JP3968810B2 - 核酸配列分析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合中に含まれると予想される特定核酸を定性又は定量するための分析方法に関し、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用、有用遺伝子のクローニングでの利用、並びに未知遺伝子の探索等の分野での利用に有用であり、更には、遺伝子を増幅する工程に関する反応条件を最適化する方法としても有用である。
【０００２】
【従来の技術】
特定核酸の分析には、特定核酸配列がその塩基配列と相補的な配列を有するプローブ（核酸プローブ）と相補結合を形成する性質が利用されている。
【０００３】
例えば従来より、特定核酸の異なる部位の特定配列に対して相補結合を形成し得る配列からなる二種類のプローブを用いるサンドイッチアッセイと呼ばれる方法が知られている。この方法では、第一のプローブは不溶性担体に固定化されており、一方第二のプローブはその一部に可視部に色を持つ色素や蛍光物質あるいはそれらを生成し得る酵素で標識されている。そして、試料にこれらのプローブを添加し、試料中の特定核酸を第一及び第二のプローブと相補結合させ、これら３者からなる複合体を不溶性担体上に形成させる。引き続き、試料反応液中の上清と不溶性担体とを分離し、上記複合体を形成していない第二のプローブを分離する（Ｂ／Ｆ分離工程）。しかる後、不溶性担体上の複合体中の標識物質を測定することにより、試料中の特定核酸の有無及び量を決定するのである。ここで、可視部に色を持つ色素や蛍光物質を生成し得る酵素を第二の標識として用いる場合は、上記複合体形成工程後、複合体を形成していない第二プローブを除去した後に、それらの前駆体である酵素基質を試料反応液に添加し、その反応産物である色素や蛍光物質を測定することにより、試料中の標的核酸の有無及びその量を決定する。
【０００４】
近年、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法が開発されたことにより、試験管内条件下で試料中の特定核酸の特定領域を増幅し、分析するに充分な量を調製することが可能となったことから、ＰＣＲ法を用いて試料中の特定核酸の特定領域を増幅した後、その反応液を試料として上記のサンドイッチアッセイによって増幅産物を測定することで、増幅前の試料中の特定核酸の有無及ぶ量を決定することも行われている。また、特定核酸配列の特定領域に相補的な配列からなるプローブを、前記ＰＣＲ法等によって増幅後、その反応液に添加して増幅核酸と相補結合を形成する条件下においた後、形成された複合体を電気泳動法によって未反応のプローブから分離することにより、増幅後の増幅産物の分析を行う方法も提案されている。
【０００５】
サンドイッチアッセイでは、反応液中に不溶性担体を利用することから、第二のプローブがこの不溶性担体に非特異的に吸着し、不溶性担体上の複合体中の標識を測定する段階で、この不溶性担体上に非特異的に吸着した第二のプローブの標識の存在により測定結果に誤差が生じ、試料中の特定核酸の有無及びその量を決定する際に問題が生じる。特に、ウイルス感染症の診断では、臨床試料中の極微量のウイルス核酸を良好な再現性で高感度に検出することが要求されることから、上記の非特異的吸着に由来する問題は解決すべき重要な課題となっている。この問題を回避する目的で、不溶性担体表面の親水化処理、蛋白質等による担体表面の吸着点のブロッキング、Ｂ／Ｆ分離工程に続いて不溶性担体を十分洗浄すること等が試みられている。
【０００６】
しかしながら、担体表面を化学的に親水化処理等することは、その可否が担体の材質に依存するうえ、技術的に必ずしも容易ではない。また担体表面の吸着点を予めブロッキングする目的で担体表面を蛋白質によって被覆する方法では、その蛋白質が第二のプローブの核酸部分又は標識と相互作用し、担体への新たな非特異的吸着を招く可能性もある。更に、Ｂ／Ｆ分離工程においては、不溶性担体の洗浄回数を増やすことは操作上の限界があり、例えば洗浄液に界面活性剤を添加する等した場合、担体上に形成されている複合体の分解を促す可能性もある。
【０００７】
また、ＰＣＲ法により特定核酸の特定領域を増幅した後にサンドイッチアッセイを行う場合は、ＰＣＲによる増幅産物が二本鎖ＤＮＡであることから、プローブと増幅された核酸との相補結合を形成させるには、増幅反応液へプローブを添加後、増幅産物である二本鎖ＤＮＡを一旦融解し一本鎖とするための加温操作 （デネーチャーリング／denaturing）と、その後冷却してプローブＤＮＡに標的ＤＮＡとの二本鎖ＤＮＡを形成させるための操作（アニーリング／annealing ）が不可欠となり、効率性と経済性を一般的要求とする臨床診断の現場に対して新たな労力と分析時間を要求することとなる。
【０００８】
前記した電気泳動法を利用する分析法においては、特に、ＰＣＲ終了後、反応容器から増幅された分析用試料を取り出す必要があり、ＰＣＲ法の実際的な応用における課題とされる、増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題をも生じる。
【０００９】
そこで、上記のような担体を使用せず、プローブの標識を測定するに際してデネーチャーリング・アニーリングからなる操作を含まず、かつ、可能な限りＰＣＲ等により増幅された核酸の飛散を排除し得る分析法の開発が求められることとなる。
【００１０】
担体を使用しない分析法として、インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを行い、反応液の蛍光を測定することによる分析法が提案されている（例えば、特開平５−２３７０００号公報／医学のあゆみ、１７３（１２）、９５９−９６３（１９９５）／Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２９、２０７−２１３（１９９５）等参照）。すなわち、ＰＣＲによる増幅産物が二本鎖ＤＮＡであることから、二本鎖核酸にインターカレーションし蛍光強度が増大する等、その蛍光特性が変化する性質を有するインターカレーター性蛍光色素を用い、これをＰＣＲによる増幅操作前に予め試料溶液に添加し、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定することにより、増幅前の標的核酸の有無及び量を決定するのである。
【００１１】
この方法によれば、密閉した反応容器内部の反応液の蛍光強度の測定からＰＣＲの進行を追跡することが可能となり、試料容器内部から反応液を採取して分析する必要がないため、増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題を回避することが可能となる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
このように、インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを行い、反応液の蛍光を測定することによる分析法は、担体を使用しない、即ち均一な反応液による系（均一系）での一段階の操作による分析法として優れた特徴を有する。
【００１３】
しかしながら、この方法は、インターカレーター性蛍光色素が二本鎖核酸に非特異的にインターカレーションすることに由来して、試料中に特定核酸以外に、例えば大量のゲノムＤＮＡが混在する場合には、インターカレーター性蛍光色素がこれらにもインターカレーションすることによって大きなバックグラウンドが生じ、特定核酸の増幅に由来する蛍光特性の変化を高精度で測定することが困難になるという課題があった。また、ＰＣＲ法では、特定核酸の特定の領域に相補的な一対の核酸を伸長反応のプラマーとして用いるが、このプライマーの配列によってはこれらが互いに相補結合する場合があり、その場合、互いに他方のプライマーを鋳型としてプライマーダイマーが生産されることになる。インターカレーター性蛍光色素は、プライマーダイマーへも非特異的にインターカレーションすることから、これに由来するバックグラウンドの増加が、本来目標とする特定核酸の増幅に基づく蛍光特性の変化を経時的に追跡する上で課題となる。
【００１４】
そこで、この解決策として、標的核酸の特定配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識し、特定核酸と相補結合すると形成された二本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレーションしその蛍光特性を変化するように設計した、特定の核酸配列の認識機能を具備するインターカレーター性蛍光色素標識プローブを用いる核酸の分析法が開発された（特願平７−１８５５９９号公報／ＥＰ公開第７１４９８６号公報／Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７ （１９９６））参照）。この方法によれば、プローブが特定核酸と相補結合を形成すると標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光特性が変化することから、相補結合を形成していないプローブを分離することなく、その相補結合の形成の有無及び形成された相補結合体の定量が可能となる。また、該プローブを特定核酸の増幅に先だって試料に添加しておけば、増幅工程中の反応液の蛍光強度を測定することにより、標的核酸の増幅されていく様子を配列特異的に経時的に追跡することも可能となる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、インターカレーター性蛍光色素を用いる特定核酸配の分析方法において、試料中に大量のゲノムＤＮＡが存在する場合や、分析に先立つＰＣＲ法による増幅操作においてプライマーダイマーが生産された場合であっても特定核酸配列に特異的に高精度の分析が可能で、かつ、余剰プローブ等の分離操作やデネーチャーリング・アニーリング操作を行うことなく、一定温度にてその存在の有無及び量を決定することが可能な担体を使用しない均一系での分析方法を提供することを目的として検討を行い、その結果、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、特定核酸を含むと予想される試料中の特定核酸の分析において、試料中の特定核酸を鋳型として、その上流域にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列及びその下流域に前記特定核酸の核酸配列（特定核酸配列）を有する二本鎖ＤＮＡを生成するＤＮＡ生成工程と、該ＤＮＡ及びＲＮＡポリメレースによって特定核酸配列を有する一本鎖ＲＮＡを生成し測定するＲＮＡ生成・測定工程からなり、ここで該ＲＮＡ生成・測定工程は、ＤＮＡ生成工程終了後、その反応液に少なくともＲＮＡポリメレース、リボヌクレオシド三燐酸及び生成されるＲＮＡに相補的な配列を含む、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが存在することによって開始され、かつ、一定温度において実施され、反応液の蛍光強度を測定する工程を含み、デネーチャーリング・アニーリングからなるハイブリダイゼーション操作及び該工程により生成されるＲＮＡと複合体を形成していないプローブを分離する操作を含まないことを特徴とする特定核酸分析方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
ＤＮＡ生成工程では、特定核酸を鋳型として、その上流域にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を、その下流域に特定核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡを生成する。当該工程は、特定核酸配列に相補的な配列からなる一組のプライマーを用い、その一方のプライマーはその５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有すプロモータープライマーであって、さらにＤＮＡポリメレース及びデオキシリボヌクレオシド三燐酸を用いることで実施できる。
【００１８】
すなわち、前記のような一組のプライマーを用い、ＤＮＡポリメレースを複数回作用させてＤＮＡ伸張反応を行うことにより、前記のような二本鎖ＤＮＡが生成されるのである。
【００１９】
本発明において使用するＤＮＡポリメレースは、特に制限はなく、例えば大腸菌ＤＮＡポリメレースＩＩＩ、クレノウフラグメント、Ｔ４ ＤＮＡポリメレース、Ｔ７ ＤＮＡポリメレース、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメレース、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメレース等を用いることができる。
【００２０】
本発明で用いられるプロモータープライマーは、前述の通り、５’末端から３’末端に向かって、少なくとも、ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、特定核酸配列に相補的な配列を順次有するように設計される。特定核酸に相補的な配列部分は、特定核酸配列の全体に相補的である必要はなく、特定核酸配列の一部に対してであれば良い。当該部分の長さは、特定核酸に相補的な核酸に対する特異性を担保するため、６―１００ヌクレオチド、特に１０―３０ヌクレオチドとすることが好ましい。なお、プロモータープライマーにおけるＲＮＡポリメレースのプロモーター配列と特定核酸配列に相補的な配列部分は、いずれの配列とも関係しない少数の塩基（リンカー塩基）を介して結合されていても良い。ＤＮＡ生成工程において、特定核酸がＲＮＡである場合には、前述したようなＤＮＡの伸長反応を行う前に、特定核酸を鋳型とするｃＤＮＡの合成を行えばよい。この操作には、特定核酸配列に相補的な配列を含む前述の一組のプライマー、逆転写酵素及び逆転写酵素の基質であるデオキシリボヌクレオシド三燐酸を使用すれば良い。ここで使用するプライマーは、前述のＤＮＡ生成工程における、一組のプライマーのうち少なくとも一方のプライマーであってもよいが、その場合は、ｃＤＮＡ合成に引き続いて行われるＤＮＡポリメレースの作用による二本鎖ＤＮＡの合成において、他方のプライマーが反応液に添加される必要がある。尚、逆転写酵素に特に制限はなく、商業的に容易に入手可能なものが利用可能である。さらに、逆転写活性を有するＤＮＡポリメレースを用いれば、前記の一組のプライマー、該ＤＮＡポリメレース及びデオキシリボヌクレオシド三燐酸を混合して試料に添加しておけば、ｃＤＮＡの生成操作と上記二本鎖ＤＮＡ生成操作とを連続的に実施することができる。
【００２１】
ＤＮＡ生成工程に続くＲＮＡ生成・測定工程では、生成した二本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメレースを作用させ、特定核酸配列を有する一本鎖ＲＮＡを生成するとともに、該生成したＲＮＡを測定する。
【００２２】
この工程は、ＤＮＡ生成工程の終了後、その反応液に少なくともＲＮＡポリメレース、リボヌクレオシド３燐酸及び生成されるＲＮＡに相補的な配列を有するインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが存在することによって開始される。従って、ＤＮＡ生成工程後、これら試薬を添加するのみで、ＲＮＡ生成・測定工程を開始することができる。上記プローブは生成されたＲＮＡと相補結合を形成し、該プローブに標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光特性が変化する。そこで、反応液の蛍光強度を測定することによって、試料中に特定核酸が存在していたか否か及びその初期量を決定することができる。 ＲＮＡ生成・測定工程で使用するＲＮＡポリメレースには特に制限はなく、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメレースやＴ３ ポリメレース、ＳＰ６ ＲＮＡポリメレースなどの商業的に容易に入手可能なものが使用できる。
【００２３】
本発明で使用するプローブは、ＲＮＡポリメレースの作用によって生成されるＲＮＡに特異的に相補的結合するオリゴヌクレオチドを、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションしてその蛍光特性が変化するインターカレーター蛍光色素で標識したものである（特願平７−１８５５９９号公報／ＥＰ公開第７１４９８６号公報／Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６）参照）。ここで、インターカレーター性蛍光色素としては、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションし蛍光特性が変化するものであれば特に制限はないが、インターカレーションにより蛍光強度が増加する性質を有するものが測定の容易性等の点から好ましく、特に蛍光強度の変化の著しいチアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー又はそれらの誘導体が好ましい。
【００２４】
インターカレーター性蛍光色素は、共有結合等によってオリゴヌクレオチドへ標識されるが、適当な分子長のリンカーを介して標識されてもよい。リンカーとしては、インターカレーター性蛍光色素が二本鎖ＤＮＡにインターカレーションすることを妨げない分子であれば特に制限はないが、両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選択されるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾を行う上で簡便で好ましい。また例えば、市販の試薬セット（Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用することもできる。インターカレーター性蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの標識部位は、オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端又は中央部分等、インターカレーター性蛍光色素の二本鎖ＤＮＡへのインターカレーションが妨げられず、かつ、オリゴヌクレオチドのＲＮＡとの相補結合を阻害しない限り、いずれの部位であっても良い。なお、プローブのＲＮＡに相補的な塩基配列の長さは、ＲＮＡに対する特異性を担保するため、６―１００ヌクレオチド、特に１０―３０ヌクレオチドとすることが好ましい。 以上のように、本願発明の分析方法では、インターカレーター蛍光色素で標識したプローブの存在下でＲＮＡポリメレースを作用させることによって、該プローブが転写産物であるＲＮＡと相補結合することから、デネーチャーリング・アニーリングからなるハイブリダイゼーション操作を一切行うことなく、反応液の蛍光の測定から試料中の標的核酸の有無及び量を高精度に分析することが可能となる。すなわち、試料中の特定核酸の初期量に依存して生成されるＲＮＡが該プローブと相補結合を形成すると、該プローブに標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光特性が変化することから、相補結合に寄与しなかった余剰のプローブを分離する工程を必要とせずに、その相補結合の形成の有無及び形成された相補結合体の定量が可能となり、特定の核酸配列からなる核酸の均一系での簡便な一段階の分析方法が提供されるのである。
【００２５】
本発明のＤＮＡ生成工程において、ＰＣＲ法を行うことも可能である。これにより、ＤＮＡ生成工程において、上流域にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有し下流域に特定核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ配列の生成量を増幅しておき、これを前述のＲＮＡ生成・測定工程に供すればよい。ＰＣＲ法による増幅操作を行う場合には、ＤＮＡ生成工程において、前記のような一組のプライマーを使用し、デネーチャーリングとアニーリングのための加温・冷却操作等を繰り返すという、通常のＰＣＲ法を実施すればよい。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２７】
図１は、試料中の特定核酸が一本鎖ＲＮＡの場合について示したものである。ＤＮＡ生成工程では、先ず、逆転写用のプライマー及びデオキシリボヌクレオシド三燐酸の存在下、逆転写酵素によって特定核酸のｃＤＮＡを合成する。合成されたｃＤＮＡは、特定核酸配列に対して相補的な配列を有する。
【００２８】
この反応液に、特定核酸配列の５’側と同一の配列を有するプロモータープライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメレースを添加し、ＰＣＲ法を行う。これによって、５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を有する二本鎖ＤＮＡが得られる。
【００２９】
引き続き、ＲＮＡ生成・測定工程に移る。反応液にインターカレーター性蛍光色素で標識したプローブ、ＲＮＡポリメレース及びリボヌクレオシド三燐酸を含む試薬を添加し、ＲＮＡポリメレースの至適温度にてインキュベーションを行う。ＲＮＡポリメレースの作用によって、ＤＮＡ生成工程において生成されたプロモーター領域を有する二本鎖ＤＮＡをもとに、特定核酸配列を有するＲＮＡが転写される。転写されたＲＮＡは反応液中に共存するインターカレーター性蛍光色素で標識したプローブと相補結合を形成し、複合体の形成量に依存して蛍光強度が増大する。従って、この工程の前後、又は工程中の反応液の蛍光強度を測定することにより、特定核酸の有無及び当初の特定核酸量を分析することができる。
【００３０】
試料中の特定核酸が二本鎖ＤＮＡの場合は、前記プライマー及びプロモータープライマーから成る一組のプライマー、デオキシリボヌクレオシド三燐酸及び耐熱性ＤＮＡポリメレースを添加しＰＣＲを行えば、ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を有する二本鎖ＤＮＡを生成することができるため、以後の操作を前記と同様に実施すれば良い。
【００３１】
実施例１
本発明の分析方法により、組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡを測定し、その検出下限界を評価した。
【００３２】
（１）組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡ（加藤らの塩基番号１〜１８６３を含む／Kato, N., Hijikata, M., Ootsuyama, Y., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528）を、以下の組成のＲＮＡ希釈液で５０、１０、５、０コピー／１０μl となるように希釈し、検体とした。
ＲＮＡ希釈液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
１００μｌ／ｍｌ酵母ＲＮＡ
（２）以下の組成の反応液５μｌをＰＣＲ用チューブに分注し、これに上記検体１０μｌを添加した。
反応液の組成
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
１５０ｍＭ ＫＣｌ
１３．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
４．３ｍＭ ＮＴＰｓ
３ｍＭ ＤＴＴ
３Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
６Ｕ／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素
３．６μＭ プライマー；
５’−ＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣ−３’
（３）サーマルサイクラーにて以下の条件で逆転写反応を行った。
逆転写反応条件
４２℃ １０分間
９９℃ ６分間
（４）以下の組成のＰＣＲ反応液６０μｌを添加した。
ＰＣＲ反応液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
５０ｍＭ ＫＣｌ
１．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．０２５％ ノニデットＰ−４０
３７．５Ｕ／ｍｌ ホットスタート専用ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
０．３μＭ プロモータープライマー；
（５）サーマルサイクラーにて以下の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ条件
（ａ）９５℃ ９分間
引き続き以下の（ｂ）〜（ｄ）より成るサイクルを４０サイクル行
った。
（ｂ）９５℃ ３０秒間
（ｃ）６５℃ ３０秒間
（ｄ）７２℃ １分間
（６）得られたＰＣＲ反応液７０μｌに下記組成の転写反応液６５．３μｌを混合しこの混合液を蛍光分光光度計内にて３７℃に保温した石英セルに移した。
転写反応液の組成
７５．３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１５．１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０．７ｍＭ ＤＴＴ
０．８６ｍＭ ＮＴＰｓ
４．３ｍＭ スペルミジン
２．２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
５３．６ｎＭ ＹＯ−２７１（インターカレーター性蛍光色素標識プローブ）；
５’−ＣＴＣＧＣ＊ＧＧＧＧＧＣＴＧ−３’
（＊は、インターカレーター性蛍光色素の標識位置を示す）
（７）引き続き、上記反応液に３０Ｕ／μｌのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ４．７μｌを添加して全量１４０μｌとし、３７℃にて蛍光強度を３０分間モニターした（励起波長4 ９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）。
【００３３】
（８）０コピーの蛍光増加の平均と標準偏差をもとめ、（平均値）＋３×（標準偏差）を当法の判定基準とした。
【００３４】
３０分間における蛍光増加と検出率を図２に示した。１０コピーの蛍光増加は０コピーと有意な差が認められ（ｔ検定、有意水準1%）、１０コピーの組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡが検出可能であった。
【００３５】
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの添加直後に反応液を一部採取し、アガロース電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色したときのバンド黒化度からＤＮＡ量を定量した結果と蛍光増加との相関関係を図３に示した。ＰＣＲ生成量と蛍光増加は良好な相関を示した。以上から、本発明によって試料中の特定核酸を配列特異的に高感度に分析できることが確認できた。
【００３６】
実施例２
本発明の分析方法により慢性Ｃ型肝炎患者血清２０検体を測定し、市販のＨＣＶ ＲＮＡ検出キット（アンプリコアＨＣＶ、日本ロシュ製）との相関を評価した。
【００３７】
（１）有機溶媒及び蛋白質変性剤をを用いて、慢性Ｃ型肝炎患者血清２０検体のそれぞれ１２０μｌから核酸を抽出した。
【００３８】
（２）上記の市販キットを用いた測定においては、抽出した核酸沈殿を付属の検体希釈液７２μｌに溶解し、このうち５０μｌを測定に用いた。また測定操作は該添付文書に従った。
【００３９】
（３）本発明においては、抽出した核酸沈殿を下記組成の検体希釈液１４μｌに溶解しこのうち１０μｌを測定に用いた。分析操作は実施例１と同様である。
検体希釈液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
１００μｇ／ｍｌ 酵母ＲＮＡ
１ｍＭ ＤＴＴ
２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
（４）市販キットにより陰性（−／−）と判定された検体について、反応時間３０分間における蛍光増加を算出し、標準偏差を求めた。（蛍光増加の平均値）＋３×（標準偏差）を当法の判定基準（３．３）とした。
【００４０】
市販キットとの相関を表に示す。市販キットで（＋／−）と判定されたものを判定保留とし、陰性（−／−）及び陽性（＋／＋）と判定されたものについて当法の判定結果と比較すると、一致率は８１．３％（｛（４＋９）／（７＋９）｝×１００＝１３／１６×１００＝８１．３）であった。
【００４１】
【表１】
【００４２】
以上より、本発明の分析方法が、従来法に比してより簡便に臨床試料中の特定核酸の検出が可能であることが確認できた。
【００４３】
実施例３
本発明の分析方法により組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡを測定し、検出系の検出下限界を評価した。
【００４４】
（１）組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡ（加藤らの塩基番号１〜１８６３を含む）をＲＮＡ希釈液で５０、１０、５、１、０コピー／１０μｌとなるように希釈し、検体とした。なお、ＲＮＡ希釈液は実施例１と同様である。
【００４５】
（２）下記組成の反応液５μｌをＰＣＲ用チューブに分注し、これに検体１０μｌを添加した。
反応液の組成
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
１５０ｍＭ ＫＣｌ
１３．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
４．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ
３ｍＭ ＤＴＴ
３Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
６Ｕ／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素
３．６μＭ プライマー；
５’−ＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ−３’
（３）サーマルサイクラーにて下記条件にて逆転写反応を行った。
逆転写反応条件
４２℃ １０分間
９９℃ ６分間
（４）下記組成のＰＣＲ反応液６０μｌを添加した。
ＰＣＲ反応液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
５０ｍＭ ＫＣｌ
１．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．０２５％ ノニデットＰ−４０
３７．５Ｕ／ｍｌ ホットスタート専用Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．３μｌ プロモータープラマー；
（５）サーマルサイクラーにて下記条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ条件
（ａ）９５℃ ９分間
引き続き、以下の（ｂ）〜（ｄ）より成るサイクルを４０サイクル行った。
（ｂ）９５℃ ３０秒間
（ｃ）６７℃ ３０秒間
（ｄ）７２℃ １分間
（６）得られたＰＣＲ反応液７０μｌに転写反応液６５．３μｌを混合し、これを蛍光分光光度計内にて３７℃に保温した蛍光石英セルに移した。転写反応液は実施例１と同様である。
【００４６】
（７）引き続き、上記反応液に３０Ｕ／μｌのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ４．７μｌを添加して全量を１４０μｌとし、３７℃にて蛍光強度を３０分間モニターした（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）。
【００４７】
（８）０コピーの蛍光増加の平均と標準偏差をもとめ、（平均値）＋３×（標準偏差）を当法の判定基準とした。
【００４８】
各濃度についての蛍光増加と検出率を図４に示す。１０コピー以上の組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡを含む試料では、それらの全てを陽性として検出可能であった。５コピーではそれらの８７．５％が検出可能であった。以上から、本発明によって特定核酸を配列特異的に高感度に検出できることが確認できた。
【００４９】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、特定核酸を含むと予想される試料の分析において、蛍光強度等を測定するＲＮＡ生成・測定工程に際し、担体を使用することなく、かつ、相補結合に寄与しなかった余剰プローブの分離を行うことなしに、その存在の有無及び量を均一系で、簡便に分析することが可能である。しかも、本発明では、該工程に際してデネーチャーリング・アニーリングという操作を行う必要はなく、一定温度にて、単に必要な試薬を反応液に添加しその蛍光強度等を測定すればよいことから、該試薬の接触という一段階の操作のみで実施することが可能である。
【００５０】
すなわち、本発明によれば、プローブがＲＮＡ生成・測定工程で生成されるＲＮＡ（特定核酸配列と同一の塩基配列を有する）と相補結合を形成すると、プローブに標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光強度の増加等、その蛍光特性が変化することから、相補結合に寄与しなかった余剰プローブを分離する工程を必要とせずに、その相補結合の形成の有無の検出及び形成された相補結合体の定量が可能となることから、用いるインターカレーター性蛍光色素の励起波長及び蛍光波長において光学的に透明な材質の容器を使用すれば、試料容器内部から反応液を採取して分析する必要がなくなり、増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題を回避しつつ、連続的な分析が可能となる。
【００５１】
また、本発明によれば、プローブが特定核酸配列を特異的に識別し相補結合を形成することによって蛍光特性が変化することから、ＤＮＡ生成工程にいてＰＣＲを実施した場合であって、プライマーダイマー等の副産物が生成した場合でも、プライマーダイマーは、プローブとの複合体形成に関与せず、従って反応液の蛍光特性の変化に寄与しない。そこで、反応液の蛍光特性の変化を測定することによって、ＰＣＲ後にプライマーダイマーの分離を行うことなしに、特定核酸のみを配列特異的に分析することが可能である。さらに、本発明によれば、ＲＮＡ生成・測定工程は、ＤＮＡ生成工程の終了後に、その反応液にＲＮＡポリメレース、リボヌクレオシド三燐酸及びプローブを添加する等することで開始できるのであるから、反応液を容器間で移し換える等の煩雑な操作が不要となり、臨床診断等で用いるのに極めて簡便な分析法が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は試料中の標的核酸が一本鎖ＲＮＡの場合の概要の一例を示す図である。
【図２】図２は本発明の分析方法によって組換え体ＨＣＶ ＲＮＡを測定したときの初期コピ−数と蛍光強度とを示す図である。図中、縦軸は、ｉｎ ｖｉｔｏｒｏ転写３０分間に増加した蛍光強度を示す。
【図３】図３は本発明の分析方法によって組換え体ＨＣＶ ＲＮＡを測定したときの標的核酸のＰＣＲ産物量と蛍光強度とを示す図である。
【図４】図４は本発明の分析方法によって組換え体ＨＣＶ ＲＮＡを測定したときの初期コピー数と蛍光強度とを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合中に含まれると予想される特定核酸を定性又は定量するための分析方法に関し、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用、有用遺伝子のクローニングでの利用、並びに未知遺伝子の探索等の分野での利用に有用であり、更には、遺伝子を増幅する工程に関する反応条件を最適化する方法としても有用である。
【０００２】
【従来の技術】
特定核酸の分析には、特定核酸配列がその塩基配列と相補的な配列を有するプローブ（核酸プローブ）と相補結合を形成する性質が利用されている。
【０００３】
例えば従来より、特定核酸の異なる部位の特定配列に対して相補結合を形成し得る配列からなる二種類のプローブを用いるサンドイッチアッセイと呼ばれる方法が知られている。この方法では、第一のプローブは不溶性担体に固定化されており、一方第二のプローブはその一部に可視部に色を持つ色素や蛍光物質あるいはそれらを生成し得る酵素で標識されている。そして、試料にこれらのプローブを添加し、試料中の特定核酸を第一及び第二のプローブと相補結合させ、これら３者からなる複合体を不溶性担体上に形成させる。引き続き、試料反応液中の上清と不溶性担体とを分離し、上記複合体を形成していない第二のプローブを分離する（Ｂ／Ｆ分離工程）。しかる後、不溶性担体上の複合体中の標識物質を測定することにより、試料中の特定核酸の有無及び量を決定するのである。ここで、可視部に色を持つ色素や蛍光物質を生成し得る酵素を第二の標識として用いる場合は、上記複合体形成工程後、複合体を形成していない第二プローブを除去した後に、それらの前駆体である酵素基質を試料反応液に添加し、その反応産物である色素や蛍光物質を測定することにより、試料中の標的核酸の有無及びその量を決定する。
【０００４】
近年、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法が開発されたことにより、試験管内条件下で試料中の特定核酸の特定領域を増幅し、分析するに充分な量を調製することが可能となったことから、ＰＣＲ法を用いて試料中の特定核酸の特定領域を増幅した後、その反応液を試料として上記のサンドイッチアッセイによって増幅産物を測定することで、増幅前の試料中の特定核酸の有無及ぶ量を決定することも行われている。また、特定核酸配列の特定領域に相補的な配列からなるプローブを、前記ＰＣＲ法等によって増幅後、その反応液に添加して増幅核酸と相補結合を形成する条件下においた後、形成された複合体を電気泳動法によって未反応のプローブから分離することにより、増幅後の増幅産物の分析を行う方法も提案されている。
【０００５】
サンドイッチアッセイでは、反応液中に不溶性担体を利用することから、第二のプローブがこの不溶性担体に非特異的に吸着し、不溶性担体上の複合体中の標識を測定する段階で、この不溶性担体上に非特異的に吸着した第二のプローブの標識の存在により測定結果に誤差が生じ、試料中の特定核酸の有無及びその量を決定する際に問題が生じる。特に、ウイルス感染症の診断では、臨床試料中の極微量のウイルス核酸を良好な再現性で高感度に検出することが要求されることから、上記の非特異的吸着に由来する問題は解決すべき重要な課題となっている。この問題を回避する目的で、不溶性担体表面の親水化処理、蛋白質等による担体表面の吸着点のブロッキング、Ｂ／Ｆ分離工程に続いて不溶性担体を十分洗浄すること等が試みられている。
【０００６】
しかしながら、担体表面を化学的に親水化処理等することは、その可否が担体の材質に依存するうえ、技術的に必ずしも容易ではない。また担体表面の吸着点を予めブロッキングする目的で担体表面を蛋白質によって被覆する方法では、その蛋白質が第二のプローブの核酸部分又は標識と相互作用し、担体への新たな非特異的吸着を招く可能性もある。更に、Ｂ／Ｆ分離工程においては、不溶性担体の洗浄回数を増やすことは操作上の限界があり、例えば洗浄液に界面活性剤を添加する等した場合、担体上に形成されている複合体の分解を促す可能性もある。
【０００７】
また、ＰＣＲ法により特定核酸の特定領域を増幅した後にサンドイッチアッセイを行う場合は、ＰＣＲによる増幅産物が二本鎖ＤＮＡであることから、プローブと増幅された核酸との相補結合を形成させるには、増幅反応液へプローブを添加後、増幅産物である二本鎖ＤＮＡを一旦融解し一本鎖とするための加温操作 （デネーチャーリング／denaturing）と、その後冷却してプローブＤＮＡに標的ＤＮＡとの二本鎖ＤＮＡを形成させるための操作（アニーリング／annealing ）が不可欠となり、効率性と経済性を一般的要求とする臨床診断の現場に対して新たな労力と分析時間を要求することとなる。
【０００８】
前記した電気泳動法を利用する分析法においては、特に、ＰＣＲ終了後、反応容器から増幅された分析用試料を取り出す必要があり、ＰＣＲ法の実際的な応用における課題とされる、増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題をも生じる。
【０００９】
そこで、上記のような担体を使用せず、プローブの標識を測定するに際してデネーチャーリング・アニーリングからなる操作を含まず、かつ、可能な限りＰＣＲ等により増幅された核酸の飛散を排除し得る分析法の開発が求められることとなる。
【００１０】
担体を使用しない分析法として、インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを行い、反応液の蛍光を測定することによる分析法が提案されている（例えば、特開平５−２３７０００号公報／医学のあゆみ、１７３（１２）、９５９−９６３（１９９５）／Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２９、２０７−２１３（１９９５）等参照）。すなわち、ＰＣＲによる増幅産物が二本鎖ＤＮＡであることから、二本鎖核酸にインターカレーションし蛍光強度が増大する等、その蛍光特性が変化する性質を有するインターカレーター性蛍光色素を用い、これをＰＣＲによる増幅操作前に予め試料溶液に添加し、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定することにより、増幅前の標的核酸の有無及び量を決定するのである。
【００１１】
この方法によれば、密閉した反応容器内部の反応液の蛍光強度の測定からＰＣＲの進行を追跡することが可能となり、試料容器内部から反応液を採取して分析する必要がないため、増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題を回避することが可能となる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
このように、インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを行い、反応液の蛍光を測定することによる分析法は、担体を使用しない、即ち均一な反応液による系（均一系）での一段階の操作による分析法として優れた特徴を有する。
【００１３】
しかしながら、この方法は、インターカレーター性蛍光色素が二本鎖核酸に非特異的にインターカレーションすることに由来して、試料中に特定核酸以外に、例えば大量のゲノムＤＮＡが混在する場合には、インターカレーター性蛍光色素がこれらにもインターカレーションすることによって大きなバックグラウンドが生じ、特定核酸の増幅に由来する蛍光特性の変化を高精度で測定することが困難になるという課題があった。また、ＰＣＲ法では、特定核酸の特定の領域に相補的な一対の核酸を伸長反応のプラマーとして用いるが、このプライマーの配列によってはこれらが互いに相補結合する場合があり、その場合、互いに他方のプライマーを鋳型としてプライマーダイマーが生産されることになる。インターカレーター性蛍光色素は、プライマーダイマーへも非特異的にインターカレーションすることから、これに由来するバックグラウンドの増加が、本来目標とする特定核酸の増幅に基づく蛍光特性の変化を経時的に追跡する上で課題となる。
【００１４】
そこで、この解決策として、標的核酸の特定配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識し、特定核酸と相補結合すると形成された二本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレーションしその蛍光特性を変化するように設計した、特定の核酸配列の認識機能を具備するインターカレーター性蛍光色素標識プローブを用いる核酸の分析法が開発された（特願平７−１８５５９９号公報／ＥＰ公開第７１４９８６号公報／Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７ （１９９６））参照）。この方法によれば、プローブが特定核酸と相補結合を形成すると標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光特性が変化することから、相補結合を形成していないプローブを分離することなく、その相補結合の形成の有無及び形成された相補結合体の定量が可能となる。また、該プローブを特定核酸の増幅に先だって試料に添加しておけば、増幅工程中の反応液の蛍光強度を測定することにより、標的核酸の増幅されていく様子を配列特異的に経時的に追跡することも可能となる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、インターカレーター性蛍光色素を用いる特定核酸配の分析方法において、試料中に大量のゲノムＤＮＡが存在する場合や、分析に先立つＰＣＲ法による増幅操作においてプライマーダイマーが生産された場合であっても特定核酸配列に特異的に高精度の分析が可能で、かつ、余剰プローブ等の分離操作やデネーチャーリング・アニーリング操作を行うことなく、一定温度にてその存在の有無及び量を決定することが可能な担体を使用しない均一系での分析方法を提供することを目的として検討を行い、その結果、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、特定核酸を含むと予想される試料中の特定核酸の分析において、試料中の特定核酸を鋳型として、その上流域にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列及びその下流域に前記特定核酸の核酸配列（特定核酸配列）を有する二本鎖ＤＮＡを生成するＤＮＡ生成工程と、該ＤＮＡ及びＲＮＡポリメレースによって特定核酸配列を有する一本鎖ＲＮＡを生成し測定するＲＮＡ生成・測定工程からなり、ここで該ＲＮＡ生成・測定工程は、ＤＮＡ生成工程終了後、その反応液に少なくともＲＮＡポリメレース、リボヌクレオシド三燐酸及び生成されるＲＮＡに相補的な配列を含む、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが存在することによって開始され、かつ、一定温度において実施され、反応液の蛍光強度を測定する工程を含み、デネーチャーリング・アニーリングからなるハイブリダイゼーション操作及び該工程により生成されるＲＮＡと複合体を形成していないプローブを分離する操作を含まないことを特徴とする特定核酸分析方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
ＤＮＡ生成工程では、特定核酸を鋳型として、その上流域にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を、その下流域に特定核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡを生成する。当該工程は、特定核酸配列に相補的な配列からなる一組のプライマーを用い、その一方のプライマーはその５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有すプロモータープライマーであって、さらにＤＮＡポリメレース及びデオキシリボヌクレオシド三燐酸を用いることで実施できる。
【００１８】
すなわち、前記のような一組のプライマーを用い、ＤＮＡポリメレースを複数回作用させてＤＮＡ伸張反応を行うことにより、前記のような二本鎖ＤＮＡが生成されるのである。
【００１９】
本発明において使用するＤＮＡポリメレースは、特に制限はなく、例えば大腸菌ＤＮＡポリメレースＩＩＩ、クレノウフラグメント、Ｔ４ ＤＮＡポリメレース、Ｔ７ ＤＮＡポリメレース、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメレース、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメレース等を用いることができる。
【００２０】
本発明で用いられるプロモータープライマーは、前述の通り、５’末端から３’末端に向かって、少なくとも、ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、特定核酸配列に相補的な配列を順次有するように設計される。特定核酸に相補的な配列部分は、特定核酸配列の全体に相補的である必要はなく、特定核酸配列の一部に対してであれば良い。当該部分の長さは、特定核酸に相補的な核酸に対する特異性を担保するため、６―１００ヌクレオチド、特に１０―３０ヌクレオチドとすることが好ましい。なお、プロモータープライマーにおけるＲＮＡポリメレースのプロモーター配列と特定核酸配列に相補的な配列部分は、いずれの配列とも関係しない少数の塩基（リンカー塩基）を介して結合されていても良い。ＤＮＡ生成工程において、特定核酸がＲＮＡである場合には、前述したようなＤＮＡの伸長反応を行う前に、特定核酸を鋳型とするｃＤＮＡの合成を行えばよい。この操作には、特定核酸配列に相補的な配列を含む前述の一組のプライマー、逆転写酵素及び逆転写酵素の基質であるデオキシリボヌクレオシド三燐酸を使用すれば良い。ここで使用するプライマーは、前述のＤＮＡ生成工程における、一組のプライマーのうち少なくとも一方のプライマーであってもよいが、その場合は、ｃＤＮＡ合成に引き続いて行われるＤＮＡポリメレースの作用による二本鎖ＤＮＡの合成において、他方のプライマーが反応液に添加される必要がある。尚、逆転写酵素に特に制限はなく、商業的に容易に入手可能なものが利用可能である。さらに、逆転写活性を有するＤＮＡポリメレースを用いれば、前記の一組のプライマー、該ＤＮＡポリメレース及びデオキシリボヌクレオシド三燐酸を混合して試料に添加しておけば、ｃＤＮＡの生成操作と上記二本鎖ＤＮＡ生成操作とを連続的に実施することができる。
【００２１】
ＤＮＡ生成工程に続くＲＮＡ生成・測定工程では、生成した二本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメレースを作用させ、特定核酸配列を有する一本鎖ＲＮＡを生成するとともに、該生成したＲＮＡを測定する。
【００２２】
この工程は、ＤＮＡ生成工程の終了後、その反応液に少なくともＲＮＡポリメレース、リボヌクレオシド３燐酸及び生成されるＲＮＡに相補的な配列を有するインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが存在することによって開始される。従って、ＤＮＡ生成工程後、これら試薬を添加するのみで、ＲＮＡ生成・測定工程を開始することができる。上記プローブは生成されたＲＮＡと相補結合を形成し、該プローブに標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光特性が変化する。そこで、反応液の蛍光強度を測定することによって、試料中に特定核酸が存在していたか否か及びその初期量を決定することができる。 ＲＮＡ生成・測定工程で使用するＲＮＡポリメレースには特に制限はなく、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメレースやＴ３ ポリメレース、ＳＰ６ ＲＮＡポリメレースなどの商業的に容易に入手可能なものが使用できる。
【００２３】
本発明で使用するプローブは、ＲＮＡポリメレースの作用によって生成されるＲＮＡに特異的に相補的結合するオリゴヌクレオチドを、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションしてその蛍光特性が変化するインターカレーター蛍光色素で標識したものである（特願平７−１８５５９９号公報／ＥＰ公開第７１４９８６号公報／Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６）参照）。ここで、インターカレーター性蛍光色素としては、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションし蛍光特性が変化するものであれば特に制限はないが、インターカレーションにより蛍光強度が増加する性質を有するものが測定の容易性等の点から好ましく、特に蛍光強度の変化の著しいチアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー又はそれらの誘導体が好ましい。
【００２４】
インターカレーター性蛍光色素は、共有結合等によってオリゴヌクレオチドへ標識されるが、適当な分子長のリンカーを介して標識されてもよい。リンカーとしては、インターカレーター性蛍光色素が二本鎖ＤＮＡにインターカレーションすることを妨げない分子であれば特に制限はないが、両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選択されるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾を行う上で簡便で好ましい。また例えば、市販の試薬セット（Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用することもできる。インターカレーター性蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの標識部位は、オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端又は中央部分等、インターカレーター性蛍光色素の二本鎖ＤＮＡへのインターカレーションが妨げられず、かつ、オリゴヌクレオチドのＲＮＡとの相補結合を阻害しない限り、いずれの部位であっても良い。なお、プローブのＲＮＡに相補的な塩基配列の長さは、ＲＮＡに対する特異性を担保するため、６―１００ヌクレオチド、特に１０―３０ヌクレオチドとすることが好ましい。 以上のように、本願発明の分析方法では、インターカレーター蛍光色素で標識したプローブの存在下でＲＮＡポリメレースを作用させることによって、該プローブが転写産物であるＲＮＡと相補結合することから、デネーチャーリング・アニーリングからなるハイブリダイゼーション操作を一切行うことなく、反応液の蛍光の測定から試料中の標的核酸の有無及び量を高精度に分析することが可能となる。すなわち、試料中の特定核酸の初期量に依存して生成されるＲＮＡが該プローブと相補結合を形成すると、該プローブに標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光特性が変化することから、相補結合に寄与しなかった余剰のプローブを分離する工程を必要とせずに、その相補結合の形成の有無及び形成された相補結合体の定量が可能となり、特定の核酸配列からなる核酸の均一系での簡便な一段階の分析方法が提供されるのである。
【００２５】
本発明のＤＮＡ生成工程において、ＰＣＲ法を行うことも可能である。これにより、ＤＮＡ生成工程において、上流域にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有し下流域に特定核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ配列の生成量を増幅しておき、これを前述のＲＮＡ生成・測定工程に供すればよい。ＰＣＲ法による増幅操作を行う場合には、ＤＮＡ生成工程において、前記のような一組のプライマーを使用し、デネーチャーリングとアニーリングのための加温・冷却操作等を繰り返すという、通常のＰＣＲ法を実施すればよい。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２７】
図１は、試料中の特定核酸が一本鎖ＲＮＡの場合について示したものである。ＤＮＡ生成工程では、先ず、逆転写用のプライマー及びデオキシリボヌクレオシド三燐酸の存在下、逆転写酵素によって特定核酸のｃＤＮＡを合成する。合成されたｃＤＮＡは、特定核酸配列に対して相補的な配列を有する。
【００２８】
この反応液に、特定核酸配列の５’側と同一の配列を有するプロモータープライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメレースを添加し、ＰＣＲ法を行う。これによって、５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を有する二本鎖ＤＮＡが得られる。
【００２９】
引き続き、ＲＮＡ生成・測定工程に移る。反応液にインターカレーター性蛍光色素で標識したプローブ、ＲＮＡポリメレース及びリボヌクレオシド三燐酸を含む試薬を添加し、ＲＮＡポリメレースの至適温度にてインキュベーションを行う。ＲＮＡポリメレースの作用によって、ＤＮＡ生成工程において生成されたプロモーター領域を有する二本鎖ＤＮＡをもとに、特定核酸配列を有するＲＮＡが転写される。転写されたＲＮＡは反応液中に共存するインターカレーター性蛍光色素で標識したプローブと相補結合を形成し、複合体の形成量に依存して蛍光強度が増大する。従って、この工程の前後、又は工程中の反応液の蛍光強度を測定することにより、特定核酸の有無及び当初の特定核酸量を分析することができる。
【００３０】
試料中の特定核酸が二本鎖ＤＮＡの場合は、前記プライマー及びプロモータープライマーから成る一組のプライマー、デオキシリボヌクレオシド三燐酸及び耐熱性ＤＮＡポリメレースを添加しＰＣＲを行えば、ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を有する二本鎖ＤＮＡを生成することができるため、以後の操作を前記と同様に実施すれば良い。
【００３１】
実施例１
本発明の分析方法により、組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡを測定し、その検出下限界を評価した。
【００３２】
（１）組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡ（加藤らの塩基番号１〜１８６３を含む／Kato, N., Hijikata, M., Ootsuyama, Y., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528）を、以下の組成のＲＮＡ希釈液で５０、１０、５、０コピー／１０μl となるように希釈し、検体とした。
ＲＮＡ希釈液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
１００μｌ／ｍｌ酵母ＲＮＡ
（２）以下の組成の反応液５μｌをＰＣＲ用チューブに分注し、これに上記検体１０μｌを添加した。
反応液の組成
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
１５０ｍＭ ＫＣｌ
１３．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
４．３ｍＭ ＮＴＰｓ
３ｍＭ ＤＴＴ
３Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
６Ｕ／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素
３．６μＭ プライマー；
５’−ＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣ−３’
（３）サーマルサイクラーにて以下の条件で逆転写反応を行った。
逆転写反応条件
４２℃ １０分間
９９℃ ６分間
（４）以下の組成のＰＣＲ反応液６０μｌを添加した。
ＰＣＲ反応液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
５０ｍＭ ＫＣｌ
１．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．０２５％ ノニデットＰ−４０
３７．５Ｕ／ｍｌ ホットスタート専用ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
０．３μＭ プロモータープライマー；
ＰＣＲ条件
（ａ）９５℃ ９分間
引き続き以下の（ｂ）〜（ｄ）より成るサイクルを４０サイクル行
った。
（ｂ）９５℃ ３０秒間
（ｃ）６５℃ ３０秒間
（ｄ）７２℃ １分間
（６）得られたＰＣＲ反応液７０μｌに下記組成の転写反応液６５．３μｌを混合しこの混合液を蛍光分光光度計内にて３７℃に保温した石英セルに移した。
転写反応液の組成
７５．３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１５．１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０．７ｍＭ ＤＴＴ
０．８６ｍＭ ＮＴＰｓ
４．３ｍＭ スペルミジン
２．２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
５３．６ｎＭ ＹＯ−２７１（インターカレーター性蛍光色素標識プローブ）；
５’−ＣＴＣＧＣ＊ＧＧＧＧＧＣＴＧ−３’
（＊は、インターカレーター性蛍光色素の標識位置を示す）
（７）引き続き、上記反応液に３０Ｕ／μｌのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ４．７μｌを添加して全量１４０μｌとし、３７℃にて蛍光強度を３０分間モニターした（励起波長4 ９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）。
【００３３】
（８）０コピーの蛍光増加の平均と標準偏差をもとめ、（平均値）＋３×（標準偏差）を当法の判定基準とした。
【００３４】
３０分間における蛍光増加と検出率を図２に示した。１０コピーの蛍光増加は０コピーと有意な差が認められ（ｔ検定、有意水準1%）、１０コピーの組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡが検出可能であった。
【００３５】
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの添加直後に反応液を一部採取し、アガロース電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色したときのバンド黒化度からＤＮＡ量を定量した結果と蛍光増加との相関関係を図３に示した。ＰＣＲ生成量と蛍光増加は良好な相関を示した。以上から、本発明によって試料中の特定核酸を配列特異的に高感度に分析できることが確認できた。
【００３６】
実施例２
本発明の分析方法により慢性Ｃ型肝炎患者血清２０検体を測定し、市販のＨＣＶ ＲＮＡ検出キット（アンプリコアＨＣＶ、日本ロシュ製）との相関を評価した。
【００３７】
（１）有機溶媒及び蛋白質変性剤をを用いて、慢性Ｃ型肝炎患者血清２０検体のそれぞれ１２０μｌから核酸を抽出した。
【００３８】
（２）上記の市販キットを用いた測定においては、抽出した核酸沈殿を付属の検体希釈液７２μｌに溶解し、このうち５０μｌを測定に用いた。また測定操作は該添付文書に従った。
【００３９】
（３）本発明においては、抽出した核酸沈殿を下記組成の検体希釈液１４μｌに溶解しこのうち１０μｌを測定に用いた。分析操作は実施例１と同様である。
検体希釈液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
１００μｇ／ｍｌ 酵母ＲＮＡ
１ｍＭ ＤＴＴ
２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
（４）市販キットにより陰性（−／−）と判定された検体について、反応時間３０分間における蛍光増加を算出し、標準偏差を求めた。（蛍光増加の平均値）＋３×（標準偏差）を当法の判定基準（３．３）とした。
【００４０】
市販キットとの相関を表に示す。市販キットで（＋／−）と判定されたものを判定保留とし、陰性（−／−）及び陽性（＋／＋）と判定されたものについて当法の判定結果と比較すると、一致率は８１．３％（｛（４＋９）／（７＋９）｝×１００＝１３／１６×１００＝８１．３）であった。
【００４１】
【表１】
以上より、本発明の分析方法が、従来法に比してより簡便に臨床試料中の特定核酸の検出が可能であることが確認できた。
【００４３】
実施例３
本発明の分析方法により組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡを測定し、検出系の検出下限界を評価した。
【００４４】
（１）組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡ（加藤らの塩基番号１〜１８６３を含む）をＲＮＡ希釈液で５０、１０、５、１、０コピー／１０μｌとなるように希釈し、検体とした。なお、ＲＮＡ希釈液は実施例１と同様である。
【００４５】
（２）下記組成の反応液５μｌをＰＣＲ用チューブに分注し、これに検体１０μｌを添加した。
反応液の組成
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
１５０ｍＭ ＫＣｌ
１３．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
４．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ
３ｍＭ ＤＴＴ
３Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
６Ｕ／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素
３．６μＭ プライマー；
５’−ＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ−３’
（３）サーマルサイクラーにて下記条件にて逆転写反応を行った。
逆転写反応条件
４２℃ １０分間
９９℃ ６分間
（４）下記組成のＰＣＲ反応液６０μｌを添加した。
ＰＣＲ反応液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
５０ｍＭ ＫＣｌ
１．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．０２５％ ノニデットＰ−４０
３７．５Ｕ／ｍｌ ホットスタート専用Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．３μｌ プロモータープラマー；
ＰＣＲ条件
（ａ）９５℃ ９分間
引き続き、以下の（ｂ）〜（ｄ）より成るサイクルを４０サイクル行った。
（ｂ）９５℃ ３０秒間
（ｃ）６７℃ ３０秒間
（ｄ）７２℃ １分間
（６）得られたＰＣＲ反応液７０μｌに転写反応液６５．３μｌを混合し、これを蛍光分光光度計内にて３７℃に保温した蛍光石英セルに移した。転写反応液は実施例１と同様である。
【００４６】
（７）引き続き、上記反応液に３０Ｕ／μｌのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ４．７μｌを添加して全量を１４０μｌとし、３７℃にて蛍光強度を３０分間モニターした（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）。
【００４７】
（８）０コピーの蛍光増加の平均と標準偏差をもとめ、（平均値）＋３×（標準偏差）を当法の判定基準とした。
【００４８】
各濃度についての蛍光増加と検出率を図４に示す。１０コピー以上の組み換え体ＨＣＶ ＲＮＡを含む試料では、それらの全てを陽性として検出可能であった。５コピーではそれらの８７．５％が検出可能であった。以上から、本発明によって特定核酸を配列特異的に高感度に検出できることが確認できた。
【００４９】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、特定核酸を含むと予想される試料の分析において、蛍光強度等を測定するＲＮＡ生成・測定工程に際し、担体を使用することなく、かつ、相補結合に寄与しなかった余剰プローブの分離を行うことなしに、その存在の有無及び量を均一系で、簡便に分析することが可能である。しかも、本発明では、該工程に際してデネーチャーリング・アニーリングという操作を行う必要はなく、一定温度にて、単に必要な試薬を反応液に添加しその蛍光強度等を測定すればよいことから、該試薬の接触という一段階の操作のみで実施することが可能である。
【００５０】
すなわち、本発明によれば、プローブがＲＮＡ生成・測定工程で生成されるＲＮＡ（特定核酸配列と同一の塩基配列を有する）と相補結合を形成すると、プローブに標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光強度の増加等、その蛍光特性が変化することから、相補結合に寄与しなかった余剰プローブを分離する工程を必要とせずに、その相補結合の形成の有無の検出及び形成された相補結合体の定量が可能となることから、用いるインターカレーター性蛍光色素の励起波長及び蛍光波長において光学的に透明な材質の容器を使用すれば、試料容器内部から反応液を採取して分析する必要がなくなり、増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題を回避しつつ、連続的な分析が可能となる。
【００５１】
また、本発明によれば、プローブが特定核酸配列を特異的に識別し相補結合を形成することによって蛍光特性が変化することから、ＤＮＡ生成工程にいてＰＣＲを実施した場合であって、プライマーダイマー等の副産物が生成した場合でも、プライマーダイマーは、プローブとの複合体形成に関与せず、従って反応液の蛍光特性の変化に寄与しない。そこで、反応液の蛍光特性の変化を測定することによって、ＰＣＲ後にプライマーダイマーの分離を行うことなしに、特定核酸のみを配列特異的に分析することが可能である。さらに、本発明によれば、ＲＮＡ生成・測定工程は、ＤＮＡ生成工程の終了後に、その反応液にＲＮＡポリメレース、リボヌクレオシド三燐酸及びプローブを添加する等することで開始できるのであるから、反応液を容器間で移し換える等の煩雑な操作が不要となり、臨床診断等で用いるのに極めて簡便な分析法が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は試料中の標的核酸が一本鎖ＲＮＡの場合の概要の一例を示す図である。
【図２】図２は本発明の分析方法によって組換え体ＨＣＶ ＲＮＡを測定したときの初期コピ−数と蛍光強度とを示す図である。図中、縦軸は、ｉｎ ｖｉｔｏｒｏ転写３０分間に増加した蛍光強度を示す。
【図３】図３は本発明の分析方法によって組換え体ＨＣＶ ＲＮＡを測定したときの標的核酸のＰＣＲ産物量と蛍光強度とを示す図である。
【図４】図４は本発明の分析方法によって組換え体ＨＣＶ ＲＮＡを測定したときの初期コピー数と蛍光強度とを示す図である。
Claims (3)
- 特定のＲＮＡからなる特定核酸を含むと予想される試料中の特定核酸の分析方法において、試料中の該特定のＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素及び前記特定核酸配列に相補的なプライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、前記特定核酸配列及び前記ｃＤＮＡ配列に相補的な配列からなる一組のプライマーを用い、ここでプライマーの一方はその５’末端にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有するプロモータープライマーであり、前記一組のプライマー及びＤＮＡポリメレースの存在下で、ポリメレース・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法により、ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列及びその下流域に前記特定核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡを増幅・生成するＤＮＡ生成工程と、当該ＲＮＡポリメレースによって特定核酸を有する一本鎖ＲＮＡを生成し測定するＲＮＡ生成・測定工程からなり、ここで、該ＲＮＡ生成・測定工程は、ＤＮＡ生成工程終了後、少なくともＲＮＡポリメレース、リボヌクレオシド三燐酸及び生成される一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を含むインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブを添加するのみで開始され、反応液の蛍光強度を測定する工程を含み、かつ、一定温度において実施され、デネーチャーリング・アニーリングからなるハイブリダイゼーション操作及び該工程により生成される一本鎖ＲＮＡと複合体を形成していない前記プローブを分離する操作を含まないことを特徴とする特定核酸分析方法。
- 前記ｃＤＮＡを合成するためのプライマーと、前記ＤＮＡ生成工程の特定核酸に相補的なプライマーが同一であることを特徴とする請求項１に記載の特定核酸分析方法。
- 前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、ＲＮＡポリメレースによって生成する一本鎖ＲＮＡとの相補結合によって形成したＲＮＡとプローブとの複合体の間に、そのインターカレーター性蛍光色素がインターカレーションする性質を有し、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化することを特徴とする、請求項１または２に記載の分析方法。
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