JPH09163991A - Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー - Google Patents
Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーInfo
- Publication number
- JPH09163991A JPH09163991A JP8318027A JP31802796A JPH09163991A JP H09163991 A JPH09163991 A JP H09163991A JP 8318027 A JP8318027 A JP 8318027A JP 31802796 A JP31802796 A JP 31802796A JP H09163991 A JPH09163991 A JP H09163991A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amplification
- nucleic acid
- hcv
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
- C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノ
ムの５’非翻訳領域の効率的な逆転写−ポリメラーゼ連
鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を改良することを目的とし
てなされた。 【解決手段】 本発明は、ＨＣＶのＲＴ−ＰＣＲ増幅の
ための配列番号：１、２及び３にて特定される改良され
たオリゴヌクレオチドプライマー類を提供する。さら
に、ＨＣＶ増幅のための前記プライマーを含むキット、
及び前記プライマーの使用を含むＨＣＶ核酸の検出方法
が提供される。
ムの５’非翻訳領域の効率的な逆転写−ポリメラーゼ連
鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を改良することを目的とし
てなされた。 【解決手段】 本発明は、ＨＣＶのＲＴ−ＰＣＲ増幅の
ための配列番号：１、２及び３にて特定される改良され
たオリゴヌクレオチドプライマー類を提供する。さら
に、ＨＣＶ増幅のための前記プライマーを含むキット、
及び前記プライマーの使用を含むＨＣＶ核酸の検出方法
が提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分子生物学及び核
酸化学の分野に関するものである。さらに特定的には、
本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の増幅のため
の方法および試薬に関するものである。従って、本発明
は、ＨＣＶの検出、一般的な医学的診断の分野、及び分
子生物学の分野において応用される。
酸化学の分野に関するものである。さらに特定的には、
本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の増幅のため
の方法および試薬に関するものである。従って、本発明
は、ＨＣＶの検出、一般的な医学的診断の分野、及び分
子生物学の分野において応用される。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】Ｃ型肝炎ウイルスは、
単一の正のセンスの、約１０，０００ヌクレオチドの長
さを有するＲＮＡ分子を含んだ小型のＲＮＡウイルスで
ある。原型的ＨＣＶは、Choo等、1989, Science 244:
359-362; Choo等、1991,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88: 2451-2455;及び欧州特許公開第318,216; 288,23
2; 及び398,748 号に記述されている。ゲノムは、単一
の大きいポリタンパク質に翻訳され、次いで加工をうけ
る単一の長い開放された読み枠を含むものと考えられて
いる。該ゲノムは、開放された読み枠の上流に、５’非
翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことが知られている。
単一の正のセンスの、約１０，０００ヌクレオチドの長
さを有するＲＮＡ分子を含んだ小型のＲＮＡウイルスで
ある。原型的ＨＣＶは、Choo等、1989, Science 244:
359-362; Choo等、1991,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88: 2451-2455;及び欧州特許公開第318,216; 288,23
2; 及び398,748 号に記述されている。ゲノムは、単一
の大きいポリタンパク質に翻訳され、次いで加工をうけ
る単一の長い開放された読み枠を含むものと考えられて
いる。該ゲノムは、開放された読み枠の上流に、５’非
翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことが知られている。
【０００３】ＨＣＶのゲノムは、株及び単離物間で程度
の大きい核酸異種性を示す（Simmonds, 1995, Hepatolo
gy 21: 570-583 、及びBukh等、1994, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91: 8239-8243 参照）。しかしなが
ら、５’ＵＴＲ配列は比較的保存されていることが知ら
れている。
の大きい核酸異種性を示す（Simmonds, 1995, Hepatolo
gy 21: 570-583 、及びBukh等、1994, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91: 8239-8243 参照）。しかしなが
ら、５’ＵＴＲ配列は比較的保存されていることが知ら
れている。
【０００４】特定の核酸の増幅方法であるポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、以前は検出不能なほど少
量の試料中に存在する核酸の迅速な検出を可能とする
（米国特許4,683,195; 4,683,202; 及び4,965,188 参
照）。ＨＣＶゲノムＲＮＡは、ＨＣＶゲノムＲＮＡを逆
転写し、得られたｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、及び
増幅生成物の存在を検出することにより検出されうる。
連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、以前は検出不能なほど少
量の試料中に存在する核酸の迅速な検出を可能とする
（米国特許4,683,195; 4,683,202; 及び4,965,188 参
照）。ＨＣＶゲノムＲＮＡは、ＨＣＶゲノムＲＮＡを逆
転写し、得られたｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、及び
増幅生成物の存在を検出することにより検出されうる。
【０００５】ＨＣＶゲノム配列のＰＣＲ増幅に基づくＨ
ＣＶ検出アッセイは、米国特許5,527,699 ；欧州特許公
開529,493; Young等、1993, J. Clin. Microbiol. 31
(4):882-886;及びYoung 等、1995, J. Clin. Microbio
l. 33(3); 654-657に記述されている。それらに記述さ
れるように、ＨＣＶ ＲＮＡの増幅は、結合逆転写−ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅により実施さ
れ得、これにおいては単一の酵素が、最初のゲノムＲＮ
Ａテンプレートからのプライマー伸長（即ち、逆転写）
及び増幅工程にて合成されるＤＮＡテンプレートからの
プライマー伸長の両方について触媒作用する。
ＣＶ検出アッセイは、米国特許5,527,699 ；欧州特許公
開529,493; Young等、1993, J. Clin. Microbiol. 31
(4):882-886;及びYoung 等、1995, J. Clin. Microbio
l. 33(3); 654-657に記述されている。それらに記述さ
れるように、ＨＣＶ ＲＮＡの増幅は、結合逆転写−ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅により実施さ
れ得、これにおいては単一の酵素が、最初のゲノムＲＮ
Ａテンプレートからのプライマー伸長（即ち、逆転写）
及び増幅工程にて合成されるＤＮＡテンプレートからの
プライマー伸長の両方について触媒作用する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、Ｃ型肝炎ウイ
ルス（ＨＣＶ）ゲノムの５’非翻訳領域の効率的な逆転
写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅のため
の改良されたオリゴヌクレオチドプライマー類を提供す
る。
ルス（ＨＣＶ）ゲノムの５’非翻訳領域の効率的な逆転
写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅のため
の改良されたオリゴヌクレオチドプライマー類を提供す
る。
【０００７】本発明のプライマーの、従来技術に記載さ
れるプライマーを上回る重要な優位点は、本発明のプラ
イマーが顕著に高い効率をもってＨＣＶ核酸の増幅を可
能とすることである。例に示されるように、本発明のプ
ライマーを使用するＨＣＶ核酸の増幅は、従来技術に記
述されるプライマーを使用する増幅より効率が１００倍
高い。本発明のプライマーを使用して得られる有意に高
い増幅効率は、従来技術から見て驚くべきものであり、
かつ予期されないものである。
れるプライマーを上回る重要な優位点は、本発明のプラ
イマーが顕著に高い効率をもってＨＣＶ核酸の増幅を可
能とすることである。例に示されるように、本発明のプ
ライマーを使用するＨＣＶ核酸の増幅は、従来技術に記
述されるプライマーを使用する増幅より効率が１００倍
高い。本発明のプライマーを使用して得られる有意に高
い増幅効率は、従来技術から見て驚くべきものであり、
かつ予期されないものである。
【０００８】本発明の別の側面は、本発明のプライマー
を使用してポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む
ＨＣＶゲノム領域の増幅方法に関する。本発明のプライ
マーを使用して得られる有意に向上した増幅効率のため
に、本発明の増幅方法は、有意に増量した増幅生成物を
与え、その一方で形成されるプライマー−二量体の量を
低減する。結果として、本発明の方法は、有意に向上し
た感度のＨＣＶ検出アッセイを可能とする。従って、本
発明は、試料中のＨＣＶ核酸の存在の検出方法であっ
て： （ａ）前記試料を、本発明のプライマーを含むＰＣＲ反
応混合物中において増幅条件下で、ＨＣＶ核酸が存在す
る場合に増幅すべく処理し；及び（ｂ）ＨＣＶ核酸の存
在を示す増幅が起きたか否かを検出すること、を含んで
なる試料中のＨＣＶ核酸の存在の検出方法をも提供す
る。
を使用してポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む
ＨＣＶゲノム領域の増幅方法に関する。本発明のプライ
マーを使用して得られる有意に向上した増幅効率のため
に、本発明の増幅方法は、有意に増量した増幅生成物を
与え、その一方で形成されるプライマー−二量体の量を
低減する。結果として、本発明の方法は、有意に向上し
た感度のＨＣＶ検出アッセイを可能とする。従って、本
発明は、試料中のＨＣＶ核酸の存在の検出方法であっ
て： （ａ）前記試料を、本発明のプライマーを含むＰＣＲ反
応混合物中において増幅条件下で、ＨＣＶ核酸が存在す
る場合に増幅すべく処理し；及び（ｂ）ＨＣＶ核酸の存
在を示す増幅が起きたか否かを検出すること、を含んで
なる試料中のＨＣＶ核酸の存在の検出方法をも提供す
る。
【０００９】本発明の他の側面は、本発明の増幅プライ
マーを含んでなるキットに関するものである。これらの
キットは、増幅核酸の検出のためのオリゴヌクレオチド
プローブ、並びにポリメラーゼ、緩衝剤及びヌクレオシ
ド三リン酸等の付加的試薬を含みうる。本発明の理解の
手助けとして幾つかの用語が以下に定義される。
マーを含んでなるキットに関するものである。これらの
キットは、増幅核酸の検出のためのオリゴヌクレオチド
プローブ、並びにポリメラーゼ、緩衝剤及びヌクレオシ
ド三リン酸等の付加的試薬を含みうる。本発明の理解の
手助けとして幾つかの用語が以下に定義される。
【００１０】“核酸”及び“オリゴヌクレオチド”なる
用語は、プライマー類、プローブ類及び増幅または検出
されるべきオリゴマー断片を指し、ポリデオキシリボヌ
クレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）につ
いて、またポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含
む）について、並びに他のプリンもしくはピリミジン塩
基、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基の
Ｎグリコシドであるポリヌクレオチドの何れかのタイプ
について総称的である。“核酸”及び“オリゴヌクレオ
チド”なる用語の間で、長さにおける意図的な区別はな
く、従って、これらの用語は、可換的に使用されるであ
ろう。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。従
ってこれらの用語は、二重鎖及び単鎖ＤＮＡ、並びに二
重鎖及び単鎖ＲＮＡを含む。
用語は、プライマー類、プローブ類及び増幅または検出
されるべきオリゴマー断片を指し、ポリデオキシリボヌ
クレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）につ
いて、またポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含
む）について、並びに他のプリンもしくはピリミジン塩
基、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基の
Ｎグリコシドであるポリヌクレオチドの何れかのタイプ
について総称的である。“核酸”及び“オリゴヌクレオ
チド”なる用語の間で、長さにおける意図的な区別はな
く、従って、これらの用語は、可換的に使用されるであ
ろう。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。従
ってこれらの用語は、二重鎖及び単鎖ＤＮＡ、並びに二
重鎖及び単鎖ＲＮＡを含む。
【００１１】オリゴヌクレオチドは、例えば、クローニ
ング及び適切な配列への制限、並びにＮａｒａｎｇ等、
１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９
９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ等、１９７９、
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホ
スホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ等、１９８１、Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１
８６２のジエチルホスホラミダイト法；及び米国特許第
４，４５８，０６６号の固体支持方法等の直接化学合成
を含む適当な方法により調製され得る。標識オリゴヌク
レオチドの合成方法は、Ａｇｒａｗａｌ及びＺａｍｅｃ
ｎｉｋ、１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１
８（１８）：５４１９−５４２３；ＭａｃＭｉｌｌａｎ
及びＶｅｒｄｉｎｅ、１９９０、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．５５：５９３１−５９３３；Ｐｉｅｌｅｓ等、１９
８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７（２２）：
８９６７−８９７８；Ｒｏｇｅｔ等、１９８９、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７（１９）：７６４３−７
６５１；及びＴｅｓｌｅｒ等、１９８９、Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：６９６６−６９７６に記述さ
れている。合成方法の総説は、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、１
９９０、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １（３）：１６５−１８７に提供される。
ング及び適切な配列への制限、並びにＮａｒａｎｇ等、
１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９
９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ等、１９７９、
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホ
スホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ等、１９８１、Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１
８６２のジエチルホスホラミダイト法；及び米国特許第
４，４５８，０６６号の固体支持方法等の直接化学合成
を含む適当な方法により調製され得る。標識オリゴヌク
レオチドの合成方法は、Ａｇｒａｗａｌ及びＺａｍｅｃ
ｎｉｋ、１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１
８（１８）：５４１９−５４２３；ＭａｃＭｉｌｌａｎ
及びＶｅｒｄｉｎｅ、１９９０、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．５５：５９３１−５９３３；Ｐｉｅｌｅｓ等、１９
８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７（２２）：
８９６７−８９７８；Ｒｏｇｅｔ等、１９８９、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７（１９）：７６４３−７
６５１；及びＴｅｓｌｅｒ等、１９８９、Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：６９６６−６９７６に記述さ
れている。合成方法の総説は、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、１
９９０、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １（３）：１６５−１８７に提供される。
【００１２】“ハイブリダイゼーション”なる用語は、
相補的塩基対形成による２本の単鎖核酸による二重構造
の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に（正
確に）相補的な核酸鎖の間、または僅かな食い違い領域
を含む“実質的に相補的な”核酸鎖の間で起こりうる。
完全に相補的な核酸鎖においてのみハイブリダイズする
であろう条件は、“緊縮なハイブリダイゼーション条
件”または“配列特異的なハイブリダイゼーション条
件”と称される。実質的に相補的な配列の安定な二重鎖
は、より緊縮さが低いハイブリダイゼーション条件下で
達成され得る。核酸技術における当業者は、この技術に
より提供される案内（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１
９８５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に従って、二
重鎖の安定性を経験的に決定しうる。
相補的塩基対形成による２本の単鎖核酸による二重構造
の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に（正
確に）相補的な核酸鎖の間、または僅かな食い違い領域
を含む“実質的に相補的な”核酸鎖の間で起こりうる。
完全に相補的な核酸鎖においてのみハイブリダイズする
であろう条件は、“緊縮なハイブリダイゼーション条
件”または“配列特異的なハイブリダイゼーション条
件”と称される。実質的に相補的な配列の安定な二重鎖
は、より緊縮さが低いハイブリダイゼーション条件下で
達成され得る。核酸技術における当業者は、この技術に
より提供される案内（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１
９８５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に従って、二
重鎖の安定性を経験的に決定しうる。
【００１３】一般的に、緊縮な条件は、規定されたイオ
ン強度及びｐＨにおいて、特定の配列についての熱的融
点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、５０％
の塩基対が解離する温度（所定のイオン強度及びｐＨに
て）である。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の緩
和は、配列の不一致を許容するようにし；また許容され
る不一致の程度は、ハイブリダイゼーション条件の適当
な調節により制御可能である。
ン強度及びｐＨにおいて、特定の配列についての熱的融
点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、５０％
の塩基対が解離する温度（所定のイオン強度及びｐＨに
て）である。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の緩
和は、配列の不一致を許容するようにし；また許容され
る不一致の程度は、ハイブリダイゼーション条件の適当
な調節により制御可能である。
【００１４】“プライマー”なる用語は、核酸鎖に対し
て相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条
件下、即ち適切な緩衝溶液及び適当な温度にて４種類の
異なるヌクレオシド三リン酸及びポリマー化試薬（即
ち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下で
のＤＮＡ合成の開始点として作用しうるオリゴヌクレオ
チドを指す。プライマーは、好ましくは単鎖オリゴデオ
キシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さ
は、プライマーの使用目的に依存するが、典型的には１
５から３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー
分子は、一般的にテンプレートと十分に安定したハイブ
リッド複合体を形成するために、より低い温度を必要と
する。プライマーは、テンプレート核酸の正確な配列を
反映する必要はないが、テンプレートにハイブリダイズ
するために充分に相補的でなければならない。プライマ
ーは、該プライマーの検出または固定を可能とするが、
ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本的
性質を変更しない付加的な特徴を組み入れ得る。例え
ば、プライマーは、標的核酸配列にハイブリッドしない
が、増幅生成物のクローニングを容易にする付加的な核
酸配列を５’末端に含みうる。ハイブリダイズするため
にテンプレートに充分に相補的なプライマーの領域は、
ここにおいてはハイブリダイズ領域と称される。
て相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条
件下、即ち適切な緩衝溶液及び適当な温度にて４種類の
異なるヌクレオシド三リン酸及びポリマー化試薬（即
ち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下で
のＤＮＡ合成の開始点として作用しうるオリゴヌクレオ
チドを指す。プライマーは、好ましくは単鎖オリゴデオ
キシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さ
は、プライマーの使用目的に依存するが、典型的には１
５から３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー
分子は、一般的にテンプレートと十分に安定したハイブ
リッド複合体を形成するために、より低い温度を必要と
する。プライマーは、テンプレート核酸の正確な配列を
反映する必要はないが、テンプレートにハイブリダイズ
するために充分に相補的でなければならない。プライマ
ーは、該プライマーの検出または固定を可能とするが、
ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本的
性質を変更しない付加的な特徴を組み入れ得る。例え
ば、プライマーは、標的核酸配列にハイブリッドしない
が、増幅生成物のクローニングを容易にする付加的な核
酸配列を５’末端に含みうる。ハイブリダイズするため
にテンプレートに充分に相補的なプライマーの領域は、
ここにおいてはハイブリダイズ領域と称される。
【００１５】ここにおいて使用されるように、“上流”
プライマーは、その伸長生成物がコード配列の結果を生
じるプライマーを指し；“下流”プライマーは、その伸
長生成物が相補的非コード鎖の結果を生じるプライマー
を指す。“ＲＴプライマー”と称される逆転写に使用さ
れるプライマーは、コード鎖にハイブリダイズし、従っ
て、下流プライマーである。
プライマーは、その伸長生成物がコード配列の結果を生
じるプライマーを指し；“下流”プライマーは、その伸
長生成物が相補的非コード鎖の結果を生じるプライマー
を指す。“ＲＴプライマー”と称される逆転写に使用さ
れるプライマーは、コード鎖にハイブリダイズし、従っ
て、下流プライマーである。
【００１６】ここにおいて使用される“オリゴヌクレオ
チドプローブ”なる用語は、相補的塩基対形成のために
標的核酸の配列と二重鎖構造を形成するオリゴヌクレオ
チドを指す。プローブは、標的核酸の検出または捕捉の
ために使用される。プローブは、好ましくは単鎖オリゴ
デオキシリボヌクレオチドである。プローブは、典型的
には標的配列の領域に対応する好ましくは１０から５０
ヌクレオチド、さらに好ましくは１５から３５ヌクレオ
チドからなる“ハイブリッド領域”からなるか、または
それを含んでなる。“対応する”は、指定される核酸ま
たはその相補体の何れかに対して少なくとも実質的に相
補的であることを意味する。プローブは、標的核酸の正
確な配列を反映する必要はないが、選択されるハイブリ
ダイゼーション条件下で標的とハイブリッドするために
充分相補的でなければならない。プローブオリゴヌクレ
オチドは、該プローブの検出または固定化を許容する
が、ハイブリダイズ領域のハイブリダイゼーションの特
徴を著しく変更しない付加的な特徴を含みうるか、ある
いはそれに結合され得る。例えば、プローブは放射標識
ヌクレオチドの取り込みにより、または独立した検出可
能な残基に結合されることにより標識されうる。
チドプローブ”なる用語は、相補的塩基対形成のために
標的核酸の配列と二重鎖構造を形成するオリゴヌクレオ
チドを指す。プローブは、標的核酸の検出または捕捉の
ために使用される。プローブは、好ましくは単鎖オリゴ
デオキシリボヌクレオチドである。プローブは、典型的
には標的配列の領域に対応する好ましくは１０から５０
ヌクレオチド、さらに好ましくは１５から３５ヌクレオ
チドからなる“ハイブリッド領域”からなるか、または
それを含んでなる。“対応する”は、指定される核酸ま
たはその相補体の何れかに対して少なくとも実質的に相
補的であることを意味する。プローブは、標的核酸の正
確な配列を反映する必要はないが、選択されるハイブリ
ダイゼーション条件下で標的とハイブリッドするために
充分相補的でなければならない。プローブオリゴヌクレ
オチドは、該プローブの検出または固定化を許容する
が、ハイブリダイズ領域のハイブリダイゼーションの特
徴を著しく変更しない付加的な特徴を含みうるか、ある
いはそれに結合され得る。例えば、プローブは放射標識
ヌクレオチドの取り込みにより、または独立した検出可
能な残基に結合されることにより標識されうる。
【００１７】ここにおいて使用されるように、オリゴヌ
クレオチドプライマーまたはプローブは、該オリゴヌク
レオチドと標的配列との間の不一致の個数が、該オリゴ
ヌクレオチドと非標的配列との間の不一致の個数より少
ない場合において、標的配列に対して“特異的”であ
る。ハイブリダイゼーション条件は、存在する不一致の
個数がオリゴヌクレオチドと標的配列との間の不一致の
個数を越えない場合にのみ安定な二重鎖が形成されるよ
う選択されうる。そのような条件下では、標的特異的オ
リゴヌクレオチドは標的配列とのみ安定な二重鎖を形成
しうる。適当な緊縮増幅条件下での標的特異的プライマ
ーの使用は、標的プライマー結合部位を含むそれらの標
的配列の特異的増幅を可能とする。同様にして、適当な
緊縮ハイブリダイゼーション条件下での標的特異的プロ
ーブの使用は、特異的標的配列の検出を可能とする。
クレオチドプライマーまたはプローブは、該オリゴヌク
レオチドと標的配列との間の不一致の個数が、該オリゴ
ヌクレオチドと非標的配列との間の不一致の個数より少
ない場合において、標的配列に対して“特異的”であ
る。ハイブリダイゼーション条件は、存在する不一致の
個数がオリゴヌクレオチドと標的配列との間の不一致の
個数を越えない場合にのみ安定な二重鎖が形成されるよ
う選択されうる。そのような条件下では、標的特異的オ
リゴヌクレオチドは標的配列とのみ安定な二重鎖を形成
しうる。適当な緊縮増幅条件下での標的特異的プライマ
ーの使用は、標的プライマー結合部位を含むそれらの標
的配列の特異的増幅を可能とする。同様にして、適当な
緊縮ハイブリダイゼーション条件下での標的特異的プロ
ーブの使用は、特異的標的配列の検出を可能とする。
【００１８】“標的領域”及び“標的核酸”なる用語
は、増幅、検出または別途分析されるべき核酸の領域を
指す。
は、増幅、検出または別途分析されるべき核酸の領域を
指す。
【００１９】“熱安定性なポリメラーゼ”なる用語は、
熱に対して相対的に安定であり、ヌクレオシド三リン酸
のポリマー形成に触媒作用して、標的配列の核酸鎖のひ
とつに対して相補的なプライマー伸長生成物を形成する
酵素を指す。該酵素は、プライマーの３’末端から合成
を開始し、テンプレートの５’末端に向けて合成が終了
するまで進行する。精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ
から商業的に入手可能である。
熱に対して相対的に安定であり、ヌクレオシド三リン酸
のポリマー形成に触媒作用して、標的配列の核酸鎖のひ
とつに対して相補的なプライマー伸長生成物を形成する
酵素を指す。該酵素は、プライマーの３’末端から合成
を開始し、テンプレートの５’末端に向けて合成が終了
するまで進行する。精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ
から商業的に入手可能である。
【００２０】“増幅反応混合物”及び“ポリメラーゼ連
鎖反応混合物”なる用語は、ポリメラーゼ連鎖反応を実
施するために好適な試薬の組合せを指す。該反応混合物
は、典型的にはオリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレ
オチド三リン酸、及びＤＮＡポリメラーゼを、適当な緩
衝溶液中に含む。好適な増幅反応混合物は、例中に与え
られる。
鎖反応混合物”なる用語は、ポリメラーゼ連鎖反応を実
施するために好適な試薬の組合せを指す。該反応混合物
は、典型的にはオリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレ
オチド三リン酸、及びＤＮＡポリメラーゼを、適当な緩
衝溶液中に含む。好適な増幅反応混合物は、例中に与え
られる。
【００２１】“増幅条件”なる用語は、ここにおいて使
用されるように標的核酸配列の増幅のために好適な反応
条件を指す。増幅条件は、増幅反応混合物及び反応の間
に使用される温度サイクル条件の両者を指す。本発明の
プライマーを使用する増幅条件下では、存在する場合に
はＨＣＶ核酸の増幅が起こるであろう。好ましい増幅条
件は、例中に与えられる。
用されるように標的核酸配列の増幅のために好適な反応
条件を指す。増幅条件は、増幅反応混合物及び反応の間
に使用される温度サイクル条件の両者を指す。本発明の
プライマーを使用する増幅条件下では、存在する場合に
はＨＣＶ核酸の増幅が起こるであろう。好ましい増幅条
件は、例中に与えられる。
【００２２】“増幅効率”なる用語は、ここにおいて使
用されるように所定の増幅サイクル数において、標的配
列の所定の初期個数から生成される生成物の量を指す。
従って、プライマーにおいてのみ異なる二つの反応の増
幅効率は、それぞれの反応で形成される生成物の量を定
量的に測定することによって比較される。
用されるように所定の増幅サイクル数において、標的配
列の所定の初期個数から生成される生成物の量を指す。
従って、プライマーにおいてのみ異なる二つの反応の増
幅効率は、それぞれの反応で形成される生成物の量を定
量的に測定することによって比較される。
【００２３】図１は、例２に記述されるように、プライ
マー対（Ａ）ＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）／Ｋ
Ｙ８０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、（Ｂ）ＳＴ７７８
ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）／ＫＹ８０（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）、（Ｃ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１）（４０ピコモル）及び（Ｄ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）（６０ピコモル）をそれぞれ使用した場合の
増幅反応の比較を示す。
マー対（Ａ）ＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）／Ｋ
Ｙ８０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、（Ｂ）ＳＴ７７８
ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）／ＫＹ８０（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）、（Ｃ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１）（４０ピコモル）及び（Ｄ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）（６０ピコモル）をそれぞれ使用した場合の
増幅反応の比較を示す。
【００２４】図２は、下記例３に記述されるように、
５’末端ヌクレアーゼアッセイに基づくプライマー対Ｋ
Ｙ７８／ＫＹ８０（−−◆−−）、ＳＴ７７８ＡＡ／Ｋ
Ｙ８０（−■−）及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−
▲−）を使用する増幅反応の比較を示す。
５’末端ヌクレアーゼアッセイに基づくプライマー対Ｋ
Ｙ７８／ＫＹ８０（−−◆−−）、ＳＴ７７８ＡＡ／Ｋ
Ｙ８０（−■−）及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−
▲−）を使用する増幅反応の比較を示す。
【００２５】図３は、下記例４に記述されるように、
５’末端ヌクレアーゼアッセイに基づくプライマー対Ｋ
Ｙ７８／ＫＹ８０（−−◆−−）、ＳＴ６７８ＡＡ／Ｓ
Ｔ２８０（−▲−）及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０
（−ｘ−）を使用する増幅反応の比較を示す。
５’末端ヌクレアーゼアッセイに基づくプライマー対Ｋ
Ｙ７８／ＫＹ８０（−−◆−−）、ＳＴ６７８ＡＡ／Ｓ
Ｔ２８０（−▲−）及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０
（−ｘ−）を使用する増幅反応の比較を示す。
【００２６】この技術の熟練の内にある分子生物学及び
核酸化学の慣用の技術は、文献中に完全に記述されてい
る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８５、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編、１９８
４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ編、１９８４）；及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照。上記及び下記の両者におい
てここに述べる全ての特許、特許出願及び刊行物を、参
考として組み入れる。
核酸化学の慣用の技術は、文献中に完全に記述されてい
る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８５、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編、１９８
４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ編、１９８４）；及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照。上記及び下記の両者におい
てここに述べる全ての特許、特許出願及び刊行物を、参
考として組み入れる。
【００２７】ＨＣＶ増幅プライマー プライマー類のヌクレオチド配列は、５’から３’の方
向で示して表１に掲げられている。上流プライマーを何
れかの下流プライマーと共に用いる増幅は、ＨＣＶゲノ
ムの５’非翻訳領域からの２４０塩基対の生成物を増幅
する。該プライマーは、ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域
内の比較的保存された領域にハイブリダイズし、他のウ
イルス由来またはヒトゲノムＤＮＡ由来の非標的配列の
同時的増幅を伴うことなく、既知のＨＣＶ単離物由来の
核酸の増幅を可能とする。
向で示して表１に掲げられている。上流プライマーを何
れかの下流プライマーと共に用いる増幅は、ＨＣＶゲノ
ムの５’非翻訳領域からの２４０塩基対の生成物を増幅
する。該プライマーは、ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域
内の比較的保存された領域にハイブリダイズし、他のウ
イルス由来またはヒトゲノムＤＮＡ由来の非標的配列の
同時的増幅を伴うことなく、既知のＨＣＶ単離物由来の
核酸の増幅を可能とする。
【００２８】
【表１】
【００２９】増幅 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅工程は、この技術
分野において周知であり、また米国特許第４，６８３，
１９５号；４，６８３，２０２号；及び４，９６５，１
８８号に記述されている。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）等の商業的販売者は、ＰＣＲ
試薬を販売し、またＰＣＲプロトコールを発行してい
る。本発明により提供される優位点の理解を容易にする
ために、ＰＣＲの要点を示す。
分野において周知であり、また米国特許第４，６８３，
１９５号；４，６８３，２０２号；及び４，９６５，１
８８号に記述されている。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）等の商業的販売者は、ＰＣＲ
試薬を販売し、またＰＣＲプロトコールを発行してい
る。本発明により提供される優位点の理解を容易にする
ために、ＰＣＲの要点を示す。
【００３０】ＰＣＲ増幅の各サイクルにおいて、二重鎖
標的配列は変性され、プライマーが該変性された標的の
各鎖にアニールされ、該プライマーは、ＤＮＡポリメラ
ーゼの作用により伸長される。該工程は、典型的には少
なくとも２５回反復される。２種のプライマーは、標的
核酸配列の反対側の末端に、各プライマーの伸長生成物
が標的配列の相補的複写物となり、かつその相補体から
分離された場合に他方のプライマーにハイブリッドしう
るような配向をもってアニールする。１００％の効率を
仮定すると、各サイクルは存在する標的配列数の二倍化
を生じるであろう。
標的配列は変性され、プライマーが該変性された標的の
各鎖にアニールされ、該プライマーは、ＤＮＡポリメラ
ーゼの作用により伸長される。該工程は、典型的には少
なくとも２５回反復される。２種のプライマーは、標的
核酸配列の反対側の末端に、各プライマーの伸長生成物
が標的配列の相補的複写物となり、かつその相補体から
分離された場合に他方のプライマーにハイブリッドしう
るような配向をもってアニールする。１００％の効率を
仮定すると、各サイクルは存在する標的配列数の二倍化
を生じるであろう。
【００３１】ＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列のいずれも
が、ＰＣＲにより増幅されうる。ここに記述されるよう
に、ＨＣＶゲノム核酸の増幅のようにＲＮＡ標的の場合
には、第一工程は、標的配列のＤＮＡ複写物（ｃＤＮ
Ａ）の合成からなる。逆転写は、独立した工程として、
または好ましくはＲＮＡ増幅のためのポリメラーゼ連鎖
反応の変法である組み込み逆転写−ポリメラーゼ連鎖反
応（ＲＴ−ＰＣＲ）において実施され得る。ＲＮＡのＲ
Ｔ−ＰＣＲ増幅はこの分野で周知であり、米国特許第
５，３２２，７７０号及び５，３１０，６５２号；Ｍｙ
ｅｒｓ及びＧｅｌｆａｎｄ、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ３０（３１）：７６６１−７６６６；米国
特許第５，５２７，６６９号；Ｙｏｕｎｇ等、１９９
３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（４）：
８８２−８８６；及びＹｏｕｎｇ等、１９９５、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（３）：６５４−６
５７に記述されている。
が、ＰＣＲにより増幅されうる。ここに記述されるよう
に、ＨＣＶゲノム核酸の増幅のようにＲＮＡ標的の場合
には、第一工程は、標的配列のＤＮＡ複写物（ｃＤＮ
Ａ）の合成からなる。逆転写は、独立した工程として、
または好ましくはＲＮＡ増幅のためのポリメラーゼ連鎖
反応の変法である組み込み逆転写−ポリメラーゼ連鎖反
応（ＲＴ−ＰＣＲ）において実施され得る。ＲＮＡのＲ
Ｔ−ＰＣＲ増幅はこの分野で周知であり、米国特許第
５，３２２，７７０号及び５，３１０，６５２号；Ｍｙ
ｅｒｓ及びＧｅｌｆａｎｄ、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ３０（３１）：７６６１−７６６６；米国
特許第５，５２７，６６９号；Ｙｏｕｎｇ等、１９９
３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（４）：
８８２−８８６；及びＹｏｕｎｇ等、１９９５、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（３）：６５４−６
５７に記述されている。
【００３２】ＲＴ−ＰＣＲに好適な種々の試料調製方法
が、文献中に記述されている。例えば、生物学的試料か
らのリボ核酸の抽出技術は、Ｒｏｔｂａｒｔ等、１９８
９、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｒｌｉｃｈ編、
Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
中、及びＨａｎ等、１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ２６：１６１７−１６２５に記述されている。使用
される個別の方法は、本発明の重要な部分ではない。当
業者は、既知の試料調製方法を用いて使用する反応条件
の至適化を行い得る。ＨＣＶ ＲＮＡの検出に使用する
ための好ましい試料調製方法は、米国特許第５，５２
７，６６９号、前出のＹｏｕｎｇ等、１９９３及び前出
のＹｏｕｎｇ等、１９９５に記述されている。
が、文献中に記述されている。例えば、生物学的試料か
らのリボ核酸の抽出技術は、Ｒｏｔｂａｒｔ等、１９８
９、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｒｌｉｃｈ編、
Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
中、及びＨａｎ等、１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ２６：１６１７−１６２５に記述されている。使用
される個別の方法は、本発明の重要な部分ではない。当
業者は、既知の試料調製方法を用いて使用する反応条件
の至適化を行い得る。ＨＣＶ ＲＮＡの検出に使用する
ための好ましい試料調製方法は、米国特許第５，５２
７，６６９号、前出のＹｏｕｎｇ等、１９９３及び前出
のＹｏｕｎｇ等、１９９５に記述されている。
【００３３】ＰＣＲ工程をもって膨大な増幅が可能であ
るため、高いＤＮＡ濃度を持った試料、正の対照テンプ
レート、または先行する増幅に由来する低濃度のＤＮＡ
夾雑物は、目的を持って添加したテンプレートＤＮＡが
存在しない場合にもＰＣＲ生成物を生じうる。交差夾雑
を最小とするであろう実験器具及び技術は、Ｋｗｏｋ及
びＨｉｇｕｃｈｉ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：
２３７−２３８並びにＩｎｎｉｓ等編、１９９０、ＰＣ
Ｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ中のＫｗｏｋ及びＯｒｒｅｇｏに議論されてい
る。先行する反応に由来する増幅核酸によるＰＣＲの夾
雑の問題を低減するための酵素的方法は、ここにそれぞ
れ参考として取り入れるＰＣＴ特許公開ＵＳ９１／０５
２１０、米国特許第５，４１８，１４９号及び米国特許
第５，０３５，９９６号、並びに前出のＹｏｕｎｇ等、
１９９５に記述されている。
るため、高いＤＮＡ濃度を持った試料、正の対照テンプ
レート、または先行する増幅に由来する低濃度のＤＮＡ
夾雑物は、目的を持って添加したテンプレートＤＮＡが
存在しない場合にもＰＣＲ生成物を生じうる。交差夾雑
を最小とするであろう実験器具及び技術は、Ｋｗｏｋ及
びＨｉｇｕｃｈｉ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：
２３７−２３８並びにＩｎｎｉｓ等編、１９９０、ＰＣ
Ｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ中のＫｗｏｋ及びＯｒｒｅｇｏに議論されてい
る。先行する反応に由来する増幅核酸によるＰＣＲの夾
雑の問題を低減するための酵素的方法は、ここにそれぞ
れ参考として取り入れるＰＣＴ特許公開ＵＳ９１／０５
２１０、米国特許第５，４１８，１４９号及び米国特許
第５，０３５，９９６号、並びに前出のＹｏｕｎｇ等、
１９９５に記述されている。
【００３４】増幅反応混合物は、典型的にはプライマー
ハイブリダイゼーション特異性を保証するために必要な
温度より充分に低い室温にて組み上げられる。室温にお
いては、プライマーが部分的にのみ相補的な核酸配列を
持つ他のものに非特異的に結合するであろうから、非特
異的な増幅が生じえて、望まれない核酸配列の合成が開
始される。これらの新たに合成された望まれない配列
は、増幅反応の間に所望の標的配列と競合しえて、所望
の配列の増幅効率を顕著に低減しうる。非特異的増幅
は、温度が必要とされるハイブリダイゼーション特異性
を与える為に充分に上昇するまでプライマー伸長が阻害
される“ホットスタート”を使用して低減されうる。
ハイブリダイゼーション特異性を保証するために必要な
温度より充分に低い室温にて組み上げられる。室温にお
いては、プライマーが部分的にのみ相補的な核酸配列を
持つ他のものに非特異的に結合するであろうから、非特
異的な増幅が生じえて、望まれない核酸配列の合成が開
始される。これらの新たに合成された望まれない配列
は、増幅反応の間に所望の標的配列と競合しえて、所望
の配列の増幅効率を顕著に低減しうる。非特異的増幅
は、温度が必要とされるハイブリダイゼーション特異性
を与える為に充分に上昇するまでプライマー伸長が阻害
される“ホットスタート”を使用して低減されうる。
【００３５】ホットスタートの１方法においては、温度
が必要とされるハイブリダイゼーション特異性を与える
為に充分に上昇するまで、１種以上の試薬が反応混合物
に与えられない。反応成分を分離または隔離するための
ロウ等の熱不安定性材料を使用するホットスタート法
は、米国特許第５，４１１，８７６号及びＣｈｏｕ等、
１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０
（７）：１７１７−１７２３に記述されている。他のホ
ットスタート法においては、増幅に先行して、または増
幅の第１工程として高温度のインキュベーションにより
活性化されるまでプライマー伸長に触媒作用しない、可
逆的に不活性化されたＤＮＡポリメラーゼが使用され
る。この様な可逆的に不活性化されたＤＮＡポリメラー
ゼの例は、ＡｍｐｌｉＴａｑTMＧＯＬＤである（総説と
してＢｉｌｃｈ等、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ３８１：４
４５−４４６参照）。非特異的増幅は、米国特許第５，
４１８，１４９号に記述されるように増幅の初期の高温
工程に先立って形成される伸長生成物を、酵素的に分解
することによっても低減される。
が必要とされるハイブリダイゼーション特異性を与える
為に充分に上昇するまで、１種以上の試薬が反応混合物
に与えられない。反応成分を分離または隔離するための
ロウ等の熱不安定性材料を使用するホットスタート法
は、米国特許第５，４１１，８７６号及びＣｈｏｕ等、
１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０
（７）：１７１７−１７２３に記述されている。他のホ
ットスタート法においては、増幅に先行して、または増
幅の第１工程として高温度のインキュベーションにより
活性化されるまでプライマー伸長に触媒作用しない、可
逆的に不活性化されたＤＮＡポリメラーゼが使用され
る。この様な可逆的に不活性化されたＤＮＡポリメラー
ゼの例は、ＡｍｐｌｉＴａｑTMＧＯＬＤである（総説と
してＢｉｌｃｈ等、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ３８１：４
４５−４４６参照）。非特異的増幅は、米国特許第５，
４１８，１４９号に記述されるように増幅の初期の高温
工程に先立って形成される伸長生成物を、酵素的に分解
することによっても低減される。
【００３６】増幅生成物の分析 本発明の好ましい実施態様において、ＨＣＶゲノム核酸
の増幅は、ＨＣＶ検出アッセイの一部として実施され
る。増幅は、ＨＣＶ核酸の量を検出可能な水準まで増大
させる。ＰＣＲ増幅核酸の検出方法は、この技術におい
て周知である。例えば、増幅生成物の存在及び量は、こ
の技術において周知のプロトコールを使用してゲル電気
泳動を用い直接にアッセイされうる（例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ等、１９８９の前出文献参照）。
の増幅は、ＨＣＶ検出アッセイの一部として実施され
る。増幅は、ＨＣＶ核酸の量を検出可能な水準まで増大
させる。ＰＣＲ増幅核酸の検出方法は、この技術におい
て周知である。例えば、増幅生成物の存在及び量は、こ
の技術において周知のプロトコールを使用してゲル電気
泳動を用い直接にアッセイされうる（例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ等、１９８９の前出文献参照）。
【００３７】増幅生成物の検出は、増幅ＨＣＶ核酸に特
異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ
を使用して実施され得る。プローブと標的核酸配列との
間に形成されるハイブリッドを検出するための好適なプ
ロトコールは、この技術において知られている。表１の
プライマーを使用して増幅されるＨＣＶ核酸は、米国特
許第５，５２７，６６９号；Ｙｏｕｎｇ等の１９９３前
出文献；及びＹｏｕｎｇ等の１９９５前出文献に記述さ
れるプローブ及び方法を使用して検出されうる。
異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ
を使用して実施され得る。プローブと標的核酸配列との
間に形成されるハイブリッドを検出するための好適なプ
ロトコールは、この技術において知られている。表１の
プライマーを使用して増幅されるＨＣＶ核酸は、米国特
許第５，５２７，６６９号；Ｙｏｕｎｇ等の１９９３前
出文献；及びＹｏｕｎｇ等の１９９５前出文献に記述さ
れるプローブ及び方法を使用して検出されうる。
【００３８】５’−ヌクレアーゼアッセイとして引用さ
れる好適なアッセイ法は、米国特許第５，２１０，０１
５号及びＨｏｌｌａｎｄ等、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７
２８０に記述されている。５’−ヌクレアーゼアッセイ
においては、標識された検出プローブはＰＣＲ増幅反応
混合物に含まれる。該プローブは、ＤＮＡ合成のプライ
マーとして作用することが阻害されるように修飾され
る。合成工程、即ちプライマー伸長の間に標的ＤＮＡと
ハイブリダイズする任意のプローブは、ＤＮＡポリメラ
ーゼ、例えばｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌク
レアーゼ活性により切り取られる。切り取られたプロー
ブの存在は、プローブと標的ＤＮＡのハイブリダイゼー
ションが起きたこと、及び増幅が起きたことの両方を示
している。プローブ切断物の検出方法は、米国特許第
５，２１０，０１５号、ＥＰ−Ａ−６９９７６８、ＥＰ
−Ａ−７１３９２１及び下記例に記述されている。
れる好適なアッセイ法は、米国特許第５，２１０，０１
５号及びＨｏｌｌａｎｄ等、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７
２８０に記述されている。５’−ヌクレアーゼアッセイ
においては、標識された検出プローブはＰＣＲ増幅反応
混合物に含まれる。該プローブは、ＤＮＡ合成のプライ
マーとして作用することが阻害されるように修飾され
る。合成工程、即ちプライマー伸長の間に標的ＤＮＡと
ハイブリダイズする任意のプローブは、ＤＮＡポリメラ
ーゼ、例えばｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌク
レアーゼ活性により切り取られる。切り取られたプロー
ブの存在は、プローブと標的ＤＮＡのハイブリダイゼー
ションが起きたこと、及び増幅が起きたことの両方を示
している。プローブ切断物の検出方法は、米国特許第
５，２１０，０１５号、ＥＰ−Ａ−６９９７６８、ＥＰ
−Ａ−７１３９２１及び下記例に記述されている。
【００３９】上述したプローブに基づくアッセイ構成
は、典型的にはハイブリッド二重鎖の検出を容易にする
ために標識オリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌク
レオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学
的、または化学的手段により検出可能な標識を取り込む
ことにより標識されうる。有用な標識は、32Ｐ、蛍光染
料、電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡにおいて通常使用
されると同様に）、ビオチン、またはハプテン並びに抗
血清またはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質
を含む。本発明の標識オリゴヌクレオチドは、上述の技
術を使用して合成されうる。
は、典型的にはハイブリッド二重鎖の検出を容易にする
ために標識オリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌク
レオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学
的、または化学的手段により検出可能な標識を取り込む
ことにより標識されうる。有用な標識は、32Ｐ、蛍光染
料、電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡにおいて通常使用
されると同様に）、ビオチン、またはハプテン並びに抗
血清またはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質
を含む。本発明の標識オリゴヌクレオチドは、上述の技
術を使用して合成されうる。
【００４０】反応混合物中の二重鎖ＤＮＡの全量につい
て増加がモニターされる、ＨＣＶ核酸増幅の検出のため
の別の方法は、Ｈｉｇｕｃｈｉ等、１９９２、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３−４１７；Ｈｉｇ
ｕｃｈｉ等、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１１：１０２６−１０３０；並びにヨーロッパ特許公
開４８７，２１８及び５１２，３３４号に記述されてい
る。二重鎖標的ＤＮＡの検出は、二重鎖ＤＮＡに結合し
た場合にエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）及び他のＤ
ＮＡ結合標識が示す増大した蛍光に依っている。増幅は
二重鎖ＤＮＡの量を増大させ、蛍光における検出可能な
増大を生じる。非特異的増幅、及び特にはプライマー二
量体は、二重鎖ＤＮＡの形成を生じるため、非特異的増
幅の低減が望ましい。本発明のプライマーは、非特異的
増幅生成物の予想されない低水準の背景をもって増幅を
可能とすることから、特に有用である。
て増加がモニターされる、ＨＣＶ核酸増幅の検出のため
の別の方法は、Ｈｉｇｕｃｈｉ等、１９９２、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３−４１７；Ｈｉｇ
ｕｃｈｉ等、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１１：１０２６−１０３０；並びにヨーロッパ特許公
開４８７，２１８及び５１２，３３４号に記述されてい
る。二重鎖標的ＤＮＡの検出は、二重鎖ＤＮＡに結合し
た場合にエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）及び他のＤ
ＮＡ結合標識が示す増大した蛍光に依っている。増幅は
二重鎖ＤＮＡの量を増大させ、蛍光における検出可能な
増大を生じる。非特異的増幅、及び特にはプライマー二
量体は、二重鎖ＤＮＡの形成を生じるため、非特異的増
幅の低減が望ましい。本発明のプライマーは、非特異的
増幅生成物の予想されない低水準の背景をもって増幅を
可能とすることから、特に有用である。
【００４１】本発明の増幅方法及びプライマーは、検出
アッセイにおけるようとに限定されるものではない。例
えばこの技術でよく知られているように、増幅される核
酸は、クローニングまたは配列決定において使用され得
る（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号参照）。
本発明のプライマーは、増幅核酸の高い収率及び得られ
る非特異的増幅生成物のより低い水準のために概して有
用である。
アッセイにおけるようとに限定されるものではない。例
えばこの技術でよく知られているように、増幅される核
酸は、クローニングまたは配列決定において使用され得
る（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号参照）。
本発明のプライマーは、増幅核酸の高い収率及び得られ
る非特異的増幅生成物のより低い水準のために概して有
用である。
【００４２】本発明は、キット、換言すると本方法を実
施するために有用な成分を含む複数の容器ユニットにも
関連する。有用なキットは、ＨＣＶ核酸の増幅のための
プライマーを含む。キットは、オリゴヌクレオチドプロ
ーブ等の増幅ＨＣＶ核酸検出の為の手段を含むことがで
きる。キットの他の選択的成分は、例えばプライマー伸
長生成物の合成を触媒する試薬、ヌクレオチド三リン酸
基質、増幅またはハイブリダイゼーション反応用の適当
な緩衝溶液、及び本方法を実施するための指示書を含
む。下記に提示される本発明の例は、例示の目的のため
に提供されるもので、本発明の範囲を制限するものでは
ない。例に従った特許請求の範囲内の発明の多くの実施
態様は、上述の説明及び以下の例を読むことにより当業
者には明らかなものとなろう。
施するために有用な成分を含む複数の容器ユニットにも
関連する。有用なキットは、ＨＣＶ核酸の増幅のための
プライマーを含む。キットは、オリゴヌクレオチドプロ
ーブ等の増幅ＨＣＶ核酸検出の為の手段を含むことがで
きる。キットの他の選択的成分は、例えばプライマー伸
長生成物の合成を触媒する試薬、ヌクレオチド三リン酸
基質、増幅またはハイブリダイゼーション反応用の適当
な緩衝溶液、及び本方法を実施するための指示書を含
む。下記に提示される本発明の例は、例示の目的のため
に提供されるもので、本発明の範囲を制限するものでは
ない。例に従った特許請求の範囲内の発明の多くの実施
態様は、上述の説明及び以下の例を読むことにより当業
者には明らかなものとなろう。
【００４３】
【実施例】例１ ＨＣＶ ＲＮＡの増幅 ＨＣＶ ＲＮＡの増幅を、下記のプロトコールを使用し
て実施した。
て実施した。
【００４４】試料の調製 増幅を、合成ＲＮＡテンプレートの使用、及び臨床的試
料から単離されたＲＮＡの使用の両者にて実施した。合
成テンプレートの使用は、各反応物に添加される標的Ｒ
ＮＡ分子の数に亘って、調整を可能とした。合成ＲＮＡ
は、Ｙｏｕｎｇ等、１９９３前出文献に記述されている
ように、ＨＣＶ ＲＮＡ転写ベクターを使用して、転写
された。臨床的試料由来のＨＣＶ ＲＮＡの増幅のため
に、ＲＮＡをＹｏｕｎｇ等、１９９５前出文献に記述さ
れているように、ＲＮＡを血清から単離した。
料から単離されたＲＮＡの使用の両者にて実施した。合
成テンプレートの使用は、各反応物に添加される標的Ｒ
ＮＡ分子の数に亘って、調整を可能とした。合成ＲＮＡ
は、Ｙｏｕｎｇ等、１９９３前出文献に記述されている
ように、ＨＣＶ ＲＮＡ転写ベクターを使用して、転写
された。臨床的試料由来のＨＣＶ ＲＮＡの増幅のため
に、ＲＮＡをＹｏｕｎｇ等、１９９５前出文献に記述さ
れているように、ＲＮＡを血清から単離した。
【００４５】増幅 増幅を、１００μｌの反応体積にて実施した。各反応物
は、以下の試薬を含んでいた。 ＨＣＶ ＲＮＡテンプレート ４００ｎＭの各プライマー（特記しない限り） １μＭの標識プローブ ５０ｍＭ ビシン（ｐＨ８．３） １００ｍＭ ＫＯＡｃ ２００μＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＵ
ＴＰ ３．６ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）2 ８％ グリセロール ２０単位のｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ* 、並びに ２単位のＵＮＧ* * Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅにより製造及び
開発され、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、
ＣＴにより販売される。
は、以下の試薬を含んでいた。 ＨＣＶ ＲＮＡテンプレート ４００ｎＭの各プライマー（特記しない限り） １μＭの標識プローブ ５０ｍＭ ビシン（ｐＨ８．３） １００ｍＭ ＫＯＡｃ ２００μＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＵ
ＴＰ ３．６ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）2 ８％ グリセロール ２０単位のｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ* 、並びに ２単位のＵＮＧ* * Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅにより製造及び
開発され、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、
ＣＴにより販売される。
【００４６】検出プローブは、下記の通り５’−ヌクレ
アーゼアッセイを使用して増幅生成物を検出可能とする
ために、各反応混合物に含まれていた。使用されたプロ
ーブは、米国特許第５，５２７，６６９号及びＹｏｕｎ
ｇ等、１９９５前出文献に記述されるＫＹ１５０であっ
た。該プローブは、５’末端にフルオレセイン（ＦＡ
Ｍ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を結合し、ＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長を阻止するために３’−ＯＨに代えて３’−ＰＯ
4 を結合して合成された。
アーゼアッセイを使用して増幅生成物を検出可能とする
ために、各反応混合物に含まれていた。使用されたプロ
ーブは、米国特許第５，５２７，６６９号及びＹｏｕｎ
ｇ等、１９９５前出文献に記述されるＫＹ１５０であっ
た。該プローブは、５’末端にフルオレセイン（ＦＡ
Ｍ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を結合し、ＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長を阻止するために３’−ＯＨに代えて３’−ＰＯ
4 を結合して合成された。
【００４７】増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐＴＣ９６００ Ｄ
ＮＡ熱サイクラー中で薄壁のＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チュ
ーブ（共にＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌ
ｋ、ＣＴ）を使用し、下記の温度プロフィルにて実施さ
れた： 温度サイクルに次いで、反応物を分析前には−２０℃に
維持した。
ＮＡ熱サイクラー中で薄壁のＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チュ
ーブ（共にＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌ
ｋ、ＣＴ）を使用し、下記の温度プロフィルにて実施さ
れた： 温度サイクルに次いで、反応物を分析前には−２０℃に
維持した。
【００４８】増幅生成物の検出 増幅されたＨＣＶ核酸は、ゲル電気泳動、及び５’−ヌ
クレアーゼアッセイの両者により分析された。ゲル電気
泳動は、増幅生成物の存在の容易に視覚的に確認するこ
と、および生成した増幅生成物の相対量の大まかな評価
を与える。５’−ヌクレアーゼアッセイは、生成した増
幅生成物の量の正確な定量的評価を与えるために使用さ
れた。
クレアーゼアッセイの両者により分析された。ゲル電気
泳動は、増幅生成物の存在の容易に視覚的に確認するこ
と、および生成した増幅生成物の相対量の大まかな評価
を与える。５’−ヌクレアーゼアッセイは、生成した増
幅生成物の量の正確な定量的評価を与えるために使用さ
れた。
【００４９】Ａ．ゲル電気泳動 増幅生成物の存在は、以下のようにしてゲル電気泳動に
より検出された。反応生成物をアガロースゲル（３％
ＮｕＳｉｅｖｅTM及び１％ ＳｅａＣｈｅｍTM）並びに
１Ｘ ＴＢＥ（０．０８９Ｍ トリス、０．０８９Ｍ
ほう酸、０．００２５Ｍ ＥＤＴＡ二ナトリウム）操作
緩衝溶液を使用して分画した。電気泳動を１００ボルト
にて約１時間実施した。電気泳動に続いて、存在する任
意のＤＮＡを染色するためにエチジウムブロマイド
（０．５μｇ／ｍｌ）を添加した。ゲルを水中で大まか
に脱色し、ＤＮＡのエチジウムブロマイド染色バンドを
ＵＶ輻射を使用して可視化した。
より検出された。反応生成物をアガロースゲル（３％
ＮｕＳｉｅｖｅTM及び１％ ＳｅａＣｈｅｍTM）並びに
１Ｘ ＴＢＥ（０．０８９Ｍ トリス、０．０８９Ｍ
ほう酸、０．００２５Ｍ ＥＤＴＡ二ナトリウム）操作
緩衝溶液を使用して分画した。電気泳動を１００ボルト
にて約１時間実施した。電気泳動に続いて、存在する任
意のＤＮＡを染色するためにエチジウムブロマイド
（０．５μｇ／ｍｌ）を添加した。ゲルを水中で大まか
に脱色し、ＤＮＡのエチジウムブロマイド染色バンドを
ＵＶ輻射を使用して可視化した。
【００５０】Ｂ．５’−ヌクレアーゼアッセイ 上述したように、増幅は、フルオレセイン標識され、Ｄ
ＮＡポリメラーゼによる伸長を妨害すべく修飾されたＨ
ＣＶ−特異的検出プローブの存在下で実施された。２個
のプライマー結合部位の間に位置するＨＣＶ標的配列の
領域に相補的なプローブは、プライマー伸長の間にｒＴ
ｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性に
より切断される。増幅に続いて、残留する非切断プロー
ブは反応混合物から分離され、次いで残留する切断プロ
ーブ断片の蛍光が、合成された増幅生成物の量を示すも
のとして測定される。
ＮＡポリメラーゼによる伸長を妨害すべく修飾されたＨ
ＣＶ−特異的検出プローブの存在下で実施された。２個
のプライマー結合部位の間に位置するＨＣＶ標的配列の
領域に相補的なプローブは、プライマー伸長の間にｒＴ
ｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性に
より切断される。増幅に続いて、残留する非切断プロー
ブは反応混合物から分離され、次いで残留する切断プロ
ーブ断片の蛍光が、合成された増幅生成物の量を示すも
のとして測定される。
【００５１】非切断プローブは、増幅に続いて、完全長
の非切断プローブに結合するが、切断プローブ断片に感
知可能に結合しないポリエチレンイミン（ＰＥＩ）にて
被覆されたビーズを用いて反応混合物から抽出される。
ＰＥＩビーズは、反応混合物に添加され、非切断プロー
ブの結合が許容され、得られたＰＥＩ−プローブ複合体
が遠心分離により除去される。残留するプローブ切断断
片の量は、蛍光測定により決定される。ＰＥＩビーズ抽
出の詳細は以下に記述される。
の非切断プローブに結合するが、切断プローブ断片に感
知可能に結合しないポリエチレンイミン（ＰＥＩ）にて
被覆されたビーズを用いて反応混合物から抽出される。
ＰＥＩビーズは、反応混合物に添加され、非切断プロー
ブの結合が許容され、得られたＰＥＩ−プローブ複合体
が遠心分離により除去される。残留するプローブ切断断
片の量は、蛍光測定により決定される。ＰＥＩビーズ抽
出の詳細は以下に記述される。
【００５２】使用に先立って、ＰＥＩビーズ（Ｊ．Ｔ．
Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪからのＢ
ａｋｅｒ Ｂｏｎｄ広孔ＰＥＩビーズ）は、４℃にて少
なくとも数時間（または一夜）蒸留脱イオン（ｄｄ）水
に浸漬された。該ＰＥＩビーズは、下記を使用して順次
洗浄された：（１）ｄｄ水、（２）エタノール、（３）
ｄｄ水、（４）１Ｍ トリス（ｐＨ８．３）、（５）５
０ｍＭ トリス（ｐＨ８．３）、１Ｍ ＮａＣｌ、及び
（６）結合緩衝溶液（１０ｍＭ トリス、５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び８
Ｍ 尿素）。最後の洗浄の後、ビーズは３００μｌの結
合緩衝溶液あたり６０ｍｇ（湿重量）のＰＥＩビーズと
なるように結合緩衝溶液中に再懸濁された。
Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪからのＢ
ａｋｅｒ Ｂｏｎｄ広孔ＰＥＩビーズ）は、４℃にて少
なくとも数時間（または一夜）蒸留脱イオン（ｄｄ）水
に浸漬された。該ＰＥＩビーズは、下記を使用して順次
洗浄された：（１）ｄｄ水、（２）エタノール、（３）
ｄｄ水、（４）１Ｍ トリス（ｐＨ８．３）、（５）５
０ｍＭ トリス（ｐＨ８．３）、１Ｍ ＮａＣｌ、及び
（６）結合緩衝溶液（１０ｍＭ トリス、５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び８
Ｍ 尿素）。最後の洗浄の後、ビーズは３００μｌの結
合緩衝溶液あたり６０ｍｇ（湿重量）のＰＥＩビーズと
なるように結合緩衝溶液中に再懸濁された。
【００５３】非結合プローブの捕捉のために、７５μｌ
のＰＣＲ反応混合物が３００μｌのＰＥＩビーズ懸濁物
（約６０ｍｇのＰＥＩビーズ）に添加された。該混合物
を１０分間回転撹拌して混合し、ＰＥＩビーズに非切断
プローブを結合させる。微量遠心機（Ｍｉｃｒｏｆｕｇ
ｅ）中で最高速度にて２分間遠心分離してＰＥＩ−プロ
ーブ複合体を除去した後、２００μｌの上澄みをピペッ
トにてマイクロウエルプレートのウエルに移した。蛍光
を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒTMマイクロタイタープレート読
み取り装置（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）において、室温にて４８
５ｎｍの励起フィルタ（２０ｎｍの透過バンド幅）及び
５３０ｎｍの輻射フィルタ（２５ｎｍの透過バンド幅）
を使用して測定した。
のＰＣＲ反応混合物が３００μｌのＰＥＩビーズ懸濁物
（約６０ｍｇのＰＥＩビーズ）に添加された。該混合物
を１０分間回転撹拌して混合し、ＰＥＩビーズに非切断
プローブを結合させる。微量遠心機（Ｍｉｃｒｏｆｕｇ
ｅ）中で最高速度にて２分間遠心分離してＰＥＩ−プロ
ーブ複合体を除去した後、２００μｌの上澄みをピペッ
トにてマイクロウエルプレートのウエルに移した。蛍光
を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒTMマイクロタイタープレート読
み取り装置（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）において、室温にて４８
５ｎｍの励起フィルタ（２０ｎｍの透過バンド幅）及び
５３０ｎｍの輻射フィルタ（２５ｎｍの透過バンド幅）
を使用して測定した。
【００５４】例２ 先行技術プライマーとの比較−ゲル電気泳動による分析 この例は、本発明のプライマーと、本プライマーに最も
類似する先行技術に記載されたプライマーとの比較を記
述する。比較されるプライマーの性質は、所定数の増幅
サイクルにおいて生成される生成物の量として定義され
る増幅効率である。
類似する先行技術に記載されたプライマーとの比較を記
述する。比較されるプライマーの性質は、所定数の増幅
サイクルにおいて生成される生成物の量として定義され
る増幅効率である。
【００５５】本発明のプライマーに最も類似する先行技
術に記載のプライマーは、米国特許第５，５２７，６６
９号；ヨーロッパ特許公開５２９，４９３号；及びＹｏ
ｕｎｇ等の、１９９３前出文献に記載されたＫＹ８０
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：５）である。これらの先行技術プライマー及
び本発明のプライマーの配列の比較は下記に示される。
術に記載のプライマーは、米国特許第５，５２７，６６
９号；ヨーロッパ特許公開５２９，４９３号；及びＹｏ
ｕｎｇ等の、１９９３前出文献に記載されたＫＹ８０
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：５）である。これらの先行技術プライマー及
び本発明のプライマーの配列の比較は下記に示される。
【００５６】
【表２】
【００５７】増幅を、合成ＨＣＶ ＲＮＡテンプレート
の０、１０、２５及び１００コピーを含む試料を使用し
て、例１に記述されるように実施した。反応を、下記に
示されるプライマーの組合せを使用して実施した。反応
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれのプライマーを
４００ｎＭ含んでいた。反応（ｄ）は、プライマー濃度
を６００ｎＭに増大した点で（ｃ）とは異なっていた。 （ａ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＫＹ７８（SEQ
ID NO ：５） （ｂ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＳＴ７７８ＡＡ
（SEQ ID NO ：２） （ｃ）ＳＴ２８０Ａ（SEQ ID NO ：１）及びＳＴ７７８
ＡＡ（SEQ ID NO ：２） （ｄ）ＳＴ２８０Ａ（SEQ ID NO ：１）及びＳＴ７７８
ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
の０、１０、２５及び１００コピーを含む試料を使用し
て、例１に記述されるように実施した。反応を、下記に
示されるプライマーの組合せを使用して実施した。反応
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれのプライマーを
４００ｎＭ含んでいた。反応（ｄ）は、プライマー濃度
を６００ｎＭに増大した点で（ｃ）とは異なっていた。 （ａ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＫＹ７８（SEQ
ID NO ：５） （ｂ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＳＴ７７８ＡＡ
（SEQ ID NO ：２） （ｃ）ＳＴ２８０Ａ（SEQ ID NO ：１）及びＳＴ７７８
ＡＡ（SEQ ID NO ：２） （ｄ）ＳＴ２８０Ａ（SEQ ID NO ：１）及びＳＴ７７８
ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
【００５８】それぞれのプライマー対を使用した増幅及
び標的数の投入を、３組にて実施した。増幅生成物を、
前述したようにゲル電気泳動にて分析した。結果を図１
に示してある。増幅ＨＣＶ標的配列に対応するバンドが
示され；下方のバンドは非特異的増幅生成物（プライマ
ー二量体）に対応する。
び標的数の投入を、３組にて実施した。増幅生成物を、
前述したようにゲル電気泳動にて分析した。結果を図１
に示してある。増幅ＨＣＶ標的配列に対応するバンドが
示され；下方のバンドは非特異的増幅生成物（プライマ
ー二量体）に対応する。
【００５９】それぞれのＨＣＶ標的濃度について、最大
量の増幅生成物に対応する最も強度が高いバンドは、プ
ライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及
びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用し
て生成された。このプライマー対のみが、１０コピーの
標的から検出可能な量の増幅生成物を生じた。また明ら
かなことは、特に１００コピーの標的を使用した増幅に
おいて、ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び
ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用して
非特異的増幅生成物の量が顕著に減少することである。
増幅（ｃ）及び（ｄ）の比較は、４００ｎＭのプライマ
ー濃度が、６００ｎＭのプライマー濃度より良好な結果
を生じることを示している。
量の増幅生成物に対応する最も強度が高いバンドは、プ
ライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及
びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用し
て生成された。このプライマー対のみが、１０コピーの
標的から検出可能な量の増幅生成物を生じた。また明ら
かなことは、特に１００コピーの標的を使用した増幅に
おいて、ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び
ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用して
非特異的増幅生成物の量が顕著に減少することである。
増幅（ｃ）及び（ｄ）の比較は、４００ｎＭのプライマ
ー濃度が、６００ｎＭのプライマー濃度より良好な結果
を生じることを示している。
【００６０】本発明のＲＴプライマーに起因する改良点
を評価するために、ＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を
使用して実施する増幅を含めた。２５及び１００コピー
の標的配列を用いた増幅（ａ）及び（ｂ）で得られた結
果は、本発明のＲＴ及び上流プライマーの両者の組合せ
を使用した増幅（ｃ）及び（ｄ）により得られるほどに
優れるものではないが、本発明のＲＴプライマーの従来
技術の上流プライマーとの組合せにおける使用が、生成
物の収率においてかなりの改良をもたらすことを示して
いる。
を評価するために、ＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を
使用して実施する増幅を含めた。２５及び１００コピー
の標的配列を用いた増幅（ａ）及び（ｂ）で得られた結
果は、本発明のＲＴ及び上流プライマーの両者の組合せ
を使用した増幅（ｃ）及び（ｄ）により得られるほどに
優れるものではないが、本発明のＲＴプライマーの従来
技術の上流プライマーとの組合せにおける使用が、生成
物の収率においてかなりの改良をもたらすことを示して
いる。
【００６１】ゲル分析は、プライマーＳＴ２８０Ａ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）の優位性の容易に視覚化される証拠を
提供するものではあるが、バンドの強度は、増幅生成物
の正確な定量的比較を与えるものではない。定量的比較
のために、５’−ヌクレアーゼアッセイが使用された。
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）の優位性の容易に視覚化される証拠を
提供するものではあるが、バンドの強度は、増幅生成物
の正確な定量的比較を与えるものではない。定量的比較
のために、５’−ヌクレアーゼアッセイが使用された。
【００６２】例３ 従来技術プライマーとの比較−５’−ヌクレアーゼ分析 この例は、例２に記述したプライマーの組合せを使用
し、増幅生成物の分析が５’−ヌクレアーゼアッセイを
使用して行われた増幅を記述するものである。増幅は、
合成ＨＣＶ ＲＮＡテンプレートを０、１０、２５、１
０2 、１０3 、１０4 、１０5 及び１０6 コピー含む試
料並びに各プライマーについて４００ｎＭのプライマー
濃度を使用して例１に記述されるのと同様に実施され
た。各プライマー対による増幅及び標的数の投入は、３
組にて実施された。上記例２と同様に、下記のプライマ
ーの組合せが使用された。 （ａ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＫＹ７８（SEQ
ID NO ：５） （ｂ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＳＴ７７８ＡＡ
（SEQ ID NO ：２） （ｃ）ＳＴ２８０Ａ（SEQ ID NO ：１）及びＳＴ７７８
ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
し、増幅生成物の分析が５’−ヌクレアーゼアッセイを
使用して行われた増幅を記述するものである。増幅は、
合成ＨＣＶ ＲＮＡテンプレートを０、１０、２５、１
０2 、１０3 、１０4 、１０5 及び１０6 コピー含む試
料並びに各プライマーについて４００ｎＭのプライマー
濃度を使用して例１に記述されるのと同様に実施され
た。各プライマー対による増幅及び標的数の投入は、３
組にて実施された。上記例２と同様に、下記のプライマ
ーの組合せが使用された。 （ａ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＫＹ７８（SEQ
ID NO ：５） （ｂ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＳＴ７７８ＡＡ
（SEQ ID NO ：２） （ｃ）ＳＴ２８０Ａ（SEQ ID NO ：１）及びＳＴ７７８
ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
【００６３】増幅生成物は、例１に記述されると同様に
５’−ヌクレアーゼアッセイを使用して分析された。デ
ータは、初期ＨＣＶ標的配列のコピー数の対数に対す
る、切断プローブ断片の蛍光シグナルとしてプロットし
て図２に示される。各蛍光値は、反復測定の平均値であ
る。各値の標準誤差は、図２に示されている。
５’−ヌクレアーゼアッセイを使用して分析された。デ
ータは、初期ＨＣＶ標的配列のコピー数の対数に対す
る、切断プローブ断片の蛍光シグナルとしてプロットし
て図２に示される。各蛍光値は、反復測定の平均値であ
る。各値の標準誤差は、図２に示されている。
【００６４】図２に示されるデータは、上述した図１に
示されるゲル電気泳動分析にて観察されるのと同様に、
本発明のプライマーを使用して得られる増幅効率におけ
る顕著な改善の確認を与える。プライマー対ＳＴ２８０
Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用して得られる標的配列の
１０−１０5 コピーの増幅にて生じる蛍光シグナルは、
プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び
ＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を使用して対応す
る増幅により生じる蛍光シグナルに比べて顕著に大き
い。さらに、図１においても分かるように、本発明のＲ
Ｔプライマー、ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：
２）を従来技術の上流プライマー、ＫＹ８０（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）との組合せにおいて使用する増幅は、
本発明のＲＴ及び上流プライマーの両者の組合せを使用
して得られるほどに優れるものではないが、生成物の収
率においてかなりの改良をもたらすことを示している。
示されるゲル電気泳動分析にて観察されるのと同様に、
本発明のプライマーを使用して得られる増幅効率におけ
る顕著な改善の確認を与える。プライマー対ＳＴ２８０
Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用して得られる標的配列の
１０−１０5 コピーの増幅にて生じる蛍光シグナルは、
プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び
ＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を使用して対応す
る増幅により生じる蛍光シグナルに比べて顕著に大き
い。さらに、図１においても分かるように、本発明のＲ
Ｔプライマー、ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：
２）を従来技術の上流プライマー、ＫＹ８０（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）との組合せにおいて使用する増幅は、
本発明のＲＴ及び上流プライマーの両者の組合せを使用
して得られるほどに優れるものではないが、生成物の収
率においてかなりの改良をもたらすことを示している。
【００６５】相対的増幅効率のひとつの基準が、所定の
蛍光シグナルを得るために必要なＨＣＶの投入コピー数
の比較により与えられる。図２に示されるように、プラ
イマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び
ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用して
１０コピーのＨＣＶ標的の増幅から得られる平均シグナ
ルは、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を使用し
て１０3 コピーのＨＣＶの増幅から得られる平均蛍光シ
グナルとほぼ等しい。従って、１００倍少ない投入コピ
ー数から同様な量の増幅生成物が得られ、あるいは換言
すれば、プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２）を使用する増幅は、従来技術のプライマーを使用す
る増幅に比べて約１００倍効率が高い。
蛍光シグナルを得るために必要なＨＣＶの投入コピー数
の比較により与えられる。図２に示されるように、プラ
イマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び
ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用して
１０コピーのＨＣＶ標的の増幅から得られる平均シグナ
ルは、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を使用し
て１０3 コピーのＨＣＶの増幅から得られる平均蛍光シ
グナルとほぼ等しい。従って、１００倍少ない投入コピ
ー数から同様な量の増幅生成物が得られ、あるいは換言
すれば、プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２）を使用する増幅は、従来技術のプライマーを使用す
る増幅に比べて約１００倍効率が高い。
【００６６】相対的増幅効率の別の基準は、検出可能な
最小ＨＣＶ標的数の比較により与えられる。プライマー
対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＳＴ７
７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用して、１０
コピーのＨＣＶ ＲＮＡの増幅は明確に検出可能なシグ
ナルを与えた。対照的に、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５）を使用すると１０コピーのＨＣＶ ＲＮＡの増
幅は検出可能なシグナルを生じなかった。１００コピー
より少ないＨＣＶでは、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５）を使用して検出可能なシグナルが生じなかっ
た。
最小ＨＣＶ標的数の比較により与えられる。プライマー
対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＳＴ７
７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用して、１０
コピーのＨＣＶ ＲＮＡの増幅は明確に検出可能なシグ
ナルを与えた。対照的に、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５）を使用すると１０コピーのＨＣＶ ＲＮＡの増
幅は検出可能なシグナルを生じなかった。１００コピー
より少ないＨＣＶでは、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５）を使用して検出可能なシグナルが生じなかっ
た。
【００６７】上流プライマーＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１）とＫＹ８０（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：４）と
の間の配列の類似性、並びに下流プライマーＳＴ７７８
ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）とＫＹ７８（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５）との間の配列の類似性が与えられて
も、増幅効率におけるこの様な劇的な改善を予期しうる
理由は存在しない。本発明のプライマーを使用して得ら
れた観察される改善は、驚くべきものであり、従来技術
から見ても予期されないものである。
Ｄ ＮＯ：１）とＫＹ８０（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：４）と
の間の配列の類似性、並びに下流プライマーＳＴ７７８
ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）とＫＹ７８（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５）との間の配列の類似性が与えられて
も、増幅効率におけるこの様な劇的な改善を予期しうる
理由は存在しない。本発明のプライマーを使用して得ら
れた観察される改善は、驚くべきものであり、従来技術
から見ても予期されないものである。
【００６８】例４ 従来技術プライマーとの比較：５’−ヌクレアーゼアッ
セイ この例は、下記のプライマーの組合せを使用する増幅の
比較を記述する。 （ａ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＫＹ７８（SEQ
ID NO ：５） （ｂ）ＳＴ２８０Ａ（SEQ ID NO ：１）及びＳＴ６７８
Ａ（SEQ ID NO ：３） （ｃ）ＳＴ２８０Ａ（SEQ ID NO ：１）及びＳＴ７７８
ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
セイ この例は、下記のプライマーの組合せを使用する増幅の
比較を記述する。 （ａ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＫＹ７８（SEQ
ID NO ：５） （ｂ）ＳＴ２８０Ａ（SEQ ID NO ：１）及びＳＴ６７８
Ａ（SEQ ID NO ：３） （ｃ）ＳＴ２８０Ａ（SEQ ID NO ：１）及びＳＴ７７８
ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
【００６９】増幅は、合成ＨＣＶ ＲＮＡテンプレート
を０、１０、２５、１０2 、１０3、１０4 、１０5 及
び１０6 コピー含む試料並びに各プライマーについて４
００ｎＭのプライマー濃度を使用して上述されるのと同
様に実施された。各プライマー対による増幅及び標的数
の投入は、３組にて実施された。増幅生成物は、上述と
同様に５’−ヌクレアーゼアッセイを使用して分析され
た。データは、初期ＨＣＶ標的配列のコピー数の対数に
対する、切断プローブ断片の蛍光シグナルとしてプロッ
トして図３に示される。各蛍光値は、反復測定の平均値
である。各値の標準誤差は、図３に示されている。
を０、１０、２５、１０2 、１０3、１０4 、１０5 及
び１０6 コピー含む試料並びに各プライマーについて４
００ｎＭのプライマー濃度を使用して上述されるのと同
様に実施された。各プライマー対による増幅及び標的数
の投入は、３組にて実施された。増幅生成物は、上述と
同様に５’−ヌクレアーゼアッセイを使用して分析され
た。データは、初期ＨＣＶ標的配列のコピー数の対数に
対する、切断プローブ断片の蛍光シグナルとしてプロッ
トして図３に示される。各蛍光値は、反復測定の平均値
である。各値の標準誤差は、図３に示されている。
【００７０】プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）及びＳＴ６７８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３）、またはプライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２）の何れかを使用した１０−１０4 コピーの標的
の増幅から生じた蛍光シグナルは、プライマー対ＫＹ８
０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５）を使用した対応する増幅から生じた蛍
光シグナルを上回った。この結果は、本発明の両プライ
マー対が、従来技術のプライマーより高い効率でＨＣＶ
標的ＲＮＡを増幅したことを示している。
ＮＯ：１）及びＳＴ６７８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３）、またはプライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２）の何れかを使用した１０−１０4 コピーの標的
の増幅から生じた蛍光シグナルは、プライマー対ＫＹ８
０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５）を使用した対応する増幅から生じた蛍
光シグナルを上回った。この結果は、本発明の両プライ
マー対が、従来技術のプライマーより高い効率でＨＣＶ
標的ＲＮＡを増幅したことを示している。
【００７１】プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２）を使用した１０コピーのＨＣＶ標的の増幅から
得られる平均シグナルの、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５）を使用した１０2 コピーのＨＣＶ標的の増幅か
ら得られる平均シグナルに対する比較は、プライマー対
ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１）及びＳＴ７７８
ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用した増幅が１０
倍以上に効率的であることを示している。同様に、プラ
イマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び
ＳＴ６７８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）も、初期ＨＣ
Ｖ標的コピー数の同じ範囲内で、ほぼ１０倍ほど効率的
であることを示している。
ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２）を使用した１０コピーのＨＣＶ標的の増幅から
得られる平均シグナルの、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５）を使用した１０2 コピーのＨＣＶ標的の増幅か
ら得られる平均シグナルに対する比較は、プライマー対
ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１）及びＳＴ７７８
ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使用した増幅が１０
倍以上に効率的であることを示している。同様に、プラ
イマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び
ＳＴ６７８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）も、初期ＨＣ
Ｖ標的コピー数の同じ範囲内で、ほぼ１０倍ほど効率的
であることを示している。
【００７２】例５ トリシン緩衝溶液中での増幅 上述の５’−ヌクレアーゼアッセイは、５’末端がフル
オレセイン（ＦＡＭ）にて標識され、ＤＮＡポリメラー
ゼによる伸長を阻止するために３’−ＯＨに代えて３’
−ＰＯ4 を有するプローブを使用する。増幅は、やはり
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ、ＣＡ）から入手されるヘキサクロロフルオレセイン
（ＨＥＸ）を使用しても実施される。ＦＡＭ−標識プロ
ーブとは異なって、ＨＥＸ−標識プローブは例１に記述
されるビシン増幅緩衝溶液中では不安定であった。しか
しながら、ＨＥＸ−標識プローブが、トリシン増幅緩衝
溶液中で安定であることが見い出された。
オレセイン（ＦＡＭ）にて標識され、ＤＮＡポリメラー
ゼによる伸長を阻止するために３’−ＯＨに代えて３’
−ＰＯ4 を有するプローブを使用する。増幅は、やはり
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ、ＣＡ）から入手されるヘキサクロロフルオレセイン
（ＨＥＸ）を使用しても実施される。ＦＡＭ−標識プロ
ーブとは異なって、ＨＥＸ−標識プローブは例１に記述
されるビシン増幅緩衝溶液中では不安定であった。しか
しながら、ＨＥＸ−標識プローブが、トリシン増幅緩衝
溶液中で安定であることが見い出された。
【００７３】試薬濃度の型どおりの再至適化が推奨され
るが、ビシン及びトリシンを使用する増幅は、本質的に
同等である。トリシン緩衝溶液を使用する増幅のために
指摘であることが見い出された反応混合物は下記に示さ
れる。温度サイクルの変更は必要でない。
るが、ビシン及びトリシンを使用する増幅は、本質的に
同等である。トリシン緩衝溶液を使用する増幅のために
指摘であることが見い出された反応混合物は下記に示さ
れる。温度サイクルの変更は必要でない。
【００７４】ＨＣＶ ＲＮＡテンプレート ４００ｎＭの各プライマー １μＭのＨＥＸ−標識プローブ ２００μＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＵ
ＴＰ ５５ｍＭ トリシン（ｐＨ８．３） ９０ｍＭ ＫＯＡｃ ３．０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）2 ８％ グリセロール ２０単位のｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ* 、並びに ２単位のＵＮＧ* * Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅにより製造及び
開発され、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、
ＣＴにより販売される。
ＴＰ ５５ｍＭ トリシン（ｐＨ８．３） ９０ｍＭ ＫＯＡｃ ３．０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）2 ８％ グリセロール ２０単位のｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ* 、並びに ２単位のＵＮＧ* * Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅにより製造及び
開発され、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、
ＣＴにより販売される。
【００７５】配列表 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：単鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧ ＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧ ＧＣＧＴＴＡ
【００７６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：単鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣ ＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧ ＴＡＣＣＡＣＡＡ
【００７７】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：単鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣ ＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧ ＴＡＣＣＡＣＡ
【００７８】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：単鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧ ＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧ ＧＣＧＴ
【００７９】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：単鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡ ＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧ ＣＡＧＴ
【００８０】
【図１】 図１は、例２に記述されるプライマー対
（Ａ）ＫＹ７８（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：５）／ＫＹ８０
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、（Ｂ）ＳＴ７７８ＡＡ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）／ＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４）、（Ｃ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１）
（４０ピコモル）及び（Ｄ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）（６０ピコモル）をそれぞれ使用した場合の増
幅反応の比較を示す電気泳動図である。
（Ａ）ＫＹ７８（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：５）／ＫＹ８０
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、（Ｂ）ＳＴ７７８ＡＡ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）／ＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４）、（Ｃ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１）
（４０ピコモル）及び（Ｄ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）（６０ピコモル）をそれぞれ使用した場合の増
幅反応の比較を示す電気泳動図である。
【図２】 図２は、例３に記述される５’末端ヌクレア
ーゼアッセイに基づくプライマー対ＫＹ７８／ＫＹ８０
（−−◆−−）、ＳＴ７７８ＡＡ／ＫＹ８０（−■−）
及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−▲−）を使用する
増幅反応の比較を示すグラフである。
ーゼアッセイに基づくプライマー対ＫＹ７８／ＫＹ８０
（−−◆−−）、ＳＴ７７８ＡＡ／ＫＹ８０（−■−）
及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−▲−）を使用する
増幅反応の比較を示すグラフである。
【図３】 図３は、例４に記述される５’末端ヌクレア
ーゼアッセイに基づくプライマー対ＫＹ７８／ＫＹ８０
（−−◆−−）、ＳＴ６７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−▲
−）及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−ｘ−）を使用
する増幅反応の比較を示すグラフである。
ーゼアッセイに基づくプライマー対ＫＹ７８／ＫＹ８０
（−−◆−−）、ＳＴ６７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−▲
−）及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−ｘ−）を使用
する増幅反応の比較を示すグラフである。
Claims (8)
- 【請求項１】 ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１）、ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及び
ＳＴ６７８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）からなる群か
ら選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。 - 【請求項２】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸のポリ
メラーゼ連鎖反応増幅のためのオリゴヌクレオチドプラ
イマー対であって、前記対がＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１）、ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２）及びＳＴ６７８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマ
ーを含む、ＨＣＶ核酸のポリメラーゼ連鎖反応増幅のた
めのオリゴヌクレオチドプライマー対。 - 【請求項３】 ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
またはＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＳ
Ｔ６７８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、またはＫＹ８
０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びＳＴ７７８ＡＡ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）からなる請求項２に記載のオリ
ゴヌクレオチドプライマー対。 - 【請求項４】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸検出の
ためのキットであって、請求項２または３の何れかに記
載のオリゴヌクレオチドプライマー対を含んでなるキッ
ト。 - 【請求項５】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸増幅の
ための方法であって、請求項２または３の何れかに記載
のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用してポリメラ
ーゼ連鎖反応を実施することを含んでなるＣ型肝炎ウイ
ルス核酸増幅方法。 - 【請求項６】 試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核
酸検出方法であって、（ａ）前記試料を、ＳＴ２８０Ａ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）、及びＳＴ６７８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３）からなる群から選択されるオリゴヌクレオ
チドプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー対
を含んだポリメラーゼ連鎖反応増幅混合物中において、
存在する場合にＨＣＶ核酸が増幅されるべく、増幅条件
下において処理し；及び（ｂ）ＨＣＶ核酸の存在を示す
増幅が起こるかどうかを検出することを含んでなる試料
中のＣ型肝炎ウイルス核酸の検出方法 - 【請求項７】 前記プライマー対が、ＳＴ２８０Ａ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）、またはＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）及びＳＴ６７８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３）、またはＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び
ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）からなる請
求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 上記に記述される発明。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US773995P | 1995-11-29 | 1995-11-29 | |
| US007739 | 1995-11-29 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005235224A Division JP3903059B2 (ja) | 1995-11-29 | 2005-08-15 | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09163991A true JPH09163991A (ja) | 1997-06-24 |
| JP3814352B2 JP3814352B2 (ja) | 2006-08-30 |
Family
ID=21727873
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31802796A Expired - Lifetime JP3814352B2 (ja) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー |
| JP2005235224A Expired - Lifetime JP3903059B2 (ja) | 1995-11-29 | 2005-08-15 | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005235224A Expired - Lifetime JP3903059B2 (ja) | 1995-11-29 | 2005-08-15 | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5837442A (ja) |
| EP (1) | EP0776981B1 (ja) |
| JP (2) | JP3814352B2 (ja) |
| AT (1) | ATE220726T1 (ja) |
| CA (1) | CA2191182C (ja) |
| DE (1) | DE69622347T2 (ja) |
| DK (1) | DK0776981T3 (ja) |
| ES (1) | ES2179909T3 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000279200A (ja) * | 1999-02-03 | 2000-10-10 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）の効率的検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびそれの使用 |
| JP2004520075A (ja) * | 2001-05-10 | 2004-07-08 | バイロメッド・リミテッド | レトロウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドおよびそれを用いるレトロウイルス濃度測定方法 |
| JP2006512898A (ja) * | 2002-07-26 | 2006-04-20 | アボット・ラボラトリーズ | Ｃ型肝炎ウイルスの検出及び定量方法 |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7070925B1 (en) | 1996-07-16 | 2006-07-04 | Gen-Probe Incorporated | Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe |
| ES2230631T3 (es) * | 1997-03-20 | 2005-05-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Cebadores modificados. |
| ATE280839T1 (de) * | 1999-02-03 | 2004-11-15 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | Oligonukleotid primer zur effizienten reversen transkription von hepatitis c virus (hcv) rns und verfahren zu deren verwendung |
| EP1046717B1 (en) * | 1999-04-20 | 2010-10-06 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | Method and probes for determining a concentration of target nucleic acid molecules and method for analyzing data obtained by the method |
| US6586584B2 (en) | 2001-01-29 | 2003-07-01 | Becton, Dickinson And Company | Sequences and methods for detection of Hepatitis C virus |
| WO2002070751A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Pcr method |
| EP1236804A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | A method for determination of a nucleic acid using a control |
| US20030152942A1 (en) * | 2001-05-09 | 2003-08-14 | Lance Fors | Nucleic acid detection in pooled samples |
| US6946245B2 (en) | 2001-12-04 | 2005-09-20 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Oligonucleotides and methods for detecting hepatitis C viral nucleic acids |
| WO2004094986A2 (en) | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US7824857B2 (en) * | 2003-12-02 | 2010-11-02 | Musc Foundation For Research Development | Methods and compositions for diagnosing epithelial cell cancer |
| WO2005084254A2 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-15 | Musc Foundation For Research Development | Enhanced detection of rna using a panel of truncated gene-specific primers for reverse transcription |
| EP1774025A4 (en) | 2004-07-09 | 2009-09-16 | Univ Pittsburgh | IDENTIFYING MARKERS IN LUNG AND BREAST CANCER |
| KR20070085275A (ko) * | 2004-09-20 | 2007-08-27 | 유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 | 멀티플 모드에 의한 멀티플렉스 반응 억제 방법 |
| WO2006085328A2 (en) * | 2005-02-14 | 2006-08-17 | Mor Research Applications Ltd. | Method and kit for diagnosing and predicting hepatitis c virus-related neoplastic transformation |
| US20070072211A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-03-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Asymmetric PCR coupled with post-PCR characterization for the identification of nucleic acids |
| US20070128620A1 (en) * | 2005-07-15 | 2007-06-07 | Applera Corporation | Hot start reverse transcription by primer design |
| CA2571904A1 (en) * | 2006-02-15 | 2007-08-15 | Fio Corporation | System and method of detecting pathogens |
| US8119352B2 (en) * | 2006-06-20 | 2012-02-21 | Cepheld | Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times |
| CA2580589C (en) | 2006-12-19 | 2016-08-09 | Fio Corporation | Microfluidic detection system |
| CA2682826C (en) | 2007-04-02 | 2013-08-13 | Fio Corporation | System and method of deconvolving multiplexed fluorescence spectral signals generated by quantum dot optical coding technology |
| JP2010530912A (ja) | 2007-06-22 | 2010-09-16 | フィオ コーポレイション | 量子ドットをドープしたポリマーマイクロビーズの製造システム及び方法 |
| CA2693055C (en) | 2007-07-09 | 2012-02-21 | Fio Corporation | Systems and methods for enhancing fluorescent detection of target molecules in a test sample |
| JP5721161B2 (ja) * | 2007-08-31 | 2015-05-20 | 国立大学法人鳥取大学 | ＴＥＲＴ遺伝子のｃＤＮＡの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット |
| US8551763B2 (en) | 2007-10-12 | 2013-10-08 | Fio Corporation | Flow focusing method and system for forming concentrated volumes of microbeads, and microbeads formed further thereto |
| EP2321810A4 (en) | 2008-06-25 | 2014-09-17 | Fio Corp | BIOLOGICAL THREAT WARNING SYSTEM |
| EP2329278A4 (en) | 2008-08-29 | 2014-05-14 | Fio Corp | PORTABLE DIAGNOSTIC TEST UNIT FOR ONE-TIME USE AND ASSOCIATED SYSTEM AND METHOD FOR TESTING BIOLOGICAL AND ECOLOGICAL SAMPLES |
| CN102348986B (zh) | 2009-01-13 | 2015-05-06 | Fio公司 | 与电子设备和快速诊断测试中的测试盒结合使用的手持诊断测试设备和方法 |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US5322770A (en) | 1989-12-22 | 1994-06-21 | Hoffman-Laroche Inc. | Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription |
| US5310652A (en) | 1986-08-22 | 1994-05-10 | Hoffman-La Roche Inc. | Reverse transcription with thermostable DNA polymerase-high temperature reverse transcription |
| IE62868B1 (en) | 1987-11-18 | 1995-03-08 | Chiron Corp | Hepatitis C virus |
| UA50829C2 (uk) | 1989-03-17 | 2002-11-15 | Чірон Корпорейшн | Очищений поліпептид, що містить антиген вірусу гепатиту с, полінуклеотид, вектор, клітини, система експресії, моноклональне антитіло, препарат поліклональних антитіл, нуклеотидна проба, аналітичні набори, спосіб виявлення нуклеїнових кислот, способи імуноаналізу, вакцина, спосіб одержання антитіл |
| RO113059B1 (ro) | 1989-05-18 | 1998-03-30 | Chiron Corp | Polinucleotida capabila de hibridizare pe o secventa hcv, metoda pentru detectarea unei secvente hcv si procedeu de eliminare a hcv din sange |
| US5035996A (en) | 1989-06-01 | 1991-07-30 | Life Technologies, Inc. | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions |
| DE69131891T2 (de) | 1990-02-16 | 2000-06-15 | Hoffmann La Roche | Verbesserungen in der spezifität und zweckmässigkeit der polymerase-kettenreaktion |
| CA2087724C (en) | 1990-07-24 | 2003-09-16 | John J. Sninsky | Reduction of non-specific amplification during in vitro nucleic acid amplification using modified nucleic acid bases |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| EP0487218B1 (en) | 1990-10-31 | 1997-12-29 | Tosoh Corporation | Method for detecting or quantifying target nucleic acid |
| US5994056A (en) | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| ES2198514T3 (es) * | 1991-08-27 | 2004-02-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Cebadores y sondas para la deteccion de la hepatitis c. |
| CA2136764A1 (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-09 | Ronald L. Marshall | Ligase chain reaction starting with rna sequences |
| DE69428167T2 (de) * | 1993-07-01 | 2002-05-29 | Hoffmann La Roche | Reagenz und Verfahren für reverse Transkription bei hoher Temperatur, verbunden mit einer Polymerase-Kettenreaktion |
| WO1995006753A1 (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-09 | The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services | Method and compositions for primer specific solid-phase detection of pcr products |
| US5491063A (en) | 1994-09-01 | 1996-02-13 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes |
| US5571673A (en) | 1994-11-23 | 1996-11-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes |
| US9105210B2 (en) | 2012-06-29 | 2015-08-11 | Microsoft Technology Licensing, Llc | Multi-node poster location |
-
1996
- 1996-10-28 US US08/738,928 patent/US5837442A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-21 EP EP96118704A patent/EP0776981B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-21 DE DE69622347T patent/DE69622347T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-21 DK DK96118704T patent/DK0776981T3/da active
- 1996-11-21 ES ES96118704T patent/ES2179909T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-21 AT AT96118704T patent/ATE220726T1/de active
- 1996-11-25 CA CA002191182A patent/CA2191182C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-28 JP JP31802796A patent/JP3814352B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-08-15 JP JP2005235224A patent/JP3903059B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000279200A (ja) * | 1999-02-03 | 2000-10-10 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）の効率的検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびそれの使用 |
| JP2004520075A (ja) * | 2001-05-10 | 2004-07-08 | バイロメッド・リミテッド | レトロウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドおよびそれを用いるレトロウイルス濃度測定方法 |
| JP2006512898A (ja) * | 2002-07-26 | 2006-04-20 | アボット・ラボラトリーズ | Ｃ型肝炎ウイルスの検出及び定量方法 |
| JP2010246555A (ja) * | 2002-07-26 | 2010-11-04 | Abbott Lab | Ｃ型肝炎ウイルスの検出及び定量方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69622347T2 (de) | 2003-02-13 |
| CA2191182C (en) | 2004-09-21 |
| ATE220726T1 (de) | 2002-08-15 |
| DK0776981T3 (da) | 2002-11-11 |
| JP2006020642A (ja) | 2006-01-26 |
| DE69622347D1 (de) | 2002-08-22 |
| ES2179909T3 (es) | 2003-02-01 |
| US5837442A (en) | 1998-11-17 |
| EP0776981A3 (en) | 1998-08-19 |
| EP0776981B1 (en) | 2002-07-17 |
| CA2191182A1 (en) | 1997-05-30 |
| JP3903059B2 (ja) | 2007-04-11 |
| EP0776981A2 (en) | 1997-06-04 |
| JP3814352B2 (ja) | 2006-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3903059B2 (ja) | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー | |
| US5112734A (en) | Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna | |
| JP2846018B2 (ja) | 核酸配列の増幅および検出 | |
| US6214979B1 (en) | Homogeneous assay system | |
| JP3644976B2 (ja) | 核酸の増幅の改良法 | |
| US6482592B1 (en) | Methods and kits for isolating primer extension products using modular oligonucleotides | |
| EP0566670A4 (en) | Nucleic acid sequence detection by triple helix formation | |
| IE922008A1 (en) | Improved Methods for Nucleic Acid Amplification | |
| CA2308368C (en) | Specific and sensitive nucleic acid detection method | |
| EP0855447B1 (en) | Method of assay of nucleic acid sequences | |
| UA47432C2 (uk) | Олігонуклеотидний праймер, призначений для ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини типу 1 (віл-1) (варіанти), пара олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 (варіанти), спосіб ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 | |
| EP1567665B1 (en) | Method for lowering both sequence variations and increase of base lines effects in a diagnostic hybridisation assay, assay for performing such a method and probe for use in the assay | |
| JPH04211400A (ja) | 修飾核酸の製造方法 | |
| JP4104657B2 (ja) | ポリヌクレオチド増幅の陽性コントロール | |
| JPH1118785A (ja) | ナイセリア・コノルホエア−特異的オリゴヌクレオチド | |
| JP2673162B2 (ja) | 核酸の高感度検出方法 | |
| US20010010906A1 (en) | Method and kit for diagnosing and/or quantifying by sandwich hybridisation of nucleic acid sequences on solid support | |
| US20170283888A1 (en) | Use of rnase h for the selective amplification of viral dna | |
| IE903415A1 (en) | Nucleic acid detection method using unequal primer¹concentrations in polymerase chain reaction | |
| US20030211492A1 (en) | Detection of nucleic acid target sequences by electron paramagnetic resonance spectroscopy | |
| US20020123038A1 (en) | Oligonucleotide for highly sensitive detection of hepatitis C virus and method for detection thereof | |
| JP2002501361A (ja) | 臨床検査試料におけるリガーゼ連鎖反応の阻害を軽減するためのスペルミジンの使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050513 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050815 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050927 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060125 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060302 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060306 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20060406 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060523 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060605 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090609 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100609 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110609 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110609 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120609 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120609 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130609 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |