JPS6036497A - 特定のヌクレオチド配列についてdna試料を試験する方法 - Google Patents
特定のヌクレオチド配列についてdna試料を試験する方法Info
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- JPS6036497A JPS6036497A JP59138045A JP13804584A JPS6036497A JP S6036497 A JPS6036497 A JP S6036497A JP 59138045 A JP59138045 A JP 59138045A JP 13804584 A JP13804584 A JP 13804584A JP S6036497 A JPS6036497 A JP S6036497A
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- probe
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、植物または動物の組織または流体の試料中の
細胞の特定の交IJ:する核酸構成成分により1.(1
明されるように、このような試本)中の特定の遺伝的状
態の存在または不存在を決Wするための方法および装置
に関する。この状態は、この試験におけるその存在また
は検出されるi+J能セFについて臨床的に必ずしも表
わされるとはかぎらない問題のy、し者の組織1例えば
、全血M1!胞中のDNAを試験することにより、漬り
、曲状1八〇、例えば、鎌状赤血球貧面について決定す
るための技術が存在する。現在構成されているような試
験は、時間を消費し、かつ試験の実施および結果の解釈
において極端な扶植を要求する。それらは、また、経費
を必要とし、そして不精確である。
細胞の特定の交IJ:する核酸構成成分により1.(1
明されるように、このような試本)中の特定の遺伝的状
態の存在または不存在を決Wするための方法および装置
に関する。この状態は、この試験におけるその存在また
は検出されるi+J能セFについて臨床的に必ずしも表
わされるとはかぎらない問題のy、し者の組織1例えば
、全血M1!胞中のDNAを試験することにより、漬り
、曲状1八〇、例えば、鎌状赤血球貧面について決定す
るための技術が存在する。現在構成されているような試
験は、時間を消費し、かつ試験の実施および結果の解釈
において極端な扶植を要求する。それらは、また、経費
を必要とし、そして不精確である。
本発明の目的は、試験DNA標本中の特定の核酸配列の
存在または不存在についての簡単な、比較的安価なかつ
信頼性のある高い解像力の試験を提供することである。
存在または不存在についての簡単な、比較的安価なかつ
信頼性のある高い解像力の試験を提供することである。
これらの目的および他の目的および利点は、本発明によ
り実現される。本発明によれば、]−程: a)試験試料から核酸を抽出し、 b)抽出された核酸を制限酵素で消化し、これにより、
制限酵、もの認識部位が試験DNA中の配列中に精確に
存在するか台かに依存して、制限を行いあるいは11わ
ず、 C)(b)の生成物を処理して一木鎖核酸を形成し、 d)(C)において生成された一本鎖の核酸を第1およ
び第2のポリヌクレオチドのプローブと接触させ、前記
第1 ′8よびMS2のポリヌクレオチドのプローブは
検出すべき前記配列のそれぞれ第1および第2の部分と
相補的であり、前記2つの部分は問題の制限部位と重複
せずかつそれにすぐの隣接し、このような接触は前記検
出すべき配列への前記第1および第2のプローブの交雑
に対して好適な条件下で実施し、前記プローブの両者を
用いる試験分子への交雑は−[程(b)において制限が
起こらなかったかに依存し、前記第1プローブは区別i
j)能な標識を組み込んでおり、e)前記第2プローブ
により、(i)両者の前記標識付けされた第1プローブ
および第2のプローブへ交雑された検出すべき前記核酸
からなる得られたニー重交雑(dual hybrid
ati。
り実現される。本発明によれば、]−程: a)試験試料から核酸を抽出し、 b)抽出された核酸を制限酵素で消化し、これにより、
制限酵、もの認識部位が試験DNA中の配列中に精確に
存在するか台かに依存して、制限を行いあるいは11わ
ず、 C)(b)の生成物を処理して一木鎖核酸を形成し、 d)(C)において生成された一本鎖の核酸を第1およ
び第2のポリヌクレオチドのプローブと接触させ、前記
第1 ′8よびMS2のポリヌクレオチドのプローブは
検出すべき前記配列のそれぞれ第1および第2の部分と
相補的であり、前記2つの部分は問題の制限部位と重複
せずかつそれにすぐの隣接し、このような接触は前記検
出すべき配列への前記第1および第2のプローブの交雑
に対して好適な条件下で実施し、前記プローブの両者を
用いる試験分子への交雑は−[程(b)において制限が
起こらなかったかに依存し、前記第1プローブは区別i
j)能な標識を組み込んでおり、e)前記第2プローブ
により、(i)両者の前記標識付けされた第1プローブ
および第2のプローブへ交雑された検出すべき前記核酸
からなる得られたニー重交雑(dual hybrid
ati。
n)生成物を、(i i)交雑しない単一に交雑化(s
ingly hybridized)標識第1プローブ
から分離し、そして f)前記標識により、存在しうる前記分離された二重交
雑生成物を検出する、 からなることを特徴とする試験試料中に含有されるDN
Aが特定の核酸配列を含むかどうかを決定する方法、が
提供される。
ingly hybridized)標識第1プローブ
から分離し、そして f)前記標識により、存在しうる前記分離された二重交
雑生成物を検出する、 からなることを特徴とする試験試料中に含有されるDN
Aが特定の核酸配列を含むかどうかを決定する方法、が
提供される。
また、(1)試験試料の核酸中に存在する核酸配列を各
々が含む第1および第2のプローブ、第1プローブは区
別可能な標識を支持しかつ決、定が実施される液体中に
n(溶性であり、第2プローブは固体の支持体−にに固
定されている、および(2)第1および第2のプローブ
に対して相補的な配列を分離する点において、特定の核
酸配列が存在するかあるいは存在しないかに依存して試
験試料を切り離すかあるいは切り離さない制限酵素から
なり、これにより陽性の決定試験試料(前記点において
切り離しが存在しない)は両者の第1および第2のプロ
ーブと交雑することができ、こうして標識を固体の支持
体へ引き統〈読取りのために固定する、ことを特徴とす
る前記試験を実施するためのキット、が提供される。
々が含む第1および第2のプローブ、第1プローブは区
別可能な標識を支持しかつ決、定が実施される液体中に
n(溶性であり、第2プローブは固体の支持体−にに固
定されている、および(2)第1および第2のプローブ
に対して相補的な配列を分離する点において、特定の核
酸配列が存在するかあるいは存在しないかに依存して試
験試料を切り離すかあるいは切り離さない制限酵素から
なり、これにより陽性の決定試験試料(前記点において
切り離しが存在しない)は両者の第1および第2のプロ
ーブと交雑することができ、こうして標識を固体の支持
体へ引き統〈読取りのために固定する、ことを特徴とす
る前記試験を実施するためのキット、が提供される。
第1および第2のプローブは、それら自体特別の方法に
より形成される。例えば、クローニングされたβ−ヘモ
グロビン遺伝子を制限酵素により消化する。110記制
限酵素は前記遺伝子をある数の断片に細分割する。鎌状
赤血球貧血の検出の場合において、問題の2つは340
bp (塩基対)単位およびzotbp単位である。断
片をサブクローこ〉′グにより互いに分離し、そしてそ
れらの−力、すなわち、340bpNi位の断片を固体
の支持体、例えば、ニトロセルロースのシーi・または
ディスクへ固定し、固定されたプローブを構成する。他
方の断片を放射性基、あるいは化学的に検11障り能な
ノ、(、例えば、変性された塩基または視的に検出可能
な基、例えば、蛍光を発するかあるいは紫外線または赤
外線を吸収する特性をもつもので標識付けする。
より形成される。例えば、クローニングされたβ−ヘモ
グロビン遺伝子を制限酵素により消化する。110記制
限酵素は前記遺伝子をある数の断片に細分割する。鎌状
赤血球貧血の検出の場合において、問題の2つは340
bp (塩基対)単位およびzotbp単位である。断
片をサブクローこ〉′グにより互いに分離し、そしてそ
れらの−力、すなわち、340bpNi位の断片を固体
の支持体、例えば、ニトロセルロースのシーi・または
ディスクへ固定し、固定されたプローブを構成する。他
方の断片を放射性基、あるいは化学的に検11障り能な
ノ、(、例えば、変性された塩基または視的に検出可能
な基、例えば、蛍光を発するかあるいは紫外線または赤
外線を吸収する特性をもつもので標識付けする。
このL順の重要な点は、影響を受けた試験試料と受けな
い試験試料との間の差において、それらの一方が、制限
酵素で処理したとき、固定されたプローブおよび標識付
けされたプローブの両者と交雑することができるように
各プローブより長1.)断片が存在し、これに対して他
方はこのように長い単位をもたず、それゆえ両者と交雑
することができないということである。二重交雑は、一
方の試験試料を介するが、他方の試験試料を介しなI/
)で標識を固体の支持体へ結合することに対して重要で
あり、このような支持体は標識の存在につ(/1て究極
的に分析されるものである。
い試験試料との間の差において、それらの一方が、制限
酵素で処理したとき、固定されたプローブおよび標識付
けされたプローブの両者と交雑することができるように
各プローブより長1.)断片が存在し、これに対して他
方はこのように長い単位をもたず、それゆえ両者と交雑
することができないということである。二重交雑は、一
方の試験試料を介するが、他方の試験試料を介しなI/
)で標識を固体の支持体へ結合することに対して重要で
あり、このような支持体は標識の存在につ(/1て究極
的に分析されるものである。
1例として鎌状赤血球貧血では、正常のヘモグロビン遺
伝子を使用して340および20 L b pのプロー
ブをつくることができ、そして銹状赤血f+、貧血ヘモ
グロビンDNAは、消化すると、2つを力/ヘーシかつ
二重交雑をすることができる長し1断片を有し、これに
対し同様に処理した正常のDNAはこのような断片をも
たないであろう。
伝子を使用して340および20 L b pのプロー
ブをつくることができ、そして銹状赤血f+、貧血ヘモ
グロビンDNAは、消化すると、2つを力/ヘーシかつ
二重交雑をすることができる長し1断片を有し、これに
対し同様に処理した正常のDNAはこのような断片をも
たないであろう。
プローブを生成しおよび/または試験試料を処理するた
めにDNA物質を酵素的の消化する方法は、種々の分離
法と同様に、この分野において知られている。
めにDNA物質を酵素的の消化する方法は、種々の分離
法と同様に、この分野において知られている。
本発明をとくに器状赤血球貧血を参照して説明するが、
本発明は存在をDNAの特定の分子の変化に関連させる
ことが可能な他の遺伝的疾患に同様によく適用すること
ができる。特定の制限酵素を見つことのみを必要とする
。この制限酵素は、影響を受けた遺伝子または受けない
遺伝子の一力のみを分解して、プローブをつくるのに必
要とする断片を形成する。次いで、このプローブは、影
響を受けた試験試料または受けない試験試料の一方また
は他方が両者のプローブと二重交雑をすることができる
長い断片を形成する」二うな方法で、予備処理された前
記試料を区別することができる。
本発明は存在をDNAの特定の分子の変化に関連させる
ことが可能な他の遺伝的疾患に同様によく適用すること
ができる。特定の制限酵素を見つことのみを必要とする
。この制限酵素は、影響を受けた遺伝子または受けない
遺伝子の一力のみを分解して、プローブをつくるのに必
要とする断片を形成する。次いで、このプローブは、影
響を受けた試験試料または受けない試験試料の一方また
は他方が両者のプローブと二重交雑をすることができる
長い断片を形成する」二うな方法で、予備処理された前
記試料を区別することができる。
本発明を添付図面を参照しながらさらに説明する。
とくに図面を参照すると、第1図において、Aはβ−一
・モグロビンを暗号化する遺伝子の開始、ならびに表現
されない側面に位置するDNA (左への細い線)の地
図である。太い部分は、β−ヘモグロビンへ翻訳される
メツセンジャーRNAの前駆物質であるRNAに転写さ
れるDNAを定め、そしてこれは図面の左を過ぎて連続
する。ぬりつぶした区域はタンパク質のアミノ酸配列を
実際に暗号化するものである;3つの空白の区域は、左
から右に、m RN A中に存在する翻訳されないリー
ダー(leader)配列、短い介在配列、および長い
介在配列であ°る。2つの介在配列はグロブリンmRN
Aに対するRNA前駆物質中に存在するが、mRNA自
体において欠けている;それらはm RN A成熟過程
の一部分である分子内の切り継ぎの結果除去される。線
の−にの記号は制限酵素の切り離し部位を示し、そして
鎌状赤m1球遺伝子において特別に欠けているDdeI
/M s 11部位が示されている。クローニングされ
たプラスミドpSS737中に表わされた0、74kb
のAluIセグメントも示されている。
・モグロビンを暗号化する遺伝子の開始、ならびに表現
されない側面に位置するDNA (左への細い線)の地
図である。太い部分は、β−ヘモグロビンへ翻訳される
メツセンジャーRNAの前駆物質であるRNAに転写さ
れるDNAを定め、そしてこれは図面の左を過ぎて連続
する。ぬりつぶした区域はタンパク質のアミノ酸配列を
実際に暗号化するものである;3つの空白の区域は、左
から右に、m RN A中に存在する翻訳されないリー
ダー(leader)配列、短い介在配列、および長い
介在配列であ°る。2つの介在配列はグロブリンmRN
Aに対するRNA前駆物質中に存在するが、mRNA自
体において欠けている;それらはm RN A成熟過程
の一部分である分子内の切り継ぎの結果除去される。線
の−にの記号は制限酵素の切り離し部位を示し、そして
鎌状赤m1球遺伝子において特別に欠けているDdeI
/M s 11部位が示されている。クローニングされ
たプラスミドpSS737中に表わされた0、74kb
のAluIセグメントも示されている。
Bは、二重交雑試験においてプローブとして使用できる
β−グロブリン遺伝子のサブクローニングされたセグメ
ントの例を示す。2形成りde I/ M s t 1
1部位の上流のHi nf I部位5塩基対が存在し、
そしてこれはプラスミドベクトル(PBR322)を経
てクローニングされた0、34kbのHinflセグメ
ントの1端が存在する。
β−グロブリン遺伝子のサブクローニングされたセグメ
ントの例を示す。2形成りde I/ M s t 1
1部位の上流のHi nf I部位5塩基対が存在し、
そしてこれはプラスミドベクトル(PBR322)を経
てクローニングされた0、34kbのHinflセグメ
ントの1端が存在する。
2形成りdeI部位自体はPBRと配列を共有しないフ
ァージベクトル(M13 MP8)を経てサブクローニ
ングされた0、20kbのDde Iセグ、メントの1
端である。相互(recipr。
ァージベクトル(M13 MP8)を経てサブクローニ
ングされた0、20kbのDde Iセグ、メントの1
端である。相互(recipr。
cal)クローニングをまた実施した。図面において、
均一な線はクローニングされたヒ)DNAセグメントで
あり、そしてジグザグな線はベクトル配列の隣接部分で
ある。隣接DdeIセグメントが弔にサブクローニング
されなかった理由は、0.175kb(7)DdeI(
!グメント(下のC参照)が不必要に短いことにある。
均一な線はクローニングされたヒ)DNAセグメントで
あり、そしてジグザグな線はベクトル配列の隣接部分で
ある。隣接DdeIセグメントが弔にサブクローニング
されなかった理由は、0.175kb(7)DdeI(
!グメント(下のC参照)が不必要に短いことにある。
隣接するMstI+セグメント(0,14kbの長さの
1つ;C参照)がサブクローニングされなかった理由は
、Ms t IIで処理されたDNAが結合されえない
ことにある。
1つ;C参照)がサブクローニングされなかった理由は
、Ms t IIで処理されたDNAが結合されえない
ことにある。
Cは正常のβ−グロブリンのアレル(a l l el
e)を含有するヒトDNAおよび紐状赤血球のアレルを
含有するDNAを、Dde IまたはMst IIで消
化して得られた関連生成物を比較する。
e)を含有するヒトDNAおよび紐状赤血球のアレルを
含有するDNAを、Dde IまたはMst IIで消
化して得られた関連生成物を比較する。
細状赤血球の体質をもっ人(+/s)がらのDNAは両
者の組のDNAセグメントをもつであろう。
者の組のDNAセグメントをもつであろう。
第2図において、左および右において、前述のように分
離プローブおよび検出プローブを用いて開始する。変性
された分離プローブを固体の支持体へ結合する。検出プ
ローブを標識付けし、変性する。
離プローブおよび検出プローブを用いて開始する。変性
された分離プローブを固体の支持体へ結合する。検出プ
ローブを標識付けし、変性する。
未知の検体を処理してそのDNAを抽出し、これを消化
し、変性する0次いで、プローブおよび処理したDNA
を交雑条件下で混合する。次いで、二重に交雑した物質
を結合して有する固体を、標識についてアンセイする。
し、変性する0次いで、プローブおよび処理したDNA
を交雑条件下で混合する。次いで、二重に交雑した物質
を結合して有する固体を、標識についてアンセイする。
以下の例示的実施例により、本発明をさらに説明する。
これらの実施例中において、すべての部は、特記しない
かぎり1重量による。
かぎり1重量による。
川
■、必ILケ」し刈ム:
二組交雑の利用についての簡単な実施例について、プラ
スミドpBR322βPstまたはプラスミドPSS7
37 [両者は、ジョン争ウィルソン博士(Dr、Jo
hn Wi 1son、Medical CoCo11
e of Georgia)から人手し、そしてGee
ver、etal、、(1981) Proc、Nat
ional Academy of 5cienceU
、S、A、L下、5058−5985 に記載されてい
る]、入手可能な、他のいくつかのヒトβ−ヘモグロビ
ン遺伝子を、それからサブクローニングされたセグメン
]・(下の2を参照)と−諸に使用するだけでよい。鎌
状赤血球血色素血症への応用性(および制限部位の多形
成を含む他の疾患への拡張性)の実施例について、+/
+およびS / Sの個体からのDNAをも必要とする
。
スミドpBR322βPstまたはプラスミドPSS7
37 [両者は、ジョン争ウィルソン博士(Dr、Jo
hn Wi 1son、Medical CoCo11
e of Georgia)から人手し、そしてGee
ver、etal、、(1981) Proc、Nat
ional Academy of 5cienceU
、S、A、L下、5058−5985 に記載されてい
る]、入手可能な、他のいくつかのヒトβ−ヘモグロビ
ン遺伝子を、それからサブクローニングされたセグメン
]・(下の2を参照)と−諸に使用するだけでよい。鎌
状赤血球血色素血症への応用性(および制限部位の多形
成を含む他の疾患への拡張性)の実施例について、+/
+およびS / Sの個体からのDNAをも必要とする
。
2、プローブのサブクローニング
プラスミドpss737は、β−ヘモグロビン遺伝子を
含む0.74kbのPstIセグメントを含有する(第
1図参照)。クローン中の問題の制限部位は、遺伝子の
コドン5〜7を含むDdeI / M s t IIで
ある。なぜなら紐状赤血球アレルにおいて、酵素の認識
7′切り離し部位を変更する弔・のA〜T変化が存在す
るからでる(DdelについてCTNAG;MstII
についてCCTNAGG)。サブクローニングの1」的
は、クローニングされた野生型遺伝子をこの点において
切り裂いて、隣接する(または、一般に、はぼ隣接する
)および重ならない配列をもつ2つのプローブをつくる
ことである。1つのプローブ、分離プローブと表示する
、はマトリックス結合しかつ一本鎖であり、そして未知
のDNAを交雑により不動化するであろう。他方のプロ
ーブ、検出プローブと表示する、は標識付けされ、また
−末鎖であり、そして溶液中で未知のDNAと交雑する
であろう。未知のDNAは制限部位DdeIおよび/ま
たはM s t IIで処理されており、そして問題は
、検出プローブが分離プローブへの架橋を介して不動化
されうるか否かということである。この架橋は未知のD
NAにより提供される。未知のDNAがβ−グロブリン
遺伝子に関して野生型である場合、DdeIまたはM
s t IIの消化はこのような架橋を排除するであろ
う。しかしながら、紐状赤血球アレルはこれらの酵素に
対して関連する部位において不感受性であるので、S/
SまたはS/+であるゲノムDNAはある検出プローブ
の不動化を許すであろう(ゲノムDNAの消化および検
出プローブの標識付けについて3および4を参照)。
含む0.74kbのPstIセグメントを含有する(第
1図参照)。クローン中の問題の制限部位は、遺伝子の
コドン5〜7を含むDdeI / M s t IIで
ある。なぜなら紐状赤血球アレルにおいて、酵素の認識
7′切り離し部位を変更する弔・のA〜T変化が存在す
るからでる(DdelについてCTNAG;MstII
についてCCTNAGG)。サブクローニングの1」的
は、クローニングされた野生型遺伝子をこの点において
切り裂いて、隣接する(または、一般に、はぼ隣接する
)および重ならない配列をもつ2つのプローブをつくる
ことである。1つのプローブ、分離プローブと表示する
、はマトリックス結合しかつ一本鎖であり、そして未知
のDNAを交雑により不動化するであろう。他方のプロ
ーブ、検出プローブと表示する、は標識付けされ、また
−末鎖であり、そして溶液中で未知のDNAと交雑する
であろう。未知のDNAは制限部位DdeIおよび/ま
たはM s t IIで処理されており、そして問題は
、検出プローブが分離プローブへの架橋を介して不動化
されうるか否かということである。この架橋は未知のD
NAにより提供される。未知のDNAがβ−グロブリン
遺伝子に関して野生型である場合、DdeIまたはM
s t IIの消化はこのような架橋を排除するであろ
う。しかしながら、紐状赤血球アレルはこれらの酵素に
対して関連する部位において不感受性であるので、S/
SまたはS/+であるゲノムDNAはある検出プローブ
の不動化を許すであろう(ゲノムDNAの消化および検
出プローブの標識付けについて3および4を参照)。
サブクローニングは、次のように進行するニブローブp
SS737を精製し、そして1つの試料をDdeIで完
全に消化する;他の試1シをHinfIで消化する(第
1図参照)。得られるDNAセグメントを調製用の低融
点アガロースゲル中の電気泳動により大きさに従って分
離する。このゲルを臭化エチジウムで着色して、UV透
過により可視化させ、そしてHinfI消化からの0.
34kbおよびDdeI消化から(7)0.20kbの
DNAの帯を切除する。ゲルの切片中の7ガロースをフ
ェノール抽出およびエタノール沈殿により精製する。こ
れらのDNAを水中に再溶解させる。この吟点において
、(134kbのH1nf工消化生成物は、次の構造を
有する: 5 ’ANTC,,,,,G G、、、、、CTNA5” そして0.20kbのDde I消化生成物は、次の構
造を有する: 5 ’TNAGG、、、、CC CC、、、、GGANT5 ’ セグメントのクローニングは、それぞれHinf■およ
びDdeI/MstIIの部位が大端において保持され
るように実施することが望ましく、そしてこれを実施す
る実際的方法は酵素で直線化されたベクトルへ前記セグ
メントをプラント末端結合する(blunt−end
ligate)ことであり、前記酵素は、クローニング
すべきセグメントと融合(fusion)したとき、酵
素切り離し部位の修復を構成する末端を与える。とくに
、HinfIセグメントはC1aIで消化されたpBR
322巾に挿入してHinfI切り離し部位を修復する
;DdeI (MstII) セグメントは、Nael
で消化されたpBR322中へ、あるいはSm a I
で消化されたファージM 13 MPg DNA中へ挿
入することができる。
SS737を精製し、そして1つの試料をDdeIで完
全に消化する;他の試1シをHinfIで消化する(第
1図参照)。得られるDNAセグメントを調製用の低融
点アガロースゲル中の電気泳動により大きさに従って分
離する。このゲルを臭化エチジウムで着色して、UV透
過により可視化させ、そしてHinfI消化からの0.
34kbおよびDdeI消化から(7)0.20kbの
DNAの帯を切除する。ゲルの切片中の7ガロースをフ
ェノール抽出およびエタノール沈殿により精製する。こ
れらのDNAを水中に再溶解させる。この吟点において
、(134kbのH1nf工消化生成物は、次の構造を
有する: 5 ’ANTC,,,,,G G、、、、、CTNA5” そして0.20kbのDde I消化生成物は、次の構
造を有する: 5 ’TNAGG、、、、CC CC、、、、GGANT5 ’ セグメントのクローニングは、それぞれHinf■およ
びDdeI/MstIIの部位が大端において保持され
るように実施することが望ましく、そしてこれを実施す
る実際的方法は酵素で直線化されたベクトルへ前記セグ
メントをプラント末端結合する(blunt−end
ligate)ことであり、前記酵素は、クローニング
すべきセグメントと融合(fusion)したとき、酵
素切り離し部位の修復を構成する末端を与える。とくに
、HinfIセグメントはC1aIで消化されたpBR
322巾に挿入してHinfI切り離し部位を修復する
;DdeI (MstII) セグメントは、Nael
で消化されたpBR322中へ、あるいはSm a I
で消化されたファージM 13 MPg DNA中へ挿
入することができる。
C1aIはpBR322を部位
、、、AT CGAT、、、。
、、、、TAGCTA、、。
で切り離す。E、coliのDNAポリメラーゼの大き
い(Klenow)断片による改なる末端の充填(fi
lling−in)は1 、、、ATCG CGAT、、。
い(Klenow)断片による改なる末端の充填(fi
lling−in)は1 、、、ATCG CGAT、、。
、、、TAGCGCTA、、。
を生成する。サブクローニングすべきHi nf Iセ
グメントの末端の充填は、 ANTC、、、、、GANT TNAG 、、、、、CTNA を生成し、そしてこれをベクトルと結合すると、配列 、、、ATCGANTC、、、、、GANTCGAT、
− 、、、TAGCTNAG 、、、、、CTNAGCTA
、、。
グメントの末端の充填は、 ANTC、、、、、GANT TNAG 、、、、、CTNA を生成し、そしてこれをベクトルと結合すると、配列 、、、ATCGANTC、、、、、GANTCGAT、
− 、、、TAGCTNAG 、、、、、CTNAGCTA
、、。
が生成し、これはHinfI部位[複数のオーバーライ
ン(overline)]を保持する。
ン(overline)]を保持する。
β−グロブリン遺伝子の0.20kbのDdeI (M
s t II)セグメントを、次の末端を与える酵素
で直線化されたベクトルの末端へ結合する: 、、、CCGG、、。
s t II)セグメントを、次の末端を与える酵素
で直線化されたベクトルの末端へ結合する: 、、、CCGG、、。
、、、GG CC,、。
1つのこのような酵素はSmaI (CCCGGG)で
°あり、そしてこれは、弔−のS m a I部位を有
するE、coliの;7r−ジ M 13 M2Sへの
クローニングに使用することができる。
°あり、そしてこれは、弔−のS m a I部位を有
するE、coliの;7r−ジ M 13 M2Sへの
クローニングに使用することができる。
他のこのような酵素はNaeI(GCCG GC)であ
り、コレはPBR322を4回、4゜l、1282およ
びそれらの間の他の2つの部位において切り離す。プラ
スミドは1282および401の間において無傷で残り
、そして崩壊される唯〜の機能はテトラサイクリン抵抗
性をり゛・える能力である。zotpbのDdeIセグ
メントのクローニングのため、ベクトルの調製は、Na
eIによるpBR322の消化、および生成物をアルカ
リ性ホスファターゼで処理して末端ホスフェートを除去
することを含む(これは引き統〈結合のtmの単純なベ
クトルの環状化を失わせる)。大きいベクトルのセグメ
ントは、調製用ゲルの電気泳動により精製される。プラ
ント末端の結合を達成するために、β−グロブリンのD
de1セグメントの末端を充填してそれらを1i−らに
(flush)する。上に示唆したように、これはセグ
メントをE、coliのDNAポリメラーゼのKlen
o断片および4種のデオキシリポヌクレオシトトリホス
ペード類で処理することにより実施する。これらの断片
およびNaeI処理ベクトルの混合物をT4およびAT
Pとともにインキュベーションし、次いで使用してバク
テリア細胞を形質転換してこの細胞に裸のDNAを取り
−Lげる能力をもたせることができる。前記細胞を培地
」二に配置する。この培地は、細胞により取りヒげられ
るプラスミドにより抵抗性を授与される抗生物質を含有
する(例えば、pBR322の場合においてアンピシリ
ン)。
り、コレはPBR322を4回、4゜l、1282およ
びそれらの間の他の2つの部位において切り離す。プラ
スミドは1282および401の間において無傷で残り
、そして崩壊される唯〜の機能はテトラサイクリン抵抗
性をり゛・える能力である。zotpbのDdeIセグ
メントのクローニングのため、ベクトルの調製は、Na
eIによるpBR322の消化、および生成物をアルカ
リ性ホスファターゼで処理して末端ホスフェートを除去
することを含む(これは引き統〈結合のtmの単純なベ
クトルの環状化を失わせる)。大きいベクトルのセグメ
ントは、調製用ゲルの電気泳動により精製される。プラ
ント末端の結合を達成するために、β−グロブリンのD
de1セグメントの末端を充填してそれらを1i−らに
(flush)する。上に示唆したように、これはセグ
メントをE、coliのDNAポリメラーゼのKlen
o断片および4種のデオキシリポヌクレオシトトリホス
ペード類で処理することにより実施する。これらの断片
およびNaeI処理ベクトルの混合物をT4およびAT
Pとともにインキュベーションし、次いで使用してバク
テリア細胞を形質転換してこの細胞に裸のDNAを取り
−Lげる能力をもたせることができる。前記細胞を培地
」二に配置する。この培地は、細胞により取りヒげられ
るプラスミドにより抵抗性を授与される抗生物質を含有
する(例えば、pBR322の場合においてアンピシリ
ン)。
個々の形質転換体のコロニーを、問題のプラスミドにつ
いてスクリーニングする。このスクリーニングは、多少
の細胞を小体積の液体中で生長させ、次いで細胞を溶解
してプラスミドDNAを解放することによって実施する
。DNAを精製し、所9の挿入体(insert)のプ
ラスミド中の存在についてセグメントの診断をり−える
指示された制限酵素で処理し、次いでDNAはアガロー
スゲル中で大きさに従って表示される。いったん適右な
縮み換えプラスミドが同定されると、それらが生17た
コロニーを使用して大きい培地を接種し、前記培地から
プラスミドの数〔1の微生物が調製される。また、コロ
ニーはぺ1・り皿上に維持し 後の使用のために凍結し
て保存される。
いてスクリーニングする。このスクリーニングは、多少
の細胞を小体積の液体中で生長させ、次いで細胞を溶解
してプラスミドDNAを解放することによって実施する
。DNAを精製し、所9の挿入体(insert)のプ
ラスミド中の存在についてセグメントの診断をり−える
指示された制限酵素で処理し、次いでDNAはアガロー
スゲル中で大きさに従って表示される。いったん適右な
縮み換えプラスミドが同定されると、それらが生17た
コロニーを使用して大きい培地を接種し、前記培地から
プラスミドの数〔1の微生物が調製される。また、コロ
ニーはぺ1・り皿上に維持し 後の使用のために凍結し
て保存される。
β−ヘモグロビン遺伝子の鎌状赤血球変異型の検出のた
めのプラスミドのプローブを発生させる特定の場合にお
いて、1つのプラスミドは0.34kbのHi nf
Iセグメントを含有し、そし−C他のものは隣接の(1
20kbのDdeIセグメントを含有する。二重交雑法
においてベクトルの交雑が誤った陽性の結果を与える可
能性が少なくとも存在するので、2つのプローブが無関
係のベクトル中に支持されることが望ましい。これは一
方のプローブについてE 、 c o l i宿主/ベ
クトル系を使用し、そして他方についてB、su、bt
iris宿主/ベクトル系を使用することによって最も
明瞭になされる。あるいは、一方のプローブをE、co
liプラスミド例えばpBR322中に存在させ、そし
て他方をE、coliファージ例えばM13中に存在さ
せることができる。
めのプラスミドのプローブを発生させる特定の場合にお
いて、1つのプラスミドは0.34kbのHi nf
Iセグメントを含有し、そし−C他のものは隣接の(1
20kbのDdeIセグメントを含有する。二重交雑法
においてベクトルの交雑が誤った陽性の結果を与える可
能性が少なくとも存在するので、2つのプローブが無関
係のベクトル中に支持されることが望ましい。これは一
方のプローブについてE 、 c o l i宿主/ベ
クトル系を使用し、そして他方についてB、su、bt
iris宿主/ベクトル系を使用することによって最も
明瞭になされる。あるいは、一方のプローブをE、co
liプラスミド例えばpBR322中に存在させ、そし
て他方をE、coliファージ例えばM13中に存在さ
せることができる。
分離プローブ、例えば、pBR322の0.34kbの
HinfIセグメントを含有するプラスミド(第1図)
を、0.1モルのNaOHで5分間処理し、次いで水中
で冷却する。この試>’+を等体積の0.1NHCI、
0.9モルのNaC1,0,09モルのNaクエン酸塩
で中和し1次いモニトロセルロースのフィルター(例え
ば、5chleicher and 5chue11か
ら入fnf能なりA 85)を通しておだやかな吸引の
もとに濾過する。この体フィルターは、0.9モルのN
aC1,0,09モルノNaクエンMlbで予備ソーキ
ングされている(6×SSC;LX標準クエン酸塩食塩
水=0.15モルのNaC1,0,015モルのNaク
エン酸塩)。次いで、濾液を6XSSCで、次いで70
%エタノールで洗浄し、そして80°Cにおいて数11
′1−間減圧下にあるいは65℃で〜夜fL空の不存在
下にベーキングする。この時点において、フィルターは
交雑手順に使用可能な状態にあるが、数か月間乾燥状態
で貯蔵することができる。
HinfIセグメントを含有するプラスミド(第1図)
を、0.1モルのNaOHで5分間処理し、次いで水中
で冷却する。この試>’+を等体積の0.1NHCI、
0.9モルのNaC1,0,09モルのNaクエン酸塩
で中和し1次いモニトロセルロースのフィルター(例え
ば、5chleicher and 5chue11か
ら入fnf能なりA 85)を通しておだやかな吸引の
もとに濾過する。この体フィルターは、0.9モルのN
aC1,0,09モルノNaクエンMlbで予備ソーキ
ングされている(6×SSC;LX標準クエン酸塩食塩
水=0.15モルのNaC1,0,015モルのNaク
エン酸塩)。次いで、濾液を6XSSCで、次いで70
%エタノールで洗浄し、そして80°Cにおいて数11
′1−間減圧下にあるいは65℃で〜夜fL空の不存在
下にベーキングする。この時点において、フィルターは
交雑手順に使用可能な状態にあるが、数か月間乾燥状態
で貯蔵することができる。
プラスミドのアルカリ処理の目的は、DNAを変性する
ことである。これはDNAのニトロセルロースへの結合
をo(能としく自然DNAは結合しない)かつ他の一本
鎖DNAとの引き続く交雑に有効とする。変性されたD
NA溶液を酸で中和し、そして塩を添加する(例えば、
6XSSC)と、変性DNAのニトロセルロースへの結
合が促進され、そして低温はプラスミドがニトロセルロ
ース上へ適用される間のプラスミドの再アニーリングを
阻[[−する。フィルターのベーキングは最終的にDN
Aを不動化する。
ことである。これはDNAのニトロセルロースへの結合
をo(能としく自然DNAは結合しない)かつ他の一本
鎖DNAとの引き続く交雑に有効とする。変性されたD
NA溶液を酸で中和し、そして塩を添加する(例えば、
6XSSC)と、変性DNAのニトロセルロースへの結
合が促進され、そして低温はプラスミドがニトロセルロ
ース上へ適用される間のプラスミドの再アニーリングを
阻[[−する。フィルターのベーキングは最終的にDN
Aを不動化する。
検出プローブの例えば32pによる標識伺けは、いくつ
かの方法で達成することができ・それらの方法のすべて
は標準法である:制限エンド〆クレアーゼの作用により
直線とされたプラスミドの末端を、次の方法により標識
付けすることができる:ポリヌクレオチドキナーゼがγ
32p ATPの末端ホスフェートをDNA分子の5゛
へ付加する反応;ある制限酵素により発生されたくぼん
だ(recessed)3’末端を、E、c。
かの方法で達成することができ・それらの方法のすべて
は標準法である:制限エンド〆クレアーゼの作用により
直線とされたプラスミドの末端を、次の方法により標識
付けすることができる:ポリヌクレオチドキナーゼがγ
32p ATPの末端ホスフェートをDNA分子の5゛
へ付加する反応;ある制限酵素により発生されたくぼん
だ(recessed)3’末端を、E、c。
1iのDNAポリメラーゼの大きい断片(Klenow
)およびα32p−標識デオキシリポヌクレオシトトリ
ホスフェート類の使用による充填:または末端デオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼの作用による標識ヌ
クレオチド類の末端伺加の作用による、標識ヌクレオチ
ド類の3′末端伺加。より高度のプローブの標識付けは
、ファージT4DNAポリメラーゼの使用により、ある
いはE、coliのDNAポリメラーゼ、標識トリホス
フェ−I・類、およびデオキシリボヌクレアーゼ■によ
り不規則に切り込まれて多数の合成プライマー部位を生
成したプラスミドを使用する銀置換DNA合成(「切り
込み翻訳(nick translation)J)に
より達成することができる。放射能を含まない他の標識
付は法も可能である。
)およびα32p−標識デオキシリポヌクレオシトトリ
ホスフェート類の使用による充填:または末端デオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼの作用による標識ヌ
クレオチド類の末端伺加の作用による、標識ヌクレオチ
ド類の3′末端伺加。より高度のプローブの標識付けは
、ファージT4DNAポリメラーゼの使用により、ある
いはE、coliのDNAポリメラーゼ、標識トリホス
フェ−I・類、およびデオキシリボヌクレアーゼ■によ
り不規則に切り込まれて多数の合成プライマー部位を生
成したプラスミドを使用する銀置換DNA合成(「切り
込み翻訳(nick translation)J)に
より達成することができる。放射能を含まない他の標識
付は法も可能である。
4、 未知のDNAの試゛Lの1
一゛1重交雑を利用する最も筒中な実施例において、p
BR322またはp S S 737 (ftS2図)
を使用することがヤきる。ただし、サブクローニングさ
れた検出プローブが「未知のもの」の不存在で不動化性
セレクターサブクローン(selector 5ubc
lone)と交雑しないことが保証されなくてはならな
い(モデルの目的に対して、検出体は「未知のもの」と
グロブリンセグメントの相同性およびベクI・ルの相同
性の[J4 Jに:より交雑できることは重要ではない
)。Pstおよび5S737のセグメントはすでにpB
R322中に存在するので、2つのプローブを構成する
最良の方法はセレクタープローブ(0,20kbのDd
eIセグメント、(2)において述べた)をB、5ub
tilisベクトル中に、あるいはE、coliのファ
ージM13中に入れ、そして検出プローブをpBR32
2中に入れることである。pBR322Pst、有用な
未知のもの、をつくるために、1つのアリコートを、M
s t IIおよび/またはDde Iで消化し、そ
してこれは野生型グロブリン遺伝子を含有するDNAを
表わす、pSS737をDdeIで処理することができ
る。プラスミドの第2のアリコートを問題の区域の外側
を切り離す酵素により直線化するが、理想的には0.3
8kbのDde Iセグメントより大きすぎず、かつグ
ロブリン遺伝子の鎌状赤血球アレルを含有するCNAの
消化から生ずる1、34kbのM s t IIより大
きすぎない長さをもつセグメントを発生させる。このよ
うな踵状赤血球DNAの模倣体(mimic)は、pB
R322βFstを2形成りdeI/Mstl!で消化
し、中央に2形成りdeI/MstIIをもつ0.74
k bのセグメントを形成することにより、得ることが
できるであろう。同一の結果はpss737をEcoR
Iで処理する場合に得られる。なぜなら、5S737は
合成EcoRIリンカ−(Itnker)を経てpss
737c7)EcoRI部位中へ挿入された同一のAI
uIセグメントをもつからである。
BR322またはp S S 737 (ftS2図)
を使用することがヤきる。ただし、サブクローニングさ
れた検出プローブが「未知のもの」の不存在で不動化性
セレクターサブクローン(selector 5ubc
lone)と交雑しないことが保証されなくてはならな
い(モデルの目的に対して、検出体は「未知のもの」と
グロブリンセグメントの相同性およびベクI・ルの相同
性の[J4 Jに:より交雑できることは重要ではない
)。Pstおよび5S737のセグメントはすでにpB
R322中に存在するので、2つのプローブを構成する
最良の方法はセレクタープローブ(0,20kbのDd
eIセグメント、(2)において述べた)をB、5ub
tilisベクトル中に、あるいはE、coliのファ
ージM13中に入れ、そして検出プローブをpBR32
2中に入れることである。pBR322Pst、有用な
未知のもの、をつくるために、1つのアリコートを、M
s t IIおよび/またはDde Iで消化し、そ
してこれは野生型グロブリン遺伝子を含有するDNAを
表わす、pSS737をDdeIで処理することができ
る。プラスミドの第2のアリコートを問題の区域の外側
を切り離す酵素により直線化するが、理想的には0.3
8kbのDde Iセグメントより大きすぎず、かつグ
ロブリン遺伝子の鎌状赤血球アレルを含有するCNAの
消化から生ずる1、34kbのM s t IIより大
きすぎない長さをもつセグメントを発生させる。このよ
うな踵状赤血球DNAの模倣体(mimic)は、pB
R322βFstを2形成りdeI/Mstl!で消化
し、中央に2形成りdeI/MstIIをもつ0.74
k bのセグメントを形成することにより、得ることが
できるであろう。同一の結果はpss737をEcoR
Iで処理する場合に得られる。なぜなら、5S737は
合成EcoRIリンカ−(Itnker)を経てpss
737c7)EcoRI部位中へ挿入された同一のAI
uIセグメントをもつからである。
S / sおよび+/+からのゲノムDNAを使用する
実施例について、DNAは10〜50m1の血液から、
RBCからの分離、高濃度の塩および洗浄剤中の白血球
の溶解、フェノールを用いる抽出およびエタノール沈殿
により、次のようにして、最も容易に調製される: DNAの急速調製 1) 血液(または羊水、尿または分散された/くイオ
ブシ−(btopsy))の試料に、1/4容1&ノ0
、25モルノT r i s −HCl、pH7,8
,0、5モル(7)N、a 2EDTA、1%のNon
1det P−40を添加する。おだやかであるが、完
全に混合する。
実施例について、DNAは10〜50m1の血液から、
RBCからの分離、高濃度の塩および洗浄剤中の白血球
の溶解、フェノールを用いる抽出およびエタノール沈殿
により、次のようにして、最も容易に調製される: DNAの急速調製 1) 血液(または羊水、尿または分散された/くイオ
ブシ−(btopsy))の試料に、1/4容1&ノ0
、25モルノT r i s −HCl、pH7,8
,0、5モル(7)N、a 2EDTA、1%のNon
1det P−40を添加する。おだやかであるが、完
全に混合する。
2) 核の粗製調製物を、円錐形の管中に低速遠心によ
り集める。核を0.5mlの0.05モルのTr i
S、0 、1モルのEDTA中の懸局させる。
り集める。核を0.5mlの0.05モルのTr i
S、0 、1モルのEDTA中の懸局させる。
3) 0.5mlのNaC1,2%の5aik。
sylを添加し、激しくかつ完全に混合する。1mlの
フェノール/クロロホルム[1:1、フェノール(飽和
w/lris−EDTA)およびクロロホルム]を添加
し、乳化する。5分間激しく振盪し、次いで高速遠心す
る。
フェノール/クロロホルム[1:1、フェノール(飽和
w/lris−EDTA)およびクロロホルム]を添加
し、乳化する。5分間激しく振盪し、次いで高速遠心す
る。
4) 水相(J、、)を集め、有機相および変性された
タンパク質の帯が乱れないで残る。他の5mlの管へ溶
液を移し、次いで2.5mlの95%のエタノールを添
加する。よく混合し、次いで高速遠心する。
タンパク質の帯が乱れないで残る。他の5mlの管へ溶
液を移し、次いで2.5mlの95%のエタノールを添
加する。よく混合し、次いで高速遠心する。
5) 十澄みをデカンテーションし、次いで3mlの7
0%のエタノールを管に添加する。激しく(渦)混合し
て沈降物を懸濁させ、次いで高速遠心する。エタノール
をデカンテーションし、次いで70%のエタノールの洗
浄を反復する。遠心およびデカンテーション後、3ml
の95%のエタノールを添加し、混合し、次いで高速遠
心する。デカンテーションし、管を乾燥する。
0%のエタノールを管に添加する。激しく(渦)混合し
て沈降物を懸濁させ、次いで高速遠心する。エタノール
をデカンテーションし、次いで70%のエタノールの洗
浄を反復する。遠心およびデカンテーション後、3ml
の95%のエタノールを添加し、混合し、次いで高速遠
心する。デカンテーションし、管を乾燥する。
6) 沈降物を0 、1 m lの制限酵素の消化緩衝
液中に溶解させ、次いで0 、01 m lの制限酵素
を添加する。37℃において1時間以上インキュベーシ
ョンする。
液中に溶解させ、次いで0 、01 m lの制限酵素
を添加する。37℃において1時間以上インキュベーシ
ョンする。
リボヌクレアーゼおよびアミラーゼの上程を含めること
ができ、そしてDNAの純度を確保するために、核酸を
CsC1浮力密度平衡勾配中で遠心することができる。
ができ、そしてDNAの純度を確保するために、核酸を
CsC1浮力密度平衡勾配中で遠心することができる。
DNAを勾配分画から3容量の70%のエタノールで沈
殿させることにより集め、沈殿を70%および95%の
エタノールで洗浄する。沈殿を乾燥し、次いでDNAを
TE(10ミリモルのTr i 5−HC1,pH7。
殿させることにより集め、沈殿を70%および95%の
エタノールで洗浄する。沈殿を乾燥し、次いでDNAを
TE(10ミリモルのTr i 5−HC1,pH7。
6.1ミリモルのNa2 EDTA)または水中の溶解
する。
する。
ゲノムCNAを未知のものとして使用するとき、最良の
実施例およびこの分野における場合のように、制限酵素
の消化は完結に近づげゝるかあるいはそれに密接に近づ
けることが重要である。とくに、野生型DNA中に存在
するが、鎌状赤面球の遺伝子中に存在しないD d e
I / M s t !1部位は、鎌状赤血球アレル
をもたないDNAの試料中で切り離されなくてはならな
い。商業的に入手可能なM s t IIは高度には活
性でないので、消化ができるだけ完結するように注意し
なくてはならいない。このような注意は、理論的に要求
されるよりは1桁多い酵素の使用を含む。それは、また
、鎌状赤血球の特別な場合において、過剰のMstII
およびDde Iを使用するDNAの消化を含むことが
できる(この場合において、問題の鎌状赤σ1球のDN
Aセグメントは1.34kb(7)長さよりも0.38
kbだけ長いが1これは非常に重要であるというわけで
はない)。消化の時間を長く干ることは、多くの酵素が
1時間以内に消化混合物中に希釈されるので、好ましく
ない。
実施例およびこの分野における場合のように、制限酵素
の消化は完結に近づげゝるかあるいはそれに密接に近づ
けることが重要である。とくに、野生型DNA中に存在
するが、鎌状赤面球の遺伝子中に存在しないD d e
I / M s t !1部位は、鎌状赤血球アレル
をもたないDNAの試料中で切り離されなくてはならな
い。商業的に入手可能なM s t IIは高度には活
性でないので、消化ができるだけ完結するように注意し
なくてはならいない。このような注意は、理論的に要求
されるよりは1桁多い酵素の使用を含む。それは、また
、鎌状赤血球の特別な場合において、過剰のMstII
およびDde Iを使用するDNAの消化を含むことが
できる(この場合において、問題の鎌状赤σ1球のDN
Aセグメントは1.34kb(7)長さよりも0.38
kbだけ長いが1これは非常に重要であるというわけで
はない)。消化の時間を長く干ることは、多くの酵素が
1時間以内に消化混合物中に希釈されるので、好ましく
ない。
5、ダ暮
交雑手順は一本鎖DNA類を含むので、セレクタープロ
ーブがその」;で不動化されるニトロセルt1−スのフ
ィルターを予備処理して、未知のDNAおよび検出プロ
ーブがそれに無差別に結合しないようにしなくてはなら
ない。このような処理は、通常、フィルター−ヒに存在
する部位をタンパク質および多糖でデンハル)(Den
hardt)の溶液として知られている混合物(水中の
各0.2%のウシ血ン古アルブミン、フィニルおよびポ
リビニルピロリドン)中で飽和させることを含み、ここ
で、多少の塩および緩伊1液(例えば、6xssc、0
、1モル(7)Tr i s、pH8)とともに、フ
ィルターを交雑に用いる温度(例えば、65℃)におい
て数時間ソーキングする。次いで予備ソーキング溶液を
、変性試料(未知)および変性検出プローブを含む交雑
媒質と置換し、そしてDNAのアニーリングを数時間進
行させる。
ーブがその」;で不動化されるニトロセルt1−スのフ
ィルターを予備処理して、未知のDNAおよび検出プロ
ーブがそれに無差別に結合しないようにしなくてはなら
ない。このような処理は、通常、フィルター−ヒに存在
する部位をタンパク質および多糖でデンハル)(Den
hardt)の溶液として知られている混合物(水中の
各0.2%のウシ血ン古アルブミン、フィニルおよびポ
リビニルピロリドン)中で飽和させることを含み、ここ
で、多少の塩および緩伊1液(例えば、6xssc、0
、1モル(7)Tr i s、pH8)とともに、フ
ィルターを交雑に用いる温度(例えば、65℃)におい
て数時間ソーキングする。次いで予備ソーキング溶液を
、変性試料(未知)および変性検出プローブを含む交雑
媒質と置換し、そしてDNAのアニーリングを数時間進
行させる。
2つの代表的な交雑条件は、次の通りである:(i)6
XSSC,0,1モル(7)TriS、pH8,65°
C、デンハルト溶液の添加は任意である; (i 1)
4XSSC140%のホルムアミド、40℃、士デンハ
ルト溶液。液体の必要祉を最小とし、かつ蒸発を防止す
るために、交雑はプレスされかつシールされたプラスチ
ックのバッグ中でしばしば実施される。
XSSC,0,1モル(7)TriS、pH8,65°
C、デンハルト溶液の添加は任意である; (i 1)
4XSSC140%のホルムアミド、40℃、士デンハ
ルト溶液。液体の必要祉を最小とし、かつ蒸発を防止す
るために、交雑はプレスされかつシールされたプラスチ
ックのバッグ中でしばしば実施される。
交雑後、セレクタープローブへ対して正確に塩基対とな
らなかったDNA類をフィルターから、溶液中で1連の
フィルターのソーキングにより、洗浄除去する。これは
雑種の安定性を維持するために広範なアニーリングを必
要とする。例えば、フィルターを大きい容量の0.2X
SSCで65°Cにおいてソーキング溶液を交換して2
回ソーキングしく低いi1X濃度において塩基対の程度
に劣る雑種は解離する)、次いで大きい容にの0.2×
SSCで室温においてソーキング溶液を交換して2回ソ
ーキングする。フィルターを次いで濾紙l−の吸い取り
により乾燥する。検出プローブを32pで標識付けした
場合、フィルターをX線フィルムと重ね、ある時間後こ
のフィルムを現像することにより、フィルターをオート
ラジオグラフィーにかける;あるいは、フィルターディ
スクまたはフィルターシートの一部分を水中に浸漬し、
そして液体シンチレーションスペクトロメーターでチェ
レンコフ(Cerenkov)放射な′測定することに
より、放射能についてア・ソセイすることができる。
らなかったDNA類をフィルターから、溶液中で1連の
フィルターのソーキングにより、洗浄除去する。これは
雑種の安定性を維持するために広範なアニーリングを必
要とする。例えば、フィルターを大きい容量の0.2X
SSCで65°Cにおいてソーキング溶液を交換して2
回ソーキングしく低いi1X濃度において塩基対の程度
に劣る雑種は解離する)、次いで大きい容にの0.2×
SSCで室温においてソーキング溶液を交換して2回ソ
ーキングする。フィルターを次いで濾紙l−の吸い取り
により乾燥する。検出プローブを32pで標識付けした
場合、フィルターをX線フィルムと重ね、ある時間後こ
のフィルムを現像することにより、フィルターをオート
ラジオグラフィーにかける;あるいは、フィルターディ
スクまたはフィルターシートの一部分を水中に浸漬し、
そして液体シンチレーションスペクトロメーターでチェ
レンコフ(Cerenkov)放射な′測定することに
より、放射能についてア・ソセイすることができる。
6、%4に゛ける手順の説
上の部4における手順を参照すると、(1)におけるT
r l s、 EDTAおよびNon1detを流体
中の細胞の試料へ添加する目的は、細胞を溶解するが、
核を溶解せず、かつそれを実施する間デオキシリボヌク
レアーゼ類を阻害することである。Trysは緩衝剤は
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンである; N
a2 EDTAはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
、DNase活性のために要求される二価のカチオンの
キレート剤である:非イオン洗浄剤、例えば、NP−4
0(またはTrlton X−100)は細胞膜を可溶
化するが、細胞核には有意の影響を及ぼさない。
r l s、 EDTAおよびNon1detを流体
中の細胞の試料へ添加する目的は、細胞を溶解するが、
核を溶解せず、かつそれを実施する間デオキシリボヌク
レアーゼ類を阻害することである。Trysは緩衝剤は
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンである; N
a2 EDTAはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
、DNase活性のために要求される二価のカチオンの
キレート剤である:非イオン洗浄剤、例えば、NP−4
0(またはTrlton X−100)は細胞膜を可溶
化するが、細胞核には有意の影響を及ぼさない。
この工程の結果は、細胞、とくにRBCが崩壊され、事
実上被のみが無傷のままで残留することである。この目
的は、二[程(2)における低速の遠心の間、核を除い
たほとんどすべての細胞物質はI−、澄み中に残るよう
に、試料をコンディショニングすることである。
実上被のみが無傷のままで残留することである。この目
的は、二[程(2)における低速の遠心の間、核を除い
たほとんどすべての細胞物質はI−、澄み中に残るよう
に、試料をコンディショニングすることである。
工程(2)の目的は、低速遠心(例えば、1kgで5〜
10分)により核を儂縮し、しかつ核を細胞物質の残部
および流体から、弔に上澄みを注ぎ出すことにきより分
離することである。核を上程(1)c7)Trls−E
DTA中に、洗浄剤の不存在下に、懸濁させて、核を工
程(3)のための抽出管へ移送する。この移送は遠心管
の使用により回避することができ、この遠心管は底部を
有し、この底部は開口しかつねじ込みにより5ml容の
ふた付き抽出管を受け入れる。抽出管はそれ自体工程(
3)〜(5)における高速遠心に耐えることができる。
10分)により核を儂縮し、しかつ核を細胞物質の残部
および流体から、弔に上澄みを注ぎ出すことにきより分
離することである。核を上程(1)c7)Trls−E
DTA中に、洗浄剤の不存在下に、懸濁させて、核を工
程(3)のための抽出管へ移送する。この移送は遠心管
の使用により回避することができ、この遠心管は底部を
有し、この底部は開口しかつねじ込みにより5ml容の
ふた付き抽出管を受け入れる。抽出管はそれ自体工程(
3)〜(5)における高速遠心に耐えることができる。
沈降した核が粘着性である場合、それIW衝液(および
必要に応じて、固定(1)において使用した4X緩衝液
)中にポリアニオンのスペルミンおよび/またはスペル
ミジンを含有させることによりiQ懸濁することができ
る。
必要に応じて、固定(1)において使用した4X緩衝液
)中にポリアニオンのスペルミンおよび/またはスペル
ミジンを含有させることによりiQ懸濁することができ
る。
工程(3)の[」的は、ヌクレオタンパク質錯体を高濃
度の塩で解離し、イオン性洗浄剤の5arkO3y1(
Naラウリルサルコシネート、これは高濃度の塩中にか
つ冷時に口f溶性であのでSDSよりも利点をもつ)、
そしてタンパク質を有機溶媒のフェノール中に分配させ
るかあるいはフェノールおよびクロロホルムで沈殿させ
ることによりタンパク質を溶液から分離することである
。
度の塩で解離し、イオン性洗浄剤の5arkO3y1(
Naラウリルサルコシネート、これは高濃度の塩中にか
つ冷時に口f溶性であのでSDSよりも利点をもつ)、
そしてタンパク質を有機溶媒のフェノール中に分配させ
るかあるいはフェノールおよびクロロホルムで沈殿させ
ることによりタンパク質を溶液から分離することである
。
遠心すると、振盪により生成された乳濁液は3つの相に
分離する:下の有機相、変性されたタンパク質の帯、お
よび上の水相。この水相は核酸および炭水化物(主とし
てグリコーゲン)、細胞中に蓄積されたものであろう、
を含有する。
分離する:下の有機相、変性されたタンパク質の帯、お
よび上の水相。この水相は核酸および炭水化物(主とし
てグリコーゲン)、細胞中に蓄積されたものであろう、
を含有する。
工程(4)のi」的は、水相を注意して回収し、次いで
これを約70%のエタノールで溶液することにより核酸
を沈殿させることである。水相が高分子量のDNAの存
在によるつくられた粘度のために、ピペントにより、集
めることが困難である場合、工程(3)における激しい
振盪はDNAの大きさを十分に減少させるであろう。あ
るいは、多少の慎重なりNAの剪断を導入することが必
要であろう[工程(3)を変更することにより、懸濁さ
れた核をまず注射器中の2モルのNaC1のみで処理し
、27ゲージの針を通して抽出管中に押[7入れてDN
Aに剪断を与え、次いで5ar−kosylおよびフェ
ノール/クロロホルムへさらす]。
これを約70%のエタノールで溶液することにより核酸
を沈殿させることである。水相が高分子量のDNAの存
在によるつくられた粘度のために、ピペントにより、集
めることが困難である場合、工程(3)における激しい
振盪はDNAの大きさを十分に減少させるであろう。あ
るいは、多少の慎重なりNAの剪断を導入することが必
要であろう[工程(3)を変更することにより、懸濁さ
れた核をまず注射器中の2モルのNaC1のみで処理し
、27ゲージの針を通して抽出管中に押[7入れてDN
Aに剪断を与え、次いで5ar−kosylおよびフェ
ノール/クロロホルムへさらす]。
工程(5)におけるエタノール洗浄のlJ的は、残留す
る溶媒および塩類を核酸の沈殿から除去することである
。95%のエタノールで洗浄した後、管を短時間沈降物
が完全に乾燥する点まで乾燥すべきである。湿ったDN
Aは乾燥したDNAより容易に溶解する。事実−Lすべ
てのエタノールを除去して、工程(6)を妨害しないが
、DNAが完全に乾燥するほど多くない液体を含有する
よにすることができる。管を数分間通さにして廃液し、
次いで沈降物のすぐ近くを除外した管の内部をQチップ
(Q、−tip)でぬぐうことができる。
る溶媒および塩類を核酸の沈殿から除去することである
。95%のエタノールで洗浄した後、管を短時間沈降物
が完全に乾燥する点まで乾燥すべきである。湿ったDN
Aは乾燥したDNAより容易に溶解する。事実−Lすべ
てのエタノールを除去して、工程(6)を妨害しないが
、DNAが完全に乾燥するほど多くない液体を含有する
よにすることができる。管を数分間通さにして廃液し、
次いで沈降物のすぐ近くを除外した管の内部をQチップ
(Q、−tip)でぬぐうことができる。
工程(6)の目的は制限エンドヌクレアーゼの作用に適
する緩衝液中にDNAを溶解し、次いでその酵素でDN
Aを消化することである。制限酵素の緩衝液は、一般に
、ミリモル都のTris緩抄i液、Mf” ”、メルカ
プトエタノール、および0.15モル程度に高い濃度の
塩を含有する。また、時には、ウシ血清アルブミンを含
有させて酵素の可溶化を促進することが望ましいであろ
う。
する緩衝液中にDNAを溶解し、次いでその酵素でDN
Aを消化することである。制限酵素の緩衝液は、一般に
、ミリモル都のTris緩抄i液、Mf” ”、メルカ
プトエタノール、および0.15モル程度に高い濃度の
塩を含有する。また、時には、ウシ血清アルブミンを含
有させて酵素の可溶化を促進することが望ましいであろ
う。
塩類、とくにMg+1の存在はDNAの溶解を抑制する
ので、DNAを水中に溶解した後、分画容量の濃緩衝液
/l!A類を添加することが有利である。例えば、DN
A沈降物を0.08m1のH2O中に溶解し、そしてこ
れに0.01m1のlOX緩衝液/塩類および0 、0
1 m、 lの酵素を添加することができる。
ので、DNAを水中に溶解した後、分画容量の濃緩衝液
/l!A類を添加することが有利である。例えば、DN
A沈降物を0.08m1のH2O中に溶解し、そしてこ
れに0.01m1のlOX緩衝液/塩類および0 、0
1 m、 lの酵素を添加することができる。
第1図は、ヘモグロビン遺伝子、第1および第2のプロ
ーブ調製および1[:常なりNAおよび鎌を赤血球DN
Aの消化生成物を示すグラフである。 ff12図は、第1および第2のプローブおよび未知の
DNAを用いる二暇の交雑を含む本発明の方法のフロー
シートである。
ーブ調製および1[:常なりNAおよび鎌を赤血球DN
Aの消化生成物を示すグラフである。 ff12図は、第1および第2のプローブおよび未知の
DNAを用いる二暇の交雑を含む本発明の方法のフロー
シートである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、工程: a)試験試料から核酸を抽出し、 b)抽出された核酸を制限酵素で消化し、これにより、
制限酵素の認m部位が特定の配列中に存在するか否かに
依存して、前記配列においてDNAを切り離しあるいは
切り離さず、 c)(b)の生成物を処理して−・末鎖核酸を形成し。 d)(c)において生成された一本鎖の核酸を第1およ
び第2のポリヌクレオチドのプローブと接触させ、前記
第1および第2のポリヌクレオチドのプローブは検出す
べき前記配列のそれぞれ第1および第2の部分と相補的
であり、前記2つの部分は問題の制限部位と重複せずか
つそれにすぐの隣接し、このような接触は前記検出すべ
き配列への前記第1および第2のプローブの交雑に対し
て好適な条件下で実施し、前記プローブの両者を用いる
交雑は工程(b)において制限が起こらなかったかに依
存し、前記第1プローブt±区別可能な標識を組み込ん
でおり、 e)前記第2プローブにより、(i)両者の前記標識材
けされた第1プローブおよび第2のプローブへ交雑され
た検出すべき前記核酸からなる得られた二重交雑生成物
を、(i i)交雑しない単一の交雑化標識第1プロー
ブから分離し、そしてf)前記標識により、存在しうる
前記分離された二重交雑生成物を検出する、 からなることを特徴とする試験試料中に含有されるり、
NAが特定の核酸配列を含むかどうかを決定する方法。 2、第2プローブは、第1プローブおよび検出すべき前
記配列の交雑生成物を交雑しない単一交雑化第1プロー
ブから分離することを可能とする形態であることを特徴
とする特許請求の範囲第1.+17記載の方法。 3、第2プローブは固体の支持体へ固定されていること
を特徴とする特1作請求の範囲第1項記載の力n、。 4、プローブの各々は異る宿主ベクトル系におけるサブ
クローニングにより独立に生成される特許請求の範囲第
1〜3項のいずれかに記載の方法。 5、第1および第2のプローブは、試験試料の物質と回
−・の物質を含有するクローニングされた核酸の消化し
、ここで消化は2つの核酸断片を生成する、2つの断片
を一方が第2プローブになるように分離し、そして区別
可能な標識を第1プローブとなる断片に適用し、前記標
識の適用を消化または分離の前または後に実施する、こ
とによって得られる、ことを特徴とする特許請求の範囲
第1〜4項のいずれかに記載の方法。 6、消化は制限酵素を用いて実施することを特徴とする
特許請求の範囲第5項記載の方法。 7、第1および第2のプローブはヘモグロビン遺伝子の
消化により生成され、試験試料は鎌状赤血球貧血につい
て試験される患者のヘモグロビン遺伝子であることを特
徴とする特許請求の範囲第5または6項記載の方法。 8、試験試料の酵素の消化は、両者のプローブと交雑=
if能な長さの鎌状赤血球貧血の核酸を基すようなもの
である特許請求の範囲第7項記載の方法。 9、第1および第2のプローブは正常のヘモグロビン遺
伝子の消化により生成され、消化された試験試料の両名
のプローブへの交雑は鎌状赤血球貧血の核酸が内部に存
在することを示す特許請求の範囲第8項記載の方法。 10、(1)試験試料の核酸中に存在する核酸配列を各
々が含む第1および第2のプローブ、第1プローブは区
別Of能な標識を支持しかつ決定が実施される液体中に
可溶性であり、第2プローブは固体の支持体上に固定さ
れている、および(2) 4¥定の核酸配列の存在また
は不存在に依存して試験試料を切り離すかあるいは切り
離さない制限酷素からなり、これにより陽性の決定試験
試料は両者の第1および第2のプローブと交雑すること
かでき、こうして標識を固体の支持体へ引き続く読取り
のために固定する、ことを特徴とする試験試料中に含有
される核酸が特定の核酸配列を含むかどうかを決定する
だめのキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US51106383A | 1983-07-05 | 1983-07-05 | |
US511063 | 1983-07-05 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6036497A true JPS6036497A (ja) | 1985-02-25 |
Family
ID=24033307
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59138045A Pending JPS6036497A (ja) | 1983-07-05 | 1984-07-05 | 特定のヌクレオチド配列についてdna試料を試験する方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0130515A3 (ja) |
JP (1) | JPS6036497A (ja) |
CA (1) | CA1222680A (ja) |
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JPS62282599A (ja) * | 1986-03-05 | 1987-12-08 | バイエル・コーポレーシヨン | ポリヌクレオチド配列の検出のための溶液相単一交雑アツセイ |
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