JP5048915B2 - 整長ｃＤＮＡ由来両鎖ｃＲＮＡサブトラクション方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトなど高等生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ混生物を３'末端から平均１０００ｂｐに整長（トリム）した後、これを鋳型として合成したセンス鎖およびアンチセンス鎖のｃＲＮＡをドライバーとして用いるサブトラクション方法や該サブトラクション方法に用いられる整長ｃＤＮＡ由来両鎖ｃＲＮＡサブトラクション用キットに関する。

マウス、ヒトなどの哺乳類のゲノムの全遺伝子数は最近約３万個程度と予想されるに至り、これに対応するｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを網羅的にクローン化することは、遺伝子のコードするタンパク質の配列予測、遺伝子の構造予測、ＤＮＡマイクロアレイの構築等の観点から、実用的にも基礎研究の上でも極めて重要であり、現在、米国、日本をはじめ世界的な取り組みがなされている。マウス、ヒトでは既に多数のｃＤＮＡがクローン化されているが、これらは主に、成体あるいは胚に適当量以上存在するｍＲＮＡに由来するものであると考えられ、残されたｃＤＮＡの単離が今後の課題であるといわれている。多細胞高等生物においては、相当部分の遺伝子は、特化された一部の細胞に限局して発現している可能性が考えられており、例えば、脳視床下部における下垂体ホルモン放出因子遺伝子や、膵島細胞における糖調節ホルモン遺伝子等は、極めて限られた少数の細胞においてのみ、その発現が見られる。ある一群の遺伝子は特定の発生段階の限局された領域でのみ発現している可能性があり、また、他の一群の遺伝子は各種ストレスや病原体の感染など環境要因の変動にさらされた細胞でのみ誘導される可能性がある。そして、一般に、より多くのｃＤＮＡ種をクローン化するためには、種々の発生段階にあるより多くの組織、細胞種について環境条件を多様化させて調べることの有用性が指摘されている。

一方、特定の性質を持つ細胞、組織の遺伝子発現産物（主にｍＲＮＡ）と、そのような性質を示さない細胞、組織の遺伝子発現産物を基に、共に等しく発現している遺伝子同士を一方のｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡ等によってハイブリダイズさせて除去することで、特定の性質を持つ細胞等に特異的に発現する遺伝子のみを単離する手法としてサブトラクション法が知られている。このように、サブトラクション法は二つの条件下で発現レベルの異なる遺伝子を単離するための方法であり、ある遺伝子のｍＲＮＡが条件Ａに比べ条件Ｂでより高レベルに発現している際、ＡとＢに由来するｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ／ｃＲＮＡ等の間でハイブリッドを形成させ、これを除去することにより、条件Ｂで発現の高い遺伝子をクローン化することが可能である（以下、Ａ由来の対照試料をドライバー、Ｂ由来の目的試料をテスターと呼ぶ）。微量の試料に対応した、ＰＣＲを工程に加えたサブトラクション法も知られている（ゲノム間の差異を検出する方法として、非特許文献１参照）。

他方、本発明者らはサブトラクションクローニングや、ｃＤＮＡライブリーの作製等への適用が可能で、かつ汎用性のある、生体内で発現している超微量のｍＲＮＡを増幅する方法として、微量全ｍＲＮＡを増幅し、特定のｍＲＮＡの変動を定量化すると共に、ｃＤＮＡライブラリーを容易に構築できる実験手技の開発を試みた結果、オリゴ（ｄＴ）を結合させた磁気ビーズに試料中のｍＲＮＡを吸着させた後、磁気ビーズ上で２重鎖ｃＤＮＡを合成し、５'末端にＴ７プロモーター配列を有するリンカーを付加した後、アンチセンス鎖ｃＤＮＡが結合した磁気ビーズを除去し、上清中のセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６プロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを再度合成し、この２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の既知配列をプライマーとしてＰＣＲを行ってｃＤＮＡ混成物を増幅し、次いでＴ７ポリメラーゼやＳＰ６ポリメラーゼを用いることにより、試料中のｍＲＮＡを１０8倍程度増幅しうる方法を確立し、かかる微量ｍＲＮＡの増幅法を用いて、ｍＲＮＡのレベルの定量、及びｃＤＮＡライブラリーの構築が可能であることを確認している（例えば、特許文献１参照）。
特開２００２−２３８５７５号公報 Science, 259: 946-951, 1993

比較的微量な試料から出発してサブトラクションを行う場合、ハイブリッド形成を免れたｃＤＮＡがしばしばＰＣＲにより増幅される。その際、以下の２点が特に問題となる。
（１）ＰＣＲを行うとき、比較的長めのｃＤＮＡが増幅されずに欠落してしまう恐れがある。
（２）効果的なサブトラクションを行うため、一般にテスターに比べ大過剰のドライバーが用いられる一方で、ハイブリッド形成後のドライバーの除去が完全でないと、テスターに混入しサブトラクションが無効となり、相反する両条件を満たすことが難しい。

本発明の課題は、特定の条件下で発現量の変動する産業上の有用性が期待される遺伝子の単離を可能とし、遺伝子資源の確保、有用遺伝子の発見、解析に極めて有用なサブトラクション方法、すなわち、微量試料に由来するｍＲＮＡを用いてサブトラクションを効率的に行い、特定の条件下で発現量の変動する遺伝子をクローン化することが可能なサブトラクション方法や、該サブトラクション方法を簡便に実施するためのサブトラクション用キットを提供することにある。

本発明者らは、まず上記ＰＣＲ時に比較的長めのｃＤＮＡが増幅されずに欠落するという問題の解決手段として、磁気ビーズ上でｃＤＮＡ混成物を合成した後に３等分し、各分画を個別に３種の制限酵素ＢａｎＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＨｉｎｃIIにより切断し、切断後に再び３分画を混合することによりｃＤＮＡを整長し、切断端を平滑化した後、共通の合成リンカーを連結し、前記本発明者らにより開発された「微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法」（特許文献１参照）記載の方法に準じてｃＤＮＡ混成物をＰＣＲにより増幅した。上記３種の制限酵素の認識部位は理論上１０２４ｂｐに１回出現するため、３種の認識部位のいずれかがｃＤＮＡの３'末端から２０００ｂｐ以内に出現する確率は９９．７％であり、その切断により大部分のｃＤＮＡを２０００ｂｐ以下、平均１０００ｂｐに整長することが可能である。このｃＤＮＡの整長により、ｃＤＮＡ混成物をＰＣＲを用いて網羅的に増幅することが可能となり、元来２ｋｂ以上の長いｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡも遺失なく増幅できることを見い出した。

つぎに、効果的なサブトラクションを行うため、一般にテスターに比べ大過剰のドライバーが用いられる一方で、ハイブリッド形成後のドライバーの除去が完全でないと、テスターに混入しサブトラクションが無効となり、相反する両条件を満たすことが難しいという問題の解決手段として、ドライバーとしてビオチン標識した両鎖ｃＲＮＡを、テスターとして２本鎖ｃＤＮＡを用いてハイブリッドを形成した後、これをストレプトアビジン磁気ビーズを用いて除去することにより、仮にドライバーｃＲＮＡがテスターに混入してもＰＣＲ反応の鋳型とはなり得ず、テスター由来ｃＤＮＡのみが選択的に増幅されることを見い出した。

本発明の課題を解決するためには、標識両鎖ｃＲＮＡの調製が必須であるが、これは、前記本発明者らにより開発された「微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法」（特許文献１参照）の記載に従い、両端にＴ７およびＳＰ６プロモーター配列を有する全ｃＤＮＡを鋳型としてインビトロ転写によりセンス鎖ｃＲＮＡおよびアンチセンス鎖ｃＲＮＡを特異的に合成する際、標識ヌクレオチドを取りこませることにより可能であることを見い出した。また、ＰＣＲにより増幅されたｃＤＮＡは、前記本発明者らにより開発された「微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法」（特許文献１参照）の記載に従い、両端にＡｖａＩおよびＡｃｃＩ制限酵素部位を構築し、プラスミドpUC19などに挿入することにより、サブトラクションライブラリーを構築することができることを見い出した。さらに必要に応じて
、増幅ｃＤＮＡを用いて再びサブトラクションハイブリダイゼーションを行うことにより、より精度のよいサブトラクション方法とすることが可能であることも見い出した。

本発明は、以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。

すなわち本発明は、（１）1)目的とする試料（テスター）及び対照とする試料（ドライバー）中のｍＲＮＡとを、それぞれオリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着させる工程；2)担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡをそれぞれ合成する工程；3) 得られた２重鎖ｃＤＮＡを、使用制限酵素数に分割し、各分画を個別に制限酵素により切断した後、各分画を混合することによりそれぞれ整長する工程；4)整長された２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５'末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーをそれぞれ付加する工程；5)２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共にそれぞれ除去する工程；6)解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡをそれぞれ合成する工程；7)２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物をそれぞれ増幅する工程；8)増幅されたドライバーの２重鎖ｃＤＮＡ混成物を用いて、前記第１のプロモーター配列及び第２のプロモーター配列を利用して、インビトロ転写系によりドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡを合成する工程；9)増幅されたテスターの２重鎖ｃＤＮＡ混成物を解離させ、前記ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡと、サブトラクションハイブリダイゼーションを行う工程；10)ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったテスター由来のサブトラクション一次産物である２重鎖ｃＤＮＡを増幅する工程；の工程を含むことを特徴とするサブトラクション方法や、（２）サブトラクション一次産物である増幅２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡと、再度サブトラクションハイブリダイゼーションを行い、ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったテスター由来のサブトラクション二次産物である２重鎖ｃＤＮＡを増幅することを特徴とする上記（１）記載のサブトラクション方法に関する。

また本発明は、（３）担体が磁気ビーズであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のサブトラクション方法や、（４）制限酵素として、ＢａｎＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＨｉｎｃIIの少なくとも１種類を用いることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のサブトラクション方法や、（５）得られた２重鎖ｃＤＮＡを３分割し、その各分画を個別にＢａｎＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＨｉｎｃIIにより切断した後、３分画を混合することにより整長することを特徴とする上記（４）記載のサブトラクション方法や、（６）２０００ｂｐ以下、平均１０００ｂｐに整長することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のサブトラクション方法や、（７）整長した後に、５'末端を平滑末端とすることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載のサブトラクション方法や、（８）第１のプロモーター配列を有するリンカーとして、その５'末端が非対合末端、３'末端が平滑末端であるリンカーを使用することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載のサブトラクション方法や、（９）第１のプロモーター配列を有するリンカー及び／又は第２のプロモーター配列を有するリンカーとして、該プロモーター配列の５'側及び／又は３'側に制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載のサブトラクション方法や、（１０）第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が異なることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれか記載のサブトラクション方法や、（１１）第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターが、該プロモーターを特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが作用するプロモーターであることを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれか記載のサブトラクション方法や、（１２）プロモーターを特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが作用するプロモーターが、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターから選ばれることを特徴とする上記（１１）記載のサブトラクション方法や、（１３）第１のプロモーター配列を有するリンカーが、配列番号１及び２で表される塩基配列からなることを特徴とする上記（１）〜（１２）のいずれか記載のサブトラクション方法や、（１４）第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーが、配列番号３で表される塩基配列からなることを特徴とする上記（１）〜（１３）のいずれか記載のサブトラクション方法に関する。

さらに本発明は、（１５）ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡをビオチン標識ｃＲＮＡとして合成し、ストレプトアビジン磁気ビーズを用いて、ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったテスター由来のサブトラクション産物を分離することを特徴とする上記（１）〜（１４）のいずれか記載のサブトラクション方法に関する。

本発明によると、特定の条件下で発現量の変動する産業上の有用性が期待される遺伝子の単離を可能とし、遺伝子資源の確保、有用遺伝子の発見、解析に極めて有用なサブトラクション方法、すなわち、微量試料に由来するｍＲＮＡを用いてサブトラクションを効率的に行い、特定の条件下で発現量の変動する遺伝子をクローン化することが可能なサブトラクション方法や、該サブトラクション方法を簡便に実施するためのサブトラクション用キットを提供することができる。

本発明のサブトラクション方法としては、1)目的とする試料（テスター）及び対照とする試料（ドライバー）中のｍＲＮＡとを、それぞれオリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着させる工程；2)担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡをそれぞれ合成する工程；3)得られた２重鎖ｃＤＮＡを制限酵素により切断してそれぞれ整長する工程；4)整長された２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５'末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーをそれぞれ付加する工程；5)２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共にそれぞれ除去する工程；6)解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡをそれぞれ合成する工程；7)２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物をそれぞれ増幅する工程；8)増幅されたドライバーの２重鎖ｃＤＮＡ混成物を用いて、前記第１のプロモーター配列及び第２のプロモーター配列を利用して、インビトロ転写系によりドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成する工程；9)増幅されたテスターの２重鎖ｃＤＮＡ混成物を解離させ、前記ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡと、サブトラクションハイブリダイゼーションを行う工程；10)ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったテスター由来のサブトラクション一次産物である２重鎖ｃＤＮＡを増幅する工程；を含む方法であれば特に制限されるものではなく、その一例が図１及び図２にステップ１〜ステップ１１として示されている。

上記工程1)における試料としては、動物、植物、微生物等の細胞・組織等のｍＲＮＡを含むものであれば特に制限されるものではなく、テスター及びドライバーとしては、ｍＲＮＡの発現量に差異があるものが通常用いられる。テスター及びドライバーの細胞溶解液等のｍＲＮＡを含む液体サンプルの調製は常法により行うことができるが、グアニジンチオシアネートの存在下等のＲＮａｓｅ活性が阻害された緩衝液中で行うことが好ましい。本発明によると、例えば、グアニジンチオシアネートを用いて細胞を溶解した後、細胞１個程度に含まれる全ＲＮＡ量０．１ｎｇ程度以上を単離すればよく、その中に増幅しようとする標的ｍＲＮＡが５ｐｇ以上程度含まれていればよい。また、工程1)において用いられる担体としては、水不溶性の担体で、加熱変性時に溶融しないものであればどのようなものでもよいが、ポリエチレンビーズ、プラスチックプレート、磁気ビーズ等を好適に例示することができるが、これらの中でも工程5)における担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する操作を簡便に実施することができる磁気ビーズが特に好ましい。また、工程1)〜4)を磁気ビーズ等の担体上で行うことにより、反応液の交換等が容易となり、試料の逸失が少ない。

工程1)におけるオリゴ(ｄＴ)は常法により合成されたものであればどのようなものでもよく、オリゴ(ｄＴ)の重合度としてはｍＲＮＡのポリ(Ａ)とハイブリダイズして、ｍＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着させうる重合度であれば特に制限されないが、５〜２００、特に１０〜３０程度が好ましい。また、オリゴ(ｄＴ)に代えてポリＵ等のｍＲＮＡのポリ(Ａ)に相補的な配列を含んでいるものも使用することができ、これらの使用も本発明に含まれる。かかるオリゴ(ｄＴ)と上記磁気ビーズ等の担体とを結合させる方法としては特に制限されるものではなく、例えば、共有結合法、イオン結合法、物理吸着法、ビオチン−アビジン系を用いる方法等を例示することができる。

工程1)のオリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に試料中のｍＲＮＡを吸着させる反応は、オリゴ(ｄＴ)結合担体とポリ(Ａ)+ＲＮＡ含有試料とを緩衝液中でインキュベーションし、担体に結合しているオリゴ(ｄＴ)とｍＲＮＡのポリ(Ａ)とをハイブリダイズすることにより行うことができる。かかるハイブリダイゼーションのためのインキュベーションは、温度２０〜２５℃で５分程度穏やかな攪拌下で行うことが好ましい。上記緩衝液としては、ＲＮａｓｅ活性が極力除去された緩衝液が好ましい。また、インキュベーション後、上記緩衝液等を用いて、試料中の担体非結合成分を不溶性担体から洗浄・除去することが好ましい。

上記工程1)で調製された担体結合オリゴ(ｄＴ)−ポリ(Ａ)+ＲＮＡ複合体は、工程2)の磁気ビーズ等の担体上でのアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡの合成に用いられる。アンチセンス鎖ｃＤＮＡの合成は、オリゴ(ｄＴ)をプライマーとし、ｍＲＮＡを鋳型として、デオキシヌクレオチドの存在下、逆転写酵素を用いて反応させ、ポリ(Ａ)+ＲＮＡ−担体結合ｃＤＮＡ複合体を担体上で調製することにより行うことができる。センス鎖ｃＤＮＡの合成は、ポリ(Ａ)+ＲＮＡ−担体結合ｃＤＮＡ複合体を、ＲＮａｓｅ含有液で処理してポリ(Ａ)+ＲＮＡを消化・除去するか、希ＮａＯＨ溶液を用いてポリ(Ａ)+ＲＮＡを解離・除去し、次いであるいは並行して、担体結合アンチセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、デオキシヌクレオチドの存在下、ＤＮＡポリメラーゼを反応させ、センス鎖ｃＤＮＡ−担体結合アンチセンス鎖ｃＤＮＡ複合体を担体上で調製することにより行うことができるが、センス鎖ｃＤＮＡ断片の連結を促進するため、ＤＮＡリガーゼを存在させておくことが好ましい。

上記工程2)で得られた担体結合２重鎖ｃＤＮＡは、工程3)において制限酵素により切断され、それぞれ整長される。整長の程度は、後工程におけるＰＣＲ時に全てのｃＤＮＡが増幅されずに欠落することがない程度に行えばよく、混成しているｍＲＮＡに由来する全てのｃＤＮＡを３'末端から２０００ｂｐ以下（平均１０００ｂｐ）に整長（トリム）することが好ましい。また、ｃＤＮＡの整長に使用する制限酵素としては、制限酵素の認識部位が理論上１０００ｂｐに１回程度出現するものが好ましく、より具体的には、制限酵素の認識部位が理論上１０２４ｂｐに１回出現するＢａｎＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＨｉｎｃII等を好適に例示することができ、これらＢａｎＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＨｉｎｃII等は単独で使用してもよいが、工程2)で得られたテスター及びドライバーそれぞれに由来する担体結合２重鎖ｃＤＮＡを使用制限酵素数に分割、好ましくは等量に分割し、各分画を個別に制限酵素により切断した後、各分画を混合することにより整長することが特に好ましい。例えば、制限酵素としてＢａｎＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＨｉｎｃIIを用いる場合、担体結合２重鎖ｃＤＮＡを３分割し、その各分画を個別にＢａｎＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＨｉｎｃIIにより切断した後、３分画を混合することにより整長することが好ましい。このように整長した担体結合２重鎖ｃＤＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ等を用いて、その５'末端を平滑末端とすることが好ましい。

次いで、上記工程3)で得られた担体結合２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５'末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーが工程4)において付加される。かかる第１のプロモーター配列を有するリンカーとしては、ＤＮＡリガーゼ等により担体結合２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５'末端に結合しうるものであれば、単鎖あるいは２重鎖のどちらでもよいが、操作の簡便性からして２重鎖が好ましく、例えば、その５'末端が非対合末端、３'末端が平滑末端であるリンカーを使用することもできる。また、上記第１のプロモーター配列を有するリンカーとして、該プロモーター配列の５'側及び／又は３'側に制限酵素認識部位（配列）を有するリンカーを使用することが、ｃＤＮＡを解析するときなど好ましい場合が多いが、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程7)までの間に、上記認識部位に相当する制限酵素を使用することは、試料に由来するｃＤＮＡを消化・分解する可能性があるので好ましくない。そして、この工程4)においては、担体結合２重鎖ｃＤＮＡのアンチセンス鎖のオリゴ(ｄＴ)からなる５'末端は磁気ビーズ等の担体上に固定されているため、この断端が遮蔽されており、まずセンス鎖ｃＤＮＡの５'末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーを確実に結合させることができ、後の工程6)においてセンス鎖ｃＤＮＡの３'末端に第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを特異的に連結できるよう工夫されている。

上記第１のプロモーター配列としては、該プロモーターを特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが作用するプロモーター配列であることが好ましく、第１のプロモーター配列と後述する第２のプロモーター配列とが異なる場合、例えば、第１のプロモーター配列としてＴ７プロモーター配列を、第２のプロモーター配列としてＳＰ６プロモーター配列を用いる場合、工程8)において、Ｔ７プロモーター配列を特異的に転写することができるＴ７ポリメラーゼを用いることにより、工程8)においてセンス鎖ｃＲＮＡを特異的に増幅することができる。上記プロモーター特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが作用するプロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列（５'−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３'；配列番号６）、ＳＰ６プロモーター配列（５'−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ−３'；配列番号７）、Ｔ３プロモーター配列（５'−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３'；配列番号８）等を具体的に例示することができる。そして、これら第１のプロモーター配列を有するリンカーは、ＤＮＡ合成装置を用いて常法により調製することができる。

上記５'末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーが付加された担体結合２重鎖ｃＤＮＡは、次の工程5)において、２重鎖が解離させられ、アンチセンス鎖ｃＤＮＡが担体と共に除去される。２重鎖ｃＤＮＡを解離する方法としては特に制限されるものではなく、例えば低塩濃度溶液中で９０〜１００℃にて約１〜１０分間加熱して２重鎖ｃＤＮＡを熱変性することにより行われる。かかる２重鎖ｃＤＮＡを解離させた後のアンチセンス鎖ｃＤＮＡ結合担体の除去は常法により行うことができ、例えば、担体が磁気ビーズの場合は磁石等の磁性体を用いて、また担体がポリエチレンビーズの場合は遠心分離若しくは濾過等により除去することができるが、溶液中に遊離状態で残存するセンス鎖ｃＤＮＡの逸失を最少限度に留めることができる点で、担体として磁気ビーズを用いることが好ましい。

次の工程6)において、工程5)で解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡが再び合成される。上記工程5)により得られる遊離状態のセンス鎖ｃＤＮＡを含む溶液に、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーが加えられ、センス鎖ｃＤＮＡの３'端のポリ(Ａ)部分に上記プライマーのオリゴ(ｄＴ)をハイブリダイズさせ、センス鎖ｃＤＮＡと前記オリゴ(ｄＴ)プライマーとの複合体を作製する。上記第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーにおける第２のプロモーター配列を有するリンカーとしては、該プロモーター配列の５'側及び／又は３'側に制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することが、ｃＤＮＡを解析するときなど好ましい場合が多いが、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程7)までの間に、制限酵素認識部位に相当する制限酵素を使用することは試料に由来するｃＤＮＡを消化・分解する可能性があるので好ましくない。上記第２のプロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列等の特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが作用するプロモーター配列であることが好ましい。そして、これら第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーは、ＤＮＡ合成装置を用いて常法により合成することができる。

センス鎖ｃＤＮＡと前記オリゴ(ｄＴ)プライマーとの複合体を用い、センス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、デオキシヌクレオチドの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を反応させることにより、両５'端にプロモーター配列を有するリンカー部分が付加された２重鎖ｃＤＮＡを合成することができる。工程7)では、この２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の既知配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、全ｃＤＮＡ混成物を増幅する。ＰＣＲはサーマルサイクラー（Perkin-Elmer社製）等を用いて常法により行うことができる。工程7)までの過程により１０μｇ程度のｃＤＮＡ混成物を得ることができる。

工程7)により大量に増幅された、両端にプロモーター配列を有するリンカー部分が付加されたドライバー由来の２重鎖ｃＤＮＡにおける前記第１のプロモーター配列及び第２のプロモーター配列を利用して、ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写系により、センス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡを大量に合成することができる。一般に、効果的なサブトラクションを行うため、テスターに比べ大過剰のドライバーが用いられることになるが、ハイブリッド形成後のドライバーがテスターに混入することなく、ドライバーを完全に除去することができるように、センス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡを標識化ｃＲＮＡとして合成することが好ましい。中でも、ビオチン標識ＵＴＰを用いて、ドライバーとしてビオチン標識した両鎖ｃＲＮＡを合成することが特に好ましい。ビオチン標識した両鎖ｃＲＮＡは、テスターとして２本鎖ｃＤＮＡを用いてハイブリッドを形成した後、ストレプトアビジン結合担体、例えばストレプトアビジン磁気ビーズを用いて完全に除去することが可能となる。この工程8)により、工程7)までの過程により得られたドライバー由来の１０μｇ程度のｃＤＮＡ混成物を用いて、１００μｇ程度のセンス鎖及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡ混成物を容易に調製することができる。この１００μｇ程度のＲＮＡ量は、通常の分子生物学的実験には十分な量であり、センス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡ混成物をドライバーとして用いてサブトラクションクローニングが可能となる。

他方、工程7)により大量に増幅された、両端にプロモーター配列を有するリンカー部分が付加されたテスター由来の２重鎖ｃＤＮＡ混成物は、工程9)で解離させられる。２重鎖ｃＤＮＡを解離する方法としては特に制限されるものではなく、例えば低塩濃度溶液中で９０〜１００℃にて約１〜１０分間加熱して２重鎖ｃＤＮＡを熱変性することにより行われる。かかる２重鎖ｃＤＮＡを解離させた後のテスター由来の単鎖ｃＤＮＡ混成物は、上記工程8)で調製されたドライバー由来の両鎖ｃＲＮＡ、好ましくはビオチン標識した両鎖ｃＲＮＡと、サブトラクションハイブリダイゼーションが行われる。工程9)のサブトラクションハイブリダイゼーションにおけるドライバー由来の両鎖ｃＲＮＡとテスター由来の単鎖ｃＤＮＡとは、重量比で、２０：１〜５：１、好ましくは１０：１程度で用いられ、その際、共通した末端配列でのハイブリダイゼーションを避けるための競合物として、第１のプロモーター配列や第２のプロモーター配列を混合しておくことが好ましい。サブトラクションハイブリダイゼーションは、ドライバー由来の両鎖ｃＲＮＡとテスター由来の２重鎖ｃＤＮＡとを混合後、加熱によりテスター由来の２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、例えば、６５〜７５℃で２０〜５０時間程度インキュベートすることにより行うことができる。

工程9)のサブトラクションハイブリダイゼーション後に、工10)でドライバーが除去される。ドライバーを完全に除去するため、前記のように、ドライバーとしてビオチン標識した両鎖ｃＲＮＡとし、このビオチン標識した両鎖ｃＲＮＡを、工程9)のサブトラクションハイブリダイゼーション後に、ストレプトアビジン磁気ビーズを用いて完全に除去することが好ましい。ドライバーを分離・除去することにより、両鎖ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったテスター由来のサブトラクション（一次）産物である目的とする２重鎖あるいは解離１重鎖ｃＤＮＡを得ることができ、この目的とする２重鎖あるいは解離１重鎖ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の既知配列をプライマーとするＰＣＲにより増幅することができる。

さらに、サブトラクション（一次）産物である増幅２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡと、再度サブトラクションハイブリダイゼーションを行い、ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったテスター由来の２重鎖ｃＤＮＡを分離・採取し、これを増幅することにより、サブトラクション二次産物とすることもできる。このサブトラクション二次産物はサブトラクション一次産物に比べて、より濃縮された目的とする２重鎖ｃＤＮＡを含んでいる。

上記のように、本発明のサブトラクション方法を用いると、超微量のｍＲＮＡであっても、通常の分子生物学的実験に十分な量まで増幅することができることから、本発明のサブトラクション方法は、微量試料を用いて、生体内で差異性を有して発現する遺伝子の検出やクローニング、ｃＤＮＡライブラリーの作製、マイクロアレイの作製・解析等に幅広く利用することができる。

本発明のｃＤＮＡライブラリーとしては、上記本発明のサブトラクション方法により得られるｃＤＮＡ混成物がベクターに導入されているものであればどのようなものでもよく、上記ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなど従来公知のライブラリー作製用のベクターを例示することができる。本発明においては、ＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を利用して調製した、その両端に特異的な制限酵素切断端配列を有するｃＤＮＡ断片を利用してプラスミドベクターに一方向性かつ１コピーの挿入を行うことが可能となる。後述する実施例において詳しく説明されているように、例えば、ｄＡＴＰとｄＴＴＰのみ含有し、ｄＣＴＰとｄＧＴＰを含まない反応液中で、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを作用させると、その３'→５'エキソヌクレアーゼ活性により、３'端側からＣ及び／又はＧからなるヌクレオチド部分がＡ又はＴが現出するところまで除去されて５'突出末端が形成され、制限酵素ＡｖａＩ及びＡｃｃＩ断端を有するｃＤＮＡ断片等を調製することができ、かかるｃＤＮＡ断片を利用するとプラスミドベクターに一方向性かつ１コピーの挿入を行うことができる。また、かかるｃＤＮＡライブラリーの作製は、例えば、１個のマウスの初期胚、１匹のマウスの微小な脳神経核・組織領域から出発することが可能である。

本発明の整長ｃＤＮＡ由来両鎖ｃＲＮＡサブトラクション用キットとしては、オリゴ(ｄＴ)を結合させた磁気ビーズ等の担体、ＢａｎＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＨｉｎｃII等の２重鎖ｃＤＮＡ整長用制限酵素、第１のプロモーター配列を有するリンカー、前記第１のプロモーター配列とは異なる第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを含むものであれば特に制限されるものではないが、前記工程1)〜10)で使用する各種緩衝液等を含むものが好ましい。本発明の整長ｃＤＮＡ由来両鎖ｃＲＮＡサブトラクション用キットを用いると、サブトラクションクローニングや、マイクロアレイの作製・解析や、ｃＤＮＡライブラリーの構築を簡便に行うことができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［ＲＮＡサンプル液の採取］
出生直後のマウス大脳皮質に由来する初代培養細胞に対して、細胞を回収する２４時間前および６時間前に２回リポ多糖（ＬＰＳ）１０μｇ／ｍｌおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）５００ユニット／ｍｌを投与した。回収細胞から酸−グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法（ＡＧＰＣ法）により全ＲＮＡを抽出した。対照として、ＬＰＳおよびＩＦＮγ未処理の細胞からも同様に全ＲＮＡを抽出し、それぞれ０．５μｇの全ＲＮＡを含む１０μｌの水溶液を出発材料とした。
［オリゴｄＴ磁気ビーズへのポリＡ＋ＲＮＡの吸収（図１；ステップ１）］
上記ＲＮＡ０．５μｇを含む水溶液１０μｌを６５℃にて５分間保温後氷上で急冷し、２５μｇのオリゴｄＴ磁気ビーズ（Dynal社製Dynabeads Oligo（dT）25）を懸濁した１０μｌの２×結合緩衝液（１×結合緩衝液の組成：１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に加え、室温で５分間インキュベートし、ポリＡ＋ＲＮＡをオリゴｄＴにアニールさせた。ポリＡ＋ＲＮＡ吸着オリゴｄＴ磁気ビーズを磁石（Dynal社製MPC-E/E1）による吸引と分散をくり返すことにより、５０μｌの０．３×結合緩衝液にて２回洗滌した。
［磁気ビーズ上での２重鎖ｃＤＮＡの合成（図１；ステップ２）］
上記ポリＡ＋ＲＮＡ吸着オリゴｄＴ磁気ビーズを２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（INVITROGEN社製SuperScriptII）２００ユニット（１μｌ）を含む２０μｌを反応混合液に懸濁し、４２℃にて５０分間（１０分ごとに攪拌しビーズを浮遊させながら）インキュベートして、アンチセンス鎖ｃＤＮＡを合成した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止し、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡビーズを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ（以下ＴＥ溶液という）５０μｌにて３回洗滌した。続いて、同ビーズを１９ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、９１ｍＭ塩化カリウム、４．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、３．８ｍＭ ＤＴＴ、０．１５ｍＭ ＮＡＤ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（INVITROGEN社製）５ユニット、大腸菌ＤＮＡリガーゼ（INVITROGEN社製）５ユニット、大腸菌ＲＮａｓｅＨ（INVITROGEN社製）１ユニットを含む２０μｌの反応混合液に懸濁し、１６℃にて１時間インキュベートして、センス鎖ｃＤＮＡを合成し、磁気ビーズ固定２重鎖ｃＤＮＡを得、ＴＥ溶液５０μｌにて２回洗滌した。
［２重鎖ｃＤＮＡの３'末端からの平均１０００ｂｐへの整長（図１；追加ステップ）］ 上記磁気ビーズ固定２重鎖ｃＤＮＡを、６μｌの１０×制限酵素緩衝液（１×制限酵素緩衝液の組成：２０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）、滅菌水５２．５μｌで５８．５μｌに懸濁し、１９．５μｌに３等分した（チューブＮｏ．１−３）。チューブに３種の制限酵素０．５μｌを別個に加えた（Ｎｏ．１：ＢａｎＩ、Ｎｏ．２：ＥｃｏＯ１０９Ｉ、Ｎｏ．３：ＨｉｎｃII）。２０μｌの反応液を３７℃にて１時間インキュベートし、３'末端長１０００ｂｐ整長２重鎖ｃＤＮＡビーズを得た。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えた後、６５℃にて２０分間インキュベートして反応を停止し、１本にまとめて、ＴＥ５０μｌにて３回洗滌した。
［５'末端の平滑化］
上記整長２重鎖ｃＤＮＡを５０ｍＭトリス塩酸、１５ｍＭ硫酸アンモニウム、７ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．０２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、滅菌水、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ０．５ユニットを含む２０μｌの反応混合液で懸濁し、１６℃１０分間インキュベートし５'末端を平滑化した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止し、整長２重鎖ｃＤＮＡビーズをＴＥ５０μｌで２回洗滌した。
［ｃＤＮＡ５'末端へのプロモーター配列の付加とセンス鎖ｃＤＮＡの分取（図１；ステップ３および４）］
配列番号１で表される５２ｍｅｒの塩基配列からなるupper strandと、配列番号２で表される５０ｍｅｒの塩基配列からなるlower strandのオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡシンセサイザーを用いて常法により合成した。lower strandの５'末端はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB社製）を用いてリン酸化した。両鎖を常法によりアニールし、２重鎖とし、図３に示したＭＳＭＡＰ−５'−Ｔ７リンカーを得た。上記の２重鎖ｃＤＮＡビーズを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、５％ポリエチレングリコール８０００、ＭＳＭＡＰ−５'−Ｔ７リンカー１μｇ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（INVITROGEN社製）１ユニットを含む２０μｌの反応混合液に懸濁し（最後に酵素液１μｌを加えて反応開始）、４℃にて１晩インキュベートし、ＭＳＭＡＰ−５'−Ｔ７リンカーを２重鎖ｃＤＮＡ５'末端に連結した（図１；ステップ３）。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止し、リンカー連結２重鎖ｃＤＮＡビーズをＴＥ溶液５０μｌにて３回洗滌した。続いて、同ビーズをＴＥ溶液２０μｌに懸濁し、９５℃にて５分間インキュベートして、熱融解によりセンス鎖ｃＤＮＡを解離させた。アンチセンス鎖ｃＤＮＡビーズを磁石に吸引し、センス鎖ｃＤＮＡを含む上清を分取した（図１；ステップ４）。
［ｃＤＮＡ３'末端へのプロモーター配列の付加とアンチセンス鎖ｃＤＮＡの再合成（図１ステップ５）］
センス鎖ｃＤＮＡ溶液４μｌに、配列番号３で表される６８ｍｅｒの塩基配列（図３）からなる、ＳＰ６プロモーター配列を付加したオリゴ（ｄＴ）プライマーＭＳＭＡＰ−３'−ＳＰ６プライマー５０ｎｇを加え、合計５μｌとした。９０℃にて３分間加熱した後、氷上にて急冷し、これに各終濃度２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを加え、４２℃にて５分間インキュベートした後、さらにＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（INVITROGEN社製SuperScriptII）２００ユニット（１μｌ）を加え２０μｌの反応混合液とした。４２℃にて１時間インキュベートして、アンチセンス鎖ｃＤＮＡを合成し、２重鎖ｃＤＮＡとした。
［ｃＤＮＡ混成物の増幅（図１；ステップ６）］
２段階のＰＣＲにより、ｃＤＮＡ混成物の増幅を行った。プライマーとしては、２重鎖ｃＤＮＡのリンカー部分の既知配列、すなわち配列番号４で表された２０ｍｅｒの塩基配列からなる５'ＰＣＲプライマー（図３）と配列番号５で表される２０ｍｅｒの塩基配列からなる３'ＰＣＲプライマー（図３）を用いた。第一段階のＰＣＲは、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．２）、１０ｍＭ塩化カリウム、６ｍＭ硫酸アンモニウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、上記２重鎖ｃＤＮＡ溶液４μｌ、５'ＰＣＲプライマー０．１ｎｍｏｌ、３'ＰＣＲプライマー０．１ｎｍｏｌ、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製PfuTurbo DNAポリメラーゼ）３ユニットを含む５０μｌの反応混合液中で行った。なお、ＰＣＲの条件は、９４℃にて１分間熱変性、６４℃にて２分間アニーリング、７２℃にて４分間伸長反応させるというサイクルを２０回繰り返すという条件で行った。第二段階のＰＣＲは、第一段階のＰＣＲ産物混合液４μｌずつを４本のチューブに分注し、各チューブの他の組成は第一段階と同様５０μｌの反応混合液中で行った。なお、ＰＣＲの条件は、上記第一段階と同様の条件で９サイクル行った。４本の産物混合物を１本に集め、ＴＥ飽和フェノール２００μｌによる抽出２回、ＴＥ飽和フェノール／クロロホルム（５０：５０）２００μｌによる抽出２回、クロロホルム２００μｌによる抽出２回の後、残された約２００μｌの産物混合液に、キャリアーとしてグリコーゲン（Roche Diagnostics社製）２０μｇ（１μｌ）を加え、さらに３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容（２０μｌ）、イソプロパノール７／１０容（１５４μｌ）を加え、室温にて１０分保管後、遠心により産物を回収した。沈殿を７０％エタノール１ｍｌにて洗滌した後、風乾しＴＥ溶液２０μｌに溶解した。
［ドライバーｃＲＮＡの合成（図２；ステップ７）］
無刺激の対照細胞に由来する上記増幅ｃＤＮＡ混成物を鋳型として、センス鎖およびアンチセンス鎖ｃＲＮＡをそれぞれＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて以下のように特異的に合成した。４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＧＴＰ、０．９ｍＭ ＵＴＰ、０．１ｍＭビオチン標識ＵＴＰ、ＲＮａｓｅインヒビター（TOYOBO社製）２０ユニット、増幅ｃＤＮＡ混成物０．３μｇ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社製）またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社製）４０ユニットを含む２０μｌの反応混合液を３７℃にて２時間インキュベートして、ビオチン標識ｃＲＮＡを合成した。続いて、ＲＮａｓｅ活性を含まないＤＮａｓｅＩ（５ユニット／μｌTAKARA社製）１μｌを加え、さらに３７℃にて１５分間インキュベートすることにより鋳型ｃＤＮＡを分解し、最後に０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止した。続いて５Ｍ酢酸アンモニウム２／３容（１５．２μｌ）、エタノール２容（７６μｌ）を加え、氷上に１０分間保管後、遠心により産物を回収した。回収した産物（沈殿物）を７０％エタノール０．１ｍｌにて洗滌した後、風乾し、滅菌水２０μｌに溶解した。
［サブトラクションハイブリダイゼーション（図２；ステップ８および９）］
ドライバーである上記ビオチン標識ｃＲＮＡ５μｇ（センス鎖およびアンチセンス鎖それぞれ２．５μｇ）に、テスターであるＬＰＳ−ＩＦＮγで刺激した細胞由来の増幅ｃＤＮＡ０．５μｇ、共通した末端配列でのハイブリダイゼーションを避けるために競合させるものとして、配列番号１で表される５２ｍｅｒの塩基配列からなるupper strand２μｇ、配列番号３で表される６８ｍｅｒの塩基配列からなる、ＳＰ６プロモーター配列を付加したオリゴ（ｄＴ）プライマーＭＳＭＡＰ−３'−ＳＰ６プライマー２μｇを混合し、３０μｌの溶液とした。３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容（３μｌ）、エタノール２倍容（６６μｌ）を加え、氷上に１０分間保管後、遠心にて核酸を回収した。回収した沈殿物を７０％エタノール０．１ｍｌにて洗滌した後、風乾し、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．３）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２ｍＭ ＥＤＴＡ、３０％ホルムアミドを含む５μｌの反応混合液に溶解した。９８℃にて１分３０秒加熱し、テスター２重鎖ｃＤＮＡを解離させた後、６８℃にて２１時間インキュベートした。
［磁気ビーズによるドライバーの除去（図２；ステップ１０）］
ストレプトアビジン磁気ビーズ（Dynal社製 Dynabeads M-280 Streptavidin）１ｍｇを２×洗滌緩衝液（１×洗滌緩衝液の組成：１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ塩化ナトリウム）５０μｌ、滅菌水４５μｌにて懸濁し、上記混合液５μｌを加えた。室温にて１０分、ビオチンとストレプトアビジンを結合させた後、５５℃にて３分間保持して非特異的結合を除き、ストレプトアビジン磁気ビーズを磁石で吸引保持してドライバーを除去し、テスターを含む上清を採取した。ビオチン化ｃＲＮＡを完全に除くため、ストレプトアビジン磁気ビーズによる除去をもう一度繰り返した後、ＴＥにて全量５００μｌとし、キャリアーとしてグリコーゲン（Roche Diagnostics社製）２０μｇ（１μｌ）を加えエタノール１ｍｌを加えた。氷上１０分保管後、遠心により産物を回収した。沈殿を７０％エタノール１ｍｌにて洗滌した後、風乾し、ＴＥ溶液１０μｌに溶解した。０．２Ｍ水酸化ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む溶液１０μｌを加え、３７℃にて３０分インキュベートし、除去しきれなかったドライバーｃＲＮＡをアルカリ分解した。ＴＥ１８０μｌにて中和後、３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容（２０μｌ）、イソプロパノール７／１０容（１５４μｌ）を加え、室温にて１０分保管後、遠心により産物を回収した。沈殿を７０％エタノール１ｍｌにて洗滌し、風乾後、ＴＥ溶液２０μｌに溶解してサブトラクション１回済みテスター溶液を得た。
［サブトラクション産物の増幅（図２；ステップ１１）］
プライマーとしては、２重鎖ｃＤＮＡのリンカー部分の既知配列、すなわち配列番号４で表された２０ｍｅｒの塩基配列からなる５'ＰＣＲプライマー（図３）と配列番号５で表される２０ｍｅｒの塩基配列からなる３'ＰＣＲプライマー（図３）を用いた。２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．２）、１０ｍＭ塩化カリウム、６ｍＭ硫酸アンモニウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、上記２重鎖ｃＤＮＡ溶液１μｌ、５'ＰＣＲプライマー０．１ｎｍｏｌ、３'ＰＣＲプライマー０．１ｎｍｏｌ、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製PfuTurbo DNAポリメラーゼ）３ユニットを含む５０μｌの反応混合液中で行った。なお、ＰＣＲの条件は、９４℃にて１分間熱変性、６４℃にて２分間アニーリング、７２℃にて４分間伸長反応させるというサイクルを１３回繰り返すという条件で行った。８本の産物混合液を１本に集め、ＴＥ飽和フェノール４００μｌによる抽出２回、ＴＥ飽和フェノール／クロロホルム（５０：５０）４００μｌによる抽出２回、クロロホルム４００μｌによる抽出２回の後、残された約４００μｌの産物混合液に、キャリアーとしてグリコーゲン（Roche Diagnostics社製）２０μｇ（１μｌ）を加え、さらに３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容（４０μｌ）、イソプロパノール７／１０容（３０８μｌ）を加え、室温にて１０分保管後、遠心により産物を回収した。沈殿を７０％エタノール１ｍｌにて洗滌した後、風乾し、ＴＥ溶液１０μｌに溶解した。以上により通常約２μｇのサブトラクション（一次）産物の増幅ｃＤＮＡが得られた（第１ラウンド終了ｃＤＮＡ混成物）。

この増幅ｃＤＮＡ０．５μｇを再度テスターとして用い、ステップ８〜１０のサブトラクションハイブリダイゼーションおよびＰＣＲによる増幅をもう一度繰り返すことにより、第２ラウンド目のサブトラクション操作を行なった。得られたサブトラクション二次産物である増幅ｃＤＮＡをライブラリー作製用のｃＤＮＡ混成物とした（第2ラウンド終了ｃＤＮＡ混成物）。
［サザンハイブリダイゼーション解析によるサブトラクション効果の検定（図４）］
サブトラクションにより特定のｃＤＮＡが濃縮されたか否かを確かめるために、各段階の全ｃＤＮＡ混成物のサザンハイブリダイゼーション解析を行なった。図４左側に、ＰＣＲにて増幅した全ｃＤＮＡ ０．２μｇを１％アガロースにて電気泳動後、エチジウムブロマイドにて蛍光染色した結果を示す。ＬＰＳ−ＩＦＮγで未処理（−）あるいは処理（＋）の培養細胞に由来する全ｃＤＮＡおよび第１ラウンド、第２ラウンドのサブトラクション終了後の全ｃＤＮＡがスメア状に検出された。図４中央に、ナイロンメンブレンにブロット後、ＤＩＧ標識したinterferon γ-inducible ４７ｋＤａ protein (Ifi47) ｃＲＮＡをプローブに用いてサザン解析を行なった結果を示す。未処理（−）に比べＬＰＳ−ＩＦＮγ処理（＋）で誘導されたIfi47 ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡは、第１ラウンドおよび第２ラウンドのサブトラクションにより濃縮されたことが明らかである。これに対し、図４右側に示すように、ＬＰＳ−ＩＦＮγ処理（＋）によっても著変を示さないglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（ＧＡＰＤＨ） ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡは、サブトラクションの第１ラウンドにより大部分が除去され、第２ラウンドによりほぼ完全に消失した。従って、２ラウンドのサブトラクションにより、テスター中に高レベルに存在するｃＤＮＡが特異的に濃縮される一方で、テスター、ドライバー中に同レベルに存在するｃＤＮＡは効率的に除去されることが示された。
［サブトラクション産物の増幅ｃＤＮＡよりのライブラリーの作製］
増幅ｃＤＮＡ混成物は、その両端に構築された特殊な配列を利用して、pUC18/19、pGEM-3Zf（＋）/（−）等のプラスミドベクターに一方向性に、かつ１コピーのみ挿入することが可能である。ｃＤＮＡ混成物の５'末端の配列
５'−ＣＣＧＧＡ・・・・・・−３'
３'−ＧＧＣＣＴ・・・・・・−５'
に対して、ｄＡＴＰとｄＴＴＰのみが存在し、ｄＣＴＰとｄＧＴＰが存在しない反応液中で、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを作用させると、その３'→５'エキソヌクレアーゼ活性により、
５'−ＣＣＧＧＡ・・・・・・−３'
３'− Ｔ・・・・・・−５'
の５'突出末端を形成できる。この末端は、pUC18/19、pGEM-3Zf（＋/−）等のポリリンカー部位をＡｖａＩにて消化した際形成される５'突出末端と相補的である。同様にして、ｃＤＮＡ混成物の３'末端の配列
５'−ＣＧＡ・・・・・・−３'
３'−ＧＣＴ・・・・・・−５'
に対して、
５'−ＣＧＡ・・・・・・−３'
３'− Ｔ・・・・・・−５'
の５'突出末端を形成できる。この末端は、pUC18/19、pGEM-3Zf（＋）/（−）等のポリリンカー部位をＡｃｃＩにて消化した際形成される５'突出末端と相補的である。この特質を利用して、各ｃＤＮＡを一方向性にプラスミドのＡｖａＩ−ＡｃｃＩ部位に挿入できる。また、各ｃＤＮＡの両端はリン酸化されていないため、ｃＤＮＡ同士の連結がおこらず、１コピーのみ挿入される。
［サブトラクション産物のｃＤＮＡライブラリーの構築とＤＮＡマイクロアレイ解析によるサブトラクション効果の検定（図５）］
以下に、前記サブトラクション産物の増幅ｃＤＮＡ混成物をpUC19に挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した実験例を示す。

５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．８）、７ｍＭ塩化マグネシウム、１５ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭメルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１ｍＭ ｄＴＴＰ、増幅ｃＤＮＡ混成物０．５μｇ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社製）２．５ユニットを含む１００μｌの反応混合液を３７℃にて１０分間インキュベートして、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性によりｃＤＮＡの両３'端よりＣおよびＧヌクレオチド残基を除去した。反応液をアガロースゲル電気泳動し、６００ｂｐから３０００ｂｐのＤＮＡ長に相当する部分のゲルを切り出し、ｃＤＮＡをGlassmilk （Bio 101社製）を用いて抽出し１０μｌの溶液とした。一方、pUC19をＡｖａＩおよびＡｃｃＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動後、ベクター部分のバンドを含むゲルを切り出し、ＤＮＡをGlassmilk（Bio 101社製）を用いて精製した。ＡｖａＩ／ＡｃｃＩ末端構成ｃＤＮＡ混成物の溶液４μｌとＡｖａＩ／ＡｃｃＩ消化pUC19 ５ｎｇを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、常法により大腸菌MAX Efficiency DH10Bコンピテントセル（INVITROGEN社製）をトランスフォームした。約４００コロニーについてプラスミドを抽出し、ｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ、１９０種類の遺伝子に分類された。これらのｃＤＮＡをカルボジイミド−コートしたスライドガラスにスポットしてマイクロアレイを作製し、Ｃｙ３およびＣｙ５の２色蛍光法により、無刺激に比べＬＰＳ−ＩＦＮγ刺激でｍＲＮＡレベルが上昇する遺伝子の検索を行なった。図５に各スポットの示した変動倍率の分布を示す。１９０クローン中３１.６％（６０クローン）にて８倍以上の上昇が認められた。これは、無刺激およびＬＰＳ−ＩＦＮγ刺激の細胞に由来するｃＤＮＡをスポットしたマイクロアレイを同様に解析した場合、８倍以上の上昇を示すクローンの割合が、それぞれ０％（０/１５９）および１０．７％（１６/１５０）であることに比べ、明らかに高い数値であった。以上より、サブトラクションが効率良く遂行されたこと、また、サブトラクションライブラリーが構築されたことが示された。

本発明の微量ｍＲＮＡ増幅法により、ｃＤＮＡ混成物やｃＲＮＡ混成物を合成する、各工程（前半）別の概略を示す図である。 本発明の微量ｍＲＮＡ増幅法により、ｃＤＮＡ混成物やｃＲＮＡ混成物 を合成する、各工程（後半）別の概略を示す図である。 本発明のサブトラクション方法に用いられるリンカーやプライマーの構 造を示す図である。 本発明のサブトラクション方法における、サザンハイブリダイゼーショ ン解析によるサブトラクション効果の検定結果を示す図である。 本発明のサブトラクション方法における、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析 によるサブトラクション効果の検定結果を示す図である。

Claims (15)

1. 以下の1)〜10)の工程を含むことを特徴とするサブトラクション方法。
   1)目的とする試料（テスター）及び対照とする試料（ドライバー）中のｍＲＮＡとを、それぞれオリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着させる工程；
   2)担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡをそれぞれ合成する工程；
   3)得られた２重鎖ｃＤＮＡを、使用制限酵素数に分割し、各分画を個別に制限酵素により切断した後、各分画を混合することによりそれぞれ整長する工程；
   4)整長された２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５'末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーをそれぞれ付加する工程；
   5)２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共にそれぞれ除去する工程；
   6)解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡをそれぞれ合成する工程；
   7)２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物をそれぞれ増幅する工程；
   8)増幅されたドライバーの２重鎖ｃＤＮＡ混成物を用いて、前記第１のプロモーター配列及び第２のプロモーター配列を利用して、インビトロ転写系によりドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡを合成する工程；
   9)増幅されたテスターの２重鎖ｃＤＮＡ混成物を解離させ、前記ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡと、サブトラクションハイブリダイゼーションを行う工程；
   10)ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったテスター由来のサブトラクション一次産物である２重鎖ｃＤＮＡを増幅する工程；
2. サブトラクション一次産物である増幅２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡと、再度サブトラクションハイブリダイゼーションを行い、ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったテスター由来のサブトラクション二次産物である２重鎖ｃＤＮＡを増幅することを特徴とする請求項１記載のサブトラクション方法。
3. 担体が磁気ビーズであることを特徴とする請求項１又は２記載のサブトラクション方法。
4. 制限酵素として、ＢａｎＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＨｉｎｃIIの少なくとも１種類を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のサブトラクション方法。
5. 得られた２重鎖ｃＤＮＡを３分割し、その各分画を個別にＢａｎＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＨｉｎｃIIにより切断した後、３分画を混合することにより整長することを特徴とする請求項４記載のサブトラクション方法。
6. ２０００ｂｐ以下、平均１０００ｂｐに整長することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のサブトラクション方法。
7. 整長した後に、５'末端を平滑末端とすることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のサブトラクション方法。
8. 第１のプロモーター配列を有するリンカーとして、その５'末端が非対合末端、３'末端が平滑末端であるリンカーを使用することを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のサブトラクション方法。
9. 第１のプロモーター配列を有するリンカー及び／又は第２のプロモーター配列を有するリンカーとして、該プロモーター配列の５'側及び／又は３'側に制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のサブトラクション方法。
10. 第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が異なることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のサブトラクション方法。
11. 第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターが、該プロモーターを特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが作用するプロモーターであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載のサブトラクション方法。
12. プロモーターを特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが作用するプロモーターが、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターから選ばれることを特徴とする請求項１１記載のサブトラクション方法。
13. 第１のプロモーター配列を有するリンカーが、配列番号１及び２で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載のサブトラクション方法。
14. 第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーが、配列番号３で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載のサブトラクション方法。
15. ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡをビオチン標識ｃＲＮＡとして合成し、ストレプトアビジン磁気ビーズを用いて、ドライバーのセンス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡの両鎖ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったテスター由来のサブトラクション産物を分離することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか記載のサブトラクション方法。