JPH06253843A

JPH06253843A - Ｄｎａ配列の増幅法

Info

Publication number: JPH06253843A
Application number: JP4300693A
Authority: JP
Inventors: Youkou Riyuu; 耀光劉; Efu Uitsuteia Robaato; エフ．ウィッティアロバート; Norihiro Mitsukawa; 典宏光川
Original assignee: CHIKYU KANKYO SANGYO GIJUTSU; CHIKYU KANKYO SANGYO GIJUTSU KENKYU KIKO; MITSUI GIYOUSAI SHOKUBUTSU BIO; MITSUI GIYOUSAI SHOKUBUTSU BIO KENKYUSHO KK
Current assignee: CHIKYU KANKYO SANGYO GIJUTSU; CHIKYU KANKYO SANGYO GIJUTSU KENKYU KIKO; MITSUI GIYOUSAI SHOKUBUTSU BIO; MITSUI GIYOUSAI SHOKUBUTSU BIO KENKYUSHO KK
Priority date: 1993-03-03
Filing date: 1993-03-03
Publication date: 1994-09-13
Anticipated expiration: 2019-12-15
Also published as: JP3602550B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】既知配列に隣接する未知配列を、複雑な操作
を必要とせずに効率よく増幅する。【構成】ＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配列の一部の配列
を有するオリゴヌクレオチドプライマー（特異的プライ
マー）と、特異的プライマーよりもＴｍが低く任意の配
列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（非特異的プ
ライマー）とを、ＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌ
クレオチドを含むＤＮＡポリメラーゼ反応液中で混合
し、ＤＮＡ配列の変性と、このＤＮＡ配列とＤＮＡプラ
イマーとのアニーリングと、ＤＮＡポリメラーゼ反応か
らなる増幅サイクルを繰り返す増幅方法において、下記
工程を行う。（Ａ）非特異的プライマーがＤＮＡ配列に非特異的にハ
イブリダイズする温度でアニーリングを行う１回の増幅
サイクル（Ｂ）特異的プライマーがＤＮＡ配列に特異的
にハイブリダイズする温度でアニーリングを行う複数回
の増幅サイクル（Ｃ）非特異的プライマーがその配列と
相補的なＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度
でアニーリングを行う複数回の増幅サイクル。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡ配列の増幅法に
関し、詳しくは配列既知のＤＮＡ配列に隣接するＤＮＡ
配列を、簡便、迅速に増幅する方法を提供するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、同一配列を有するＤＮＡを大量に
複製し分子数を増大させる方法、すなわちＤＮＡを増幅
する方法として、いわゆるＰＣＲ（Polymerase chain r
eaction）法が広く行われている。この方法は、図１に
示したように、二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの熱変性、増幅を目的とする部位の両端の配列に相当するオリゴ
ヌクレオチド（プライマー１、プライマー２）と、前記
熱変性ＤＮＡとのアニーリング、前記オリゴヌクレオチドをプライマーとしたポリメラ
ーゼ反応、からなる増幅サイクルを繰り返すことにより、前記ＤＮ
Ａ配列を指数関数的に増幅する方法である。

【０００３】この方法により、極めて微量のＤＮＡの増
幅が可能となったが、増幅させたい領域の両末端の配列
が知られていないとプライマーを合成することができな
いため、既知配列にしか適用できないものであった。

【０００４】そこで、配列既知のＤＮＡ配列に隣接する
配列未知のＤＮＡ領域を増幅する方法として、上記ＰＣ
Ｒ法を基本とするいくつかの改良法が報告されている。
一つは、既知配列の両側または片側に隣接する未知配列
を、制限酵素で切断してから環状化し、既知配列部分に
特異的で互いに外向きの２種の特異的プライマーを用
い、通常のＰＣＲ法と同様の増幅サイクルを繰り返して
行うという方法であり、逆ＰＣＲ（inverse ＰＣＲ）法
と呼ばれている。

【０００５】また、"bubble"ＰＣＲ法と呼ばれる方法
は、既知配列の片側に隣接する未知配列を制限酵素で切
断し、これに２本鎖オリゴヌクレオチドを連結させ、既
知配列に特異的なプライマーとオリゴヌクレオチドに特
異的なプライマーを用い、増幅サイクルを繰り返すとい
う方法である。なお、この方法では、未知配列に連結さ
せるオリゴヌクレオチドは、その中央部に相補的ではな
い配列を含み、既知配列に特異的なプライマーから伸長
して合成された配列にのみプライマーが結合するよう
に、配列が設計されているしかしながら、これらの方法は、適当な制限酵素の選択
やＤＮＡの環状化、あるいはオリゴヌクレオチドの連結
に労力と時間を要する。また、ＤＮＡ増幅反応の産物を
用いて塩基配列を決定するためには、増幅反応液中に含
まれるプライマーやヌクレオチドを除去するための操作
が必要とされる。

【０００６】このような問題を解決するために、ＤＮＡ
の環状化やオリゴヌクレオチドの連結をせずに、既知配
列に連結する未知配列を、単一のプライマーを用いて増
幅させる方法が開示されている（Parks, C.L., Shenk,
T. et al., Nucleic Acids Res., 19, No.25 (199
1)））。この方法は、既知配列に相当する配列を有する
プライマーを用い、このプライマーが未知配列に非特異
的にハイブリダイズするような温和な条件下での増幅サ
イクル、及び前記プライマーが特異的にハイブリダイズ
するようなストリンジェントな条件下での増幅サイクル
を各々繰り返すことにより前記既知配列及び未知配列を
増幅するという方法である。

【０００７】また、特異的プライマーに加えて任意の配
列を有する非特異的プライマーを用い、異なる温度でア
ニーリングして増幅サイクルを行うことにより未知配列
を増幅する方法が提案されている（Parker, J.D. et a
l., Nucleic Acids Res., 19,No.11 (1991)））。すな
わち、図２に示すように、特異的プライマーを増幅させ
たいＤＮＡ配列にハイブリダイズする温度で、かつ、非
特異的プライマーがミスマッチを含みながらハイブリダ
イズする温度でアニーリングを行い、増幅サイクルを繰
り返して既知配列近傍のＤＮＡを増幅することができ
る。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、既知配列に隣接する配列を、Ｄ
ＮＡの環状化やオリゴヌクレオチドの連結といった複雑
な操作を必要とせずに、しかも、効率よく増幅させるこ
とができる方法を提供することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、オリゴヌクレオ
チドプライマーが非特異的に標的ＤＮＡ配列にハイブリ
ダイズさせる増幅サイクルを１回のみ行い、しかる後に
プライマーが特異的にハイブリダイズする温度でアニー
リングを行う増幅サイクルを繰り返すと、効率よくＤＮ
Ａ配列を増幅できることを見出し、本発明に至った。

【００１０】すなわち本発明は、ＤＮＡ配列とこのＤＮ
Ａ配列の一部の配列を有するオリゴヌクレオチドプライ
マーとを、ＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオ
チドを含むＤＮＡポリメラーゼ反応液中で混合し、前記
ＤＮＡ配列の変性と、このＤＮＡ配列とＤＮＡプライマ
ーとのアニーリングと、ＤＮＡポリメラーゼ反応からな
る増幅サイクルを繰り返すことにより前記ＤＮＡ配列を
増幅する方法において、（Ａ）オリゴヌクレオチドプラ
イマーがＤＮＡ配列の任意の位置に非特異的にハイブリ
ダイズする温度で前記アニーリングを行う１回の増幅サ
イクルと、（Ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーがその
配列と相補的なＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズす
る温度で前記アニーリングを行う複数の増幅サイクル、
とを含むことを特徴とするＤＮＡ配列の増幅法である。

【００１１】また本発明は、ＤＮＡ配列と、このＤＮＡ
配列の一部の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ
ー（特異的プライマー）と、特異的プライマーよりもＴ
ｍが低く任意の配列を有するオリゴヌクレオチドプライ
マー（非特異的プライマー）とを、ＤＮＡポリメラーゼ
とデオキシリボヌクレオチドを含むＤＮＡポリメラーゼ
反応液中で混合し、前記ＤＮＡ配列の変性と、このＤＮ
Ａ配列とＤＮＡプライマーとのアニーリングと、ＤＮＡ
ポリメラーゼ反応からなる増幅サイクルを繰り返すこと
により前記ＤＮＡ配列を増幅する方法において、（Ａ）
非特異的プライマーがＤＮＡ配列に非特異的にハイブリ
ダイズする温度でアニーリングを行う１回の増幅サイク
ル、（Ｂ）特異的プライマーがＤＮＡ配列に特異的にハ
イブリダイズする温度でアニーリングを行う複数回の増
幅サイクル、（Ｃ）非特異的プライマーがその配列と相
補的なＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度で
アニーリングを行う複数回の増幅サイクル、を含むこと
を特徴とするＤＮＡ配列の増幅法。

【００１２】尚、本発明においては、「ハイブリダイ
ズ」とは、一本鎖ＤＮＡ配列とオリゴヌクレオチドプラ
イマーとが水素結合により部分的二本鎖を形成すること
をいい、「アニール」あるいは「アニーリング」とは、
一本鎖ＤＮＡ配列とオリゴヌクレオチドプライマーとが
ハイブリダイズするような条件に置くことをいう。

【００１３】また、特記しない限り、「特異的」とはプ
ライマーとＤＮＡ配列とがミスマッチを含まずにハイブ
リダイズすることをいい、「非特異的」とは、これらが
ミスマッチを含んでハイブリダイズすることをいう。以
下、本発明を詳細に説明する。

【００１４】＜１＞本発明のＤＮＡ配列の増幅法に使用
するプライマー特異的プライマーは、ＤＮＡ配列の一部の配列に特異的
な、すなわちＤＮＡ配列の一部と同一の配列を有するオ
リゴヌクレオチドプライマーであり、その配列は未知配
列に隣接する既知配列から選択する。

【００１５】一方、非特異的プライマーは、任意の配列
を有するオリゴヌクレオチドであり、既知配列に隣接す
る未知配列上で、特異的プライマーと同一の配列を有す
るストランドでない方のストランドのうち相補的な部位
（以下、「標的部位」という）にハイブリダイズし、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（以下、単に「ポリメラーゼ」とい
う）反応のプライマーとしての役割を果たすためのもの
である。

【００１６】非特異的プライマーは、特異的プライマー
よりもＴｍ（melting temperature：相補的な配列との
二本鎖形成及び解離が平衡となる温度）が低くなるよう
に設計することが好ましく、この温度差としては５℃以
上、好ましくは１０〜１５℃が挙げられる。尚、Ｔｍ値
は、下記計算式により予想できる。

【００１７】

【数１】Ｔｍ＝６９．３℃ ＋０．４１（％ＧＣ比）
℃−６５０／Ｌ℃ （但し、Ｌはプライマーの塩基数を表す）

【００１８】尚、上式により得られるＴｍ値は、塩を含
まない水溶液中での値であり、実際は塩濃度やｐＨ等に
よって左右される。通常のポリメラーゼ反応に用いられ
る緩衝液中では、上記で得られる値よりも高い場合が多
い。

【００１９】ところで、本発明は、非特異的プライマー
から始まるポリメラーゼ反応により合成させるストラン
ドに特異的プライマーをハイブリダイズさせ、他方のス
トランドを合成することを基本とする。したがって非特
異的プライマーは、上記ポリメラーゼ反応により特異的
プライマーがハイブリダイズする部位に到達できる位置
に結合しなければならない。

【００２０】一般に、ポリメラーゼ反応により合成され
るＤＮＡ鎖長は、限定された条件下で約１０ｋｂであ
り、一般的な条件下では５ｋｂ前後が限界であることか
ら、この観点からは非特異的プライマーは鎖長が短い方
が好ましい。例えば、未知配列が均一な配列である場
合、非特異的プライマーは、既知配列から５０００〜１
００００塩基以内の未知配列にハイブリダイズできる必
要がある。すなわち、ヌクレオチドは４種類であるか
ら、５〜１０ｋｂ以内の位置に非特異的配列がハイブリ
ダイズできるためには、ミスマッチ部分を除いて、６
（＝log₄4094）ないしは７（＝log₄16）塩基の非特異的
プライマーを使用しなければならない。

【００２１】しかし、６〜７塩基程度の鎖長の非特異的
プライマーを用いると、ＤＮＡ配列上の多数の目的とし
ない部位にハイブリダイズし、非特異的プライマーが反
対側のストランドに結合して起こるポリメラーゼ反応に
よるる副産物を生じ、それらの反応が目的とする配列を
増幅する反応と拮抗するために目的産物の増幅が阻害さ
れてしまう恐れがある。

【００２２】上記の条件を満足するためには、配列の異
なるオリゴヌクレオチド混合物、又は複数種のヌクレド
チドと水素結合を形成できるイノシン残基を含むオリゴ
ヌクレオチドを非特異的プライマーとして用いて水素結
合を形成できる塩基数を増加させるとともに、長鎖のプ
ライマーを用いてＴｍ値よりもかなり低温で多数のミス
マッチを起こさせて既知配列近傍にハイブリダイズさ
せ、以後の反応においては、プライマーのＴｍ近傍でハ
イブリダイズさせることによって、配列特異性を向上さ
せることが好ましい。この場合、特異的プライマーの鎖
長としては２０〜２５が好ましい。一方、非特異的プラ
イマーの鎖長は１４〜１７が好ましい。いずれのプライ
マーも、プライマー内で２次構造を形成せず、またプラ
イマーどうしが互いにハイブリダイズしない配列である
ことが好ましい。

【００２３】＜２＞本発明のＤＮＡ配列の増幅法本発明は、非特異的プライマー（特異的プライマーのみ
を使用する場合は特異的プライマー）が、ＤＮＡ配列の
任意の位置に非特異的にハイブリダイズする温度でアニ
ーリングを行う増幅サイクルを１回行うことを特徴と
し、従来知られている異なる温度で増幅サイクルを行う
種々の方法に適用することができる。

【００２４】尚、以下の記載において、非特異的プライ
マー（特異的プライマーのみを使用する場合は特異的プ
ライマー）がＤＮＡ配列に非特異的にハイブリダイズす
る温度（「低温」）でアニーリングを行う増幅サイクル
を「低温サイクル」、特異的プライマーのみ（特異的プ
ライマーのみを使用する場合を含む）がＤＮＡ配列に特
異的にハイブリダイズする温度（「高温」）でアニーリ
ングを行う増幅サイクルを「高温サイクル」、非特異的
プライマーがその配列と相補的なＤＮＡ配列に特異的に
ハイブリダイズする温度（「中温」）でアニーリングを
行う増幅サイクルを「中温サイクル」という。

【００２５】以下に、上記各サイクルを、図３に基づい
て説明する。図３において、ＤＮＡ配列のうち、特異的
プライマーと同一の配列を有するストランド（図中、細
線）を「＋鎖」、他方のストランド（図中、「太線」）
を「−鎖」と呼ぶ。

【００２６】（１）増幅サイクル高温サイクル高温サイクルは、特異的プライマーのみを選択的に−鎖
上の対応する部位にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼ
反応により未知配列を増幅させるための反応である。こ
のサイクルが、最も特異性の高い反応であり、副産物の
生成量が少ない。特異的プライマーはより低い温度でも
ハイブリダイズできるので、ＤＮＡ配列を増幅させるた
めには高温サイクルは必ずしも必要ではないが、増幅産
物の特異性を高めるためには行うことが好ましい。ま
た、複数種の特異的プライマーを使用することにより、
増幅産物の収率を高めることができる。

【００２７】低温サイクル低温サイクルは、非特異的プライマーを＋鎖上の非特異
的な位置にハイブリダイズさせ、−鎖を合成させるため
の反応である。非特異的プライマーは、複数の部位にハ
イブリダイズし、さらに−鎖にもハイブリダイズするの
で、このサイクルでは副産物が多く生成する。低温サイ
クルを行った後に高温サイクルを行い、さらに再び低温
サイクルを行うと、非特異的増幅が起こり（図３中、
＊、＊＊印）、その結果、＋鎖、−鎖共に非特異的プラ
イマーにより増幅されるものが生じる（図中、＊＊印：
以下、「両方向非特異的増幅産物」という）。このよう
な増幅産物は、ＤＮＡ配列のうち目的としない多数の部
位で生成されるので、目的産物の収率が悪くなる。

【００２８】中温サイクル低温サイクルを行った後に高温サイクルを行うと、＋鎖
のうち非特異的プライマーに対応する部位は、非特異的
プライマーに完全に相補的な配列に置換される。非特異
的プライマーは、低温では非特異的にＤＮＡ配列にハイ
ブリダイズすることができるが、中温ではハイブリダイ
ズできない。しかし、中温であっても上記の置換された
配列は相補的であるのでハイブリダイズすることができ
るので、−鎖の合成が可能となる。これに対し、低温サ
イクルで生成する＊印や＊＊印に相当する産物は中温サ
イクルでは理論上生成しないので、両方向非特異的増幅
産物の生成を抑制することが可能となる。

【００２９】尚、低温サイクル及び中温サイクルでも特
異的プライマーはＤＮＡ配列にハイブリダイズできるの
で、特異的プライマーから始まるポリメラーゼ反応も起
こるが、この反応では非特異的増幅は起こらないので、
図中では二回目の低温サイクルと中温サイクルでは省略
してある。ただし、特異的プライマーの配列に近似する
配列が、染色体ＤＮＡ上の既知配列以外の部位に存在す
る場合には、非特異的増幅が起こり得る。この増幅産物
も、特異的プライマーに近似するＤＮＡ配列を増幅する
という意味では目的産物である。

【００３０】（２）本発明の態様本発明の方法は、上記の各サイクルを組み合せることに
より行われ、基本的には１回の低温サイクルと、これに
続く高温サイクル及び中温サイクルの繰り返しからな
る。上述したように、高温サイクルは必ずしも必要では
ないが、中温においても非特異的プライマーがミスマッ
チを含みながらＤＮＡ配列にハイブリダイズするものが
ある程度存在するために、両方向非特異的増幅産物の生
成を抑制するためには、高温サイクルを含むことが好ま
しい。また、低温サイクルを行う前に、高温サイクルを
複数回行うと、さらに増幅産物の特異性を高めることが
できる。

【００３１】各サイクルの最適な組み合せ及び回数は、
使用するプライマーの種類や増幅を目的とするＤＮＡ配
列のＧＣ含量等により異なるが、いくつかの態様を以下
に例示する。

【００３２】(i)特異的プライマーのみを使用する場合特異的プライマー自体も低温では非特異的にＤＮＡ配列
にハイブリダイズすることができるので、非特異的プラ
イマーを用いなくても増幅できる場合がある。

【００３３】特異的プライマーのみを使用する場合は、
低温サイクルを１回行い、その後に、高温サイクルを繰
り返すことが好ましく、低温サイクルの前に高温サイク
ルを複数回行うことがさらに好ましい。

【００３４】(ii)特異的プライマー及び非特異的プライ
マーを用いる場合この場合も、上記と同様に、低温サイクルを１回行い、
その後に、高温サイクルと中温サイクルを繰り返すこと
が好ましく、低温サイクルの前に高温サイクルを複数回
行うことがさらに好ましい。

【００３５】また、各増幅サイクルを行った後に、使用
した特異的プライマーがＤＮＡ配列にハイブリダイズす
る部位よりも下流（３’側）の部位に相当する他の特異
的プライマーを使用して、再び増幅を行うと、増幅産物
の特異性をより向上させることができる。尚、高温サイ
クルと中温サイクルを繰り返す代わりに、両プライマー
のＴｍの中間温度で中温サイクルを複数回行うことも可
能である。

【００３６】（３）本発明に用いる反応条件等本発明の方法に用いる各反応は、従来のＰＣＲ法あるい
はその改良法と特に変わるところはなく、通常用いられ
ている条件を採用すればよい。

【００３７】例えば、ＤＮＡ配列の変性は、二本鎖ＤＮ
Ａを一本鎖に変性することができる温度に置けばよく、
例えば、９０〜９４℃、３０秒〜２分が挙げられる。
尚、ＤＮＡポリメラーゼがこの段階やアニーリングの段
階で失活しないように、Taq DNA polymerase等の耐熱性
ポリメラーゼを使用することが好ましい。

【００３８】アニーリングは、変性を行った後に、高温
サイクルでは特異的プライマーの予想Ｔｍ〜＋１０℃の
範囲に、中温サイクルでは非特異的プライマーの予想Ｔ
ｍ程度に、低温サイクルでは非特異的プライマーの予想
Ｔｍよりも２０℃前後低い温度に、各々１〜５分置くこ
とにより行われるのが通常である。又、アニーリングが
起こり易いように、特に低温サイクルでは変性の後に経
時的に上記温度まで下げるとよい。尚、理論的にはアニ
ーリングはＴｍよりも低い温度で行われるが、前述した
ように予想Ｔｍは塩を含まない水溶液中での値であるの
で、ポリメラーゼ反応液中では特異的プライマーは、上
記温度以上でアニーリングすることができる。

【００３９】ポリメラーゼ反応は、反応に使用するＤＮ
Ａ合成酵素の反応至適温度で行い、例えばTaq DNA poly
meraseを使用するときは７０〜７２℃の範囲で２〜４分
程度反応させる。

【００４０】また、反応温度の設定、調整は、市販のＰ
ＣＲ用の装置を用いて行うことができる。尚、各ステッ
プの保持時間は酵素の反応速度、耐熱性、使用する機器
の加熱、冷却速度等により適宜設定する。例えば、酵素
の反応速度が高い場合は反応時間を短く、酵素の耐熱性
が高い場合には変性時間を長くすることができる。

【００４１】さらに、上記の方法でＤＮＡ配列を増幅し
た後に、使用した特異的プライマーの標的部位よりも下
流の部位にハイブリダイズする他の特異的プライマーを
用意し、高温サイクルと中温サイクルを繰り返すことに
より、目的産物をより選択的に増幅することができる。

【００４２】＜４＞本発明のＤＮＡ配列の増幅法の応用（１）塩基配列決定への応用上記のＤＮＡ配列の増幅法を、ジデオキシ法による塩基
配列決定に応用することにより、未標識のプライマーを
用いて塩基配列を決定することができる。

【００４３】ジデオキシ法は、塩基配列を決定しようと
するＤＮＡと、この塩基配列の一部に対し相補的な配列
を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌ
クレオチドと、ジデオキシヌクレオチドと、ＤＮＡポリ
メラーゼとを緩衝液中で共存させてポリメラーゼ反応を
行い、ＤＮＡ合成産物を電気泳動により解析することに
よって塩基配列を決定する方法である。デオキシヌクレ
オチドに対して少量加えられたジデオキシヌクレオチド
がポリメラーゼ反応で取り込まれると、ＤＮＡ合成が停
止するので、ＤＮＡ合成産物を電気泳動により解析する
ことにより、塩基配列を決定することができる。この方
法では、合成産物の検出は、通常ＲＩ標識プライマーを
用いたオートラジオグラフィー、あるいは蛍光標識プラ
イマーを用いた光学的方法により行われる。

【００４４】本発明を応用して塩基配列を決定するに
は、例えば、塩基配列を決定しようとするＤＮＡ配列を
特異的プライマー及び非特異的プライマーを用いて増幅
した後、増幅反応液に適量のジデオキシヌクレオチドを
加え、高温サイクルを繰り返せばよい。こうすることに
より、ポリメラーゼ反応による合成産物を、サイクルの
回数に比例して増幅させながら、ジデオキシヌクレオチ
ドの取り込みを行うことができる。

【００４５】従来のＰＣＲ法による増幅産物をジデオキ
シ法で塩基配列決定する場合には、塩基配列決定用のプ
ライマーを添加する前に、ＰＣＲ法に用いたプライマー
を反応液から除く必要があるが、この方法によると、特
異的プライマーと非特異的プライマーのＴｍが異なるた
め、これらのプライマーを除くことなく、特異的プライ
マーを塩基配列決定用のプライマーとしてそのまま使用
することができる。この点では、種々の改良法でも同様
であるが、これらは副産物の含量が高いので、直接配列
決定に用いることはできない。これに対し、本発明の方
法では、目的産物の純度が高いので、増幅反応液をその
まま塩基配列決定に使用することができる。

【００４６】（２）その他本発明は、増幅産物をプローブとした染色体歩行や、形
質転換生物の同一性の鑑定、レトロウイルスの挿入部位
の決定等にも応用することができる。

【００４７】本発明の方法は、既知配列に隣接する未知
配列を増幅することができるので、ｃＤＮＡの配列を基
に、プロモーターやイントロン等の配列を得ることがで
きる。また、タンパクのアミノ酸配列から推定される配
列を有する特異的プライマーを使用して、そのタンパク
をコードする遺伝子を増幅することができる。

【００４８】

【作用】以下に、本発明の態様として特異的プライマー
と非特異的プライマーを用い、複数回（ｘ回）の高温サイクルからなる第１工程と、１回の低温サイクルからなる第２工程と、複数回（ｙ回）の高温サイクルと複数回（ｚ回）の中
温サイクルからなる複合サイクルの反復（ｎ回）である
第３工程、からなる方法を例として、作用を図４に基づいて具体的
に説明する。尚、理解を容易にするために、出発物質で
あるＤＮＡ配列を１コピーとして説明する。ここで１コ
ピーとは、ゲノムＤＮＡ等のように、出発物質が極めて
長いＤＮＡが分断されたものである場合、それぞれが１
分子づつであることをいう。したがって、通常は、増幅
を目的とする既知配列に隣接する未知配列以外に、多数
のＤＮＡ配列が混在している。

【００４９】＜１＞第１工程第１工程は、高温サイクルをｘ回行うことにより行われ
る。最初の反応サイクルでは、変性により２本の一本鎖
ＤＮＡが得られ、そのうち一方が鋳型となって、その既
知配列部分に特異的プライマーが完全にマッチした状態
でハイブリダイズし、鋳型の配列と相補的なＤＮＡが合
成される。もう一方の一本鎖ＤＮＡは、ここでは鋳型と
ならない。

【００５０】２回目の反応サイクルでは、最初の反応サ
イクルで得られた部分二本鎖ＤＮＡが変性により再び一
本鎖ＤＮＡとなり、以下最初の反応サイクルと同様にし
て、特異的プライマーがプライマーとなってＤＮＡが合
成される。これがｘ回繰り返されると、特異的プライマ
ーが末端となる一本鎖ＤＮＡがｘ個生成する。上記以外
の部分では、特異的プライマーは、高温サイクルでは標
的部位以外には結合できず、非特異的反応は起こらない
ので副産物は生成しない。

【００５１】この段階では、目的産物は、（１＋ｘ）個
となる。

【００５２】＜２＞第二工程第二工程は、１回の低温サイクルからなり、ＤＮＡ配列
の任意の部位に非特異的プライマーがミスマッチを含ん
でハイブリダイズし、ＤＮＡ合成が行われる。ここで新
たに生成するＤＮＡの末端は非特異的プライマー自体で
あり、鋳型の相当する部分の配列が非特異的プライマー
の配列に置換されたことになる。以降の中温・高温サイ
クルで特異的プライマーからＤＮＡが合成されると非特
異的プライマーに相補的な配列が生成し、この部位に非
特異的プライマーが特異的にハイブリダイズできるの
で、低温でのアニーリングを必要とせず、副産物の生成
を抑制することができる。

【００５３】一方、染色体ＤＮＡ中には、非特異的プラ
イマーの配列と完全に一致又は近似する配列が確率的に
存在するので、この配列の近傍に非特異的プライマーが
ハイブリダイズすると、両方向非特異的増幅産物が生成
し、その産物が増幅する。また、目的以外の部位にも非
特異的プライマーがハイブリダイズする結果、副産物の
増幅が起こるが、生成するストランドの反対側のストラ
ンドには特異的プライマーがハイブリダイズできないの
で、それ以上の増幅は理論上起こらない。しかし、その
一方で、中温サイクルでも非特異的プライマーがミスマ
ッチを含みながらある程度ハイブリダイズするので、中
温サイクルでも副産物の増幅が起こり得る。

【００５４】従来の方法では、低温サイクルを反復して
行うので副産物がかなり生成するが、本発明では低温サ
イクルを１回としたことで、副産物の生成を抑制するこ
とができる。

【００５５】この段階で、目的産物は（１＋ｘ＋１）個
となるが、鋳型分子自体は非特異的プライマーの配列に
置換していないので、以降の反応の鋳型となるものは
（ｘ＋１）である。

【００５６】＜３＞第３工程第３工程は、ｙ回の高温サイクルとｚ回の中温サイクル
からなる複合サイクルを、ｎ回反復して行われる。この
工程では、高温サイクルでは目的産物のみが増幅し、中
温サイクルでは目的産物及び低温サイクルで生じた両方
向非特異的産物の両者が増幅される。その結果、複合サ
イクルをｎ回行った後には、目的産物は、（ｘ＋１）
｛（ｙ＋２）２^(z-1)｝ⁿ個となり、副産物は２^zn個とな
る。

【００５７】上記の反応以外に、特異的プライマーが低
温サイクルで非特異的にハイブリダイズしてできる増幅
産物も生じる。こうして生じる産物１分子につき、第３
工程では２^(y+z)n倍に増幅される。また、低温サイクル
で、非特異的プライマーが、特異的プライマーの標的部
位に近い部位や遠い部位にハイブリダイズする結果、長
さの異なる増幅産物ができることがある。このような産
物も、目的とする未知配列が増幅されたものであるの
で、その意味では目的産物であり、増幅産物の単一化を
目指す場合を除いて問題とはならない。

【００５８】第３工程では、目的産物に対する両方向非
特異的増幅産物の生成量が最少となるようにｘ、ｙ、
ｚ、ｎを決定するのが好ましい。全ての工程における全
サイクル数ａ＝ｘ＋１＋ｎ（ｙ＋ｚ）は、酵素の耐熱性
によって制限され、Thermus aquaticus由来のポリメラ
ーゼ（Perkin-Elmer社製：AmpliTaq DNA polymerase）
を使用する場合には、ａ＝５０程度が限界であるのでａ
を一定と考えると、（ｘ＋１）｛（ｙ＋２）２^(z-1)｝ⁿ
／２^znが最大になるのは、ｘ＝４、ｙ＝２、ｚ＝１のと
きである。また、ｎはａを何回にするかによって決定さ
れる。

【００５９】上記第１〜３工程からなるサイクル（以下
の実施例では、「大サイクル」という）終了後に、別の
非特異的プライマーを用いて大サイクルを行うと、増幅
産物の特異性を向上することができる。

【００６０】

【実施例】以下に、本発明のＤＮＡ配列の増幅法及びそ
の応用についての実施例を説明する。

【００６１】

【実施例１】Ｔ−ＤＮＡ挿入配列に隣接する植物ゲノ
ム配列の増幅本発明のＤＮＡ配列の増幅法の実施例として、植物ゲノ
ムにＴ−ＤＮＡを挿入し、このＴ−ＤＮＡ配列を既知配
列として、これに隣接する植物ゲノムを増幅した例を説
明する。

【００６２】（１）Ｔ−ＤＮＡ挿入配列を持つ植物の作
製シロイヌナズナに、Ｔｉプラスミドのバイナリーベクタ
ーであるｐＧＤＷ３２を持つアグロバクテリウム（Agro
bacterium tumefacience）を、リーフデスク法などの方
法で感染させ、Ｔ−ＤＮＡ挿入配列を持つ形質転換植物
を得た。これらの形質転換植物から、尿素−フェノール
法などによりゲノムＤＮＡを抽出した。

【００６３】（２）増幅反応の反応液の組成Ｔ−ＤＮＡ挿入配列の末端近傍にハイブリダイズする特
異的プライマーとして３種のオリゴヌクレオチドＴＲ
１、ＴＲ２、ＴＲ３を用意した。これらの配列は、配列
表に、各々配列番号１、配列番号２及び配列番号３とし
て記載した通りであり、Ｔ−ＤＮＡ挿入配列の５’側か
ら３’側に順にハイブリダイズする。尚、これらのプラ
イマーは２３塩基からなり、各々Ｔｍ値はＴＲ１が６
０．６℃、ＴＲ２とＴＲ３が５７．１℃である。これら
のプライマーが、既知配列にハイブリダイズする位置を
図５に示す。尚、この配列は、プライマーと同一の配列
を有するストランドを示している。

【００６４】非特異的プライマーとしては、配列番号
４、５、６に示した配列を有する３種のオリゴヌクレオ
チド混合物Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３を用意した。各配列中、Ｗ
はＡ又はＴ、ＳはＧ又はＣを表す。

【００６５】Ｗ１は１５塩基からなる６４種類のオリゴ
ヌクレオチドの混合物であり、Ｔｍ値は４３．７℃、Ｗ
２は１６塩基からなる１２８種類のオリゴヌクレオチド
の混合物であり、Ｔｍ値は４６．６℃、Ｗ３は１６塩基
からなる２５６種類のオリゴヌクレオチドの混合物であ
り、Ｔｍ値は４５．３℃である。

【００６６】ＤＮＡの増幅は、使用するプライマーを変
えて本発明の方法を２回以上行うのが好ましい。各反応
における反応液は、鋳型とプライマー以外は共通した組
成のものを使用した。この基本組成は、10 mM Tris-HCl
（pH8.3）、50mM KCl、2mM MgCl₂、0.001％ゼラチン、1
00μＭ dNTPとした。

【００６７】１回目の大サイクルでの反応液は、上記基
本組成に１０ｎｇの鋳型ゲノムＤＮＡ、０．７単位のＤ
ＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus社製 AmpliTaq
DNApolymerase）、０．２μMのＴＲ１、非特異的プライ
マー（２μM Ｗ１、３μMＷ２、４μM Ｗ３のうちいず
れか１種）を添加して最終的に２０μｌとした。反応
は、これに２０μｌのミネラルオイルを重層して行っ
た。

【００６８】２回目以降の大サイクルでのＤＮＡ増幅反
応は、１回目と同じ非特異的プライマーを使用したが、
特異的プライマーは１回目の反応に使用した特異的プラ
イマーよりも、３’側にハイブリダイズできる特異的プ
ライマー（ＴＲ２、ＴＲ３）を使用した。この反応液に
は、１回目の反応液０．１μｌと３．５単位のAmpliTaq
DNA polymerase、０．２μＭの特異的プライマー（Ｔ
Ｒ２又はＴＲ３）、非特異的プライマーを添加して計１
００μｌとし、これに２０μｌのミネラルオイルを重層
して反応を行った。

【００６９】また、各回の反応を通じて使用する非特異
的プライマーの選定においては、まず、Ｗ１を使用して
反応し、好ましい増幅産物が得られない場合には、順次
Ｗ２、Ｗ３を使用して１回目の反応から再度実施すると
よい。

【００７０】（３）増幅反応の反応温度サイクル１回目の大サイクルのＤＮＡ増幅反応は、市販の装置
（Perkin-Elmer Cetus社製 thermal cycler）を使用し
て、以下の工程で行った。

【００７１】（第１工程）ＤＮＡの変性（９４℃１
分）、アニーリング（６５℃１分）、ポリメラーゼ反応
（７２℃３分間）からなる高温サイクルを、５回繰り返
した。

【００７２】（第２工程）９４℃１分でＤＮＡの変性を
行った後、５分間で２５℃まで冷却し、２５℃５分保持
してアニーリングを行い、５分間で７２℃まで加熱して
から７２℃で３分ポリメラーゼ反応を行い、低温サイク
ルとした。

【００７３】（第３工程）ＤＮＡ変性（９４℃３０
秒）、アニーリング（６５℃１分）、ポリメラーゼ反応
（７２℃３分）からなる高温サイクルを２回と、ＤＮＡ
変性（９４℃３０秒）、アニーリング（４５℃１分）、
ポリメラーゼ反応（７２℃３．５分）からなる中温サイ
クル１回を行う複合サイクルを、１５回繰り返した。

【００７４】２回目以降の大サイクルでの増幅反応は、
９４℃１分、６２℃１分、７２℃３分の高温サイクルが
２回、９４℃３０秒、４５℃１分、７２℃３．５分の中
温サイクル１回からなる複合サイクルを１３回繰り返す
ことにより行った。

【００７５】各々の反応後の反応液のうち、５μｌをと
り、１．２〜１．５％のアガロースゲル電気泳動を行
い、増幅産物のＤＮＡを分析を行った。結果を図６
（Ａ）に示す。レーン１は大サイクル１回目の増幅産
物、レーン２、３はこれをさらに２回目の大サイクルで
増幅して得られた産物についての結果である。

【００７６】さらに、出発ＤＮＡ配列１ｎｇに対し、１
５０ｎｇの小麦クロモゾームＤＮＡを加え、同様にして
増幅させて得られた産物を解析した。結果を図６（Ｂ）
に示す。レーン１は大サイクル１回についてのもの、レ
ーン２、３はさらに２回目の大サイクルを行ったもの、
レーン４は、レーン２の試料について３回目の大サイク
ルを行ったものである。

【００７７】図中、「Ｍ」は分子量マーカーを示し、図
の左に各バンドの分子量を示した。また、各試料につい
て、大サイクルの回数及び最終サイクルに用いたプライ
マーの種類を表１に示す。

【００７８】

【表１】

【００７９】（解析結果）大サイクル１回のみのもの
（レーン１）では、主要な増幅産物は３種類（３本のバ
ンド）あるが、特異的プライマーを代えてさらに増幅サ
イクルを行うと、１本のバンドになる。このバンドは、
レーン２、３で大きさが異なる位置に泳動されるが、こ
れは特異的プライマーがハイブリダイズする位置が、レ
ーン３のものではより３’側であるためである。これら
のバンドはレーン１ではほとんど認められないが、２回
目の大サイクルを行うことによって、目的産物の特異性
が向上した結果、１本のバンドのみが増幅されたものと
考えられる。

【００８０】尚、Ｔ−ＤＮＡ挿入配列の場合では、大サ
イクル１回目では、非特異的プライマーが結合する部位
が異なる結果生じる増幅産物の種類は、平均２．２個で
あり、通常は最大５種類程度である。

【００８１】レーン１で認められるバンドは、２回目の
大サイクルでは消失し、両端が特異的プライマーである
増幅産物であると推定される。これらの増幅産物は、レ
ーン２、３で得られるバンドとは大きさは異なるが、単
に低温サイクルで特異的プライマーがハイブリダイズし
た結果得られたものであり、既知配列に隣接する未知配
列が増幅されたという意味においては目的産物であると
いうことができる。

【００８２】また、染色体ＤＮＡにＴＲ１の配列に類似
する配列が存在し、その近傍にＴＲ１がハイブリダイズ
した結果、両端が特異的プライマーである増幅産物とし
て生成した可能性もある。これらは、既知配列とは近傍
の配列が異なるために、ＴＲ２やＴＲ３を使用した場合
には増幅されず、バンドが消失したと考えられる。

【００８３】いずれにしても、シロイヌナズナ染色体Ｄ
ＮＡのように長いＤＮＡ配列（約１０¹⁸塩基）を材料に
用いても、本発明の方法により、目的とするＤＮＡ配列
の特異的増幅が可能であることがわかったまた、出発材料にさらに多様性に富んだ小麦クロモゾー
ムＤＮＡ（約１．５×１０¹⁰）を大量に加えても、特異
的な増幅が認められ（レーン２〜４）、本発明の方法が
極めて特異性の高いものであることがわかる。

【００８４】

【実施例２】増幅産物を直接鋳型とする塩基配列の決
定次に、本発明の応用として、増幅産物を直接鋳型として
用いた塩基配列決定の例を説明する。

【００８５】実施例１で得られた大サイクル２回目反応
液１０μｌ（100〜200ngのＤＮＡを含む）に対し、０．
５μｌの（α-³²P）dCTP（〜110TBq/mmol）、１単位のA
mpliTaq DNA polymerase、４μlのジメチルスルホキシ
ド（DMSO）と10 pmoleの特異的プライマー（ＴＲ２）を
含む緩衝液３０μｌを加えた。この反応液を各９μlず
つに４分割し、各分割液に対し１μlの0.5mM ddGTP, 5m
M ddATP, 5mM ddTTP,5mM ddCTPのいずれかを添加し、９
４℃２０秒、６０℃１分、７２℃２分のサイクルを４０
回繰り返す反応を行った。この反応液を、通常のジデオ
キシ法に用いる塩基配列決定と同様に電気泳動を行って
塩基配列を決定した。

【００８６】得られた塩基配列を配列番号７に示す。塩
基番号６９までは形質転換に用いたＴｉプラスミドの配
列で、塩基番号７０〜２５１まではゲノムＤＮＡ中に挿
入されたＴ−ＤＮＡに隣接する未知のシロイヌナズナゲ
ノムＤＮＡ配列であった。尚、得られた未知配列は、シ
ロイヌナズナゲノムＤＮＡのサザン分析の結果から、約
２００塩基対を基本単位とする繰り返し配列であること
が解明された。

【００８７】図７に、他の塩基配列決定例における電気
泳動の結果を示す。本発明では、ジデオキシヌクレオチ
ドの取り込みとＤＮＡ合成産物の増幅を同時に行ってい
るが、通常のジデオキシ法と同様にシークエンスラダー
が形成されていることがわかる。

【００８８】

【実施例３】Ｐ１ベクター挿入断片の増幅次に、本発明の実施例として、Ｐ１ベクターに挿入され
たＤＮＡの配列の増幅の例を説明する。

【００８９】（１）Ｐ１ベクターが挿入された大腸菌ゲ
ノムＤＮＡの調製シロイヌナズナ染色体ＤＮＡ断片を含むＰ１ベクターを
保有する大腸菌のコロニーを爪楊枝等で取り、直接反応
液中に懸濁し、増幅反応に用いる鋳型とした。また、液
体培地で培養した大腸菌からアルカリリシス法などによ
りＰ１プラスミドＤＮＡを調製してもよい。

【００９０】（２）増幅反応の反応液の組成Ｐ１ベクターのクローニングサイトの近傍に存在するＳ
ｐ６プロモーターの配列の１部を有するオリゴヌクレオ
チドを３種用意し、特異的プライマーとした。各々のプ
ライマーは、ハイブリダイズする部分がクローニングサ
イトから挿入配列方向である順に、Ｓｐ６−１（配列番
号８：２２塩基、Ｔｍ６２．１℃）、Ｓｐ６−２（配列
番号９：１７塩基、Ｔｍ５２．８℃）、及びＳｐ６−３
（配列番号１０：１５塩基、Ｔｍ４２．４℃）である。

【００９１】一方、非特異的プライマーとしては、実施
例１に用いたＷ３を使用した。ＤＮＡ増幅反応は、特異
的プライマーを変えて２回以上行った。各反応における
反応液組成は、特異的プライマー以外は実施例１と同様
であり、特異的プライマーには、１回目の大サイクルに
はＳｐ６−１を、２回目の大サイクルにはＳｐ６−２又
はＳｐ６−３を、各々０．２μＭ使用した。

【００９２】（３）増幅反応の反応温度サイクル１回目のＤＮＡ増幅反応は、実施例１と同様にして行っ
た。また、２回目の増幅反応は、９４℃１分、４５℃１
分、７２℃３．５分の中温サイクルを２２回繰り返すこ
とにより行った。

【００９３】各々の反応後の反応液のうち、５μｌをと
り、１．２〜１．５％のアガロースゲル電気泳動を行
い、増幅産物のＤＮＡを分析を行った。結果を図８に示
す。レーン１、２は、各々異なるＰ１クローンを鋳型と
して、Ｓｐ６−１を特異的プライマーとした１回の大サ
イクルにより増幅を行った結果である。レーン３、４
は、レーン１の試料を特異的プライマーにＳｐ６−２、
Ｓｐ６−３を各々用いて２回目の大サイクルを行ったも
の、レーン５、６はレーン２の試料をＳｐ６−２、Ｓｐ
６−３を各々用いて２回目の大サイクルを行ったものに
ついての結果である。

【００９４】（解析結果）レーン１の試料では、多数の
バンドが認められるが、プライマーを代えて大サイクル
を繰り返すと１本のバンドになる（レーン３、４）。こ
れに対し、レーン２の試料では、大サイクル１回ですで
に一本のバンドに集約されている。この結果は、増幅に
用いる材料によっては、１回の大サイクルのみで充分で
あることを示している。特に、Ｐ１クローンのように鋳
型配列が１０⁵塩基程度の長さのものについては、１回
で充分な場合が多いと考えられる。したがって、大サイ
クル１回目終了後の反応液について増幅産物の解析を行
い、不十分であればさらにプライマーを代えて大サイク
ルを２回、あるいは３回行えばよい。

【００９５】

【実施例４】次に、本発明の実施例としてＰ１ベクター
に挿入されたＤＮＡの配列を、実施例３とは異なる反応
温度サイクルで増幅した例を説明する。

【００９６】（１）Ｐ１ベクターが挿入された大腸菌ゲ
ノムＤＮＡの調製実施例３と同様にして行なった。

【００９７】（２）増幅反応の反応液の組成特異的プライマーは実施例３に用いたＳｐ６−１を使用
した。一方、非特異的プライマーとしては、実施例１に
用いたＷ２を使用した。ＤＮＡ増幅反応における反応液
組成は、実施例３と同様の組成を使用した。

【００９８】（３）増幅反応の反応温度サイクル１回目のＤＮＡ増幅反応は、実施例１の（第３工程）を
ＤＮＡ変性（９４℃３０秒）、アニーリング（５８℃１
分）、ポリメラーゼ反応（７２℃３分）からなる中温サ
イクルを３０回繰り返した。反応後の反応液のうち、５
μｌをとり、１．２〜１．５％のアガロースゲル電気泳
動を行い、増幅産物のＤＮＡの分析を行なった。結果を
図９に示す。

【００９９】（解析結果）この結果は、第３工程を中温
サイクルのみで行なった場合も、目的とする増幅産物が
得られることを示している。実施上特に、単一のバンド
とすることを必要としない場合には、本実施例の方法で
目的を達することが可能である。

【０１００】

【実施例５】続いて、実施例１で得られたＴ−ＤＮＡを
挿入したシロイヌナズナの染色体ライブラリーのうちの
１株について、第３工程を中温サイクルのみで行った増
幅例を説明する。

【０１０１】（１）Ｔ−ＤＮＡ挿入配列を持つ植物の作
製実施例１と同様にして行った。

【０１０２】（２）増幅反応の反応液の組成特異的プライマーは実施例１に用いたＴＲ２あるいはＴ
Ｒ３を使用した。一方、非特異的プライマーとしては、
実施例１に用いたＷ３を使用した。ＤＮＡ増幅反応にお
ける反応液組成は、実施例１と同様の組成を使用した。

【０１０３】（３）増幅反応の反応温度サイクル増幅反応は、実施例１の（第３工程）をＤＮＡ変性（９
４℃３０秒）、アニーリング（５８℃１分）、ポリメラ
ーゼ反応（７２℃３分）からなる中温サイクルを３０回
繰り返した。特異的プライマーとしてＴＲ２あるいはＴ
Ｒ３を用いた増幅反応液から各々５μｌをとり、１．２
〜１．５％のアガロースゲル電気泳動を行い、増幅産物
のＤＮＡの分析を行なった。結果を図１０に示す。

【０１０４】（解析結果）いずれの特異的プライマーを
用いた場合でも、増幅産物は、ほぼ単一のバンドとして
得られた。ＴＲ３を用いた場合の増幅産物（レーン２）
は、ＴＲ２を用いた場合の増幅産物（レーン１）よりも
小さく、その差はＴ−ＤＮＡ中のＴＲ２及びＴＲ３と同
一の配列を有する部位の距離６４塩基と一致していた。
このことから、上記で得られた各々の増幅産物は、いず
れも目的産物であることがわかった。

【０１０５】この結果は、シロイヌナズナのように大き
な染色体を材料にした場合でも、中温サイクルのみで目
的とする増幅産物が得られることを示している。

【０１０６】

【発明の効果】本発明の方法により、既知配列に隣接す
る未知配列を、ＤＮＡの環状化やオリゴヌクレオチドの
連結といった複雑な操作を必要とせずに、しかも、効率
よく増幅させることができる。

【０１０７】

【配列表】

【０１０８】配列番号：１配列の長さ：23 配列の形：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCAACAAGTC ACGGATATTC GTG 23

【０１０９】配列番号：２配列の長さ：23 配列の形：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTGAAAACGA CAAAAACTGC GAA 23

【０１１０】配列番号：３配列の長さ：23 配列の形：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TTTGACACCA GTTGCTATCA TTG 23

【０１１１】配列番号：４配列の長さ：15 配列の形：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 NTCGASTWTS GWGTT 15

【０１１２】配列番号：５配列の長さ：16 配列の形：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 NGTCGASWGA NAWGAA 16

【０１１３】配列番号：６配列の長さ：16 配列の形：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 WGTGNAGWAN CANAGA 16

【０１１４】配列番号７配列の長さ：251 配列の形：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の種類：起源：生物名：シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana(アラヒ゛ト
゛フ゜シスサリアナ)）組織の種類：葉配列 GACACCAGTT GCTATCATTG CGGCCAAGCT CAGGATCAGA TTGTCGTTTC CCGCCTTCGG 60 TTTAAACTAA CCAAAATGCT TGCTTCTTCA TCAAAGCTTT CTTGGTTCTT TGCTGTGAGT 120 GAATTTGGCA GGTCAGAAGC TGTGAGTGAG CTTGCCATGT CAAAGACCAT GGCAGAGCAA 180 CGGCAGTATC TTCCCATATT TTCTGTTAGA GATGAACTAT TGCTGGTTGG TGGTCTTTCC 240 TTTTTATGGC C 251

【０１１５】配列番号：８配列の長さ：22 配列の形：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TACGTAGGCC TAATTGGCCG TC 22

【０１１６】配列番号：９配列の長さ：17 配列の形：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CCGTCGACAT TTAGGTG 17

【０１１７】配列番号：10 配列の長さ：15 配列の形：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTGACACTAT AGAAG 15

【図面の簡単な説明】

【図１】従来のＰＣＲ法の原理を示す図。

【図２】公知の改変ＰＣＲ法の原理を示す図。

【図３】本発明に用いる増幅サイクルを示す図。

【図４】本発明の方法の概念を示す図。

【図５】Ｔ−ＤＮＡの配列の一部と、これに特異的プ
ライマーがハイブリダイズする位置を示す図。

【図６】ＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す電気泳動
図。

【図７】塩基配列決定の電気泳動図。

【図８】ＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す電気泳動
図。

【図９】ＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す電気泳動
図。

【図10】ＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す電気泳動
図。

【符号の説明】

図中、Ｍはマーカーを、図の左の数字は分子量を示す。

フロントページの続き (72)発明者光川典宏茨城県つくば市東新井10番１号スカイノブルー320号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＤＮＡ配列とこのＤＮＡ配列の一部の配
列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを、ＤＮＡ
ポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチドを含むＤＮＡ
ポリメラーゼ反応液中で混合し、前記ＤＮＡ配列の変性
と、このＤＮＡ配列とＤＮＡプライマーとのアニーリン
グと、ＤＮＡポリメラーゼ反応からなる増幅サイクルを
繰り返すことにより前記ＤＮＡ配列を増幅する方法にお
いて、（Ａ）オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ配
列の任意の位置に非特異的にハイブリダイズする温度で
前記アニーリングを行う１回の増幅サイクルと、（Ｂ）
オリゴヌクレオチドプライマーがその配列と相補的なＤ
ＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度で前記アニ
ーリングを行う複数の増幅サイクル、とを含むことを特
徴とするＤＮＡ配列の増幅法。
【請求項２】ＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配列の一部の
配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（特異的プ
ライマー）と、特異的プライマーよりもＴｍが低く任意
の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（非特異
的プライマー）とを、ＤＮＡポリメラーゼとデオキシリ
ボヌクレオチドを含むＤＮＡポリメラーゼ反応液中で混
合し、前記ＤＮＡ配列の変性と、このＤＮＡ配列とＤＮ
Ａプライマーとのアニーリングと、ＤＮＡポリメラーゼ
反応からなる増幅サイクルを繰り返すことにより前記Ｄ
ＮＡ配列を増幅する方法において、（Ａ）非特異的プラ
イマーがＤＮＡ配列に非特異的にハイブリダイズする温
度でアニーリングを行う１回の増幅サイクル、（Ｂ）特
異的プライマーがＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズ
する温度でアニーリングを行う複数回の増幅サイクル、
（Ｃ）非特異的プライマーがその配列と相補的なＤＮＡ
配列に特異的にハイブリダイズする温度でアニーリング
を行う複数回の増幅サイクル、を含むことを特徴とする
ＤＮＡ配列の増幅法。
【請求項３】請求項１において、前記オリゴヌクレオ
チドプライマーと同一の配列を有するＤＮＡ配列の部位
よりも下流側の近傍の配列を有するオリゴヌクレオチド
プライマーをポリメラーゼ反応液中に加えることを特徴
するＤＮＡ配列の増幅法。
【請求項４】請求項２において、特異的プライマーと
同一の配列を有するＤＮＡ配列の部位よりも下流側の近
傍の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをポリ
メラーゼ反応液中に加えることを特徴するＤＮＡ配列の
増幅法。