JPS6070086A - コロナウイルス用ワクチンの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はコロナウィルス用ワクチンの調製方法に関する
ものである。特に本発明はコロナウィルスのゲノムＲＮ
ＡまたはメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相当する
合成りＮＡの新規で迅速な調製方法に関するものである
。本発明方法によって得られるＤＮＡ分子を、クローニ
ングベクターを形質転換によって適当な宿主細胞に持ち
込んだ後ＤＮＡ分子を発現に導くことができるり四−ニ
ングベクターに導入することができる。発現後に得られ
る生成物（タンパク質）を、コロナウィルスに対する細
胞性免疫応答または抗体の生成を刺激するワクチンの調
製のために用いることができる。

本発明による方法の他の応用としては、ウィルスＲＮＡ
のヌクレオチド配列をＤＮＡクローンから決定すること
ができ、その後コロナウィルスに起因する病気に対して
防御する合成オリゴペプチドワクチンを、前記ヌクレオ
チド配列の知識によって調製することができる。

また本発明方法はＲＮ　Ａに結合するＤＮＡプライマー
を用いてウィルスＲＮＡのヌクレオチド配列を直接決定
するために使”用することができる。

ＤＮＡプライマーは配列反応のための出発点としで役立
つ。

（従来の技術） 現在まで、ウィルスワクチンは弱毒性ウィルスまたは不
活化ウィルスに基づいて調製されてきた。

この種のワクチンは全ウィルス粒子を含む。

また、若干のウィルスからいわゆるサブユニットワクチ
ンを調製する試みがあった。この種のワクチンは全ウィ
ルス粒子を含まず、１種または数種の免疫原活性ウィル
スタンパク質を含むだけである。

ワクチンの調製分野における最近の開発は組換えＤＮＡ
技術の利用である。ウィルスゲノムのヌクレオチド配列
を完全にまたは一部分含むＤＮＡ分子を、クローニング
ベクターに導入することができる。この種のクローニン
グベクターを形質転換によって適当な宿主細胞に導入す
る場合、ウィルスＤＮＡは発現になることができる。こ
の方法で得られるタンパク質をワクチンの調製に用いる
ことができる。

これまでは玉鎖ＲＮＡウィルスからのコピーＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）分子は、ピリオンＲＮＡまたはｍＲＮＡの３′
末端に位置したポリ（Ａ）ストレッチに結合するオリゴ
（ｄＴ）との反応を開始することによって得られていた
。

（発明が解決しようとする問題点） この既知の技術によると、ゲノムの５１末端を用いるよ
りも、ゲノムの８′末端に相当する再結合ＤＮＡクロー
ンを得る方が容易である。これは事実、努力して研究さ
れたコロナウィルス、すなわちマウスの肝炎ウィルス株
Ａ　５９　（ＭＨＶ−Ａ５９）に対して、ゲノムの最末
端の８′末端に位置するＮおよびＥ□タンパク質に対す
る遺伝子暗号のヌクレオチド配列のみが、これまで記載
されていることからも明らかである。中和抗体を引き出
すＥ２分子に対してコードする遺伝子情報はクローンお
よび配列には極めて難しい。

（問題点を解決するための手段） コロナウィルスのゲノムＲＮＡまたはｍＲＮＡに相当す
る合成ｃ　ＤＮＡを迅速に得ることができ（４） る方法を見出した。

最近の研究では、宿主細胞の細胞質において圧銅ゲノム
と共に合成されるマウスの肝炎ウィルス（ＭＨＶ）の６
亜種ｍＲＮＡは、従来のＲＮＡスプライシングに見出さ
れる機構に似ているが明らかに相違する機構によって共
に結合するリーダー配列とボディ配列から成る。この機
構は相接しない配列を、コロナウィルス感染細胞の細胞
質において機能ｍＲＮＡを生成するように結合する。

コロナウィルスは玉鎖ＲＮＡウィルスに包まれる。ゲノ
ムＲＮＡは線状であり長さが１５，０００〜２０，００
０塩基である。コロナウィルスについて、ＭＨＶ鎖Ａ５
９は最もよく研究されている。

ＭＨＶは細胞質が同型であり、ウィルスの遺伝情報を１
種のゲノムＲＮＡおよび数種の亜ゲノムｍＲＮＡとして
感染細胞中に発現する。これらのｍＲＮＡは等モル量で
はないが比較的一定割合で感染期間中に形成される（参
照Ｊ、　Ｌ、　Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚら、ＶｉｒＯＩＯｇ
ｙ　１１４　（１９８）　、　８９〜５１頁）。

ウィルスＲＮＡのリボヌクレアーゼＴ１分解の後に得ら
れるオリゴヌクレオチドの分析によって、ＭＨＶ株Ａ５
９のｍＲＮＡ７からのＴ□オリゴヌクレオチド１０およ
び１９（使用した命名法についてはＭ、　Ｍ、　Ｏ，Ｌ
ａｉら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４１　（１９８２）　。

５５７〜５６５頁参照）は、相当するゲノムの８′末端
において存在しない（Ｗ、　Ｊ、　Ｍ、　５ｐａａｎら
、Ｊ、Ｖｉｏｌ、４２（１９８２）、４８２〜４８９頁
参照）ことが見出された。これは、これらのオリゴヌク
レオチドが全ｍＲＮＡが共通に有するリーダー配列から
誘導されることを示している。オリゴヌクレオチド１０
は一層大きいｍＲＮＡおよびゲ／ムＲＮＡ中に見出され
たが、オリゴヌクレオチド１９については、ｍＲＮＡの
特定の電気泳動移動度の差を示した。このオリゴヌクレ
オチドはｍＲＮＡ７　、ｍＲＮＡ６およびｍＲＮＡ５中
にオリゴヌクレオチド１０．１９ａおよび８ａとしてそ
れぞれ存在する。オリゴヌクレオチド１９および１９ａ
は塩基組成が非常に似ている。また、ｍＲＩＪ１６およ
び一層大きいｍＲＮＡ中に見出され、ｍＲＮＡ　７にお
いては見出されなかったオリゴヌクレオチド１７は、オ
リゴヌクレオチド１９および１９ａの塩基組成に似てい
る塩基組成をもつ（Ｊ、　Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、Ｎｕ
ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ユ（１９８８）、８
８８〜８９１頁）。５′末端でｍＲＮＡは共通に互いに
少なくとも５種のヌクレオチドを有する。

これらのデータを第１図の模式図で表すことができる。

第１図において、・印とＡＮは、それぞれ５１末端構造
および８′末端ポリアデニル酸塩構造を示す。リボヌク
レアーゼＴ０耐性オリゴヌクレオチドを数字で示ず。配
列ＸおよびＹはまだ同定されていなかった。Ｅ、　（マ
トリックス／エンベロープタンパク質）およびＮ（ヌク
レオキャプシドタンパク質）はそれぞれｍＲＮＡ６およ
び７の翻訳生成物である。四角で囲んだ領域をｍＲＮＡ
の他の領域よりも大きい寸法で示した。

第１図のモデルでは、ゲノムＲＮＡ　（またはｍＲＮＡ
１　）の５′末端に示す配列は、各亜ゲノムｍＲＮＡの
５′末端にも示されなければならない。

これらの配列を以下「リーダー」と呼ぶ。上記の（７ラ 発見に基づいて、ＭＨＶ−１５９ヌクレオチド１０はこ
れらの配列の中に存在しなければならない。またＭＨＶ
−１５９オリゴヌクレオチド１９および１９ａの一部は
リーダー内に存在しなければならないが、ｍＲＮＡの種
々の「ボディ」とのリーダー配列の結合から差が生じる
であろう。オリゴヌクレオチド１７はｍＲＮＡＲＮＡツ
ボディ末端にて配列を示し、その一部はｍＲＮＡ７を作
る際に失われるが、例えば、ｍＲＮＡ６を作る際には失
われない。

第１図のモデルを、ｍＲＮＡ７からコピーした単鎖０Ｄ
ＮＡとゲノムＲＮＡまたはｍＲＮＡ６との間に形成され
るハイブリッドの電子顕微鏡分析によって試験した。こ
の方法で得られたデータは第１図のモデルをよく支持し
ている。

また第１図のモデルは、ｍＲＮＡ７とゲノム両者に存在
するヌクレオキャプシド遺伝子の直接上流領域のヌクレ
オチド配列に見られる差によって確かめられる。

さらに第１図のモデルの支持は、ＭＨＶ−Ａ５９（８） のゲノムの相当する領域と全く同じでなければならない
ｍＲＮＡ７の５′末端にて、配列を直接決定することに
よって見出された。

これらのことを第１表および第２表にまとめる。

第１表はＭＨＶ−１５９ｍＲＮＡの「ボディＪおよび「
リーダー」の結合位置に関連する。

Ｃ！ＩＩ　Φ ＋：）　ｐ 一部 ｃ！３ｃ！＋ ｃ！３Ｃ！ｌ　ｂ ■　→　ｐ く　■　■ ＥＥ ＯＯＯ ＥＥ ＤＤ ＥＥ ：）　ｐ　＋：） ′；Ｉ　■　ｐ ＥＣ！ＩＩＥ 臣　ｐ （１１） 配列は次のように決定した。

ｍＨＮＡ７は、ＤＮＡプライマーと共にＲＮＡ上に直接
配列する、 一ゲノム（ｍＲＮＡ１　）は組換え体ＣＤＮＡ−クロー
ン（Ｓ９）を配列する、 一オリゴヌクレオチド１９ａは２種の前述の配列を用い
て最大のホモロジーを捜す。

これによって、ＭＨＶ−Ａ５９ｍＲＮＡ７ボデイの５′
末端は位置−２１、ｍＲＩＪＡ７の分枝位置およびゲノ
ムを越えて伸びることができないことが明らかとなろう
。上述のように、Ｔ□オリゴヌクレオチド１９ａ（これ
はｍＲＮＡ６に対して特異的である）およびＴ０オリゴ
ヌクレオチド１９（これはｍＲＮＡ７に対して特異的で
ある）は極めて類似した塩基組成を有する。塩基組成か
らの１９ａの配列を予言することによって（Ｍ８Ｍ、　
Ｃ０Ｌａ１　ら、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４−二１（１９８
２）、５５７　〜５６５頁参照）、また位置−２４と−
２との間のＭＩ（Ｖ−Ａ５９と比較することによって、
ｍＲＮＡ６に結合したリーダー配列の８′末端がオリゴ
ヌクレオチド１９と１９ａにおける最初の塩基差（５′
から８′まで読む）を越えて伸びることができないこと
がわかる。このことから、ＭＨＶ−１５９に対してオリ
ゴヌクレオチド１９と１９ａを生成するリーダーとボデ
ィ配列の結合が配列５　’ＡＡＵＧＵＡＡＵＯＵＡＡＡ
ＯＵ８　’の中のどこかで行われることになる。従って
すべて、結合工程中に反復パリンドｏ　−Ａ　Ａ　Ｕ　
ＯＵ　Ａ　（または配列ＡＡＵＯＵ）が認識信号として
役立つことを示している。。

用いられるデータはポリメラーゼジャンプ機構によって
説明される（　Ｊ、　Ｐｅｒｒａｕｌｔ、０ｕｒｒ、　
Ｔｏｐ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　９８　（１
９８１）　、　１５１〜２０７頁参照）。この種の機構
は負の鎖になった「鋳型」の８′末端からの短いＲＮＡ
転写の合成を含む。次いでポリメラーゼ／リーダーコン
プレックスまたはリーダー単独を、転写を続行する負の
鎖になった鋳型の内側の位置に転位する。この転位は鋳
型からのリーダーの解離を含むかまたは含まない。

上述の機構は科学的見地からだけではなく、特定の遺伝
子の０ＤＮＡ分子操作およびこれら遺伝子の配列決定の
ための新しい方法を示すものである。これは１例として
ＭＨＶ−Ａ５９に関して示すものである。上記、のよう
に、リーダーとボディとの間の結合は配列５　ＡＡＵＯ
ＵＡＡＵＯＵＡＡＡＯＵ８　’で行われる。この配列は
遺伝子Ｆと遺伝子Ｇとの間のゲノムの内部領域に存在す
る。また本発明は、この配列が完全にまたは部分的に他
の遺伝子開領域に存在すると仮定できる事実に基づいて
いる。これは、この配列またはその一部（例えば、８　
’ＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡ５’　）に補足的にあ
るプライマー分子を、０ＤＮＡの調製またはその配列の
確立のために出発点として使用することができることを
示す。ゲノムＲＮＡを用いる場合、相当する遺伝子の特
性を示している。ディメンションを有する若干の不連続
の単鎖ｃＤＮＡ分子を合成することになる。

正しいＤＮＡ分子を選択することができ、その後で第２
の鎖を合成しクローニングすることができる。

また１同じプライマーを精製したｍＨＮＡ（１〜７）に
結合することもできる。正しい濃度を用いる場合、これ
は内部位置に結合するが、リーダーには結合しない。そ
の結果、特に次に続く一層小さいｍＲＮＡの中に存在し
ないｍＲＮＡ領域に相当する単鎖ｃ　Ｄ　Ｎ１分子が得
られる。この○ＤＩＪＡ分子を単離することができ、第
二の鎖を、ＲＮａｓｅ　Ｔ□オリゴヌクレオチド１０　
（５’ＴＡＣ！０ＣＴ（３ＴＯＡＡＯＴＯＴＡＡＡＡＯ
８’　）またはその領域からの類似分子に相当するヌク
レオチドを用いて「プライミング」によってつくること
ができる。

以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明する。

（実施例） 実施例ｌ ＲＮＡ６を、スパーンらによって記載されたように（Ｗ
、　Ｊ、　Ｍ、　５ｐａａｎら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４２
　（１９８８）。

４２２〜４８９頁）、ＭＨＶ　−Ａ　５９を用いて感染
させた細胞から単離し、マトリックスとしてｃＤＮＡの
合成に用いた。上述のプライマー８’ＴＡＧＡＴＴＡＧ
ＡＴＴＴＧＡ５　ｔを第１のＤＮＡ鎖に対する出発点と
して使用した。反応混合物（１０μりは１μりのＲＮＡ
、５０μりのプライマー、さらに５０ｍＭノドリス−Ｈ
ＯＩ　（Ｉ）Ｈ８，＋３　）、５０ｍＭ（７）ＫＣｌ。

８　ｍＭのＭｇＣｌ２．１ｍＭのジチオトレイトール、
２単位／μりのＲＮＡ逆転写酵素（Ｊ、　Ｗ、　Ｂｅａ
ｒｄ＋ｔＴ、　Ｖｉｒｏｌ。

旦５１７〜５２２　（１９７９））、各５００ｕＭのｄ
ＯＴＰ　、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ、２５０ｕＭのｄＡＴ
Ｐおよび５〜１０ｕＣ１のアＡ／７ア”Ｐ−ｃｌＡＴＰ
（放射化学センター、英国アマジャムｉ　＞　４０００
ｉ　／　ｍ　ｍｏｌ　）を含む。この混合物を４２°Ｃ
にて８０分間温温情た。生成したＣＤＮＡをゲル電気泳
動によって分析した。主要生成物は期待した大きさであ
った（約７７０塩基）。

第２のＤＮＡ鎖の合成をモニターできるように、次の濃
度のデオキシヌクレオチドトリホス７オネートを反応混
合物に加えて実験をくり返した；各５００　ｕＭのｄＡ
ＴＰ　、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ。

２００ｕＭ（７）ｄＯＴＰおよび２５　ｕＣｉの８Ｈ−
ｄＯＴＰ（２１０１／　ｍ　ｎｏｌｉ放射化学センター
、英国アマジャム）。第１のＣＤＮＡ鎖の合成の後、Ｒ
ＮＡ鋳型をアルカリ処理によって加水分解した。０．５
（ＪＬＤ） ＭのＥＤＴＡ（ｐａｓ、ｏ）および１５０　ｍＭのＮａ
ＯＨを反応混合物に連続的に添加し、最終濃度をそれぞ
れ２０　ｍＭおよび５０　ｍＭとした。６５°Ｃにて１
時間および３７°Ｃにて８時間温情した後、混合物を中
和し、マニアティらによって記載されたように（Ｔ、　
Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ○ｌｏｎｉｎ
ｇ　、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒＹ　１９８２　、２８８
頁）、フェノ−ルーフ四ロホルムで抽出してｃＤＮＡを
再び単離した。

第２のＤＮＡ鎖の合成のための反応混合物の組成（１５
ｆｉｔ　）は、１００　ｍＭのヘペｘ　−ＫＯＨｐＨ６
，９。

５０　ｍＷのＫＣＪＩ　、　４　ｍＭのＭｇ０ｔ、　、
　０．５　ｍＭのＤ’［”Ｉ’。

各５００　ｕＭのｄｏ’Ｌ’Ｐ　、ｄＧＴＰおよびＴＴ
Ｐ。

２５０　ｕＭ＋７）ｄＡ　ＴＰ、　５〜１　ｏ　ｕｏｉ
のア／ｌ／７ア”Ｐ−ｃｌＡＴＰ（放射化学センター、
英国アマジャムｉ　＞　４０００１　／　ｍ　ｍＯり、
０．７単位の０ＤＮＡ−ポリメラーゼ１（フレノウ酵素
、ベーリンガー・マンハイム）、１０ｎ９のＣＤＮＡ〜
ＲＮＡ６および１００　ｎ９のプライＴ−５’ＴＡＯＯ
（！Ｔ。

ＴＯＡＡＯＴＯＴＡＡＡＡＯ８／であった。易熱性成分
の添加前に、反応混合物を９６°Ｃまで１０分間加熱し
・次（１６） −いてＤＮＡ−７’ライマーの結合を促進するまで徐々
に冷却した。反応開始後、２２°Ｃで２時間温情した。

生成した第２のＣＤＮＡ鎖をゲル電気泳動によって分析
し、第１の０ＤＮＡ鎖との相互移動を証明した。

結論として、ＲＮＡ６はその５′末端に第２の鎖７’　
５　イマーと同一の配列を含む。その結果、コの部分は
プライマーを合成したガイダンスのＲＮＡ　７の５′末
端と同一でなければならない。

従って、ＲＮＡ７とは別の亜ゲノムメツセンジャーＲＮ
Ａの第２の０ＤＮＡ鎖を開始することが第２の鎖プライ
マーによって可能である。

実施例２ 上述と同じ方法を用いて、二重鎖（ｄｓ　）ｃＤＮＡ〜
ＲＮＡ６を大量に調製した。このために、精製Ｌ４ＲＮ
Ａ６（７）代りに、ＭＨＶ−Ａ５９ｔ−用いて感染させ
た３ａｃ　（−）細胞から調製したいわゆるボＩＪ（Ａ
）＋ＲＮＡを使用した。このＲＮＡ調製は感染した細胞
中に全ＲＮＡの約５％を構成する全ウィルスｍＲＮＡを
含む。これをオリゴ（ｄＴ　）セルローズのり四マドグ
ラフィによって精製した。

（Ｔ、Ｍａｎｊ−ａｔｉｓ　ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｑｌｏｎｉｎｇ　、ＡＩ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ　、　０ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１１９７〜１９８頁）。二重鎖
ＯＤＮＡは、上記生成物の他に、多分能のｍＲＮＡに由
来する一層大きい分子を含む。第二の鎖プライマーを用
いないと、検出できるＤＭＡ合成が起らない。

制限酵素Ｒ８ａ工またはＦｎｕＤエエを用いて０ＤＮＡ
の位置を切断後（Ｔ、ＭａｎｉａｔｉＳら、　Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒｏｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ　、　００１（１ｓｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　１０４〜１０６頁
）、制限フラグメントをＭ　１８　ｍｐ９　Ｄ　Ｎ　Ａ
の複製型の「Ｓｍａ工位置」にクローニングした。制限
酵素Ｈｐａ工工を用い０ＤＮＡを切断後、得られたフラ
グメントをＭ　１８　ｍｐ８の複製型のｒ　ＡｃｃＩ位
置」にクローニングした（　Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ　、遺
伝子工学：原理と方法（１９８ｇ　）　、　Ｗ−巻、１
９〜８６頁、Ｊ、に、　５ｅｔｌｏＷおよびＡ、　Ｈｏ
ｌｌａｅＭｅｒ編、Ｐｌｅｎｕｍｐｒｅｓｓ　ｌニュー
ヨーク）。この７ラグメントを５０　ｍＭのトリＸ　Ｈ
ＯＩ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ＋７）’Ｍｇａ１２．
０．５　ｍＭ＋７）Ａ　Ｔ　Ｐ、　１０　ｍＷのジチオ
トレイトール、５０μり／−のＢＳＡ、１ｍＭのスペル
ミジン、２０ｎ９のベクター（ＳｍａＩまたはＡｃｃＩ
によって線状化した）、および８５　Ｒ９の０ＤＮＡ分
解物を含む反応混合物（１５ｕｚ　）中のベクターに連
結反応させた。「付着端」連結反応（ＨｐａＩ工）に対
して、４ｏニユーイングランド・ビオラプス単位のりガ
ーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　％　
米国マサチュセッッ、ベバリー）を１反応につき使用し
、「フラントエント」ノ連結反応（Ｒ６ａＩ　、　Ｆｎ
ｕＤＩ工１ｙに対して１反応につき４００単位のりガー
ゼを使用した。リガーゼ反応を終夜４°Ｃで行った。続
いて十分な大腸菌に１２　（ＪＭ１０８　）細胞をリガ
ーゼ反応混合物を泪いてトランスフェクションした。ラ
クトース（−）プラーク（プラークの全体数の３〜１１
％）を単離し、ファージを生成させ（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ
ら、Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ　、　１４５　（１９８０）
１６１〜１７８頁）、そこからウィルスＤＮＡを単離し
た；単離後ファージＤＮＡを直接、単鎖ＤＮＡ配列を用
いる０ＤＮＡ挿入のジデオキシ配（１９） 列分析に対して使用した（　Ｐ、　Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ　。

Ｉｎｃ、米［ｉライスフンシン、ミルウオーキー）。特
にＤＮＡクローンＲ８Ａ３５５の配列に関連している。

これを第２表に示し、ＲＮＡ　Ｖ中の相当するリーダー
配列と比較した。このデーターは実施例１と完全に一致
しており、ｃＤＷＡの第２鎖の合成のブライミングがい
わゆる第２鎖プライマー５　／ＴＡＯＯＯＴＯＴＯＡＡ
ＯＴＯＴＡＡＡＡＯ８’による本発明の方法で行われる
ことを示している。

（２０） −−ノ ｅ　ｅ −へ　−ハ ＭＨＶ−Ａ５９（７）ＲＮＡ７のリーダーおよびＲＮＡ
６の５′末端のヌクレオチド配列の比較。

ＲＮＡ６の配列は、８　’ＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＴＴＧ
Ａ５　’を用いる第１のｃＤＮＡ鎖および５’ＴＡ００
０ＴＯＴＯＡＡＯ’ｌ’０ＴＡＡＡＡＯ８’を用いる第
２のＤＮＡ＠の合成をブライミングして得られる０ＤＮ
Ａクローン（Ｒ８Ａ８５５）から得られた。第２　ＤＭ
Ａ鎖のプライマーはＲＮＡ７のリーダーのヌクレオチド
配列から予言された。

ＲＮＡ７の配列はＲＮＡに直接ジデオキシ配列すること
によって得られた。四角で囲んだＡＴＧおよびＡＵＧは
、それぞれウィルスタンパク質Ｅ１およびＮの合成に対
する開始コドンである。

ａ）　Ｅ　１の開始Ａ　Ｔ　Ｇ　（５’ＡＴＧＡＧＴＡ
ＧＴＡＣＩＴＡＯＴ８’　）と共に出発領域に補足しで
あるプライマー８’ＴＡＧＴＯＡＴＯＡＴＧＡＴＧＡ５
　／として用いるゲノムに直接ジデオキシ配列して確認
された不適当な組合せ。

【図面の簡単な説明】

第１図はｍＲＮＡ１　、ｍＲＮＡ６およびｍＲＮＡ７に
関するデータを示す模式図である。 ・印・・・５′末端構造 ＡＮ・・・８′末端ポリアデニル酸塩構造Ｘ、Ｙ・・・
配列 Ｅ□・・・マトリックス／エンベロープタンパク質Ｎ・
・・ヌクレオキャプシドタンパク質。 特許出願人　デュファル・インチルナチオナル・レセー
ルフ・ベー・ヴ工一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ゲノムＲＮ　ＡまたはｍＲＮＡ中でくり返し遺伝子
   間配列に結合する第１のＣＤＮＡ＠の合成のためのプラ
   イマーを使用し、所望により、各Ｒ貸Ａ中に生ずる「リ
   ーダー」の一部に類似する第２のｃＤＮＡ鎖の合成に対
   してプライマーを出発点として使用し、ゲノムＲＮＡま
   たはｍＲＮＡに相当する０ＤＮＡを調製することを特徴
   とするコロナウィルス用ワクチンの調製方法。 λ　第１の鎖プライマーとして８　”Ｉ’ＡＧＡＴＴＡ
   ＣＡＴ’ｌ”Ｉ’ＧＡ５’を使用し、第２の鎖プライマ
   ーとして５　’ＴＡＯＯＯＴＯＴ（！ＡＡＯＴＯＴＡＡ
   ＡＡＯ８’を使用する特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ＆　マウス肝炎ウィルスのｃＤＮＡを調製する特許請求
   の範囲第１または２項記載の方法。 表　マウス肝炎ウィルス鎖５９の０ＤＮＡを調製する特
   許請求の範囲第１〜８のいずれか１項記載の方法。 翫　コロナウィルス感染性気管支炎（ＩＢ）ウィルス、
   ネコの感染性腹膜炎（ＦＩＰ）ウィルスまたは透過可能
   な胃腸炎（ＴＧＥ）ウィルスのｃＤＮＡを調製する特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ａ　ゲノムＲＮＡまたはｍＲＮＡ中でくり返し遺伝子間
   配列に結合する第１のｃＤＮＡ鎖の合成のためのプライ
   マーを使用し、所望により、各ＲＮＡ中に生ずる「リー
   ダー」の一部に類似する第２のｃＤＮＡ鎖の合成に対し
   てプライマーを出発点として使用し、調製して得たゲノ
   ムＲＩＡまたはｍＲＨＡに相当する０ＤＮＡを特徴とす
   るコロナウィルス用ワクチン。