JPS58501771A - オリゴヌクレオチド治療剤及びその製法 - Google Patents
オリゴヌクレオチド治療剤及びその製法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
明 剖で 特表昭58−5(11771(2)オリゴヌクレオチド治療剤及びそ
の製法発明の背景
本発明は一般的K、例えば抗生目的などの生物学的機能を制御することに関し、
より詳しくはin vivo蛋白合成制御のためにメツセンジャーリボ核酸をオ
リゴヌクレオチドに結合させた型のハイブリッド形成技術を利用することに関す
る。
薬理学の分野において、治療剤の使用は長く病気を抑制するための有効な方法で
あると認識されている。
その様な治療剤は、Lばしば病的状態を治癒或いは緩和するために細菌或いはウ
ィルス感染、化学的不均衡などを治療するために使用されている。研究者たちは
時には主たる発展が病気の分子的基礎を明らかにした後に新たな治療剤を発見す
ることもあるが、むしろしばしば抗生のための観察或いは機能的に関連した化学
薬品の化学構造を変成することに頼らざるを得ないことが多い。
抗生物質に関して云えば、あるものは当初極めて有効であるが多くのものは時間
と共に生物が耐性となるか或いはそれらの作用に対して全く免疫を有するように
なる。加うるに、これまでに開発されな有効な抗ウィルス剤は極めて少なく、且
つ感染生物の生理学についての明確な詳細な知誠なくしてけ′frたな有効な治
療剤の開発は計画性のないものに留まる。
かように、新たな抗生物質その他の治療剤の系統的設計を可能にする多目的且つ
安価であり更に極めて特異的且つ有効な治療剤を生産する方法に対する確たる需
要が存在する。本発明はこれらの需要を満たすものである。
発明の概要
本発明は新規拮抗剤の開発をめぐる不確実性を実質的に減少させ、医薬物質の範
囲を相当に増大させる生きた生物に使用するための治療剤その他の試薬を同定及
び構成する方法論を提供するものである。更に本発明の治療剤の構成は大量生産
の場合にも製造が簡単であり、使用に際して極めて有効であり、その改良された
結果を不当な交差反応を起こすことなく達成するものである。
本発明の現在好ましい実施態様における具体例を挙げると、生物の生体成分を解
読するメツセンジャーリボ核酸の部分に相補的な塩基配列を有する好ましくはホ
スホトリエステルHaの安定化されたオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴ
ヌクレオチド及びメツセンジャーリボ核酸の相補的性質により、これらの二成分
は適当な条件下において容易にハイブリッドを形成し、生物の生体成分の合成を
抑制し、且つその蛋白質が生物の生育能力に致命的である場合には抗生物質とし
て作用する。
本発明による治療剤の開発方法は、典型的には、生物の生体成分に対する少なく
とも一部の遺伝情報を含有する生物の核酸の塩基配列を与える工程、及びその生
体成分に特異的なメツセンジャーリボ核酸と引続いてハイブリッド形成させるた
めKその配列が前記塩基配列から得られるオリゴヌクレオチドを合成する工程を
含むものである。この生体成分は必須蛋白質或いは単に卵胞刺戦ホルモンである
ゴナドトロピンのよウナホルモンであってもよい。塩基配列の順序はデオキシリ
ボ核酸(DNA )或いはリボ核r1k(RNA)好ましくはメツセンジャーリ
ボ核酸(mRNA)から決定することができるっ或いは又、所望のオリゴヌクレ
オチド塩基配列は生体成分が蛋白質であるような場合はその生体成分の配列から
決定することもできる。好ましいオリゴヌクレオチドは最低約14以上の塩基例
えば約23の塩基を有し、安定性を増大するためには、例えばホスホトリエステ
ル形態などのより安定な形態に転換され、使用時の劣化を防止することができる
。
オリゴヌクレオチドを大量生産するためには、それを化学的に例えば自動化機械
において合成するが、或−は例えばpBR322などのプラスミドに挿入してク
ローニングを行う。プラスミド挿入はhind m制限酵素或いはAJuI制限
酵素により減成される、例えば、GATTCGAATC或いはCTAAGCTT
AGなどのリンカ−塩基配列を用いて達成することができる。塩基配列の順序が
決定されていない場合には、塩基配列をクローニングした径値の源からのメツセ
ンジャーリボ核酸に対して交差−ハイブリッド形成させて標的に対して非特異的
な塩基配列を除去することができる。
本発明のもう一つの側面は、細胞内のその他の生体成分の活性を実質的に妨害す
ることなく細胞内の1以上の生体成分の活性を選択的に抑制する方法である。
この方法は特性の生体成分を解読するmRNAの部分に実質的に相補的な塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドを形成する工程、及びこのオリゴヌクレオチドを
細胞内に入れて選ばれたmRNAとハイブリッド形成させる工程を含むものであ
る。これによりmRNAの蛋白質への翻訳の妨害が生ずる。このオリゴヌクレオ
チドは少なくとも約14個以上の塩基、例えば約23個の塩基を有する。標的m
RNAは蛋白質例えば卵胞刺戟ホルモンなどのホルモンを解読することができる
ものである。このホルモンはアルファ鎖及びベータ鎖を有し、オリゴヌクレオチ
ドはその他のゴナドトロピンm RN Aとの交差反応を避けるためにベータ鎖
を解読するmRNAに特異的であるべきである。適当なオリゴヌクレオチド塩基
配列はACCACGCGR,CCR2ATGACGATGTG であり、ここに
R1はG或いはTであり、R2も又G或いはTである。
本発明のもう一つ別の側面によれば、宿主生物の外来生物による感染を抑制する
方法が提供される。この方法は外来生物の核酸からの必須蛋白質を解読する少な
くとも一部の遺伝情報を含有する塩基配列を単離し、その順序が前記塩基配列か
ら得られ、蛋白質を解読するメツセンジャーリボ核酸に実質的に相補的であるオ
リゴヌクレオチドを合成し、有効量のこのオリゴヌクレオチドを用いて外来生物
を処理してメツセンジャーリボ核酸の一部とハイブリッド形成を行って蛋白質の
翻訳を妨害することよりなるものである。このオリゴヌクレオチドはデオキシリ
ボヌクレオチドであってもよく、より安定な形St例えばホスホトリエステル形
態に転換され劣化及びその合成の前に決定される配列順序を防止することができ
る。更にオリゴヌクレオチドの特異性を増大させるためにそれを異った生物例え
ば宿主生物からのmRNAに対して交差−へイブリッド形成させ、非特異的オリ
ゴヌクレオチド配列を除去することができる。
前記説明より、本発明が長く存、続した生きた生物に使用する治療剤の改良され
た開発方法に対する需要を満足させるものであり、主として、それが極めて万能
であり且つ生体成分に対して極めて特異的な薬剤を提供することにより従来利用
可能であった方法に対して相当な進歩を示すことが判るであろう。本発明のその
他の側面及び利点は以下添付の図面を混えて行われる以下のより詳細な説明より
明らかとなるであろう。
図面の簡単な説明
第1図は、分子生物学の中心原理を示す図解説明図である。
第2図は、メツセンジャーリボ核酸(mRNA )のT蛋白質への正常な翻訳並
びにで蛋白質の翻訳を妨害する本発明の合成オリゴヌクレオチドを示す図解説明
図である。
第3図は、5V−40T蛋白質に特異的なウィルスデオキシリボ核酸(DNA)
暗号及び関連したm RN A及びオリゴヌクレオチドの表である。
第4図は、T蛋白質オリゴヌクレオチドを含有する高収率プラスミドの構成を示
す図解説明図である。
第5図は、制限酵素を用いてプラスミドを切断し、11jl[したT蛋白質オリ
ゴヌクレオチドを与える図解説明図である。
第6図は、DNA配列を処理してDNAポリホスホトリエステルを形成すること
を示す図解説明図である。
第7図は、卵胞刺戟ホルモンの部分的アミノ酸配列並びに予想されたmRNA配
列及び関連したオリゴヌクレオチド族の部分的アミノ酸配列を示す図である。
発明の詳細な説明
図面、特に第1図及び第2図を参照すると、生命の分子生物学の所謂「中心原理
」が示されている。基本的には、現在デオキシリボ核酸(D N A)が殆んど
全ての生きた生物の遺伝暗号を運ぶことが了解されている。この暗号はホスホリ
ル化されたデオキシリボース糖骨格に結合した4個のヌクレオチド塩基の組織さ
れた配列の形態で存在する。一般的にDNAは各種の弱い力によって対向して一
緒に保持された二本の反対方向く向いた鎖よりなる二本鎖ら旋の形態で存在する
。
これらの弱い力の主たる成分は対向する鎖上のヌクレオチド間に存在する所謂水
素結合である。これらの4個の塩基、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニ
ン(G)及びチミン(T)は水素結合を一般的に一つの形態においてのみ水素結
合を形成する。即ち、AとT1及びCとGである。従って、一つの鎖の配列を知
ることにより、第2の鎖の配列は容易に決定することができる。
この中心原理のもう一つの側面は、蛋白質はDNA鎖から間接的にメツセンジャ
ーリボ核酸(mRNA )を介して生成されることである。mRNAは一本鎖D
NAとリボース骨格を有し、ウラシル(U)がチミンに変っている他は同一の構
造を有するものであるが、一本のDNA鎖から直接に転写され、実質的に反対の
塩基配列を有する即ちDNA鎖配列か5′・・・ACGT・・・3′であれば転
写されたmRNA配列は3′・・・UGCA・・・5′である。
中心原理のもう一つの側面はmRNAの蛋白質への翻訳に関する。簡単に述べる
と、開始部位などを除いて各に3個のヌクレオチド塩基群(三連符暗号)が蛋白
質の一つのアミノ酸を解読する。従って、蛋白質のmRNA配列を知ることによ
りそのアミノ酸配列を一般的に決定することができる。しかしながら、逆は真な
らず即ちアミノ酸配列を知ることはmRNA配列の正確な知識を保障するもので
はない。これは、64個(4s)の可能な三連符暗号が存在するのに対し、アミ
ノ酸は僅かに24個存在するという事実に由来し、あるアミノ酸は複数の三連符
暗号を有することを可能にしている。
DNA及びmRNA鎖の構造の類似性は興味ある効果を創り出す。最も顕著には
、もし相補的DNA及びRNA鎖がある溶液中に同時に存在するならば一定の確
立された条件下において、これらの鎖はアニーリングを起こし、へイブリッドを
形成することができる。
適当なアニーリングにおける重要な因子は融溶温度であり、それはブリラテン等
の方法により計算することができる( Br1tl@n @t ml、 Met
hods of InzymoJogy29:363 (1974))。
本発明によれば、ある選ばれたmRNAの塩基配列に実質的にマツチすることの
できる塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドがそのmRNAとのへイブリッ
ド形成のために提供される。一度その様なハイブリッドが存在すると、m RN
Aの蛋白質への翻訳が相当に阻害されるようになる。もし、その阻害された蛋
白質が生物の生存に致命的である場合には、生物の生育能力即ち成長或いは生命
の継続が危機に瀕する。重要なことは、このオリゴヌクレオチドは、ただ一つの
蛋白質を解読するmRNAに対して特異的に設計することができることであり、
その他の蛋白質のためのmRNAとは交差反応すべきでないことである。
このオリゴヌクレオチドを開発する方法は基本的に二つの工程を含むものである
。以下に十分説明されるように、一つの可能性のある第−工Iiは阻害されるべ
き蛋白質に特異的なm RN Aの適当な配列を決定することであり、第二の工
程はmRNAに相補的なオリゴヌクレオチドを製造することである。一度作成さ
れるとこのオリゴヌクレオチドを処理して安定性の増大したホスホトリエステル
形態に転換することが出来る。
核酸塩基配列を決定するためには各種の技術が存在する。多くの場合において、
mRNA或いは遺伝子の配列は生化学文献において決定され公刊されて―る。
事実、研究者達asV−40ウィルスについて完全なヌクレオチド配列を決定し
ている( Reddy at &C3ci −enee 200 :494 (
1978年)〕。周知の如く、ある代替的方法はmRNAを十分量にて単離及び
精製して配列研究を行うものであるが、これは比較的不安定であるため、又場合
によっては極めて稀有な多くのmRNA配列のために困難であるっ
核酸塩基配列を決定する更にもう一つの方法はアミノ酸配列を標的蛋白質から分
解することを必要とする。
、精製された形態の標的蛋白質のアミノ酸配列の決定後引続いて市販の蛋白質配
列(例えばBookman In5tru −m@nta社製、Cojifor
nia州FuJJ*rton )を利用する逐次減成を使用してアミノ酸配列を
与えることができる。一度これが得られると、三連符暗号についての知識を適用
して予想塩基配列を得ることができる。ホルモングルカゴンについてのその様な
方法の具体例がタリス等の論文に見ることができる。(TuJJis at a
j+Bioehsmiaaj and BiophyslaaJ R*5nar
ch Communi −cations 93:941 (1980年)〕。
一度適当な核酸の配列及び所望のmRNA配列が決定されるとm RN Aに相
補的なデオキシリボヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドを構成することが
できる。多くの合成技術が知られているが、最も典型的なものはアガーワル等に
よって(Agarwa)et&J、N&−turv 227 : 27 (19
70年)〕説明されているジエステル法であり、又、オリゴヌクレオチドシンセ
サイザーはベガ バイオケミカルズ社(Vega B iochamiaaJs
。
P、O,Be2C11648,アリシナ州 Tuason )及びバイオロジャ
ルズ社(BioJogiaaJs+、 Inc、、カナダ国、Toro−nto
) から市販されている。
所望のオリゴヌクレオチド配列が未知の場合には、・適当なオリゴヌクレオチド
を以下のようにして調製することかできる。標的生物からmRNAを単離後、多
数の(I製が好ましくけDNA、所謂複製D N A (eDNA)の形で作成
される。このcDNAを次いでその他の生物から単離したmRNAに対して交差
−ハイブリッド形成を行い、ハイブリッド形成を行ったeDNAはいずれも除去
する。残存するa D N Aが標的生物に対してのみ特異的であり治療剤とし
て役に立ち得る。
高度の特異性を得るためには、約14個以上の残渣のオリゴマーを構成すること
ができる。これより短い配列も作用し得るが配列が長くなれば長くなる種特異性
がより高くなる。このことは数学的に容易に見ることができる。即ち、4個の塩
基から選ばれた10単位の重合体は4” (1,048,576個)のランダム
な組合せを有するのに過ぎないのに対し、20単位の重合体は420個のランダ
ムな組合せ即ち1.09 X 10” (1,090,000,000,000
)に等しい組合せを有する。
10個の塩基に対比して20単位のオリゴヌクレオチドを作成する際に困難が付
加されるにも拘らず、この複雑性における指数函数的増大は望ましくない交差反
応性を減少させることが保障される。哺乳動物の細胞は約2 X 10’ 個の
RNAのヌクレオチドの複雑性を有する。即ち、換言すれば約30,000個の
mRNA配列に相当するほぼ2億個の特異配列mRNAのヌクレオチドを含有す
ると推定されている。それらの配列の一つがランダムに選択された20単位の重
合体を含有する確率ははi55500分の1である。これに対して、10単位の
重合体はランダムな交差反応に対して、約190対1の6機会を有するっ
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
実施例l
5V−40ウイルスは通常「T蛋白質」或いは「T抗原蛋白質」として知られて
いる必須蛋白質を製造する。前記の如(,5V−40ウイルスに対する完全な遺
伝子暗号が決定されており、このウィルスのゲノム上の5091〜5071の残
基がT蛋白質mRNAの部分を解読することが知られている。これらの残基の配
列、ウィルスのT蛋白質mRNAの配列、及び設計されたT蛋白質特異的オリゴ
ヌクレオチドか第3図に示されている。この場合には、T蛋白質特異的オリゴヌ
クレオチドはウィルスのT蛋白質mRNAに相線的であり、ウィルスのDNA暗
号の部分と同一である。
T蛋白質特異的オリゴヌクレオチドのin vivoにおける有効性を試験する
前にオリゴヌクレオチドをある生物からの全mRNAと混合して交差反応性をチ
ェックすることができる。それがハイブリッドを形成する場合には、T蛋白質を
解読するウィルスのゲノムの異った部分を利用すべきである。そうでない場合に
は、このオリゴヌクレオチドを更に試験する準備が整ったことになる。
更に試験を行うには、5−40ウイルスの生育を必要とする。これらの実験の目
的のために、5V−40ウイルスをアフリカミドリザル細胞例えばホップス等(
Hoppg @t aj、 Journaj of Immunojogy 9
1 :416(1963年)〕による細胞系統B5C−1中において生育を行い
、力価を測定した。ウィルスの同一性は以下の方法により確認することができる
:a)新生へムスターにウィルスを接種後に腫瘍生成をチェックすること、
b)抗−8Y−40抗血清によるウィルスの中和、及び
C)感染細胞と標準的技術により調製された抗−5V−40T抗原に向けられた
抗体と・の反応。
S V −40mRNAの単離は次のようにして達成することができる。全RN
Aは先ず予め焼かれたガラス容器を用いてグアニジン塩酸抽出法により得られ、
コックス等の方法(Cox at a)、 Methods in Knzym
ojogy121120 (1968年)〕によりジエチルポリカーボネートで
処理され、微量のRNエースを除去する。このA+RNAをCaA’Jabor
ativs Re5earch (vサシューセツツ州、Wajtham) 或
いはR,L、 BiochemicaJts社 (ウィスコンシン州、MiJv
auk・の)から得ることのできるオリゴ−dTセルロース上でバンドル等(B
antA’e et aA!、 Ana7y−ticaJBiochemist
ry 72:413’(1976年)〕 により記載される技術を利用して単離
される。このRNA画分の純度及び完全性をベイリー等(Ba1jay @t
aJ+Anajytieaj Bioah@migtry 70 : 75 (
1976年)〕に記載される方法に従った電気泳動により測定するっ又、RNA
の翻訳能力をマーカス等(Maraum at a)。
M@thods ln EnzymoJogy: 30 : 749 (197
4年)〕により記載されるin vitro 系における小麦胚中において測定
することができる。この1nマttro *訳生成物はラエメリ(La@mm*
jl、 Nature 227: 680 (1970年)〕により記載される
硫酸ラウリルナトリウム9%ポリアクリルアミドゲル上で観察される。
このウィルスのmRNA配列を含有する精製されたA+mRNAけ0,2%の硫
酸ラウリルナトリウムを含有するpH6,8の0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液
中において37°Cで合成オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することがで
きる。約1′qのA+mRNA及び合成オリゴヌクレオチドを約1100u/1
17 の濃度で含有する溶液を100″Cで1〜2分間加熱した後、37°Cに
冷却し、アニーリングを行う。ハイブリッド形成反応の時間の函数としての程度
は、ゲル濾過カラム上で追跡することができる。
ハイブリッド形成には、任意の理論的に適当な温度を使用することができるが、
実際にはθ″C〜約80′cの範囲の温度が良好なハイブリッド形成を行うのに
適し、好ましい温度範囲は10″C〜約40’Cである。一般的に、特定のハイ
ブリッド形成のための最適アニーリング温度はそれらの溶融温度より約20”C
〜25℃低い温度であると思われる。従って、37.5°Cで操作される合成オ
リゴヌクレオチドはそれらの塩基配列及び長さく基づいてその溶融温度が通常の
生理学的条件下に試験された場合に約57℃〜62℃であるように設計されるべ
きである。
へイブリッド形成試験について、合成オリゴヌクレオチド対そのm RN A相
補体の比は一般的に約30=1である。これより低い比率も使用可能であるが、
しかし約3=1未満の配列はハイブリッド形成を低下させる。酵母RNA或いは
グロビンmRNAを利用した対照反応を使用して何等のハイブリッド形成が示さ
れないことにより、S V −40mRNAのみに対するハイブリッド形成特異
性を確認することができる。又、熱変成プ四フィール研究及びハイブリッド形成
の動力学の比較により合成オリゴヌクレオチドかSV−40mRNA配列とのみ
反応することが確認される。
一度オリゴヌクレオチドが単離されたS V −40mRNAとハイブリッド形
成することが示されると、(前記)小麦胚系を利用してin vitro の翻
訳試験を試み、へイブリッドかl!I訳されないことを示すことができる。
基本的には、S V −40mRNAを小麦胚糸に導入すると、この糸は大きな
で抗原蛋白を生成する。しかしながら、等量以上の合成オリゴヌクレオチドをこ
の系FC追mf6とそのmRNAも又導入され念SV−40蛋白質の合成は妨害
することなくT抗原蛋白質合成を実質的に阻害することができる。
オリゴヌクレオチドのinマ1マOの試験はオリゴヌクレオチドを5V−40で
感染された細胞の培養液に添加することにより達成することができる。T抗原蛋
白質合成は約6時間以内に相当に阻害され、5V−40の成長は約24時間以内
に強く阻害される。対照培養液の成長は全く影響を受けない。
本発明の合成オリゴヌクレオチドの大量生産はプロインスリンの遺伝子のクロー
ニングの技術において開発された通常のクローニング技術によって行うことがで
きる。或いは又、オリゴヌクレオチドは前記市販の装置で化学的に合成すること
ができる。簡単に述べると、クローニング法はプラス(ドとして知られるより大
きなりNA片に運ばれる細菌の遺伝子中にオリゴヌクレオチドを酵素的に挿入す
ることを含すものである。
このプラスミドは適当な宿主細菌中に導入し、細菌の増殖と共に多数の複製が作
成される(Bayer及びCohens米国特許4.237.224号参照)。
より詳細には、第4図及び第5図を参照すると、Bethemda R@5ea
rch Labs 社 (メアリーランド州、Rook−マiA!Je)から市
販されているpBR322と称されるクローニングプラスミドを使用してT蛋白
質特異性オリゴヌクレオチドを大量生産することができる。標準的技術を使用し
てこのオリゴヌクレオチドを二本鎖形態に転換し、次いで末端s’po、をボリ
ヌクレ牙チドキナーゼを用いて5′末端の各々に添加し、T−4Uガーゼを介し
て引続いて連結を行う。5′末端を形成する反応条件はリチャードソンの報文(
RiChardmon、 Prog −rvma in NuaJeia Ac
1ds R*s*areh 2:815 (1972年)〕に見られる。
二本鎖オリゴヌクレオチドをヒトマキジルアパタイトカラム上でり四マドグラフ
により精製後、それをプラスミド中に挿入する。このオリゴヌクレオチドは鈍い
末端を有するので、プラスミドは予均−即ち「粘着性」末端を有すべきではない
。粘着性末端をプラスミドから除去するためKS1ヌクレアーゼその他の一本鎖
特異的ヌクレアーゼを利用することができる。制限酵素を使用する一般的説明は
ネイサンズ及びスミスの論文(Nathands and 3m1th、 An
nualReview of Blo −ah@m1stry 44 : 27
3 (1975年)〕に見られる。
最良の結果のためには、オリゴヌクレオチド及びプラスミド間のリンカ−系、特
にHlnd ■及びAJuI両酵素切断部位を有するリンカ−を利用することが
できる。第4図に見られる知<、一つのその様なリンカ−は5′・・・CTAA
GCTTAG・・・3′を有する。この配列はAJuI (AGCT)及びHl
ndII[(AAGCTT)の両者に対する認識配列を含有する二本鎖の左右対
称の分子を表わす。標準条件下において、DNAリガーゼを利用してこの分子を
オリゴヌクレオチドに結合させて、リンカー−オリゴヌクレオチド−リンカ−分
子を形成することができる。同様にして、この結合オリゴヌクレオチドを線状化
された鈍−末端のHlndl[I切断pBR322運搬体分子中に導入すること
ができる。
結合後、プラスミドはリンカー−オリゴヌクレオチドを導入してその共有結合的
閉環立体構造を再びとり、それらの全ては第5図においてpT−蛋白質オリゴヌ
クレオチドとして示されている。この再環化されたプラスミドを次いで使用して
大腸菌(E、aojti) などの適当な細菌宿主を形質転換する。形質転換の
方法及び形質転換体の選択は公知であり、ツーエン(Cob+sn )及びボイ
ヤー(Boyer) の米国特許4.237.224号に詳細に説明されている
。
結合プラスミドp−オリゴヌクレオチドを含有する形質転換された細菌が高密度
に生育され、多量の結合プラスまドを製造するとオリゴヌクレオチドを次いで精
製する。プラスミドを成熟細胞から取り出した後、プラスミドを適当な制限酵素
で処理する。第5図に示される如く、プラスミドを先ずBind■で切断してリ
ンカー−T−蛋白質−オリゴヌクレオチドーリンカー及び元のプラスミドのプラ
グメントを含む各種副生物を得る。これらはゲル電気泳動或いは高圧液体クロマ
トグラフィーを利用して容易に分離される。更に、単離されたリンカー−オリゴ
ヌクレオチド−リンカ−をエンドヌクレアーゼAノuiで切断して純粋な二本鎖
オリゴヌクレオチド及び部分的に劣化したリンカ−を得る。これらも又それらの
大きさの差異に基づいて分離することができる。
第6図に示す如く、オリゴヌクレオチドを次いでミラー等の方法(MiJj@r
@t aJ、 Bioch@m1stry 16 : 1988(1977年
)〕に記載される夏応を利用して変成してヌクレアーゼ耐性を有するホスホトリ
エステル形態にす。
ることかできる。基本的には、オリゴヌクレオチドを先ず50″Sの無水酢酸−
ビリジンを用いて一昼夜のインキュベーション期間アシル化する。生成物を沈澱
させ、エーテルから単離する。次いで30%エタノールを無水2,6ルチデン(
30%)、NN−ジメチルホルムアミド(30%)及びp−トルエンスルホニル
クロライド(17%)中において用い、約6時間以内させることにより、ホスホ
トリエステルを形成することができる。保護アセチル基を次いで0.5容の濃水
酸化アンモニウムを添加して加水分解し1次いで約1時間55°Cにおいてイン
キュベーションを行う。エチルホスホトリエステル形態の最終オリゴヌクレオチ
ド生成物を次いでペーパークロマトグラフィー或いは高圧液体クロマトグラフィ
ーにより単離する。
オリゴヌクレオチドをホスホトリエステル形態に転換することは、各種分解酵素
九対する高められた耐性によりin vivoにおけるオリゴヌクレオチドの安
定性を改良するように思われる。しかしながら、オリゴヌクレオチドは最終的に
は分子を無保護状態におく自然発生的な脱エチル化によって劣化する。事実、初
期のエチル化の度合−を抑制することにより、1n viマ0の劣化速度を抑制
することができるっホスホトリエステル形態の更にもう一つの利点は、オリゴヌ
クレオチドの細胞膜に浸透する能力の増大であると思われる。
実施例2
女性の卵細胞及び男性の精子細胞の成熟において機能する、下垂体により生成さ
れる蛋白質ホルモンである卵胞刺戟ホルモン(F 8 H)の合成を阻害するこ
とのできる合成オリゴヌクレオチドも又作ることが可能である。FIiHは二つ
の鎖、アルファ鎖及びベータ鎖からなることが知られており、そのアミノ酸配列
は数種の動物種について決定されている。興味あることにFSHのアルファ鎖は
チロイド刺戟ホルモン、黄体形成ホルモン及び絨毛膜ゴナドトロピンなどのその
他のゴナトド四ビンホルモンと共通しているのに対し、ベータ鎖が異ることであ
る。従って、その他のゴナドトロピンに実質的に影響を及ばずことなく選択的に
FSHの合成を閉め出すためにはオリゴヌクレオチドはベータ鎖を解読するmR
NAに対して特異的でなければならない。
ベータ鎖アミノ酸32〜40の配列は第7図に示されている。前記の如く、これ
らのアミノ酸のmRNA塩基配列は絶対確実性をもってすることはできないが、
一応予想することは可能である。不確実な点は予想され7hmRNA配列中の文
字「X」によって示されている。従って、得られたオリゴヌクレオチド族は8つ
の可能性のある26個の塩基配列よりなり、可能性のある代替的塩基は主たる塩
基配列の下の括弧内に示されている。
33番目乃至400番目アミノ酸に対する予想されるm RN A配列から始ま
ることにより4種の異ったF8HmRNAに対応し得る23個の塩基のオリゴヌ
クレオチドが存在することが判る。これらの配列は以下の5′末端から読んで次
の通りである:GTGTAGCAGTAGCCGGCGCACCA。
GTGTAGCAGTATCCGGCGCACCA。
GTGTAGCAGTAGCCTGCGCACCA、及びGTGTAGCAGT
ATCCTGCGCACCAoこれらの4つの配列は精密に正しくあるべきであ
り、その場合に完全にFSHmRNAとハイブリッド形成することが可能である
。最良の配列を決定するためにFSHmRNAに対するへイブリッド形成試験並
びに引続きヒドロキシアパタイトその他の適当なカラム上での精製を前記方法に
従って行うことができる。最良の配列が決定されると、それを前記の如くプラス
ミド中におくか、或いは化学的に合成することにより大量合成が行われる。この
オリゴヌクレオチドはin viマ0におけるFSHの合成を実質的に阻害する
。
前記説明より、本発明は生きた生物に使用する新規治療剤の設計方法を提供する
ものであり、この方法は用途が広く安価であることが判る。更に、本発明によす
製造されるオリゴヌクレオチドは極めて有効且つ特異的であり、生きた生物内に
おける蛋白質合成の選択的抑制を可能にする。
本発明の幾つかの特別の形態について例示を行い説明したが、本発明の精神及び
範囲から離れることなく各種修正がなされ得ることが明らかである。従って、本
発明は請求の範囲以外の制限を受けるものではない。
F/G、3
+p 、、reM ’ sex ttHヂqcx Hx me u4tt ty
pe sex y ti”6FIG、5
9ツカ−74−El’を了りク′22ムイテμ“F/G、G
国際調査報告
Claims (1)
- 1. ある生物の生体成分のための少なくとも一部の遺伝情報を含有するその生 物の核酸の塩基配列を与える工程及び該生体成分に特異的なメツセンジャーリボ 核酸とハイブリッド形成のためにその配列が該塩基配列から得られたオリゴヌク レオチドを合成する工程を含んでなる治療剤の製造方法。 λ 該生物による劣化を防止するためK、該オリゴヌクレオチドをより安定な形 11に変換する工程を更に含んでなる請求の範囲第1項記載の方法。 3、 該より安定な形態がホスホトリエステル形態である請求の範囲第2項記載 の方法。 4、 該生体成分が蛋白質である請求の範囲第1項記載の方法。 5、該オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである請求の範囲第4項 記載の方法。 6、塩基配列が約14個以上の塩基よりなる請求の範囲第1項記載の方法。 7、 塩基配列が約23個の塩基よりなる請求の範囲第1項記載の方法。 8、 該塩基配列の順序がオリゴヌクレオチドを合成する前に該生体成分に特異 的なリボ核酸或いはデオキシリボ核酸から決定される請求の範囲第1項記載の方 法。 9、 更に該オリゴヌクレオチドをクローニングのためにプラスミド中に挿入す る工程を含んでなる請求の範囲第1項記載の方法。 10、該オリゴヌクレオチドがリンカ−塩基配列を用いて該プラスミド中に挿入 される請求の範囲第9項記載の方法。 11、該リンカ−配列がGATTCGAATC或いはCTAAGCTTAGであ る請求の範囲第10項記載の方法。 12、、リンカ−がHLndm或いはAJu I制限酵素による部分的劣化を受 ける請求の範囲第1θ項記載の方法。 13、更に塩基配列をその他の該生物以外の少なくとも一つの源からの核酸に対 して交差−ハイブリッド形成を行う工程を含むことにより塩基配列が該生物に対 してより特異的となる請求の範囲第1項記載の方法。 14、ある細胞の1以上の特定の生体成分を該細胞のその他の生体成分の活性を 実質的に妨害することなく選択的に抑制する方法において、該方法は該生体成分 を解読する一部のメツセンジャーリボ核酸と実質的に相補的な塩基配列を有する オリゴヌクレオチドを形成する工程、及び該オリゴヌクレオチドを該細胞中に導 入することを含むことを特徴とする方法。 15、ある宿主生物の外来生物による感染を阻害する方法において、該方法か該 外来生物の生育能力に致命的な蛋白質を解読する少なくとも一部の遺伝情報を含 有する該外来生物の核酸の塩基配列を単離し、その順序か該塩基配列から得られ 蛋白質を解読するメツセンジャーリボ核酸に実質的に相補的であるオリゴヌク1 オチドを合成する工程、及び該外来生物を有効量のオリゴヌクレオチドで処理し て一部の該メツセンジャーリボ核酸とへイブリッド形成を行い、該蛋白質の翻訳 を妨害する工程を含むことKより外来生物の生育能力を阻害することを特徴とす る方法。 16、蛋白質合成抑制用薬剤において、該薬剤が劣化を防止する安定な形態のオ リゴヌクレオチドよりなり、該蛋白質を解読する少なくとも一部のメツセンジャ ーリボ核酸の塩基配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有することを特徴 とする薬剤。
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