JPH0223899A - 核酸配列の増幅および検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、核酸配列の増幅法、さらに、核酸テンプレー
ト（ｔｅ鴎ｐｌａｔｅ）上の一塩基の相違を検出するた
めの方法である。

（従来の技術） 核酸の一部を酵素的に対合させる方法はいくつか知られ
ている。ワイスら（１１ｅｉｓｓ、Ｂ、、ら、　Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２４５（ＩＴ）：４５４３（１９６８））
は、Ｔ４−ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）リガーゼを用い
た、ＤＮＡ２重鎖における、２つに分断された鎖断片の
連結について述べている。スガラメラら（Ｓｇａｒａｍ
ｅｌｌａ、　Ｖ、　Ｉら＋　Ｐｒｏｃ。

ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、＾、　６７（３
）：１４６８（１９７０））は平滑末端のＯＮ＾２重鎖
を連結するためのＴ４−ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）リ
ガーゼの利用について述べている。ナスら０１ａｔｈ、
Ｌ、ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４９（１２）
：３６８０（１９７４））はＤＮＡリガーゼをポリリボ
ヌクレオチドとポリデオキシリボヌクレオチドとの連結
に利用することを述べている。ヒギンズら（ｌｌｉｇＩ
Ｉｉｎｓ、Ｎ。

Ｐ、、ら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
Ｐ、ｙ　６８：５０（１９７９））は口Ｎ＾連結酵素の
総説を提供している。ハリソンら（１１ａｒｒｉｓｏｎ
、　Ｂ、　、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　１２：８２３５（１９８４））はポリマー
溶液中でＴ４ＲＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチド
とポリヌクレオチドとの連結反応が促進されることを説
いている。

増幅に関しては、サイキら（Ｓａｉｋｉ、Ｒ，に、、ら
、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０（１９８５））が
、増幅する領域に隣接する２種のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを与え、変性したゲノムＤＮＡの鎖にそのプラ
イマーを対合させ、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼｌのク
レノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
）およびデオキシリボヌクレオシドトリホスファターゼ
によって伸長させる、ポリメラーゼ連鎖反応と呼ばれる
方法による、β−グロビンのゲノム上の配列の酵素的な
増幅について述べている。ムリスに対する米国特許第４
　、６８３　、２０２号明細書はポリメラーゼ連鎖反応
法についてさらに述べている。

サイキらに対する米国特許４．６８３．１９４号明細書
は、ある配列に対し、その配列に相補的なオリゴヌクレ
オチドプローブをハイブリダイズさせ、その制限酵素切
断部位により近いプローブの末端で標識された制限酵素
切断部位を結びつけることにより核酸配列中の特異的な
多様な制限酵素切断部位を検出する方法について述べて
いる。核酸配列とそれに対してハイブリダイズしたプロ
ーブは次いで制限酵素により消化され、標識、非標識の
オリゴマー断片が分別され、標識の入ったオリゴヌクレ
オチドが検出される。

ムリスらに対する米国特許第４，６８３，１９５号明細
書はプライマーと重合試薬を用いた核酸配列の増幅過程
および特異的な核酸配列の存在の有無を検出する過程に
ついて述べている。ひとつの核酸試料の分離した鎖は２
種の異なるオリゴヌクレオチドプライマーで処理され、
目的とする核酸配列を合成するためのテンプレートとし
て働くプライマーは伸長して相補的な伸長産物を形成す
る。その後、増幅された配列は検出するべき配列にハイ
ブリダイズする事のできる標識されたプローブを添加す
ることによって検出される。

（発明が解決しようとする課Ｂ） 本発明は、第一に、テンプレート配列がより容易に検出
されることが可能となるように、核酸テンプレートから
の特定の核酸配列を増幅する手段として利用可能である
ため、診断への応用に有用である。与えられた核酸配列
を増幅するためには、その配列を、目的とする標的塩基
の両側に隣接するオリゴヌクレオチド鎖（基質）の少な
くトモ１組とハイブリダイズさせるが、その際、１対の
オリゴヌクレオチド鎖の１方にある指定された末端塩基
を標的塩基と相補的とし、またその指定された末端塩基
が、同じ対の他方の基質の末端との連結部（ジャンクシ
ョン）を形成している。前者のオリゴヌクレオチド基質
譬は実際においては標的塩基および隣接する核酸配列に
ハイブリダイズすると同時に、プローブの指定された末
端塩基がテンプレートの標的塩基に相補的である場合に
のみ、標的塩基及び隣接配列の反対側に隣接するように
デザインされた後者のオリゴヌクレオチド基質基質と連
結するプローブである。

与えられたテンプレート上に、指定された末端塩基が相
補するべき標的塩基が存在しないような不適合な条件下
で連結が起きる可能性があるが、本発明によれば、連結
部位のいずれか一方における１塩基の不適合により、２
つのオリゴヌクレオチド額間の連結頻度を低下させ、理
論的には核酸テンプレート上の単一の塩基の相違をも区
別するために、そうした誤った連結は抑圧され得る。し
たがって、本発明における本方法は、核酸配列上の単一
の塩基あるいは塩基突然変異を検出する診断技術として
も利用可能である。したがって、このような本発明のよ
り進んだ態様は、決定的な構造遺伝子上の単一の突然変
異の結果生ずる、鎌型赤血球貧血病、血友病あるいは色
盲などの遺伝子病の診断に有用である。

（課題を解決するための手段） 一般に、本発明は、各々の核酸が一本の鎖あるいは分離
した相補的頓からなってるような、ひとつの核酸テンプ
レート試料に含まれる少なくとも一種の特定の核酸配列
における一つの塩基または塩基対の相違をも検出する方
法を特色としており、本方法は、この鎖を２種の比較的
短いオリゴヌクレオチド基質の２組のうち、少なくとも
一つと処理することを含み、この組の各々は、（ｉ）少
なくとも一方の鎖のテンプレート配列の少なくとも一部
分と相補的であり、したがって該部分にハイブリダイズ
し、そして（ｉｉ）該特定の核酸配列に含まれる指定さ
れた標的塩基の両側に隣接するが、その際、各々の組の
オリゴヌクレオチド中の２つの短いオリゴヌクレオチド
の１方がその一つの末端に、該テンプレートの標的塩基
の一つに相補的な塩基を一個含むような組であり、そし
て上記の処理の条件は、もしテンプレート中に標的塩基
が存在すれば、該標的塩基の一つに相補的な相補的オリ
ゴヌクレオチドの一つの末端塩基と、同じ組のもう一方
の相補的オリゴヌクレオチドの末端塩基との間で連結が
起きることにより、各々の組中の２つの短いオリゴヌク
レオチドが相互に連結するような反応条件である。

本発明は、さらに、単鎖あるいは相補的核酸鎖からなる
核酸あるいは核酸混合物を含む試料中の、少なくとも一
種の特定の核酸配列を増幅する方法を特色とし、この場
合、本試料は本配列、あるいは複数の配列を含むと推定
されており、末法は、（ａ）少なくとも一つの特定の核
酸配列に相補的な２組のオリゴヌクレオチド対の少なく
ともｔＵ＋でこの鎖を処理するが、４８２　＆Ｉｌのオ
リゴヌクレオチド対は、核酸配列（単数あるいは複数）
に含まれる一本鎖テンプレート上の少なくとも一つの標
的塩基あるいは平滑末端を規定する少なくとも−・つの
標的塩基対に隣接することが出来るものでもあり、さら
に少なくとも一つの組のオリゴヌクレオチドの一方の一
つの末端ヌクレオチドが、標的塩基もしくは標的塩基対
の複数塩基の一つに相補的であり、その際、上記処理の
条件として、試料中に標的塩基あるいは標的塩基対が存
在する場合のみに、末端ヌクレオチドが対の内の他方の
オリゴヌクレオチドの末端と相互的に連結し、その結果
、特定の核酸配列に対して相補的な連結産物を形成する
ような条件下で行い、（ｂ）もし、試料中に検出される
べき標的塩基あるいは標的塩基対が存在すれば、連結産
物をテンプレートから分離する条件下で試料を処理し、
そして、（ｃ）連結が起こったかを判断することから構
成されている。

本発明のその他の利点並びに特色は、本件に関する好ま
しい態様についての以下の記載と特許請求の範囲から明
らかにされるだろう。

（発明の詳細な説明） 本発明の本性は、いかなる特定の核酸配列テンプレート
をも増幅が可能であり、核酸テンプレート上のただ一つ
の塩基の相違を識別、検出することが可能である。した
がって、本発明は、鎌型赤血球貧血病のような点突然変
異の結果として起こる種々の遺伝的疾患の診断に有効で
ある。その他の診断への応用では、ゲノムＯＮ＾中の限
られたコピー数のＤＮＡテンプレートの検出のために、
信号の増幅が必要である０例えば、１０Ａｒの［ｌＮ＾
中には単一の遺伝子にして約１００万コピーが存在する
のみである。さらに、行なわれる特定の診断法によって
は、ごく限られた量のＤＮＡしか得られないかも知れな
い。

本発明の本性によれば、核酸テンプレート上の標的塩基
の両方向に対して、相補的でそして隣接するような短い
オリゴヌクレオチド鎖が合成される。これらの比較的短
いオリゴヌクレオチド（隣接オリゴヌクレオチドあるい
は基質）は、−Ｃ的に第１図に示されているように、Ｏ
Ｎ−１，ＯＮ−２，ＯＮ−３およびＯＮ−４と表示され
る。隣接オリゴヌクレオチドは当業者にはよく知られた
方法によって合成されるだろう。

隣接オリゴヌクレオチドの長さは、この隣接オリゴヌク
レオチドを目的の標的塩基対に隣接する核酸テンプレー
トの部分にのみハイブリダイズあるいは再結合（アニー
ル）させるための独特の塩基パターンを含むのに充分な
長さを持っていなければならない、ｉｉ接オリゴヌクレ
オチドの厳密な長さは、反応温度、ｐＨ条件および標的
配列の複雑さなどを含む種々の因子に依存している。一
般に、約４から約１００ヌクレオチドからなる隣接オリ
ゴヌクレオチドは、より高い反応温度の下でも充分に安
定なハイブリッド複合対を形成する。大抵の場合、本発
明にしたがって用いられる好ましい隣接オリゴヌクレオ
チドは、約８から約２０ヌクレオチドからなるものであ
る。

本発明の本性は、−本あるいは二本鎖の核酸テンプレー
トを用いて行なわれるだろう、もし、核酸テンプレート
が二本鎖からなるなら、本発明の連結増幅を始める前に
、第一に鎖を分離する必要がある。核酸の鎖を分離する
一つの方法は、核酸が完全に変性するまで熱を加えるこ
とを含んでいる。こうした変性は、通常８０℃から１０
５℃の範囲の温度で、ｌから１０分の範囲の間で行なわ
れる。

核酸鎖の分離は、ヘリカーゼ（ｈｉｌｉｃａｓｅ）酵素
およびＲｅｃ＾といった、酵素によっても起こすことが
できる。ウォーレスら（Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、、
ら５ｃｉｅｎｃｅ　２０９：１３９６（１９８０））に
より述べられている通り、適当な制限酵素に続いて、エ
クソヌクレアーゼ■（Ｅｘｏ　ｍ　）あるいはラムダ・
エクソヌクレアーゼで消化することにより、２本のうち
一方の鎖を除くことも可能である。

増幅される特定の核酸配列はより大きな分子のごく一部
でもよく、あるいは分離した分子でもよい。増幅される
配列は、分子あるいはぞの断片のより大きな混合物の一
部であることも出来る。材料となる核酸は、同じあるい
は別種の標的塩基を含む複数の目的とする配列を含んで
いるかも知れず、その結果こうした配列はいずれも同時
に増幅され得る。複数の目的とする標的配列とともに、
複数種の核酸からなる試料もまた、本発明の本性によっ
て増幅されることができる。

どの様な材料から由来したテンプレート核酸も、目的と
する核酸配列を含んでいるかあるいは含んでいると思わ
れる限り本発明を実施するために用いることができる０
例えば、細菌、酵母、ウィルス、植物あるいは動物由来
のプラスミド、天然のＯＮ＾あるいはＲＮＡ、またはク
ローン化された口Ｎ＾あるいはＲＮＡを用いることがで
きる。ゲノムＤＮＡあるいは総ＲＮＡも、ヒトの血液お
よび組織から種々の方法によって抽出されるだろう０合
成オリゴヌクレオチドも用いることができるだろう、　
ＲＮＡを開始テンプレートとして用いる場合は、ＲＮＡ
はまず逆転写酵素などの酵素によりＯＮ＾分子へと複写
される。

第１図を参照すると、テンプレートは標的塩基対１−Ｔ
１をもつβ１正常型βグロビン対立遺伝子である。第２
図では、テンプレートは標的塩基対０Ｔ＾１をもつβ１
鎌型赤血球対立遺伝子である。第１図および第２図に示
された特定のテンプレートおよび隣接オリゴヌクレオチ
ドは本発明を説明するだけのものであり、本発明が、ヒ
トβグロビン遺伝子の対立遺伝子の検出あるいは増幅に
限定されるものではないことが理解されねばならない。

第１図に示されるように、テンプレートの５°−３゛（
上）鎖を（＋）とし、３’−５’　（下）Ｍを（−）と
呼ぶ。

隣接オリゴヌクレオチド０１１−２とＯＮ−４は８−ヌ
クレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ＯＮ−１と
ＯＮ−３は１４−ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド
である０本発明の本法は、第１図に示されているものと
同様な対称性、すなわち３゛隣接オリゴヌクレオチドで
あるＯＮ−２とＯＮ−４が同じ長さであり、５゛隣接オ
リゴヌクレオチドであるＯＮ−１とＯＮ−３が同じ長さ
であることが必要である。２つの３゛あるいは２つの５
゛隣接オリゴヌクレオチドはより長いものを用いること
も可能であり、また４つの全ての隣接オリゴヌクレオチ
ドが同じ長さであることも可能である。しかし、３°隣
接オリゴヌクレオチド（ＯＮ−２とＯＮ−３）の５”末
端はリン酸化されていなくてはならず、またこれらの末
端は随時、例えば放射活性燐酸によって標識され得る。

５゛隣接オリゴヌクレオチド（ＯＮ−１と０ト３）は自
己連結およびテンプレート−非依存性連結を防ぐために
通常はリン酸化されない。

増幅するべき核酸テンプレートが二本鎖である場合、目
的とする標的塩基対は第１図のように、Ａ１であるかま
たはＴ−Ａ、Ｇ−ＣあるいはＣ−Ｇだろう、したがって
、テンプレートが一本鎖である場合は、標的塩基は４種
の塩基のいずれでもよい。

しかし、本発明の本法は、単一塩基あるいは単一塩基対
の相違を含んだ上述の用例に限定されるものではない、
したがって、隣接するオリゴヌクレオチドの相補的領域
は、本発明の本法が複数の塩基の相違を含む配列の判別
および検出に用いることができる複数の塩基あるいは塩
基対の相違を含むことも可能である。

二本鎖の核酸テンプレートの場合、標的塩基対は、第１
図に見られるように、粘着末端ではなく平滑末端を規定
することが必要である。

隣接オリゴヌクレオチド基質の組は、いずれかの鎖上の
突然変異が起こり得る位置をもつ核酸配列に相補的であ
る。さらに、二本鎖のテンプレートでは、２つの３゛隣
接オリゴヌクレオチドの一つの末端塩基のうちの一つと
、連結されるべき２つの５１隣接オリゴヌクレオチドの
一つの末端塩基のうちの一つが、各々の標的塩基に相補
的でなければならない。したがって、第１図に示されて
いるように、３°隣接オリゴヌクレオチド（塩基Ｔ、Ｏ
Ｎ−２）の一つのうちの５゛末端の塩基は、（＋）テン
プレート鎖の標的塩基＾に相補的であり、５゛隣接オリ
ゴヌクレオチド（塩基＾、ｏＮ−３）の一つのうちの３
”末端にあるヌクレオチドは（−）テンプレート鎖の標
的塩基Ｔに相補的である。したがって、いずれの隣接オ
リゴヌクレオチド組の４つの末端塩基すなわち、この配
列の最も末端に位置する２つの塩基と、互いに連結する
ような位置にある２つの塩基のうち、連結する可能性の
ある塩基の組合せの末端塩基の一つは、検出可能な連結
が起きるために標的塩基に相補的でなければならない。

第１図に示されている標的塩基対＾−Ｔの右側にある塩
基対Ｇ−Ｃもまた標的塩基となり得る。この場合、５゛
隣接オリゴヌクレオチド（塩基Ｃ，ＯＮ−１）の一つの
うちの３゛末端ヌクレオチドは、（＋）テンプレート鎖
の標的塩基Ｇに相補的であり、３゛隣接オリゴヌクレオ
チド（塩基Ｇ、ＯＮ−４）の一つの５°末端ヌクレオチ
ドは、（−）テンプレート鎖の標的塩基Ｃに相補的であ
る。

さらに、最終的な連結部を含む隣接オリゴヌクレオチド
の末端にあるそれ以外の位置のヌクレオチドも、本発明
の実施の際の標的ヌクレオチドとして考えることができ
る。

第１図で見られるように、３°隣接オリゴヌクレオチド
ＯＮ−２はテンプレートの（＋）あるいは上の鎖に相補
的で、またその５°末端には（＋）鎖の標的塩基＾に相
補的な塩基Ｔを含み、隣接オリゴヌクレオチドの残りの
部分は５゛末端塩基から外側に向がって伸長するように
合成されている。５゛隣接オリゴヌクレオチドＯＮ−１
は、テンプレートの０）あるいは上の鎖に相補的となる
ように合成されており、また、その３゛末端Ｃの塩基が
、テンプレート上の標的塩基の３°側の（＋）鎖の塩基
に相補的となるように定められている。この隣接オリゴ
ヌクレオチドの残りの部分は、５゛方向へと外側に伸長
している。

５°隣接オリゴヌクレオチドＯＮ−３は、その３°末端
にある塩基＾が（−）鎖の標的塩基Ｔに相補的になり、
ＯＮ−３の残りの部分は標的塩基から外側に伸長するよ
うに、テンプレートの（−）または下の鎖に相補的にな
っている。３”隣接オリゴヌクレオチドＯＮ−４はテン
プレートの（−）あるいは下の鎖に相補的であり、ＯＮ
−４の５゛末端の塩基Ｇは標的塩基の５゛側にある（−
）鎖の塩基に相補的となるように定められている。　０
１１−４の残りの部分は、３゛方向へ２外側に伸長して
いる。したがって、ＯＮ−２の５°末端の塩基とＯＮ−
３の３゛末端は標的塩基対に相補的である。

二本鎖核酸テンプレートを用いる場合は、対称性から、
長さの相違を除いて、ＯＮ−２はＯＮ−３と相補的であ
ることが必要である。同様に、０１１−１は、長さの相
違を除けばＯＮ−４と相補的である。第１図に見られる
ように、ＯＮ−１はＯＮ−４と相補的である。したがっ
て、二本鎖の核酸テンプレートが用いられる場合は、そ
れに隣接するオリゴヌクレオチドには、例えば以下のよ
うな二本鎖を使うことが可能である。

Ｎ−１ ＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣＧＧＣ ＧＧＡＧＡＡＧＴ　　　３’ Ｎ−４ ５′ Ｎ−２ ３’　　ＴＧＡＧＧＡＣＴ ５’　　ＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＮ−３ こうした二本鎖オリゴヌクレオチドは、いかなる増幅連
結反応の前にも、鎖を分離するために、上述のように処
理しなければならない。

適当な温度およびアッセイ条件下では、正しい相補的な
標的塩基がテンプレートの標的部位に存在する場合にの
み、ポリヌクレオチドリガーゼはＯＮ−１と０１２及び
／又は０ト３とＯＮ−４をＯＮ−２とＯＮ−３の標的塩
基の位置に連結して、有意な盪の、より長い連結産物を
形成する０例えば、バタテリオファーシＴ４誘発ＯＮ＾
リガーゼや大腸菌ＯＮ＾リガーゼといった、どの様な適
当なポリヌクレオチドリガーゼも本発明の実施に用いる
ことが可能である。

増幅反応混合液に少なくとも２００ｍＭのＮａＣｌを含
有させることにより、はぼ完全に誤った連結が抑制され
ることが見いだされている。したがって、第１図に関し
て、もしテンプレートＤＮＡの標的部位が０ト２の５゛
末端あるいはＯＮ−３の３゛末端に相補的でないヌクレ
オチドを含むなら、ヌクレオチドの誤った対合により、
２２塩基長の産物を形成するようないずれの有意な連結
反応も妨げられるだろう。

そのため、そのような連結産物が存在しないことは、目
的の標的塩基が特定のテンプレート上に存在しないこと
を示している０例えば、もし第１図のテンプレートが標
的塩基部位で塩基＾とＴが交換している鎌型赤血球（β
３遺伝子なら、第１図に措かれたＯＮ−２／ＯＮ−１あ
るいは０１１−３／ＯＮ−４の連結は全くないだろう、
したがって、気体される２２ヌクレオチドの増幅連結産
物は形成されないだろう。

第２図に示された特定の隣接オリゴヌクレオチドに関し
ては、各々の対の２つのオリゴヌクレオチドが一つのオ
リゴヌクレオチド（ＯＮ−１あるいはＯト３）の３°末
端と他のもの（ＯＮ−ｓ２あるいはＯＮ−４）との５゛
末端が連結部を形成するように、隣接した位置でβグロ
ビンのテンプレートにアニールする。

テンプレート塩基上の標的ヌクレオチドは、（＋）鎖と
（−）鎖のどちらが連結のためのテンプレートとして働
くかによって、基質の３゛末端ヌクレオチドかあるいは
５゛末端ヌクレオチドとペアを形成する。

ある連結増幅法が成功したか、失敗したかは隣接オリゴ
ヌクレオチドを放射性あるいは蛍光標識を用いてＩ！議
する事によって検出できる６例えば、！ｔｐ、　＄３８
あるいはその他の適当な放射性核種は、フルオレッセイ
ン、ローダミンまたはその誘導物と同様に用いることが
できるだろう、連結増幅産物は、次に、長い連結産物と
短い前駆対とを識別できるような、ゲル電気泳動クロマ
トグラフィーあるいはハイブリダイゼーションなどの操
作によっても確認することができる０例えば、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いて、連結産物を隣接オリ
ゴヌクレオチド反応体から、その大きさにしたがって分
離することができる。これらの技術のいくつかは、以下
の実施例で詳細に述べられるだろう。

以下の実施例で説明されるように、本発明の末法にした
がって、本文で述べられた連結増幅が、−次的あるいは
対数的様式の下で行なわれることが可能である。対数的
連結−増幅の工程は第３図に示されている。実施例で用
いられている合成オリゴヌクレオチド基質およびテンプ
レートのＤＮＡ配列は、以下の第１表に記載されている
。

第１表 合成オリゴヌクレオチド基質およびテンプレートのＤＮ
Ａ配列 オリゴヌクレオチド　遺伝子 配列 ＯＮ−１ ＯＮ−ｉ２　　” ＯＮ−５２ ＯＮ−ａ３　　” ＯＮ−５３ ＯＮ−４ ■β１９Ａ ■β１９ｓ ■β２３＾。

β２３Ｓ” ５’ＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣ ５°ＴＣＡＧＧＡＧτ ５’ＡＣＡＧＧＡＧＴ ５’ＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧ＾ ５’ＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＴ βｓ５°ＧＧＡＧＡＡＧＴ ５’ＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧ＾＾にＴＣＴＧＣ５’ＣＴ
ＣＣＴＧＴＧＧＡＧ＾＾ＧＴＣＴＧＣ５’ＣＧＧＣＡＧ
ＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＨ５’ＣＧＧＣＡ
ＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣ０正常型βグロ
ビン遺伝子に対する基１７ＯＮ−ａ２、ＯＮ−ａ３は第
１図中のＯＮ−２およびＯＮ−３と同じである。

１１β１９Ｓと１１β１９＾はβグロビン遺伝子の非コ
ード鎖に相補的な、独特の１９ヌクレオチド長のオリゴ
ヌクレオチドであり、ＯＮ−１／ＯＮ−２対の連結のた
めのオリゴヌクレオチドテンプレートとして働く。

■β２３Ｓ”とＨβ２３＾°は２３ヌクレオチド長で、
βグロビン遺伝子のコード鎖に相補的である。これらの
２つのヌクレオチドは、ＯＮ−３／ＯＮ−４対の連結の
ためのテンプレートとして働く。

ＯＮ−１／ＯＮ−ｓ２およびＯＮ−１／ＯＮ−ａ２対の
どちらも、（＋）コード鎖とハイブリダイズするが、Ｏ
Ｎ−ｓ２とＯＮａ２はその５“末端の一つのヌクレオチ
ドで違っているだけであり、０トｓ２は鎌型赤血球対立
遺伝子を特定するものである。同様に、ＯＮ−ｓ３／Ｏ
Ｎ−４とＯＮａ３／ＯＮ−４対は非コード鎖にハイブリ
ダイズするが、ＯＮ−ｓ３とＯＮ−ａ３は３”末端で一
つのヌクレオチドでしか違わない。

βａ（正常型）あるいはβＳ（鎌型赤血球型）対立遺伝
子を検出するために、隣接オリゴヌクレオチド基質であ
るＯＮ−１／ＯＮ−ａ２およびＯＮ−ａ３／ＯＮ−４対
の少なくとも一つを含む組が、正常型βグロビン配列に
用いられ、ＯＮ−１／ＯＮ−ｓ２およびＯＮ−ｓ３／Ｏ
Ｎ−４対の少なくとも一つが鎌型赤血球型配列を検出す
るために用いられる。

以下に述べる連結増幅反応において、ＯＮ−１／ＯＮ２
あるいはＯＮ−３／ＯＮ−４対のテンプレート依存性の
連結は、他の基質対に相補的な配列を持つ２２塩基の産
物を形成する０例えば、ＯＮ−１−ＯＮ−ａ２産物はＯ
Ｎ−ａ３／ＯＮ−４基質に相補的となり、ＯＮ−ｓ３−
ＯＮ−４産物はＯＮ１／ＯＮ−ｓ２基質に相補的となる
だろう０本発明の一つの態様にしたがい、その連結産物
は、次に他方の対の隣接オリゴヌクレオチド基質の連結
のためのテンプレートとして役立ち、それにより、さら
に連結反応を行なうためのテンプレートをさらに生産す
ることができる。もし、初期の連結段階が塩基の誤った
対合の結果として起こらない場合、それに続く増幅段階
によって、検出可能な連結反応を示す信号を生ずること
はないだろう。

ひとたび２２ヌクレオチド長の連結産物が形成されると
、これはそのテンプレートとハイブリダイズしたままに
なっている。変性により、この２重鎖は分離し、２つの
新たなテンプレートが生ずる。

もし、変性を煮沸により行なえば反応混合液中のりガー
ゼは失活するだろう、したがって、次の増幅を開始する
ためには新たに酵素を添加しな（ではならない。

実施例１ もし他に指示されていなければ、オリゴヌクレオチドテ
ンプレート上の全てのオリゴデオキシリボヌクレオチド
連結反応は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７゜６
）、　１０−Ｍ　ＭｇＣｌア、ｌ−阿口丁丁（ジチオス
レイトール）。

１ｍＭ　ＡＴＰ、　２００ｍＭ　ＮａＣｌおよび５χＰ
ＥＧ　（ポリエチレングリコール）中で、５−１ＯμＨ
の各々のｉｔオリゴヌクレオチドを少量の放射性標識し
た３”オリゴヌクレオチド基質（１００，０００−３０
０，０００ｃｐｓ）と指示された壇のテンプレートと混
合することにより行なわれた。

プラスミドとゲノムＤＮＡテンプレートの反応は５！θ
分間煮沸し、氷上で冷却し、リガーゼ（１単位；ＢＲＬ
）を添加することにより開始される。もし他に指示され
ていなければ、全ての連結反応物は電気泳動のために回
収され、場合により、仔牛腸アルカリホスファターゼ（
１−５単位）で１−２時間処理された。

核酸配列の一次的増幅連結反応は、各回の増幅反応を行
なうごとに、ちととなった核酸テンプレート（オリゴ、
プラスミドあるいはゲノムＤＮＡ）を繰り返し用いるこ
とによって行なわれる。２重鎖プラスミド、あるいはゲ
ノムＤＮＡテンプレートの一方の鎖に対する、適当なオ
リゴヌクレオチドテンプレートに対して相補的な、一種
類の隣接オリゴヌクレオチドの組のみを用いる０例えば
、ＯＮ−１とＯＮ−２あるいはＯＮ−３とＯＮ−４の組
のいずれかが、反復的増幅に用いられるが、双方を用い
ることはない。

第２図に示されているヒト鎌型赤血球（β５βグロビン
遺伝子の５′鎖の配列を一次的に増幅するために、１ｍ
Ｍ　ＯＮ−１，１ａＭ　５’リン酸化ＯＮ−ａ２．０．
１ｐｍｏ１のβ’　ＩＩβ１９ｓ）テンプレートをさら
に含むような、上述の反応混合液が調製された。もし、
二本鎖テンプレートを用いる場合は、反応混合液を約９
０−１００°Ｃで１０分間煮沸することによってこれを
変性させなければならない。

各回の連結反応の開始は、氷上に置かれた反応混合液に
１単位のりガーゼを添加することにより行う、この混合
液を３０℃で約３０分間保温するが、テンプレート濃度
が低い場合はさらに長時間保温する。

反応の初回、並びにその後反復される全ての回の反応は
、リガーゼを不活性化し、連結された産物（ＯＮ−１−
ＯＮ−２）をテンプレートから解離させるために、反応
混合液を直ちに１００℃で５分間加熱することにより停
止される。この操作により、このテンプレートは解離さ
れ、以後の増幅反応に用いられることが可能となる０次
の反応の前に、この反応混合液を１０秒間遠心し、直ち
に約０℃に冷却する。この時点で、各々のテンプレート
ｌコピーに対して、はぼ一つのＯＮ−１−ＯＮ−２連結
産物が存在している。

第２回目の連結反応を開始するために、もう１単位の酵
素を反応混合液に添加する。隣接オリゴヌクレオチドで
ある０ト１とＯＮ−２を、初めの反応混合液に１Ｍ過剰
に加えであるため、それ以上の隣接オリゴヌクレオチド
基質は加えない、その後、この反応混合液を、初回と同
様に保温し、テンプレートを連結反応産物から解離する
ために煮沸し、冷却する。この時点で、各々のテンプレ
ートｌコピーに対して、はぼ２つのＯＮ−１−ＯＮ−２
連結産物が存在している。

さらに反応を反復する際には、新たな酵素を添加する。

保温、テンプレートを産物から解離するための煮沸、冷
却、および新たな酵素の添加という段階は、検出可能な
信号が生ずるのに必要な回数だけ反復される。

ＯＮ−１−ＯＮ−２連結反応産物の検出は、い（つかの
方法により行なうことができる。　ＯＮ−１および／ま
たは０ト２は、放射活性あるいは非放射活性標識を用い
て標識が可能であり、ゲル電気泳動により反応物から分
離することができ、連結反応産物は予想された産物のサ
イズに対応するゲル中の位置の標識の存在を検出するこ
とにより決定される。

ＯＮ−ａ２．ＯＮ−ｓ２と０ト４は、キナーゼ反応によ
り、放射性（ｒ　［”Ｐ］＾ＴＰ　６０００　Ｃｉ／ｓ
ａ＋ｏｌＨニューイングランド・ヌクレアー）あるいは
非放射性のＡＴＰで、その５°末端がリン酸化されてい
る。５゛がリン酸化された標識されていない基質は、キ
ナーゼを失活させるために２０分間沸騰湯浴中で加熱し
た後に用いる。放射性リン酸により内部標識されたオリ
ゴヌクレオチド産物は、陰イオン交換クロマトグラフィ
ー（ＤＩ！−５２セルロース−ワットマン）により、未
反応のＡＴＰおよびその他の反応産物から分離される。

放射性リン酸化反応により、約１０’−１０”ｃｐｓ／
ｐｍｏｌＯ比活性を持つ産物が得られる。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動による連結反応産物の
検出と定量は、連結反応から取られた試料をフィコール
・ローディング緩衝液と混合し、この混合液を、ＴＨＥ
（８９ｍＭ↑ｒｉｓ、　８９ｍＭホウ素、２■Ｍ　ＥＤ
Ｔ＾）を用いた、２０χポリアクリルアミド（バイオ−
ラッド）、尿素（７Ｍ）ゲルで、６００ｖ、１　、５　
時間電気泳動にかけることにより行なわれる０次に、こ
のゲルをサラン・ラップに包み、２枚のライトニング・
プラス増感スクリーン（デュポン）の間に挟み、−夜オ
ートラジオグラフにかける。連結反応産物の定量は、オ
ートラジオグラムをデンシトメトリーで測定するか、あ
るいはＡＭＢＩＳラジオアイソトープ・スキャニング・
システムＩｔ（（有）オートメイテッド・マイクロバイ
オロジー・システム）を用いて、直接ゲルから得られる
。後者の場合、ポリアクリルアミドゲルはまず５χの酢
酸溶液で１０分間固定される。

ＯＮ−１−ＯＮ−２連結反応産物は、この産物を含む溶
液を、ＯＮ−１−ＯＮ−２連結反応産物は下記の固定化
相補的配列にハイブリダイズするが、ＯＮ４，ＯＮ−２
はいずれもハイブリダイズしないような条件下で、固定
化された相補的ＯＮ＾あるいはＲＮＡ配列を含む基質に
ハイブリダイズする事によっても検出することができる
。結合した標識は連結反応産物の存在を示す、この連結
反応産物は、放射性１ａ識を施した１＆ｌｌの対応基質
（０！ｌｌ−３１０１１−４）を用いて、次段階の連結
反応において検出することも可能である。

連結したＯＮ−３１０Ｐ−４を検出すべき場合には、標
識したＯＮ−１／ＯＮ−２が用いられるだろう。

−次的増幅一連結反応をＮ−回反復した後の産物のレベ
ルは、口を連結反応の効率とすると、ＮＸＱに等しい、
Ｑの範囲は、０から１であり、ｌは１００χ連結反応が
起こったことを示す。

実施例２ ＯＮ−１／ＯＮ−ｓ２°およびＯＮ−ｓ３／ＯＮ−４”
は、上述の方法論を用いてオリゴヌクレオチドテンプレ
ートに一次的に連結された。　ＯＮ−ｓ２°とＯＮ−ｓ
４°は　、その長さが６ヌクレオチド長しかないことを
除いては、ＯＮ−ｓ２とＯＮ−４と同じである。　１０
ｐｓｏｌの！ｆｆ１Ｐ−５゛リン酸化ＯＮ−ｓ２”と非
標識の５’０１ｌ−ＯＮ−１（レーンａ−ｄ）、あるい
は！！ｐ−５°リン酸化ＯＮ−４”と非標識の５’０Ｈ
−ＯＮ−ｓ３（レーンｅ−ｈ）は、各々１９塩基長ある
いは２３塩基長のオリゴヌクレオチドテンプレートに対
し、１０容盪の反応系で、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
とともに３０℃で３０分間反応して連結される。第４図
は以下に述べられた連結増幅反応の結果を示している。

レーンａとｅの試料は酵素処理を行なっておらず、レー
ンｂとｆの試料はテンプレートが除がれており、陰性の
対照である。テンプレートには以下のオリゴヌクレオチ
ドテンブレー）１ｐ醜Ｏ１が用し１られた：Ｈβ１９ｓ
（ｃ）；　Ｈβ１９＾（ｄ）；Ｉｆβ２３Ｓ’（ｇ）；
　＋ｔβ２３＾”（ｈ）。

第４図に見られるように、鎌型赤血球テンプレートおよ
び鎌型赤血球基質を含む期待された連結反応が起き（レ
ーンＣおよびｇ）、正常型（＾）βグロビン基質の連結
反応は鎌型赤血球テンプレート上では起こらなかった（
レーンｄおよびｈ）。

実施例３ 本発明の末法は、核酸配列を対数的に増幅するためにも
利用可能である。対数的増幅連結反応と上述の一次的増
幅連結反応の主な相違点は、４種類の隣接オリゴヌクレ
オチド（ＯＮ−１／ＯＮ−２およびＯＮ３／ＯＮ−４）
の全てが、反復される各回の反応の間、基質として存在
することである。いずれの隣接オリゴヌクレオチド組の
連結反応産物も、第３図に示されるように、以後反復さ
れる増幅反応において、他の隣接オリゴヌクレオチド組
のためのテンプレートとして働くのである。

検出するための放射性標識を施した基質は、開始材料に
加えることも可能であり、また最終回の反応を行なう際
に添加することもできる。

−次的増幅反応でも同様であるが、検出可能な信号を生
ずるのに必要とされる増幅反応の反復回数の推定は、対
数的増幅反応を行なう前にもなされなければならない、
Ｎ回反復後、口を連結反応の効率とすると、反応産物の
形成は、（１＋Ｑ）Ｎ−１に等しい、以下の表は、各々
の反応サイクルが１００χの効率であると仮定した場合
にＮサイクル後に存在する連結反応産物の相対量を示し
ている。

回数 増幅倍率 ３２、　７６７ ２、　０９７．　１４１ ３３、　５５４．　４３１ 例えば、もしある比活性の下で１０１倍の産物の増幅が
求められるなら、連結反応の効率を１００χと仮定する
と、増幅反応を約２０回反復することが必要である（２
■Ｌｉ１Ｏ番）。

はぼ完全な連結反応効率は、初期のテンプレート源が隣
接オリゴヌクレオチド産物と連結する、後半の反復反応
において出現する。初期の反復反応では、連結反応の効
率は、反応条件すなわち、用いたりガーゼの種類やテン
プレートの由来に依存してやや低いかも知れない。

反復される各回の対数的連結反応は、氷上の反応混合液
に１単位の酵素を添加することにより開始される。初め
およびその後反復される増幅反応の各々において、酵素
を添加した反応混合液は、３０℃で約３０分間、あるい
はもしテンプレート濃度が低い場合は、さらに長時間保
温される。各々の反応の最後に、酵素を不活性化し、産
物の鎖をテンプレート鎖から解離させるために、反応混
合液を直ちに沸騰温度に５分間おく０次いで、この反応
混合液を１０秒間遠心し、直ちに約０℃に冷却する。

２回目の連結反応を開始するために、もう１単位の酵素
を反応混合液に添加する。その後、この反応混合液を、
上述のように保温、煮沸し、冷却する。この時点で、反
応開始時に存在した各々のテンブレー）（１コピー）に
対して、はぼ３倍のテンプレート（３コピー）があるこ
とになる、以後反復される増幅反応は、検出可能な信号
が生ずるのに必要な回数だけ、同様な手順で行なわれる
。

増幅反応の進度は、予めきめた回の反応の間に、反応混
合液から約１Ｏ１１１を採取する事によって監視するこ
とができるだろう、採取された反応液は、熱により不活
性化し、次いで２から３ｉ１１のローディング緩衝液と
混合される。その後、この緩衝化された混合液２１１１
を２０χポリアクリルアミドゲルにのせ、このゲルを６
００ｖで１時間電気泳動し、２枚のデュポン・ライトニ
ング−プラス増感スクリーンとともに一夜オートラジオ
グラフィーする。

末法、および実施例１で述べた反応混合液を用いて、６
．６７ｎＭのオリゴヌクレオチドテンプレートＨβ２３
炉およびＨβ２３Ａ°が、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと、２．
３３μ−の各々の隣接オリゴヌクレオチド基質である！
ｔｐ−５’標識ＯＮ−ｓ２（１０’ｃｐｍ）；　”Ｐ−
５°標識ＯＮ−４（１０’ｃｐｍ）；　５０ｆｆ−ＯＮ
−１；および５’　０Ｈ−ＯＮ−β３によって増幅され
た。毎回の反応を開始するために、１単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼが用いられた。６回の連結増幅反応が行なわれ
た。

第５八図は、各々のテンプレートについて毎回の反応を
監視した結果を示したオートラジオグラムである。２−
６回の反応においては、連結反応は鎌型赤血球配列を含
むＨβ２３Ｓ゛テンプレートに特異的なものであった。

隣接オリゴヌクレオチドｉｆｆは、■β２３＾°テンプ
レートの存在下では連結されることができなかった。

対数的連結反応法の産物は、毎回の反応でほぼ倍加する
。第５Ｂ図は、増幅率を連結増幅反応の回数に対する関
数として対数軸にプロットしたものを示している。直線
が得られ、０．９８という値が効率として得られた。し
たがって、各回において、前回の連結反応産物が、以後
のオリゴヌクレオチド連結反応のためのテンプレートと
して効果的に働いている。

本発明の末法は、以下の実施例で説明されるように、プ
ラスミドおよびゲノムＤＮＡ配列の検出に用いることも
できる。

実施例４ 増幅連結反応のためのテンプレートは、各々約４．４ｋ
ｂｐの正常型（β１および鎌型赤血球（β１βグロビン
遺伝子の挿入を含む、ｐＨβ拳およびｐＨβ＄プラスミ
ドから由来したものである。全てのＯＮへの調製は、Ｔ
ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００変法にしたがい、続いてプロテ
イナーゼにおよびＲＮａｓｅ処理によって行なわれた。

プラスミドＤＮＡは、以下のようにして、連結反応にお
けるテンプレートとして用いるに先立ち、制限酵素（Ｒ
ａｍ旧および／またはＴａｑ　１）とエクソヌクレアー
ゼｌ１ｌ（Ｅｘｏｌｌ）によって処理された：ｐＨβ１
およびＰＨβゝは、別々にＢａ−旧（５単位／ｐｓ＋ｏ
ｌ）によって３７℃で２時間消化し、５分間沸騰湯浴中
で反応を停止した０次に、Ｅｇｏ　ｍ　（１００単位／
ｐ−ｏｌ）を終濃度ｌ−となるよう、ＤＴＴとともに反
応混合液に加えた。この混合液を３７°Ｃで４時間保温
した。最終的な精製のためにフェノール−クロロホルム
抽出を行なった。

反応の結果生ずる２種のテンブレー）　（ｐＨβ３およ
びｐＨβ″）の各々について１ＢＭを、Ｔ４Ｄｌｌ＾リ
ガーゼと、各反応系の総容量が１００ｕｆであることを
除いては、実施例Ｉおよび実施例３に述べられている反
応混合液および方法にしたがって、対数的に増幅させた
。以下の隣接オリゴヌクレオチド基質、すなわち、３ｆ
ｆｉｐ−５’標識ＯＮ−β２（１０’″ＣＰ−）；　”
Ｐ−５’標ｉ。

Ｎ−４（１０’ｃｐｓ）；　５’０Ｈ−ＯＮ−１；およ
び５’　０Ｈ−ＯＮ−β３、各５００ｎＭが用いられた
。　１０，１２．１４回の増幅反応後、反応混合液から
４１１１が採取され、電気泳動およびオートラジオグラ
フィーによって分析された。

第６図は、この連結増幅反応の結果を示したものである
。レーンａ−ｃの産物は、テンプレートを含まない反応
から得られたものであり、レーンｄｆの産物は、ｐ■β
ゝテンプレートを含む反応から得られたものであり、レ
ーンｇ−ｉの産物はｐＨβ１テンプレートを含む反応か
ら得られたものである。し−ンａ、ｄおよびｇの反応産
物は、１０回の反応後採取、分析され、レーンｂ、ｅお
よびｈの産物は、１２回の反応後分析され、レーンｃ、
ｆおよびｉの産物は、１４回の反応後、分析されたもの
である。

正常型のβグロビン配列（トｉ）を含むｐｕβ１を含む
反応あるいはテンプレートを含まないレーン（ａＣ）で
は、連結反応産物が全く検出されない、　ｐＨ８３鎌型
赤血球テンプレートは有意に増幅され、検出可能な信号
が１０（レーンｄ）　、　１２　（レーンｅ）　、　１
４（レーンｆ）回の増幅反応の間で顕著に増加している
。

この反応で用いられる１ｗＭのプラスミドテンプレート
に対して、約１０回の連結増幅反応が約５０倍の増幅に
当たる検出可能な信号を生ずるために必要である。対照
的に、同じ濃度のオリゴヌクレオチドテンプレートを増
幅し、同倍率の増幅を得るためには、３−６回の増幅反
応しか必要ではない。

実施例５ 正常型（β１／β′″）、鎌型赤血球貧血病（β１／β
寥）、鎌型赤血球貧血症（βａ／βＳ）のゲノムＤＮＡ
試料は、適当な供与者の血液標品から単離された。β血
友病の主要ＯＮ＾はＥＢＶで形質転換した白血球培養細
胞（ＮＩＧＭＳヒユーマン・ゲネティック・ミュータン
ト・セル・レボジトリ−（Ｈｕｓ＋ａｎ　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　Ｍｕｔａｎｔ　ＣｅＩｆ　ＲｅｐｏｓｉＬｏｒｙ）
、カムデン、ニューシャーシー州からのＧＭ　２２６７
細胞）から調製された。続いて、血友病ＯＮ＾は培養細
胞から単層された。全てのＤＮＡの調製は、Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１００変法にしたがい、続いてブロテイナーゼ
におよびＲＮａｓｅ処理によって行なわれた。

ゲノムＤＮＡ（５ｐｇ）は丁ａｑ　ｌ制限酵素（１０単
位／＃ｇ）（ベーリンガー・マンハイム）により６５℃
で一夜消化し、その後、Ｂａｇ　Ｈｌ（１０単位／Ｉｔ
ｇ）（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−）により３７
℃で８時間消化した。その後、終濃度１＠Ｍの［ｌＴＴ
とともにＥｘｏｌｌｌヌクレアーゼ（１００単位／ｐｏ
ｏりを反応混合液に添加し、これを３７°Ｃで５時間保
温した。最終的な精製のために、フェノール−クロロホ
ルム抽出を行なった。

ゲノムＯＮ＾およびプラスミドＤＮＡの連結反応の条件
は、ゲノムＤＮＡ試料の反応系の総容量が２００．１で
あることを除けば同一である。

β血友病、鎌型赤血球貧血病由来のゲノムＤＮＡおよび
正常型［ＩＮ＾は、２００ｎＨの以下の組合せの隣接オ
リゴヌクレオチドを用いて増幅された。　３２ｐ−５’
標識ＯＮ−β２（ｌｏ”ｃｐｍ）／”Ｐ−５’標識ＯＮ
−４（ｌｏ’ｃｐｍ）１５’０１１−ＯＮ−１１５’　
０１１−ＯＮ−β３；　および３１ｐ−５−標識ＯＮ−
２（１０’ｃｐ値）／”Ｐ−５°標識ＯＮ−４（１０’
ｃｐｍ）１５°０１ｌ−ＯＮ−１１５’　０Ｈ−ＯＮ−
３゜ ゲノムＤＮＡ５ｐｇは約５００．０００分子の同型接合
型の単一コピーの遺伝子を含んでいる。２００ｙｊの反
応混合液中でテンプレートとして用いた場合、５＃ｇの
ＤＮＡはテンプレートにして、２．５Ｘ１０−”Ｈに相
当する。この濃度は、連結反応のテンプレートとしては
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの見かけ上のに−より充分に低い
ものである。したがって、この酵素の活性は、かなり低
いものと予セされる。この反応論的制限を克服するため
、連結反応を行なう初期の回は、より長時間保温された
。初回の連結反応時間は５時間だった。以後の回では、
保温時間を徐々に３０分までに短縮していった。　（１
−５回−５時間：　６−１０同一４時間；　１１−１５
回−３時間：　１６−２０回−２時間：　２０−３０同
一！時間：３０回以上−３０分間、）シかし、各回は、
平滑末端産物の蓄積を避けるため、５時間を越えないよ
うにした。

第７八図および第７Ｂ図はこれらのテンプレートと隣接
基質を用いて対数的増幅反応を７０−７５回行なった結
果を示している。第７Ａ図はβ３隣接オリゴヌクレオチ
ド組から得られた増幅反応産物を含み、第７ｎ図はβ１
隣接オリゴヌクレオチド組から得られた増幅反応産物を
含んでいる。各々のオートラジオダラムの、レーンａお
よびｂは、β血友病ゲノムＤＮＡテンプレートを用いた
反応産物を含み、レーンＣおよびｄは鎌型赤血球貧血病
ゲノムＤＮＡテンプレートからの産物を含み、レーンｅ
およびｒは正常型βグロビンゲノムＤＮＡテンプレート
を用いた産物を含んでいる。レーンａ、ｃおよびｅのテ
ンプレートは、７０回増幅されたものであり、レーンｂ
、ｄおよびｆのテンプレートは、７５回増幅されたもの
である。予期された産物のバンドが、第７八図（鎌型赤
血球貧血病テンプレートおよび隣接オリゴヌクレオチド
）のレーンＣおよびｄに現れ、第７Ｒ図（正常型βグロ
ビンテンプレートおよび隣接オリゴヌクレオチド）のレ
ーンｅおよびｆに現れている。β血友病りに＾（レーン
ａおよびｂ）！びに誤った対合を行なったゲノムＤＮＡ
および基質は、いずれも信号がないことが示された。

したがって、この実施例は本発明の連結増幅反応法が鎌
型赤血球貧血病に対するゲノムＤＮＡ配列における診断
法として用いることが回部であることを示している。

実施例６ β血友病、鎌型赤血球貧血病および正常型ゲノムＤＮＡ
５＃ｇを、実施例４および実施例５に記載されてし）る
ように、Ｂａ−旧／Ｔａｑ　１およびＥｘｏ　ｍヌクレ
アーゼにより各々消化した。−次的増幅は、実施例１に
記載されているように行なわれた。使用された隣接オリ
ゴヌクレオチドは、Ｔ４キナーゼによる標識反応からＤ
Ｅ−５２クロマトグラフイーによるそれ以上精製を行な
わずに、直接用いられた１１００ｆ。

ｌの１２Ｐ−５＝標識ＯＮ−β２と１００１００ｆのＯ
Ｎ−１であった。

隣接オリゴヌクレオチドは別々に、総１１０　ｔｓｌの
容量の反応系内で、２００＠Ｍ　ＮａＣｌ，と０．５単
位のＴ４１１Ｎ＾リガーゼ存在の下で、３種類のテンプ
レートと組み合わせた０反応混合液は３０℃で３時間保
温し、煮沸することによって反応は停止された。２回目
の増幅反応は、さらに０．５単位の酵素を添加すること
によって開始された。この反応液は再び３時間保温され
た。３回の連結増幅反応が行なわれた。

その後、生じた産物は上述のように電気泳動し、オート
ラジオグラフされた。

第８図はその結果のオートラジオグラムを示している。

レーンａはβ血友病テンプレートを用いた反応産物を含
み、レーンｂは鎌型赤血球貧血病テンプレートを用いた
反応産物を含み、またレーンＣは、正常型βグロビンテ
ンプレートを用いた反応産物を含んでいる。陽性の対照
としては、０゜０１、１．１ｏｆｓｓｏｌのＨβ１９Ｓ
テンプレート（各々レーンｄ−ｒ＞を用いて行なった。

レーンｂは、予期された産物を示し、一方レーンａとＣ
は、予期されたように産物がないことを示している。

本発明の末法は、ポリメラーゼ連鎖反応のような、他の
核酸増幅性由来の増幅反応産物の検出手段としても用い
ることが可能である。

実施例７ 増幅反応は、２．５単位のサーマス・アクアティカスの
ＤＮＡポリメラーゼおよび、２５６ヌクレオチド離れた
位置でβグロビン遺伝子にアニールする１９塩基長の二
つの合成オリゴヌクレオチドである、オリゴヌクレオチ
ド・プライマーＢＧＰＩおよびＢＧＰ２ヲ２．５μガ含
む、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション′キ７）　
（Ｐｏｌｙａｘｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ　１ｌｉｔ）（シーン・アンプ・キット、パーキン
−エルマー・シータス（Ｇｅｎｅ＾−ｐ　Ｗｉｔ、　Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ））を用いて行な
った。ａＷＭされた２９４塩基対の断片は、目的とする
βグロビンの配列を含んでいる。

以下のゲノムＤＮＡ２＃ｇは上述の通り処理した後にテ
ンプレートとして用いられた：β血友病、同型接合型鎌
型赤血球貧血病（β゛／βｓ）、正常型βグロビン（β
為／β１）および異型接合型鎌型赤血球貧血症（β１／
β’）　、　３０回の増幅反応により、標的配列が約５
Ｘ１０’倍にまで増幅された。　ＰＣＲによって４縮さ
れたゲノムＤＮＡ配列から１０ｐｌ採取したものは、１
．５χのアガロースゲルで５時間６０Ｖ電気泳動した。

電気泳動によって分なされた産物は、次にサザン（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　
９８：５０３−５１７（１９７５））ノ方法にしたがッ
テ、２０ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ＝１５０ｍＭＮａＣｌお
よび１５鴎阿クエン酸ナトリウム）を用いてシーントラ
ンφナイロン膜（Ｇｅｎｅｔｒａｎ　ｎｙｌｏｎ　ｓｅ
ｓ＋ｂｒａｎｅ）に転写された。

このシーントラン・ナイロン膜は、５ＸＳＳＰＥ（ＩＸ
ＳＳＰＥ＝　ｌｏｍＭ　’）　７酸す）　ＩＪウムｐｌ
＋７．０．　Ｏ，１８？ｌ　ＮａｃＩおよび１ｓＭ　Ｅ
ＤＴＡ）、　ｌχＨａ口ｏｄｓｏ４．　ｌＯ＃ｇ／ｍｌ
のホモミックス（Ｈｏｓｏｓｉｘ）ＲＮＡおよび、ｌｏ
’ｃｐ−／ｍｌの放射性標識したオリゴヌクレオチド中
で、１０倍過剰量の非標識の競合物とともに、４７℃で
２時間、ｍａｐ５”標識オリゴヌクレオチドプローブＨ
Ｂ１９ＳあるいはｌｌＢ１９Ａに直接ハイブリダイズさ
れた。この膜は、まず６　Ｘ　ＳＳＣで３０分間、３回
、室温で洗われた。それに続＜　Ｔｌ’１ＡＣ１溶液中
での５９℃１時間の洗浄により、全ての誤ったパイプリ
ダイゼーションが除かれた。

（ＴＭ八へ１＝　５０＊Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０，
３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、２蒙Ｍ　ＥＤＴ＾
、　０．２５χ５ＤＳ）。

その後、対数的連結増幅反応が、反応液の総容量１０ｏ
ａｆｆｉ中で、Ｔ４ＯＮ＾リガーゼを用いて、２００ｎ
ＭのβＳ基￥ｔ（ＯＮ−１／ＯＮａ２およびＯＮ−ｓ３
／ＯＮ−４）あるいは、２００ｎＭのβ１基質（ＯＮ−
１／ＯＮ−ｓ２あるいはＯＮ−ａ３／ＯＮ−４）を用い
て、ＰＣＲにより濃縮された配列試料２０ｔｔｌについ
て４回行なわれた。各試料の５０４が、２０χポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって分析された。

１．５χアガロースゲルの臭化エチジウム染色により、
単一の２９４塩基対のバンドが示される（第９Ａ図。

レーンｃ−ｅ）、第９Ａ図のレーンは、（ａ）一対照、
（ｂ）β血友病、（ｃ）−同型接合型鎌型赤血球貧血病
、（ｄ）−正常型βグロビン、（ｅ）−異型接合型鎌型
赤血球貧血症である。血友病ＤＮＡのＰＧＩ１による増
幅反応（Ａ面、レーンｂ）では、いくつかの非特異的Ｏ
Ｎ＾のバンドは増幅されるが、２９４塩基対のバンドは
見えない。

シーントラン・ナイロンフィルター膜上に固定化された
ＰＣＲＩ縮試料（第９Ａ図のレーンｂ−ｅの試料、第９
Ｂ図のレーン１−４に対応する）のオリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーション分析は、濃縮されたＤＮＡが、
目的とするβグロビン配列を含んでいることを確証して
いる（第９Ｂ図）、ノザリら（Ｎｏｚａｒｉ。

Ｇ、）、Ｇｅｎｅ　４３：２３（１９８６）および、１
９８７年７月８日提出の、ｐ、ブルース・ウォーレス（
Ｒ，Ｂｒｕｃｅ　Ｗａｌｌａｃｅ）の特許出願第０７１
，２１０号明細書に記載されているように、放射性標識
された１１９ｓと非標識のＩＩ／？１９＾（第９Ｂ図、
ａ面）あるいは、標識されたＨβ１９Ａと非標識のＨβ
１９５（第９８図、ｂ面）を用いた、このフィルターの
競合ハイブリダイゼーシ目ンは、鎌型赤血球貧血病（β
″／β３．　第９Ｂ図、レーン２．　ａ面）、正常型（
β１／β１．　第９Ｂ図、レーン３．２面）および鎌型
赤血球貧血ｑ（β１／β１．第９Ｂ図、レーン４．　ａ
・およびｂ面）ＤＮＡを正しく認識した。

ＰＧＩ１により濃縮された２５６塩基対断片は、それら
がリガーゼの反応論的制限（すなわち、テンプレートに
対する高いに■）を克服するほど相対的に豊富に存在す
るため、ライゲーション分析において理想的に働く、β
責第９Ｃ図、レーンａ−ｄ）隣接オリゴヌクレオチド基
質を用いた、これらの２９４塩基対のテンプレートにつ
いて行なわれた連結増幅反応は（第９Ｃ図のテンプレー
ト：ａ、ｅ−β血友病：ｂ、ｆ−同型接合型鎌型赤血球
貧血病：　Ｃ，ｇ−正常型βグロビン、　ｄ、ｈ−異型
接合型鎌型赤血球貧血症）は、鎌型赤血球貧血病試料お
よび鎌型赤血球貧血症試料に対し陽性を示したく第９Ｃ
図、レーンｂおよびｄ）。

β１隣接オリゴヌクレオチド基質を用いた連結増幅反応
（第９Ｃ図、レーンｅ−ｈ）は、同様に正常型試料およ
び鎌型赤血球貧血症試料に対して陽性である（第９Ｃ図
、レーンｇおよびｈ）。

この実施例は、連結増幅反応が、他の配列増幅技術と併
用した検出法として用いることができることを示してい
る。

分子生物学およびその関連分野の当業者にとって明かな
、本発明に関する上に記載した態様に対するその他の修
飾は、以下に記載の特許請求の範囲の範囲内にあること
が意図されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、鎌型赤血球貧血病に関連した対立塩基対［Ｉ
Ｎへの多様性が見られる領域における、正常なヒト（β
′１）βグロビン遺伝子の３５塩基対長のテンプレート
および、連結増幅反応に用いる正常なβグロビン対立遺
伝子に相補的な４種のオリゴデオキシリボヌクレオチド
基質ストランドを表わす図である。 第２図は、鎌型赤血球貧血病に関連した対立塩基対ＤＮ
Ａの多様性が見られる領域における、正常なヒト（βＳ
）βグロビン遺伝子の３５塩基対長のテンプレートおよ
び、連結増幅反応に用いる鎌型赤血球の対立遺伝子に相
補的な４種のオリゴデオキシリボヌクレオチド基質スト
ランドを表わす図である。 第３図は、テンプレートを用いた対数的連結増幅反応の
模式的な工程図である。 第４図は、鎌型赤血球（レーンＣおよびｇ）と正常βグ
ロビン（レーンｄおよびｈ）のオリゴヌクレオチドテン
プレート上の、β８に隣接したオリゴヌクレオチド基質
の一次的増幅連結物のオートラジオグラムの写真である
。 第５Ａ図は、鎌型赤血球（Ｈβ２３Ｓ’　）と正常細胞
（■β２３Ａ’）のオリゴヌクレオチドテンプレートを
用いて、鎌型赤血球遺伝子配列に相補的にデザインされ
た、隣接オリゴヌクレオチド基質の対数的増幅連結を６
回行なった反応産物のオートラジオグラムの写真である
。 第５Ｂ図は、対数的増幅連結が行なわれた回数に対して
増幅率を対数軸にプロットしたものを示すグラフである
。 第６図は、正常（レーンｇ−ｉ）および鎌型赤血球（レ
ーンｄ−ｆ）のβグロビン遺伝子を含むプラスミドから
得たテンプレートを用い、夫々第１図および第２図に示
す鎌型赤血球βグロビン遺伝子配列および正常型βグロ
ビン遺伝子配列に相補的にデザインされた隣接オリゴヌ
クレオチド基質を用いてｔｏ−１４回の対数的連結増幅
反応を行なった、連結増殖産物を含むオートラジオグラ
ムの写真である。 第７図は、β−血友病（レーンａ、ｂ）、鎌型赤血球（
レーンｃ、　ｄ）および正常型βグロビン（レーンｅ、
［）ＤＮＡテンプレートを用いて、ヒトのゲノムＤＮＡ
を増幅した結果のオートラジオグラムの写真であって、
第７八図は、β１隣接オリゴヌクレオチドとの連結から
得られたものであり、第７Ｂ図は、β１隣接オリゴヌク
レオチドから得られたものの結果のオートラジオグラム
の写真である。 第８図は、β１隣接オリゴヌクレオチドとβ−唾友病（
レーンａ）、鎌型赤血球（レーンｂ）、正常型βグロビ
ン（レーンＣ）および対照（レーンｄ４）からのヒトゲ
ノムＤＮＡテンプレートとを用いた一次的連結増幅反応
産物のオートラジオグラムの写真である。 第９図は実施例７の結果を示す写真であって、第９Ａ図
は、ヒトβグロビン遺伝子の対立遺伝子の、１）■で増
幅された２９４塩基対の断片を含む臭化エナジウムで染
色したアガロースゲルの写真であり、第９８（ａ）図お
よび第９８　（ｂ）図は、第９Ａ図のゲルからナイロン
膜に転移さゼ、放射性標識をしたＨβ１９Ｓ（パネルａ
）と放射性標識をしたＨβ１９＾（パネルｂ）プローブ
とハイブリダイゼーションしたＰＣＲ産物のオートラジ
オグラムの写真であり、そして第９Ｃ図は、ＰＣＲによ
り濃縮された配列を基質として用いた連結増幅反応産物
のオートラジオグラムの写真である。 代理人　　　弁理士　　湯銭　恭三、、（’、Ａ４名）
ＦＩＧ、　３ ＦＪＧ、５Ａ ブ、・プし一ト ＦＪＧ、５Ｂ マ ！ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、８ ａ ＦＪＧ、９Ａ ＦＩＧ、９Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、核酸テンプレート試料中に含まれる、各々の核酸が
   一本鎖あるいは別々の相補的鎖からなる、少なくとも一
   種の特定の核酸配列における塩基または塩基対の相違を
   検出する方法であって、該鎖を各組が二つの比較的短い
   オリゴヌクレオチド基質からなる二組のうちの少なくと
   も一組で処理することよりなり、 該組は、（ｉ）少なくとも一方の鎖のテンプレート配列
   の少なくとも一部分と相補的であり、したがって該部分
   にハイブリダイズし、そして（ｉｉ）該特定の核酸配列
   に含まれる指定された標的塩基の両側に隣接するが、そ
   の際、各々の組のオリゴヌクレオチド中の二つの短いオ
   リゴヌクレオチドの一方がその一つの末端に、該テンプ
   レートの標的塩基の一つに相補的な塩基を一個含むよう
   な組であり、そして 上記の処理の条件は、もしテンプレート中に標的塩基が
   存在すれば、該標的塩基の一つに相補的な相補的オリゴ
   ヌクレオチドの一つの末端塩基と、同じ組のもう一方の
   相補的オリゴヌクレオチドの末端塩基との間で連結が起
   きることにより、各々の組中の二つの短いオリゴヌクレ
   オチドが相互に連結するような反応条件である、上記方
   法。 ２、該核酸テンプレートがＤＮＡである、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３、該核酸テンプレートがＲＮＡである、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ４、該テンプレート鎖と該基質とを処理するに先立ち、
   逆転写酵素を用いた処理により、該ＲＮＡがＤＮＡに複
   写される特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、該テンプレートが二本鎖であり、その鎖が該鎖と該
   テンプレートを処理するに先立ち、変性により分離され
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、最終的な連結反応産物の３’末端を含む、該ヌクレ
   オチド対のいずれのオリゴヌクレオチドもが、その５’
   末端でリン酸化されている、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ７、該標的塩基あるいは該標的塩基対の欠失あるいは突
   然変異が遺伝病を生起する、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ８、該遺伝病が鎌型赤血球貧血症である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ９、該オリゴヌクレオチド対がＯＮ−１／ＯＮ−２、Ｏ
   Ｎ−３／ＯＮ−４またはＯＮ／１／ＯＮ−ｓ２およびＯ
   Ｎ−ｓ３／ＯＮ−４である、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 １０、該オリゴヌクレオチド対の、少なくとも一方のオ
   リゴヌクレオチドが放射性標識されている特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 １１、該基質処理のための反応混合液が、少なくとも２
   ００ｍＭのＮａＣｌを含む、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 １２、該連結反応が、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび大腸菌
   ＤＮＡリガーゼからなるグループから選択された酵素を
   用いて行なわれる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３、一本鎖もしくは相補的核酸鎖からなる核酸あるい
   は核酸混合物を含むと予測される試料中の少なくとも一
   種類の特定の核酸配列を増幅する方法であって、 （ａ）二組のオリゴヌクレオチド対の少なくとも一組で
   この鎖を処理するが、該二組は試料中の少なくとも一つ
   の特定の核酸配列に相補的なものであり、且つ該二組は
   、前記少なくとも一種類の核酸配列に含まれる一本鎖テ
   ンプレート上の少なくとも一つの標的塩基あるいは平滑
   末端を規定する少なくとも一つの標的塩基対に隣接する
   ことが出来るものでもあり、 さらに少なくとも一つの組のオリゴヌクレオチド対の一
   方の一つの末端ヌクレオチドが、標的塩基もしくは標的
   塩基対の二つの塩基の一つに相補的であり、 その際、上記処理の条件として、試料中に標的塩基ある
   いは標的塩基対が存在する場合のみに、末端ヌクレオチ
   ドが対を成す他方のオリゴヌクレオチドの末端と相互に
   連結し、その結果、前記特定の核酸配列に対して相補的
   な連結産物を形成するような条件下で行い、 （ｂ）もし、試料中に検出されるべき標的塩基あるいは
   標的塩基対が存在すれば、連結産物をテンプレートから
   分離する条件下で試料を処理し、そして、 （ｃ）連結が起こったかを判断する、 ことからなる上記方法。 １４、工程（ａ）および（ｂ）が、少なくとも一回反復
   される、特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、核酸配列が該二組のオリゴヌクレオチドで処理さ
   れ、また二組のオリゴヌクレオチドの一方の組の連結産
   物がその複合状態から分離された時、他方の組のオリゴ
   ヌクレオチドのためのテンプレートとして働き、その結
   果連結反応産物の対数反応的形成をもたらす、特許請求
   の範囲第１３項記載の方法。 １６、核酸配列が、該二組のオリゴヌクレオチドの一対
   だけと処理され、該一組からの該連結反応産物がその複
   合状態から分離され、該組のもう一方が同一のテンプレ
   ートに連結およびハイブリダイズし、その結果連結反応
   産物の一次反応的形成をもたらす、特許請求の範囲第１
   ３項記載の方法。 １７、該連結反応産物が、変性によってそのテンプレー
   トから分離される、特許請求の範囲第１３項記載の方法
   。 １８、該核酸が一本鎖であり、この鎖が段階（ａ）以前
   あるいは段階（ａ）の途中で変性によって分離される、
   特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １９、最終的な連結反応産物の３’末端を含む該オリゴ
   ヌクレオチド対のオリゴヌクレオチドのどれもが、その
   ５’末端でリン酸化されている、特許請求の範囲第１３
   項記載の方法。 ２０、該標的塩基あるいは該標的塩基対の欠失または突
   然変異が、遺伝病を起こす、特許請求の範囲第１３項記
   載の方法。 ２１、該遺伝病が鎌型赤血球貧血症である、特許請求の
   範囲第２０項記載の方法。 ２２、該オリゴヌクレオチド対が、ＯＮ−１／ＯＮ−２
   およびＯＮ−３／ＯＮ−４である、特許請求の範囲第２
   １項記載の方法。 ２３、該オリゴヌクレオチド対が、ＯＮ−１／ＯＮ−ｓ
   ２およびＯＮ−ｓ３／ＯＮ−４である、特許請求の範囲
   第２１項記載の方法。 ２４、工程（ａ）がＴ４ＤＮＡリガーゼおよび大腸菌Ｄ
   ＮＡリガーゼからなるグループから選択された酵素を用
   いて行なわれる、特許請求の範囲第１３項記載の方法。 ２５、該特異的核酸配列がＤＮＡである、特許請求の範
   囲第１３項記載の方法。 ２６、該特異的核酸配列がＲＮＡである、特許請求の範
   囲第１３項記載の方法。 ２７、該ＲＮＡが、工程（ａ）に先立ち、逆転写酵素処
   理によってＤＮＡに複写される、特許請求の範囲第２６
   項記載の方法。 ２８、該オリゴヌクレオチド対の少なくとも一方のオリ
   ゴヌクレオチドが放射性標識されている、特許請求の範
   囲第１３項記載の方法。 ２９、工程（ａ）の反応混合液が、少なくとも２００ｍ
   ＭのＮａＣｌを含む、特許請求の範囲第１３項記載の方
   法。