JPS62281A - 核酸配列の増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、その存在する核酸配列を増幅し、プローブを
用いてそれを検出するための方法に関する。より詳細に
は本発明は、与えられたＤＮＡ又はＲＮＡ配列から初期
に存在する量に比較してより大量の任意の特定の核酸配
列を生成胆しめる方法に関する。該ＤＮＡ又はＲＮＡは
単鎖又は二重鎖であってもよく、比較的純粋な種であっ
ても核酸の混合物の一成分であってもよい。本発明の方
法では、所望の核酸配列の増幅を達成するために反応を
繰り返し行うようにする。

以下余白 〔従来の技術〕 特に診断上の用途のためには、標的核酸配列は問題のＤ
ＮＡ又はＲＮＡのほんの僅かな部分であることがあり、
非同位体標識又は末端標識オリゴヌクレオチドプローブ
を使用するのではその存在を検出することは困難である
。プローブ検出システムの感度を向上させるために多く
の労力が費やされているが、現在利用できる方法を用い
て容易に検出できるに充分な量を得るために、標的配列
を増幅するような研究は殆ど行われていない。

核酸を初めから、あるいは既存の配列から合成する方法
がいくつかの文献に記載されている。これらの方法は、
完全に特定された配列の与えられた核酸を大量に生産す
ることを可能にするものである。

核酸を初めから合成する１つの既知方法は、ヌクレオシ
ド誘導体からの核酸の有機合成を含むものである。この
合成は溶液中又は固体担体上で行われる。有機合成の１
つのタイプはリン酸トリエステル法であり、これは遺伝
子断片又は短い遺伝子を調製するために利用される。リ
ン酸トリエステル法では、オリゴヌクレオチドが調製さ
れ、次にこれは結合されてより長鎖の核酸を形成する。

この方法は、Ｓ、Ａ、ナーランクらにより、Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６８巻９０頁（１９７９年）及び米
国特許第４．３５６．２７号に開示されている。該特許
は、ソマトスフチン遺伝子の合成とクローニングを開示
している。

有機合成の第２のタイプはリン酸ジエステル法であり、
これはトランスファーＲＮＡ遺伝子の調製に利用されて
いる。この方法はＥ、　　Ｌ、プラウ　　。

ンらによりＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６８巻１０
９頁（１９７９年）に開示されている。リン酸トリエス
テル法と同じように、リン酸ジエステル法もオリゴヌク
レオチドの合成を含み、これらが実質的に結合されて所
望の核酸が形成される。

上記した初めからの合成法は核酸の長鎖を合成するため
に利用されるが、核酸を大量合成するための実用的方法
ではない。両法とも労力と時間を消費し高価な装置と試
薬を必要としかつ全体収率が低い。全体収率が低いのは
、オリゴヌクレオチドの合成とそれらを結合する反応が
非効率的であることに起因する。長鎖の核酸を合成する
際あるいは短鎖の核酸を大量に合成する場合でさえも、
多くのオリゴヌクレオチドを合成し多くの結合反応を行
うことが要求される。従ってこれらの方法は任意で所望
の核酸を大量に合成するには実用的ではない。

初めに存在する少量の核酸から大量の核酸を生産する方
法も存在する。これらの方法は好適な宿主系内での核酸
のクローニングを含み、ここでは所望の核酸は宿主の形
質変換に使用される好適なベクター中に挿入される。宿
主が培養されるとベクターが複製され、所望の核酸のコ
ピーが生産される。核酸断片のサブクローニングについ
ては、Ｔ、マニアチスらにより、コールド・スプリング
ラボラトリ−のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
　３９０　４０１頁（１９８２年）に簡単に記述されて
いる。この技術については米国特許第４．４１６．９８
８号及び４，４０３，０３６号にも記述されている。

米国特許第４．２９３．６５２号に記載されている核酸
の第３の合成法は、上述の有機合成と分子クローニング
法を合わせたものである。接法では、所望の核酸配列を
作り上げるのに必要な好適な数のオリゴヌクレオチドを
初めに合成し、次にこれらを次の挿入の前に増殖により
増幅されるベクターに挿入する。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、この分子クローニング法に幾らかの類似性を
有している。しかし本発明はいかなる生物の繁殖をも含
まず、従って繁殖に伴って起こり得る危険や不都合を回
避することができる。本発明は所望の核酸と関連しない
核酸の合成を必要とせず、従って本発明によれば複雑な
生物学的混合物からコストをかけて生成物を精製するこ
とも回避できる。

本発明はプライマーと重合試薬を用いて１種の核酸又は
複数の核酸の混合物中に存在するｌ又は２以上の特定の
核酸配列を増幅し、かつ増幅した配列を検出する方法で
ある。１つのプライマーの伸長生成物は、他のプライマ
ーとハイブリダイズしたときに所望の特定の核酸配列の
生成のための鋳型となり、又その逆も起こる。そしてこ
のプロセスは所定量の配列が生成するまで必要なだけ繰
り返される。標的配列から大量の核酸を比較的短時間で
生産するためには、本方法は上記の従来法より効率的で
あると期待される。本方法は核酸混合物に僅かしか含ま
れていない核酸種を増幅し、核種を効率的に検出するた
めに特に有用である。

〔問題点を解決するための手段〕

さらに詳しくは、この発明は、核酸又は核酸混合物中に
存在する少なくとも１種の特定の核酸配列を増幅する方
法を提供し、この場合、各核酸は同じ長さ又は異る長さ
の２つの別個の相補的な鎖から成り、そして前記の方法
は、 （ａ）前記類を各界る特定の配列を増幅するための２つ
のオリゴヌクレオチドプライマーにより、増幅されるべ
き各界る配列について各核酸鎖に相補的な各プライマー
の伸長生成物が合成される条件下で処理し、各核酸鎖に
相補的な各プライマーの延長生成物が合成され、ここで
、前記プライマーは各特定の配列の異る鎖と実質的に相
補的であって１方のプライマーから合成された延長生成
物がその相補体から分離された場合に他方のプライマー
の延長生成物の合成のためのプライマー鋳型として機能
することができるように選択され；（ｂ）前記プライマ
ー延長生成物をそれらが合成された鋳型から分離して単
鎖分子を生成せしめ；そして （ｃ）段階（ｂ）から生じた単鎖分子を段階（ａ）のプ
ライマーにより、段階（ｂ）において生成した各単鎖を
鋳型としてプライマー延長生成物が合成される条件下で
処理する； ことを含んで成る。

これらの段階は逐次的に又は同時に行うことができる。

さらに、段階（ｂ）及び（ｃ）は配列の所望のレベルの
増幅が得られるまで反復することができる。

この発明は、完全に特定された配列の既存の核酸を多量
に製造するためのみならず、存在することは知られてい
るがしかし完全には特定されていない核酸配列を製造す
るためにも有用である。いずれの場合にも、増幅される
べき配列の最初のコピーは入手可能でなければならない
。但しそれは純粋である必要はなく、又は別個の（ｄｉ
ｓｃｒｅｔｅ）分子である必要はない。

〔具体的な説明〕

プライマー、プローブ、検出すべきオリゴマー断片、オ
リゴマ一対照体、及び標識されていないプロワキングオ
リゴマーに関して使用される「オリゴヌクレオチド」と
いう用語は、２又はそれ以上の好ましくは３より多くの
デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから成
る分子として定義される。その正確な大きさは多くの因
子に依存し、その因子はオリゴヌクレオチドの究極的な
機能と用途に依存する。

ここで使用される「プライマー」という用語は、精製さ
れた制限消化物として自然に存在しあるいは合成的に調
製されたオリゴヌクレオチドを意味し、このプライマー
は、例えば好適な温度及びｐＨでヌクレオチドとＤＮＡ
ポリメラーゼのような重合試薬が存在するような、核酸
ストランドに相補的なプライマーの伸長生成物の合成が
誘発される条件下に置かれたときに合成開始点として機
能することができる。該プライマーは増幅効率を最大に
するため単鎖であることが好ましいが、その代わりに二
重鎖であってもよい。二重鎖であると、プライマーは伸
長生成物を調製するために使用される前にまずその鎖を
分離するために処理される。プライマーはオリゴデオキ
シリボヌクレオチドであることが好ましい。ブライマー
は、重合試薬の存在下で伸長生成物の合成を開始するた
めに十分な長さでなければならない。プライマーの正確
な長さは、温度やプライマー源を含む多くの因子に依存
する。例えば、目的とする配列の複雑さに依存してオリ
ゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５から２５又
はそれより多くのヌクレオチドを含むが、より少ないヌ
クレオチドを含むものであってもよい。短いプライマー
分子は、鋳型とともに十分安定なバイブリド複合体を形
成するために、より低い温度を要求する。

プライマーは増幅されるべき各特定の配列の異なるスト
ランドと「実質的」に相補的であるように選択される。

このことはプライマーはそれぞれのストランドとハイブ
リダイズするに十分に相補的でなければならないことを
意味する。従ってプライマーの配列は鋳型の配列を正確
に反映する必要はない。例えば相補的でないヌクレオチ
ド断片を、プライマーの配列の残部がストランドに相補
的であるようにプライマーの５゛末端に結合させてもよ
い。代わりに、プライマーの配列が増幅されるべきスト
ランドの配列と十分な相補性を有していてそれらとハイ
ブリダイズし、それによって他方のプライマーの伸長生
成物合成用鋳型を形成するならば、相補的でない塩基又
はより長い配列がプライマー内に散在していてもよい。

本発明で使用される「制限エンドヌクレアーゼ」及び「
制限酵素」という用語は、二重鎖ＤＮＡを特定の核酸配
列又はその近傍で切断するような細菌性酵素を意味する
。

本発明で使用されるｒＤＮＡの多形現象」という用語は
、ＤＮＡ中の特定部位に２又はそれより多くの異なった
ヌクレオチド配列が存在できる状態を意味する。

「制限断片長さの多形現象（ＲＡＬＰ）Ｊという用語は
、特定の制限エンドヌクレアーゼによる消化により形成
される制限断片の長さに個体間の相違があることを意味
する。

本発明は、核酸中に存在すると思われる１又はそれ以上
の所望の特定の核酸配列を増幅する方法に関する。本性
によれば大量の特定の配列を調製できるので、本発明は
ＤＮＡ又はメツセンジャーＲＮＡのクローニング効率を
改良し、かつ標的配列を増幅してその検出を容易にする
ために使用することができる。この発明はまた、不完全
な化学合成から生ずる核酸の混合物から所望の配列を多
量に得るためにも有用である。

一般に、本発明の方法は、用いられる反応ステップの数
に比較して指数的な収量で少なくとも１つの特定の核酸
配列を生産する連鎖反応を含み、該配列は（ａ）必要と
される末端が、それとハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドを合成できるに十分な程度に詳細に知られており
、（ｂ）連鎖反応を開始するために少量の配列が入手可
能であることが条件となる。連鎖反応で得られる生成物
は、使用した特定のプライマーの末端に対応する末端を
有するような個別的な核酸のデュプレックスである。

精製された状態でも精製されていない状態でもよい任意
の核酸源を、所望の特定の核酸配列を含むと思われるの
であれば、出発核酸として使用できる。従って末法では
、例えば単鎖であっても二重鎖であってもよいＤＮＡ又
はＲＮＡ例えばメツセンジャーＲＮＡを使用することが
できる。更にそれぞれ１つの鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡの
バイブリドを使用してもよい。これらの核酸の混合物を
使用してもよく、又先行する増幅反応において同じか又
は異なったプライマーを用いて生産された核酸を使用し
てもよい。増幅すべき特定の核酸配列は大きな分子の一
部であってもよく、特定の配列が核酸全体を構成するよ
うにはじめから個別的な分子として存在していてもよい
。増幅すべき配列は初めから純粋な状態で存在する必要
はなく、該配列は、複雑な混合物の小部分、例えば全ヒ
トＤＮＡ中のβ−グロビン遺伝子、又は特定の生物的試
料の掻く僅かの部分のみを構成する特定の微生物に起因
する核酸配列の部分であってもよい。

出発物質としての核酸は、同じか又は異なった２以上の
所望の特定の核酸配列を含んでいてもよい。

従って本発明の方法は、１つの特定の核酸配列を大量に
生産するだけでなく、同じか又Ｊよ異なった核酸分子上
に位置する２以上の異なった特定の核酸配列の同時増幅
にも有用である。

核酸は、例えばｐＢＲ３２２のようなプラスミド、クロ
ーン化されたＤＮＡ又はＲＮＡ、又は細菌、酵母、ビー
ルス及び植物や動物などの高級生物等の自然にあるＤＮ
Ａ又はＲＮＡ等の任意源から得ることができる。ＤＮＡ
又はＲＮＡは、例えばマニアチスらによりＭｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　の２８０から２８１頁（１９
８２年）に記載されているような種々の技術により、血
や絨毛又は羊膜細胞等の組織物質から抽出することがで
きる。

本発明方法により、任意の特定の核酸配列を生産するこ
とができる。配列の両末端の十分な数の塩基が十分詳細
に分かっており、これにより所望の配列の異なった複数
のストランドに対し、かつ該配列に沿った次のような相
対位置にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチド
プライマーを調製することができればよく、すなわち、
１つのプライマーから合成伸長した生成物が、鋳型（相
補体）から分離されたときに、限定された長さの核酸中
へ他のプライマーを伸長させるための鋳型としての役割
を果せばよい。配列の両末端の塩基に関する知識が増加
するほど目的とする核酸配列のためのプライマーの特異
性も大きくなり、従って末法の有効性も大きくなる。以
後使用するプライマーという用語は、特に増幅すべき断
片の末端配列に関する情報にいくらかの曖昧さがある場
合には、１より大きい数のプライマーを意味するものと
理解されるべきである。例えば、核酸配列が蛋白質配列
の情報から推測できる場合、遺伝子コードの縮重に起因
する全ての可能なコドン変化を示す配列を含むプライマ
ーを集めて各額用として使用する。このような集合のう
ちの１つのプライマーは、増幅すべき所望配列の末端と
一致する。

オリゴヌクレオチドプライマーは任意の好適な方法、例
えば上記したリン酸トリエステル法及びリン酸ジエステ
ル法又はそれらのオートメーション化された方法を使用
して調製することができる。

このようなオートメーション化された方法のうちの１つ
によれば、ビューケージらによりＴｅｔｒａｈｅｄ−ｒ
ｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２巻１８５９−１８６２頁に
記載されている通り、ジエチルフォスフォロアミダイト
を出発物質として使用して合成することができる。修飾
された固体担体上でのオリゴヌクレオチド合成の１つの
方法が米国特許第４．４５８．０６６号に記載されてい
る。生物源（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物）か
ら分離したプライマーを使用することも可能である。

特定の核酸配列は、該配列を鋳型として含む核酸を使用
して生産される。核酸が２つの鎖を含んでいるときは、
別のステップとしてでもプライマーの伸長生成物の合成
と同時でもよいが、該核酸は鋳型として使用される前に
鎖を分離する必要がある。この鎖分離は、物理的、化学
的及び酵素的方法を含む任意の好適な変性法により行う
ことができる。核酸の鎖を分離する１つの物理的方法は
、完全に（９９％以上）変性されるまで核酸を加熱する
ことを含む。典型的な加熱変性は８０から１５０℃で１
から１０分間加熱することを含む。鎖の分離は、ヘリカ
ーゼ、又はヘリカーゼ活性を有しリボＡＴＰの存在下で
ＤＮＡを変性させるものとして知られる酵素Ｒｅ　ｃＡ
として知られる酵素類からの１酵素により誘発させるこ
ともできる。

ヘリカーゼで核酸の鎖を分離するのに好適な反応条件は
ターン　ホフマン　ベーリングにより亜（ｌｕａｒ＋ｔ
ｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏ１ｏ■の４３から６３頁（１９
７８年）に記載され、ＲｅＣＡを使用する技術は、Ｃ，
ラディングによりＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓの１６巻４０５から４３７頁に記載されている。

増幅すべき配列を含む当初の核酸が単鎖であると、その
相補体をそれに１つ又は２つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーを加えて合成する。好適な単一プライマーが加え
られると、プライマー、重合試薬及び後述する４つのヌ
クレオチドの存在下でプライマーの伸長生成物が合成さ
れる。生成物は鋳型として使用される前に鎖を分離する
必要がある。この鎖分離は、物理的、化学的及び酵素的
方法を含む任意の好適な変性法により行うことができる
。核酸の鎖を分離する１つの物理的方法は、完全に（９
９％以上）変性されるまで核酸を加熱することを含む。

典型的な加熱変性は８０から１５０℃で１から１０分間
加熱することを含む。鎖の分離は、ヘリカーゼ、又はヘ
リカーゼ活性を有しリボＡＴＰの存在下でＤＮＡを変性
させるものとして知られる酵素ＲｅｃＡとして知られる
酵素類からの１酵素により誘発させることもできる。

ヘリカーゼで核酸の鎖を分離するのに好適な反応条件は
ターン　ホフマン　ベーリングによりＣ３ｌＩ−Ｑｕａ
ｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙの４３から６３頁
（１９７８年）に記載され、Ｒｅ　ｃＡを使用する技術
は、Ｃ，ラディングにより八ｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓの１６巻４０５から４３７頁に記載されている
。

増幅すべき配列を含む当初の核酸が単鎖であると、その
相補体をそれに１つ又は２つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーを加えて合成する。好適な単一プライマーが加え
られると、プライマー、重合試薬及び後述する４つのヌ
クレオチドの存在下でプライマーの伸長生成物が合成さ
れる。生成物は部分的に単鎖核酸と相補的で、核酸鎖と
ハイブリダイズして長さの異なるデュプレックスを形成
し、これは上記した通り単鎖に分離され、相補的な２つ
の分離された鎖となる。代わりに２つの好適なプライマ
ーを単鎖に加えて反応を行うこともできる。

当初の核酸が増幅すべき配列を構成するならば、プライ
マーの伸長生成物は当初の核酸の鎖と完全に相補的とな
り、ハイブリダイズして同じ長さの鎖から成るデュプレ
ックスを形成し、これは分離されて単鎖の分子となる。

核酸の相補的な鎖が分離すると、当初の核酸が二重鎖で
あっても単鎖であっても、その鎖は他の核酸鎖の合成用
鋳型として容易に使用することができる。この合成は任
意の好適な方法を用いて行うことができる。通常それは
好ましくはｐＨが７から９、最も好ましくは８である緩
衝水溶液中で起こる。好ましくは過剰のモル比（クロー
ン化された核酸については、通常プライマ一対鋳型が１
０００　：　１　、そしてゲノムの核酸については通常
プライマ一対鋳型が１０ｂ　：１）の２つのオリゴヌク
レオチドプライマーを分離された鋳型鎖を含む緩衝水溶
液中に加える。しかし本性を診断的用途に使用する場合
には相補的な鎖の量は既知ではないことを理解すべきで
あり、従って相補的な鎖の量に関連するプライマーの量
を確信をもって決定することはできない。しかし実際に
は、増幅すべき配列が複雑な長鎖の核酸鎖の混合物中に
含まれる場合には、加えられるプライマーの量は相補的
な鎖（鋳型）の量よりも通常モル過剰とする。本性の効
率を改良するためには、大きな過剰モル比とすることが
好ましい。

デオキシリボヌクレオシド三リン酸であるデオキシＡＴ
Ｐ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ及びＴＴＰの十分
な量も合成混合物に加え、生成する溶液を約９０−１０
０℃で約１から１０分、好ましくは１から４分間加熱す
る。この加熱時間の後、溶液の温度をプライマーのハイ
ブリダイゼーションに好適な室温まで下げる。この冷却
した混合物にブライマー伸長反応を誘導し又は触媒する
ための適当な薬剤（誘導試薬又は重合試薬と称する）を
加え、従来知られている条件下で反応を行わせる。この
合成反応は、室温からそれを越えると重合試薬が効率的
に機能しない温度までの間で行わせることができる。従
って例えばＤＮＡポリメラーゼを重合試薬として使用す
るときは、温度を通常４０℃以上に上昇させない。最も
好ましくは反応は室温において起こる。

重合試薬（誘導試薬）は、プライマーの伸長生成物の合
成を達成できるものならば、酵素を含むどのような化合
物でも系でもよい。この目的のための好適な酵素は、例
えばＥ、コーリーＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ、コーリー
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ、他の入手できるＤＮＡポリメラーゼ、逆転写
酵素及び耐熱性酵素を含む他の酵素を含み、これらは好
適な方法でヌクレオチドの結合を容易にし、各核酸鎖と
相補的であるプライマーの伸長生成物を形成する。一般
に合成は各プライマーの３゛末端から始まり、合成が終
了するまで鋳型類に沿って５゜末端方向に向かって進行
し、異なった長さの分子を生成する。しかし上述の方法
と同じ方法を用いて５゛末端で合成を始め、他の方向に
向かって反応を進行させる試薬がある。

新たに合成された鎖とそれと相補性を有する核酸鎖は、
本性のその後のステップにおいて使用される二重鎖分子
を形成する。次のステップでは、二重鎖分子の鎖は上述
の任意の手順を用いて分離され、単鎖分子を提供する。

新たな核酸が該単鎖分子上で合成される。追加の誘導試
薬、ヌクレオチド及びプライマーを、上記に規定した条
件下で反応を進行させるために必要ならば加えてもよい
。オリゴヌクレオチドブライマーの一末端から再度合成
が始まり、そして鋳型の単鎖に沿って進行して他の核酸
を生成する。

このステップの後における伸長生成物の半分は２つのプ
ライマーが結合した特定の核酸配列から成っている。

鎖分離と伸長生成物合成のステップは、特定の核酸配列
を所定量生産するまで必要なだけの回数繰り返すことが
できる。後により詳細に記載するように、特定の核酸配
列は指数的に蓄積する。最初の核酸又は核酸の混合物か
ら２以上の特定の核酸配列を生産することが望ましい場
合は、好適な数の異なったオリゴヌクレオチドプライマ
ーを使用する。例えば２つの異なった特定の核酸配列を
生成する場合には、４つのプライマーを使用する。

プライマーのうちの２つは特定の核酸配列のうちの１つ
に関するもので、他の２つのプライマーは第２の特定の
核酸配列に関するものである。これにより、２つの異な
った特定の配列が本性を用いて指数的に生産され得る。

本発明は、各ステップ後に新しい試薬を加える段階的方
法、又は全ての試薬を初期のステップで加える同時的方
法、又はある与えられた数のステップの後に新しい試薬
を加える一部段階的で一部同時的である方法のいずれに
よっても行うことができる。熱処理のように重合試薬を
不活性化する鎖分離方法を採用した場合には、熱に対し
て不安定である酵素の場合がそうであるように、各鎖分
離ステップ後に重合試薬を補充することが必要である。

ヘリカーゼのような酵素的手段を含む多数の精製された
成分を鎖分離ステップで使用する場合は、同時的方法を
使用することができる。同時的方法では、反応混合物は
、所望の配列を含む核酸鎖の他に、鎖分離酵素（例えば
ヘリカーゼ）、ｒＡＴＰのような鎖分離酵素への適切な
エネルギー供給源、４つのヌクレオチド、モル過剰のオ
リゴヌクレオチドプライマ−及びＥ、コーリーＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片のような誘導試薬を含むこ
とができる。

同時的方法で変性のために熱を使用するときは、誘導試
薬に依存するが好ましくは６５−９０℃の高温で機能す
る熱安定性ポリメラーゼ等の熱安定性誘導試薬を使用し
、この温度で核酸は平衡状態にある単鎖と二重鎖から成
っている。長さの短い核酸には、約５０℃程度の低温が
採用される。どの程度の高温が使用できるかは、その温
度で酵素が失活するかあるいはプライマーのハイブリダ
イゼーションが不十分な程度しか起こらないかどうかに
依存する。このような熱安定性酵素は、例えばＡ、Ｓ、
カレディンらにより旧ｏｋｈｉｍｉｙａ　４５巻６４４
−６５１頁（１９８０年）に記載されている。末法の各
ステップは、全ての試薬が始めから存在するにもかかわ
らず、続いて起こる。必要ならば追加の試薬を加えても
よい。適切な長さの時間が経過して所望量の特定の核酸
配列が生成した後、任意の公知方法で酵素を失活させる
か反応成分を分離するかして反応を停止させる。

本発明方法は連続的に行ってもよい。オートメーション
化された方法の一態様として、反応を、変性区域、試薬
添加区域及び反応区域を通ってサイクルさせるような方
法がある。他の態様では、プライマーの伸長生成物の合
成に使用する酵素をカラム中で固定化することができる
。他の反応成分は連続するカラムと加熱用コイルを通る
ようにポンプを使って連続的に循環され、これにより、
生成した核酸が酵素を失活させることなく繰り返し変性
される。

本発明の概略が下記に示され、ここでは相補的な鎖〔Ｓ
“〕と〔Ｓ−〕から成る所望配列（Ｓ）を含む二重＄Ｎ
　Ｄ　Ｎ　Ａが核酸として使用されている。

第１の及び引き続いて起こる反応サイクルでは、当初の
鋳型上の各オリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、プ
ライマーの１つとともにのみ終了する制限のない長さの
、１つの新しい５ｓＤＮＡ分子生成物を生成する。以後
「長鎖生成物」と呼ぶこれらの生成物は直線的に蓄積し
、つまり任意数のサイクルの後に存在する量はサイクル
数に比例する。

このように生産される長鎖生成物は、引き続いて起こる
サイクルの間一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライ
マーの鋳型として機能し、所望配列〔Ｓ゛〕又は〔Ｓ−
〕の分子を生成する。これらの分子も一方又は他方のオ
リゴヌクレオチドプライマーの鋳型として機能し、更に
他の〔Ｓ゛〕及び（Ｓ−）を生成し、従ってサイクル数
に関連して指数的に（Ｓ）の蓄積を生じさせる連鎖反応
が維持される。

オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより形
成される意図されない副生成物は、それ自身触媒活性が
なく　（稀な例を除く）、従って直線的に蓄積する。

以下余白 増幅される特定の配列（Ｓ）は、次のように図示される
。

（Ｓ”　　）　　　５’　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ　　３’（　Ｓ
　−　３　　３’　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹ
ＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ　５’好適なオリゴヌク
レオチドプライマーは、プライマ−１　：　　ＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧＧブライマ−２：　八ＡＡＡＡＡＡＡＡＡで
あり、もしＣＳ）を含むＤＮＡ　： ．．．．ＺＺＺＺＺ２ＺＺＺＺＺＺ２ＺＺ２ＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ
ＺＺＺＺ２ＺＺ２Ｚ２ＺＺＺＺＺＺ．．，．．　．　．
　．　ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴ　ＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ．　．　．　．分離
されて単一鎖になり、その単一鎖がプライマ−１又は２
とハイブリダイズすると、次のが４種類のデオキシリボ
ヌクレオシド三リン酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼで
触媒され得る。

３゛５′ 伸長方向　　　　　　　　　　　　ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
Ｇ　　　プライマ−１．，．．ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡχχχＸＸＸＸＸＸＸ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚ．．．．当初の鎖型鎖十 当初の鎖型鎖 ．　，　．　．　ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ　．　．　
．　．ブライマ−２　　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ八　　　
　　　　伸長方向５゛３′ ３“　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５゛．．．．ＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺ
ＺＺＺＺ２ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ新しく合成された長い生成物　１ ５′　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３′．．．．２２２２
２２２２２２２２２２２２＾八＾Ａ＾八ＡＡＡＡＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＺＺＺＺ２ＺＺＺ
２ＺＺＺＺＺＺＺ．．．．当初の鋳型鎖十 ３′５・ ．　．　．　．　２Ｚ２ＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＺＺＺＺ２Ｚ２ＺＺＺＺＺＺＺＺＺ　．　．　
．　．当初の鋳型鎖一 ５′３′ 八＾八ＡＡＡＡＡＡ＾ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ．．．．
新しく合成された長い往成物 上記４つの鎖が次のザイクルにおいてプライマーｌ及び
２と再ハイブリダイ次の反応を触媒する。

フ゜ライマー２５′　　八八Ａ八Δ＾八八Ａ＾　　　　
　　　　　　　イ申長の方向３’．．．．ｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹ
ＹＹＹＹＹＹＹＧ（ｒＧＧＧＧＧＧＧＧ　　５’新しく
合成された長い生成物ｌ ズすれば、 重合剤 伸長の方向　　　　　　　　　　　　　　　ＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧ　５”　ブライマ−１５’　．．．．ｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚ．．．．３’当初の鋳型鎖十 フ゜ライマー２５゛　　八八八八八ＡＡＡＡ八　　　　
　　　　　　　　　　　イ申長の方向３’．．．．ｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴＴＴＩＴ
ＴＹＹＹＹＹ’ｌＹ′ｆＹ’ｌＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚ．．．．　　５’当初の鋳型鎖一 ここまで伸長　　　　　　　　　−−　ＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧ　５”プライマ−１５’　　　ＡＡＡＡＡＡｒＩ
Ａ＾ＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ７．．．３’上記４つのデュプ
レックスが分離されると次の鎖が生ずる。

５’　　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＫＸＸ’ＸＸＸＸＸ’
ＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ３′新しく合成された〔Ｓ”
〕 ３”、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹ’ｉ’ｌＹ’ｆＹＹＹＹＹＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧ　５’第１サイクルで合成された長い
生成物１３’、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹ’／
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ　５’新しく合成された長い生成
物１ ５’　、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚＡＡＡＡＡＡ＾ＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、、、、３’当初の鋳
型鎖十 ５’　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡχＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
、、、、３新しく合成された長い生成物２ ３　’　、　、　ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴ
ＴＴＴＴＴ　ＴＴＴｎ’ＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧｚｚｚｚｚｚｚｚｘｚｚｚｚｚｚｚ　、　、　
、　、　５　’当初の鋳型鎖− ３’　　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹｎ’ＹＹＹＹＹＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ　５’新しく合成された〔Ｓ−〕 ５′　＾＾Ａ＾八ＡＡへＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＺＺＺＺ２ＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺ、、
１．．３’第１サイクルで合成された長い生成物２一方
のプライマーのオリゴヌクレオチド配列と共に終る鎖及
び他方の相補的配列の各鎖は、生産することが望まれて
いる特定の核酸配列（Ｓ）であることが分かる。

本性のステップは、プライマー１及び２、重合試薬及び
存在するヌクレオチドの量によってのみ限定される以外
、無限に繰り返すことができる。

最初の核酸は複製されないので、その量は全工程中一定
である。長鎖生成物は最初の核酸からのみ生産されるの
で、その量は直線的に増加する。特定の配列の量は指数
的に増加する。従って特定の配列はその量が増加して優
勢な成分となる。このことは次表に示され、該表は各サ
イクルの効率が１００％であるとした場合のｎサイクル
後の理論的に存在する成分量を比較したものである。

以下余白 ０か らｎサ イクル後の二重 鎖の数 ｌゴラソに牧 μＵ既 丑１凹」良粗 竹ｆＪ区列」コＵ ■ ■ ■ ■ １．０１３ ■ ３２．７５２ ■ １．０４８．５５５ ＩＩ−ｎ− 単鎖の核酸を鋳型として使用すると、サイクルあたり１
つの長鎖生成物が生成する。

本性は好適な発現ベクターに特定の核酸配列を挿入する
ためにクローン化するのに使用できる。

該ベクターは適切な宿主生物を形質転換して標準的な組
み換え体ＤＮＡ技術により遺伝子生成物を生産する際に
使用できる。

更に末法はインビトロの突然変異用として使用すること
ができる。オリゴデオキシリボヌクレオチドは増幅され
るべきＤＮＡ配列と正確に相補的である必要はない。こ
れらは、ポリメラーゼ酵素や他に使用されるいずれかの
誘導試薬によって伸長されるために十分な程度に、鎖と
ハイブリダイズすることができればよい、使用するプラ
イマーが最初の鋳型と正確に相補的でない場合のポリメ
ラーゼ連鎖反応の生成物は鋳型よりむしろプライマー配
列を有し、これによりインビトロの突然変異を可能にす
る。引き続くサイクルでは、より以上のミスペアーブラ
イミングが必要とされないので、この突然変異が減るこ
とのない効率下で増幅される。このように生産された突
然変異体は標準的な分子生物学的技術により適切なベク
ター中へ挿入され、変化した蛋白質を生産する能力等の
変化した特質をこのベクターに与える。

上述した変化したＤＮＡ配列を形成する方法は、より以
上の配列変化を誘発させるために異なったプライマーを
使用して該変化したＤＮＡに対して繰り返すことができ
る。この方法では、一連の突然変異配列が徐々に生成さ
れ、ここで、この一連のものに新しく加えられるものは
、最後のものと僅かに異なることができるが、最初のＤ
ＮＡ源配列とは非常に大きく異なることができる。この
方法では、非常に大きなミスマツチの場合にプライマー
が機能しないために単一ステップでは行うことのできな
い変化を、最終的には作り出すことができる。

更に、十分な量のプライマーが増幅される鎖に相補的で
ある配列を含むのであれば、プライマーはその配列の一
部として相補的でない配列を含むことができる０例えば
鋳型配列に相補的でない核酸配列（例えばプロモーター
、リンカ７、コード配列等）を、１つ又は両方のプライ
マーの５”末端に結合させることができ、これにより増
幅工程の生成物にこれを付加することができる。伸長プ
ライマーを添加した後、相補的でない核酸挿入部を含む
新しい鋳型の所望量を得るために十分な数のサイクルを
実施する。これにより簡単な技術を用いて比較的短時間
（例えば２時間又はそれ以下）内に組合わされた断片を
大量に生産することが可能になる。

末法は、伝染性疾患、遺伝子性疾患又は細胞性の疾患、
例えば癌、と関連する特定の核酸配列、例えば発癌遺伝
子、の検出及び／又は特徴付けを可能にするために使用
される。増幅は、例えば胎児細胞から得られるＤＮＡを
用いる鐘状赤血球貧血の胎児診断等、分析に利用できる
核酸の量が非常に小さい場合に有用である。増幅は、本
来的に感度の良くない非放射性検出技術を用いて少量の
試料を分析する場合、又は放射性技術を用いるが迅速な
検出が望ましい場合に特に有用である。

本発明の目的のためには、遺伝子性疾患は、例えば鐘状
赤血球貧血、嚢胞性繊維症、α−サラセミア、β−サラ
セミア等の、任意の生物体がらのゲノムＤＮＡ中の特定
の欠損及び／又は変異を含む。鐘状赤血球貧血は、末法
による好適なりＮＡ配列の増幅の後のオリゴマー制限分
析又はＲＦＬＰ状分析を経て容易に検出することができ
る。α−サラセミアは配列が存在しないことにより検出
することができ、β−サラセミアは疾患を起こさせる変
異に近接してリンクする多形性Ｃ’ｐｏｌｙｍｏｒｐｌ
ｉｃ）制限部位の存在により検出することができる。

これら全ての遺伝子性疾患は適切な配列を増幅し、それ
を放射性プローブを使用せずにサザンプロット法により
分析して検出することができる。

このような方法では、例えば非常に少量の所望配列を含
む羊水からのＤＮＡの少量の試料を増幅し、制限酵素で
切断し、そしてサザンプロット法で分析する。増幅シグ
ナルをハイレベルとすることにより、非放射性標体を使
用することが容易になる。

他の態様では、少量のＤＮＡを便利なレベルまで増幅し
、次に更に伸長反応を行うが、この場合容易に検出でき
るヌクレオチド誘導体（例えばｓｉｐ又はビオチンでラ
ベルしたヌクレオチド三リン酸）を直接最終のＤＮＡ生
成物に導入し、これを制限分析及び電気泳動分析あるい
は任意の他の好適な方法を用いて分析する。この技術の
モデル系の例を第５図に示しである。

第３図のモデル系に示した更に他の態様では、核酸は増
幅の前に特定の制限エンドヌクレアーゼに暴露する。切
断された配列は増幅できないので、予め制限酵素で処理
したＤＮＡ試料の存在にもかかわらず増幅された断片が
現れることは、増幅された配列中にエンドヌクレアーゼ
の部位がないことを暗示する。増幅された配列が存在す
るか否かは適当な方法で検出することができる。

この技術の実際的な適用方法は、本明細書とサイキらに
よるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３巻１００８−１０
１２頁に記載されているオリゴマー制限技術を用いて鎌
状赤血球貧血の検出を容易にする使用により例示するこ
とができる。鎌状赤血球貧血はβ−グロビン遺伝子の第
６コドンの１つの塩基対の表化により生ずるヘモグロビ
ンの疾患である。第６図は多形現象（ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈｉｓｎ）９Ｍ域中の正常及び鎌状赤血球貧血のβ−グ
ロビン遺伝子の配列を示すもので、一本線は正常遺伝子
にのめ１′？■する旦ｄｅＩ部位の位置を示し、二本線
は正常及び譲状赤血球貧血対立遺伝子、の両方に存在す
る非多形性のＨｉｎｆ　Ｉ部位の位置を示す。第７図は
両制限部位部位間にわたり星印で示された部分がラベル
されているプローブを用いて正常のβ−グロビンＤＮＡ
をオリゴマー制限開裂する方法を示すものである。前に
記載したようにして増幅されたＤＮＡが変性され、ラベ
ルされたプローブとアニールされる。酵素ＤｄｅｌはＤ
ＮＡを再構成された旦ｄｅ１部位で開裂させ、ラベルさ
れたオクタマーを生じさせる。テストに使用した条件下
では、オクタマーはデュプレックスから離れるのに十分
な短さである。引き続く酵素Ｈｉｎｆ　Ｉの添加は今や
単鎖であるオクタマーに何の影響も与えない。第８図は
β−グロビンＤＮＡの鐘状赤血球対立遺伝子に適用した
前記と同じ方法を示す。酵素旦ｄｅｌは、Ａ−、Ａの塩
基対がミスマツチしたものであるため、増幅されたＤＮ
Ａとラベルされたプローブとで形成されたデュプレック
スを開裂させることはできない。しかし酵素Ｕが戸はハ
イブリッド制限開裂せしめ、ラベルされたトリマーが生
成される。実際にはこの方法は、特定のシグナルがいず
れかの対立遺伝子の存在と関連するので、個体のＤＮＡ
が野性型のホモ接合体か、譲状赤血球貧血型のホモ接合
体か又は繊状赤血球貧血形質を有するペテロ接合体であ
るかを検診することができる。上述の方法を使用して適
切な配列を増幅させることにより１つの３２ｐラベルの
みを有するプローブを用いて単コピー遺伝子を迅速に分
析することができる。

種々の伝染性疾患は、原因となる微生物に特異的である
特定のＤＮＡ配列の臨床試料中での存在により診断する
ことができる。これらはサルモネラ、クラミジア、ネイ
セリア等の細菌、肝炎ビールス等のビールス、マラリア
の原因となるプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）
等の寄生体を含む。ファルコーに与えられた米国特許第
４．３５８，５３５号は、伝染性疾患の診断用の特別な
りＮＡハイブリダイゼーションプローブの使用につき記
述している。ファルコー法に固有の問題は、感染した患
者からの臨床試料中には比較的少ない数の病原生物しか
存在せず、これらから抽出されたＤＮＡは試料中の全Ｄ
ＮＡの非常に小さな部分を構成するのみであるというこ
とである。ＤＮＡ試料を固定化しハイブリダイゼーショ
ン検出する前に問題となっている配列を特異的に増幅す
ることは、これらの方法の感度と特異性を大きく改良す
る。

伝染性疾患の診断用にＤＮＡプローブを臨床的にルーチ
ン化して使用することは、ワードのヨーロッパ特許第６
３．８７９号に記載されているように非放射的にラベル
されたプローブを使用するのならば、大いに簡略化され
る。この方法では、ビオチンを含むＤＮＡプローブがア
ビジン又はビオチンに特異的な抗体に結合した色素体（
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ　ｉｃ）酵素により検出される。こ
の型の検出は便利であるが、比較的低感度である。本性
による特異的なりＮＡ増幅と安定にラベルされたプロー
ブを組み合わせることにより、ファルコー及びワードの
方法をルーチン化した臨床における有用な方法にするの
に要求される便利さと感度を提供することができる。

この増幅工程は単一コピーのヒト遺伝子から十分な量の
ＤＮＡを調製するのに利用することもでき、これにより
臭化エチジウムのような簡単な非特異的なりＮＡ染色に
よりそれを検出でき、直接ＤＮＡ診断を行うことができ
る。

伝染性疾患及び生物体のゲノム中の病原的異常性を検出
するほか、本性は任意の病原状態と関連しないＤＮＡ多
形現象（ボリモルフイズム）を検出するために使用する
こともできる。

次の実施例は例示のために提示するもので、どのように
も本発明を限定することを意図するものではない。これ
らの実施例で全てのパーセントは固体の場合は重量で、
液体の場合は容量であり、他に指定がない限り温度は摂
氏温度である。

大施炎上 次のヌクレオチド配列を有する２５塩基対配列５’　Ｃ
ＣＴＣＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴ　
３’３’　　ＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＡＣ
ＣＴＡＣＧ＾　５′（ＡＴＣＣから得られるｐＢＲ３２
２の４７塩基対印■制限断片に含まれる）を次のように
調製した。

４７塩基対断片を含むｐＢＲ３２２のＦｏｋｌ消化物を
、供給者であるニューイングランド社の指未による条件
に従ってｐＢＲ３２２をＦｏｋｌで消化することにより
調製した。使用したプライマーは、 ５’　ｄ　（ｃＣＴＣＧＧＣＡＣＣＧ）　３’と５′ｄ
（＾ＧＣＡＴＣＣＡＧＧＧＴＧ）　３’であり、通常の
技術により調製した。２５ｍＭのリン酸カリウムと１０
ｍＭの塩化マグネシウム、及び１００ｍＭの塩化ナトリ
ウムから成る緩衝液（ｐＨ７，５）３３μｌに２４３３
ピコモルの上述の各プライマー、２．４ピコモルのｐＢ
Ｒ３２２のヱ」〔消化物、２２ナノモルのデオキシＡＴ
Ｐ、２２ナノモルのデオキシＣＴＰ、１９ナノモルのデ
オキシＧＴＰ及び１０ナノモルのＴＴＰを加えた。

混合物を８５℃で５分間加熱し、室温まで冷却した。Ｅ
、コーリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片の５単
位を加え、温度を１５分間維持した。その後再度８５℃
で５分間加熱し、冷却した。

クレノー断片の５単位を再度加え、１５分間反応を行っ
た。加熱、冷却及び反応の各ステップを更に１１回繰り
返した。

最後の繰り返しの後、５μｌを反応混金物から取り出し
た。これを８５℃で３分間加熱し、室温に冷却した。１
２．５ピコモルのα−Ｐ３２　デオキシシチジン三リン
酸と５単位のクレノー断片を加え反応を１５分間進行さ
せた。ラベルされた生成物をポリアクリルアミドゲルの
電気泳動で確認した。

１３サイクル後に見える強くラベルされたバンドのみが
、意図する２５塩基対配列であった。

実施例１ 増幅されるべき所望の配列は、ヒトのβ−グロビナン遺
伝子に含まれかつ鎌状赤血球貧血に関するＭ　ｓ　ｔ　
１１部位に伸びる９４塩基対の配列であった。

該配列は第１図に示すヌクレオチド配列を有している。

Ｉ、プライマーの合成 次の２つのオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
を下記する方法を用いて調製した。

５’　ＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＧ　３’　　ブラ
イマーΔ、及び５’　ＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡ
　３’　プライマーロ以下余白 オートメーションヒされたＡｈ法 ビューケージとカルサース法　（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎＬｅｔｔｅｒｓ　２２巻１８５９−１８６２頁（１９
８１年）に従って合成したジエチルフォスフオロアミダ
イトを・バイオサーチＳＡＭ−１を使用して制御した多
孔ガラス担体から誘導したヌクレオシド−・次々と濃縮
した。この方法は、ジクロルメタン中でのトリクロル酢
酸による脱トリチル化と活性のある水素供与体としてベ
ンゾトリアゾールを使用する縮合及びテトラハイドロフ
ラン及びピリジン中での無水酢酸とジメチルアミノピリ
ジンによるキャッピングを含んでいた。１サイクルの時
間は約３０分であった。各ステップの収率は実質的に当
量的であり、脱トリチル化の間に解離するジメトキシト
リチルアルコールを集め分光器による検査で決定した。

固体担体をカラムから取り出し、１ｍｌの濃水酸化アン
モニウムに閉鎖管中室温で４時間曝した。

担体を濾過で取り除き、一部が保護されたオリゴデオキ
シリボヌクレオチドを含む溶液の温度を５５℃に上昇さ
せ、５時間維持した。アンモニアを取り除き、残渣を調
製用ポリアクリルアミドゲルに適用した。３０ボルト／
ｃｆｆｉで９０分間電気泳動を行い、生成物を含むバン
ドを螢光プレート上のＵＶシャドウィングで同定した。

該バンドを切り取り、１ｍｌの蒸留水で一晩かけて４℃
で溶出した。この溶液をアルチックＲＰ１８カラムにか
け、ｐ　Ｈ６，０の１％酢酸アンモニウム緩衝液中７−
１３％のア七ト二トリルで溶出した。この溶出液は２６
０ｎｍの紫外吸収でモニターし、適切なフラクションを
集め、固定した量での紫外吸収で定量分析し、かつ室温
下で減圧遠心機中で蒸発させ乾燥した。

オリゴデオキシリボヌクレオチドの１徴・け精製したオ
リゴヌクレオチドのテスト溶液をポリヌクレオチドキナ
ーゼ及びｒ”Ｐ−ＡＴＰで３ｔｐラベルした。このラベ
ルした化合物を５０ボルト／ｃｌＩで４５分間電気泳動
にかけた後、１４−２０％のポリアクリルアミドゲルの
オートラジオグラフィーで確認した。この方法では分子
量を確認することができる。ヘビ毒ジェステラーゼと細
菌性アルカリフォスファターゼを使用してオリゴデオキ
シリボヌクレオチドをヌクレオシドに消化し、そして次
は逆相ＨＰＬＣカラム、並びに１０％アクリロニトリル
及び１％酢酸アンモニウム移動相を使用して、誘導され
たヌクレオシドを分離し定量することにより塩基組成を
決定した。

■・旦に人差 Ａ、全ヒト　　μＤＮＡの 正常のβ−グロビンのヒトゲノムＤＮＡホモ接合体を、
ステソトラーらによりＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ
。

Ｓｅｔ、の７２巻５９６６−５９７０頁に記載された技
術を用いてセルラインＭｏ１ｔ４（ヒユーマン・ジェネ
ティック・ミュータント・セル・レボジトリ−から入手
し、ＧＭ２２１９ｃと同定した）か°ら抽出した。

Ｂ、クローン化したグロビン゛　云　の゛正常のβ−グ
ロビン遺伝子の１．９　ｋ　ｂ　（７）旦憇Ｈ１断片を
コスミドｐＦｃ１１から分離し、ｐＢＲ３２２のＢａａ
＋Ｈ１部位に挿入した（ソベロンらの飽懸９巻２８７−
３０５頁（１９８０年））。合成４０塩基対プローブと
ハイブリダイズする領域を含むこの断片は、第１及び第
２のエクソン、第２のイントロン、並びに遺伝子の５°
のフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列を含む（ロー
ンらの釦旦１５巻１１５７−１１７４頁）。このクロー
ンはｐＢＲ３２８：　Ｈｂ八と名付けられ、ＡＴＣＣ第
３９，６９８号として１９８４年５月２５日に寄託され
た。

β−グロビンの鎌状赤血球貧血対立遺伝子の対応する１
、９　ｋ　ｂの旦ａｎ＋ＨＩ断片はコスミドｐＰ１２か
ら分ｇｏされ、上述の通りクローン化された。このクロ
ーンはｐＢＲ３２８：　ＨｂＳと名付けられ、ＡＴＣＣ
第３９，６９９号として１９８４年５月２５日に寄託さ
れた。

各組み換えプラスミドをＥ、コーリーＭＭ２９４（ＡＴ
　ＣＣ第３９．６０７号）へ形質変換し、そして増殖せ
しめた。

それぞれの全量が１００μｇであるｐＢＲ３２８：　Ｉ
ＩｂＡとｐＢＲ３２８：　１Ｉｂｓを単独で２０単位の
ｙ牡ＩＩ　にニーイングランドバイオ５１社）とともに
１６時間３７℃、１５０ｍＭのＮａＣ１，１２ｍＭのＴ
ｒｉｓ　ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、１２ｍＭのＭｇＣｈ
　、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び１００
μｇ／ａ＋１のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で消化
した。生成物はそれぞれｐＢＲ３２８：　ｌ１ｂＡ　／
　ＭｓｔｌＩ及びｐＢＲ３２８：　ＨｂＳ／ＭｓｔＩＩ
と名付ける。

■、ポリメラーゼの′ｒ°　　心 ６０ｍＭ酢酸ナトリウム、３０ｍＭ）リス−アセテート
及び１０ｍＭ酢酸マグネシウムを含むｐＨ８，０のｔｌ
ｉ衝液１００μｉへ１００ピコモルのプライマーＡ　（
ｄ　（ｃＡＣＡＧＧＧＣＡＣＴＡＡＣＧ）の配列）、１
００ピコモＪしのブライマーＢ　（ｄ　（ＴＴＴＧＣＴ
ＴＣＴＧＡＣＡＣＡ）の配列）及び１０００ピコモルの
デオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ及び
ＴＴＰを含む２μｌの溶液を加えた。上述した、下記の
ＤＮＡ源を加えた。

１０μｇの全ヒト野性型ＤＮＡ　（反応Ｉ）０．１ピコ
モルのｐＢＲ３２８：Ｈｂ八（反応■）０．１ピコモル
のｐＢＲ３２８：　ＨｂＳ　（反応■）０．１ピコモル
のｐＢＲ３２８：　Ｈｂ＾／Ｍｓｔｌｌ　（反応■）０
、１ピコモルのｐＢＲ３２８：ＨｂＢ／ＭｓｔＩＩ　（
反応■）非標的ＤＮＡ　（反応■） 得られる各溶液を１００℃で４分間加熱し２分間で室温
まで冷却し、その後Ｅ、コーリーＤＮＡポリメラーゼの
クレノー断片の４単位を含むｌμｌを加えた。各反応は
１０分間行い、その後ブライマー、ヌクレオチド及びＤ
ＮＡを加え、加熱し、冷却し、ポリメラーゼを加え、そ
して反応させるサイクルを反応Ｉについては１９回、反
応＋１−Ｖｌについては４回繰り返した。

第１サイクルの前、及び各反応の最後のサイクルの後で
取り出された反応Ｉ及びＨのアリコート４マイクロリツ
トルを、ｐ　Ｈ８，３の０．０８９Ｍ　）リス硼酸塩緩
衝液中で、２．５ｍＭＥＤＴＡ中で、１２％ポリアクリ
ルアミドゲルに加えた。このゲルを２５ポル）　／　ｃ
ｒｎ、４時間電気泳動させ、固相担体として機能するナ
イロン膜へ移し、そして、ｐ　Ｈ７，４で３０％のフォ
ルムアミド、３　ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハルツ及び５％
のドデシル硫酸ナトリウム中で、標準的技術を用いて調
製した次式：％式％） の３ｔｐでラベルされた４０塩基対の合成断片で検知し
た。第２図は、反応■及び■用の検知されたナイロン膜
のオートラジオグラフである。レーン１は０．１ピコモ
ルの５８塩基対の対照合成断片で、そのうちの１つの鎖
は上記プローブと相補的である。レーン２は第１の増幅
サイクルの前の４μｌの反応１の液である。レーン３は
２０回の増幅サイクル後の４μｌの反応１の液である。

レーン４は５回の増幅サイクル後の４μｌの反応■の液
である。レーン５はα−３ｔｐ−デオキシＮＴＰ及びポ
リメラーゼでラベルされたｐＢＲ３２２にューイングラ
ンドバイオラブ社）のヱ回り　にューイングランドバイ
オラプ社）から成る分子量標準である。

レーン３は、２０サイクル後反応混合物■は適切な分子
量を有する特定の配列を大量に含み、他の検出できる生
成物がないことを示している。５サイクル後の反応混合
物■もレーン４に示す通り出発物質である核酸と他の生
成物の他にこの生成物も含んでいる。

５サイクル後の反応■から■の液５．０μｌに上述の各
プライマ−５ピコモルを加えた。溶液を４分間１００℃
に加熱し室温へ戻した。それぞれ３ピコモＪＬｔＯ）ｃ
ｔ−”Ｐ−テオキ’ｉ　Ａ　Ｔ　Ｐ　％　ａ　−’　”
　Ｐ−デオキシＣＴＰ、α−３ｔＰデオキシＧＴＰ及び
α−”Ｐ−ＴＴＰ、並びに４単位のクレノー断片を加え
た。最終的な容積が１０μｌであり塩濃度が上記した通
りである反応を１０分間行わせた。ポリメラーゼ活性は
６０℃で２０分間加熱すると失われた。反応ＩＩ−Ｖｌ
の反応液４μｌを、０．０８９Ｍトリス硼酸塩緩衝液、
２．５ｍＭＥＤＴＡ中で１２％ポリアクリルアミドゲル
に加えた。このゲルを２５ポル）　／　ｃｒａ、４時間
電気泳動させ、その後オートラジオグラフ処理した。

第３図は、電気泳動のオートラジオグラフである。レー
ン１は分子量標準、レーン２は反応■、レーン３は反応
■、レーン４は反応■及びレーン５は反応■である。対
照としてのＤＮＡを伴なわない反応■のレーンはレーン
のどこにもイメージを有さない。図から、標的ＤＮＡか
ら予想される９４塩基対断片は、無傷のβ−グロブリン
ＤＮＡ配列が増幅用に使用できるときのみ存在できるこ
とが分かる（つまりレーン２のりＢＲ３２８：　ＩＩｂ
Ａ　、レーン３のｐＢＲ３２８：　ＨｂＳ及びレーン５
のｐＢＲ３２８：１（ｂＳ／Ｍ旦１１）。Ｍ口ＩＩによ
る消化はｐＢＲ３２８：　ｌｌｂ八を９４塩基対配列中
で切断し、それを増幅できなイヨウにし、９４塩基対の
バンドはレーン４に現れない。これに対し、ｐＢＲ３２
８：　ＨｂＳの９４塩基対配列はプラスミドがＭｓｔｌ
ｌで消化されても切断せず、従って第５図に示すように
増幅に利用できる。

第４図は９４塩基対配列を増幅する３ザイクルの連鎖反
応を示すものである。ＰＣＯＩとＰＣＯ２はプライマー
Ａ及びＢである。右の数はサイクルを示し、左の数は特
定の分子が生産されたサイクル数を示す。

災土斑主 本実施例は、ヒトヘモグロビン遺伝子中の対立遺伝子琶
旦Ｉｆ部位を含む１１０塩基対配列の増幅を示すもので
ある。

プライマーは実施例２の技術で調製されたものである。

１．０マイクログラムの全ヒトＤＮＡ、１００ピコモル
のｄ（＾ＣＡＣＡＡＣＴＣＴＣＴＴＣＡＣＴＡＧＣ）及
び１００ピコモルのｄ　（ｃＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣ
ＧＴＴＣＡＣＣ）を以下のような１００μｌの溶液に溶
解させた。

１、５　ｍ　Ｍ各４つのデオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸 ３０ｍＭｐＨ７，９のトリスアセテート緩衝液６０ｍＭ
酢酸ナトリウム １０ｍＭ酢酸マグネシウム ２５ｍＭジチオスレイトール この溶液を１００℃で１分間加熱し、迅速に２５℃に下
げて１分間加熱し、その後ＤＮＡポリメラーゼのクレノ
ー断片２．５単位を加えた。ポリメラーゼの反応が２５
℃で２分間行い、その後加熱、冷却、クレノー断片の添
加及び反応を望むだけ繰り返した。

各サイクルの効率が７０℃で、１５サイクル行って、β
−グロビン遺伝子の所望の１１０塩基対断片１．４フェ
トモルを合成した。

大施桝土 本実施例は、ヒトヘモグロビン遺伝子の対立遺伝子中の
Ｍｓｔ１１部位を含む２４０塩基対配列の増幅を示すも
のである。この配列は、Ｎｃｏ−Ｉ　、１（ｉｎｆ　ｌ
及びｙ■ＩＩ制限部位を含んでいる。

ｐＨが８．０で、６０ｍＭ酢酸ナトリウム、３０ｍＭ）
リスアセテート及び１０ｍＭ酢酸マグネシウムの混合物
（０，１ピコモルのｐＢＲ３２Ｂ　：　１ＩｂＡを含む
）に、 以下余白 １００ピコモルのｄ　（ＧＧＴＴＧＧＣ（：ＡＡＴＣＴ
ＡＣＴＣＣＣＡＧＧ）プライマー、１００ピコモルのｄ
（Ｔへへｃｃ丁ＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣ）プ
ライマーー、各１０００ピコモルのデオキシＡＴＰ、デ
オキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ及びＴＴＰ を含む２μ！の溶液Ａを加えた。

２つのプライマーは実施例２に記載した技術で調製した
。溶液を１００℃で４分間加熱し、空気中で２分間冷却
し、その後Ｅ、コーリーＤＮＡポリメラーゼのクレノー
断片４単位を含む液ｌμｌを加えた。反応を１０分間進
行させ、その後溶液Ａの添加、加熱、冷却、ポリメラー
ゼの添加及び反応からなるサイクルを３回繰り返した。

反応液５．０μｌに、上記の各オリゴヌクレオチドプラ
イマー５ピコモルを加えた。溶液を１００℃で４分間加
熱し、室温まで下げ、その後それぞれ３ピコモルのα−
３２ｐ−ラベルされたデオキシリボヌクレオシド三リン
酸及び４単位のクレノー断片を加えた。最終的な容量が
１０μｌで塩濃度が上記の通りである反応を１０分間進
行させる。ポリメラーゼ活性は６０℃で２０分間加熱す
ると失活し″た。

２μｌのアリコートをＮμ＞　Ｉ　％　１ｌｉｎｆ　Ｉ
及びＭ　ｓ　ｔ　Ｉ　ｒで消化し、ｐ　Ｈ８，３の０．
０８９Ｍ　）リスアセテート緩衝液、０．２５ｍＭＥＤ
ＴＡ中で１２％ポリアクリルアミドゲルに加えた。ゲル
を２５ボルト／ｃＩＩ＋で４時間電気泳動させ、オート
ラジオグラフ処理した。第５図は電気泳動のオートラジ
オグラフを示し、ここでレーン１は分子量標準、し７ン
２は酵素の消化を伴わないもの（無傷の２４０塩基対）
、レーン３はＮｃｏｌによる消化（１３１及び１０９塩
基対）、レーン４はＭｓｔｌｌによる消化（１４９及び
９１塩基対）、そしてレーン５は１ｌｉｎｆｌによる消
化（１４４及び９６塩基対）である。オートラジオグラ
フは２４０塩基対反応の増幅したものと一致する。

叉呈炎工 本実施例は、逐次的消化による鎌状赤血球貧血を検出す
゛るための本発明の方法の使用を示すものである。

以下余白 オリゴデオキシリボヌクレオチドの八　　びリン鼓■ ５”　　ＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴ
ＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧ　　３’の配
列のラベルされたＤＮＡプローブ（１がラベルを意味す
る）Ｒ５Ｏ６、及びＲ３０６と３つの塩基対がミスマツ
チしている ３°　ＧＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣ
ＧＧＣＡＡＴＧＡＣＧＧＧＡＣＡＣＣＣ５”の配列のラ
ベルされていないブロックオリゴマーＲ３ｌ０を、実施
例２（１）の方法に従って合成した。プローブＲ５０６
は、その５ピコモルを、７０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７
，６）　、ｌ　ＯｍＭＭｇＣｈ　、１．５　ｍＭスペル
ミン及び２．５　ｍ　Ｍジチオスレイトールを含む反応
容ｆｉ４０μｌ中の４単位のＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼにューイングランドバイオラブ）及び５０ピコモル
のγ−３２ｐ−ＡＴＰ　にューイングランドニュークレ
ア、約７２００Ｃｉ　／　ｍ　Ｍ）と接触させることに
よりラベルした。全容量を２５ｍＭＥＤＴＡで１００．
ｕＪに調節し、トリス−ＥＤＴＡ　（ＴＥ）緩衝？＆（
１０ｍＭトリス緩衝液、０．１　ｍＭＥＤＴＡ、ｐ　Ｈ
８，０）により平衡化されたバイオランド製の１ｍｌの
Ｂｉ。

Ｇｅ１Ｐ−４スピン透析カラム上でマニアティスらがＭ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　４６４−４６５
頁（１９８２年）に記載している方法に従って精製した
。ラベルされたプローブは、トリス−硼酸−ＥＤＴＡ　
（ＴＢＥ）緩衝液（８９ｍＭ）リス、８９ｍＭ硼酸、２
．５ｍＭＥＤＴＡ、、、ｐＨ８，３）中１８％のポリア
クリルアミドゲル（１９：ｌのアクリルアミド：ＢＩＳ
とバイオラッド）上で５００ｖｈｒにて電気泳動してさ
らに精製した。オートラジオグラフによる位置きめの後
、ラベルされたプローブを含む部分を切り取り、粉砕し
、０．２ｍｌのＴＥ緩衝液中へ一晩かけて４℃で溶出さ
せた。反応生成物のＴＣＡ沈澱は比活性が４．９　Ｃｉ
　／　、：７９モルであり、最終的濃度が２０ピコモル
／ｍｌであることを示している。

ラベルされないＲ３ｌ０ブロツキングオリゴマーは２０
０ピコモル／ｍｌの濃度で使用した。

、からのヒトゲノムＤＮＡの　を 実質的にステラトラ−らのハ閃７９巻５９６６−５９７
０頁（１９８２年、Ｍｏ１ｔ４について）に記載の方法
及びマニアティスらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｑ独工Ｉ
」−２８０＝２８１真（１９８２年）に記載の方法を使
用して、Ｍｏ１ｔ４．５Ｃ−１及びＧＭ２０６４のリン
パ球系から高分子のゲノムＤＮＡを分離した。

Ｍｏ１ｔ４　　（ヒユーマン・ミュータント・セル・デ
ポジトリ−、ＧＭ２２１９Ｃ）は正常のβ−グロビンに
ついてホモ接合体のＴ細胞系であり、そしてＡＴＣＣに
１９８５年３月１９日に寄託されたＳＣ−１は鎌状赤血
球貧血対立遺伝子についてホモ接合体のＥＢ■で形質変
換されたＢ細胞系である。ＧＭ２０６４　（ヒユーマン
・ミュータント・セル・デボジトリ−２ＣＭ２０６４　
）は胎児ヘモグロビンの遺伝的な永続性（ＨＰ　Ｆ　Ｈ
）についてホモ接合体である個体当初単離され、β−又
はδ−グロビン遺伝子配列を含んでいない。全ての細胞
系は１０％の牛胎児血清を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４
０中に維持された。

ｎ−血？ｉ　′からのヒトゲノムＤＮＡの′−既知の鎌
状細胞キャリヤー（ＡＳ）からのＣＨ１２と名付けられ
た臨床血液試料をカルフォルニア州オークランドの小児
病院のベルトラム・ルピン博士から得た。ヌンベルグら
のＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

とし７５巻５５５３−５５５６頁（１９７８年）に記載
されている方法の変法を使用して、主に末梢の血液リン
パ球から成るバフィーコート部分からゲノムＤＮＡを調
製した。

細胞を、５ｍｌのトリス−ＥＤＴＡ　−ＮａＣ１（ＴＥ
Ｎ）緩衝液（ｐＨ８の１０ｍＭトリス、ｐ　Ｈ３，１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮａｃ１）中に再懸濁し、０．２
ｍｇ／ｎ＋１のプロテイナーゼ、０．５％のＳＤＳに調
節し、そして３７℃で一晩インキユベートした。

過塩素酸ナトリウムを０．７Ｍに加え、そして細胞溶解
物を室温で１−２時間穏やかに振とうした。

細胞溶解物をフェノールとクロロフォルムの１：１混合
物３０ｍ１で抽出し、続いてクロロフォルム３０ｍ１で
抽出し、次にエタノールで核酸を沈澱させた。ペレット
を２ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁させ、ＲｐＪａｓｅを０
．００５ｍｇ／ｍｌに加えた。３７℃で１時間消化させ
た後、ＤＮＡを同量のフェノール、フェノール／クロロ
フォルム、及びクロロフォルムでそれぞれ一度ずつ抽出
し、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを０．５１のＴＥ
緩衝液に再懸濁させ、２６０ｎｍの吸収により濃度を決
定した。

２マイクログラムのゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス緩
衝剤（ｐＨ７，５）　、５０ｍＭＮａＣｌ、ｌＯｍＭＭ
ｇＣｈ、１５０ピコモルの配列 ｄ　（ｃＡＣＡＧＧＧＣＡＣＴＡＡＣＧ）のプライマー
Ａ１及び配列ｄ　（ｃＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡ
）のプライマーＢを含む反応容ｌ　１００μｌの当初溶
液中で増幅し、かつ蒸発を防ぐため約１００μｌ厚の鉱
油で被覆した。

各ＤＮＡ試料につき、１サイクルが次の３ステツプから
成る増幅のための１５サイクルを行った。

（１）２分間９５℃で熱ブロツクセント中で変性する。

（２）熱ブロツクセットを直ちに３０℃に移し２分間プ
ライマーとゲノムＤＮＡがアニーリングするようにする
。

（３）Ｅ、コーリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断
片にニューイングランドバイオラブ）５単位とデオキシ
ＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ及びＴＴＰそ
れぞれ１ナノモルを含む２ｐｉの溶液（１０ｍＭ）リス
（ｐＨ７，５）　、５０ｍＭＮａｃＩ、　１０　ｍＭＭ
ｇｃｌｇ　、及び４ｍＭジチオスレイトールから成る緩
衝液中）を加える。この伸長反応を３０℃にて１０分間
行った。

最後のサイクルの後、９５℃に２分間維持して反応を停
止させた。鉱油は０．２ｍｌのクロロフォルムで抽出し
て廃棄した。最後の反応液の容量は１３０μｌであった
。

２５マイクロリツトルの増幅されたゲノムＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、同量のＴＥ緩衝液中に再懸濁した。

１０マイクロリツトル（１５４ｎｇのゲノムＤＮＡと同
等の前増幅体を含む）を１．５ｍｌのマイクロフユージ
管に入れ、そして２０ｐｉｌのＴＥ緩衝液により最後の
容量を３０μｌとした。

試料を鉱油で被覆して９５℃で１０分間変性した。

ラベルされたＲ３０６ブローブ０．０２ピコモルを含Ｃ
；　０．６　ＭＮａＣｌ　１０マイクロリツトルを管に
加え、穏やかに混合し、直ちに５６℃の熱ブロックに移
して１時間おいた。ラベルしていないＲ３ｌ０ブロツキ
ングオリゴマー４マイクロリツトル（０，８ピコモル）
を加え、更に１０分間同じ温度でハイブリダイゼーシジ
ンを続けた。５マイクロリツトルの６０　ｍ　ＭＭｇＣ
ｈ／　０．１％ＢＳＡ及びｌｐｌのＤｅｌｌ（１０単位
、ニューイングランドバイオラブ）を加え、再アニーリ
ングされたＤＮＡを５６℃で３０分間消化した。１マイ
クロリツトルの１１ｉｎｆ　Ｉ　　（１０単位、ニュー
イングランドバイオラブ）を加え、更に３０分インキュ
ベートした。４μｌの７５ｍＭＥＤＴＡと６μｌのトラ
ッキング染料を最終容積が６１μｌになるように反応混
合物に加えて反応を終了した。

鉱油を０．２ｍｌのクロロフォルムで抽出し、１８μｌ
の反応混合物（４５ｎｍのゲノムＤＮＡ）をヘーファー
３Ｅ２００装置中の３０％ポリアクリルアミドのミニゲ
ル（１９：　１、バイオラド）に負荷した。このゲルを
ブロモフェノールブルー染料の前端が当初の位置から３
．　ＯｃＩａ動くまで約３００ボルトで１時間電気泳動
させた。該ゲルの前端の１．５　ｃｍは取り除かれ、残
りのゲルは４日間−７０℃で強化スクリーンに曝される
。

の　　ＬｆＪ、９　ス） 各レーンは４５ｎｇの増幅されたゲノムＤＮＡを含んで
いる。レーンＡはＭｏ１ｔ４　ＤＮＡを、レーンＢはＣ
Ｈ１２を、レーンＣは５Ｃ−１を、又レーンＤはＧＭ２
０６４を含んでいる。Ｍｏ１ｔ４は、細胞光たり２コピ
ーのβ＾遺伝子を有する正常の個体の遺伝子型ＣＡＡで
あり、Ｃ１１１２は、細胞光たり１個のβ４と１個のβ
３遺伝子を存する鎌状細胞キャリアからの臨床用試料’
（Ａ　Ｓ　）であり、そしてＳＣ−１は細胞光たり２コ
ピーのβ５を有する鎌状血球血貧血個体の遺伝子型を意
味する。ＧＭ２０６４はβ−又はδ−グロビン配列を含
有せず、ネガティブ対照として存在する。

写真から分かるようにＤｄｅＴで開裂された、β＾特異
的であるオクタマーはβ１遺伝子を含むＤＮＡにのみ存
在しくレーンＡ及びＢ）　、ＨｉｎｆＬで開裂された、
β３特異性を有するトリマーは、β３遺伝子を含むＤＮ
Ａにのみ存在する（レーンＢ及びＣ）。トリマー及びオ
クタマーの両者の存在（レーンＢ）は鎌状赤血球貧血キ
ャリアを示すものであり、オクタマーのみを生ずる正常
の個体（レーンＡ）及びトリマーのみを示す鎌状赤血球
貧血にかかっている個体（レーンＣ）から区別される。

比較のため、上記実験を増幅されていないゲノムＤＮＡ
を用いて繰り返し行い、増幅を行うと検出感度が少なく
とも１０００倍増加することが分かった。

ス１１江１ 本実施例は、ラベルされたプローブを使用することなく
全ヒ１−ＤＮＡ中の全く精製されていない単一コピー遺
伝子をゲル上で直接検出する方法を示すものである。

実施例３に記載した技術を用い、β−グロブリン遺伝子
の第１エクソン中の配列からの１１０塩基対断片を、全
ヒトＤＮＡｌ０マイクログラムから２０サイクルで増幅
した。この２０サイクル後に生産される１１０塩基対断
片は、臭化エチジウムにより容易に染色されてゲル上で
見ることができた。

配列は、最初に制限酵素旦ｄｅＩにより切断されると、
配列がβ−グロビンのＳ対立遺伝子中における場合のよ
うに酵素により認識される制限部位を含まないものでな
い限り、増幅されりかった。

災施炭Ｉ Ａ、　ヒトβ−グロビンＡ対立遺伝子からの１．９ｋｂ
挿入部を含有する合計１００フェムトモルのｐＢＲ３２
８，５００Ｃｉ１モルである各α−３２ｐ−デオキシＮ
ＴＰを５０ナノモルずつ、及び実施例３で使用し゛た各
プライマ−１ナノモルを、１００μｌの３０ｍＭ）リス
−アセテ−）（ｐＨ７，９）、６０ｍＭ酢酸ナトリウム
、１００ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭ酢酸マグ
ネシウムを含む溶液中に溶かした。この溶液を１００℃
にして２分加熱し、２５℃にて１分冷却した。４．５単
位のＥ、コーリーＤＮＡポリメラーゼ■及び０．０９単
位の無機ピロフォスファターゼを加えて反応混合物中で
ピロリン酸が生ずるのを防止し、その後反応を２５℃で
２分間進行させ、更に加熱、冷却、酵素の添加及び反応
のサイクルを９回繰り返した。各合成サイクルの後、１
０μｌのアリコートを取り出し１μｌの６００ｍＭＥＤ
ＴＡに加えた。それぞれを、９０ｍＭのトリスボレー°
ト及び２．５　ｍ　ＭのＥＤＴＡ中、ｐ　Ｈ８，３で１
４％のポリアクリルアミドゲル上で２４ポルｌ−／ａ、
２．５時間で分析した。操作の終了したゲルは、０．５
μｇ／ｌｌ１１の臭化エチジウムを加えた同じ緩衝液に
２０分浸し、当初の緩衝液で洗浄し、赤フィルターを用
いて紫外線中で写真を撮影する。

生産された１１０塩基対断片は紫外線ブゲルから切り出
し、そしてクレンコフ放射により係数した。

Ｎがサイクル数を意味し、ｙがサイクル毎の部分的収率
である式 ％式％） にデータを一致させようとする試みは、ｙが０．６１９
であるときに楽観的なものとなる。これは、十分な増幅
が起こっていることを暗示している。

Ｂ、各デオキシＮＴＰを１００ナノモルずつ１００μｌ
の反応溶液に加え、放射性ラベルを行わず、各サイクル
毎に液を取り出さなかった以外は、上記と同じ実験を繰
り返した。１０サイクル後に反応物を２分間沸騰させて
反応を停止させ、５７℃、１時間で再ハイブリダイゼー
ションを行った。

１１０塩基対生成物の配列を、その８μｌのアリコート
を、１μ℃のウシ血清アルブミン（２５ｍｇ／ｍｌ）と
ｌμｌの好適な制限酵素（且ｉｎ　ｆ　Ｉ　、、　Ｍｎ
１１　、　Ｍｓｔｌｌ、　Ｎｅｏ　Ｉ　）を加えて制限
分析し、３７℃で１５時間反応させて確認した。ＰＡＧ
Ｅは、上述の通り行った。

ス財１１影 本実施例は、ｐＢＲ３２８とｐＢＲ３２２の種々の断片
を増幅するために異なったプライマーを使用する例を示
す。

Ａ９次のプライマーを使いｐＢＲ３２８の１３０塩基対
断片を調製すること以外は実施例７Ａと同じように実験
を繰り返した。

ｄ　（ＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴ
ＴＣＡＣＴＡＧＣ）及びｄ　（ＧＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣ
ＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）８９次のプ
ライマーを用いたこと以外は実施例７Ａと同じように実
験を繰り返しｐＢＲ３２Ｂの２６２塩基対断片を調製し
た６反応時間はサイクル当たり２０分であった。

ｄ　（ＧＧＴＴＧＧＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧ
）及びｄ　（ＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴＣ
ＴＴＧ）Ｃ，ヒトβ−グロビンＳ対立遺伝子からの１．
９ｋｂの挿入部を含む、１００フェムトモルのｐＢＲ３
２８のｙ旦ＩＩ消化物を当初の鋳型として用いた以外は
、実施例８Ｂと同様に実験を行った。該プラスミドはＭ
　ｓ　ｔ　Ｉ　Ｉにより数回切断されたが、増幅すべき
配列の内側では切断が起こらなかった。更に、使用した
プライマーは次の通りで、２４０塩基対断片を生産した
。

ｄ　（ＧＧＴＴＧＧＣＣ八八ＴＣＴＡＣへへＣＣＡＧＧ
）　　及びｄ　（ＴＡＡＣＣＴＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣ
ＴＧＣＣＣ）Ｄ、１００フェムトモルのｐＢＲ３２２の
Σｒｕｌ消化物を鋳型として用い、１００μｌの反応液
中で各デオキシＮＴＰを２００ナノモル使用し、次のプ
ライマーを使用してｐＢＲ３２２から５００塩基対断片
を生産した以外は実施例７Ｂと同様に実験を行った。

ｄ　（ＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴ）及
びｄ　（ｃＴＴＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧ）
反応時間は３７℃でサイクル当たり２０分であった。最
後の再ハイブリダイゼーションｔよ５７℃で１５時間行
った。電気′泳動は４％アガロースゲル上で行った。

大施適主 本実施例は、インビトロ変異が増幅されたセグメントに
導入されるような本発明方法を例示するものである。

Ａ、Ｎｒｕｌで直線化したｐＢＲ３２２合計１００フェ
ムトモル、１ナノモルの７５塩基対断片を生成するよう
に設計されたそれぞれ次式 ％式％） のプライマー、それぞれ１００ナノモルの各デオキシＮ
ＴＰを、ｐＨ８の４０ｍＭのトリス、２０ｍＭＭｇｃ１
ｇ　、５ｍＭのジチオスレイトール及び５１１１ｇ／ｍ
ｌのウシ血清アルブミンの溶液１００μＮ中で混合した
。この混合物を１００℃にして１分間加熱し、水浴中２
３℃、０．５分間冷却し、次に４．５単位のクレノー断
片と０．０９単位の無機ピロフォスファターゼを加え、
反応を３分間行った。加熱、冷却、酵素添加及び反応の
サイクルを９回繰り返した。１０回目の反応サイクルは
凍結により終了させ、反応混合物のアリコート８μｌを
４％アガロースゲルに適用し、臭化エチジウムにより視
覚化した。

Ｂ、オリゴヌクレオチドプライマーとして次式のものを
使用した以外は実施例９Ａと同様の実験を繰り返した。

ｄ　（ｃＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧ）　
　及びｄ（八ＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ
ＧＧＧＡＧＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ
Ｔ）これらのプライマーは１０１塩基対を生産するよう
に設計され、その（２番目のプライマー中の）２６ヌク
レオチドはｐＢＲ３２２には存在しない。これらのヌク
レオチドはＴ７プロモーターの配列を表すもので、これ
を、ｐＢＲ３２２からの７５塩基対配列に、２０の相補
的塩基と２６塩基の５”側伸長部とを有するプライマー
を使用して連結した。この方法は２時間より少ない時間
で実施することができ、１００フェムトモルのｐＢＲ３
２２から比較的純粋な１０１塩基対断片２ピコモルを生
産することができた。

Ｔ７プロモーターはＲＮＡ転写を開始させるために使用
できる。Ｔ７ポリメラーゼを１０１塩基対断片に加えて
単鎖ＲＮ　Ａを生成ぜしめることができる。

Ｃ，オリゴヌクレオチドプライマーとして下記のものを
使用して、ｐＢＲ３２２から１０００塩基対断片を調製
した以外は実施例８Ｄと同様に実験を繰り返した。

ｄ　（ＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴ）　
　及びｄ　（ｃＣＡＧＣＡＡＧＡＣＩＩ；ＴＡＧＣＣＣ
ＡＧＣ）Ｄ、上記９Ｃと同様の実験を繰り返した。但し
、オリゴヌクレオチドプライマーとして下記のもの、ｄ
　（ＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴ）　　
　　及びｄ　（ＡＡＴＴ八八ＴへへＧＡＣＴＣＡＣＴＡ
ＴＡＧＧＧＡＧＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣ
ＣＣＴ）使用して１０２６対断片を調製した。２番目の
プライマー２６ヌクレオチドはｐＢＲ３２２には存在せ
ず、上記のＴ７プロモーターを示すものである。このプ
ロモーターは、ｐＢＲ３２２からの１０００塩基対断片
に隣接して挿入された。

これらの結果は、鋳型鎖と完全にマ・ソチしていないが
それにもかかわらず十分にノ１イブリダイズして酵素的
に伸長するプライマーは、当初の鋳型に対応する鎖より
むしろプライマーの鎖を含む長鎖生成物を生成せしめる
ということを暗示する。

長鎖生成物はインビトロ変異を生じさせる第２のプライ
マー用の鋳型としての役割を果たす。その後のサイクル
では、更に多くのミスペアしたフ′ライミングが要求さ
れないので、効率が減少することなくこの変異は増幅さ
れる。この場合その５°末端に相補的でない伸長部分が
あるプライマーが、複製されるべき鋳型に隣接して生成
物中に新しい配列を挿入するために使用された。

大施尿上皇 本実施例は単コピー遺伝子を増幅させる際にバックグラ
ウンドを減少させるためにネスト状に（ｎｅｓ　ｔｅｄ
）セットしたプライマーを使用することを例示するもの
である。

野性型β−グロビン対立遺伝子についてホモ接合体であ
る全ヒトＤＮＡに対して、２−０サイクルの増幅を次の
ように行った。１０μｇのＤＮＡ、それぞれ２００ピコ
モルの次式のプライマー、′ｄ（八ＣＡＣＡＡＣＴＧＴ
ＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ”）　　　及びｄ　（ｃＡＡＣＴ
ＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）並びに１００ナノモ
ルずつのｄＮＴＰを、１００μｌの３０ｍＭ）リス−ア
セテート、６０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのジチ
オスレイトール、及び１０ｍＭの酢酸マグネシウム中で
１００℃にて１分間加熱し、２５℃に１分間下げて、そ
して２単位のクレノー断片とともに２分間処理した。加
熱、冷却、クレノー試薬の添加のサイクルを１９回繰り
返した。１０μｌの液体を反応混合物から取り出し、更
に１０回の増幅のためのサイクルを次の各プライマーを
用いて行った。

ｄ　（ｃＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣ
ＴＣＣＴＧ）　　及びｄ　（ｃＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡ
ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣ）これらは、上
記で生産された１１０塩基対断片中に含まれる５８塩基
対断片を増幅した。増幅すべき最後の１０回のサイクル
は、１０μｌのアリコートを、上記した各デオキシＮ　
Ｔ　Ｐ　１００ナノモルと各ブライマー２００ピコモル
を含む９０ａｌｔの新しいトリス−アセテート緩衝液に
希釈することにより達成することができる。反応条件は
上記の通りとした。１０サイクルの後ｌＯμｌのアリコ
ート（当初のＤＮＡの１００ナノグラムに対応）を６％
のＮｕレシーブＦＭＣ社）アガロースゲルに加え、臭化
エチジウムを使って視覚化した。

第１０図は、紫外線で発光させた従来法の通り赤いフィ
ルターを通して写真楊影した上記ゲルを示すものである
。レーン１は分子量のマーカーである。レーン２は上記
反応のアリコートである。

レーン３は当初の野性型ＤＮＡが増幅の前にＤｄｅｌに
より開裂されたこと以外は上記したものと同じ反応のア
リコートである。レーン４は鎌状赤血球貧血β−グロビ
ン対立遺伝子についてホモ接合体であるヒ）ＤＮＡを増
幅の前に旦ｄｅＩで処理したこと以外は上記と同様な反
応のアリコートである（鎌状赤血球貧血対立遺伝子は増
幅される断片内にＤｄｅ１部位を含まない）。レーン５
は鮭の精子ＤＮＡでヒトＤＮＡを置き換えた以外は上記
と同様の反応のアリコートである。レーン６は増幅後反
応液をＤｄｅｌで処理したこと以外は上記と同様な反応
のアリコートである（Ｄｄｅｌは５８塩基対の野性型生
成物を２７塩基体及び３４塩基体の断片に変換する）。

レーン７は増幅後立ｄｅｌで処理したレーン４の材料の
アリコートである（５８塩基対の鎌状赤血球貧血生成物
は旦ｄｅｌを含まない）。

アガロースゲルの臭化エチジウム染色のみを使用してヒ
トＤＮＡの１マイクログラムからの単コピー遺伝子を代
表する５８塩基対断片を検出するためには、約５００．
０００倍に増幅することか必要である。これは、ここで
２つのオリゴヌクレオチドのネスト状セットを使用して
達成することができる。第１のセットは１１０塩基対断
片を増幅し、内部のネスト状セットは、第１０図に示す
ように便利に検出できるレベルになるまでこの生成物の
サブ−断片を増幅する。先行する増幅工程で増幅された
配列中に含まれ、又他のブライマーの伸長生成物中にも
含まれるより小さな配列をブライマーを使って増幅する
末法は、例えばコナーらのＰＮＡＳ８０巻２７８頁（１
９８３年）及びレアリーらのハ閃８０巻４０４５頁（１
９８３年）に記載されているように放射性同位体又は非
放射性同位体プローブのハイブリダイゼーションの方法
論に頌ることなく、β−グロビンの座における野性型を
鎌状赤血球貧血対立遺伝子から区別することを可能にす
る。

去施開上上 末法は、患者のＤＮＡ試料中の例えばクラミジアのよう
な伝染性疾患と関連する特定の配列を、所望の増幅され
た配列を含むビオチン化されたハイブリダイゼーション
プローブを使用しかつ前述の米国特許第４，３５８，５
３５号に記載された方法を使用して検出する際に有用で
あることが期待される。

ビオチン化されたハイブリダイゼーションプローブは、
一部が二重鎖となったＤＮＡに、次式のスペーサーアー
ムを介してビオチンに結合した４”−メチレン置換−４
，５′−８−トリメチルプソラレンを挿入しかつ光を照
射することによｊＱ調製することができる。

式中Ｒは−Ｈ又はＣＨＯ基であり、ＲＩＩは−１１であ
り、Ｘは１〜４の数であり、そしてｙは２〜４の数であ
る。プローブ上のビオチニル基の検出は、エンゾバイオ
ケム社により市販されているストレプタビジンー酸性フ
ォスファターゼ複合体を用いて、パンフレットに製造者
が示している検出方法により達成することができる。ハ
イブリダイゼーションプローブは、検出用複合体との結
合、及びそれに続く酸性ホスファターゼにより触媒され
る反応（この反応が沈澱性色素を生成する）に基く沈澱
した染色スポットとして見ることができる。

林料Ω寄託 細胞系５Ｃ−１（ｃＴＣＣ９００８２）は、１９８５年
３月１９日、米国、２０８５２　、メリーランド州ロッ
クビルパークローンドライブ１２３０１に所在するアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ
）にＡＴＴＴ受理番号第ＣＲＬ８７５６号として寄託さ
れた。５Ｃ−１の寄託は、ＡＴＣＣと本特許出願人のシ
ータス・コーポレーションとの間の契約に従って行われ
た。ＡＴＣＣとの契約は、本寄託を記載しかつ特定する
米国特許が発行された場合又は米国又は外国特許出願が
公衆に公告された場合又は公開された場合のいずれか早
い方が来たときにこの細胞系の子孫を公衆がそれを永続
的に利用できるようにするために提供し、更に本細胞系
を利用させることについては、米国特許商標局長官が米
国特許法第１２２条及びそれに関する長官のルール（３
７ＣＦＲＬ　１４条も特に８８６０Ｇ６３８に関連して
含む）に従って権限を持って決定した人間に対しても行
う。本出願の譲受人はもし寄託した細胞系が好適な条件
下で培養したにもかかわらず、死滅し、失われ、損傷し
たときは通知を受けてから迅速に同じ細胞系の育成培養
基と置き換えることに同意する。

纏めると、本発明はまず１つ又はそれ以上の特定の核酸
を、プライマーの伸長により生産される生成物が引き続
き次のプライマーの伸長反応の鋳型としての役割を果た
すような連鎖反応を用いて増幅させることにより核酸中
の配列を検出するようにした方法を提供する。末法は当
初にほんの僅かの量しか含まれていない核酸配列を検出
するために特に有用である。更に増幅法は分子クローニ
ングにも使用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、増幅されることが望まれるヒト−β−グロビ
ンの９４塩基対長の配列を示すものであり、鎌状赤血球
貧血に伴う単一塩基対変化を９４ｍａｒの下方に描いで
ある。 第２図は、ヒトの野性型ＤＮＡ中、及び正常のβ−グロ
ビン遺伝子の１．９　ｋ　ｂのＢａａ＋ＨＩ断片を含む
プラスミド（ｐＢＲ３２８：　ＨｂＡと示される）中に
含まれる上記９４ｍａｒの増幅を示す臭化エチジウムで
染色されたポリアクリルアミドのゲルの写真である。 第３図は、ｐＢＲ３２８：　ＩＩｂＡ　、及びβ−グロ
ビンの鎌状赤血球貧血対立遺伝子の１．９　ｋ　ｂの１
憇ＨＩ断片を含有するプラスミド（ｐＢＲ３２８：　Ｈ
ｂＳと称する）中に存在する特定の標的９４ｍａｒ配列
のいずれかの増幅を示すポリアクリルアミドゲル電気泳
動のオートラジオグラフを示し、ｐＢＲ３２８：　Ｈｂ
＾では増幅されるべき配列がＭｓｔｌｌにより開裂され
、そしてｐＢＲ３２８：　ＨｂＳでは増幅されるべき配
列が処理されたがＭｓｔＵにより開裂されなかった。 第４図は、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用い
る３サイクルについて、ヒトβ−グロビンの所望の９４
１１１ｅｒ配列の増幅のためのポリメラーゼの連鎖反応
のステップと生成物の詳細を示すものである。 第５図は、ｐＢＲ３２Ｂ　：　ＨｂＡ中の２４抛ｅｒＱ
ａ列の４サイクル後の増幅を示す臭化エチジウムで染色
されたポリアクリルアミドのゲルを示す写真であり、こ
こはアリコートがＮｃｏＴ＜レーン３）　、Ｍｓｔｌｌ
（レーン４）又は且１ｎｆｌ（レーン５）により消化さ
れる。レーン１は分子量の基準で、レーン２は無傷の２
４０ｂｐの生成物を含んでいる。 第６図は、Ｄｄｅｌ及びＨ４ｎｆｒ制限部位間にある正
常な（βＡ）β−グロビン遺伝子及び鎌状赤血球（β３
）β−グロビン遺伝子の配列を示すもので、β６につい
ての１本線は旦ｄｅ１部位（ｃＴＧＡＧ）の位置を示し
、β１及びβ３についての２重線はＨｉｎｆ１部位（Ｇ
ＡＣＴＣ）の位置を示している。 第７図は、４０ｍｅｒプローブ、並びにＤｄｅｌ及びこ
れに続く基１ｎｆｌ制限酵素を用いる正常β−グロビン
の逐次的な消化の結果を示すものである。 第８図は、第７図と同じ４Ｑｍｅｒプローブ並びにＤｄ
ｅｌ及びこれに続く基１ｎｆｌ制限酵素を使用する鎌状
β−グロビンの逐次的な消化の結果を示すものである。 第９図は、この発明の増幅にかけられた全ヒトＤＮＡの
試料中に存在するβ−グロビン対立遺伝子を特異的に特
徴付けるための、第７図と同じ４Ｑｍｅｒプローブの使
用を示す、臭化エチジウムで染色されたポリアクリルア
ミドのゲルを示す写真である。 第１０図は、臭化エチジウムと紫外線を用いて視覚化し
た６％のＮｕシープアガロースゲルの写真を示すもので
ある。この写真は、１ｔｏ−ｂ　ｐ増幅生成物のサブ−
フラグメントの増幅を示し、このサブ−フラグメントは
１１０ｂｐ断片内の内部ネストである。 以下余白 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ ２重鎖９４−１）Ｉ）配列 ＡＡＡＣＧ　　ＡＡＧＡＣＴＧＴＧＴ　　　ＴＧＡＣＡ
ＣＡＡＧＴ　　ＧＡＴＣＧＴＴＧＧＡ↑ 対立遺伝子塩基対 ＤＮＡポリモルフイズム ＣＴＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣ
ＡＡＴＧ　　ＡＣＧＧＧＡＣＡＣｌ　　　　　２　　３
　　’　　　　　　　５　　ｂｐ。−−１４１ 一、ｍｉＰ　　４８ ｂｐ　　ｉ　　　　　２　　３４　５ 、ｗ、、　　　、ｅｍｉｉａ　−１−Ｉ−１餠 眉らｍ− １４１１、。 ７．４７．。２１τｌい２．ぞ−〆τ；ぜ５１七；ニー
Ｂ ｆ５２”ｌ１ｌｌｌｌｓａ　　　　゛ 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、４−２　　　　：　　　ポリメラーゼ　ＬＭＰ
Ｓ；変性、再アニール ＯＣＣＡＴＣＴＡＴＩＧ　ｃ＋ｒＴＫχＴ罠ａフコσＯ
℃ｍｒ８工！工２に２伸長 ５’　　ＰＣＯ２面ｍロスχＡ→伸長 ２　ＧＧＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡＡ面駄蘭拡紀厨治元ワ諮
３スＫＴＧＡＴＣＧＩ％Ｇ　冗■コＧωに冗ａσに２　
　　　　　　　　＋ｒＴ′ｒＧｍ　ｍ℃ｘｚｚｍ伸長 ５’　　ＰＣＯ２ＴＴ１’Ｇ３Ａ−−伸長１ＧＧＴＡＧ
ＡＴＡＡＣＷ−蛎に男ム＋品振に心にＶ■頂圀算に刀α
に四−て５’　　ＰＣＯ２ＴＴｒＧｍＡ−伸長 ２　　　　　　　焦蛎占晶弔石ひα”ＪＪＣＩ阜℃＝腐
算に℃在■τｒπ０苅煽ＴＡＡＣｃＡＡｒＡＡＭ　蛎Ｊ
圧品ｍに℃に刀剋口圏覧に刀暎つ。ｒχｂｐ　　’　　
　　　　　　２　　３　４　６ＲＧ、５ 図面の２γ１書（内容に変更なし）ｒ ＦＩＧ、７ ′はラベル 図面のか、ビ（内、：口こ変更なし） ＦＩＧ、８ ”　ｉ、、ｔ　’ｉ−＜ｙｖ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　ＡＦｔＧ、　！０ 手　続　補　正　書（方式） ％式％ ２、　発明の名（に１、 核酸配列の増幅方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　ンタス　コーボレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎〕門−丁目８番１０号５、
　補正命令の日付 昭和６１年６月２４０（発送［Ｊ）７３７丁−６、補正
の対象 図　　面（第１．４．＋５．７．８図）７、補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし） ８゜添付書類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、１つの核酸又は複数の核酸の混合物（各核酸は同一
   の長さ又は異る長さの２つの別個の相補的鎖から成る）
   中に含まれる少なくとも１つの特定の核酸配列の増幅方
   法であって、 （ａ）前記鎖を各異る特定の配列を増幅するための２つ
   のオリゴヌクレオチドプライマーにより、増幅されるべ
   き各異る配列について、各核酸鎖に相補的な各プライマ
   ーの伸長生成物が合成される条件下で処理し、ここで、
   前記プライマーは各特定の配列の異る鎖と実質的に相補
   的であって１方のプライマーから合成された延長生成物
   がその相補体から分離された場合に他方のプライマーの
   延長生成物の合成のためのプライマー鋳型として機能す
   ることができるように選択され； （ｂ）前記プライマー延長生成物をそれらが合成された
   鋳型から分離して単鎖分子を生成せしめ；そして （ｃ）段階（ｂ）から生じた単鎖分子を段階（ａ）のプ
   ライマーにより、段階（ｂ）において生成した各単鎖を
   鋳型としてプライマー延長生成物が合成される条件下で
   処理する； ことを含んで成る方法。 ２、段階（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１回反復するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、段階（ｂ）を変性により又は酵素ヘリカーゼを使用
   して行い、そして段階（ａ）及び（ｃ）を重合のための
   誘導剤及び４種類の異るヌクレオチドを用いて行うこと
   を特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の
   方法。 ４、段階（ａ）及び（ｃ）を、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ
   ）ＤＮＡポリメラーゼ I 、Ｅ．コリＤＮＡポリメラー
   ゼ I のｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、
   熱安定酵素、又は逆転写酵素から選択された重合のため
   の誘導剤を使用して行うことを特徴とする特許請求の範
   囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５、前記核酸がＤＮＡであり、そしてプライマーがオリ
   ゴデオキシリボヌクレオチドであることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方
   法。 ６、前記核酸がメッセンジャーＲＮＡであり、そしてプ
   ライマーの集合を各相補的鎖のために使用し、その１つ
   は相補的鎖と１００％相同であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法
   。 ７、段階（ａ）において使用される核酸の混合物が段階
   （ｃ）により生成される前増幅工程の生成物であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか
   １項に記載の方法。 ８、使用されるプライマーが前増幅工程で使用されたプ
   ライマーと異ることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   〜第７項のいずれか１項に記載の方法。 ９、１方のプライマーが、増幅されるべき特定の配列と
   相補的でない少なくとも１個のヌクレオチドを含有する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第８項のいず
   れか１項に記載の方法。 １０、段階（ａ）及び（ｃ）における２つのプライマー
   がそれぞれ少なくとも１０００：１のプライマー：相補
   的鎖のモル比で存在することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載の方法。