JPS6322197A - 択一的ヌクレオチド配列の識別方法 - Google Patents
択一的ヌクレオチド配列の識別方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ハイブリダイゼーションプローブの使用、そ
のためのハイブリダイゼーションプローブ、及びこの方
法において使用するためのキットに関する。この発明は
特に１、変異塩基配列から特定の塩基配列を識別するこ
と、そして特に標的塩其配列の隣接するセグメントを検
出可能な第一ヌクレオチドプローブ、及び第二ヌクレオ
チドプローブとのハイブリダイゼーションにかけること
により得られる利点に関する。
のためのハイブリダイゼーションプローブ、及びこの方
法において使用するためのキットに関する。この発明は
特に１、変異塩基配列から特定の塩基配列を識別するこ
と、そして特に標的塩其配列の隣接するセグメントを検
出可能な第一ヌクレオチドプローブ、及び第二ヌクレオ
チドプローブとのハイブリダイゼーションにかけること
により得られる利点に関する。
従ってこの発明は特に、複雑なゲノムへの短いオリゴヌ
クレオチドプローブのハイブリダイゼーションにおいて
一般に遭遇されるバックグラウンドの非特異的ハイブリ
ダイゼーションの問題を改善しながら特定の塩基配列を
認別することに関する。
クレオチドプローブのハイブリダイゼーションにおいて
一般に遭遇されるバックグラウンドの非特異的ハイブリ
ダイゼーションの問題を改善しながら特定の塩基配列を
認別することに関する。
〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕核酸
ハイブリダイゼーション分析は生物医学的研究及び組換
ＤＮＡ技法の分野において広い用途を有する技法である
。すなわち、例えばハイブリダイゼーションプローブは
、科学的又は医学的に興味ある核酸及び他の分子を検出
し、モニターし、位置決定しそして単離するために有用
である。例えば、フェニルケトン尿症、α−アンチトリ
プシン欠損、α−及びβ−サラセミア、並びに鎌形赤血
球貧血のごときある種の疾患状態に関連するＤＮＡ塩基
配列中の変化を検出するために使用される小オリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーションプローブが有用である
。これらの疾患状態はしばしば遺伝子中の既知の皐−の
点変異を伴う。
ハイブリダイゼーション分析は生物医学的研究及び組換
ＤＮＡ技法の分野において広い用途を有する技法である
。すなわち、例えばハイブリダイゼーションプローブは
、科学的又は医学的に興味ある核酸及び他の分子を検出
し、モニターし、位置決定しそして単離するために有用
である。例えば、フェニルケトン尿症、α−アンチトリ
プシン欠損、α−及びβ−サラセミア、並びに鎌形赤血
球貧血のごときある種の疾患状態に関連するＤＮＡ塩基
配列中の変化を検出するために使用される小オリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーションプローブが有用である
。これらの疾患状態はしばしば遺伝子中の既知の皐−の
点変異を伴う。
短いオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションブロー
ブがかなり使用されるが、これらは通常、特に高等動物
のゲノムの分析に使用される場合、非特異的ハイブリダ
イゼーションの高いバックグラウンドと関連する。この
問題はゲノムが非常に複雑であることから生ずる。すな
わち、例えば吐乳類は細菌に比べて細胞当り１０００倍
以上のオーダーのＤＮＡを含有し、ヌクレオチド配列の
多くが反復しているであろう。従って、いずれの所与の
ヌクレオチドプローブについても、目的のデュプレック
ス以外の安定なデュプレックス（以後、ハイブリドとも
称する）が一般に形成されるであろう、この問題は特に
、ハイブリダイゼーション過程を促進するために非常に
高いオリゴヌクレオチド濃度を使用することにより悪化
する。この問題は、ゲル電気泳動を用いてオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーションの前に異るＤＮＡ（又は
ＲＮＡ）断片を分離し、特異的にハイブリダイズする断
片が非特異的にハイブリダイズする断片がら分離される
ことを保証することにより迂回され得る０例えば、Ｗｏ
ｏ等（Ｂａｎｂｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ、Ｒｅｃｏｍｂ−
ｉｎａｎｔ ＤＮＡ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ
Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ。
ブがかなり使用されるが、これらは通常、特に高等動物
のゲノムの分析に使用される場合、非特異的ハイブリダ
イゼーションの高いバックグラウンドと関連する。この
問題はゲノムが非常に複雑であることから生ずる。すな
わち、例えば吐乳類は細菌に比べて細胞当り１０００倍
以上のオーダーのＤＮＡを含有し、ヌクレオチド配列の
多くが反復しているであろう。従って、いずれの所与の
ヌクレオチドプローブについても、目的のデュプレック
ス以外の安定なデュプレックス（以後、ハイブリドとも
称する）が一般に形成されるであろう、この問題は特に
、ハイブリダイゼーション過程を促進するために非常に
高いオリゴヌクレオチド濃度を使用することにより悪化
する。この問題は、ゲル電気泳動を用いてオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーションの前に異るＤＮＡ（又は
ＲＮＡ）断片を分離し、特異的にハイブリダイズする断
片が非特異的にハイブリダイズする断片がら分離される
ことを保証することにより迂回され得る０例えば、Ｗｏ
ｏ等（Ｂａｎｂｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ、Ｒｅｃｏｍｂ−
ｉｎａｎｔ ＤＮＡ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ
Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ。
コールドスプリングハーバ−ラボラトリーズ（１９８３
） 、１０５−１１０頁〕はα１−アンチトリプシンオ
リゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする小制限
断片をやはりこのプローブにハイブリダイズするＤＮＡ
の高分子種から分離するためにサザン移行技法を用いて
いる。
） 、１０５−１１０頁〕はα１−アンチトリプシンオ
リゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする小制限
断片をやはりこのプローブにハイブリダイズするＤＮＡ
の高分子種から分離するためにサザン移行技法を用いて
いる。
ゲル電気泳動を用いる複雑なゲノムのオリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーション分析には、生物体からの純粋
なりＮＡ（又はＲＮＡ）の調製、制限エンドヌクレアー
ゼ処理によるＤＮＡ分子の断片化、及びほとんどの場合
ゲルからハイブリダイゼーション用固体支持体への分離
されたＤＮＡ（又はＲＮＡ）分子の移行が必要である。
ドハイブリダイゼーション分析には、生物体からの純粋
なりＮＡ（又はＲＮＡ）の調製、制限エンドヌクレアー
ゼ処理によるＤＮＡ分子の断片化、及びほとんどの場合
ゲルからハイブリダイゼーション用固体支持体への分離
されたＤＮＡ（又はＲＮＡ）分子の移行が必要である。
この方法の複雑さのため、この方法は日常的診断用とし
て適当でなく、かつ自動化することが困難である。
て適当でなく、かつ自動化することが困難である。
特異的にハイブリダイズする長いオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いるハイブリダイゼーション分析のためのよ
り簡単な方法が、ＤＮＡについて邦人、Ｖｏｌ ７７（
１９８０）ｐ６８５１−６８５５により、そしてＲＮＡ
についてはＴ、Ｍａｎｓｅｒ及び阿、Ｌ、（：ｅｆｔｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ。
ローブを用いるハイブリダイゼーション分析のためのよ
り簡単な方法が、ＤＮＡについて邦人、Ｖｏｌ ７７（
１９８０）ｐ６８５１−６８５５により、そしてＲＮＡ
についてはＴ、Ｍａｎｓｅｒ及び阿、Ｌ、（：ｅｆｔｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、＾ｅｎｄ Ｓｃｉ ＵＳ＾、Ｖｏｌ ８１（
１９８４）ｐ２４７０−２４７４に例示されており、そ
してこの方法はＤＮＡ又はＲＮＡを粗細胞溶解物から固
体支持体に直接固定化することを含む。非特異的ハイブ
リダイゼーションのため、この直接固定化法は通常オリ
ゴヌクレオチドプローブの使用と適合しない。
１９８４）ｐ２４７０−２４７４に例示されており、そ
してこの方法はＤＮＡ又はＲＮＡを粗細胞溶解物から固
体支持体に直接固定化することを含む。非特異的ハイブ
リダイゼーションのため、この直接固定化法は通常オリ
ゴヌクレオチドプローブの使用と適合しない。
バックグラウンド非特異的ハイブリダイゼーションの上
記の問題点に加えて、この発明はまた特に、従来ゲル法
によってのみ検出可能であったトランスロケーション（
ｔｒａｎｓｌｏｃａＬｉｏｎ）の検出を単純化すること
に関する。
記の問題点に加えて、この発明はまた特に、従来ゲル法
によってのみ検出可能であったトランスロケーション（
ｔｒａｎｓｌｏｃａＬｉｏｎ）の検出を単純化すること
に関する。
従って本発明は、少なくとも部分的に、上記の問題点を
改善しながら択一的（ａｌｔｅｒｎａｔｉνｅ）複数ヌ
クレオチド配列間を識別する方法の発見に基いている。
改善しながら択一的（ａｌｔｅｒｎａｔｉνｅ）複数ヌ
クレオチド配列間を識別する方法の発見に基いている。
従って、この発明は、例えば、直接的に固定化されたＤ
ＮＡもしくはＲＮＡサンプル又は溶液中のＤＮＡもしく
はＲＮＡサンプルの有意な分析を可能にすること１こよ
って、所与の塩基配列中の変異が容易に検出できるよう
にしすること、及びトランスロケーションの検出を単純
化することにおいて有利である。これに関し、ヌクレオ
チドプローブが短かくなるに従ってハイブリダイゼーシ
ョンの選択性が貧弱となり、そしてそれ故にバックグラ
ウンドが高−くなることが知られている。
ＮＡもしくはＲＮＡサンプル又は溶液中のＤＮＡもしく
はＲＮＡサンプルの有意な分析を可能にすること１こよ
って、所与の塩基配列中の変異が容易に検出できるよう
にしすること、及びトランスロケーションの検出を単純
化することにおいて有利である。これに関し、ヌクレオ
チドプローブが短かくなるに従ってハイブリダイゼーシ
ョンの選択性が貧弱となり、そしてそれ故にバックグラ
ウンドが高−くなることが知られている。
さらに、ヌクレオチドプローブが短がくなるに従って、
熱転移（ｔｈｅｒｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）の中
間点の温度である融解温度（Ｔｍ）により測定する場合
に、形成されるデュプレックスの安定性が弱くなる０本
発明は少なくとも部分的に、相対的に長いヌクレオチド
プローブと異る短いヌクレオチドプローブのハイブリダ
イゼーション特性が、前記の問題点を改善しながら択一
的複数ヌクレオチド配列間を識別するために有利に使用
され得るという発見に基いている。
熱転移（ｔｈｅｒｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）の中
間点の温度である融解温度（Ｔｍ）により測定する場合
に、形成されるデュプレックスの安定性が弱くなる０本
発明は少なくとも部分的に、相対的に長いヌクレオチド
プローブと異る短いヌクレオチドプローブのハイブリダ
イゼーション特性が、前記の問題点を改善しながら択一
的複数ヌクレオチド配列間を識別するために有利に使用
され得るという発見に基いている。
この発明はさらに、ハイブリダイゼーション分析を実質
的に単純化し、こうして択一的ヌクレオチド配列間を識
別する強力な技法を提供する方法の発見に基いている。
的に単純化し、こうして択一的ヌクレオチド配列間を識
別する強力な技法を提供する方法の発見に基いている。
この発明の１つの特徴に従えば、択一的複数ヌクレオチ
ド配列間を識別する方法が提供され、この方法は、標的
塩其配列の隣接するセグメントを検出可能な第一ヌクレ
オチドプローブと及び第二ヌクレオチドプローブとのハ
イブリダイゼーションにかけてハイブリドを形成せしめ
、ここで、該第一及び第二プローブはこれらが相補的標
的配列とスプリットブローブハイブリド（ｓｐｌｉｔ
ｐｒｏｂｅｈｙｂｒｉｄ ）を形成する場合にこれらが
次に連結されて得られたハイブリドが連結されるような
ものであり、次に得られたハイブリドを検出し；前記検
出可能な第一ヌクレオチドプローブの及び第二ヌクレオ
チドプローブのＤＮＡ配列が、標的配列中の可能性ある
（ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）ミスマツチが該プローブの間
にあるか又はこれらのプローブの内の１つのプローブの
末端（この末端はこれらのプローブの内の他方のプロー
ブに隣接している）にあるようなものであり、 前記方法が、相補的標的配列が１又は複数の非相補的ヌ
クレオチドを有する標的配列から識別されるように実施
される； ことを特徴とする。
ド配列間を識別する方法が提供され、この方法は、標的
塩其配列の隣接するセグメントを検出可能な第一ヌクレ
オチドプローブと及び第二ヌクレオチドプローブとのハ
イブリダイゼーションにかけてハイブリドを形成せしめ
、ここで、該第一及び第二プローブはこれらが相補的標
的配列とスプリットブローブハイブリド（ｓｐｌｉｔ
ｐｒｏｂｅｈｙｂｒｉｄ ）を形成する場合にこれらが
次に連結されて得られたハイブリドが連結されるような
ものであり、次に得られたハイブリドを検出し；前記検
出可能な第一ヌクレオチドプローブの及び第二ヌクレオ
チドプローブのＤＮＡ配列が、標的配列中の可能性ある
（ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）ミスマツチが該プローブの間
にあるか又はこれらのプローブの内の１つのプローブの
末端（この末端はこれらのプローブの内の他方のプロー
ブに隣接している）にあるようなものであり、 前記方法が、相補的標的配列が１又は複数の非相補的ヌ
クレオチドを有する標的配列から識別されるように実施
される； ことを特徴とする。
必要であれば、連結後に得られるハイブリドを選択的変
性にかけることができる。
性にかけることができる。
連結されたプローブの存在は任意の常用手段により、例
えば選択的変性により、あるいはプローブの一方が結合
対の１つの構成員を担持する場合には該結合対の他方の
構成員を用いることにより、検出され得る。この様な結
合対の適当な例は後で検討する。相補的標的配列又は非
相補的標的配列が検出可能なハイブリドの不存在によっ
て同定されることが期待され、そしてこれも本発明の範
囲に含まれる。
えば選択的変性により、あるいはプローブの一方が結合
対の１つの構成員を担持する場合には該結合対の他方の
構成員を用いることにより、検出され得る。この様な結
合対の適当な例は後で検討する。相補的標的配列又は非
相補的標的配列が検出可能なハイブリドの不存在によっ
て同定されることが期待され、そしてこれも本発明の範
囲に含まれる。
従来、特異的な識別がハイブリダイゼーション温度の注
意深い操作及び結合した識別プローブの洗浄により達成
されていたことが注目されよう。
意深い操作及び結合した識別プローブの洗浄により達成
されていたことが注目されよう。
本発明においては、プローブは、可能性あるミスマツチ
のいずれかの側で標的配列にハイブリダイズし、プロー
ブ而にギャップ、好ましくは皐−ヌクレオチドギャップ
が存在するように設計され、あるいはプローブは標的配
列中の隣接する配列にハイブリダイズと可能性あるミス
マツチがプローブの内の１つのプローブの末端（この末
端は他方のプローブと隣接する）に存在するように設計
される０本発明の効果は、特異性が主として２個の独立
して作用するプローブと前記のプローブを連結する手段
、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼとの相互作用の結果である
ことである。すなわち、この発明は、連結されるべき隣
接するプローブの３′又は５′部位がそれらがハイブリ
ダイズすべき配列に対して相補的でない場合に、連結、
例えばＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結が効果的でないと
予想されるような識別方法を実施することを可能にする
。同様に、ギャップ、好ましくは単一ヌクレオチドギャ
ップが２個のプローブ間に存在する場合に、本発明は、
例えばＤＮＡポリメラーゼ反応混合物に添加されたデオ
キシヌクレオチドトリホスフェートが試験のもとにある
塩基残基に相補的でない場合に、ギャップを満たしそし
て例えばＤＮＡリガーゼによる連結を可能にするための
ＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片又はウシ胸腺
ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの導入が有意に
効果的でないような識別方法の実施を可能にする。
のいずれかの側で標的配列にハイブリダイズし、プロー
ブ而にギャップ、好ましくは皐−ヌクレオチドギャップ
が存在するように設計され、あるいはプローブは標的配
列中の隣接する配列にハイブリダイズと可能性あるミス
マツチがプローブの内の１つのプローブの末端（この末
端は他方のプローブと隣接する）に存在するように設計
される０本発明の効果は、特異性が主として２個の独立
して作用するプローブと前記のプローブを連結する手段
、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼとの相互作用の結果である
ことである。すなわち、この発明は、連結されるべき隣
接するプローブの３′又は５′部位がそれらがハイブリ
ダイズすべき配列に対して相補的でない場合に、連結、
例えばＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結が効果的でないと
予想されるような識別方法を実施することを可能にする
。同様に、ギャップ、好ましくは単一ヌクレオチドギャ
ップが２個のプローブ間に存在する場合に、本発明は、
例えばＤＮＡポリメラーゼ反応混合物に添加されたデオ
キシヌクレオチドトリホスフェートが試験のもとにある
塩基残基に相補的でない場合に、ギャップを満たしそし
て例えばＤＮＡリガーゼによる連結を可能にするための
ＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片又はウシ胸腺
ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの導入が有意に
効果的でないような識別方法の実施を可能にする。
従ってこの発明は、ハイブリダイゼーション分析を実質
的に単純化すること可能にし、そして択一的ヌクレオチ
ド配列間を識別するための強力な技法を提供する。すな
わち、例えば、狭い温度範囲でのそして特定の時間にわ
たるハイブリダイゼーション又は洗浄の使用に頼る必要
性が除去され、従って狭い範囲の誤差に頼るすべての技
法において本質的な困難が克服される。この発明は、少
なくと幾つかの具体例においては室温においてハイブリ
ダイゼーション分析を行うことさえ可能にする。
的に単純化すること可能にし、そして択一的ヌクレオチ
ド配列間を識別するための強力な技法を提供する。すな
わち、例えば、狭い温度範囲でのそして特定の時間にわ
たるハイブリダイゼーション又は洗浄の使用に頼る必要
性が除去され、従って狭い範囲の誤差に頼るすべての技
法において本質的な困難が克服される。この発明は、少
なくと幾つかの具体例においては室温においてハイブリ
ダイゼーション分析を行うことさえ可能にする。
この発明の方法は例えば、相補的標的配列が存在する場
合には相補的ハイブリドの形成からもたらされる検出可
能なシグナルの検出により（必要であればハイブリドは
検出に先立って変性される）、あるいは１又は複数の非
相補的ヌクレオチドを含有する標的配列が存在する場合
、ミスマツチにわたるハイブリドの不存在から又は形成
されたハイブリドの選択的変性からもたらされる検出可
能なシグナルの不検出により行われる。
合には相補的ハイブリドの形成からもたらされる検出可
能なシグナルの検出により（必要であればハイブリドは
検出に先立って変性される）、あるいは１又は複数の非
相補的ヌクレオチドを含有する標的配列が存在する場合
、ミスマツチにわたるハイブリドの不存在から又は形成
されたハイブリドの選択的変性からもたらされる検出可
能なシグナルの不検出により行われる。
従って、第一ヌクレオチドプローブは検出可能でなけれ
ばならないが、第二ヌクレオチドは方法の態様に依存し
て検出可能であっても検出可能でなくてもよい。
ばならないが、第二ヌクレオチドは方法の態様に依存し
て検出可能であっても検出可能でなくてもよい。
第一ヌクレオチドはシグナル発生手段、例えば放射性ラ
ベル又は非放射性シグナル発生複合体を担持していても
よいがその必要はなく、プローブはその後にシグナルを
発生できるように処理されればよい、そして、１塩基対
という差異の小さい、複雑なゲノム中の配列間を識別す
ることが可能である。
ベル又は非放射性シグナル発生複合体を担持していても
よいがその必要はなく、プローブはその後にシグナルを
発生できるように処理されればよい、そして、１塩基対
という差異の小さい、複雑なゲノム中の配列間を識別す
ることが可能である。
相補的標的塩其配列とのハイブリダイゼーションの後に
スプリットブローブハイブリドが形成された場合、得ら
れたハイブリドを連結反応にかけて検出可能な第一ヌク
レオチドプローブを第二ヌクレオチドプローブに連結し
、得られたハイブリドを変性にかけ、この場合検出可能
な第一ヌクレオチドプローブの第二ヌクレオチドプロー
ブへの連結が行われなかったハイブリドは変性され、他
方完全に相補的な検出可能な連結されたオリゴヌクレオ
チド−標的配列ハイブリドは変性されない。
スプリットブローブハイブリドが形成された場合、得ら
れたハイブリドを連結反応にかけて検出可能な第一ヌク
レオチドプローブを第二ヌクレオチドプローブに連結し
、得られたハイブリドを変性にかけ、この場合検出可能
な第一ヌクレオチドプローブの第二ヌクレオチドプロー
ブへの連結が行われなかったハイブリドは変性され、他
方完全に相補的な検出可能な連結されたオリゴヌクレオ
チド−標的配列ハイブリドは変性されない。
プローブが予想されるミスマツチを含有する標的配列の
部分にハイブリダイズするように設計される場合、プロ
ーブは一般にオリゴヌクレオチド（後で定義する）であ
ろう、適当な処理は例えば選択的変性を含むことができ
、あるいはプローブの一方が結合対の一方の構成員を含
むことができる。
部分にハイブリダイズするように設計される場合、プロ
ーブは一般にオリゴヌクレオチド（後で定義する）であ
ろう、適当な処理は例えば選択的変性を含むことができ
、あるいはプローブの一方が結合対の一方の構成員を含
むことができる。
第一及び第二ヌクレオチドプローブの隣接する安定なハ
イブリドの連結が、隣接するオリゴヌクレオチドプロー
ブの存在を伴わないで非特異的標的配列にハイブリダイ
ズした検出可能なオリゴヌクレオチドとは反対に、特異
的標的配列にハイブリダイズした検出可能なオリゴヌク
レオチドの大きなハイブリド熱安定性をもたらす。
イブリドの連結が、隣接するオリゴヌクレオチドプロー
ブの存在を伴わないで非特異的標的配列にハイブリダイ
ズした検出可能なオリゴヌクレオチドとは反対に、特異
的標的配列にハイブリダイズした検出可能なオリゴヌク
レオチドの大きなハイブリド熱安定性をもたらす。
この明細書において使用する場合、″“オリゴヌクレオ
チド”なる表現は、１塩基対という少数のミスマツチを
含有する標的配列とハイブリドを形成することができな
いか、あるいはハイブリドを形成することができるが、
このハイブリドが、対応する完全に相補的なハイブリド
を変性しない条件下で選択的に変性されるように１塩基
対という少数のミスマツチの存在により不安定化されて
いるようなヌクレオチド配列を意味する。
チド”なる表現は、１塩基対という少数のミスマツチを
含有する標的配列とハイブリドを形成することができな
いか、あるいはハイブリドを形成することができるが、
このハイブリドが、対応する完全に相補的なハイブリド
を変性しない条件下で選択的に変性されるように１塩基
対という少数のミスマツチの存在により不安定化されて
いるようなヌクレオチド配列を意味する。
可能性ある変異配列が、検出可能な第一ヌクレオチドプ
ローブがハイブリダイズする標的配列のセグメント中に
存在することができ；それが、第二配列がハイブリダイ
ズする標的配列のセグメント中に存在することができ；
あるいはそれが、これらのセグメントの間に存在するこ
とができる。
ローブがハイブリダイズする標的配列のセグメント中に
存在することができ；それが、第二配列がハイブリダイ
ズする標的配列のセグメント中に存在することができ；
あるいはそれが、これらのセグメントの間に存在するこ
とができる。
検出可能な第一ヌクレオチドプローブ又は第二ヌクレオ
チドプローブがハイブリダイズする標的配列のセグメン
ト中に可能性ある変異配列が存在する場合に、この可能
性ある変異配列が前記プローブの内の１つのプローブの
末端にあり、この末端が前記プローブの内の他方のプロ
ーブに隣接するようにプローブが設計されるであろう。
チドプローブがハイブリダイズする標的配列のセグメン
ト中に可能性ある変異配列が存在する場合に、この可能
性ある変異配列が前記プローブの内の１つのプローブの
末端にあり、この末端が前記プローブの内の他方のプロ
ーブに隣接するようにプローブが設計されるであろう。
従って例えば、可能性ある変異配列が第二ヌクレオチド
がハイブリダイズする標的配列のセグメント中に存在す
る場合、スプリットブローブハイブリドの形成はミスマ
ツチにわたる第二プローブの弱いハイブリドの形成をも
たらすか、あるいは第二プローブが非常に短い場合、ハ
イブリダイゼーションをもたらさないであろう９弱いハ
イブリドが形成される場合、選択的変性は第二プローブ
ハイブリドの変性をもたらすであろう０次に、得られた
ハイブリドが連結にかけられる場合、第二プローブ標的
配列にハイブリダイズする場合、そしてすなわち第二プ
ローブ二部的配列−ハイブリド中にミスマツチが存在し
ない場合にのみ連結が行われ得る。連結の後に得られた
ハイブリドが選択的変性にかけられる場合、第二プロー
ブと連結されることなく第一プローブが単独で標的配列
にハイブリダイズしているハイブリドが変性し、第二プ
ローブの相補的配列とのミスマツチを含有しない標的配
列にハイブリダイズした検出可能なプローブが残される
であろう。
がハイブリダイズする標的配列のセグメント中に存在す
る場合、スプリットブローブハイブリドの形成はミスマ
ツチにわたる第二プローブの弱いハイブリドの形成をも
たらすか、あるいは第二プローブが非常に短い場合、ハ
イブリダイゼーションをもたらさないであろう９弱いハ
イブリドが形成される場合、選択的変性は第二プローブ
ハイブリドの変性をもたらすであろう０次に、得られた
ハイブリドが連結にかけられる場合、第二プローブ標的
配列にハイブリダイズする場合、そしてすなわち第二プ
ローブ二部的配列−ハイブリド中にミスマツチが存在し
ない場合にのみ連結が行われ得る。連結の後に得られた
ハイブリドが選択的変性にかけられる場合、第二プロー
ブと連結されることなく第一プローブが単独で標的配列
にハイブリダイズしているハイブリドが変性し、第二プ
ローブの相補的配列とのミスマツチを含有しない標的配
列にハイブリダイズした検出可能なプローブが残される
であろう。
第−又は第二ヌクレオチドプローブは所望により結合対
の一構成員を有することができる。−最に、結合対の一
楕成員は第二ヌクレオチドプローブに担持され又はその
一部であろう。結合対の他の構成員は溶液中又は支持体
上にあることができる。適当な場合には、検出可能な第
一ヌクレオチドプローブに連結された第二ヌクレオチド
プローブを、結合対の他方の構成員を担持する支持体上
で単随することができる。このような結合対は例えば蛋
白質−リガント又は抗原−抗体、例えばアビジン−ビオ
チン又はジニトロフェニル−抗ジニトロフェニル抗体で
あることができる。
の一構成員を有することができる。−最に、結合対の一
楕成員は第二ヌクレオチドプローブに担持され又はその
一部であろう。結合対の他の構成員は溶液中又は支持体
上にあることができる。適当な場合には、検出可能な第
一ヌクレオチドプローブに連結された第二ヌクレオチド
プローブを、結合対の他方の構成員を担持する支持体上
で単随することができる。このような結合対は例えば蛋
白質−リガント又は抗原−抗体、例えばアビジン−ビオ
チン又はジニトロフェニル−抗ジニトロフェニル抗体で
あることができる。
確かに、結合対の１つの構成員は、プローブ配列の一部
分であるヌクレオチド配列であることができ、又はプロ
ーブ上のヌクレオチド配列技であることができる。結合
対の他の構成員は例えば前記ヌクレオチド配列に結合す
る蛋白質であることができ、又はそれがハイブリダイズ
する他のヌクレオチドであることができる。
分であるヌクレオチド配列であることができ、又はプロ
ーブ上のヌクレオチド配列技であることができる。結合
対の他の構成員は例えば前記ヌクレオチド配列に結合す
る蛋白質であることができ、又はそれがハイブリダイズ
する他のヌクレオチドであることができる。
ハイブリダイゼーション及び／又は選択的変性は、好ま
しくは効果的なハイブリダイゼーション選択性、好まし
くは、特定の長さの連結されたプローブについて最大ハ
イブリダイゼーション選択性をもたらすように選択され
た温度において行われる。有利には、ハイブリダイゼー
ション及び／又は選択的変性は水溶液中で、明乳預ゲノ
ムへの選択的ハイブリダイゼーションのために適当な上
昇した温度において行われ、この温度は連結されたスプ
リットプローブについては６０℃以上、−般に約６８℃
である。これに代り、このような連結されたスプリット
プローブのハイブリダイゼーション及び／又は選択的変
性は、ハイブリドを不安定化するのに有効な有機溶剤、
例えばホルムアミドを含有する溶剤の存在下でさらに低
い温度で行うことができる。１例えば、約５０％のホル
ムアミドが使用される場合、ハイブリダイゼーション及
び／又は選択的変性は約４２°Ｃにおいて行われる。
しくは効果的なハイブリダイゼーション選択性、好まし
くは、特定の長さの連結されたプローブについて最大ハ
イブリダイゼーション選択性をもたらすように選択され
た温度において行われる。有利には、ハイブリダイゼー
ション及び／又は選択的変性は水溶液中で、明乳預ゲノ
ムへの選択的ハイブリダイゼーションのために適当な上
昇した温度において行われ、この温度は連結されたスプ
リットプローブについては６０℃以上、−般に約６８℃
である。これに代り、このような連結されたスプリット
プローブのハイブリダイゼーション及び／又は選択的変
性は、ハイブリドを不安定化するのに有効な有機溶剤、
例えばホルムアミドを含有する溶剤の存在下でさらに低
い温度で行うことができる。１例えば、約５０％のホル
ムアミドが使用される場合、ハイブリダイゼーション及
び／又は選択的変性は約４２°Ｃにおいて行われる。
この発明の他の態様においては、ハイブリダイゼーショ
ンプロービングの方法が提供され、この′方法は、標的
塩其配列の隣接するセグメントを検出可能な第一ヌクレ
オチドプローブとの及び第二ヌクレオチドとのハイブリ
ダイゼーションにかけて相補的標的配列とのスプリット
ブローブハイブリドが形成されるようにし、必要な場合
には得られた該ハイブリドを選択的変性にかけ、これに
よって１又は複数の非相補的ヌクレオチドを含有する標
的塩其配列の部分にハイブリダイズした第−又は第二ヌ
クレオチドプローブのどちらかを変性せしめ、そして次
に得られたハイブリドを連結反応にかけて検出可能な第
一ヌクレオチドプローブを第二ヌクレオチドプローブに
連結し、必要な場合には得られたハイブリドを選択的変
性にかけて第一及び第二ヌクレオチドプローブに相補的
な標的配列と第一及び第二ヌクレオチドプローブに対し
て非相補的な１又は複数のヌクレオチドを含有する標的
配列との間を識別することを含んで成る。
ンプロービングの方法が提供され、この′方法は、標的
塩其配列の隣接するセグメントを検出可能な第一ヌクレ
オチドプローブとの及び第二ヌクレオチドとのハイブリ
ダイゼーションにかけて相補的標的配列とのスプリット
ブローブハイブリドが形成されるようにし、必要な場合
には得られた該ハイブリドを選択的変性にかけ、これに
よって１又は複数の非相補的ヌクレオチドを含有する標
的塩其配列の部分にハイブリダイズした第−又は第二ヌ
クレオチドプローブのどちらかを変性せしめ、そして次
に得られたハイブリドを連結反応にかけて検出可能な第
一ヌクレオチドプローブを第二ヌクレオチドプローブに
連結し、必要な場合には得られたハイブリドを選択的変
性にかけて第一及び第二ヌクレオチドプローブに相補的
な標的配列と第一及び第二ヌクレオチドプローブに対し
て非相補的な１又は複数のヌクレオチドを含有する標的
配列との間を識別することを含んで成る。
ハイブリダイゼーション又は選択的変性は、例えばスプ
リットヌクレオチドブローブハイブリド又は単一ヌクレ
オチドプローブハイブリドの融解温度より高いがしかし
連結された一プα−ブハイブーリドの融解温度より低い
温度において、又は上記のごとくハイブリドを不安定化
せしめるのに効果的な有機溶剤の存在下で行うことがで
きる。ハイブリダイゼーションが選択的変性条件下で行
われる場合、ハイブリダイゼーションの後であって連結
の前の他の選択的変性段階を回避することができる。
リットヌクレオチドブローブハイブリド又は単一ヌクレ
オチドプローブハイブリドの融解温度より高いがしかし
連結された一プα−ブハイブーリドの融解温度より低い
温度において、又は上記のごとくハイブリドを不安定化
せしめるのに効果的な有機溶剤の存在下で行うことがで
きる。ハイブリダイゼーションが選択的変性条件下で行
われる場合、ハイブリダイゼーションの後であって連結
の前の他の選択的変性段階を回避することができる。
第一及び第二ヌクレオチドプローブはそれ自体既知の任
意の便利な手段により、例えばＤＮＡリガーゼを用いる
酵素的連結により、あるいは例えばビオチン−アビジン
架橋を用いる共有／非共有連結により連結することがで
きる。
意の便利な手段により、例えばＤＮＡリガーゼを用いる
酵素的連結により、あるいは例えばビオチン−アビジン
架橋を用いる共有／非共有連結により連結することがで
きる。
検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び／又は第二ヌ
クレオチドプローブは、これらの間のギャップが注目の
標的配列の存在下でＤＮＡポリメラーゼにより満たされ
るまで、最初は連結され得ないかもしれない。
クレオチドプローブは、これらの間のギャップが注目の
標的配列の存在下でＤＮＡポリメラーゼにより満たされ
るまで、最初は連結され得ないかもしれない。
検出可能な第一ヌクレオチドプローブと第二ヌクレオチ
ドプローブとを連結する効果は、対応する検出可能なプ
ローブハイブリドのみに比べて、得られた架橋されたプ
ローブハイブリドの熱安定性を増加することである。す
なわち、例えば連結されたプローブハイブリドの温度は
、対応するスプリットプローブハイブリド又は検出可能
な第一ヌクレオチドプローブもしくは第二ヌクレオチド
プローブの一方のみが標的塩其配列にハイブリダイズし
ている対応するハイブリドを変性せしめる温度に上昇す
る。こうして、相補的標的塩其配列を含む連結されたプ
ローブハイブリドは無傷のままのこる。従って、本発明
の方法は、検出可能なプローブ配列に対して完全に相補
的な塩基配列を池の配列から識別する。
ドプローブとを連結する効果は、対応する検出可能なプ
ローブハイブリドのみに比べて、得られた架橋されたプ
ローブハイブリドの熱安定性を増加することである。す
なわち、例えば連結されたプローブハイブリドの温度は
、対応するスプリットプローブハイブリド又は検出可能
な第一ヌクレオチドプローブもしくは第二ヌクレオチド
プローブの一方のみが標的塩其配列にハイブリダイズし
ている対応するハイブリドを変性せしめる温度に上昇す
る。こうして、相補的標的塩其配列を含む連結されたプ
ローブハイブリドは無傷のままのこる。従って、本発明
の方法は、検出可能なプローブ配列に対して完全に相補
的な塩基配列を池の配列から識別する。
本発明の上記の態様は、例えば点変異の存在を分析する
ために複雑なゲノム中の特異的ハイブリダイゼーション
部位にオリゴヌクレオチドを向けるのに最も有用である
が、複雑なゲノム中の他の変異、例えばトランスロケー
ションの分析のためにも使用される。トランスロケーシ
ョンの分析のためには、スプリットプローブの検出され
ない第二ポリヌクレオチドがそれと関連する結合対の１
つの構成員を有し、そして可能性あるトランスロケーシ
ョンブレークポイントに隣接するゲノム配列にハイブリ
ダイズするであろう、検出可能なプローブは好ましくは
数キロベースの長さであり、そして可能性あるトランス
ロケーションブレークポイントの領域を含む。ハイブリ
ダイゼーション後のスプリットプローブを含むポリヌク
レオチドの定量的連結はゲノム領域が隣接してそしてト
ランスロケーションにより中断されない場合のみ起こる
。トランスロケーションの存在は一定比率の検出可能な
プローブが検出可能でないポリヌクレオチドに連結され
るのを妨害するであろう、ハイブリダイズしたポリヌク
レオチドのその後の変性及び結合対の他の構成員の適用
の後、一定比率の検出可能なポリヌクレオチドは結合対
の他の構成員と複合体を形質したポリヌクレオチドと関
連することは見られないであろう。結合対は好ましくは
抗原−抗体又はビオチン−アビジン相互作用から成り、
これによって例えば変性されたハイブリドは結合対の一
方の構成と複合体を形成した固相を通過し、そして溶出
液が検出可能なプローブの存在について分析される。
ために複雑なゲノム中の特異的ハイブリダイゼーション
部位にオリゴヌクレオチドを向けるのに最も有用である
が、複雑なゲノム中の他の変異、例えばトランスロケー
ションの分析のためにも使用される。トランスロケーシ
ョンの分析のためには、スプリットプローブの検出され
ない第二ポリヌクレオチドがそれと関連する結合対の１
つの構成員を有し、そして可能性あるトランスロケーシ
ョンブレークポイントに隣接するゲノム配列にハイブリ
ダイズするであろう、検出可能なプローブは好ましくは
数キロベースの長さであり、そして可能性あるトランス
ロケーションブレークポイントの領域を含む。ハイブリ
ダイゼーション後のスプリットプローブを含むポリヌク
レオチドの定量的連結はゲノム領域が隣接してそしてト
ランスロケーションにより中断されない場合のみ起こる
。トランスロケーションの存在は一定比率の検出可能な
プローブが検出可能でないポリヌクレオチドに連結され
るのを妨害するであろう、ハイブリダイズしたポリヌク
レオチドのその後の変性及び結合対の他の構成員の適用
の後、一定比率の検出可能なポリヌクレオチドは結合対
の他の構成員と複合体を形質したポリヌクレオチドと関
連することは見られないであろう。結合対は好ましくは
抗原−抗体又はビオチン−アビジン相互作用から成り、
これによって例えば変性されたハイブリドは結合対の一
方の構成と複合体を形成した固相を通過し、そして溶出
液が検出可能なプローブの存在について分析される。
本発明の他の態様においては、標的塩其配列、例えば複
雑なゲノム中のトランスロケーションの分析方法が提供
され、この方法においては、出発可能な第一ヌクレオチ
ドプローブが可能性あるトランスロケーションの領域に
わたってハイブリダイズするようにされ、そして検出さ
れない第二ヌクレオチドプローブが該可能性あるトラン
スロケーションに隣接する配列にハイブリダイズされ、
検出されない第二ヌクレオチドプローブは結合対の一方
の横開を担持し、この方法はスブリッ１〜プローブハイ
ブリドの形成を含み、このハイブリドは連結されたプロ
ーブハイブリドを形成するように連結にかけられ、この
ハイブリドは次に変性される。
雑なゲノム中のトランスロケーションの分析方法が提供
され、この方法においては、出発可能な第一ヌクレオチ
ドプローブが可能性あるトランスロケーションの領域に
わたってハイブリダイズするようにされ、そして検出さ
れない第二ヌクレオチドプローブが該可能性あるトラン
スロケーションに隣接する配列にハイブリダイズされ、
検出されない第二ヌクレオチドプローブは結合対の一方
の横開を担持し、この方法はスブリッ１〜プローブハイ
ブリドの形成を含み、このハイブリドは連結されたプロ
ーブハイブリドを形成するように連結にかけられ、この
ハイブリドは次に変性される。
この発明の他の態様においては、前に定義した方法が提
供され、この方法においては、検出可能な第一ヌクレオ
チドプローブ及び第二ヌクレオチドプローブのそれぞれ
が成分を担持し、検出可能な第一ヌクレオチドプローブ
に付加された成分及び第二ヌクレオチドプローブに付加
された成分の両者を担持するヌクレオチド配列が得られ
る場合にのみ、ハイブリドの形成の後及び適当であれば
変性の後にシグナルが検出される。
供され、この方法においては、検出可能な第一ヌクレオ
チドプローブ及び第二ヌクレオチドプローブのそれぞれ
が成分を担持し、検出可能な第一ヌクレオチドプローブ
に付加された成分及び第二ヌクレオチドプローブに付加
された成分の両者を担持するヌクレオチド配列が得られ
る場合にのみ、ハイブリドの形成の後及び適当であれば
変性の後にシグナルが検出される。
ヌクレオチドプローブは例えばオリゴヌクレオチドプロ
ーブであることができる。
ーブであることができる。
この態様の方法は例えば、非−放射性エネルギー移行法
（例えばスタンダードオイル社のヨーロッパ特許公開Ｎ
ｏ、７０６８５を参照のこと）、又は酵素チャンネリン
グ法（例えばシバ社のヨーロッパ特許上ＦＪｉＮｏ、９
５０８７を参照のこと）を用いて行うことができる。こ
の態様は、特定の標的ヌクレオチド配列のための均一ア
ッセイを提供することができる。
（例えばスタンダードオイル社のヨーロッパ特許公開Ｎ
ｏ、７０６８５を参照のこと）、又は酵素チャンネリン
グ法（例えばシバ社のヨーロッパ特許上ＦＪｉＮｏ、９
５０８７を参照のこと）を用いて行うことができる。こ
の態様は、特定の標的ヌクレオチド配列のための均一ア
ッセイを提供することができる。
この発明の他のＢｍにおいては、択一的ヌクレオチド配
列の間を識別する方法が提供され、この方法においては
、これによって、相補的標的配列が存在する場合にはス
プリットプローブハイブリドが得られるように、標的配
列が２以上のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリ
ダイゼーションにかけられ、検出可能な第一ヌクレオチ
ドプローブは検出可能な末端オリゴヌクレオチドプロー
ブでありそして第二ヌクレオチドプローブは他の末端オ
リゴヌクレオチドプローブであってそれに付加された結
合対の一方の構成員を有し、個々の他のオリゴヌクレオ
チドプローブは前記末端オリゴヌクレオチド間の隣接す
る標的配列に別々にではあるが隣接してハイブリダイズ
し、得られたハイブリドを次に選択的変性にかけること
によって塩基対ミスマツチにわたる標的配列にハイブリ
ダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを変性せしめ、
そして連結された個々のオリゴヌクレオチドが検出可能
なオリゴヌクレオチドプローブを結合対の一方の構成員
を有するオリゴヌクレオチドプローブにつないて連結さ
れたプローブハイブリドを形成せしめ、次にこのハイブ
リドを変性しそして結合対の他方の構成員と接触せしめ
ることにより、前記結合対を含む検出可能な連結された
プローブヌクレオヂド配列を他のヌクレオチド配列から
分離する。従って、１つの末端オリゴヌクレオチド（一
連の他のオリゴヌクレオチドに隣接してハイブリダイズ
する）は例えばそれに付加された検出可能なシグナル発
生成分を有し、他方他の末端オリゴヌクレオチドは結合
対の部分を形成する成分を有しこの成分はオリゴヌクレ
オチドを他のヌクレオチド配列を含有す、る混合物から
溶液中で回収することを可能にするために効果的である
。
列の間を識別する方法が提供され、この方法においては
、これによって、相補的標的配列が存在する場合にはス
プリットプローブハイブリドが得られるように、標的配
列が２以上のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリ
ダイゼーションにかけられ、検出可能な第一ヌクレオチ
ドプローブは検出可能な末端オリゴヌクレオチドプロー
ブでありそして第二ヌクレオチドプローブは他の末端オ
リゴヌクレオチドプローブであってそれに付加された結
合対の一方の構成員を有し、個々の他のオリゴヌクレオ
チドプローブは前記末端オリゴヌクレオチド間の隣接す
る標的配列に別々にではあるが隣接してハイブリダイズ
し、得られたハイブリドを次に選択的変性にかけること
によって塩基対ミスマツチにわたる標的配列にハイブリ
ダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを変性せしめ、
そして連結された個々のオリゴヌクレオチドが検出可能
なオリゴヌクレオチドプローブを結合対の一方の構成員
を有するオリゴヌクレオチドプローブにつないて連結さ
れたプローブハイブリドを形成せしめ、次にこのハイブ
リドを変性しそして結合対の他方の構成員と接触せしめ
ることにより、前記結合対を含む検出可能な連結された
プローブヌクレオヂド配列を他のヌクレオチド配列から
分離する。従って、１つの末端オリゴヌクレオチド（一
連の他のオリゴヌクレオチドに隣接してハイブリダイズ
する）は例えばそれに付加された検出可能なシグナル発
生成分を有し、他方他の末端オリゴヌクレオチドは結合
対の部分を形成する成分を有しこの成分はオリゴヌクレ
オチドを他のヌクレオチド配列を含有す、る混合物から
溶液中で回収することを可能にするために効果的である
。
隣接してハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、連
結に先立って変性されるオリゴヌクレオチドハイブリド
が存在しない場合に連結されたプローブを介してシグナ
ル発生成分と結合成分とを効果的につなぐために適切な
処理により一緒に連結される０個々のいずれかのオリゴ
ヌクレオチドハイブリドの喪失が次の段階でシグナル発
生成分と結合成分とをつなげることを不可能にする。連
結されたプローブハイブリドを変性し、そして連結され
たプローブ中の１つの末端オリゴヌクレオチドを認識す
る結合対の他方の成分と接触せしめる。
結に先立って変性されるオリゴヌクレオチドハイブリド
が存在しない場合に連結されたプローブを介してシグナ
ル発生成分と結合成分とを効果的につなぐために適切な
処理により一緒に連結される０個々のいずれかのオリゴ
ヌクレオチドハイブリドの喪失が次の段階でシグナル発
生成分と結合成分とをつなげることを不可能にする。連
結されたプローブハイブリドを変性し、そして連結され
たプローブ中の１つの末端オリゴヌクレオチドを認識す
る結合対の他方の成分と接触せしめる。
所望により、連結されたプローブを混合物中の他のオリ
ゴヌクレオチドから分離しそして次に検出可能な成分の
存在について分析する。
ゴヌクレオチドから分離しそして次に検出可能な成分の
存在について分析する。
結合オリゴヌクレオチドとシグナル発生オリゴヌクレオ
チドの連絡は、隣接してハイブリダイズしたオリゴヌク
レオチドの連結後の、ハイブリダイズしたシグナル発生
オリゴヌクレオチドと結合オリゴヌクレオチドとの間の
すべての隣接するオリゴヌクレオチドの存在に依存する
。連絡された結合成分を有する連結されたプローブの分
離を行う結合対はアビジンとビオチン、又は抗原とそれ
に関連する特異的抗体であることができる。この態様は
、他の態様における様な２個のみの隣してハイブリダイ
ズする連結された又はスプリットプローブよりも、標的
ヌクレオチドのより長い範囲の分析を提供する。
チドの連絡は、隣接してハイブリダイズしたオリゴヌク
レオチドの連結後の、ハイブリダイズしたシグナル発生
オリゴヌクレオチドと結合オリゴヌクレオチドとの間の
すべての隣接するオリゴヌクレオチドの存在に依存する
。連絡された結合成分を有する連結されたプローブの分
離を行う結合対はアビジンとビオチン、又は抗原とそれ
に関連する特異的抗体であることができる。この態様は
、他の態様における様な２個のみの隣してハイブリダイ
ズする連結された又はスプリットプローブよりも、標的
ヌクレオチドのより長い範囲の分析を提供する。
この発明の他の態様は、検出可能な第一ヌクレオチドプ
ローブ及び第二ヌクレオチドプローブを標的配列中の可
能性ある変異配列の各側にハイブリダイズせしめ、そし
て次に、好ましくは、正常配列又は予想される変異配列
のいずれかに相補的なヌクレオチドを導入しそして連結
するＤＮＡポリメラーゼの使用によって前記プローブを
連結し、次に得られたハイブリドを検出する。この様な
検出は例えば、得られたハイブリドを選択的変性にかけ
、これによって検出可能な第一ヌクレオチドプローブと
第二ヌクレオチドプローブとの連結が行われていない存
在するハイブリドを変性せしめることにより行うことが
できる。
ローブ及び第二ヌクレオチドプローブを標的配列中の可
能性ある変異配列の各側にハイブリダイズせしめ、そし
て次に、好ましくは、正常配列又は予想される変異配列
のいずれかに相補的なヌクレオチドを導入しそして連結
するＤＮＡポリメラーゼの使用によって前記プローブを
連結し、次に得られたハイブリドを検出する。この様な
検出は例えば、得られたハイブリドを選択的変性にかけ
、これによって検出可能な第一ヌクレオチドプローブと
第二ヌクレオチドプローブとの連結が行われていない存
在するハイブリドを変性せしめることにより行うことが
できる。
使用されるＤＮＡポリメラーゼは例えばＤＮＡポリメラ
ーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片又はウシ胸腺ＤＮＡポリメラ
ーゼαである。連結は好ましくはＤＮＡリガーゼにより
行われる。検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第
二ヌクレオチドプローブは好ましくはそれらが標的配列
にハイブリダイズし、これによって該プローブ間に単一
ヌクレオチドのギャップを残すようなものである。
ーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片又はウシ胸腺ＤＮＡポリメラ
ーゼαである。連結は好ましくはＤＮＡリガーゼにより
行われる。検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第
二ヌクレオチドプローブは好ましくはそれらが標的配列
にハイブリダイズし、これによって該プローブ間に単一
ヌクレオチドのギャップを残すようなものである。
ヌクレオチドプローブがシグナル、又はシグナルを生成
することができる残基を担持すべきことが望ましい場合
、このようなシグナル又は残基はそれ自体既知であり、
例えば放射性ラベルである。
することができる残基を担持すべきことが望ましい場合
、このようなシグナル又は残基はそれ自体既知であり、
例えば放射性ラベルである。
非−ラジオアイソト−プシグナルを生成することができ
る残基は例えばプペーサーによってオリゴヌクレオチド
から通常分間されているシグナル発生部分を含んで成る
。このスペーサー基は所望により、直接共有結合により
、又は蛋白口−リガントもしくは抗原−抗体相互作用、
゛例えばアビジン−ビオチンもしくはジニトロフェニル
−抗ジニトロフェニル抗体相互作用により複合体のシグ
ナル発生部分に連結されることができる。残基のシグナ
ル発生部分はそれ自体シグナルを発生することができる
ものでもよく、又はそれ自体既知の方法に従って適切な
薬剤との相互作用によりシグナルを生成することができ
るものであってもよい。
る残基は例えばプペーサーによってオリゴヌクレオチド
から通常分間されているシグナル発生部分を含んで成る
。このスペーサー基は所望により、直接共有結合により
、又は蛋白口−リガントもしくは抗原−抗体相互作用、
゛例えばアビジン−ビオチンもしくはジニトロフェニル
−抗ジニトロフェニル抗体相互作用により複合体のシグ
ナル発生部分に連結されることができる。残基のシグナ
ル発生部分はそれ自体シグナルを発生することができる
ものでもよく、又はそれ自体既知の方法に従って適切な
薬剤との相互作用によりシグナルを生成することができ
るものであってもよい。
従って、例えば共有結合で付加された残基の好ましいシ
グナル発生部分は酵素的に活性化された色の変化をもた
らす系を込む。好ましい酵素系はアルカリ性ホスファタ
ーゼ、酸性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ル
シフェラーゼ、又はオースラディッシュ・パーオキシダ
ーゼを用いる。
グナル発生部分は酵素的に活性化された色の変化をもた
らす系を込む。好ましい酵素系はアルカリ性ホスファタ
ーゼ、酸性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ル
シフェラーゼ、又はオースラディッシュ・パーオキシダ
ーゼを用いる。
これらの酵素系は、それ自体シグナルを発生することは
できないが、それ自体既知の方法に従って適当な基質の
存在下でシグナルを生成することができる。共有結合し
た残基のシグナル発生部分は、例えば化学発光、蛍光、
又は発色のごとき任意の常用の技法に従って機能するこ
とができる。
できないが、それ自体既知の方法に従って適当な基質の
存在下でシグナルを生成することができる。共有結合し
た残基のシグナル発生部分は、例えば化学発光、蛍光、
又は発色のごとき任意の常用の技法に従って機能するこ
とができる。
使用においては、核酸プローブが微量の十分に相補的な
オリゴヌクレオチド配列を検出することが一般に必要で
ある。この様な場合、プローブ中にシグナルを増幅する
手段を導入することが有利である。増幅は既知の技法に
より、例えばヨーロッパ特許公開２７０３６（セルフ）
、４９６０６（セルフ）、５８５３９ （、セルフ）及
び６０１２３（セルフ）中に記載されている系の１つ又
は複数を用いて行うことができる。
オリゴヌクレオチド配列を検出することが一般に必要で
ある。この様な場合、プローブ中にシグナルを増幅する
手段を導入することが有利である。増幅は既知の技法に
より、例えばヨーロッパ特許公開２７０３６（セルフ）
、４９６０６（セルフ）、５８５３９ （、セルフ）及
び６０１２３（セルフ）中に記載されている系の１つ又
は複数を用いて行うことができる。
この発明の他の特徴に従えば、標的塩其配列の隣接する
セグメントにハイブリダイズした検出可能な第一ヌクレ
オチドプローブ及び第二ヌクレオチドプローブを含んで
成り、該検出可能な第一ヌクレオチドプローブが該第二
ヌクレオチドプローブに連結され得るスプリットブロー
ブハイブリドが提供される。
セグメントにハイブリダイズした検出可能な第一ヌクレ
オチドプローブ及び第二ヌクレオチドプローブを含んで
成り、該検出可能な第一ヌクレオチドプローブが該第二
ヌクレオチドプローブに連結され得るスプリットブロー
ブハイブリドが提供される。
検出可能な第一ヌクレオチドプローブは好ましくは疾患
状態に関連する塩基配列のセグメントに相同であるか又
はこのような変異配列に隣接する標的塩其配列に相同で
あるか又は対応する正常配列に相同である。この様な変
異配列は一般に点変異である。検出可能な第一ヌクレオ
チドプローブの配列が変異配列に隣接する場合、ヌクレ
オチドプローブの配列は、これらが好ましくは可能性あ
る変異配列のいずれかの側の標的塩其配列のセグメント
に相同であるようなものである。
状態に関連する塩基配列のセグメントに相同であるか又
はこのような変異配列に隣接する標的塩其配列に相同で
あるか又は対応する正常配列に相同である。この様な変
異配列は一般に点変異である。検出可能な第一ヌクレオ
チドプローブの配列が変異配列に隣接する場合、ヌクレ
オチドプローブの配列は、これらが好ましくは可能性あ
る変異配列のいずれかの側の標的塩其配列のセグメント
に相同であるようなものである。
非−ヌクレオチド性架橋は例えばジスルフィド結合又は
ビオチン−アビジン結合である。
ビオチン−アビジン結合である。
少なくとも第一ヌクレオチドプローブは検出可能であり
、そしてそれ故シグナル、又はシグナルを生成すること
ができる残基を含有する（上記を参照のこと）。
、そしてそれ故シグナル、又はシグナルを生成すること
ができる残基を含有する（上記を参照のこと）。
本発明の方法を便利に実施することができるようにする
ため、ヌクレオチドプローブをキットに導入することが
一般に有利であり、そしてそれ故このキットは本発明の
他の特徴である。
ため、ヌクレオチドプローブをキットに導入することが
一般に有利であり、そしてそれ故このキットは本発明の
他の特徴である。
この発明の他の特徴に従えば、択一的ヌクレオチド配列
間を識別するためのキットが提供され、このキットは検
出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第二ヌクレオチ
ドプローブを含んで成り、各プローブは標的配列の隣接
するセグメントに対して相同なヌクレオチド配列を有し
、可能性ある変異配列がこれらのセグメントのいずれが
一方又はそれらの間に存在し、このキットはさらにこれ
らのプローブが連結されない場合それらを連結するため
の試薬を含む。
間を識別するためのキットが提供され、このキットは検
出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第二ヌクレオチ
ドプローブを含んで成り、各プローブは標的配列の隣接
するセグメントに対して相同なヌクレオチド配列を有し
、可能性ある変異配列がこれらのセグメントのいずれが
一方又はそれらの間に存在し、このキットはさらにこれ
らのプローブが連結されない場合それらを連結するため
の試薬を含む。
可能性ある変異配列は一般に疾患状態に開運する点変異
であろう。この様な場合、キットは好ましくは疾患状態
と関連する点変異を検出するための、検出可能な第一ヌ
クレオチドプローブ及び第二ヌクレオチドプローブ；並
びに点変異が欠けている対応する正常配列を検出するた
めの、検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第二ヌ
クレオチドプローブを含む。
であろう。この様な場合、キットは好ましくは疾患状態
と関連する点変異を検出するための、検出可能な第一ヌ
クレオチドプローブ及び第二ヌクレオチドプローブ；並
びに点変異が欠けている対応する正常配列を検出するた
めの、検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第二ヌ
クレオチドプローブを含む。
これに関して、幾つかの疾患状態はヒトＤＮＡゲノムの
異る複数の領域に存在する複数の点変異により特徴付け
られる。この様な場合、各関連点変異が存在するか否か
を決定する必要があり、そしてそれ故に複数セットのプ
ローブ（少なくとも、検出可能な第一ヌクレオチドプロ
ーブ及び第二ヌクレオチドプローブ）が使用され、１セ
ツトのプローブがいずれかの点変異の存否を検出する。
異る複数の領域に存在する複数の点変異により特徴付け
られる。この様な場合、各関連点変異が存在するか否か
を決定する必要があり、そしてそれ故に複数セットのプ
ローブ（少なくとも、検出可能な第一ヌクレオチドプロ
ーブ及び第二ヌクレオチドプローブ）が使用され、１セ
ツトのプローブがいずれかの点変異の存否を検出する。
さらに、対応する正常又は変異配列のプローブのセット
をキットに含めるのが好ましい。
をキットに含めるのが好ましい。
キットはまた、ＤＮＡを抽出するための手段及び／又は
固体支持体上にＤＮＡを固定化するための手段を含める
のが有利であろう。
固体支持体上にＤＮＡを固定化するための手段を含める
のが有利であろう。
所望により、検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び
第二ヌクレオチドプローブの少なくとも一方が結合対の
一方の構成員を含有することができ、結合対の他方の構
成員は例えばキットにより与えられる固体支持体上に存
在する。
第二ヌクレオチドプローブの少なくとも一方が結合対の
一方の構成員を含有することができ、結合対の他方の構
成員は例えばキットにより与えられる固体支持体上に存
在する。
キットはまた、適当なＭＷＴ液及び／又は洗浄液を含み
、そしてこの発明に従ってキットを使用するための指示
書を含むであろう。
、そしてこの発明に従ってキットを使用するための指示
書を含むであろう。
次に、この発明を例によりさらに具体的に説明するが、
これによってこの発明の範囲を限定するものではない。
これによってこの発明の範囲を限定するものではない。
これらの例において、特にことわらない限り溶液は水性
溶液であつ、そして％値はｗ／ｖである。
溶液であつ、そして％値はｗ／ｖである。
種々の試薬の組成は次の通りである。
Ｓ Ｓ Ｃ： ０．１５Ｍ ＮａＣ１±０．０５Ｍクエ
ン酸ナトリウム；キナーゼ緩衝液： ０．０６６Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１７，６） 、 １ｍＭスペルミ
ジン、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２．１５ｍＭジチオスレイ
トール及び０．２ｍｇ／ｍＮウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）； １０×コアー・バッファ （ＣＯＲＥ ＢＵＦＦＥＲ
） ： ５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８） 、
１００ｍＭ ＨｇＣｌ２．５００ｍＭＮａＣ１； １０×ニツクトランスレーシヨン緩＠液： ０．５ＭＴ
ｒｉｓ−１１Ｃ１（ｐＨ７，２） 、 ０．ＩＭ Ｍｇ
５Ｏ，、１ｍＭジチオスレイトール、及び５００μｇ／
ｍｌ ＢＳＡ（ペンタックス、画分■）； Ｉ・リドン−Ｘ−１０：ポリオキシエチレンエーテル界
面活性剤； フイコル（Ｆｉｃｏｌｌ） ：透析されそして凍結乾燻
された形の約４００ 、０００の分子量を有するシュー
クロースの非イオン性合成ポリマー；ノニデツ１−Ｐ−
４０：分子当り平均９分子のエチレンオキサイドを含有
するオクチルフェノ−！レエヂレンオキサイド縮合イ勿
；デンハート試薬：０．２ｇ／ｌフィコル（Ｆｉｃｏｌ
）４００．０００，０．２ｇ／ｆポリビニルピロリドン
（ＰＶＰ）及び０．２ｇ／ｌウシアルブミン（ＢＡ）。
ン酸ナトリウム；キナーゼ緩衝液： ０．０６６Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１７，６） 、 １ｍＭスペルミ
ジン、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２．１５ｍＭジチオスレイ
トール及び０．２ｍｇ／ｍＮウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）； １０×コアー・バッファ （ＣＯＲＥ ＢＵＦＦＥＲ
） ： ５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８） 、
１００ｍＭ ＨｇＣｌ２．５００ｍＭＮａＣ１； １０×ニツクトランスレーシヨン緩＠液： ０．５ＭＴ
ｒｉｓ−１１Ｃ１（ｐＨ７，２） 、 ０．ＩＭ Ｍｇ
５Ｏ，、１ｍＭジチオスレイトール、及び５００μｇ／
ｍｌ ＢＳＡ（ペンタックス、画分■）； Ｉ・リドン−Ｘ−１０：ポリオキシエチレンエーテル界
面活性剤； フイコル（Ｆｉｃｏｌｌ） ：透析されそして凍結乾燻
された形の約４００ 、０００の分子量を有するシュー
クロースの非イオン性合成ポリマー；ノニデツ１−Ｐ−
４０：分子当り平均９分子のエチレンオキサイドを含有
するオクチルフェノ−！レエヂレンオキサイド縮合イ勿
；デンハート試薬：０．２ｇ／ｌフィコル（Ｆｉｃｏｌ
）４００．０００，０．２ｇ／ｆポリビニルピロリドン
（ＰＶＰ）及び０．２ｇ／ｌウシアルブミン（ＢＡ）。
Ｐ［ｌＳ（リン酸緩衝化塩溶液） ： ０．０１Ｍリン
酸ナトリウム（ｐＨ７，４）及び０．１３Ｍ ＮａＣｊ
！ ；５ＳＰＥ ： １０ ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
ｉｔ ７ ） 、 ０．１８ＭＮａｃｌ及び１ ｍＭ
ＥＤＴ＾。
酸ナトリウム（ｐＨ７，４）及び０．１３Ｍ ＮａＣｊ
！ ；５ＳＰＥ ： １０ ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
ｉｔ ７ ） 、 ０．１８ＭＮａｃｌ及び１ ｍＭ
ＥＤＴ＾。
次の略号を使用する。
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ｔＲＮＡ ）ランスファー・リボ核酸ＥＤＴＡ
エチレンジアミン四酢酸ＰＢＳ リン酸緩衝
化塩溶液 ＳＤＳ ドデシル硫酸すＩ・リウム２ｘＳＳＣ２
製部度の５ＳＣ ６ＸＳＳＣ６濃度度の５ＳＣ ２０ＸＳＳＣ２０倍濃度の５ＳＣ ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ＢＡ ウシアルブミン ＰＶＰ ポリビニルピロリドン Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン １０×コアーバツフアー １０倍濃度のコアー・バッファー ＡＴＰ アデノシントリホスフェートＮＰ４０
ノニデットＰ、４０ １０Ｘニックトランスレーション［液 １０倍濃度のニックトランスレーシ ョン緩衝液。
エチレンジアミン四酢酸ＰＢＳ リン酸緩衝
化塩溶液 ＳＤＳ ドデシル硫酸すＩ・リウム２ｘＳＳＣ２
製部度の５ＳＣ ６ＸＳＳＣ６濃度度の５ＳＣ ２０ＸＳＳＣ２０倍濃度の５ＳＣ ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ＢＡ ウシアルブミン ＰＶＰ ポリビニルピロリドン Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン １０×コアーバツフアー １０倍濃度のコアー・バッファー ＡＴＰ アデノシントリホスフェートＮＰ４０
ノニデットＰ、４０ １０Ｘニックトランスレーション［液 １０倍濃度のニックトランスレーシ ョン緩衝液。
次のものは商標である。
ミニフォルト（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）
トリトン（ＴｒｉＬｏｎ） −Ｘ−１００コアー・バッ
ファー（ＣＯＲＥ １３ＵＦＦＥＲ）フィコール（Ｆｉ
ｃｏｌｌ）。
ファー（ＣＯＲＥ １３ＵＦＦＥＲ）フィコール（Ｆｉ
ｃｏｌｌ）。
斜ユユ
オリゴヌクレオチドハイブリグイゼーション分析のため
に使用したプラスミドはｐＩＦｓｌｌｏｌ （Ｅｄｇｅ
等、Ｎｕｃｌｅｉｒ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
Ｖｏｌ １１（１９８３）、６４１９〜６４３５頁）、
及びこの明細書においてρにつと称するその誘導体であ
りこのプラスミドにおいてはアラニンをコードするコド
ンＧＣＴがアミノ酸位置２８に、）ＩｕｌＦＮ−α２中
のセリンをコードするコドンＴＣＣの代りに存在する。
に使用したプラスミドはｐＩＦｓｌｌｏｌ （Ｅｄｇｅ
等、Ｎｕｃｌｅｉｒ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
Ｖｏｌ １１（１９８３）、６４１９〜６４３５頁）、
及びこの明細書においてρにつと称するその誘導体であ
りこのプラスミドにおいてはアラニンをコードするコド
ンＧＣＴがアミノ酸位置２８に、）ＩｕｌＦＮ−α２中
のセリンをコードするコドンＴＣＣの代りに存在する。
Ｉ Ｊｌｇ 、 １１００ｎ 、及びＬｏｎｇのアリ
コートを１５３μｌの水中に稀釈した。
コートを１５３μｌの水中に稀釈した。
これらに３０μ！の２Ｍ ＮａＯＨ、１７ｕＮのＩ Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ１’（ｐＨ１７，４）及び１００μｌ
の２０ＸＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣ１、０，
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）を添加した。サンプルを
１００℃に１０分間加熱し、次に氷上に置き、そして７
０ｕｌのＩ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｉ１１ｊ！（ｐＨ７）を加
えた。プラスミドＤＮＡの稀釈物をシュライケル・アン
ド・シュネル・ミニフォルト■装置を使用して製造者の
指示に従ってＢＡ８５ニトロセルロース（シュライケル
・アンド・シュネル・キーン、Ｎ、ｌ＋、、米国）上で
？過した。キトロセルローフ紙をミニフォルト装置に合
うように切断し、そして２ＸＳＳＣ上に浮べることによ
って湿した後に装置に装着する。次に、ＤＮＡサンプル
をウェルに適用し、そして０．５ｍ１１分の速度で濾過
した。ｐＩＦｓｌｌｏｌ中の合成インターフェロンα２
遺伝子の配列に対応するオリゴヌクレオチド１１及び１
３ （Ｅｄｇｅ等、前記参照のこと）をハイブリダイゼ
ーションのために使用した。オリゴヌクレオチド１１及
び１３は次のＤＮＡ配列を有する。
Ｔｒｉｓ−ＨＣ１’（ｐＨ１７，４）及び１００μｌ
の２０ＸＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣ１、０，
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）を添加した。サンプルを
１００℃に１０分間加熱し、次に氷上に置き、そして７
０ｕｌのＩ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｉ１１ｊ！（ｐＨ７）を加
えた。プラスミドＤＮＡの稀釈物をシュライケル・アン
ド・シュネル・ミニフォルト■装置を使用して製造者の
指示に従ってＢＡ８５ニトロセルロース（シュライケル
・アンド・シュネル・キーン、Ｎ、ｌ＋、、米国）上で
？過した。キトロセルローフ紙をミニフォルト装置に合
うように切断し、そして２ＸＳＳＣ上に浮べることによ
って湿した後に装置に装着する。次に、ＤＮＡサンプル
をウェルに適用し、そして０．５ｍ１１分の速度で濾過
した。ｐＩＦｓｌｌｏｌ中の合成インターフェロンα２
遺伝子の配列に対応するオリゴヌクレオチド１１及び１
３ （Ｅｄｇｅ等、前記参照のこと）をハイブリダイゼ
ーションのために使用した。オリゴヌクレオチド１１及
び１３は次のＤＮＡ配列を有する。
オリゴヌクレオチド１１
５’ ＣＣＴ八ＴへＴＣＣＣＴＣＴＴＣ３’オリゴヌ
クレオチド１３ ５’ ＴＣＣＴＧＴＣＴＧ＾八ΔＧＡＣ３’へリゴヌ
クレオチド１３を次の様にして３２Ｐでラベルした。
１８．５μ！の水中４００ｎｇのオリゴヌクレオチドに
２０μｒの３２ｐ−γ−ＡＴＰ（アデノシン５’ −（
”Ｐ）ｌ−リホスフェート、水溶液中トリエチルアンモ
ニウム塩、約３０００Ｃｉ／ｎ ｍｏｌ 、 １０μＣ
ｉ／μｌ、アメルシャムインターナショナル）、４．５
μｌの１０×キナーゼ緩衝液〔１０×緩衝液＝０．６６
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６） 、 １０ｍＭス
ペルミジン、０．１Ｍ ＨｇＣｌ２．１５０ｍＭジチオ
スレイトール及び２ｍｇ／ｍ１のウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ、ニュクレイック・アシド・エンザイム・グレー
ド、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）〕、及び２
μｌのＴ４ボリヌクレオチドキサーゼ（５ユニツト／μ
！、ベーリンガーマンハイム）を加えた。３７℃にて１
時間置いた後、サンプルの半分をバイオゲル（［ｌｉｏ
ｇｅｌ）Ｐ ２の４ｍＭのカラム〔ビオラド、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−１１Ｃｊ！ （ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴ＾
によりあらかじめ平衡化したもの〕に適用した。′２Ｐ
−ラベルされたヌクレオチドは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
１１１Ｊ（ｐＨ８） 。
クレオチド１３ ５’ ＴＣＣＴＧＴＣＴＧ＾八ΔＧＡＣ３’へリゴヌ
クレオチド１３を次の様にして３２Ｐでラベルした。
１８．５μ！の水中４００ｎｇのオリゴヌクレオチドに
２０μｒの３２ｐ−γ−ＡＴＰ（アデノシン５’ −（
”Ｐ）ｌ−リホスフェート、水溶液中トリエチルアンモ
ニウム塩、約３０００Ｃｉ／ｎ ｍｏｌ 、 １０μＣ
ｉ／μｌ、アメルシャムインターナショナル）、４．５
μｌの１０×キナーゼ緩衝液〔１０×緩衝液＝０．６６
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６） 、 １０ｍＭス
ペルミジン、０．１Ｍ ＨｇＣｌ２．１５０ｍＭジチオ
スレイトール及び２ｍｇ／ｍ１のウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ、ニュクレイック・アシド・エンザイム・グレー
ド、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）〕、及び２
μｌのＴ４ボリヌクレオチドキサーゼ（５ユニツト／μ
！、ベーリンガーマンハイム）を加えた。３７℃にて１
時間置いた後、サンプルの半分をバイオゲル（［ｌｉｏ
ｇｅｌ）Ｐ ２の４ｍＭのカラム〔ビオラド、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−１１Ｃｊ！ （ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴ＾
によりあらかじめ平衡化したもの〕に適用した。′２Ｐ
−ラベルされたヌクレオチドは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
１１１Ｊ（ｐＨ８） 。
１ｍＭＥＤＴΔを含有する溶出ＨＦｒ液のボイドボリウ
ム中に溶出された。１００ｎＨの３２ｐ−ラベル化オリ
ゴヌクレオチドプローブを１１００ｎの未ラベル化オリ
ゴヌクレオチドプローブ１１と共にハイブリダイゼーシ
ョンのために使用した。ｐ（ＦＳＩＩＱｌ又はｐＫ９
ＤＮＡがその上に固定化されたニトロセルロースフィ
ルターを６８℃にて２時間、５Ｘデンハート試薬（Ａｇ
／ｆｌのライコル、１ｇ／ｌのポリビニルピロリドン、
１ｇ／ｌのＢＡ（ウシ血清、フラクションＶ、マイルス
ラボラトリース）、５×ＳＳＣ，５０ｍＭリン酸すｌ・
リウム（ｐＨ７＞、１％のグリセリン、０．１％のドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）及び１００μｇの音波処
理変性したニシン精子ＤＮＡ（シグマ）〕中で前ハイブ
リダイズせしめた。２ｍｌの５ＸＳＳＣ，０，５％ＮＰ
４０（ＢＤＨ）及び２５０１ｔ ｇ／ ｍｌ ＬＲＮ
Ａ （シグマ、タイプＸ−Ｓ＞中で、１００ｎＨの一緒
に添加されたオリゴヌクレオチド１１及び１３、又は開
封として１００ｎＨの単独で添加されたオリゴヌクレオ
チド１３を用いてハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーションは室温にて一夜行った。次にフィ
ルターを６ｘＳＳＣ，０，０６％ピロリン酸ナトリウム
及び２０ｍＭリン酸すＩ・リウム緩街液（ｐ［１７）中
で室温にて５分間洗浄し、そして洗浄ｔａｔｒ液を収り
替えた後、室温にてさらに３分間洗浄した。次に、フィ
ルターを２％ＢＡ及び０．１％トリトン−Ｘ−１００（
Ｂ Ｄ Ｈ）を含有するリン酸緩衝化塩溶液ＣＰＢＳ：
０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４） 。
ム中に溶出された。１００ｎＨの３２ｐ−ラベル化オリ
ゴヌクレオチドプローブを１１００ｎの未ラベル化オリ
ゴヌクレオチドプローブ１１と共にハイブリダイゼーシ
ョンのために使用した。ｐ（ＦＳＩＩＱｌ又はｐＫ９
ＤＮＡがその上に固定化されたニトロセルロースフィ
ルターを６８℃にて２時間、５Ｘデンハート試薬（Ａｇ
／ｆｌのライコル、１ｇ／ｌのポリビニルピロリドン、
１ｇ／ｌのＢＡ（ウシ血清、フラクションＶ、マイルス
ラボラトリース）、５×ＳＳＣ，５０ｍＭリン酸すｌ・
リウム（ｐＨ７＞、１％のグリセリン、０．１％のドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）及び１００μｇの音波処
理変性したニシン精子ＤＮＡ（シグマ）〕中で前ハイブ
リダイズせしめた。２ｍｌの５ＸＳＳＣ，０，５％ＮＰ
４０（ＢＤＨ）及び２５０１ｔ ｇ／ ｍｌ ＬＲＮ
Ａ （シグマ、タイプＸ−Ｓ＞中で、１００ｎＨの一緒
に添加されたオリゴヌクレオチド１１及び１３、又は開
封として１００ｎＨの単独で添加されたオリゴヌクレオ
チド１３を用いてハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーションは室温にて一夜行った。次にフィ
ルターを６ｘＳＳＣ，０，０６％ピロリン酸ナトリウム
及び２０ｍＭリン酸すＩ・リウム緩街液（ｐ［１７）中
で室温にて５分間洗浄し、そして洗浄ｔａｔｒ液を収り
替えた後、室温にてさらに３分間洗浄した。次に、フィ
ルターを２％ＢＡ及び０．１％トリトン−Ｘ−１００（
Ｂ Ｄ Ｈ）を含有するリン酸緩衝化塩溶液ＣＰＢＳ：
０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４） 。
０．１３Ｍ Ｎａ（Ｊ！〕で１６°Ｃにて３０分間処理
した。次にフィルターをＰＢＳ及び°２％ＢＡにより５
回すすいでトリトン−ｘ −ｉｏｏを除去した。ハイブ
リダイズされたプローブの架橋のなめ、フィルターを６
６ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃｉ’（ｐＨ７，６） 、 ５
ｍＭ ＭｇＣＬ 、 ５ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ ＡＴＰ 、 ５００μｇ／ ＋ｎＩＢＳＡ及び０
．３Ｕ／μＩ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー、５
１１／μｌ）で処理した。インキュベーションは１６℃
にて８０分間後っな。次にフィルターを６０℃にて２０
分間６ｘＳＳＣ，０，０６％ピロリン酸ナトリウム及び
２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中で洗浄した。次
に、フィルターをサランラップにくるみ、そしてオート
ラジオグラフィー用フィルムに２日ｍ暴露しな、第１図
は、６０℃での最終洗浄の後検知できるオートラジオブ
ラフイーシグナルが、ハイブリダイズしたオリゴヌクレ
オチド１１及び１３がリガーゼにより連結された場合の
プラスミドｐＩＦｓ１１０’ｌ（ｆ ）についてのみ観
察された。固定化されたｐＫ ９ （Ｉぐ）に対するバ
ックグラウンドシグナルが、ハイブリダイゼーション及
びオリゴヌクレオチド１１及び１３の連結の後に観察さ
れた。２のバックグラウンドシグナルはｐｌＦｓｌｌｏ
ｌについて得られた対応するシグナルの約１％を示し、
そしてプラスミドＪ）Ｋ９の対応する領域とのハイブリ
ドミスマツチのためオリゴヌクレオチド１３の最少のハ
イブリダイゼーションから生じた。従って、この例によ
り、隣接するハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプ
ローブがニトロセルロースフィルター上での連結により
効果的に架橋されたことが示された。さらに、記載され
た実験条件において、オートラジオグラフィーシグナル
の強度の喪失を伴わないで連結時間を５分間に短縮する
ことができた。
した。次にフィルターをＰＢＳ及び°２％ＢＡにより５
回すすいでトリトン−ｘ −ｉｏｏを除去した。ハイブ
リダイズされたプローブの架橋のなめ、フィルターを６
６ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃｉ’（ｐＨ７，６） 、 ５
ｍＭ ＭｇＣＬ 、 ５ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ ＡＴＰ 、 ５００μｇ／ ＋ｎＩＢＳＡ及び０
．３Ｕ／μＩ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー、５
１１／μｌ）で処理した。インキュベーションは１６℃
にて８０分間後っな。次にフィルターを６０℃にて２０
分間６ｘＳＳＣ，０，０６％ピロリン酸ナトリウム及び
２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中で洗浄した。次
に、フィルターをサランラップにくるみ、そしてオート
ラジオグラフィー用フィルムに２日ｍ暴露しな、第１図
は、６０℃での最終洗浄の後検知できるオートラジオブ
ラフイーシグナルが、ハイブリダイズしたオリゴヌクレ
オチド１１及び１３がリガーゼにより連結された場合の
プラスミドｐＩＦｓ１１０’ｌ（ｆ ）についてのみ観
察された。固定化されたｐＫ ９ （Ｉぐ）に対するバ
ックグラウンドシグナルが、ハイブリダイゼーション及
びオリゴヌクレオチド１１及び１３の連結の後に観察さ
れた。２のバックグラウンドシグナルはｐｌＦｓｌｌｏ
ｌについて得られた対応するシグナルの約１％を示し、
そしてプラスミドＪ）Ｋ９の対応する領域とのハイブリ
ドミスマツチのためオリゴヌクレオチド１３の最少のハ
イブリダイゼーションから生じた。従って、この例によ
り、隣接するハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプ
ローブがニトロセルロースフィルター上での連結により
効果的に架橋されたことが示された。さらに、記載され
た実験条件において、オートラジオグラフィーシグナル
の強度の喪失を伴わないで連結時間を５分間に短縮する
ことができた。
倒４−
Ｂｌｉｎ及び５ｔａｒｒｏｒｄ （Ｎｕｃｌｅｉｃ 八
ｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
ｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
Ｖｏｌ、３（１９７６） ２３０３頁〕の方法を用いて
リンパ芽球系Ｄａｕｃｌ ｉから高分子量ＤＮＡを単離
した。２００μｇのＤａｕｄｉ Ｄ Ｎ Ａを３２０μ
ｐの水に稀釈し、そしてこれに４０μｌの１０×コアー
・バッファー（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）
及び４０μ１ＥｃｏＲＩ （５０ユニツ）４μｌ、ノー
サンプリア・バイオロジカルレス、クラムリントン、ナ
ーサンベルランド、ＵＫ）を添加した。３７℃にて３時
間のインキュベーションの後、溶液を同容量のフェノー
ル／クロロホルム（１： １）により抽出し、次に１容
量のクロロホルム、及び最後に１容量の水飽和エーテル
により３回抽出した。ＤＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウム
に調整−シ、そして２容量の氷冷工、 タノールによ
り沈澱せしめた。ＤＮＡペレットを冷７０％エタノール
中で洗浄し、そしてペレットを乾燥しそして１００μｌ
の水中に再溶解した。
リンパ芽球系Ｄａｕｃｌ ｉから高分子量ＤＮＡを単離
した。２００μｇのＤａｕｄｉ Ｄ Ｎ Ａを３２０μ
ｐの水に稀釈し、そしてこれに４０μｌの１０×コアー
・バッファー（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）
及び４０μ１ＥｃｏＲＩ （５０ユニツ）４μｌ、ノー
サンプリア・バイオロジカルレス、クラムリントン、ナ
ーサンベルランド、ＵＫ）を添加した。３７℃にて３時
間のインキュベーションの後、溶液を同容量のフェノー
ル／クロロホルム（１： １）により抽出し、次に１容
量のクロロホルム、及び最後に１容量の水飽和エーテル
により３回抽出した。ＤＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウム
に調整−シ、そして２容量の氷冷工、 タノールによ
り沈澱せしめた。ＤＮＡペレットを冷７０％エタノール
中で洗浄し、そしてペレットを乾燥しそして１００μｌ
の水中に再溶解した。
３μｇのプラスミドｐｌＦｓ１１０１及びｐＫ９（例１
を参照のこと）を１７μ！の水に溶解し、そしてこれに
２μ！のコアー・バッファー及び１μｌのＥｃｏＲｒ（
前記参照のこと）を添加した。この混合物を３７℃にて
３時間インキュベートし、そして次にＤａｕｄ １ＤＮ
Ａについて前記したようにして溶剤抽出し、そしてエタ
ノール沈澱を行った。乾燥したペレットを１０μｐの水
に再溶解した。
を参照のこと）を１７μ！の水に溶解し、そしてこれに
２μ！のコアー・バッファー及び１μｌのＥｃｏＲｒ（
前記参照のこと）を添加した。この混合物を３７℃にて
３時間インキュベートし、そして次にＤａｕｄ １ＤＮ
Ａについて前記したようにして溶剤抽出し、そしてエタ
ノール沈澱を行った。乾燥したペレットを１０μｐの水
に再溶解した。
１０ ｕ ｇｃｌ）ＥｃｏＲｒ消化したＤａｕｄｉ Ｄ
Ｎ Ａ ｔ！：ｐＩＦｓｌｌｏｌ又はｐＫ９のいずれ
がのＩＢのアリコートと混合し、そしてＭａｎｉａｔｉ
ｓ等（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉＢ、＾。
Ｎ Ａ ｔ！：ｐＩＦｓｌｌｏｌ又はｐＫ９のいずれ
がのＩＢのアリコートと混合し、そしてＭａｎｉａｔｉ
ｓ等（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉＢ、＾。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ： Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−ｒａ Ｌｏｒ
ｙ 、 １９８２）に記載されているようにして０．５
％水平アガロースゲル上でのゲル電気泳動にかけた。
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−ｒａ Ｌｏｒ
ｙ 、 １９８２）に記載されているようにして０．５
％水平アガロースゲル上でのゲル電気泳動にかけた。
電気泳動の後、ＤＮＡをサチン移行法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ等）によりニトロセルロースフィルター上に移行せし
め次にハイブリダイゼーションを行い、又は５ｔｕｄｅ
ｎｃｋｉ及びＷａｌｌａｃｅ（Ｄ Ｎ Ａ 、Ｖｏｌ
３，７〜１５頁（１９８４）により記載されている様に
して調製された乾燥したアガロースゲル内でＤＮＡを直
接プローブした。ニトロセルロースフィルター上に移行
せしめたＤＮＡについて、ハイブリダイゼーションを例
１に記載したようにして行ったが、但し、ハイブリダイ
ゼーション温度を３２°Ｃとし、そしてプローブとして
１１００ｎのオリゴヌクレオチド１１、及び１１００ｎ
の３２ｐ−ラベル化オリゴヌクレオチド１３を使用した
。フィルターを室温にて３０分間、５ｘｓｓｃ、０．０
６％ピロリン酸ナトリウム及び２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム（ｐｔｌ ７ ）中でそして次に４０°Ｃにて１５分
間洗浄してｐＫ９プラスミドＤＮＡに会合した３２ｐ−
ラベル化オリゴヌクレオチドのほとんどを除去した。次
にフィルターを、−７０℃にて強化スクリーンを使用し
てコグツクＸ−０へｎライ八Ｒフィルムに暴露した。こ
の４０°Ｃでの洗浄の後、［１ａｕｄｉ ａｌ胞ＤＮＡ
へのハイブリダイゼーションに由来するバックグラウン
ドシグナルは第２図に示すようになお明らかであった。
ｓ等）によりニトロセルロースフィルター上に移行せし
め次にハイブリダイゼーションを行い、又は５ｔｕｄｅ
ｎｃｋｉ及びＷａｌｌａｃｅ（Ｄ Ｎ Ａ 、Ｖｏｌ
３，７〜１５頁（１９８４）により記載されている様に
して調製された乾燥したアガロースゲル内でＤＮＡを直
接プローブした。ニトロセルロースフィルター上に移行
せしめたＤＮＡについて、ハイブリダイゼーションを例
１に記載したようにして行ったが、但し、ハイブリダイ
ゼーション温度を３２°Ｃとし、そしてプローブとして
１１００ｎのオリゴヌクレオチド１１、及び１１００ｎ
の３２ｐ−ラベル化オリゴヌクレオチド１３を使用した
。フィルターを室温にて３０分間、５ｘｓｓｃ、０．０
６％ピロリン酸ナトリウム及び２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム（ｐｔｌ ７ ）中でそして次に４０°Ｃにて１５分
間洗浄してｐＫ９プラスミドＤＮＡに会合した３２ｐ−
ラベル化オリゴヌクレオチドのほとんどを除去した。次
にフィルターを、−７０℃にて強化スクリーンを使用し
てコグツクＸ−０へｎライ八Ｒフィルムに暴露した。こ
の４０°Ｃでの洗浄の後、［１ａｕｄｉ ａｌ胞ＤＮＡ
へのハイブリダイゼーションに由来するバックグラウン
ドシグナルは第２図に示すようになお明らかであった。
乾燥したアガロースゲルを、１１００ｎのオリゴヌクレ
オチド１１及び１００ｎＨの３２ｐラベル化オリゴヌク
レオチド１３と、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）
、 ０．９Ｍ ＮａＣ１’ 、らｍＭ ＥＤＴ＾、０
．３％ ＳＤＳ及び１０Ｍｇ／ｖａｌのＥ、コリＤＮＡ
中で３２°Ｃにて一夜、直接にハイブリダイズせしめた
。乾燥し−たゲルを、２ ｘ ５ＳＰＥ （５ＳＰＥは
１０ｍＭリン酸すトリウム（ｐＨ７） 、 ０．１８Ｍ
ＮａＣ１’ 、 １ ｎＭ ＥＤＴ＾〕及び０．１％
ＳＤＳ中で室温にて３０分間そして次に同じ洗浄緩衝液
中で４０℃にて１５分間次々と洗浄した。
オチド１１及び１００ｎＨの３２ｐラベル化オリゴヌク
レオチド１３と、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）
、 ０．９Ｍ ＮａＣ１’ 、らｍＭ ＥＤＴ＾、０
．３％ ＳＤＳ及び１０Ｍｇ／ｖａｌのＥ、コリＤＮＡ
中で３２°Ｃにて一夜、直接にハイブリダイズせしめた
。乾燥し−たゲルを、２ ｘ ５ＳＰＥ （５ＳＰＥは
１０ｍＭリン酸すトリウム（ｐＨ７） 、 ０．１８Ｍ
ＮａＣ１’ 、 １ ｎＭ ＥＤＴ＾〕及び０．１％
ＳＤＳ中で室温にて３０分間そして次に同じ洗浄緩衝液
中で４０℃にて１５分間次々と洗浄した。
結果はニトロセルロースフィルター上で観察されたもの
（第２図）と同様であった。 ＤａｕｃｌｉＭ胞ＤＮＡ
へのハイブリダイゼーションに基くバックグラウンドを
除去するため、ニトロセルロース又は乾燥したゲル中に
固定化されたＤＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレ
オチド１１及び１３を例１に記載したようにしてリガー
ゼ処理により架橋し、そして最後に６０°Ｃにて１５分
間前記のようにして洗浄した。これはｌｏｇの１ラスミ
ドｐｌＦｓ１１０１に対応する１社−バンドをもたらし
、バックグラウンドはほとんどなく、そしてｐＫ９に対
応するシグナルを存在しなかった。ニトロセルロースに
固定化されたＤＮＡについて第３図に示す。
（第２図）と同様であった。 ＤａｕｃｌｉＭ胞ＤＮＡ
へのハイブリダイゼーションに基くバックグラウンドを
除去するため、ニトロセルロース又は乾燥したゲル中に
固定化されたＤＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレ
オチド１１及び１３を例１に記載したようにしてリガー
ゼ処理により架橋し、そして最後に６０°Ｃにて１５分
間前記のようにして洗浄した。これはｌｏｇの１ラスミ
ドｐｌＦｓ１１０１に対応する１社−バンドをもたらし
、バックグラウンドはほとんどなく、そしてｐＫ９に対
応するシグナルを存在しなかった。ニトロセルロースに
固定化されたＤＮＡについて第３図に示す。
医」−
分析に使用するプラスミドＤＮＡはｐｌＦｓｌｌＱｌ（
Ｅｄｇｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｒ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ、Ｖｏｌ １１（１９８３）ｐ６４１９〜６４３
５）であった。２μｇのｐｌＦｓ１１０１プラスミドＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩ（２０ユニツト、ベセスダ・リサーチ
・ラボラドリース）により２０μｌの反応容量中で２時
間、酵素の供給者により推奨された条件下で消化した０
反応混合物をフェノール／クロロホルム（１：１＞で１
回及びクロロホルムで１回抽出し、次に２μｍ３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５，２）及び４５μ！のエタノールを
加えた。ＤＮＡを一２０℃にて一夜沈澱せしめ、７０％
エタノール中で洗浄し、そして乾燥した後３０μｌの水
中に再懸濁した。
Ｅｄｇｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｒ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ、Ｖｏｌ １１（１９８３）ｐ６４１９〜６４３
５）であった。２μｇのｐｌＦｓ１１０１プラスミドＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩ（２０ユニツト、ベセスダ・リサーチ
・ラボラドリース）により２０μｌの反応容量中で２時
間、酵素の供給者により推奨された条件下で消化した０
反応混合物をフェノール／クロロホルム（１：１＞で１
回及びクロロホルムで１回抽出し、次に２μｍ３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５，２）及び４５μ！のエタノールを
加えた。ＤＮＡを一２０℃にて一夜沈澱せしめ、７０％
エタノール中で洗浄し、そして乾燥した後３０μｌの水
中に再懸濁した。
分析のために使用したオリゴヌクレオチドを１１（−１
＞及び１３と称し、ここでオリゴヌクレオチド１３はｐ
ＩＦＳＩＩＯＩ中の合成インターフェロンα２遺伝にお
いて造成するために使用され、そしてオリゴヌクレオチ
ド１１（−１）は遺伝子造成のために使用されたオリゴ
ヌクレオチド１１の誘導体であって、配列が５′に１塩
だけシフトしている。
＞及び１３と称し、ここでオリゴヌクレオチド１３はｐ
ＩＦＳＩＩＯＩ中の合成インターフェロンα２遺伝にお
いて造成するために使用され、そしてオリゴヌクレオチ
ド１１（−１）は遺伝子造成のために使用されたオリゴ
ヌクレオチド１１の誘導体であって、配列が５′に１塩
だけシフトしている。
すなわち、オリゴヌクレオチドは次の配列を有する。
オリゴヌクレオチド１１（−１）
５’ ＣＣＧＴＡＴＣＴＣＣＣＴＧＴＴ３′オリゴヌ
クレオチド１３ ５’ ＴＣＣＴＧＴＣＴＧＡ＾＾ＧＡＣ３′Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｎｉ−ａｔｉｓ、Ｆｒ１ｔ
ｓｃｈ及びＪａｎｂｒｏｏｋｌ、コールド・スプリング
・ハーバ−）において合成リンカ−について記載されて
いるようにして、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、
オリゴヌクレオチド１３をｆｆ２ｐにより５′末端ラベ
ルした。キナーゼ反応を、７３°Ｃにて１０分間加熱し
次に２回フェノール抽出することにより停止した。次に
溶液なエーテルで抽出し、そして過剰のエーテルを吹き
とばした。
クレオチド１３ ５’ ＴＣＣＴＧＴＣＴＧＡ＾＾ＧＡＣ３′Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｎｉ−ａｔｉｓ、Ｆｒ１ｔ
ｓｃｈ及びＪａｎｂｒｏｏｋｌ、コールド・スプリング
・ハーバ−）において合成リンカ−について記載されて
いるようにして、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、
オリゴヌクレオチド１３をｆｆ２ｐにより５′末端ラベ
ルした。キナーゼ反応を、７３°Ｃにて１０分間加熱し
次に２回フェノール抽出することにより停止した。次に
溶液なエーテルで抽出し、そして過剰のエーテルを吹き
とばした。
ＥｃｏＲＩで消化されたｐＩＦｓｌｌｏｌ ＤＮＡの４
μｌのアリコートを、１ＱｘＳＳＣ１１％ＮＰ４０及び
０、５ Ａｔ ｇ／ ｍｌ ＬＲＮ Ａの溶液の５０ｕ
ｌのアリコートに加えた。１ ｐｍｏｌｅアリコートの
′ｊ２ｐラベル化オリゴヌクレオチド１３を１ ｐｍｏ
ｌｅのオリゴヌクレオチド１１（−１）と共に又はこれ
を伴わないで添加し、そして溶液を水により１００μｌ
に稀釈した。
μｌのアリコートを、１ＱｘＳＳＣ１１％ＮＰ４０及び
０、５ Ａｔ ｇ／ ｍｌ ＬＲＮ Ａの溶液の５０ｕ
ｌのアリコートに加えた。１ ｐｍｏｌｅアリコートの
′ｊ２ｐラベル化オリゴヌクレオチド１３を１ ｐｍｏ
ｌｅのオリゴヌクレオチド１１（−１）と共に又はこれ
を伴わないで添加し、そして溶液を水により１００μｌ
に稀釈した。
この溶液を５分間１００’Ｃに加熱し、そして次に３９
℃にて２時間水浴中に置いてオリゴヌクレオチドを標的
ｐｌＦｓ１１０Ｌ ＤＮＡにハイブリダイズせしめた。
℃にて２時間水浴中に置いてオリゴヌクレオチドを標的
ｐｌＦｓ１１０Ｌ ＤＮＡにハイブリダイズせしめた。
ＤＮＡサンプルを１０μ！の水中に溶解し、これに１μ
！の２ｏＭｄＣＴＰ又は２ｏＭｄＣＴＰ（ＰＬバイオチ
ミカルス）を加えた。次に、２．５７ｘｎの１０×ニツ
クトランスレ一シヨン緩衝液ＣＭｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎ
ｕａｌ、上記、を参照のこと；ＩＯＸ緩ｆｉｒ液は０．
５ Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ｃｊ！（ｐＨ７，２） 、 ０
．１ Ｍ Ｍｇ５ｏ、 、 １ｍＭジチオスレイトール
及び５００μｇ／ｍ１ＢｓＡ（ペンタックス、フラクシ
ョンＶ）を含んで成る〕を添加し、そしてこの溶液を水
により２５μｌに稀釈した。ＤＮＡポリメラーゼ■のＫ
ｌｅｎｏｗ断片Ｉ（ベーリンガー）２ユニツトを加え、
そして溶液を室温にて３０分間インキュベートした。１
．５μｌの１０×ニツクトランスレーシヨン緩衝液を４
μりの１０ｍＭＡＴＰ及び７．５μｌの水と共に加えた
。２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ・リサー
チ・ラボラドリース）を加え、そして溶液を１４°Ｃに
て４時間インキュベートした。
！の２ｏＭｄＣＴＰ又は２ｏＭｄＣＴＰ（ＰＬバイオチ
ミカルス）を加えた。次に、２．５７ｘｎの１０×ニツ
クトランスレ一シヨン緩衝液ＣＭｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎ
ｕａｌ、上記、を参照のこと；ＩＯＸ緩ｆｉｒ液は０．
５ Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ｃｊ！（ｐＨ７，２） 、 ０
．１ Ｍ Ｍｇ５ｏ、 、 １ｍＭジチオスレイトール
及び５００μｇ／ｍ１ＢｓＡ（ペンタックス、フラクシ
ョンＶ）を含んで成る〕を添加し、そしてこの溶液を水
により２５μｌに稀釈した。ＤＮＡポリメラーゼ■のＫ
ｌｅｎｏｗ断片Ｉ（ベーリンガー）２ユニツトを加え、
そして溶液を室温にて３０分間インキュベートした。１
．５μｌの１０×ニツクトランスレーシヨン緩衝液を４
μりの１０ｍＭＡＴＰ及び７．５μｌの水と共に加えた
。２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ・リサー
チ・ラボラドリース）を加え、そして溶液を１４°Ｃに
て４時間インキュベートした。
２μｌの反応混合物を８％のネイティブ・ポリアクリル
アミドゲル上で分析した。負荷するに先立ち、サンプル
を１００℃にて５分間加熱し、そして氷上で急速に冷却
したｔ＆ １μ！のゲル負荷緩衝液（０，２５％ブロモ
フェノールブルー、０．２５％キシレンシアツール及び
１５％フィコール・タイプ４００）を加えた。第４図は
このゲル分析の結果を示す。３２塩基対オリゴヌクレオ
チドマーカーバンドに対応するオー１−ラジオグラフシ
グナルがレーン１においてのみ観察された。このレーン
においては、リガーゼ処理に先立つポリメラーゼ反応に
−ｄＣＴＰを含めた。リガーゼ処理を伴う（レーン
３）又はリガーゼ処理を伴わない（レーン４）ポリメラ
ーゼ段階に、：ＩＣＴＰに代ってｄＧＴＰをめな場合、
３２塩基の位置にオートラジオグラフィーシグナルが得
られなかった。
アミドゲル上で分析した。負荷するに先立ち、サンプル
を１００℃にて５分間加熱し、そして氷上で急速に冷却
したｔ＆ １μ！のゲル負荷緩衝液（０，２５％ブロモ
フェノールブルー、０．２５％キシレンシアツール及び
１５％フィコール・タイプ４００）を加えた。第４図は
このゲル分析の結果を示す。３２塩基対オリゴヌクレオ
チドマーカーバンドに対応するオー１−ラジオグラフシ
グナルがレーン１においてのみ観察された。このレーン
においては、リガーゼ処理に先立つポリメラーゼ反応に
−ｄＣＴＰを含めた。リガーゼ処理を伴う（レーン
３）又はリガーゼ処理を伴わない（レーン４）ポリメラ
ーゼ段階に、：ＩＣＴＰに代ってｄＧＴＰをめな場合、
３２塩基の位置にオートラジオグラフィーシグナルが得
られなかった。
これらの結果が示すところによれば、オリゴヌクレオチ
ド１１（−１）及び１３に由来する３２塩基長の連結生
成物の生成には、個別にハイブリダイズしたオリゴヌク
レオチド間のＧ残基に対する一塩基ギャップを満たすた
めに正しいデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄ
ＣＴＰ）を含めることが必要である。正しくないヌクレ
オチド（例えばｄＧＴＰ）を含めること、又は推論とし
て、他の残基によるギャップ中のＧ残基の置き換えは３
２塩基長の連結生成物の形成を妨害する。従ってこれは
、標的ＤＮＡ配列中の特定のヌクレオチドの存在又は不
存在についての診断試験を提供する。
ド１１（−１）及び１３に由来する３２塩基長の連結生
成物の生成には、個別にハイブリダイズしたオリゴヌク
レオチド間のＧ残基に対する一塩基ギャップを満たすた
めに正しいデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄ
ＣＴＰ）を含めることが必要である。正しくないヌクレ
オチド（例えばｄＧＴＰ）を含めること、又は推論とし
て、他の残基によるギャップ中のＧ残基の置き換えは３
２塩基長の連結生成物の形成を妨害する。従ってこれは
、標的ＤＮＡ配列中の特定のヌクレオチドの存在又は不
存在についての診断試験を提供する。
倒Ａユ
この発明の他の例示において、広い温度範囲にわたるＴ
４ＤＮＡリガーゼによる連結に対するミスマツチの効果
について系統的な研究を行った。
４ＤＮＡリガーゼによる連結に対するミスマツチの効果
について系統的な研究を行った。
７塩基対オーバーラツプの１本の銀白でのすべてのミス
マツチの可能性を試験した（第１表）。ミスマツチオリ
ゴヌクレオチドの連結を等モル量の非−ミスマツチオリ
ゴヌクレオチドＣＲＮＩの存在下での競争実験において
アッセイした。配列はＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ ） ｔ
ｒｐプロモーター〔ＪＤ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １０，６６３９−６６５７（１
９８２））の−３５領域に対応する。この研究における
すべてのオリゴヌクレオチドはＤＮＡ配列決定により特
徴付けた［：Ｍａｘａｍ ＡＭ及びＧ１１ｂｅｒｔ Ｈ
，、Ｐｒｏｃ、Ｎａ月−＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ八、７
４，５６０−５へ４（１９７７）） 、連結生成物を、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後で、推定上の生成
物バンドにおける放射能のセレンコツ（Ｃｅｒｅｎｋｏ
ｖ）計数により定量した。十分に相補的なオリゴヌクレ
オチドＣＲＮＩの存在下でミスマツチオリゴヌクレオチ
ドを連結せしめたすべての場合において、ミスマツチの
連結された生成物の収量は、ミスマツチ塩基が連結点か
ら６塩基対だけ隔離されるまで、及びこれらの場合の連
結反応の温度が３５℃未満であるまで、最少であった。
マツチの可能性を試験した（第１表）。ミスマツチオリ
ゴヌクレオチドの連結を等モル量の非−ミスマツチオリ
ゴヌクレオチドＣＲＮＩの存在下での競争実験において
アッセイした。配列はＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ ） ｔ
ｒｐプロモーター〔ＪＤ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １０，６６３９−６６５７（１
９８２））の−３５領域に対応する。この研究における
すべてのオリゴヌクレオチドはＤＮＡ配列決定により特
徴付けた［：Ｍａｘａｍ ＡＭ及びＧ１１ｂｅｒｔ Ｈ
，、Ｐｒｏｃ、Ｎａ月−＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ八、７
４，５６０−５へ４（１９７７）） 、連結生成物を、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後で、推定上の生成
物バンドにおける放射能のセレンコツ（Ｃｅｒｅｎｋｏ
ｖ）計数により定量した。十分に相補的なオリゴヌクレ
オチドＣＲＮＩの存在下でミスマツチオリゴヌクレオチ
ドを連結せしめたすべての場合において、ミスマツチの
連結された生成物の収量は、ミスマツチ塩基が連結点か
ら６塩基対だけ隔離されるまで、及びこれらの場合の連
結反応の温度が３５℃未満であるまで、最少であった。
第−表
ＴＧＴＴＧ八ＣＴＧへＣＣＣＴ ３” ＣＲＮ２１
コニｉ ３ ＴにＴＴ
Ｇ八ＣＴへＣＣ３’ＣＲＮ１５′ ＾ＴＴＣＴにへΔΔ
ＴＧＡＧＣ ＴＴＴＡＣＴＣＧＡＣ＾へＣＴＧ５’ ＣＲＮ ２ ＴＧ ＴＴ ＧＡ ＣＴＧ ＣＣＣＧ
ＴＣＲＮ６＾ Ｔ ＣＲ８６Ｂ ＾ ＣＲＮ６ＣＧ ＣＲＮ５＾ ＴＧ ＴＴ ＧＴ ＣＴＧ ＣＣＣＣ：
ＴＣＲＮ５Ｂ ＧＣ ＣＲＮ５ＣにＧ ＣＲＮ５Ｄ Ｔ＾ Ｃｒｔ８５Ｅ Ｃ＾ ＣＲＮ５Ｆ ＾＾ ＣＲＮ４＾ ＴＧ ＴＣＧＡ ＣＴＣＣＣＣＧ ＴＣ
ＲＮ４Ｂ Ｔ＾ ＣＲ８４ＣＴＧ ＣＲＮ４Ｄ ＣＴ ＣＲＮ４Ｅ ＡＴ ＣＲＮ４Ｆ ＧＴ ＣＲＮ３八 ＴＴ ＴＴ ＧＡ
ＣＴＧ ＣＣＣＧ ＴＣＲＮ３Ｂ ＴＣ ＣＲＮ３ＣＴ＾ ＣＲＮ３Ｄ Ｃ（： ＣＲＮ３Ｅ ＡＧ ＣＲＮ３Ｆ ＣＧ ミスマツチを担持する領域は合成Ｅ、コリｔｒｉｐプロ
モーターの一３５領域である。打且４からの５′オーバ
ーラツプへのアニーリングについてＣＲＮＩと競争する
のはＣＲＮ２（対照）又はＣＲＮ３Ａ〜Ｃ６である。こ
れらのオリゴヌクレオチドはＩ且４５’オーバーラツプ
とのすべての可能な単一ミスマツチを含む。
コニｉ ３ ＴにＴＴ
Ｇ八ＣＴへＣＣ３’ＣＲＮ１５′ ＾ＴＴＣＴにへΔΔ
ＴＧＡＧＣ ＴＴＴＡＣＴＣＧＡＣ＾へＣＴＧ５’ ＣＲＮ ２ ＴＧ ＴＴ ＧＡ ＣＴＧ ＣＣＣＧ
ＴＣＲＮ６＾ Ｔ ＣＲ８６Ｂ ＾ ＣＲＮ６ＣＧ ＣＲＮ５＾ ＴＧ ＴＴ ＧＴ ＣＴＧ ＣＣＣＣ：
ＴＣＲＮ５Ｂ ＧＣ ＣＲＮ５ＣにＧ ＣＲＮ５Ｄ Ｔ＾ Ｃｒｔ８５Ｅ Ｃ＾ ＣＲＮ５Ｆ ＾＾ ＣＲＮ４＾ ＴＧ ＴＣＧＡ ＣＴＣＣＣＣＧ ＴＣ
ＲＮ４Ｂ Ｔ＾ ＣＲ８４ＣＴＧ ＣＲＮ４Ｄ ＣＴ ＣＲＮ４Ｅ ＡＴ ＣＲＮ４Ｆ ＧＴ ＣＲＮ３八 ＴＴ ＴＴ ＧＡ
ＣＴＧ ＣＣＣＧ ＴＣＲＮ３Ｂ ＴＣ ＣＲＮ３ＣＴ＾ ＣＲＮ３Ｄ Ｃ（： ＣＲＮ３Ｅ ＡＧ ＣＲＮ３Ｆ ＣＧ ミスマツチを担持する領域は合成Ｅ、コリｔｒｉｐプロ
モーターの一３５領域である。打且４からの５′オーバ
ーラツプへのアニーリングについてＣＲＮＩと競争する
のはＣＲＮ２（対照）又はＣＲＮ３Ａ〜Ｃ６である。こ
れらのオリゴヌクレオチドはＩ且４５’オーバーラツプ
とのすべての可能な単一ミスマツチを含む。
礼拌又囚友汲
オリゴヌクレオチドを改良された固相ホスホＩ・リエス
テル法（Ｇａｉｔ、ＭＪ等（１９８０）、Ｎｕｃｌｅｉ
ｒ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、８．１０８１−１０
９６ ；及びＭａｒｋｈａｍ 、＾Ｆ等（１９８０）
。
テル法（Ｇａｉｔ、ＭＪ等（１９８０）、Ｎｕｃｌｅｉ
ｒ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、８．１０８１−１０
９６ ；及びＭａｒｋｈａｍ 、＾Ｆ等（１９８０）
。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８．５
１９３−５２０５）により合成し、そして高速液体クロ
マトグラフィーにより、まずＰａｒｉｓｉｌ １Ｏ−Ｓ
ＡＸ陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｊｏｎｅｓ Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｇｌａｍｏｒｇａｎ ｏ
ｒＷＩ＋ａｔｍａｎ Ｌｔｄ）上で、次にＣ，ａμＢｏ
ｎｄａｐａｋ逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｅｓ Ｉｎｃ、）上でＮｅｕｔｏｎ、ＣＲ等（１９
８３） 、Δｎｏ１．８ｉｏｃｈｅｍ、、１２９．２２
−３０により記載されているようにして精製した。
１９３−５２０５）により合成し、そして高速液体クロ
マトグラフィーにより、まずＰａｒｉｓｉｌ １Ｏ−Ｓ
ＡＸ陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｊｏｎｅｓ Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｇｌａｍｏｒｇａｎ ｏ
ｒＷＩ＋ａｔｍａｎ Ｌｔｄ）上で、次にＣ，ａμＢｏ
ｎｄａｐａｋ逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｅｓ Ｉｎｃ、）上でＮｅｕｔｏｎ、ＣＲ等（１９
８３） 、Δｎｏ１．８ｉｏｃｈｅｍ、、１２９．２２
−３０により記載されているようにして精製した。
５’ ：１２ｐ−放射性ラベル化オリゴヌクレオチド
の配列決定は、シトシン＋チミン、アデニン、及びアデ
ニン開裂より大きいグアノシン開裂についてはＭａｘａ
ｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ （Ｍａｘａｍ、へ阿等、（１９
７７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ＾ｃａｄｅ＋＋＋ｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ。
の配列決定は、シトシン＋チミン、アデニン、及びアデ
ニン開裂より大きいグアノシン開裂についてはＭａｘａ
ｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ （Ｍａｘａｍ、へ阿等、（１９
７７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ＾ｃａｄｅ＋＋＋ｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ。
ＵＳＡ ７４，５６０−５６４）により記載されている
ようにして、そしてヒドロキシルアミン塩酸塩による部
分的シトシン特異的開裂についてはＲｕｂｉｎ及びＳｃ
ｈｍｉｄ（Ｒｕｂｉｎ、ＣＭ等（１９８０）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８゜４６１３−
１６１９ ）により記載されているようにして行った。
ようにして、そしてヒドロキシルアミン塩酸塩による部
分的シトシン特異的開裂についてはＲｕｂｉｎ及びＳｃ
ｈｍｉｄ（Ｒｕｂｉｎ、ＣＭ等（１９８０）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８゜４６１３−
１６１９ ）により記載されているようにして行った。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼはベーリンガーマンハイムＧ ｍ
ｂ Ｈからのものであり、そして全体を通じて使用され
る単位の定義はＷｅｉｓｓ等（Ｗｅｉｓｓ、Ｂ、等（１
９６８） 。
ｂ Ｈからのものであり、そして全体を通じて使用され
る単位の定義はＷｅｉｓｓ等（Ｗｅｉｓｓ、Ｂ、等（１
９６８） 。
Ｊｏｕｒｎｏｌ ｏｒ Ｂｉｏｌｏ １ｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒ 、２４３．４５４３−４５５５ ）に従う
ものである。１ユニツトは、３７℃においてｌ ｎ ｍ
ｏｉｅの”ＰＰｉをＮｏｒｉｔ吸収性材料に２０分間で
交換する酵素活性である。リガーゼ反応は６６ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，６） 、 ６．６ａ＋Ｍ Ｍ
ｇＣｌ２゜１０ｍＭジチオスレイトール及び０．４＋ｎ
Ｍ ＡＴＰ中で行った。
ｍｉｓｔｒ 、２４３．４５４３−４５５５ ）に従う
ものである。１ユニツトは、３７℃においてｌ ｎ ｍ
ｏｉｅの”ＰＰｉをＮｏｒｉｔ吸収性材料に２０分間で
交換する酵素活性である。リガーゼ反応は６６ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，６） 、 ６．６ａ＋Ｍ Ｍ
ｇＣｌ２゜１０ｍＭジチオスレイトール及び０．４＋ｎ
Ｍ ＡＴＰ中で行った。
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼはニューイングランドビ
オラプスからのものであり、ユニットの定義はｌｎｍｏ
ｌｅの酸不溶性３２ｐを３７℃にて３０分間に生成せし
める酵素活性である。キナーゼ反応は５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｔ’（ｐＨ９，０） 、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ
２゜２０ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭスペルミ
ジン、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ中で得った。ＡＴＰ濃度
はリン酸化オリゴヌクレオチドのその次の使用に依存し
て可変的である。
オラプスからのものであり、ユニットの定義はｌｎｍｏ
ｌｅの酸不溶性３２ｐを３７℃にて３０分間に生成せし
める酵素活性である。キナーゼ反応は５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｔ’（ｐＨ９，０） 、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ
２゜２０ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭスペルミ
ジン、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ中で得った。ＡＴＰ濃度
はリン酸化オリゴヌクレオチドのその次の使用に依存し
て可変的である。
アデノシン５′−〔γ−３２ｐ））リホスフェート・ト
リエチルアンモニウム塩（”Ｐ ＡＴＰ）はアメルシャ
ム・インターナショナルからのものであり、１ｍＣ１／
ｍＮ水性エタノールであり、比活性＞ ５０００Ｃｉ
／ ｍｍｏ ｌである。
リエチルアンモニウム塩（”Ｐ ＡＴＰ）はアメルシャ
ム・インターナショナルからのものであり、１ｍＣ１／
ｍＮ水性エタノールであり、比活性＞ ５０００Ｃｉ
／ ｍｍｏ ｌである。
オートラジオグラフィーは室温又は−７０”Ｃにおいて
、イルフォー°ド固定タングステン強化スクリーンと共
にコドックＸＲ−５フィルムを用いて行った（ Ｌａ５
ｋｅｙ 、Ｒ、へ１等（１９７７）、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ、８２゜３１４−３４１）。
、イルフォー°ド固定タングステン強化スクリーンと共
にコドックＸＲ−５フィルムを用いて行った（ Ｌａ５
ｋｅｙ 、Ｒ、へ１等（１９７７）、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ、８２゜３１４−３４１）。
電気泳動け、特にことわらない限り、７Ｍ尿素、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ボレート（ｐＨ８，３）及び１ ＋ｎＭ
ＥＤＴＡを含有する２０％アクリルアミド（１９，３
３％アクリルアミド、０．６７％ビスアクリルアミド）
を通して行った。
Ｍ Ｔｒｉｓ−ボレート（ｐＨ８，３）及び１ ＋ｎＭ
ＥＤＴＡを含有する２０％アクリルアミド（１９，３
３％アクリルアミド、０．６７％ビスアクリルアミド）
を通して行った。
電気泳動サンプルは８０％ホルムアミド、１０ｍＭ Ｎ
ａ０ＩＩ、 １ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェ
ノールブルー中に再懸濁するか又は稀釈した。サンプル
を１００’Ｃにて２分間熱変性せしめ、次に氷上で急速
に冷却した後に電気泳動にかけた。特にことわらない限
り、ブロモフェノールブルーが原点から１５ｃｍ移動す
るまで、電気泳動を４０Ｖ／ａｍの電位勾配で行った。
ａ０ＩＩ、 １ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェ
ノールブルー中に再懸濁するか又は稀釈した。サンプル
を１００’Ｃにて２分間熱変性せしめ、次に氷上で急速
に冷却した後に電気泳動にかけた。特にことわらない限
り、ブロモフェノールブルーが原点から１５ｃｍ移動す
るまで、電気泳動を４０Ｖ／ａｍの電位勾配で行った。
３２ｐラベル化オリゴヌクレオチドはポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により精製し、そしてＤＮＡをゲルから
電気溶出により、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ボレート（ｐＨ
１８，３） 、 ０．２ ｍＭ ＥＤＴＡ（１社）を含
有する透析バッグ中に、１６Ｖ／ｃｍの電位勾配で４５
分間回収し、次に極性を２０秒間逆転せしめた。電気溶
出物を逐次的ブタノール抽出により約５００μｌの容量
に濃縮し、フェノール−クロロホルム（０，５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ −１１ｃ＆’（ｐＨ７、５）により緩衝化し、次
に水で抽出する） （５００μｍ）により抽出した。水
相をエーテル（３Ｘ１ｍｉ’）により抽出し、ブタノー
ル抽出によりさらに２０μｌに濃縮し、真空乾燥し、そ
してエタノール沈澱せしめた。エタノール沈澱は、ＤＮ
Ａを０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６、２５０μｍ
）中に再懸濁し次にエタノール（８００μｍ）を添加し
そして混合し、−７０℃に９０分間以上置き、次にエッ
ペンドルス小遠沈管中で１５分間遠心分離することによ
り行った。ベレットを真空乾燥し、そして水（５００μ
！）中に再懸濁した。
ドゲル電気泳動により精製し、そしてＤＮＡをゲルから
電気溶出により、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ボレート（ｐＨ
１８，３） 、 ０．２ ｍＭ ＥＤＴＡ（１社）を含
有する透析バッグ中に、１６Ｖ／ｃｍの電位勾配で４５
分間回収し、次に極性を２０秒間逆転せしめた。電気溶
出物を逐次的ブタノール抽出により約５００μｌの容量
に濃縮し、フェノール−クロロホルム（０，５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ −１１ｃ＆’（ｐＨ７、５）により緩衝化し、次
に水で抽出する） （５００μｍ）により抽出した。水
相をエーテル（３Ｘ１ｍｉ’）により抽出し、ブタノー
ル抽出によりさらに２０μｌに濃縮し、真空乾燥し、そ
してエタノール沈澱せしめた。エタノール沈澱は、ＤＮ
Ａを０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６、２５０μｍ
）中に再懸濁し次にエタノール（８００μｍ）を添加し
そして混合し、−７０℃に９０分間以上置き、次にエッ
ペンドルス小遠沈管中で１５分間遠心分離することによ
り行った。ベレットを真空乾燥し、そして水（５００μ
！）中に再懸濁した。
オンラインＭ １７５０サイレント７００プリンターを
有するインターテクニク５Ｌ４００リウイド・シンチレ
ーション・カウンターを用いてセレンコツ放射を測定し
た。電気溶出物を、２０μβ標準プラスチツク計数バイ
アル（パラカード）中に入れられたシリコーン処理され
た７５０社微小遠心チューブ中に移した。サンプルを１
０分間暗所に適合せしめ、次にトリチウムを計数するた
めに液体シンチレーション分光計をセットすることによ
ってセレンコツ放射を決定した。ゲルからバンドを切り
出し、プラスチック計数バイアルに直接入れ、そして電
気溶出物について記載したのと同様にしてセレンコツ放
射を測定した。溶液中での同じ量の１２ｐ−ラベル化オ
リゴニクレオチドに対するゲルバンド中のセレンコツ放
射の減少を考慮することができる。
有するインターテクニク５Ｌ４００リウイド・シンチレ
ーション・カウンターを用いてセレンコツ放射を測定し
た。電気溶出物を、２０μβ標準プラスチツク計数バイ
アル（パラカード）中に入れられたシリコーン処理され
た７５０社微小遠心チューブ中に移した。サンプルを１
０分間暗所に適合せしめ、次にトリチウムを計数するた
めに液体シンチレーション分光計をセットすることによ
ってセレンコツ放射を決定した。ゲルからバンドを切り
出し、プラスチック計数バイアルに直接入れ、そして電
気溶出物について記載したのと同様にしてセレンコツ放
射を測定した。溶液中での同じ量の１２ｐ−ラベル化オ
リゴニクレオチドに対するゲルバンド中のセレンコツ放
射の減少を考慮することができる。
ミスマツ ２ 戸
合計２２０の競争反応を行った。各ミスマツチオリゴヌ
クレオチド又はＣＲＮ２（配列対照）をＤＮＡリガーゼ
アッセイにおいて、０，５，１０，１５゜２０ 、２５
、３０ 、３５、及び４０℃にてＣＲＮＩと競争せし
めた。各場合に０℃無酵素対照を含めた。すべての競争
は、ＬＦｉ４ （５，０ｐ ｍｏｌｅ） 、ｔｒｐ３
（７，５ｐ ｍｏｌｅ）、ＣＲＮ １ （７，５ｐ ｍ
ｏｌｅ）及び競争オリゴヌクレオチド（７，５ｐ ｍｏ
ｌｅ）を含有する６０μｌの容量中で行った０モル濃度
において合計オリゴヌクレオチドは４５６．５ｎＭ、虹
且４は８３ｎＭ、であり敗且３、ＣＲＮＩ及び競争体は
すべて１２４．５ｎＭであった。
クレオチド又はＣＲＮ２（配列対照）をＤＮＡリガーゼ
アッセイにおいて、０，５，１０，１５゜２０ 、２５
、３０ 、３５、及び４０℃にてＣＲＮＩと競争せし
めた。各場合に０℃無酵素対照を含めた。すべての競争
は、ＬＦｉ４ （５，０ｐ ｍｏｌｅ） 、ｔｒｐ３
（７，５ｐ ｍｏｌｅ）、ＣＲＮ １ （７，５ｐ ｍ
ｏｌｅ）及び競争オリゴヌクレオチド（７，５ｐ ｍｏ
ｌｅ）を含有する６０μｌの容量中で行った０モル濃度
において合計オリゴヌクレオチドは４５６．５ｎＭ、虹
且４は８３ｎＭ、であり敗且３、ＣＲＮＩ及び競争体は
すべて１２４．５ｎＭであった。
各競争オリゴヌクレオチドについて、水溶液（３９０μ
ｌ ）中競争体（７５ｐ ｍｏｌ ）及びＣＲＮＩ（７
５ｐｍｏｌｅ）を含んで成る“競争混合物″を調製した
。
ｌ ）中競争体（７５ｐ ｍｏｌ ）及びＣＲＮＩ（７
５ｐｍｏｌｅ）を含んで成る“競争混合物″を調製した
。
この競争複合体を１０個の等しい部分にわけた。
両オリゴヌクレオチドを”Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオ
チドキナーゼにより５′−リン酸化した。
チドキナーゼにより５′−リン酸化した。
これらをさらに前記のようにポリアクリルアミドゲル電
気泳動、電気溶出及びエタノール沈澱によりさらに精製
した。他の成分を、虹且３（７，５ｐ ｍｏｌｅ） 、
セｙ４ （５，Ｏｐ ａ＋ｏｌｅ）及びｌ０ＸＤＮＡ
リガーゼ［液（６μｌ）を２０μ！当りに含有する“屓
且ミックス”中に混合した。
気泳動、電気溶出及びエタノール沈澱によりさらに精製
した。他の成分を、虹且３（７，５ｐ ｍｏｌｅ） 、
セｙ４ （５，Ｏｐ ａ＋ｏｌｅ）及びｌ０ＸＤＮＡ
リガーゼ［液（６μｌ）を２０μ！当りに含有する“屓
且ミックス”中に混合した。
競争を検討した各温度について、各競争混合物の１つの
ありコート及びｍミックスのアリコー１−（２００μｍ
）を各競争混合物に移し、そして２０分間ブレインキュ
ベートした。やはり必要な温度においてブレインキュベ
ートされたＤＮＡリガーゼを加え（μ！中１ユニット）
、そして水（１μｍ）が添加された０℃酵素なし対照を
除き、混合した。
ありコート及びｍミックスのアリコー１−（２００μｍ
）を各競争混合物に移し、そして２０分間ブレインキュ
ベートした。やはり必要な温度においてブレインキュベ
ートされたＤＮＡリガーゼを加え（μ！中１ユニット）
、そして水（１μｍ）が添加された０℃酵素なし対照を
除き、混合した。
インキュベーションは３０分間であり、そしてフエノー
ル／クロロホルムによる抽出により停止し、そして電気
泳動の前に一７０°Ｃにて貯蔵した。
ル／クロロホルムによる抽出により停止し、そして電気
泳動の前に一７０°Ｃにて貯蔵した。
各競争について温度範囲にわたって実施された反応の水
相からアリコート（１０μｍ）を取り出し、そしてこれ
らのアリコートをホルムアミド／Ｎａ０ｆｌ／ブロモフ
エノールブルー（２０μｍ）の別々の部分と混合し、そ
して記載されているようにして電気泳動した０個々の競
争オリゴヌクレオチドについての一連の温度範囲のもの
を別個のゲル上で泳動せしめ、これらのゲルを記載され
ている様にしてオートラジオグラフ処理した（第５図、
第６図、第７図）。
相からアリコート（１０μｍ）を取り出し、そしてこれ
らのアリコートをホルムアミド／Ｎａ０ｆｌ／ブロモフ
エノールブルー（２０μｍ）の別々の部分と混合し、そ
して記載されているようにして電気泳動した０個々の競
争オリゴヌクレオチドについての一連の温度範囲のもの
を別個のゲル上で泳動せしめ、これらのゲルを記載され
ている様にしてオートラジオグラフ処理した（第５図、
第６図、第７図）。
０℃酵素なし対照からの両バンドを切り出し、そしてセ
レンコツ計数してＣＲＮｌに対する競争オリゴヌクレオ
チドの実際の比率を決定した。
レンコツ計数してＣＲＮｌに対する競争オリゴヌクレオ
チドの実際の比率を決定した。
ＣＲＮＩからの生成物バンド及び競争体からの可視生成
物バンドを同様にして単離し、そしてセレンコツ計数し
た。競争体生成物バンドが見えない場合、ＣＲＮＩ及び
ＣＲＮ２の間の競争からのオートラジオグラフの推定に
より生成物が予期されるゲル領域を単離した。これらの
バンドもまたセレンコツ計数して各温度における全生成
物中のミスマツチ生成物の比率を決定した。
物バンドを同様にして単離し、そしてセレンコツ計数し
た。競争体生成物バンドが見えない場合、ＣＲＮＩ及び
ＣＲＮ２の間の競争からのオートラジオグラフの推定に
より生成物が予期されるゲル領域を単離した。これらの
バンドもまたセレンコツ計数して各温度における全生成
物中のミスマツチ生成物の比率を決定した。
０℃にて３０分間の連結の後の典型的な結果を表に示す
、少量のミスマツチ連結生成物がｌ１１察される場合、
これらの収量は０ 、５．１０，１５．２０及び２５℃
の連結温度において本質的に同一であった。
、少量のミスマツチ連結生成物がｌ１１察される場合、
これらの収量は０ 、５．１０，１５．２０及び２５℃
の連結温度において本質的に同一であった。
ミスマツチ生成物の量は、連結が３０°Ｃにて行われた
場合−貫して約５０％低下し、そして３５℃でのインキ
ュベーションの後さらに低下した。
場合−貫して約５０％低下し、そして３５℃でのインキ
ュベーションの後さらに低下した。
以下余白
ＣＲＮ ２ Ｎ０ＮＥ ５４７
１２１４ ４５．ＩＣＲＮ ３＾ ＡＣ
ＡＡＣＴＧ ８ １２４４ ０
．６ＣＲＮ ａＢ ＡＣＡＡＣＴＧ
６ １１９６
０．５＾ ＣＲ）Ｉ ３ＣＡＣＡＡＣＴＧ ３６
１２０６ ２．９ＣＲＮ
３Ｄ ＡＣＡＡＣＴＧ
１９ １３２９ １．
４＾ ＣＲＮ ３ε ＡＣＡＡＣＴＧ ８
１２３２ ０．６ＣＲＮ ３Ｆ Ａ
ＣＡＡＣＴに １０ １０８６ ０．
９ＣＲＮ ４八 ＡＣＡＡＣＴＧ
１２ ９６３
１．２＾ ＣＲＮ ４Ｂ ＡＣＡＡＣＴＧ
１２ １１７４
１．ＯＣＲＮ ４ＣＡＣＡＡＣＴに １５
１１８３ １．３ＣＲＮ ４Ｄ
ＡＣＡＡＣＴ（： １３
１３０３ ０．１＾ ＣＲＮ ４Ｅ ＡＣＡＡＣＴＧ ２４
１２８１ １．９ＣＲＮ ４Ｆ
ＡＣＡＡＣＴＧ ８
１２０８ ０．７ＣＲＮ ５＾
ＡＣＡＡＣＴＧ ６７ １１３
６ ５．９ＣＲＮ ５８ ＡＣＡＡＣＴ
Ｇ ２７ １３２８ ２．ＯＣＲ
Ｎ ５ＣＡＣＡＡＣＴＧ ２２ １０７
０ ２．ＩＣＲＮ ５Ｄ ＡＣＡＡＣＴ
Ｇ １１ １２０１ ０．９ＣＲ
Ｎ ５Ｅ ＡＣＡＡＣＴＧ １１
１２８１ ０．９＾ ＣＲＮ ５Ｆ ＡＣＡＡＣＴＧ ２３
１２０７ ２．ＩＣＩ’（Ｎ ６＾ Ａ
ＣＡＡＣＴＧ ４９８ １３８３
３６．ＯＣＩＩＮ ６８ ＡＣＡＡＣＴＧ
４２１ １２１４ ３４．７この結果
が示すところによれば、ＤＮＡ中の点変異の検出は、適
切な対のオリゴヌクレオチドであって、その一方が正常
な配列に対して相補的であり、そして他方が変異した配
列に相補的であるものの存在下でアッセイを行い、次に
連結生成物を分析することにより可能である。
１２１４ ４５．ＩＣＲＮ ３＾ ＡＣ
ＡＡＣＴＧ ８ １２４４ ０
．６ＣＲＮ ａＢ ＡＣＡＡＣＴＧ
６ １１９６
０．５＾ ＣＲ）Ｉ ３ＣＡＣＡＡＣＴＧ ３６
１２０６ ２．９ＣＲＮ
３Ｄ ＡＣＡＡＣＴＧ
１９ １３２９ １．
４＾ ＣＲＮ ３ε ＡＣＡＡＣＴＧ ８
１２３２ ０．６ＣＲＮ ３Ｆ Ａ
ＣＡＡＣＴに １０ １０８６ ０．
９ＣＲＮ ４八 ＡＣＡＡＣＴＧ
１２ ９６３
１．２＾ ＣＲＮ ４Ｂ ＡＣＡＡＣＴＧ
１２ １１７４
１．ＯＣＲＮ ４ＣＡＣＡＡＣＴに １５
１１８３ １．３ＣＲＮ ４Ｄ
ＡＣＡＡＣＴ（： １３
１３０３ ０．１＾ ＣＲＮ ４Ｅ ＡＣＡＡＣＴＧ ２４
１２８１ １．９ＣＲＮ ４Ｆ
ＡＣＡＡＣＴＧ ８
１２０８ ０．７ＣＲＮ ５＾
ＡＣＡＡＣＴＧ ６７ １１３
６ ５．９ＣＲＮ ５８ ＡＣＡＡＣＴ
Ｇ ２７ １３２８ ２．ＯＣＲ
Ｎ ５ＣＡＣＡＡＣＴＧ ２２ １０７
０ ２．ＩＣＲＮ ５Ｄ ＡＣＡＡＣＴ
Ｇ １１ １２０１ ０．９ＣＲ
Ｎ ５Ｅ ＡＣＡＡＣＴＧ １１
１２８１ ０．９＾ ＣＲＮ ５Ｆ ＡＣＡＡＣＴＧ ２３
１２０７ ２．ＩＣＩ’（Ｎ ６＾ Ａ
ＣＡＡＣＴＧ ４９８ １３８３
３６．ＯＣＩＩＮ ６８ ＡＣＡＡＣＴＧ
４２１ １２１４ ３４．７この結果
が示すところによれば、ＤＮＡ中の点変異の検出は、適
切な対のオリゴヌクレオチドであって、その一方が正常
な配列に対して相補的であり、そして他方が変異した配
列に相補的であるものの存在下でアッセイを行い、次に
連結生成物を分析することにより可能である。
第１図、第２図及び第３図は、オートラジオグラフであ
って、１はＥｄｇｅ等Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ−５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ ｆｌ、（１９８３） ｐ６
４１９−６４３５に記載されているプラスミドｐｌＦｓ
１１０１中のヒトインターフェロンα２のＤＮＡ配列を
示し、そしてＫはインターフェロンα２類似体（Ａｌａ
”）ＩＦＮ−α２をコードするＤＮＡ配列であってコド
ンＴＣＣがＧＣＴにより置き換えられているものを示す
。この類似体塩基配列をこの明細書においてｐＫ９と称
する。 第４図はオートラジオグラフであって、レーンＭは３２
塩基長オリゴヌクレオチドマーカーバンドに対応するシ
グナルを示し、レーン１はそれぞれがその３′末端に導
入された単一ｄＣＴＰ残基を有するオリゴヌクレオチド
１１（−１）及び１３に由来する３２塩基長連結生成物
に対応するシグナルを示す。レーン２〜５は３２塩基長
オリゴヌクレオチドに対応するシグナルをなんら示さな
い。 第５図は、０〜４０℃（これらのインキュベーション温
度はオートラジオグラフの上に示す）において行われた
、５ ′Ｏ１ｌ ｔｒｐ３．５’０１１す且４．５′３
２ＰＣＲＮ１、及び５’ ”Ｐ ＣＲＮ２を含む反応混
合物のアリコートのオートラジオグラフである。〇−は
酵素を含まない対照である。ＢＰＢはブロモフェノール
ブルーマーカー色素の位置を示す。 第６図は、０〜４０℃（これらのインキュベーション温
度はオートラジオグラフの上に示す）において行われた
、５ ’ ＯＨ輩且３．５ ’ Ｏｌｌ ｔｒｐ４．５
’ ”Ｐ ＣＲＮＩ及び５’ ”Ｐ ＣＲＮ４Ｃを含む
リガーゼ反応混合物のアリコートのオートラジオグラフ
を示す。０−は酵素を含まない対照である。ＢＰＢはブ
ロモフェノールブルーマーカー色素の位置を示す。 第７図は、０〜４０℃（これらのインキュベーション温
度はオートラジオグラフの上に示す）において行われた
、５ ’ ＯＨ旨且３．５ ’ ＯＨｍ４．５′コ２Ｐ
ＣＲＮＩ及び５’ ”Ｐ ＣＲＮ６Ｃを含むリガーゼ
反応混合物のアリコートのオートラジオグラブを示す。 ０−は酵素を含まない対照である。ＢＰＢはブロモフェ
ノールブルーマーカー色素の位置を示す。
って、１はＥｄｇｅ等Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ−５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ ｆｌ、（１９８３） ｐ６
４１９−６４３５に記載されているプラスミドｐｌＦｓ
１１０１中のヒトインターフェロンα２のＤＮＡ配列を
示し、そしてＫはインターフェロンα２類似体（Ａｌａ
”）ＩＦＮ−α２をコードするＤＮＡ配列であってコド
ンＴＣＣがＧＣＴにより置き換えられているものを示す
。この類似体塩基配列をこの明細書においてｐＫ９と称
する。 第４図はオートラジオグラフであって、レーンＭは３２
塩基長オリゴヌクレオチドマーカーバンドに対応するシ
グナルを示し、レーン１はそれぞれがその３′末端に導
入された単一ｄＣＴＰ残基を有するオリゴヌクレオチド
１１（−１）及び１３に由来する３２塩基長連結生成物
に対応するシグナルを示す。レーン２〜５は３２塩基長
オリゴヌクレオチドに対応するシグナルをなんら示さな
い。 第５図は、０〜４０℃（これらのインキュベーション温
度はオートラジオグラフの上に示す）において行われた
、５ ′Ｏ１ｌ ｔｒｐ３．５’０１１す且４．５′３
２ＰＣＲＮ１、及び５’ ”Ｐ ＣＲＮ２を含む反応混
合物のアリコートのオートラジオグラフである。〇−は
酵素を含まない対照である。ＢＰＢはブロモフェノール
ブルーマーカー色素の位置を示す。 第６図は、０〜４０℃（これらのインキュベーション温
度はオートラジオグラフの上に示す）において行われた
、５ ’ ＯＨ輩且３．５ ’ Ｏｌｌ ｔｒｐ４．５
’ ”Ｐ ＣＲＮＩ及び５’ ”Ｐ ＣＲＮ４Ｃを含む
リガーゼ反応混合物のアリコートのオートラジオグラフ
を示す。０−は酵素を含まない対照である。ＢＰＢはブ
ロモフェノールブルーマーカー色素の位置を示す。 第７図は、０〜４０℃（これらのインキュベーション温
度はオートラジオグラフの上に示す）において行われた
、５ ’ ＯＨ旨且３．５ ’ ＯＨｍ４．５′コ２Ｐ
ＣＲＮＩ及び５’ ”Ｐ ＣＲＮ６Ｃを含むリガーゼ
反応混合物のアリコートのオートラジオグラブを示す。 ０−は酵素を含まない対照である。ＢＰＢはブロモフェ
ノールブルーマーカー色素の位置を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、択一的複数ヌクレオチド配列間の識別方法であって
、標的塩基配列の隣接する複数のセグメントを検出可能
な第一ヌクレオチドプローブと及び第二ヌクレオチドプ
ローブとのハイブリダイゼーションにかけてハイブリド
を形成せしめ、ここで第一及び第二プローブのヌクレオ
チド配列はこれらが相補的標的配列とスプリットハイブ
リドプローブを形成した場合これらが次に連結されて前
記得られたハイブリドを連結させるようなものであり、
次に得られたハイブリドを検出することを含んで成り； 前記検出可能な第一ヌクレオチドプローブの及び前記第
二ヌクレオチドプローブのＤＮＡ配列が、前記標的配列
中の可能性あるミスマッチが前記プローブの間かまたは
前記プローブの内の１つのプローブの末端に位置し該末
端が前記プローブの内の他の１つと隣接するようなもの
であり； 該方法が、相補的標的配列が１又は複数の非−相補的ヌ
クレオチドから識別されるように行われる； ことを特徴とする識別方法。 ２、前記検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第二
ヌクレオチドプローブが標的配列中の可能性ある変異配
列の各側にハイブリダイズし、これらのプローブが連結
反応にかけられ、この反応が正常な配列又は予想される
変異配列のいずれかに相補的な１又は複数のヌクレオチ
ドを導入しそして該１又は複数のヌクレオチドを連結に
かけることを含んで成り、次に得られたハイブリドを検
出することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
方法。 ３、得られたハイブリドを選択的変性にかけ、これによ
って検出可能な第一ヌクレオチドプローブと第二ヌクレ
オチドプローブとの連結が行われていない存在するハイ
ブリドを変性せしめることにより選択を行うことを特徴
とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、前記１又は複数のヌクレオチドの導入がＤＮＡポリ
メラーゼの使用によって行われることを特徴とする、特
許請求の範囲第２項又は第３項に記載の方法。 ５、前記検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第二
ヌクレオチドプローブが、これらが標的配列にハイブリ
ダイズしこれによって該プローブ間の単一ヌクレオチド
のギャップを残すようなものである、特許請求の範囲第
２項〜第４項のいずれか１項に記載の方法。 ６、相補的標的塩基配列とのハイブリダイゼーションの
後にスプリットプローブハイブリドが形成され、得られ
たハイブリドが第二ヌクレオチドプローブに検出可能な
第一ヌクレオチドプローブを連結するための連結反応に
かけられ、そしてこうして得られたハイブリドが適切な
処理にかけられ、これによって、検出可能な第一ヌクレ
オチドプローブと第二ヌクレオチドプローブとの連結が
行われていない存在するハイブリドが変性され、他方完
全に相補的な検出可能な連結されたオリゴヌクレオチド
−標的配列ハイブリドについては変性が行われない、こ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ７、標的塩基配列の隣接するセグメントを検出可能な第
一ヌクレオチドプローブと及び第二ヌクレオチドプロー
ブとのハイブリダイゼーションにかけて、相補的標的配
列とのスプリットプローブハイブリドを形成せしめ、必
要であれば得られたハイブリドを選択的変性にかけ、こ
れによって１又は複数の非−相補的ヌクレオチドを含有
する標的配列の部分にハイブリダイズする第一及び第二
ヌクレオチド配列のいずれかを変性せしめ、得られたハ
イブリドを次に連結反応にかけこれによって検出可能な
第一ヌクレオチドプローブを第二ヌクレオチドプローブ
に連結し、そして必要であれば得られたハイブリドを選
択的変性にかけ、これによって第一及び第二ヌクレオチ
ドプローブに相補的な標的配列と、第一及び第二ヌクレ
オチドプローブの一方に対して非−相補的な１又は複数
のヌクレオチドを有する標的配列との間を識別する、こ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ８、検出可能な第一ヌクレオチドプローブを可能性ある
トランスロケーションの領域領域にわたってハイブリダ
イズするように適合せしめ、そして検出されない第二ヌ
クレオチドプローブを前記可能性あるトランスロケーシ
ョンに隣接する配列にハイブリダイズするように適合せ
しめ、ここで前記検出されない第二ヌクレオチドプロー
ブは結合対の１つの構成員を担持しており、この方法は
、スプリットプローブハイブリドを形成せしめ、これを
連結して連結されたプローブハイブリドを形成せしめ、
次にこのハイブリドを変性せしめることを特徴とする、
トランスロケーションの分析のための特許請求の範囲第
１項に記載の方法。 ９、検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第二ヌク
レオチドプローブのそれぞれが下記の成分を担持してお
り、ハイブリドの形成及び適切な場合には変性の後、該
検出可能な第一のヌクレオチドプローブに付着された成
分及び該第二ヌクレオチドプローブに付着された成分の
両者を担持するヌクレオチド配列が得られた場合にのみ
シグナルが検出されることを特徴とする特許請求の範囲
第１項に記載の方法。 １０、相補的標的配列が存在する場合にスプリットプロ
ーブハイブリドが得られるように標的配列を２以上のオ
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション
にかけ、ここで検出可能な第一ヌクレオチド配列は検出
可能な末端オリゴヌクレオチドプローブでありそして第
二ヌクレオチドプローブはそれに付着された結合対の一
方の構成員を有する他方の末端オリゴヌクレオチドプロ
ーブであり、他の個々のオリゴヌクレオチドは前記末端
オリゴヌクレオチドプローブ間の隣接する標的配列に個
別にしかし隣接してハイブリダイズするものであり、得
られたハイブリドを次に選択的変性にかけ、これによっ
て塩基対ミスマッチにわたる標的配列にハイブリダイズ
したオリゴヌクレオチドを変性せしめ、そして個々のオ
リゴヌクレオチドを連結して前記検出可能なオリゴヌク
レオチドプローブを結合対の一方の構成員を有するオリ
ゴヌクレオチドプローブに連絡することにより連結され
たプローブハイブリドを形成し、次にこのハイブリドを
変性しそして結合対の他方の構成員と接触せしめ、これ
によって該結合対を含む検出可能な連結されたプローブ
ヌクレオチド配列を他のヌクレオチド配列から分離する
ことを特徴とする、択一的複数ヌクレオチド配列間を識
特するための特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １１、標的塩基配列の隣接するセグメントにハイブリダ
イズした検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第二
ヌクレオチドプローブを含んで成り、該検出可能な第一
ヌクレオチドプローブが該第二ヌクレオチドプローブに
連結され得る、スプリットプローブハイブリド。 １２、前記検出可能な第一ヌクレオチド配列及び／又は
第二ヌクレオチド配列が疾患に関連する変異配列のいず
れかの側に又は対応する正常配列にハイブリダイズし；
あるいは標的塩其配列にハイブリダイズして、その中の
疾患と関連する変異塩基配列が前記プローブの内の一方
のプローブの末端にあり、この末端が前記プローブの内
の他方のプローブに隣接しており、又は対応する正常細
胞とハイブリダイズしている、特許請求の範囲第１１項
に記載のスプリットプローブハイブリド。 １３、択一的複数塩基配列間を識別するためのキットで
あって、検出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第二
ヌクレオチドプローブを含んで成り、各プローブは標的
配列の隣接するセグメントに対して相同なヌクレオチド
配列を有し、これらのセグメントの一方の中に又はこれ
らの間に可能性ある変異配列が存在し；検出可能な第一
ヌクレオチドプローブ及び／又は第二ヌクレオチドプロ
ーブは、可能性ある変異配列が前記プローブの内の一方
のプローブの末端にあり、該末端は前記プローブの内の
他方のプローブに隣接し、又は可能性ある変異配列がこ
れらのプローブの間に存在するようなものであり；さら
に前記連結のための試薬を含んで成るキット。 １４、疾患状態と関連する点変異を検出するための、検
出可能な第一ヌクレオチドプローブ及び第二ヌクレオチ
ドプローブ、並びに対応する点変異が存在しない正常配
列を検出するための、検出可能な第一ヌクレオチドプロ
ーブ及び第二ヌクレオチドプローブ、を含む特許請求の
範囲第１３項に記載のキット。
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