JP3644976B2 - 核酸の増幅の改良法 - Google Patents

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Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸の増幅方法に関する。特異的な核酸セグメントの増幅は、特定種の核酸の検出可能な量の製造に特に有用である。例えば、特異的な疾病状態に特徴的な核酸の存在が示されるとき、この核酸は通常生物学的サンプル中に少量存在する。これらの少量の核酸を検出可能にするためには、非常に感受性の検出法を使用するか、非常に多量のサンプル物質を濃縮しなければならない。本発明の増幅法を使用すると、生物学的サンプル中に存在する少量の核酸の特異的なセグメントをも増幅し得る。この増幅した核酸は直ちに、例えば標識化した相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより検出し得る。無論、核酸の増幅は、組換えDNA法で使用する多量の核酸の製造及びクローニング及び配列決定する目的にも有用である。
【０００２】
【従来の技術】
特異的な核酸セグメントの公知の増幅法としては、例えば米国特許第4,683,195号及び同第4,683,202号に記載のポリメラーゼ鎖反応(PCR)並びに、欧州特許出願第0,329,822号に記載の核酸配列ベースの増幅(NASBA)が挙げられる。PCRを用いてプライマー伸長産物を合成し、これを熱変性により鋳型から分離し、次いで鋳型として作用し、ターゲットDNA配列を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーとターゲットDNA配列を処理することにより、多量のデオキシリボ核酸（DNA）を製造する。RNAをPCRで増幅する時、RNA鎖をまず、逆転写酵素を利用してDNA鎖に転写する。ポリメラーゼ鎖反応中の中間体はDNAのみからなる。
【０００３】
NASBAを利用して、多量の一本鎖RNAを、一本鎖RNA若しくはDNAまたは二重鎖DNAから産生する。RNAをNASBAで増幅するとき、ssRNAはs RNAポリメラーゼ認識部位を含む第１のプライマーの延長により第１のDNA鎖の合成用の鋳型として働く。続いて、このDNA鎖は、第２のプライマーの延長により第２の、相補的なDNA鎖の合成用の鋳型として作用し、二重鎖活性RNA-ポリメラーゼプロモーター部位となり、第２のDNA鎖は、RNAポリメラーゼを利用して、第１の鋳型、ssRNAを多量に合成するための鋳型として作用する。
【０００４】
全ての増幅法は、鋳型にプライマーをつけ、続いて使用した増幅法に依存して異なり得る特定の核酸ポリメラーゼによりこれらのプライマーを延長することを含む。
【０００５】
核酸の増幅に関連する問題とは、核酸が種々の二次構造（secondary structure）を形成し得ることである。核酸の鎖は、例えば、ヘアピンループを形成し得る配列を含み得る。これらの二次構造は、鋳型にプライマーを付けること及び引き続く鋳型に沿ってプライマーが延長することを妨害する。増幅プライマーのアニーリングまたは伸長を干渉することにより、これらの二次構造は増幅効率を低下させる。
【０００６】
通常の塩基の対合を弱めるヌクレオチドを増幅時に取り込むことにより、増幅物（amplificate）内の内部ループ形成のような二次構造の形成を阻害する。ヌクレオチドを不安定化するこれらの構造を取り込むことにより、二次構造を不安定化し、増幅はより効率的になる。
【０００７】
核酸中の二次構造の形成は、核酸の配列決定に関する問題としても公知である。というのは、このような構造、即ち、圧縮領域(compressed regions)によりゲル電気泳動時に異常移動パターンを発生するからである。RNAの配列決定に関して合成した核酸フラグメント中のグアノシンに対するイノシンの置換は、D.R.Millsら、P.N.A.S.,Vol.76,pp.2232-2235に記載されている。核酸フラグメント中にイノシンを導入すると、二次構造を妨害し、これにより核酸の配列決定後のゲル分離中の解像度を改良する。
【０００８】
ポリメラーゼ鎖反応で増幅したDNA中に構造を不安定化させる塩基類似体を導入することは、Cetus CorporationによりPCT出願WO90/03443号に開示されている。Cetusらにより請求された方法でPCR増幅時に導入したヌクレオチドを不安定化する構造は、7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェート（c7dGTP）である。PCRでc7dGTPを用いると、7-デアザグアニンを増幅したDNA産物中に取り込む。この類似体は、グアニン環のN-7がフーグスティーン（Hoogsteen）結合の形成を妨害するメチン部分で置換している点が通常のグアニンと異なる。DNA中間体との増幅方法の場合には、c7dGTPを取り込むと増幅効率が上昇する。
【０００９】
核酸ヌクレオチドの増幅に関する本発明の方法は、増幅時に通常の塩基の対合を弱めるリボヌクレオチドを導入することにより特徴つけられる。特定のRNA配列は、殆ど崩壊し得ない非常に強固な二次構造を形成することが知られている。本発明による方法を使用した通常の塩基の対合を弱めるリボヌクレオチドは、増幅時にリボ核酸中間体に取り込まれ、増幅を妨害し得るヘアピンループ様の二次構造をそれほど形成し得ないリボ核酸を作成する。通常の塩基の対合を弱めるリボ核酸として、イノシン-トリホスフェート（ITP）を使用するのが好ましい。ITPはグアニン-トリホスフェート（GTP）の類似体である。核酸中に取り込まれるとき、イノシンはシトシンと２個の水素結合を形成するだけであるが、グアニンはシトシンと３個の水素結合を形成するという点でイノシンはグアニンと異なる。従って、I-C塩基対は通常G-C塩基対と比較して比較的弱い。従って、比較的強いG-C塩基対により通常一緒に保持される二次構造が、ITPの取り込みにより弱められるか、全く形成しない。ITPは好適な核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長時にリボ核酸に取り込まれる。このようにして形成した核酸鎖は二次構造をそれほど形成し得ないので、これらは次の増幅サイクルでより効率的な鋳型として役立つ。
【００１０】
本発明の方法は、PCRと異なり、DNA並びにRNAから出発する多量のRNA中間体を産生するNASBAと似た増幅方法で特に有用である。PCRでの増幅時にDNA中間体にイノシンを取り込むと、上記PCT出願(WO90/03443号，Cetus Corp.)に記載の如くプライマー伸長時に塩基の食い違いが頻繁に起こる。RNA中間体を産生する増幅方法を用いると、意外にも良好な結果が得られ、増幅の誤差率も明らかに、ITPを取り込まない通常の増幅よりも高くない。特にNASBAを増幅方法として使用すると、増幅時のITPの取り込みにより、10〜100倍も高い増幅係数で起きた。これは、ITPを取り込むと、ITPを取り込まない場合よりも、生物学的サンプル中に存在する核酸の元の量から10〜100倍も多くRNAを産生し得ることを意味する。
【００１１】
本発明の方法により、ITPは、GTP、UTP、CTP及びATPのような通常のリボヌクレオチドを含む増幅混合物に添加し得る。
【００１２】
添加されたITPは、通常存在するGTPを一部置換するのが好ましい。増幅反応混合物中に存在するGTPの50%以下がITPと置換されている場合に、良好な結果が得られる。ITP:GTPの比が高すぎると、増幅は妨害される。ITPは増幅に関して使用した酵素NASBAで用いたT7ポリメラーゼのような核酸ポリメラーゼの基質として、通常のGTPと同じようには良好でないことが証明された。ITP:GTPの最適比は、約1:3であることが知見された。このようにして、必要なだけのITPが増幅された核酸中に取り込まれ、剛直な二次構造の形成は妨害するが、増幅反応混合物中に存在するITPの量によって増幅は妨害されない。
【００１３】
通常の塩基の対合を弱めるリボヌクレオチドを含むことを特徴とするヌクレオチドの混合物を含む核酸の増幅用キットは、本発明の一部である。このような増幅キットは、さらに、増幅すべき特異的な核酸に好適な増幅プライマー及び必須酵素などの他の増幅試薬を含み得る。
【００１４】
本発明は、核酸が相補的な検出プローブにハイブリダイズされ、検出すべき核酸を本発明による核酸の増幅方法に従って増幅した場合の増幅した核酸の検出方法にも関する。増幅時に通常の塩基の対合を弱めるヌクレオチドを取り込むと、より効率的な増幅及びより感受性の検出の両方が得られる。検出すべき核酸に対し相補的な検出プローブのハイブリダイゼーションは、増幅した核酸中の二次構造の存在によっても影響され得る。二次構造は、増幅した核酸へのオリゴヌクレオチドの結合を妨害し得る。核酸への標識オリゴヌクレオチドの結合を用いて二次構造を妨害すると、検出方法の感受性を下げ得る。本発明の増幅した核酸の検出方法を用いると、増幅した核酸及び相補的オリゴヌクレオチドのアニーリングを妨害する二次構造の形成を防止するので、感受性が増加する。従って、増幅した核酸に阻害ヌクレオチドを取り込むことにより、２倍都合が良い。即ち、増幅効率が増加するだけでなく、検出プローブに核酸をハイブリダイズすることにより核酸を検出する場合、検出方法の感度もかなり改良する。
【００１５】
増幅した核酸の検出を実施する慣用の一方法では、増幅した核酸を含むサンプルをゲル電気泳動にかけ、ゲルをフィルターにブロットし、核酸を標識相補的オリゴヌクレオチドである検出プローブとハイブリダイズすることにより実施する。本発明による方法により増幅された検出すべき核酸は、ややほどけた形でフィルターに結合する。これは、通常の塩基の対合を弱めるヌクレオチドを取り込むことにより二次構造の形成が妨害されるからである。二次構造が存在しないので、フィルターまたは任意の他の固相に存在する増幅した核酸への相補的配列のハイブリダイゼーションは改良される。
【００１６】
無論、本発明の検出方法は、上記の態様に限定されない。相補的配列への増幅した核酸のハイブリダイゼーションを含む任意の検出方法が、増幅時に通常の塩基の対合を弱めるヌクレオチドの取り込む作用から恩恵を得、これにより二次構造の形成が妨害される。本発明の方法は、増幅した核酸が相補的配列にハイブリダイズされる場合、任意の他の検出方法に等しく適用し得る。例えば、検出プローブは、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイと同様に、固相上に固定化された相補的オリゴヌクレオチドであってもよい。この場合、増幅した核酸は、固相上に固定化された相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより固相に結合し、第２の、標識化相補的オリゴヌクレオチドを有する固定化された増幅した核酸をハイブリダイズすることにより検出し得る。
【００１７】
さらに、本発明は増幅した核酸の検出用試験キットに関する。このような試験キットは、通常の塩基の対合を弱める特定量のヌクレオチドを含むヌクレオチドの混合物、好適な増幅プライマー及び酵素（核酸ポリメラーゼ）を含む核酸増幅用の好適な試薬並びに、例えば、増幅した核酸が結合可能であり、その上に固定化された相補的オリゴヌクレオチドを含む固相及び第２の相補的標識化オリゴヌクレオチドなどのような検出手段を含み得る。または、増幅した核酸を電気泳動にかける際、電気泳動終了後、核酸を検出するのに好適な試薬を試験キットに含め得る。電気泳動後に増幅した核酸を検出するための試薬としては、電気泳動前または後に増幅した核酸にハイブリダイズし得る標識化相補的オリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドが標識化酵素であるとき、試験キットは、酵素標識用の好適な基質も含み得る。
【００１８】
本発明の好適な態様を実施例１に示す。この実施例及びその結果を記載する図１より、増幅方法に於いてITPを取り込むと、増幅方法の効率を明らかに改良し、検出時の感度を高めることが理解されよう。標識化オリゴヌクレオチドの増幅物に対する結合が改良されているので、検出時に得られたシグナル強度は増加する。
【００１９】
【実施例】
実施例１： NASBA による HCV ゲノムの一部の増幅及び続く増幅した核酸の検出
ベクターpGem7z f(＋)（Promega）は、HCVゲノムの227nt（UTR-領域）の、smaI部位（多価クローニング部位）に挿入を含む。ベクターは、＃14と呼称される。PromegaプロトコルによりT7-ポリメラーゼによる転写を実施すると、（＋）RNA鎖を産生する。in vitroで生成した（＋）RNAを、（標準）NASBA−sopにより増幅した。ITPを、2.5NM NASBA緩衝液に添加した。ITP:GTP比は1:3であった。増幅した核酸は、天然のゲルシステム（３% nusive/1%アガロース）上で電気泳動にかけ、ζプローブ膜上にブロットし、増幅物の内部フラグメントに相補的である32Ｐ標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。核酸分子の種々の開始量（102〜108分子を変動する投入量）を有するサンプルを増幅した。得られた結果は、同一核酸セグメントをITPを添加せずに増幅したときに得られた結果と比較した。図１に結果を示した。この図から、ITPの存在下で増幅した核酸の投入量102分子ではゲル中で検出可能なバンドとなったが、ITPを含まずに増幅した核酸は、増幅を投入量104分子で開始したときにやっと検出可能なシグナルを与えたことが解る。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の結果を示す電気泳動（オートラジオグラム）の写真である。

Claims (6)

  1. 標的核酸配列の増幅方法であって、
    （ａ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに認識される二重鎖プロモーターを含む標的配列に対応するＤＮＡ鋳型を提供する工程、
    （ｂ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびイノシン三リン酸（ＩＴＰ）を含むリボヌクレオチドの混合物を用いて上記ＤＮＡ鋳型から多数のＲＮＡコピーを転写する工程（該イノシン三リン酸は該混合物中に通常存在するグアニン三リン酸（ＧＴＰ）と部分的に置き換わっている）、
    （ｃ）イノシンヌクレオチドが取込まれている産生されたＲＮＡを、その後の新たな量の二重鎖鋳型の産生に使用し、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返しＲＮＡの量を増幅させる工程を含む上記増幅方法。
  2. ＩＴＰ：ＧＴＰの比が１：３から１：１の範囲である請求項１に記載の方法。
  3. ＩＴＰ：ＧＴＰの比が約１：３である請求項１に記載の方法。
  4. ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ポリメラーゼである、請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 転写を基礎とする増幅方法を実施するための反応混合物であって、
    −ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および
    −イノシン三リン酸（ＩＴＰ）を含むリボヌクレオチドの混合物（該イノシン三リン酸は該混合物中に通常存在するグアニン三リン酸（ＧＴＰ）と部分的に置き換わっている）を含む反応混合物。
  6. 請求項１乃至５に記載の方法を実施するためのキットであって、
    −ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ−ゼを含む、転写を基礎とする増幅反応のための酵素混合物、および
    −イノシン三リン酸（ＩＴＰ）を含むリボヌクレオチドの混合物（該イノシン三リン酸は該混合物中に通常存在するグアニン三リン酸（ＧＴＰ）と部分的に置き換わっている）を含み、更にその他の増幅試薬を含んでいてもよい上記キット。
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