JPWO2004040019A1 - 核酸の増幅法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、標的核酸配列を含む核酸を効率的に合成または増幅する方法に関するものである。本発明による方法においては、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるプライマーであって、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとし、前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間の介在配列の塩基数をＹ’（Ｙ’は０であり得る）としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを使用する。
Description
［発明の背景］
発明の分野
本発明は、遺伝子工学分野において有用な核酸配列の合成法および増幅法に関するものであり、より詳細には、鎖置換反応を利用した核酸配列の合成法および増幅法に関するものである。
発明の分野
本発明は、遺伝子工学分野において有用な核酸配列の合成法および増幅法に関するものであり、より詳細には、鎖置換反応を利用した核酸配列の合成法および増幅法に関するものである。
遺伝子工学分野においては、遺伝的な特徴を直接的に分析しうる方法として、核酸配列の相補性に基づく分析が知られている。このような分析では、試料中に存在する目的遺伝子量が少ない場合には、一般にその検出が容易ではないため、目的遺伝子そのものを予め増幅することが必要となる。
目的遺伝子の増幅（核酸増幅）は、主に、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により行われる。このような酵素的方法の主要なものとしては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法；米国特許第４６８３１９５号明細書、米国特許第４６８３２０２号明細書および米国特許第４８００１５９号明細書）、さらには、ＰＣＲ法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法；Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，ｐｐ１４６−１５２，１９９２）がある。これらの方法は、鋳型となる二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（変性）、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、およびプライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つの段階からなる反応を繰り返すことにより、ＤＮＡまたはＲＮＡからの目的遺伝子の増幅を可能とするものである。これらの方法では、反応溶液を上記３段階のそれぞれに適した温度に調節する計３工程の繰り返しが必要とされる。
上記の核酸増幅法において工程数を２工程とする改良法としては、シャトルＰＣＲ法（「ＰＣＲ法最前線」、蛋白質 核酸 酵素 別冊、共立出版、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６））が知られている。シャトルＰＣＲ法では、ＰＣＲ法における３段階の反応のうち、プライマーのアニーリングおよび伸長の２段階が同一温度で行われるため、計２工程の反応により目的遺伝子を増幅することが可能となる。さらに、欧州特許出願公開第０３２０３０８号明細書には、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）が開示されており、該方法では、耐熱性のＤＮＡリガーゼを用いて２工程の温度サイクリング反応（加熱と冷却の繰り返し反応）を行うことにより既知の遺伝子配列が増幅される。
以上に記載した方法においては、広い温度範囲で、かつ、厳密な温度制御を経時的に行なうことのできる高価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。また、該反応は、２種類〜３種類の温度条件で行なうために、各反応温度に調整するための時間が必要であり、サイクル数が増えれば増えるほど、それに要する時間は増大する。
上記問題点を解決すべく、等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発されている。このような方法としては、例えば、特公平７−１１４７１８号公報に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、自立複製（３ＳＲ；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許第２６５０１５９号公報に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許第２７１０１５９号公報に記載のＱベータレプリカーゼ法、米国特許第５８２４５１７号明細書、国際公開第９９／０９２１１号パンフレットまたは国際公開第９５／２５１８０号パンフレットに記載の種々の改良ＳＤＡ法、国際公開第００／２８０８２号パンフレットに記載のランプ法（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、国際公開第０２／１６６３９号パンフレットに記載のアイキャン法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）等が挙げられる。これらの等温核酸増幅法に関与する全段階の反応は一定の温度に保たれた反応混合物中で同時に進行する。
ＳＤＡ法では、最終的にＤＮＡが増幅される系において、ＤＮＡポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼが介する二本鎖の置換により、試料中の目的核酸（およびその相補鎖）の増幅が可能となる。該方法では、４種類のプライマーが必要とされ、その内の２種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように設計する必要がある。また、該方法では、核酸合成のための基質として、修飾されたデオキシヌクレオチド３リン酸、例えば３リン酸部分のα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子（Ｓ）に置換されたデオキシヌクレオチド３リン酸が必要とされる。従って、該方法は、高いランニングコストを必要とする。さらに該方法では、増幅された核酸断片中に修飾ヌクレオチド、たとえばαＳ置換デオキシヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅断片を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析に供しようとする場合に、該増幅断片が制限酵素で切断できないことがあり、よって、そのような解析を実施できない場合がある。
米国特許第５８２４５１７号明細書に記載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成され、３’末端側がＤＮＡであるキメラプライマーを必要とする。そのようなＲＮＡとＤＮＡから構成されるキメラプライマーはその合成にかかる費用が高く、また、ＲＮＡを含むプライマーはその取り扱いに専門的な知識を必要とする。また、国際公開第９９／０９２１１号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、５’突出末端を生じさせる制限酵素を必要とし、さらに、国際公開第９５／２５１８０号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマー対を必要とするため、これらの方法は高いランニングコストを必要とする。
アイキャン法では、ＲＮＡとＤＮＡから構成され、３’末端側がＲＮＡであるキメラプライマー、さらには、そのプライマーの３’末端のＲＮＡ部分を切断するＲＮａｓｅＨが必要とされるため、必要な試薬のための費用が高価となる。そのため、この方法は、特に大量のサンプルについての遺伝子検査等において、高いランニングコストを必要とする。
ランプ法では、４種類のプライマーが必要とされ、それらが６個所の領域を認識することにより、目的遺伝子の増幅が可能となる。すなわち、この方法では、まず、第一のプライマーが鋳型鎖にアニーリングして伸長反応が起こり、この第一のプライマーの構成に起因して伸長鎖の５’末端部分でステム−ループ構造が形成される。次に、第一のプライマーよりも上流側に設計された第二のプライマーによる鎖置換反応により第一のプライマーによる伸長鎖が鋳型鎖から分離する。これと同様の反応が二本鎖核酸のもう一方の鎖についても行なわれ、これらの反応が繰り返されることにより、標的核酸が増幅される。従って、ランプ法では増幅反応の作用機序が複雑となり、さらには必ず６個所の領域を選定しなければならないため、プライマーの設計が困難となる。また、４種類のプライマーのうち、２種類は比較的長鎖のプライマーが必要とされるため、プライマーの合成およびその精製に費用と時間がかかる。
従って、低いランニングコストで実施でき、かつ得られた核酸断片をさらに遺伝子工学的な処理に使用することを可能とする核酸増幅法が求められている。特に、一対のプライマーで速やかに増幅可能な等温核酸増幅法が望まれる。
［発明の概要］
本発明者らは、鎖置換反応を利用した核酸の増幅法において、該方法に使用される、プライマーの伸長によってステム−ループ形成可能なプライマーを特定の条件を満たすように設計することにより、１種のプライマーを用いて標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む核酸を合成でき、さらには、２種のプライマーを用いて効率的に標的核酸を増幅できることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
従って、本発明は、標的核酸配列を含む核酸を効率的に合成または増幅する方法、ならびにこれらの方法に用いられるプライマーまたはプライマーセットを提供することを目的とする。
そして、本発明による核酸合成法は、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成する方法であって、
（ａ）標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程、
（ｂ）鋳型核酸を用意する工程、
（ｃ）前記プライマーを前記鋳型核酸にアニーリングさせ、プライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む相補核酸を合成する工程、
（ｄ）工程（ｃ）により合成された相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）を同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズさせ、これにより、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする工程、および
（ｅ）工程（ｄ）により一本鎖とされた鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（ｃ）により合成された相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程、
を含んでなる方法である。
また、本発明による核酸増幅法は、二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）二本鎖鋳型核酸の第一鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなる第一のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程、
（ｂ）二本鎖鋳型核酸の第二鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ｃ）よりも５’側に存在する配列（Ｄ）の相補配列（Ｄｃ）にハイブリダイズする配列（Ｄ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる第二のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ｃｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ｃ）と前記配列（Ｄ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程、
（ｃ）第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸を用意する工程；
（ｄ）前記第一および第二のプライマーをそれぞれ前記第一および第二の鋳型核酸にアニーリングさせ、それぞれプライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む第一および第二の相補核酸を合成する工程、
（ｅ）工程（ｄ）により合成された第一および第二の相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）および配列（Ｄ’）を、同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）および配列（Ｄｃ）にそれぞれハイブリダイズさせ、これにより、第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｃ）の部分を一本鎖とする工程、ならびに
（ｆ）工程（ｅ）により一本鎖とされた第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｃ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（ｄ）により合成された第一および第二の相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程、
を含んでなる方法である。
さらに、本発明によるプライマーは、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成するためのプライマーであって、
標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーである。
さらに、本発明によるプライマーセットは、二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅するためのプライマーセットであって、
（ａ）二本鎖鋳型核酸の第一鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなる第一のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にある、第一のプライマー、および
（ｂ）二本鎖鋳型核酸の第二鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ｃ）よりも５’側に存在する配列（Ｄ）の相補配列（Ｄｃ）にハイブリダイズする配列（Ｄ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる第二のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ｃｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ｃ）と前記配列（Ｄ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にある、第二のプライマー、
を含んでなるプライマーセットである。
本発明によれば、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、１本のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、等温条件下で連続して標的ＤＮＡを合成することが可能となる。また、本発明によれば、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、１対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、等温条件下で連続して標的ＤＮＡを増幅することが可能となる。従って、本発明による方法は、サーマルサイクラー等の特別な装置を必要とせず、また、温度設定に要する時間も必要ないため、短時間で増幅産物が得られるという優れた効果を奏する。さらに、本発明に従って増幅されたＤＮＡ断片は、制限酵素処理することができるため、制限酵素断片長多型や変異検出等の遺伝子検査の領域において利用可能である。
目的遺伝子の増幅（核酸増幅）は、主に、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により行われる。このような酵素的方法の主要なものとしては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法；米国特許第４６８３１９５号明細書、米国特許第４６８３２０２号明細書および米国特許第４８００１５９号明細書）、さらには、ＰＣＲ法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法；Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，ｐｐ１４６−１５２，１９９２）がある。これらの方法は、鋳型となる二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（変性）、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、およびプライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つの段階からなる反応を繰り返すことにより、ＤＮＡまたはＲＮＡからの目的遺伝子の増幅を可能とするものである。これらの方法では、反応溶液を上記３段階のそれぞれに適した温度に調節する計３工程の繰り返しが必要とされる。
上記の核酸増幅法において工程数を２工程とする改良法としては、シャトルＰＣＲ法（「ＰＣＲ法最前線」、蛋白質 核酸 酵素 別冊、共立出版、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６））が知られている。シャトルＰＣＲ法では、ＰＣＲ法における３段階の反応のうち、プライマーのアニーリングおよび伸長の２段階が同一温度で行われるため、計２工程の反応により目的遺伝子を増幅することが可能となる。さらに、欧州特許出願公開第０３２０３０８号明細書には、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）が開示されており、該方法では、耐熱性のＤＮＡリガーゼを用いて２工程の温度サイクリング反応（加熱と冷却の繰り返し反応）を行うことにより既知の遺伝子配列が増幅される。
以上に記載した方法においては、広い温度範囲で、かつ、厳密な温度制御を経時的に行なうことのできる高価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。また、該反応は、２種類〜３種類の温度条件で行なうために、各反応温度に調整するための時間が必要であり、サイクル数が増えれば増えるほど、それに要する時間は増大する。
上記問題点を解決すべく、等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発されている。このような方法としては、例えば、特公平７−１１４７１８号公報に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、自立複製（３ＳＲ；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許第２６５０１５９号公報に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許第２７１０１５９号公報に記載のＱベータレプリカーゼ法、米国特許第５８２４５１７号明細書、国際公開第９９／０９２１１号パンフレットまたは国際公開第９５／２５１８０号パンフレットに記載の種々の改良ＳＤＡ法、国際公開第００／２８０８２号パンフレットに記載のランプ法（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、国際公開第０２／１６６３９号パンフレットに記載のアイキャン法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）等が挙げられる。これらの等温核酸増幅法に関与する全段階の反応は一定の温度に保たれた反応混合物中で同時に進行する。
ＳＤＡ法では、最終的にＤＮＡが増幅される系において、ＤＮＡポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼが介する二本鎖の置換により、試料中の目的核酸（およびその相補鎖）の増幅が可能となる。該方法では、４種類のプライマーが必要とされ、その内の２種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように設計する必要がある。また、該方法では、核酸合成のための基質として、修飾されたデオキシヌクレオチド３リン酸、例えば３リン酸部分のα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子（Ｓ）に置換されたデオキシヌクレオチド３リン酸が必要とされる。従って、該方法は、高いランニングコストを必要とする。さらに該方法では、増幅された核酸断片中に修飾ヌクレオチド、たとえばαＳ置換デオキシヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅断片を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析に供しようとする場合に、該増幅断片が制限酵素で切断できないことがあり、よって、そのような解析を実施できない場合がある。
米国特許第５８２４５１７号明細書に記載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成され、３’末端側がＤＮＡであるキメラプライマーを必要とする。そのようなＲＮＡとＤＮＡから構成されるキメラプライマーはその合成にかかる費用が高く、また、ＲＮＡを含むプライマーはその取り扱いに専門的な知識を必要とする。また、国際公開第９９／０９２１１号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、５’突出末端を生じさせる制限酵素を必要とし、さらに、国際公開第９５／２５１８０号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマー対を必要とするため、これらの方法は高いランニングコストを必要とする。
アイキャン法では、ＲＮＡとＤＮＡから構成され、３’末端側がＲＮＡであるキメラプライマー、さらには、そのプライマーの３’末端のＲＮＡ部分を切断するＲＮａｓｅＨが必要とされるため、必要な試薬のための費用が高価となる。そのため、この方法は、特に大量のサンプルについての遺伝子検査等において、高いランニングコストを必要とする。
ランプ法では、４種類のプライマーが必要とされ、それらが６個所の領域を認識することにより、目的遺伝子の増幅が可能となる。すなわち、この方法では、まず、第一のプライマーが鋳型鎖にアニーリングして伸長反応が起こり、この第一のプライマーの構成に起因して伸長鎖の５’末端部分でステム−ループ構造が形成される。次に、第一のプライマーよりも上流側に設計された第二のプライマーによる鎖置換反応により第一のプライマーによる伸長鎖が鋳型鎖から分離する。これと同様の反応が二本鎖核酸のもう一方の鎖についても行なわれ、これらの反応が繰り返されることにより、標的核酸が増幅される。従って、ランプ法では増幅反応の作用機序が複雑となり、さらには必ず６個所の領域を選定しなければならないため、プライマーの設計が困難となる。また、４種類のプライマーのうち、２種類は比較的長鎖のプライマーが必要とされるため、プライマーの合成およびその精製に費用と時間がかかる。
従って、低いランニングコストで実施でき、かつ得られた核酸断片をさらに遺伝子工学的な処理に使用することを可能とする核酸増幅法が求められている。特に、一対のプライマーで速やかに増幅可能な等温核酸増幅法が望まれる。
［発明の概要］
本発明者らは、鎖置換反応を利用した核酸の増幅法において、該方法に使用される、プライマーの伸長によってステム−ループ形成可能なプライマーを特定の条件を満たすように設計することにより、１種のプライマーを用いて標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む核酸を合成でき、さらには、２種のプライマーを用いて効率的に標的核酸を増幅できることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
従って、本発明は、標的核酸配列を含む核酸を効率的に合成または増幅する方法、ならびにこれらの方法に用いられるプライマーまたはプライマーセットを提供することを目的とする。
そして、本発明による核酸合成法は、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成する方法であって、
（ａ）標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程、
（ｂ）鋳型核酸を用意する工程、
（ｃ）前記プライマーを前記鋳型核酸にアニーリングさせ、プライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む相補核酸を合成する工程、
（ｄ）工程（ｃ）により合成された相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）を同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズさせ、これにより、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする工程、および
（ｅ）工程（ｄ）により一本鎖とされた鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（ｃ）により合成された相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程、
を含んでなる方法である。
また、本発明による核酸増幅法は、二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）二本鎖鋳型核酸の第一鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなる第一のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程、
（ｂ）二本鎖鋳型核酸の第二鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ｃ）よりも５’側に存在する配列（Ｄ）の相補配列（Ｄｃ）にハイブリダイズする配列（Ｄ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる第二のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ｃｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ｃ）と前記配列（Ｄ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程、
（ｃ）第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸を用意する工程；
（ｄ）前記第一および第二のプライマーをそれぞれ前記第一および第二の鋳型核酸にアニーリングさせ、それぞれプライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む第一および第二の相補核酸を合成する工程、
（ｅ）工程（ｄ）により合成された第一および第二の相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）および配列（Ｄ’）を、同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）および配列（Ｄｃ）にそれぞれハイブリダイズさせ、これにより、第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｃ）の部分を一本鎖とする工程、ならびに
（ｆ）工程（ｅ）により一本鎖とされた第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｃ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（ｄ）により合成された第一および第二の相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程、
を含んでなる方法である。
さらに、本発明によるプライマーは、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成するためのプライマーであって、
標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーである。
さらに、本発明によるプライマーセットは、二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅するためのプライマーセットであって、
（ａ）二本鎖鋳型核酸の第一鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなる第一のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にある、第一のプライマー、および
（ｂ）二本鎖鋳型核酸の第二鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ｃ）よりも５’側に存在する配列（Ｄ）の相補配列（Ｄｃ）にハイブリダイズする配列（Ｄ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる第二のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ｃｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ｃ）と前記配列（Ｄ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にある、第二のプライマー、
を含んでなるプライマーセットである。
本発明によれば、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、１本のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、等温条件下で連続して標的ＤＮＡを合成することが可能となる。また、本発明によれば、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、１対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、等温条件下で連続して標的ＤＮＡを増幅することが可能となる。従って、本発明による方法は、サーマルサイクラー等の特別な装置を必要とせず、また、温度設定に要する時間も必要ないため、短時間で増幅産物が得られるという優れた効果を奏する。さらに、本発明に従って増幅されたＤＮＡ断片は、制限酵素処理することができるため、制限酵素断片長多型や変異検出等の遺伝子検査の領域において利用可能である。
図１は、本発明による核酸増幅方法を模式的に示した図である。
図２は、ヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅に用いたプライマーの５’側の配列と３’側の配列の、該遺伝子上での位置を示す図である。
図３は、ｓＹ１６０遺伝子の増幅に用いたプライマーの５’側の配列と３’側の配列の、該遺伝子上での位置を示す図である。
図４は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＴ ＤＮＡの増幅に用いたプライマーの５’側の配列と３’側の配列の、該ＤＮＡ上での位置を示す図である。
図５は、各種条件下におけるヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅の結果を示す図である。
図６は、各種条件下におけるヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅の結果を示す図である。
図７は、各種条件下におけるヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅の結果を示す図である。
図８は、各種条件下におけるｓＹ１６０遺伝子の増幅の結果を示す図である。
図９は、各種条件下におけるＭ１３ｍｐ１８ＲＴ ＤＮＡの増幅の結果を示す図である。
図１０は、各種条件下におけるＭ１３ｍｐ１８ＲＴ ＤＮＡの増幅の結果を示す図である。
図１１は、ヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子からの増幅産物を制限酵素処理して得られる泳動パターンを示す図である。
図１２は、ｓＹ１６０遺伝子からの増幅産物を制限酵素処理して得られる泳動パターンを示す図である。
図１３は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＴ ＤＮＡからの増幅産物を制限酵素処理して得られる泳動パターンを示す図である。
図１４は、各種融解温度調整剤の存在下におけるヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅の結果を示す図である。
［発明の具体的説明］
本発明による核酸合成の作用機序を、図１に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）、および配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）を決定する。本発明によるプライマーは、配列（Ａｃ’）を含んでなり、さらにその５’側に配列（Ｂ’）を含んでなる。配列（Ａｃ’）は、配列（Ａ）にハイブリダイズするものである。配列（Ｂ’）は、配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするものである。ここで、本発明によるプライマーは、前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ａｃ’）が標的核酸配列の配列（Ａ）にハイブリダイズした状態となる（図１（ａ））。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（Ｂ’）が、同核酸中に存在する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステム−ループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（Ａ）が一本鎖となり、この部分に先のプライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする（図１（ｂ））。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズしたプライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（図１（ｃ））。
上記の作用機序において、配列（Ｂ’）が配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする現象は、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記プライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。このステムループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（Ａ））に同一のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成した鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸が生成する。
以上の反応を繰り返すことにより、鋳型核酸中の標的核酸配列に相補的な核酸を大量に合成することが可能となる。また、上記の鋳型核酸の相補鎖を鋳型として同様の核酸合成を行なうこともできる。従って、本発明によれば、二本鎖の鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅することも可能となる。
本発明による核酸合成法は、以下の工程を含んでなる：
（ａ）標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程；
（ｂ）鋳型核酸を用意する工程；
（ｃ）前記プライマーを前記鋳型核酸にアニーリングさせ、プライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む相補核酸を合成する工程；
（ｄ）工程（ｃ）により合成された相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）を同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズさせ、これにより、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする工程；および
（ｅ）工程（ｄ）により一本鎖とされた鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（ｃ）により合成された相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程。
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
上記工程（ａ）において用意される本発明によるプライマーは、工程（ｃ）における鋳型核酸へのアニーリング、工程（ｄ）における配列（Ｂ’）と配列（Ｂｃ）とのハイブリダイゼーション、および同一配列を有する他のプライマーがアニーリングしうる一本鎖の配列（Ａ）の提供を可能とするように構成されている。以下、これらの工程を良好に行なうためのプライマーの構成について、さらに詳細に説明する。
上記工程（ｅ）において新たなプライマーが効率よくアニーリングするためには、工程（ｃ）により合成された相補核酸の工程（ｄ）におけるステム−ループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列（Ａｃ’）の塩基数Ｘと標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数Ｙとの差（Ｘ−Ｙ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（Ａ）よりも５’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、上記工程（ｅ）において新たなプライマーが効率よくアニーリングするためには、工程（ｃ）により合成された相補核酸の工程（ｄ）におけるステム−ループ構造形成を効率よく行なうことが必要となる。そして、効率の良いステム−ループ構造形成、すなわち、効率の良い配列（Ｂ’）と配列（Ｂｃ）とのハイブリダイゼーションには、前記配列（Ｂ’）と前記配列（Ｂｃ）との間の距離（Ｘ＋Ｙ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では伸長鎖の長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（Ｂ’）が配列（Ｂｃ）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（Ｂ’）が配列（Ｂｃ）にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とするためには、配列（Ｂ’）と配列（Ｂｃ）との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
以上のような観点から、プライマーを構成する配列（Ａｃ’）と配列（Ｂ’）の間に介在配列が存在しない場合において、本発明によるプライマーは、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４２以下とされる。
また、プライマーを構成する配列（Ａｃ’）と配列（Ｂ’）の間に介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合には、本発明によるプライマーは、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。
本発明によるプライマーは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成されており、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。本発明によるプライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは３０〜６０ヌクレオチドとする。また、本発明によるプライマーを構成する配列（Ａｃ’）と配列（Ｂ’）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ａｃ’）と配列（Ｂ’）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオチド３リン酸をいい、例えば、ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α−チオ−リボヌクレオチド）等がある。
また、本発明によるプライマーには、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
本発明によるプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。本発明によるプライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
本発明による核酸合成方法において使用するＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このＤＮＡポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。本発明による核酸合成方法において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｅｒ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
本発明による核酸合成方法において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
本発明による核酸合成方法において鋳型となる核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料から単離することができる。
鋳型核酸の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離などにより実施することが可能である。
より具体的には、本発明による核酸合成方法における鋳型核酸としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）を行なって一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
上記の逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ）、例えばＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが可能である。
さらに、本発明による核酸合成方法においては、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等を使うことにより、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡからの逆転写反応とｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡポリメラーゼ反応を１種類のポリメラーゼで行なうことが可能である。また、ＤＮＡポリメラーゼと、ＭＭＬＶ逆転写酵素などの逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。
本発明による核酸合成方法では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行なうこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ｅ）により得られた二本鎖の核酸は工程（ｄ）で繰り返して使用される。すなわち、工程（ｅ）により得られた二本鎖の核酸は工程（ｃ）により得られるものと同一の構造を有するため、そのまま工程（ｄ）において利用される。これにより、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を量産することができる。
本発明による核酸合成方法の特徴の一つは、等温で実施可能であることである。従って、本発明によれば、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成する方法であって、鋳型核酸と本発明によるプライマーとを含んでなる核酸合成用溶液を用意する工程、およびこの核酸合成用溶液を等温でインキュベートする工程を含んでなる方法が提供される。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。
本発明による核酸合成方法は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、本発明による核酸合成方法において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
本発明による核酸合成方法において、二本鎖からなる核酸を鋳型とし、その各鎖に対して設計した２種の本発明によるプライマーからなるプライマーセットを用いることにより、前記核酸中の標的核酸配列を増幅することができる。従って、本発明によれば、二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法が提供され、この核酸増幅方法は以下の工程を含んでなる：
（ａ）二本鎖鋳型核酸の第一鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなる第一のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程；
（ｂ）二本鎖鋳型核酸の第二鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ｃ）よりも５’側に存在する配列（Ｄ）の相補配列（Ｄｃ）にハイブリダイズする配列（Ｄ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる第二のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ｃｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ｃ）と前記配列（Ｄ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程；
（ｃ）第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸を用意する工程；
（ｄ）前記第一および第二のプライマーをそれぞれ前記第一および第二の鋳型核酸にアニーリングさせ、それぞれプライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む第一および第二の相補核酸を合成する工程；
（ｅ）工程（ｄ）により合成された第一および第二の相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）および配列（Ｄ’）を、同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）および配列（Ｄｃ）にそれぞれハイブリダイズさせ、これにより、第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｃ）の部分を一本鎖とする工程；ならびに
（ｆ）工程（ｅ）により一本鎖とされた第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｃ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（ｄ）により合成された第一および第二の相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程。
なお、プライマーの設計、反応条件等の詳細は、本発明による核酸合成方法について上記した通りである。
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸増幅方法において、工程（ｆ）により得られた二本鎖の核酸は工程（ｅ）で繰り返して使用される。すなわち、工程（ｆ）により得られた二本鎖の核酸は工程（ｄ）により得られるものと同一の構造を有するため、そのまま工程（ｅ）において利用される。
他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸増幅方法において、工程（ｆ）により一本鎖の核酸として得られた第一および第二の相補核酸は、工程（ｄ）においてそれぞれ第二および第一の鋳型核酸として繰り返して使用される。すなわち、工程（ｆ）により得られた第一の相補核酸は工程（ｄ）における第二の鋳型核酸として利用され、工程（ｆ）により得られた第二の相補核酸は工程（ｄ）における第一の鋳型核酸として利用される。
本発明による核酸増幅方法は、本発明による核酸合成方法と同様に等温で実施可能である。従って、本発明によれば、二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、二本鎖鋳型核酸と本発明によるプライマーセットとを含んでなる核酸増幅用溶液を用意する工程、およびこの核酸増幅用溶液を等温でインキュベートする工程を含んでなる方法が提供される。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。その温度条件の詳細については、本発明による核酸合成方法に関して上述したとおりである。
本発明による核酸増幅方法においては、逆転写酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを使用すると、ＲＮＡを鋳型とする場合においても、該ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を含む核酸増幅方法として最適に実施できる。また、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を独立させて行い、その生成物を本発明による核酸増幅方法に使用してもよい。
本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法において、核酸の合成効率または増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Ｔｍ）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の合成効率および増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は、特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。
さらに、本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロールなどの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
さらに、本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は、トレハロースなどの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法においては、酵素が失活するか、またはプライマーをはじめとする試薬のうちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで合成反応または増幅反応が繰り返される。
本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法においては、非天然ヌクレオチドを含む核酸を鋳型核酸とすることも可能である。本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドに含まれる塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンもしくはウラシル）以外の塩基を含むヌクレオチドであって、核酸配列中に取り込まれうるものを意味し、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、ｉｓｏＧ，ｉｓｏＣ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，６３２９−６３３３，１９９５）等が挙げられる。非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅には、一般に、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる。一方で、本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法は、例えば５０℃前後の等温で行うことが可能であるため、従来のＰＣＲ法と比較して核酸増幅酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）が失活する可能性が低い。従って、本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法は、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅にも有効である。非天然ヌクレオチドを含む核酸の増幅に用いられる酵素は、そのような標的核酸を増幅可能なものであればよく、特に限定されないが、特に取り込み効率の観点から、Ｙ１８８Ｌ／Ｅ４７８Ｑ変異型ＨＩＶ Ｉ 逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ＨｏｔＴｕｂ ＤＮＡポリメラーゼ等が好適である（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｉｓｍｏｕｒ １ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２，Ｎｏ．２８，８５９８，２００３／米国特許第６６１７１０６号明細書、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ．Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ８，１１４９−１１５２，１９９８等を参照のこと）。さらに、核酸増幅酵素の耐熱性を向上させる物質、例えばトレハロースなど、を反応溶液に添加することもでき、これにより、より効率的に非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅を行うことができる。
本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法を使用することにより、ＤＮＡチップに固定するための一本鎖核酸、塩基配列決定のための一本鎖ＤＮＡプローブ、または長鎖ＰＣＲ法のためのメガプライマーを、簡便かつ迅速に作製することができる。例えば、本発明による核酸合成方法またほ核酸増幅方法を使用することにより、目的に応じて、センス配列のみ、あるいはアンチセンス配列のみを選択して増幅させることが可能である。従って、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法は、ある標的核酸のセンス配列またはアンチセンス配列の製造方法としても有用である。
本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出が可能である。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。
また、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法によって得られた増幅産物は、免疫クロマトグラフなどを用いても検出が可能である。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。
さらに、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法において、ビーズに固定化したプライマーを用いることができ、これにより、核酸合成または核酸増幅によるビーズの凝集を確認することによって合成産物または増幅産物を検出することが可能となる。また、複数の標的核酸を合成または増幅の対象とする場合には、それぞれの標的核酸について設計したプライマーを相互に識別可能なビーズ（例えば、色、形状等が異なるビーズ）に固定化し、これらを含有する単一の反応溶液を用いて核酸合成反応または核酸増幅反応を行なうことができる。その場合には、各ビーズの凝集の有無を確認することにより、各標的核酸の存否を知ることができる。
さらに、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法において、アレイ（例えば、ＤＮＡチップ）に固定化したプライマーを用いることができ、これにより、核酸合成または核酸増幅によってアレイ上に生ずる核酸凝集物を確認することにより、合成産物または増幅産物を検出することが可能となる。また、複数の標的核酸を合成または増幅の対象とする場合には、それぞれの標的核酸について設計したプライマーをアレイ上の識別可能な位置に固定化し、該アレイを含有する反応溶液を用いて核酸合成反応または核酸増幅反応を行なうことができる。その場合には、アレイ上の対応する位置における核酸凝集物の有無を確認することにより、各標的核酸の存否を知ることができる。核酸凝集物の確認に代えて、インターカレーターを利用することもできる。
本発明による核酸増幅方法によって得られた増幅断片は通常の塩基により構成されるため、増幅後、増幅断片内部の制限酵素部位を用いて適当なベクターにサブクローニングすることも可能である。さらに、ＲＦＬＰのような、制限酵素を用いた処理をすることも可能であり、遺伝子検査の分野においても広く利用することができる。また、本発明による核酸増幅方法によって得られた増幅断片は通常の塩基により構成されるため、増幅断片中にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を組込んでおけば、増幅断片から直接ＲＮＡを合成することが可能となり、このＲＮＡは、ＲＮＡプローブとして使用することもできる。
さらに、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法においては、通常のｄＮＴＰの代わりに、ビオチンや蛍光物質で標識された塩基を使用することができ、これにより、ビオチンや蛍光物質で標識されたＤＮＡプローブを調製することも可能である。
本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法により調製された一本鎖核酸は、ＤＮＡチップ上に固定するＤＮＡ断片として使用できる。すなわち、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法は、ＤＮＡチップ作製において固定化するＤＮＡ鎖を調製する方法にも応用が可能である。また、あらかじめ、プライマーの５’末端をあらかじめＤＮＡチップ上に固定しておき、そのチップ上で核酸合成または核酸増幅を行ない、ＤＮＡチップを作製することも可能である。また、その核酸合成または核酸増幅を行なう前にあらかじめ蛍光標識プローブを添加しておけば、ＤＮＡチップ上で核酸合成または核酸増幅を行ないながら、リアルタイムな検出も可能となる。
本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを含んでなる。また、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法は、本発明によるプライマーまたはプライマーセット以外のプライマーを必要としないという利点を有する。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるキットは、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセット以外のプライマー成分を含まないものとされる。本発明によるキットはさらに、上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
図２は、ヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅に用いたプライマーの５’側の配列と３’側の配列の、該遺伝子上での位置を示す図である。
図３は、ｓＹ１６０遺伝子の増幅に用いたプライマーの５’側の配列と３’側の配列の、該遺伝子上での位置を示す図である。
図４は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＴ ＤＮＡの増幅に用いたプライマーの５’側の配列と３’側の配列の、該ＤＮＡ上での位置を示す図である。
図５は、各種条件下におけるヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅の結果を示す図である。
図６は、各種条件下におけるヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅の結果を示す図である。
図７は、各種条件下におけるヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅の結果を示す図である。
図８は、各種条件下におけるｓＹ１６０遺伝子の増幅の結果を示す図である。
図９は、各種条件下におけるＭ１３ｍｐ１８ＲＴ ＤＮＡの増幅の結果を示す図である。
図１０は、各種条件下におけるＭ１３ｍｐ１８ＲＴ ＤＮＡの増幅の結果を示す図である。
図１１は、ヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子からの増幅産物を制限酵素処理して得られる泳動パターンを示す図である。
図１２は、ｓＹ１６０遺伝子からの増幅産物を制限酵素処理して得られる泳動パターンを示す図である。
図１３は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＴ ＤＮＡからの増幅産物を制限酵素処理して得られる泳動パターンを示す図である。
図１４は、各種融解温度調整剤の存在下におけるヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅の結果を示す図である。
［発明の具体的説明］
本発明による核酸合成の作用機序を、図１に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）、および配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）を決定する。本発明によるプライマーは、配列（Ａｃ’）を含んでなり、さらにその５’側に配列（Ｂ’）を含んでなる。配列（Ａｃ’）は、配列（Ａ）にハイブリダイズするものである。配列（Ｂ’）は、配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするものである。ここで、本発明によるプライマーは、前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ａｃ’）が標的核酸配列の配列（Ａ）にハイブリダイズした状態となる（図１（ａ））。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（Ｂ’）が、同核酸中に存在する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステム−ループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（Ａ）が一本鎖となり、この部分に先のプライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする（図１（ｂ））。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズしたプライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（図１（ｃ））。
上記の作用機序において、配列（Ｂ’）が配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする現象は、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記プライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。このステムループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（Ａ））に同一のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成した鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸が生成する。
以上の反応を繰り返すことにより、鋳型核酸中の標的核酸配列に相補的な核酸を大量に合成することが可能となる。また、上記の鋳型核酸の相補鎖を鋳型として同様の核酸合成を行なうこともできる。従って、本発明によれば、二本鎖の鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅することも可能となる。
本発明による核酸合成法は、以下の工程を含んでなる：
（ａ）標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程；
（ｂ）鋳型核酸を用意する工程；
（ｃ）前記プライマーを前記鋳型核酸にアニーリングさせ、プライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む相補核酸を合成する工程；
（ｄ）工程（ｃ）により合成された相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）を同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズさせ、これにより、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする工程；および
（ｅ）工程（ｄ）により一本鎖とされた鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（ｃ）により合成された相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程。
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
上記工程（ａ）において用意される本発明によるプライマーは、工程（ｃ）における鋳型核酸へのアニーリング、工程（ｄ）における配列（Ｂ’）と配列（Ｂｃ）とのハイブリダイゼーション、および同一配列を有する他のプライマーがアニーリングしうる一本鎖の配列（Ａ）の提供を可能とするように構成されている。以下、これらの工程を良好に行なうためのプライマーの構成について、さらに詳細に説明する。
上記工程（ｅ）において新たなプライマーが効率よくアニーリングするためには、工程（ｃ）により合成された相補核酸の工程（ｄ）におけるステム−ループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列（Ａｃ’）の塩基数Ｘと標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数Ｙとの差（Ｘ−Ｙ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（Ａ）よりも５’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、上記工程（ｅ）において新たなプライマーが効率よくアニーリングするためには、工程（ｃ）により合成された相補核酸の工程（ｄ）におけるステム−ループ構造形成を効率よく行なうことが必要となる。そして、効率の良いステム−ループ構造形成、すなわち、効率の良い配列（Ｂ’）と配列（Ｂｃ）とのハイブリダイゼーションには、前記配列（Ｂ’）と前記配列（Ｂｃ）との間の距離（Ｘ＋Ｙ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では伸長鎖の長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（Ｂ’）が配列（Ｂｃ）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（Ｂ’）が配列（Ｂｃ）にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とするためには、配列（Ｂ’）と配列（Ｂｃ）との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
以上のような観点から、プライマーを構成する配列（Ａｃ’）と配列（Ｂ’）の間に介在配列が存在しない場合において、本発明によるプライマーは、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４２以下とされる。
また、プライマーを構成する配列（Ａｃ’）と配列（Ｂ’）の間に介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合には、本発明によるプライマーは、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。
本発明によるプライマーは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成されており、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。本発明によるプライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは３０〜６０ヌクレオチドとする。また、本発明によるプライマーを構成する配列（Ａｃ’）と配列（Ｂ’）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ａｃ’）と配列（Ｂ’）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオチド３リン酸をいい、例えば、ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α−チオ−リボヌクレオチド）等がある。
また、本発明によるプライマーには、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
本発明によるプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。本発明によるプライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
本発明による核酸合成方法において使用するＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このＤＮＡポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。本発明による核酸合成方法において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｅｒ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
本発明による核酸合成方法において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
本発明による核酸合成方法において鋳型となる核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料から単離することができる。
鋳型核酸の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離などにより実施することが可能である。
より具体的には、本発明による核酸合成方法における鋳型核酸としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）を行なって一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
上記の逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ）、例えばＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが可能である。
さらに、本発明による核酸合成方法においては、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等を使うことにより、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡからの逆転写反応とｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡポリメラーゼ反応を１種類のポリメラーゼで行なうことが可能である。また、ＤＮＡポリメラーゼと、ＭＭＬＶ逆転写酵素などの逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。
本発明による核酸合成方法では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行なうこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ｅ）により得られた二本鎖の核酸は工程（ｄ）で繰り返して使用される。すなわち、工程（ｅ）により得られた二本鎖の核酸は工程（ｃ）により得られるものと同一の構造を有するため、そのまま工程（ｄ）において利用される。これにより、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を量産することができる。
本発明による核酸合成方法の特徴の一つは、等温で実施可能であることである。従って、本発明によれば、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成する方法であって、鋳型核酸と本発明によるプライマーとを含んでなる核酸合成用溶液を用意する工程、およびこの核酸合成用溶液を等温でインキュベートする工程を含んでなる方法が提供される。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。
本発明による核酸合成方法は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、本発明による核酸合成方法において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
本発明による核酸合成方法において、二本鎖からなる核酸を鋳型とし、その各鎖に対して設計した２種の本発明によるプライマーからなるプライマーセットを用いることにより、前記核酸中の標的核酸配列を増幅することができる。従って、本発明によれば、二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法が提供され、この核酸増幅方法は以下の工程を含んでなる：
（ａ）二本鎖鋳型核酸の第一鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなる第一のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程；
（ｂ）二本鎖鋳型核酸の第二鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ｃ）よりも５’側に存在する配列（Ｄ）の相補配列（Ｄｃ）にハイブリダイズする配列（Ｄ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる第二のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ｃｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ｃ）と前記配列（Ｄ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程；
（ｃ）第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸を用意する工程；
（ｄ）前記第一および第二のプライマーをそれぞれ前記第一および第二の鋳型核酸にアニーリングさせ、それぞれプライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む第一および第二の相補核酸を合成する工程；
（ｅ）工程（ｄ）により合成された第一および第二の相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）および配列（Ｄ’）を、同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）および配列（Ｄｃ）にそれぞれハイブリダイズさせ、これにより、第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｃ）の部分を一本鎖とする工程；ならびに
（ｆ）工程（ｅ）により一本鎖とされた第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｃ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（ｄ）により合成された第一および第二の相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程。
なお、プライマーの設計、反応条件等の詳細は、本発明による核酸合成方法について上記した通りである。
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸増幅方法において、工程（ｆ）により得られた二本鎖の核酸は工程（ｅ）で繰り返して使用される。すなわち、工程（ｆ）により得られた二本鎖の核酸は工程（ｄ）により得られるものと同一の構造を有するため、そのまま工程（ｅ）において利用される。
他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸増幅方法において、工程（ｆ）により一本鎖の核酸として得られた第一および第二の相補核酸は、工程（ｄ）においてそれぞれ第二および第一の鋳型核酸として繰り返して使用される。すなわち、工程（ｆ）により得られた第一の相補核酸は工程（ｄ）における第二の鋳型核酸として利用され、工程（ｆ）により得られた第二の相補核酸は工程（ｄ）における第一の鋳型核酸として利用される。
本発明による核酸増幅方法は、本発明による核酸合成方法と同様に等温で実施可能である。従って、本発明によれば、二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、二本鎖鋳型核酸と本発明によるプライマーセットとを含んでなる核酸増幅用溶液を用意する工程、およびこの核酸増幅用溶液を等温でインキュベートする工程を含んでなる方法が提供される。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。その温度条件の詳細については、本発明による核酸合成方法に関して上述したとおりである。
本発明による核酸増幅方法においては、逆転写酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを使用すると、ＲＮＡを鋳型とする場合においても、該ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を含む核酸増幅方法として最適に実施できる。また、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を独立させて行い、その生成物を本発明による核酸増幅方法に使用してもよい。
本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法において、核酸の合成効率または増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Ｔｍ）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の合成効率および増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は、特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。
さらに、本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロールなどの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
さらに、本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は、トレハロースなどの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法においては、酵素が失活するか、またはプライマーをはじめとする試薬のうちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで合成反応または増幅反応が繰り返される。
本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法においては、非天然ヌクレオチドを含む核酸を鋳型核酸とすることも可能である。本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドに含まれる塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンもしくはウラシル）以外の塩基を含むヌクレオチドであって、核酸配列中に取り込まれうるものを意味し、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、ｉｓｏＧ，ｉｓｏＣ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，６３２９−６３３３，１９９５）等が挙げられる。非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅には、一般に、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる。一方で、本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法は、例えば５０℃前後の等温で行うことが可能であるため、従来のＰＣＲ法と比較して核酸増幅酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）が失活する可能性が低い。従って、本発明による核酸合成方法および核酸増幅方法は、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅にも有効である。非天然ヌクレオチドを含む核酸の増幅に用いられる酵素は、そのような標的核酸を増幅可能なものであればよく、特に限定されないが、特に取り込み効率の観点から、Ｙ１８８Ｌ／Ｅ４７８Ｑ変異型ＨＩＶ Ｉ 逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ＨｏｔＴｕｂ ＤＮＡポリメラーゼ等が好適である（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｉｓｍｏｕｒ １ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２，Ｎｏ．２８，８５９８，２００３／米国特許第６６１７１０６号明細書、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ．Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ８，１１４９−１１５２，１９９８等を参照のこと）。さらに、核酸増幅酵素の耐熱性を向上させる物質、例えばトレハロースなど、を反応溶液に添加することもでき、これにより、より効率的に非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅を行うことができる。
本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法を使用することにより、ＤＮＡチップに固定するための一本鎖核酸、塩基配列決定のための一本鎖ＤＮＡプローブ、または長鎖ＰＣＲ法のためのメガプライマーを、簡便かつ迅速に作製することができる。例えば、本発明による核酸合成方法またほ核酸増幅方法を使用することにより、目的に応じて、センス配列のみ、あるいはアンチセンス配列のみを選択して増幅させることが可能である。従って、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法は、ある標的核酸のセンス配列またはアンチセンス配列の製造方法としても有用である。
本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出が可能である。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。
また、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法によって得られた増幅産物は、免疫クロマトグラフなどを用いても検出が可能である。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。
さらに、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法において、ビーズに固定化したプライマーを用いることができ、これにより、核酸合成または核酸増幅によるビーズの凝集を確認することによって合成産物または増幅産物を検出することが可能となる。また、複数の標的核酸を合成または増幅の対象とする場合には、それぞれの標的核酸について設計したプライマーを相互に識別可能なビーズ（例えば、色、形状等が異なるビーズ）に固定化し、これらを含有する単一の反応溶液を用いて核酸合成反応または核酸増幅反応を行なうことができる。その場合には、各ビーズの凝集の有無を確認することにより、各標的核酸の存否を知ることができる。
さらに、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法において、アレイ（例えば、ＤＮＡチップ）に固定化したプライマーを用いることができ、これにより、核酸合成または核酸増幅によってアレイ上に生ずる核酸凝集物を確認することにより、合成産物または増幅産物を検出することが可能となる。また、複数の標的核酸を合成または増幅の対象とする場合には、それぞれの標的核酸について設計したプライマーをアレイ上の識別可能な位置に固定化し、該アレイを含有する反応溶液を用いて核酸合成反応または核酸増幅反応を行なうことができる。その場合には、アレイ上の対応する位置における核酸凝集物の有無を確認することにより、各標的核酸の存否を知ることができる。核酸凝集物の確認に代えて、インターカレーターを利用することもできる。
本発明による核酸増幅方法によって得られた増幅断片は通常の塩基により構成されるため、増幅後、増幅断片内部の制限酵素部位を用いて適当なベクターにサブクローニングすることも可能である。さらに、ＲＦＬＰのような、制限酵素を用いた処理をすることも可能であり、遺伝子検査の分野においても広く利用することができる。また、本発明による核酸増幅方法によって得られた増幅断片は通常の塩基により構成されるため、増幅断片中にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を組込んでおけば、増幅断片から直接ＲＮＡを合成することが可能となり、このＲＮＡは、ＲＮＡプローブとして使用することもできる。
さらに、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法においては、通常のｄＮＴＰの代わりに、ビオチンや蛍光物質で標識された塩基を使用することができ、これにより、ビオチンや蛍光物質で標識されたＤＮＡプローブを調製することも可能である。
本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法により調製された一本鎖核酸は、ＤＮＡチップ上に固定するＤＮＡ断片として使用できる。すなわち、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法は、ＤＮＡチップ作製において固定化するＤＮＡ鎖を調製する方法にも応用が可能である。また、あらかじめ、プライマーの５’末端をあらかじめＤＮＡチップ上に固定しておき、そのチップ上で核酸合成または核酸増幅を行ない、ＤＮＡチップを作製することも可能である。また、その核酸合成または核酸増幅を行なう前にあらかじめ蛍光標識プローブを添加しておけば、ＤＮＡチップ上で核酸合成または核酸増幅を行ないながら、リアルタイムな検出も可能となる。
本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを含んでなる。また、本発明による核酸合成方法または核酸増幅方法は、本発明によるプライマーまたはプライマーセット以外のプライマーを必要としないという利点を有する。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるキットは、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセット以外のプライマー成分を含まないものとされる。本発明によるキットはさらに、上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
例１
本例では、鋳型としてＨｕｍａｎ ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用してヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅を試みた。用いたプライマーは、以下に示す通りとした。これらのプライマーの合成は、エスペックオリゴサービス株式会社に依頼した。
実験に使用したプライマーの特徴を以下に記載した。また、テンプレートに対する各プライマー領域の位置関係は図２に示す通りとした。なお、下記の配列において、下線部は、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのそれぞれにおいて共通の３’末端領域を示す。
プライマーセット１：鋳型にアニーリングする配列（２０ｍｅｒ）のみからなるプライマーの組み合わせ；
プライマーセット２：各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーの組み合わせ；
プライマーセット３：各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の６塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーの組み合わせ；
プライマーセット４：各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の１１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーの組み合わせ；
プライマーセット５：各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の１６塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーの組み合わせ；
プライマーセット６：各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１０ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の２１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーの組み合わせ；
プライマーセット７：各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の２１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーの組み合わせ；
プライマーセット８：各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１６ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の２１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーの組み合わせ；
プライマーセット９：各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（２２ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の２１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーの組み合わせ；
プライマーセット１０：各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（２５ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の２１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーの組み合わせ；
プライマーセット１１：各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（２８ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の２１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーの組み合わせ；
次の組成を有する反応液（２５μＬ）：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（２ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．１％）、ｄＮＴＰ（０．４ｍＭ）、それぞれ１００ｐｍｏｌの上記のプライマー対および１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、さらに８ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を含有；を調製し、これを６０℃で２０、４０、または６０分間インキュベートした。
各反応液５μｌについて、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＢＭＡ）社製；タカラバイオ社より購入；「ＮｕＳｉｅｖｅ」はＢＭＡ社の登録商標である）にて電気泳動を行った。結果は図５、図６、および図７に示すとおりである。これらの図における各レーンのサンプルは下記の表１〜３に示す通りである。
各図のレーン５、９、１３、１７、および２１ではテンプレートが添加されていないため、未反応のプライマーが染色されたもの以外のバンドは確認されなかった。
図５のレーン２および３ではテンプレートが添加されているため、未反応のプライマーと高分子サイズのテンプレートのバンドが確認された。しかし、反応時間が不十分であるため、増幅産物は確認されなかった。図５のレーン４からわかるように、テンプレートが添加された反応時間６０分のサンプルについては増幅産物が得られたが、これらは、低サイズ域がラダー状で高サイズ域がスメアー状の増幅産物であった。図５のレーン２〜５では、鋳型にアニーリングするオリゴヌクレオチド（２０ｍｅｒ）のみからなるプライマーセット１を用いており、本発明による合成反応が起らなかったために、目的とする増幅産物が得られなかった。
図５のレーン６以降は各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、５’端側にある配列が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーセットを用いて増幅を行った結果である。
図５のレーン８および１２からわかるように、プライマーセット２または３を用いた場合、６０分の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約１６０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
さらに、図５のレーン１５および１６、図６のレーン３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９および２０、ならびに図７のレーン３および４からわかるように、プライマーセット４、６、７、８、９、１０、および１１を用いた場合、４０分以上の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約１６０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
さらに、図５のレーン１８〜２０からわかるように、プライマーセット５を用いた場合、２０分以上の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約１６０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
プライマーセット２および３のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が比較的小さい場合には、同一の配列を有する次のプライマーがアニーリングすべき鋳型上の配列の大部分が二本鎖のままとなり、次のプライマーのアニーリングが困難になるために、長い反応時間が必要になると考えられる。
また、プライマーセット６〜１１のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が比較的大きい場合には、各プライマーの５’端側の配列が折り返す効率が低下し、比較的長い反応時間が必要になると考えられる。
一方で、プライマーセット５のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が小さすぎず、かつ、大きすぎない距離にある時に、本発明における最も効率のよい増幅が可能となると考えられる。
例２
本例では、鋳型としてＨｕｍａｎ ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用してｓＹ１６０遺伝子の増幅を試みた。用いたプライマーは、以下に示す通りとした。これらのプライマーの合成は、エスペックオリゴサービス株式会社に依頼した。
実験に使用したプライマーの特徴を以下に記載した。また、テンプレートに対する各プライマー領域の位置関係は図３に示す通りとした。なお、下記の配列において、下線部は、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのそれぞれにおいて共通の３’末端領域を示す。
プライマーセット１２：プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の２７塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の２１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーの組み合わせ；
プライマーセット１３：プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１２と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１６ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の２７塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１２と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１６ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の２１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーの組み合わせ；
次の組成を有する反応液（２５μＬ）：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（２ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．１％）、ｄＮＴＰ（０．４ｍＭ）、それぞれ１００ｐｍｏｌの上記のプライマー対および１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、さらに８ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を含有；を調製し、これを６０℃で６０または９０分間インキュベートした。
各反応液５μｌについて、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ社製；タカラバイオ社より購入；「ＮｕＳｉｅｖｅ」はＢＭＡ社の登録商標である）にて電気泳動を行った。結果は図８に示すとおりである。これらの図における各レーンのサンプルは下記の表４に示す通りである。
レーン４および７ではテンプレートが添加されていないため、未反応のプライマーが染色されたもの以外のバンドは確認されなかった。
レーン２および５ではテンプレートが添加されているため、未反応のプライマーと高分子サイズのテンプレートのバンドが確認された。しかし、反応時間が不十分であるため、増幅産物は確認されなかった。レーン３および６からわかるように、テンプレートが添加された反応時間９０分のサンプルについては目的とする増幅産物が十分に得られた。低サイズのバンドのうち、約２６０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
例３
本例では、鋳型としてＭ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡ（ファージベクター：タカラバイオ社製）を使用して、その増幅を試みた。用いたプライマーは、以下に示す通りとした。これらのプライマーの合成は、エスペックオリゴサービス株式会社に依頼した。
実験に使用したプライマーの特徴を以下に記載した。また、テンプレートに対する各プライマー領域の位置関係は図４に示す通りとした。なお、下記の配列において、下線部は、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのそれぞれにおいて共通の３’末端領域を示す。
プライマーセット１４：プライマーの３’端側にある配列（２４ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（２４ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の５１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２２ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（２５ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の５４塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーとの組み合わせ；
プライマーセット１５：プライマーの３’端側にある配列（２４ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２２ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーとの組み合わせ；
プライマーセット１６：プライマーの３’端側にある配列（２４ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の７塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２２ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の７塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーとの組み合わせ；
プライマーセット１７：プライマーの３’端側にある配列（２４ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の１３塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２２ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の１３塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーとの組み合わせ；
プライマーセット１８：プライマーの３’端側にある配列（２４ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の１９塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２２ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の１９塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーとの組み合わせ；
プライマーセット１９：プライマーの３’端側にある配列（２４ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の２５塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２２ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の２３塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーとの組み合わせ；
プライマーセット２０：プライマーの３’端側にある配列（２４ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（２３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の２５塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２２ｍｅｒ：プライマーセット１４と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（２３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の２３塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーとの組み合わせ；
次の組成を有する反応液（２５μＬ）：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（２ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．１％）、ｄＮＴＰ（０．４ｍＭ）、それぞれ１００ｐｍｏｌの上記のプライマー対および０．０５μｇの鋳型ＤＮＡ、さらに８ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を含有；を調製し、これを６５℃で２０〜１２０分間インキュベートした。
各反応液５μｌについて、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ社製；タカラバイオ社より購入；「ＮｕＳｉｅｖｅ」はＢＭＡ社の登録商標である）にて電気泳動を行った。結果は図９および図１０に示すとおりである。これらの図における各レーンのサンプルは下記の表５および表６に示す通りである。
各図のレーン５、９、１３、１７、および２１ではテンプレートが添加されていないため、未反応のプライマーが染色されたもの以外のバンドは確認されなかった。
図９のレーン３および４ではテンプレートが添加されており、反応時間９０分以上で増幅産物が得られた。しかし、これは、目的のサイズとは異なる低サイズのラダー状の増幅産物であった。これらのレーンでは、増幅反応にプライマーセット１４が用いられている。そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔は、センスプライマーでは５０ヌクレオチドであり、アンチセンスプライマーでは５３ヌクレオチドである。このことから、プライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が過度に大きくなると、各プライマーの５’端側にある配列が折り返す効率が顕著に低下し、本発明の合成反応が起こりにくくなるために、目的とする増幅産物が得られなかったものと考えられる。
図９のレーン７からわかるように、プライマーセット１５を用いた場合、９０分以上の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約２４０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
さらに、図９のレーン１２および１６、ならびに図１０のレーン４および８からわかるように、プライマーセット１６、１７、１９、および２０を用いた場合、６０分の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約２４０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
さらに、図９のレーン１９からわかるように、プライマーセット１８を用いた場合、４０分以上の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約２４０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
プライマーセット１５のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が小さい場合には、同一の配列を有する次のプライマーがアニーリングすべき鋳型上の配列の大部分が二本鎖のままとなり、次のプライマーのアニーリングが困難になるために、長い反応時間が必要になると考えられる。
また、プライマーセット１９および２０のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が大きい場合には、各プライマーの５’端側の配列が折り返す効率が低下し、比較的長い反応時間が必要になると考えられる。
一方で、プライマーセット１８のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が小さすぎず、かつ、大きすぎない距離にある時に、本発明における最も効率のよい増幅が可能となると考えられる。
例４
例１〜３で得られた増幅産物のうち、それぞれのターゲットごとに最も増幅効率が良かったと思われる増幅産物を用い、制限酵素で消化した。例１に記載のプライマーセット５を用いて得られた増幅産物の反応液１μＬを制限酵素ＭｂｏＩＩで消化し、例２に記載のプライマーセット１２を用いて得られた増幅産物の反応液１μＬを制限酵素ＢｓｔＸＩで消化し、例３に記載のプライマーセット１８を用いて得られた増幅産物の反応液１μＬを制限酵素ＰｓｔＩで消化した。制限酵素消化の条件は、３７℃で３時間とした。
各消化物について、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ社製；タカラバイオ社より購入；「ＮｕＳｉｅｖｅ」はＢＭＡ社の登録商標である）にて電気泳動を行った。結果は図１１、図１２、および図１３に示すとおりである。それぞれの塩基配列から推測される各制限酵素消化断片のサイズは、泳動写真の横に記したとおりである。未消化でのバンドのほとんどが消化後に推定されるサイズのバンドへ変化したことから、目的の増幅産物が得られていることが確認された。
例５：各種融解温度調整剤の効果
増幅反応溶液に各種融解温度調整剤を添加して増幅反応を行ない、増幅効率に対する融解温度調整剤の効果を検討した。例１と同様に、鋳型としてＨｕｍａｎ ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用してヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅を試みた。用いたプライマーは、例１で最も良好な増幅効率を示したプライマーセット５（配列番号９および配列番号１０）とした。
次の組成を有する反応液（２５μＬ）：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（８ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．１％）、ｄＮＴＰ（１．４ｍＭ）、それぞれ１６００ｎＭの上記プライマー対、および鋳型ＤＮＡ、さらに１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を含有；を調製した。鋳型ＤＮＡの濃度は、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、または０ｎｇとした。この反応液に、さらに、最終濃度として、６％ＤＭＳＯ、０．５Ｍベタイン、４％ホルムアミド、または１０％グリセロールを添加した。これを６０℃で９０分間インキュベートした。
増幅反応後、実施例１と同様に電気泳動を行った。結果は図１４に示すとおりである。図１４における各レーンのサンプルは下記の表７示す通りである。
図１４において、約１６０ｂｐ付近のバンドが本発明の合成反応により予想される増幅産物である。図１４から明らかなように、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡを用いた場合には、融解温度調整剤の有無にかかわらず増幅産物が得られた。一方で、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡを用いた場合には、融解温度調整剤を添加した場合にのみ増幅産物が得られた。さらに、１ｎｇの鋳型ＤＮＡを用いた場合にも、融解温度調整剤を添加した場合にのみ増幅産物のバンドが確認され、特に、融解温度調整剤としてＤＭＳＯ（６％）を添加した場合に最も明確な増幅産物のバンドが確認された。
以上の結果から、本発明による核酸増幅方法において、ＤＭＳＯ、ベタイン、ホルムアミド、グリセロールなどの融解温度調整剤を反応液に添加することにより増幅効率が向上し、特に、ＤＭＳＯを添加した場合に良好な増幅効率が得られると考えられる。
例１
本例では、鋳型としてＨｕｍａｎ ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用してヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅を試みた。用いたプライマーは、以下に示す通りとした。これらのプライマーの合成は、エスペックオリゴサービス株式会社に依頼した。
実験に使用したプライマーの特徴を以下に記載した。また、テンプレートに対する各プライマー領域の位置関係は図２に示す通りとした。なお、下記の配列において、下線部は、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのそれぞれにおいて共通の３’末端領域を示す。
プライマーセット１：鋳型にアニーリングする配列（２０ｍｅｒ）のみからなるプライマーの組み合わせ；
各反応液５μｌについて、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＢＭＡ）社製；タカラバイオ社より購入；「ＮｕＳｉｅｖｅ」はＢＭＡ社の登録商標である）にて電気泳動を行った。結果は図５、図６、および図７に示すとおりである。これらの図における各レーンのサンプルは下記の表１〜３に示す通りである。
図５のレーン２および３ではテンプレートが添加されているため、未反応のプライマーと高分子サイズのテンプレートのバンドが確認された。しかし、反応時間が不十分であるため、増幅産物は確認されなかった。図５のレーン４からわかるように、テンプレートが添加された反応時間６０分のサンプルについては増幅産物が得られたが、これらは、低サイズ域がラダー状で高サイズ域がスメアー状の増幅産物であった。図５のレーン２〜５では、鋳型にアニーリングするオリゴヌクレオチド（２０ｍｅｒ）のみからなるプライマーセット１を用いており、本発明による合成反応が起らなかったために、目的とする増幅産物が得られなかった。
図５のレーン６以降は各プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ：プライマーセット１と同様の配列）が鋳型にアニーリングし、５’端側にある配列が、そのプライマーによる伸長鎖上の、各プライマーの３’末端残基の下流から始まる領域にハイブリダイズするようなプライマーセットを用いて増幅を行った結果である。
図５のレーン８および１２からわかるように、プライマーセット２または３を用いた場合、６０分の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約１６０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
さらに、図５のレーン１５および１６、図６のレーン３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９および２０、ならびに図７のレーン３および４からわかるように、プライマーセット４、６、７、８、９、１０、および１１を用いた場合、４０分以上の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約１６０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
さらに、図５のレーン１８〜２０からわかるように、プライマーセット５を用いた場合、２０分以上の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約１６０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
プライマーセット２および３のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が比較的小さい場合には、同一の配列を有する次のプライマーがアニーリングすべき鋳型上の配列の大部分が二本鎖のままとなり、次のプライマーのアニーリングが困難になるために、長い反応時間が必要になると考えられる。
また、プライマーセット６〜１１のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が比較的大きい場合には、各プライマーの５’端側の配列が折り返す効率が低下し、比較的長い反応時間が必要になると考えられる。
一方で、プライマーセット５のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が小さすぎず、かつ、大きすぎない距離にある時に、本発明における最も効率のよい増幅が可能となると考えられる。
例２
本例では、鋳型としてＨｕｍａｎ ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用してｓＹ１６０遺伝子の増幅を試みた。用いたプライマーは、以下に示す通りとした。これらのプライマーの合成は、エスペックオリゴサービス株式会社に依頼した。
実験に使用したプライマーの特徴を以下に記載した。また、テンプレートに対する各プライマー領域の位置関係は図３に示す通りとした。なお、下記の配列において、下線部は、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのそれぞれにおいて共通の３’末端領域を示す。
プライマーセット１２：プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の２７塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２０ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（１３ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の２１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーの組み合わせ；
各反応液５μｌについて、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ社製；タカラバイオ社より購入；「ＮｕＳｉｅｖｅ」はＢＭＡ社の登録商標である）にて電気泳動を行った。結果は図８に示すとおりである。これらの図における各レーンのサンプルは下記の表４に示す通りである。
レーン２および５ではテンプレートが添加されているため、未反応のプライマーと高分子サイズのテンプレートのバンドが確認された。しかし、反応時間が不十分であるため、増幅産物は確認されなかった。レーン３および６からわかるように、テンプレートが添加された反応時間９０分のサンプルについては目的とする増幅産物が十分に得られた。低サイズのバンドのうち、約２６０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
例３
本例では、鋳型としてＭ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡ（ファージベクター：タカラバイオ社製）を使用して、その増幅を試みた。用いたプライマーは、以下に示す通りとした。これらのプライマーの合成は、エスペックオリゴサービス株式会社に依頼した。
実験に使用したプライマーの特徴を以下に記載した。また、テンプレートに対する各プライマー領域の位置関係は図４に示す通りとした。なお、下記の配列において、下線部は、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのそれぞれにおいて共通の３’末端領域を示す。
プライマーセット１４：プライマーの３’端側にある配列（２４ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（２４ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の５１塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなセンスプライマーと：プライマーの３’端側にある配列（２２ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’端側にある配列（２５ｍｅｒ）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、プライマーの３’末端残基の５４塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするようなアンチセンスプライマーとの組み合わせ；
各反応液５μｌについて、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ社製；タカラバイオ社より購入；「ＮｕＳｉｅｖｅ」はＢＭＡ社の登録商標である）にて電気泳動を行った。結果は図９および図１０に示すとおりである。これらの図における各レーンのサンプルは下記の表５および表６に示す通りである。
図９のレーン３および４ではテンプレートが添加されており、反応時間９０分以上で増幅産物が得られた。しかし、これは、目的のサイズとは異なる低サイズのラダー状の増幅産物であった。これらのレーンでは、増幅反応にプライマーセット１４が用いられている。そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔は、センスプライマーでは５０ヌクレオチドであり、アンチセンスプライマーでは５３ヌクレオチドである。このことから、プライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が過度に大きくなると、各プライマーの５’端側にある配列が折り返す効率が顕著に低下し、本発明の合成反応が起こりにくくなるために、目的とする増幅産物が得られなかったものと考えられる。
図９のレーン７からわかるように、プライマーセット１５を用いた場合、９０分以上の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約２４０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
さらに、図９のレーン１２および１６、ならびに図１０のレーン４および８からわかるように、プライマーセット１６、１７、１９、および２０を用いた場合、６０分の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約２４０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
さらに、図９のレーン１９からわかるように、プライマーセット１８を用いた場合、４０分以上の反応時間で目的増幅産物を得ることが可能であった。低サイズのバンドのうち、約２４０ｂｐ付近のバンドは、本発明の合成反応により予想される産物である。
プライマーセット１５のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が小さい場合には、同一の配列を有する次のプライマーがアニーリングすべき鋳型上の配列の大部分が二本鎖のままとなり、次のプライマーのアニーリングが困難になるために、長い反応時間が必要になると考えられる。
また、プライマーセット１９および２０のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が大きい場合には、各プライマーの５’端側の配列が折り返す効率が低下し、比較的長い反応時間が必要になると考えられる。
一方で、プライマーセット１８のように、そのプライマー伸長鎖上における、プライマーの３’末端側配列に相当する領域と５’末端側配列がハイブリダイズする領域との間隔が小さすぎず、かつ、大きすぎない距離にある時に、本発明における最も効率のよい増幅が可能となると考えられる。
例４
例１〜３で得られた増幅産物のうち、それぞれのターゲットごとに最も増幅効率が良かったと思われる増幅産物を用い、制限酵素で消化した。例１に記載のプライマーセット５を用いて得られた増幅産物の反応液１μＬを制限酵素ＭｂｏＩＩで消化し、例２に記載のプライマーセット１２を用いて得られた増幅産物の反応液１μＬを制限酵素ＢｓｔＸＩで消化し、例３に記載のプライマーセット１８を用いて得られた増幅産物の反応液１μＬを制限酵素ＰｓｔＩで消化した。制限酵素消化の条件は、３７℃で３時間とした。
各消化物について、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ社製；タカラバイオ社より購入；「ＮｕＳｉｅｖｅ」はＢＭＡ社の登録商標である）にて電気泳動を行った。結果は図１１、図１２、および図１３に示すとおりである。それぞれの塩基配列から推測される各制限酵素消化断片のサイズは、泳動写真の横に記したとおりである。未消化でのバンドのほとんどが消化後に推定されるサイズのバンドへ変化したことから、目的の増幅産物が得られていることが確認された。
例５：各種融解温度調整剤の効果
増幅反応溶液に各種融解温度調整剤を添加して増幅反応を行ない、増幅効率に対する融解温度調整剤の効果を検討した。例１と同様に、鋳型としてＨｕｍａｎ ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用してヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子の増幅を試みた。用いたプライマーは、例１で最も良好な増幅効率を示したプライマーセット５（配列番号９および配列番号１０）とした。
次の組成を有する反応液（２５μＬ）：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（８ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．１％）、ｄＮＴＰ（１．４ｍＭ）、それぞれ１６００ｎＭの上記プライマー対、および鋳型ＤＮＡ、さらに１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を含有；を調製した。鋳型ＤＮＡの濃度は、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、または０ｎｇとした。この反応液に、さらに、最終濃度として、６％ＤＭＳＯ、０．５Ｍベタイン、４％ホルムアミド、または１０％グリセロールを添加した。これを６０℃で９０分間インキュベートした。
増幅反応後、実施例１と同様に電気泳動を行った。結果は図１４に示すとおりである。図１４における各レーンのサンプルは下記の表７示す通りである。
以上の結果から、本発明による核酸増幅方法において、ＤＭＳＯ、ベタイン、ホルムアミド、グリセロールなどの融解温度調整剤を反応液に添加することにより増幅効率が向上し、特に、ＤＭＳＯを添加した場合に良好な増幅効率が得られると考えられる。
【配列表】
Claims (21)
- 鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成する方法であって、
（ａ）標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程、
（ｂ）鋳型核酸を用意する工程、
（ｃ）前記プライマーを前記鋳型核酸にアニーリングさせ、プライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む相補核酸を合成する工程、
（ｄ）工程（ｃ）により合成された相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）を同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズさせ、これにより、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする工程、および
（ｅ）工程（ｄ）により一本鎖とされた鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（ｃ）により合成された相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程、
を含んでなる、方法。 - 工程（ｅ）により得られた二本鎖の核酸を工程（ｄ）で繰り返して使用する、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）が等温で行われる、請求項１に記載の方法。
- 鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼが使用される、請求項１に記載の方法。
- 鋳型核酸がＲＮＡである場合に、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの混合物である、請求項６に記載の方法。
- 鋳型核酸中の標的核酸配列が非天然ヌクレオチドを含んでなるものである、請求項１に記載の方法。
- 二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）二本鎖鋳型核酸の第一鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなる第一のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程、
（ｂ）二本鎖鋳型核酸の第二鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ｃ）よりも５’側に存在する配列（Ｄ）の相補配列（Ｄｃ）にハイブリダイズする配列（Ｄ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる第二のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ｃｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ｃ）と前記配列（Ｄ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあるプライマーを用意する工程、
（ｃ）第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸を用意する工程、
（ｄ）前記第一および第二のプライマーをそれぞれ前記第一および第二の鋳型核酸にアニーリングさせ、それぞれプライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む第一および第二の相補核酸を合成する工程、
（ｅ）工程（ｄ）により合成された第一および第二の相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）および配列（Ｄ’）を、同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）および配列（Ｄｃ）にそれぞれハイブリダイズさせ、これにより、第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｃ）の部分を一本鎖とする工程、ならびに（ｆ）工程（ｅ）により一本鎖とされた第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｃ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（ｄ）により合成された第一および第二の相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程、
を含んでなる、方法。 - 工程（ｆ）により得られた二本鎖の核酸を工程（ｅ）で繰り返して使用する、請求項９に記載の方法。
- 工程（ｆ）により一本鎖の核酸として得られた第一および第二の相補核酸を、工程（ｄ）においてそれぞれ第二および第一の鋳型核酸として繰り返して使用する、請求項９に記載の方法。
- 工程（ｄ）、工程（ｅ）および工程（ｆ）が等温で行われる、請求項９に記載の方法。
- 鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼが使用される、請求項９に記載の方法。
- 鋳型核酸がＲＮＡの場合に、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する工程をさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
- 工程（ｄ）、工程（ｅ）および工程（ｆ）が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項９に記載の方法。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの混合物である、請求項１５に記載の方法。
- 鋳型核酸中の標的核酸配列が非天然ヌクレオチドを含んでなるものである、請求項９に記載の方法。
- 鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成するためのプライマーであって、
標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にある、プライマー。 - 請求項１８に記載のプライマーを含んでなる、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成するためのキット。
- 二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅するためのプライマーセットであって、
（ａ）二本鎖鋳型核酸の第一鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなる第一のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ａｃ’）と前記配列（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にある、第一のプライマー、および
（ｂ）二本鎖鋳型核酸の第二鎖における標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列（Ｃ）よりも５’側に存在する配列（Ｄ）の相補配列（Ｄｃ）にハイブリダイズする配列（Ｄ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる第二のプライマーであって、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列（Ｃｃ’）の塩基数をＸとし、標的核酸配列中における前記配列（Ｃ）と前記配列（Ｄ）に挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にあり、
プライマー中において前記配列（Ｃｃ’）と前記配列（Ｄ’）との間に介在配列が存在する場合には、ＸおよびＹを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をＹ’としたときに、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００〜１．００の範囲にある、第二のプライマー、
を含んでなる、プライマーセット。 - 請求項２０に記載のプライマーセットを含んでなる、二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅するためのキット。
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