．２×
ＳＳＣで室温においてソーキング溶液を交換して２回ソ
ーキングする。フィルターを次いで濾紙ｌ−の吸い取り
により乾燥する。検出プローブを３２ｐで標識付けした
場合、フィルターをＸ線フィルムと重ね、ある時間後こ
のフィルムを現像することにより、フィルターをオート
ラジオグラフィーにかける；あるいは、フィルターディ
スクまたはフィルターシートの一部分を水中に浸漬し、
そして液体シンチレーションスペクトロメーターでチェ
レンコフ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）放射な′測定することに
より、放射能についてア・ソセイすることができる。

６、％４に゛ける手順の説 上の部４における手順を参照すると、（１）におけるＴ
　ｒ　ｌ　ｓ、　ＥＤＴＡおよびＮｏｎ１ｄｅｔを流体
中の細胞の試料へ添加する目的は、細胞を溶解するが、
核を溶解せず、かつそれを実施する間デオキシリボヌク
レアーゼ類を阻害することである。Ｔｒｙｓは緩衝剤は
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである；　Ｎ
ａ２　ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
、ＤＮａｓｅ活性のために要求される二価のカチオンの
キレート剤である：非イオン洗浄剤、例えば、ＮＰ−４
０（またはＴｒｌｔｏｎ　Ｘ−１００）は細胞膜を可溶
化するが、細胞核には有意の影響を及ぼさない。

この工程の結果は、細胞、とくにＲＢＣが崩壊され、事
実上被のみが無傷のままで残留することである。この目
的は、二［程（２）における低速の遠心の間、核を除い
たほとんどすべての細胞物質はＩ−、澄み中に残るよう
に、試料をコンディショニングすることである。

工程（２）の目的は、低速遠心（例えば、１ｋｇで５〜
１０分）により核を儂縮し、しかつ核を細胞物質の残部
および流体から、弔に上澄みを注ぎ出すことにきより分
離することである。核を上程（１）ｃ７）Ｔｒｌｓ−Ｅ
ＤＴＡ中に、洗浄剤の不存在下に、懸濁させて、核を工
程（３）のための抽出管へ移送する。この移送は遠心管
の使用により回避することができ、この遠心管は底部を
有し、この底部は開口しかつねじ込みにより５ｍｌ容の
ふた付き抽出管を受け入れる。抽出管はそれ自体工程（
３）〜（５）における高速遠心に耐えることができる。

沈降した核が粘着性である場合、それＩＷ衝液（および
必要に応じて、固定（１）において使用した４Ｘ緩衝液
）中にポリアニオンのスペルミンおよび／またはスペル
ミジンを含有させることによりｉＱ懸濁することができ
る。

工程（３）の［」的は、ヌクレオタンパク質錯体を高濃
度の塩で解離し、イオン性洗浄剤の５ａｒｋＯ３ｙ１（
Ｎａラウリルサルコシネート、これは高濃度の塩中にか
つ冷時に口ｆ溶性であのでＳＤＳよりも利点をもつ）、
そしてタンパク質を有機溶媒のフェノール中に分配させ
るかあるいはフェノールおよびクロロホルムで沈殿させ
ることによりタンパク質を溶液から分離することである
。

遠心すると、振盪により生成された乳濁液は３つの相に
分離する：下の有機相、変性されたタンパク質の帯、お
よび上の水相。この水相は核酸および炭水化物（主とし
てグリコーゲン）、細胞中に蓄積されたものであろう、
を含有する。

工程（４）のｉ」的は、水相を注意して回収し、次いで
これを約７０％のエタノールで溶液することにより核酸
を沈殿させることである。水相が高分子量のＤＮＡの存
在によるつくられた粘度のために、ピペントにより、集
めることが困難である場合、工程（３）における激しい
振盪はＤＮＡの大きさを十分に減少させるであろう。あ
るいは、多少の慎重なりＮＡの剪断を導入することが必
要であろう［工程（３）を変更することにより、懸濁さ
れた核をまず注射器中の２モルのＮａＣ１のみで処理し
、２７ゲージの針を通して抽出管中に押［７入れてＤＮ
Ａに剪断を与え、次いで５ａｒ−ｋｏｓｙｌおよびフェ
ノール／クロロホルムへさらす］。

工程（５）におけるエタノール洗浄のｌＪ的は、残留す
る溶媒および塩類を核酸の沈殿から除去することである
。９５％のエタノールで洗浄した後、管を短時間沈降物
が完全に乾燥する点まで乾燥すべきである。湿ったＤＮ
Ａは乾燥したＤＮＡより容易に溶解する。事実−Ｌすべ
てのエタノールを除去して、工程（６）を妨害しないが
、ＤＮＡが完全に乾燥するほど多くない液体を含有する
よにすることができる。管を数分間通さにして廃液し、
次いで沈降物のすぐ近くを除外した管の内部をＱチップ
（Ｑ、−ｔｉｐ）でぬぐうことができる。

工程（６）の目的は制限エンドヌクレアーゼの作用に適
する緩衝液中にＤＮＡを溶解し、次いでその酵素でＤＮ
Ａを消化することである。制限酵素の緩衝液は、一般に
、ミリモル都のＴｒｉｓ緩抄ｉ液、Ｍｆ”　”、メルカ
プトエタノール、および０．１５モル程度に高い濃度の
塩を含有する。また、時には、ウシ血清アルブミンを含
有させて酵素の可溶化を促進することが望ましいであろ
う。

塩類、とくにＭｇ＋１の存在はＤＮＡの溶解を抑制する
ので、ＤＮＡを水中に溶解した後、分画容量の濃緩衝液
／ｌ！Ａ類を添加することが有利である。例えば、ＤＮ
Ａ沈降物を０．０８ｍ１のＨ２Ｏ中に溶解し、そしてこ
れに０．０１ｍ１のｌＯＸ緩衝液／塩類および０　、０
１　ｍ、　ｌの酵素を添加することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヘモグロビン遺伝子、第１および第２のプロ
ーブ調製および１［：常なりＮＡおよび鎌を赤血球ＤＮ
Ａの消化生成物を示すグラフである。 ｆｆ１２図は、第１および第２のプローブおよび未知の
ＤＮＡを用いる二暇の交雑を含む本発明の方法のフロー
シートである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： ａ）試験試料から核酸を抽出し、 ｂ）抽出された核酸を制限酵素で消化し、これにより、
   制限酵素の認ｍ部位が特定の配列中に存在するか否かに
   依存して、前記配列においてＤＮＡを切り離しあるいは
   切り離さず、 ｃ）（ｂ）の生成物を処理して−・末鎖核酸を形成し。 ｄ）（ｃ）において生成された一本鎖の核酸を第１およ
   び第２のポリヌクレオチドのプローブと接触させ、前記
   第１および第２のポリヌクレオチドのプローブは検出す
   べき前記配列のそれぞれ第１および第２の部分と相補的
   であり、前記２つの部分は問題の制限部位と重複せずか
   つそれにすぐの隣接し、このような接触は前記検出すべ
   き配列への前記第１および第２のプローブの交雑に対し
   て好適な条件下で実施し、前記プローブの両者を用いる
   交雑は工程（ｂ）において制限が起こらなかったかに依
   存し、前記第１プローブｔ±区別可能な標識を組み込ん
   でおり、 ｅ）前記第２プローブにより、（ｉ）両者の前記標識材
   けされた第１プローブおよび第２のプローブへ交雑され
   た検出すべき前記核酸からなる得られた二重交雑生成物
   を、（ｉ　ｉ）交雑しない単一の交雑化標識第１プロー
   ブから分離し、そしてｆ）前記標識により、存在しうる
   前記分離された二重交雑生成物を検出する、 からなることを特徴とする試験試料中に含有されるり、
   ＮＡが特定の核酸配列を含むかどうかを決定する方法。 ２、第２プローブは、第１プローブおよび検出すべき前
   記配列の交雑生成物を交雑しない単一交雑化第１プロー
   ブから分離することを可能とする形態であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１．＋１７記載の方法。 ３、第２プローブは固体の支持体へ固定されていること
   を特徴とする特１作請求の範囲第１項記載の力ｎ、。 ４、プローブの各々は異る宿主ベクトル系におけるサブ
   クローニングにより独立に生成される特許請求の範囲第
   １〜３項のいずれかに記載の方法。 ５、第１および第２のプローブは、試験試料の物質と回
   −・の物質を含有するクローニングされた核酸の消化し
   、ここで消化は２つの核酸断片を生成する、２つの断片
   を一方が第２プローブになるように分離し、そして区別
   可能な標識を第１プローブとなる断片に適用し、前記標
   識の適用を消化または分離の前または後に実施する、こ
   とによって得られる、ことを特徴とする特許請求の範囲
   第１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６、消化は制限酵素を用いて実施することを特徴とする
   特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、第１および第２のプローブはヘモグロビン遺伝子の
   消化により生成され、試験試料は鎌状赤血球貧血につい
   て試験される患者のヘモグロビン遺伝子であることを特
   徴とする特許請求の範囲第５または６項記載の方法。 ８、試験試料の酵素の消化は、両者のプローブと交雑＝
   ｉｆ能な長さの鎌状赤血球貧血の核酸を基すようなもの
   である特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、第１および第２のプローブは正常のヘモグロビン遺
   伝子の消化により生成され、消化された試験試料の両名
   のプローブへの交雑は鎌状赤血球貧血の核酸が内部に存
   在することを示す特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、（１）試験試料の核酸中に存在する核酸配列を各
   々が含む第１および第２のプローブ、第１プローブは区
   別Ｏｆ能な標識を支持しかつ決定が実施される液体中に
   可溶性であり、第２プローブは固体の支持体上に固定さ
   れている、および（２）　４￥定の核酸配列の存在また
   は不存在に依存して試験試料を切り離すかあるいは切り
   離さない制限酷素からなり、これにより陽性の決定試験
   試料は両者の第１および第２のプローブと交雑すること
   かでき、こうして標識を固体の支持体へ引き続く読取り
   のために固定する、ことを特徴とする試験試料中に含有
   される核酸が特定の核酸配列を含むかどうかを決定する
   だめのキット。