JPH0636760B2 - 核酸の増幅法 - Google Patents

核酸の増幅法

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JPH0636760B2
JPH0636760B2 JP3027815A JP2781591A JPH0636760B2 JP H0636760 B2 JPH0636760 B2 JP H0636760B2 JP 3027815 A JP3027815 A JP 3027815A JP 2781591 A JP2781591 A JP 2781591A JP H0636760 B2 JPH0636760 B2 JP H0636760B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、目的核酸配列の増幅方
法に関する。さらに詳しくは、酵素触媒反応の基質でな
くなるようにプローブまたはプライマーの少なくとも１
種が反応開始部位において可逆的に修飾されている、リ
ガーゼ連鎖反応またはポリメラーゼ連鎖反応増幅法に関
する。修飾の例としては、反応基の化学的ブロッキン
グ、１または２以上の核酸塩基を付加して「突出(overha
ng)」を生成すること、１または２以上の核酸塩基を欠失
させて「後退(recess)」を生成させることなどが挙げられ
る。この修飾末端は、目的配列に依存しない偽のシグナ
ル生成を回避または減少させ、その後に目的配列に依存
した仕方で補正して増幅し得るようにする。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】多く
の場合、核酸に基づく診断アッセイを実行できるかどう
かは、わずかしかない目的分子により生成されるシグナ
ルを増幅することができるかどうかに依存している。シ
グナルを増幅することも一つの解決法ではあるが、核酸
に基づくアッセイ法においては目的配列を増幅すること
がしばしば好ましい解決法となる。目的配列の増幅に
は、目的とされる核酸の切片を繰り返しコピーまたは複
製することが含まれる。
【０００３】ポリメラーゼ連鎖反応(以下、「ＰＣＲ」と
もいう)として知られている目的配列の増幅法では、一
対のプライマー(主プライマーおよび従プライマー)を過
剰に用いて目的核酸の相補鎖の外側末端にハイブリダイ
ズさせる。この目的核酸を鋳型として用い、ポリメラー
ゼによりプライマーをそれぞれ伸長させる。これら伸長
生成物は、それ自体が目的配列となり、その後、最初の
目的鎖から解離される。新たにプライマーをハイブリダ
イズさせてポリメラーゼにより伸長させ、このサイクル
を繰り返して目的配列分子の数を幾何級数的に増大させ
る。ＰＣＲは米国特許第４,６８３,１９５号および同第
４,６８３,２０２号各明細書に記載されている。
【０００４】目的配列増幅の別法は、リガーゼ連鎖反応
(以下、「ＬＣＲ」ともいう)法として知られている。ＬＣ
Ｒでは、２つの主プローブ(第一プローブおよび第二プ
ローブ)および２つの従プローブ(第三プローブおよび第
四プローブ)を過剰で用いる。第一プローブは目的鎖の
第一の切片に、第二プローブは目的鎖の第二の切片にそ
れぞれハイブリダイズし、該第一の切片と第二の切片と
は隣接しており、主プローブがお互いに５'リン酸−３'
水酸基の関係で隣接するように、またリガーゼによりこ
れら２つのプローブを共有結合的に融合またはライゲー
トして融合生成物とすることができるようになってい
る。加えて、同様の隣接様式にて、第三(従)プローブは
上記第一プローブに、第四(従)プローブは上記第二プロ
ーブにそれぞれハイブリダイズすることができる。もち
ろん、目的配列が最初に二本鎖である場合には、従プロ
ーブはまた第一に目的配列の相補鎖にハイブリダイズす
る。従プローブの融合鎖が目的鎖から分離されたら、該
融合鎖は第三プローブおよび第四プローブとハイブリダ
イズし、これら第三プローブおよび第四プローブはライ
ゲートして相補的な従融合生成物を生成し得る。ＬＣＲ
および本明細書に記載する改良法を理解するために、上
記融合生成物は目的配列かまたはその相補鎖のいずれか
に機能的に同等であることを認識することが重要であ
る。ハイブリダゼーションとライゲーションのサイクル
を繰り返すことにより、目的配列の増幅が達成される。
この方法は、ＥＰ−Ａ−３２０３０８号公報中に一層詳
細に記載されている。
【０００５】増幅反応の大きな強みの一つは、極めて少
数の目的分子を検出することができるということであ
る。しかしながら、目的としない配列がシグナルととも
に増幅されると増幅反応の信頼性を損なうおそれがある
ので、増幅法は高度に特異的でなければならないという
ことは重要である。ＰＣＲおよびＬＣＲの両方とも、非
特異的で偽りのバックグラウンドシグナルを生成し得る
し、増幅しさえもする。ＰＣＲおよびＬＣＲに潜在する
原理が異なるため、バックグラウンドシグナル源もそれ
ぞれ異なる(これらについては、以下で別々に説明す
る)。
【０００６】リガーゼ連鎖反応に付随する潜在的問題
は、目的配列に依存しないプローブのライゲーションに
より引き起こされるバックグラウンドシグナルである。
第三プローブは第一プローブに、第二プローブは第四プ
ローブにそれぞれハイブリダイズするので、これらプロ
ーブ(過剰に添加してある)はそれら自体の間で容易に二
本鎖を生成し得る。これら二本鎖は目的配列の存在とは
独立にライゲートされ、融合生成物を生成する。このよ
うな融合生成物は、所望の増幅された目的配列とは識別
することができないにもかかわらず、さらに増幅を推し
進めていく。これら二本鎖の目的配列に依存しない平滑
末端ライゲーションは比較的まれに起こることではある
が、診断アッセイにおいて望ましくない高度のバックグ
ラウンドシグナルを引き起こすことは充分によくあるこ
とである。
【０００７】ＰＣＲにおいて一般に認められている偽り
のバックグラウンドシグナルの原因は、増幅を意図して
いないＤＮＡ分子の領域にプライマー配列がハイブリダ
イズすることによるものである。一般にこのようなハイ
ブリダゼーションが起こるのは、目的試料が、目的配列
に加えて該目的配列とのある種の類似性を有する他の配
列を含んでいるためである。これら類似配列にプライマ
ーがハイブリダイズするのは目的配列にハイブリダイズ
するのに比べれば起こりにくいことではあるが、幾らか
のハイブリダゼーションは起こり得る。そのような意図
していない非特異的なハイブリダゼーションが起こった
場合に、もしもプライマー分子の３'末端ヌクレオチド
が目的分子の相補的ヌクレオチドに首尾よくハイブリダ
イズすると、ポリメラーゼ酵素によってプライマー伸長
が首尾よく開始され、目的配列とは異なるオリゴヌクレ
オチドが生成することがあり得る。場合によっては、こ
のヌクレオチドは指数関数的増幅を担いさえもし得る。
増幅されるかどうかにかかわらず、この偽りのヌクレオ
チド配列は、幾つかの分析状況において目的配列を表示
するものと解釈され、従って間違った結果が導かれるこ
とになる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】オリゴヌクレオチドプロ
ーブおよびプライマーは、ＬＣＲおよびＰＣＲにおいて
それぞれ劇的に異なる役割を果たすものであるが、本明
細書では両方法に適用できる一般的な説明をするため
「イニシエーター」および「プローブ／プライマー」なる語
を使用することにする。本発明の主要な目的は、偽りの
シグナルの生成を減少させることにより、核酸に基づく
アッセイの感度を向上させることにある。この目的は、
少なくとも１種のプローブ／プライマー末端を修飾し
て、プローブ／プライマーが偽りのシグナルの生成に寄
与する可能性を大きく減少させることにより、本発明で
達成される。この修飾したプローブ／プライマーが目的
配列に特異的にハイブリダイズした後にのみ、該修飾末
端を目的配列に依存した仕方で「補正(corrected)」して
該プローブ／プライマーが酵素増幅反応に関与し得るよ
うにする。
【０００９】ＬＣＲかまたはＰＣＲに有用な本発明の特
徴の一つとして、増幅反応の酵素触媒工程に関与するこ
とが必須の基を化学的残基でブロッキングまたはマスキ
ングしてある核酸プローブ／プライマーを提供する。こ
の酵素的な工程は、ＬＣＲではライゲーションであり、
ＰＣＲでは伸長である。いずれの場合も、プローブ／プ
ライマーは目的配列とハイブリダイズし酵素反応を開始
することができ(それゆえ、「イニシエーター」と呼ばれ
る)、ライゲートした生成物または伸長した生成物は「増
幅生成物」と呼ばれる。ブロッキングする基は、実質的
にプローブ／プライマーが目的配列とハイブリダイズし
た場合にのみ酵素により除かれ得るように選択する。別
の態様においては、プローブ／プライマーは一方の末端
に付加塩基からなる突出を含んでいる。これら付加塩基
は、後に目的配列に依存した仕方で開裂して増幅反応が
起こり得るようにする。
【００１０】ＬＣＲの場合の他の特徴としては、プロー
ブはライゲーションの部分に関して後退を有しており、
このため目的配列にハイブリダイズしたときにギャップ
を生成する。このギャップは、後に目的配列に依存した
仕方で埋められてプローブがライゲートできるようにす
る。ギャップを埋めることは、１または２以上のプロー
ブの伸長により、または第五プローブまたは第六プロー
ブを用いた後にライゲートすることにより行うことがで
きる。
【００１１】本発明の他の目的は、第一の配列を第二の
配列から識別するための改良法であって、該第一の配列
は第二の配列と目的領域中で１個の塩基のみが相違して
いるものを提供することにある。この第一の配列は目的
配列と考えることができ、また第二の配列は、識別する
ことが可能な潜在的な交差反応性の鎖と考えることがで
きる。
【００１２】簡単に説明すると、本発明は、目的核酸配
列を酵素的に増幅させて増幅生成物を得る方法であっ
て、酵素が、核酸イニシエーター、核酸イニシエーター
が結合する鋳型としての目的配列または増幅生成物、酵
素的に組み立てて目的配列に相補的な増幅生成物を生成
し得る、構築ブロックとしての少なくとも１種のヌクレ
オシド含有反応物を利用するものであり、該増幅生成物
自体がさらに鋳型として働く方法において、 (ａ)目的配列とハイブリダイズし得る必要なイニシエー
ターであって、該イニシエーターがハイブリダイズした
ときに該酵素が該酵素の基質としての該イニシエーター
に実質的に作用し得ず増幅生成物が組み立てられないよ
うに、少なくとも１種の該イニシエーターを修飾したも
のを用意し、 (ｂ)該イニシエーターを該目的配列とハイブリダイズさ
せてイニシエーター−鋳型複合体を生成させ、 (ｃ)鋳型に依存した仕方で該修飾を補正して該酵素が該
イニシエーター−鋳型複合体に作用し得るようにし、 (ｄ)増幅生成物を酵素的に組み立て、ついで (ｅ)該目的配列から増幅生成物を解離させ、ハイブリダ
イゼーション、補正および組み立て工程を繰り返して所
望の目的配列を増幅させることを特徴とする方法に関す
る。
【００１３】従って、本明細書で「イニシエーター」と
は、ＰＣＲに使用するプライマーか、またはＬＣＲに使
用する１または２以上のプローブのいずれかをいう。伸
長に関連して使用する場合は、ヌクレオシド含有反応物
は、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体である。ラ
イゲーションと関連して使用する場合は、イニシエータ
ーは一対のパートナープローブの一方(すなわち、一つ
の主プローブおよび／または一つの従プローブ)のみで
あり、ヌクレオシド含有反応物は第二のオリゴヌクレオ
チドプローブ(すなわち、該一対のプローブのもう一方
のプローブであり、これは最終的にイニシエーターとラ
イゲートされる)である。
【００１４】修飾の補正は、行った修飾の仕方に依存す
る。しかしながら、本発明の利点を充分に実現するため
には、修飾イニシエーターが実質的に目的配列かまたは
酵素的組み立ての結果生成した増幅生成物(いずれも適
当な鋳型として働く)にハイブリダイズした場合にのみ
補正が行われなければならない。従って、補正は「鋳型
に依存している」。補正試薬および組み立て試薬につい
ては、以下でさらに詳細に記載する。
【００１５】以下、本発明をさらに詳しく説明する。本
発明の目的のためには、目的配列は一本鎖として記載さ
れる。しかしながら、このことは、目的配列は実際は二
本鎖であるがプローブ／プライマーとハイブリダイズす
る前にその相補鎖から分離される場合も含むことが理解
されなければならない。二本鎖の目的配列の場合は、従
プローブ(ＬＣＲの場合は第三プローブＡ'および第四プ
ローブＢ'；ＰＣＲの場合は別のプライマーＢ)もまた目
的配列の相補鎖にハイブリダイズすることにより最初の
工程に関与するであろう。一本鎖の目的配列の場合は、
従プローブまたは従プライマーは最初のハイブリダイゼ
ーション工程には関与しないであろうが、その後のハイ
ブリダイゼーション工程には関与するであろう。目的配
列は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)であってもリボ核酸
(ＲＮＡ)であってもよい。
【００１６】本明細書において「プライム」(')の記号
は、相補的塩基または配列を示すのに用いる。プローブ
またはプライマーが他の配列とハイブリダイズするとき
は該配列に対して「相補的」であるといい、該ハイブリダ
イズした領域中に実質的に相補的な塩基対を有する。従
って、プローブＡは、Ａ'とは末端を共有しない場合で
もＡ'に対して相補的であり得る。ＢおよびＢ'について
も同じことがいえる。同様に、短配列ＸnおよびＹmも、
それぞれＸ'nおよびＹ'mと称する相補的配列を有する。
最後に、単一塩基、たとえばＱの相補体はＱ'で表され
る。本明細書において配列に関連して「相補的」というと
きは、ハイブリダイズした領域中にミスマッチの塩基対
を有する配列をも包含する(ただし、アッセイ条件下で
ハイブリダイズし得えなければならない)。
【００１７】「４種の塩基」とは、ＤＮＡの場合にはグア
ニン(Ｇ)、シトシン(Ｃ)、アデニン(Ａ)およびチミン
(Ｔ)をいうが、ＲＮＡの場合にはグアニン(Ｇ)、シトシ
ン(Ｃ)、アデニン(Ａ)およびウラシル(Ｕ)をいうことも
理解されなければならない。この語はまた、上記塩基の
類似体および誘導体をも包含する。変性塩基であるイノ
シン(Ｉ)を本発明に用いることもできるが、本発明によ
るプローブの修飾部分にＩを用いるのは好ましくない。
【００１８】 Ｉ．ＬＣＲ： ＬＣＲに関しては、本発明の重要な特徴は、平滑末端の
二本鎖を生成し得る２対のプローブを使用する代わり
に、プローブ対の一方の少なくとも一つのプローブが最
初から「修飾」末端を有しており、そのため得られた二本
鎖が「非平滑末端」となり、および／または該二つのプロ
ーブ二本鎖のリガーゼ触媒による融合の基質として適当
でなくなるということである。「修飾末端」は、相補的プ
ローブに関してよりもライゲーション部分に関して定義
される。「修飾末端」は、(１)通常のＬＣＲ条件下でリガ
ーゼ触媒融合に関与することが必須である基(たとえ
ば、５'リン酸基または３'水酸基)上にブロッキング残
基(または付加塩基残基)を有するか(たとえば、図２Ａ
または図２ＢのプローブＡを参照)、または(２)塩基が
欠失して一方のプローブ末端と次のプローブ末端との間
にギャップが生じている(たとえば、図３のプローブ
Ｂ、図４のプローブＡ'およびプローブＢ、図５のプロ
ーブＤおよびプローブＥ)。
【００１９】本明細書では簡便のため、第一のタイプの
修飾末端を「突出」と称する。この突出は、目的配列にハ
イブリダイズしたときにライゲーション部分からはみ出
る付加ブロッキング残基または付加塩基残基である。こ
の「突出」なる語は、プローブとその相補的プローブとが
末端を共有する必要がないという事実から、一つのプロ
ーブがその相補的プローブに関して伸長するということ
と混同すべきでない。第二のタイプの修飾末端は本明細
書では「後退」と称する。後退は、目的配列にハイブリダ
イズした後の主プローブと従プローブとの間のギャップ
である。これらの修飾末端の存在により、目的配列の不
在下で相補的プローブがお互いに平滑末端ライゲーショ
ンを起こすことにより生成される偽陽性シグナルが減少
する。
【００２０】上記プローブをライゲートすることができ
るように、その後に修飾の「補正」を行う。本明細書にお
いて「補正」とは、目的配列に依存した仕方で、上記２つ
の主プローブおよび２つの従プローブをそれらのパート
ナーにライゲートできるようにする工程をいう。従っ
て、目的配列、目的配列の相補鎖またはそれらから生成
したポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしたプロー
ブのみが「補正される」。「補正」は、使用した修飾末端の
タイプにより、種々の方法で行うことができる。
【００２１】本明細書において「ライゲーション部分」ま
たは「ライゲーションを意図する部分」とは、鋳型に依存
した仕方でライゲートすべき２つのプローブパートナー
の間の特定部位をいう。これは、「補正した」プローブが
そのパートナーと５'リン酸−３'水酸基の関係で隣接し
て位置する部位である。４つのＬＣＲプローブの各セッ
トについて、２つのライゲーション部分、すなわち主プ
ローブパートナーのライゲーション部分と従プローブパ
ートナーのライゲーション部分とがある。従来のＬＣＲ
では２つのライゲーション部分はお互いに反対側にあ
り、プローブ対がお互いにハイブリダイズしたときに平
滑末端二本鎖を生成した。本発明では、「突出」の態様の
場合のみ、ライゲーション部分はお互いに反対側にあ
る。ライゲーション部分は、後退の態様ではギャップの
おかげで１または２以上の塩基により置き換えられる。
正確なライゲーション部分は態様毎に異なるので、各態
様を説明するときにさらに詳しく定義する。
【００２２】各プローブは、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)
またはリボ核酸(ＲＮＡ)からなる。従来のヌクレオチド
ホスホールアミダイト化学およびアプライド・バイオシ
ステムズ(Ａpplied Ｂiosystems,Ｉnc.(フォスターシ
ティー、ＣＡ))；デュポン(ウイルミントン、ＤＥ)また
はミリゲン(Ｍilligen)(ベッドフォード、ＭＡ)から入
手可能な装置を用いて所望のプローブを合成することは
日常的な仕事である。プローブの５'末端のリン酸化
は、リガーゼによるライゲーションに必要なときに、当
該技術分野で知られているようにキナーゼによって行う
ことができる。
【００２３】本明細書において、塩基Ｘ、ＹおよびＱ、
およびそれらの相補体は、４塩基のある種のサブセット
(ＮまたはＭ)から選択されたものとして記載する。実際
は、これらの配列は「選択された」ものでは全然ないが、
目的鎖の配列により指令されたものである。この場合に
おける「選択された」とは、所望の特性を有する目的配列
が位置しており、目的配列の適当な切片の周りにプロー
ブが構築されていることを意味する。
【００２４】一般に、本発明の方法は、(ａ)修飾プロー
ブを目的配列(および、二本鎖からなっていて目的配列
の相補鎖が存在する場合は、該相補鎖)にハイブリダイ
ズし、(ｂ)目的配列に依存した仕方で該修飾を補正して
プローブがライゲートできるようにし、(ｃ)補正したプ
ローブをそのパートナーにライゲートして融合生成物ま
たはライゲート生成物を生成させ、ついで(ｄ)該融合生
成物を目的配列から解離させ、上記ハイブリダイゼーシ
ョン、補正およびライゲーション工程を繰り返して所望
の目的配列を増幅する、という繰り返し工程からなる。
工程(ａ)、(ｃ)および(ｄ)に関してはすべての態様につ
いて本質的に同じであり、一緒に説明することができ
る。これらは、従来のＬＣＲに用いるものと一般に同じ
工程である。工程(ｂ)は使用した修飾方法により異なる
ため、各異なるタイプ毎に別々に説明する。
【００２５】修飾プローブの目的配列(および、任意に
目的配列の相補鎖)へのハイブリダイゼーションは、従
来技術、たとえばＥＰ−３２０３０８号明細書に適切に
説明されている。プローブ長、プローブ濃度および条件
の厳重さ(stringency)のすべてが、ハイブリダイゼーシ
ョンの起こる程度および速度に影響する。好ましくは、
プローブは、所望の特異性を付与するため、すなわち試
料中のランダムな配列とハイブリダイズするのを防ぐた
め充分に長くなければならない。一般に、１５〜１００
塩基のプローブがこの目的を達成する。現在のところ好
ましいプローブは約１５〜約４０塩基の長さを有するも
のである。
【００２６】各プローブは、化学量論的に反応すると思
われるので、ほぼ等モル濃度で添加する。各プローブ
は、約５ナノモル(ｎＭ)〜約９０ｎＭ、好ましくは約１
０ｎＭ〜約３０ｎＭの範囲の濃度で存在させる。各反応
に使用するプローブの最適量はまた、行わなければなら
ないサイクル数によっても変わる。最適濃度は、当業者
により容易に決定することができる。
【００２７】条件の厳重さは、温度、溶媒および他のパ
ラメーターに依存することが当業者には一般に知られて
いる。これらのパラメーターのうちでおそらく最も制御
し易いのは温度であるので、これは一般にＬＣＲを行う
際に変化させる厳重さのパラメーターである。本発明の
方法を行うのに必要な厳重さの条件は通常のＬＣＲとさ
ほど異ならないので、さらに詳細な説明は必要でないで
あろう。日頃の実験者は、以下に記載する実施例に従っ
て行うことができるであろう。
【００２８】一般的方法の次工程は特別の補正工程の後
に行うものであり、一つのプローブをその隣接するパー
トナーにライゲートするものである。それゆえ、各主プ
ローブをその関連主プローブにライゲートし、各従プロ
ーブをその関連従プローブにライゲートする。「隣接」プ
ローブとは、隣接した配向で目的配列にハイブリダイズ
し得るプローブのうちの一つであり、一方のプローブは
そのパートナープローブの３'水酸基末端に５'リン酸基
末端が隣接して位置している。「隣接」プローブは、目的
配列に依存した仕方で修飾末端を補正して得られる。酵
素的ライゲーションが、２つの隣接プローブを共有結合
的に結合させる好ましい方法であるので、本明細書では
「ライゲーション」の語を用いることにする。しかしなが
ら、「ライゲーション」とは一般的な語であり、２つのプ
ローブを共有結合的に結合するいかなる方法をも包含す
るものと理解すべきである。酵素的ライゲーションに代
わる方法は、ＥＰ−Ａ−３２４６１６号明細書に記載さ
れているような光ライゲーション(photo−ligation)で
ある。
【００２９】好ましい酵素的ライゲーション工程を可能
にする条件および試薬は、当業者に一般に知られてお
り、上記従来技術の説明の際に記載した文献中に開示さ
れている。本発明に有用なライゲーション試薬として
は、大腸菌リガーゼ、Ｔ４リガーゼおよびサームス・サ
ーモフィルス(Ｔhermus thermophilus)リガーゼ(たと
えば、ＡＴＣＣ２７６３４など)(ＥＰ−３２０３０８号
明細書に開示)などの原核生物のリガーゼが挙げられ
る。最後のリガーゼ(サームス・サーモフィルスリガー
ゼ)はＬＣＲの熱的サイクルの間に活性を維持すること
ができるので現在のところ好ましい。熱的に安定なリガ
ーゼが存在しないと、サイクルを繰り返すたびに毎にリ
ガーゼを加えなければならない。真核生物のリガーゼも
また有用であり、たとえばラビン(Ｒabin)らのＪ.Ｂio
l.Ｃhem.２６１：１０６３７〜１０６４７(１９８６)に
報告されているようなキイロショウジョウバエ(Ｄrosop
hilia)属のＤＮＡリガーゼが挙げられる。
【００３０】ライゲーションが終わったら、融合プロー
ブを目的配列から解離(たとえば、融解)させ、従来のＬ
ＣＲと同様、工程を数サイクル繰り返す。繰り返すサイ
クル数は１〜約１００であるが、現在のところ約１５〜
約７０が好ましい。
【００３１】プローブを設計するに際しては、その相補
的(従)プローブにハイブリダイズしたときに、意図する
ライゲーション部位から離れた末端自体が遊離のもの
で、他の必要としないライゲーション反応に関与しない
ようにすることが好ましい。それゆえ、ライゲート可能
な粘着末端または平滑末端は避けるべきである。そのよ
うな末端を使用しなければならない場合は、遊離の５'
リン酸基を回避するかまたは除去すべきである。このこ
とは、(通常、５'末端リン酸基を有しない)オリゴヌク
レオチドプローブを合成することにより、またはホスフ
ァターゼ酵素を使用して末端リン酸基を除去する(たと
えば、ＤＮＡの制限消化により生成したオリゴヌクレオ
チドから)ことにより行うことができる。別法として、
プローブの「間違った」外部末端のライゲーションは、以
下に詳述するように、少なくとも一つのプローブの末端
を「フック(hook)」またはマーカー残基でブロッキングす
ることにより防ぐことができる。
【００３２】増幅後は、当該技術分野で知られた多くの
従来法により増幅配列を検出することができる。特に好
ましい態様においては、少なくとも２つのプローブの利
用できる外部末端(融合生成物の反対の末端)、および好
ましくは４つのすべてのプローブの外部末端にフックを
結合させる。「フック」は、特異的リガンド−レセプター
親和性を有する残基であればいかなるものであってもよ
い。一般に、融合生成物の一方の末端(たとえば、Ａの
５'末端およびＡ'の３'末端)のフックは、固相上にコー
ティングした試薬(抗体やアビジンなど)により固定化し
得る抗原やハプテンからなる。他方の末端(たとえば、
Ｂの３'末端およびＢ'の５'末端)のフックは、抗体−酵
素結合体などの標識または標識系により認識され得る別
の抗原またはハプテンを含む。フックの例としては、当
該技術分野で知られた多くのもののうちでもビオチン、
フルオレセインおよびジゴキシンが挙げられる。ついで
基質を添加すると、基質は酵素により検出可能な生成物
に変換される。エンゾ(Ｅnzo)のＥＰ−Ａ−３３０２２
１号明細書には、一方の末端にビオチン分子を結合した
オリゴヌクレオチドが記載されている。
【００３３】 Ａ．突出修飾末端： すでに述べたように、第一の態様は、少なくとも一つの
プローブに、ライゲーションを意図した部位から延びる
ようにしてブロッキング残基または付加塩基を付加した
修飾末端である。ブロッキング残基または付加塩基は
「突出」からなり、これが平滑末端ライゲーションが不可
能な理由である。第一の変更例では、突出は化学的ブロ
ッキング剤、Ｒからなる。
【００３４】標準的なＤＮＡリガーゼ反応では、ライゲ
ーション部位において基質鎖が３'水酸基と５'リン酸基
を呈示することが必要とされることがよく知られてい
る。幾つかの修飾(特に３'水酸基における)によりＲ基
を導入されることが知られている。Ｒ基は、該修飾末端
がリガーゼ反応に関与できなくするが、修飾鎖が二本鎖
構造の一部であるときは除去することができる。そのよ
うな修飾としては、３'水酸基の酸素原子に水素原子の
代わりに結合した下記Ｒ基が挙げられる； (式中、Ｚは−Ｈ、−(ＣＨ2)nＣＨＯ(式中、ｎは１〜約
３、好ましくは１または２である)、−デオキシリボー
スおよび−ジデオキシリボースよりなる群から選ばれた
基である)。
【００３５】末端をＲ基で適当に修飾したプローブの合
成法は、当該技術分野でよく知られている。たとえば、
３'リン酸基を有するオリゴヌクレオチドの化学合成は
マーキービッツ(Ｍarkiewicz)およびウイアズィキービ
ッツ(Ｗyrzykiewicz)のＮucl.Ａcids Ｒes.１７：７１
４９〜７１５８(１９８９)に記載されている。より大き
なブロッキング基(ある種の試料中に存在しているかも
しれない非特異的なホスファターゼから３'リン酸基を
隠す利点を有するかもしれない)は、末端転移酵素およ
びｄＵＴＰまたはｄｄＵＴＰを用いてオリゴヌクレオチ
ドを調製し、ついでウラシルグリコシラーゼで処理する
ことにより都合よく調製することができる。ウラシルグ
リコシラーゼの精製法は、リンダール(Ｌindahl)らの
Ｊ.Ｂ.Ｃ.２５２：３２８６〜３９２４(１９７７)に教
示されている。ｄＵＴＰ付加の場合には、強塩基で処理
した後、ウラシルグリコシラーゼで処理することにより
グリコアルデヒド誘導体を調製することができる。上記
で例示したＲ基はあくまでも例を示したものに過ぎず、
当業者であれば、同様に機能し得る多くの変更物を合成
することができるであろうことを理解すべきである。
【００３６】酵素のエンドヌクレアーゼＩＶ[シウェク
(Ｓiwek)ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.１６：５０３１〜５
０３８(１９８８)]は、ブロッキング基を含む鎖が相補
鎖にハイブリダイズしている場合に(しかも、実質的に
ハイブリダイズしている場合にのみ)そのようなブロッ
キング基を除去し、３'水酸基を暴露する。エンドヌク
レアーゼＩＶが二本鎖ＡＡ'またはＢＢ'に作用すること
による、目的配列から独立した修飾末端の補正は稀では
あるが、必要なら、修飾末端を有するプローブに相補的
にして１または２以上のヌクレオチドが後退しているよ
うにプローブを設計することにより、そのような目的配
列から独立した修飾末端の補正をさらに最小にすること
ができる。
【００３７】突出末端の他の変更例においては、突出は
付加核酸塩基(プローブが目的配列にハイブリダイズし
たら開裂して除去することができる)からなる。この突
出は、意図するライゲーション部位での嵩高さによりラ
イゲーションを防ぎ、リガーゼ反応に必須に関与する基
を立体化学的にブロッキングまたはマスキングする(ブ
ロッキング末端について記載したように)。この突出と
上記の単なる化学的ブロッキングとの相違は、「ブロッ
キング」基(すなわち、突出)の性質およびサイズにあ
る。これは、本来、プローブ分子とコリニアーにある核
酸残基からなる。しかしながら、該基のサイズは、目的
配列にハイブリダイズしたときに該分子の修飾末端がラ
イゲーション部分の近傍に留まるには余りにも大きすぎ
る。さらに、突出は除去しなければならないので、リガ
ーゼ触媒反応に全く関与し得ないように設計することが
できる(たとえば、５'リン酸基を欠如させることによ
り)。
【００３８】３種の突出を記載するが、これらは単に例
示のために選択したものにすぎない。当業者であれば、
同様に突出を除去し得る他の酵素もまた全く同様に使用
することができることがわかるであろう。その例示と
は、１.本質的にリボヌクレオチドからなる突出(目的配
列がＤＮＡからなる場合)；２.非塩基部位を含む突出；
および３.目的配列中の塩基との塩基対がミスマッチと
なる塩基を含む突出である。しかしながら、一般に、下
記のように突出の除去が鋳型に依存したものとなるよう
に、突出は目的配列に相補的でなければならない。突出
の長さは、１〜１０塩基、好ましくは１〜５塩基であ
る。
【００３９】 １．リボヌクレオチド修飾： リボヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドの合
成法は、アタベコフ(Ａtabekov)らのＦＥＢＳ Ｌet２
３２：９６〜９８(１９８８)に記載されている。リボヌ
クレオチド残基伸長からなる修飾末端を有するＤＮＡプ
ローブを本発明に用いることができる。このリボヌクレ
オチドは、リガーゼに対して適当な基質とはなり得ず、
修飾プローブはライゲートされないし、増幅されないで
あろう。原則として、これら伸長は、選択したプローブ
の５'末端または３'末端のいずれであってもよい。
【００４０】「補正」は、リボヌクレオチドの除去によ
る。リボヌクレアーゼＨと一般に呼ばれる酵素は、天然
に広く分布していることが知られている。そのようなリ
ボヌクレアーゼＨの一つは、シグマ・ケミカルから入手
することができる(Ｃat＃Ｒ６５０１)。そのような酵素
は、鎖がＤＮＡ鎖にハイブリダイズしている場合に(お
よび、本質的にハイブリダイズしている場合にのみ)リ
ボヌクレオチドがその中に存在している核酸鎖から該リ
ボヌクレオチドを選択的に除去する。特定のリボヌクレ
アーゼ(ＲＮＡｓｅ)が鎖からすべてのリボヌクレオチド
を除去するのか１以外のすべてのリボヌクレオチドのみ
を除去するのかについて議論があるが、このことは本発
明には一般に関係のないことである。というのは、少な
くとも幾つかのリガーゼ(たとえば、Ｔ４リガーゼ)がリ
ボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドにライゲー
トし得ることが知られているからである。いかなる特定
のＲＮＡｓｅＨの場合でも、残されるリボヌクレオチド
残基が０個であるのか１個であるのかをＬＣＲの目的の
ために決定することは極めて容易である。２つのリボ修
飾したＬＣＲプローブセット(酵素がすべてのリボヌク
レオチドかまたは１以外のすべてのリボヌクレオチドを
除去することに基づいて設計)を調製するだけでよく、
各場合にＬＣＲ反応の性能を決定する。いったん確立さ
れたら、その後は酵素の挙動を所定のものとして扱うこ
とができる。実際、異なるＲＮＡｓｅＨ種は、３'修飾
または５'修飾が一層容易なのも一層容易でないのもあ
る。このことは、所定のＲＮＡｓｅＨ種について経験的
に容易に決定することができる。
【００４１】そのようなリボヌクレオチド修飾プローブ
をＬＣＲ反応に用いる。２つのプローブパートナーが目
的配列上の隣接領域にハイブリダイズすると、これらは
ＲＮＡｓｅＨが修飾プローブを「補正」しない限り(すな
わち修飾プローブからリボヌクレオチドを除去しない限
り)、リガーゼにより結合され得ない。リボヌクレオチ
ドがプローブの５'末端にある場合は、内部のリン酸基
が暴露されてリガーゼ反応における基質として働く。こ
のことは、プローブの製造においてそのような５'リン
酸基を付加するという特別の工程の必要性をなくすもの
である。ライゲーションが終わると、融合したプローブ
は、標準的なＬＣＲの場合と全く同様に新たな目的配列
として機能する。
【００４２】 ２．非塩基部位開裂： 種々の広範囲に分布する酵素(たとえば、エンドヌクレ
アーゼＩＶ；シウェクら、上記)が、実質的に一本鎖Ｄ
ＮＡがその相補鎖とハイブリダイズして二本鎖となって
いる場合にのみ、該一本鎖ＤＮＡを非塩基部位の位置に
て開裂する。非塩基部位を有するオリゴヌクレオチドの
合成法は、タケシタ(Ｔakeshita)らのＪ.Ｂ.Ｃ.２６
２：１０１７１〜１０１７９(１９８７)に記載されてい
る。修飾オリゴヌクレオチドプローブは、非塩基部位の
位置が、５'末端を寄与することを意図するプローブ上
のライゲーション部位のすぐ５'側か、または３'末端を
寄与することを意図するプローブ上のライゲーション部
位のすぐ３'側になるように合成することができる。い
ずれの場合も、プローブが一緒にハイブリダイズしたと
きに、これら２つのプローブが使用酵素により非塩基部
位にて目的配列に依存しないで開裂されないように、相
補的プローブを設計すべきである。プローブが真の目的
配列にハイブリダイズしたとき以外は非塩基部位のすぐ
近傍で二本鎖構造が生じないように、２部分のライゲー
ションの短い分枝(offsets)を有するようにプローブの
セットを設計することができた。このようにして、補正
は目的配列に依存するものである。
【００４３】目的配列にハイブリダイズする場合は、非
塩基部位での開裂により、(その位置およびその性質の
両方により)リガーゼにより隣接プローブに結合され得
る末端が暴露される。ライゲーション後、融合分子は、
標準的なＬＣＲと同様に新たな目的配列として働く。
【００４４】 ３．ミスマッチ修復： すべての「修飾」オリゴヌクレオチドのうちでおそらく最
も容易であるのは、ハイブリダイズ状態の範囲を越えて
いかなる特別の性質も有しないものである。そのような
オリゴヌクレオチドは、標準的な市販試薬を用い、標準
的な合成法により容易に調製することができる。しかし
ながら、目的配列にハイブリダイズしたときに、そのよ
うな配列の唯一の修飾が示される、すなわち二本鎖中に
ミスマッチの塩基対が存在する。そのようなミスマッチ
塩基対を補正または修復し得る多くの生物学的系が知ら
れている。原則的に、そのような系のいずれもＬＣＲプ
ローブセット中の修飾を補正するために採用することが
できるが、ここでは一般的な方法の例示として一つの系
を詳しく説明することとする。
【００４５】Ａ対Ｇのミスマッチを特異的に認識するこ
とのできる酵素(または酵素複合体)が、カリン(Ｋarin)
らによって報告されている[Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ
ＳＡ８６：８８７７〜８８８１０(１９８９)]。そのよ
うな「Ａ／Ｇミスマッチ」では、この酵素は、Ａを含有す
る鎖を鎖中のＡとその隣の残基との間で開裂する。それ
ゆえ、突出がプローブの残りの部分からＡ残基によって
分離され、該プローブが真の目的配列とハイブリダイズ
したときに該Ａ残基がＧ残基の向かい側の位置にくるよ
うにプローブを設計することができる。真の目的配列に
ハイブリダイズすると、突出はプローブの残りの部分か
らミスマッチのＡ残基も含めて開裂され、その位置およ
びその性質のために、隣接して位置する他のプローブに
リガーゼによって結合され得る末端を暴露する。ライゲ
ーション後、得られた融合分子は、ＬＣＲのその後のサ
イクルにおいて新たな目的配列として機能し得る。
【００４６】別の特徴として、上記方法は、対立性(all
elism)を示しているかもしれない特定の塩基部位の同定
を決定するために用いることができる。特定のＡＧミス
マッチの例においては、たとえば、そのような変化の約
５／６を直接アッセイすることができる。特定部位の最
初の同定は、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかでなければ
ならない。それがＧであるときは、突然変異体はＧ以外
である。同様に、それがＣであるときは、その相補体は
Ｇであり、突然変異体の相補体はＧではない。それがＡ
またはＴであるときは、そのような突然変異体の２／３
はＧかまたはＣのいずれかである。それゆえ、単一塩基
突然変異体対立因子の１／２は特定Ｇの損失となり、残
りの２／３は特定Ｇ残基が現れる結果となる。いずれの
場合も、ＬＣＲプローブセットの構成員の一つにＡ残基
を有利に配置することにより、融合プローブ分子の出現
割合が大きく影響される。Ｇ残基が失われている場合
は、Ａ含有プローブは開裂することができず、ＬＣＲ反
応の進行は著しく損なわれる。新たにＧが出現している
場合は、Ａ含有プローブは開裂することができ、ＬＣＲ
反応の速度は大きく促進される。当業者であれば、上記
ＡＧミスマッチ修復系と同様にして特定部位にて他の単
一塩基の変化を同定するため、異なる特異性を有する他
のミスマッチ修復系を容易に適合することができるであ
ろう。
【００４７】 Ｂ．後退による末端修飾： 第二の態様では、１または２以上のプローブから短い塩
基配列を除去し、プローブが目的配列(または目的配列
の相補鎖、またはそれから生成するポリヌクレオチド)
にハイブリダイズしたときに一方のプローブの５'末端
と他方のプローブの３'末端との間に後退またはギャッ
プが残るようにすることにより、修飾末端を生成させ
る。目的配列を増幅するためのＬＣＲを行うためには、
プローブの間のギャップを埋めなければならない(すな
わち、修飾を「補正」しなければならない)。第一の観点
では、このことは、ポリメラーゼまたは逆転写酵素およ
びギャップの反対側の目的配列に相補的なデオキシヌク
レオチド三リン酸の過剰量を用いて行うことができる。
別法としては、目的配列に相補的な第五のプローブおよ
び該第五プローブに相補的な第六のプローブを用いて行
うことができる。これら別の観点については以下で別々
に記載する。
【００４８】しかしながら、この態様を詳しく説明する
前に、セットなる術語を簡単に説明しておくことが便利
であろう。セット(たとえば、Ｓ)は、該セットＳ内に含
まれるすべての要素からなる。「Ｓでない」セットは、Ｓ
内に認められない「ユニバース(Ｕniverse)」の残りのす
べての要素からなる。本明細書において「ユニバース」
は、上記Ｇ、Ｃ、ＡおよびＴまたはＧ、Ｃ、ＡおよびＵ
の４塩基からなる。セットＳと他のセット(たとえば、
Ｒ)との交差は、ＳおよびＲの両方に認められる要素の
みからなる。それゆえ、本明細書において「ＮでもＭで
もない」セットは、ギャップＸnおよびギャップＹmのい
ずれにも存在しない塩基からなる。本発明では、「Ｎで
もＭでもない」セットは空のセットであってはならな
い、すなわち、このセット中には「停止塩基」をコードす
るため少なくとも１つの塩基が残っていなければならな
い。
【００４９】 １．伸長によるギャップ埋め： 本発明の第一の観点では、本発明は、(ａ)プローブを目
的配列(および、二本鎖からなっていて目的配列の相補
鎖が存在する場合は、該目的配列の相補鎖)にハイブリ
ダイズし、(ｂ)少なくとも一つのプローブを伸長して少
なくとも一つのギャップ(Ｘnと称する)を埋め、(ｃ)該
伸長プローブを隣接プローブにライゲートして融合生成
物またはライゲート生成物を生成し、ついで(ｄ)該融合
生成物を目的配列から解離させ、上記ハイブリダイゼー
ション、伸長およびライゲーションの工程を繰り返して
所望の目的配列を増幅する、という繰り返し工程からな
る。
【００５０】この態様では、「修飾末端」を形成する「ギ
ャップ」Ｘnは、ポリメラーゼおよび逆転写酵素を用いて
１または２以上のプローブを伸長することにより「補正」
する。一般に、ＤＮＡ目的配列にハイブリダイズしたプ
ローブの伸長は、当該技術分野で知られているようにＤ
ＮＡポリメラーゼまたはクレノー断片により行われる。
ＲＮＡ目的配列の場合には、伸長は逆転写酵素により行
われる。逆転写酵素の例としては、一般に当業者に入手
可能なニワトリ骨髄芽球症ウイルス(ＡＭＶ)やモロニー
(Ｍolony)マウス白血病ウイルス(Ｍ−ＭｕＬＶ)などか
らのものが挙げられる。もちろん、Ｔａｑポリメラーゼ
(熱的に安定であり、ＬＣＲに必要な高温のサイクルに
よく耐え得る)などの伸長試薬を利用することが好まし
い。伸長試薬が熱的に安定でなければ、一般にＬＣＲの
各サイクル毎に再添加しなければならない。
【００５１】この方法による補正では、ギャップ領域中
の目的配列の塩基に相補的なデオキシヌクレオチド三リ
ン酸(ｄＮＴＰ'ｓ)が反応混合物中に存在していること
が必要である。さらに詳しく説明すると、配列Ｘnを有
するギャップに関しては、加えなければならないｄＮＴ
Ｐ'ｓはｄＸ'ＴＰ(式中、Ｘ'はギャップＸn中の各塩基
の相補体を意味する)で示される。ｄＮＴＰ'ｓは多くの
市販元から市販されており、たとえばファルマシア(ピ
スカタウエイ、ＮＪ)やベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ(ガイセルスバーグ、ＭＤ)などが挙げられる。
【００５２】伸長は、伸長プローブが隣接プローブに隣
接し、該隣接プローブにライゲートし得るようにライゲ
ーション部位で正確に止めなければならない。この目的
のために「停止塩基」を用いる(図３および図４参照)。
「停止塩基」(Ｑ'と称する)は、その相補体Ｑに基づいて
定義され、Ｑに相補的なｄＮＴＰ'ｓを反応混合物から
省く、すなわちｄＱ'ＴＰを反応混合物から省くことに
より達成される。それゆえ、４種のｄＮＴＰ'ｓのうち
の相補的な３種を反応混合物に加えることができるよう
に、４種の塩基のうちの３種のみからなるセットＮから
ギャップ配列用の塩基をいかにして選択しなければなら
ないかがわかる。第四のｄＮＴＰ、すなわちｄＱ'ＴＰ
が反応混合物から省かれている場合には、伸長は所望の
ライゲーション部位で停止するであろう。従って、Ｑ'
は隣接プローブ中の第一の塩基であり、停止塩基をコー
ドする目的配列上の塩基は、ギャップに隣接する第一の
塩基であるということになる(図３において５'末端
上)。停止塩基Ｑ'自体(相補体Ｑではなく)はＸnギャッ
プの３'末端に隣接して存在していることに注意すべき
である。これは、Ｑ'停止塩基がまた、プローブＢ'の所
望でない３'末端伸長を防ぐためにも存在していなけれ
ばならないからである。
【００５３】より単純な特別の場合の方が概念を把握し
易いので、単一ギャップ法についてまず説明する。しか
しながら、単一ギャップ法は後で説明する二重ギャップ
法の単なる特別な場合にすぎないことを理解すべきであ
る。図３は、一つのプローブのみ(すなわち、Ｂ)がその
５'末端にギャップを有するので単一ギャップ法の態様
を示すものである。第一プローブＡは、目的配列Ｔの第
一の切片にハイブリダイズしている。第二プローブＢ
は、該目的配列の第二の切片にハイブリダイズし、該第
一の切片の５'末端と該第二の切片の３'末端との間に１
または２以上の塩基のギャップを残している。このギャ
ップをＸnと称する。第三プローブＡ'は該第一プローブ
Ａにハイブリダイズすることができ、第四プローブＢ'
は該第二プローブＢにハイブリダイズすることができ
る。図３に示すように、目的配列Ｔは相補鎖Ｔ'を有す
る二本鎖であり得る。この場合には、プローブＡ'およ
びプローブＢ'は、該目的配列の相補鎖の第一の切片お
よび第二の切片にハイブリダイズすることにより最初の
ハイブリダイゼーションに関与する。
【００５４】ポリメラーゼまたは逆転写酵素による伸長
は５'から３'方向に進行する。その後、もし伸長を妨げ
るものが何もなければ、ＡおよびＢ'の両方の３'末端は
ポリメラーゼにより伸長可能である。Ａ'が目的配列の
相補鎖上にハイブリダイズすれば、Ａ'はＢ'の伸長を立
体的に妨害する。しかしながら、Ａ'が目的配列の相補
鎖にハイブリダイズしなくても、Ｂ'の伸長に必要なつ
ぎの塩基(この場合はＱ')が反応混合物からなくなれば
伸長は依然として停止するであろう。逆に、プローブＡ
は、プローブＢか停止塩基相補体(Ｑ)に目的配列上で出
会うまで伸長されていく。Ａ'はＡの伸長のための鋳型
として働かないので、プローブＡは目的配列にハイブリ
ダイズした場合にのみ伸長していく。
【００５５】上記のように、伸長プローブが隣接プロー
ブＢの５'末端にライゲートし得るように、ギャップの
末端(すなわち、ライゲーション部位)でＡの伸長を停止
させることが重要である。それゆえ、反応混合物には、
ギャップＸnの５'末端に最も隣接する塩基に相補的なデ
オキシヌクレオチド三リン酸が省かれている。従って、
Ｘnは、いかなる塩基長であってもよい、すなわちｎは
１または２以上のいかなる整数であってもよい。Ｘの塩
基における唯一の制限は、４種の塩基のうちの３種の塩
基からなるセットＮの中から塩基の選択をしなければな
らないということである。停止塩基Ｑ'をコードするた
めに、少なくとも１種の塩基を残しておかなかればなら
ない。Ｘn配列中に３種よりも少ない塩基を用いた場合
には、残りのいずれの塩基も停止塩基として用いること
ができることを理解すべきである。それゆえ、Ｑは「Ｎ
でない」セットから選択され、ここで「Ｎでない」とは、
４種の塩基(ユニバース)からセットＮに含まれる要素を
省いた塩基からなることをいう。
【００５６】この態様におけるライゲーション部位は、
常にプローブＡ'およびプローブＢの５'末端であること
が今や明らかである。これら末端が停止塩基Ｑの部位で
もあるということは単なる偶然の一致ではない。
【００５７】詳細な説明は後に記載するとして、一般的
な例示を示すことにする。図３においてギャップＸnが
配列ＧＡを示すものとする。それゆえ、塩基は、４種の
塩基のうちの２種からなるセットＮ(Ｎ＝{Ｇ、Ａ})から
選択される。プローブ伸長の間に添加しなければならな
いｄＮＴＰ'ｓはｄＣＴＰおよびｄＴＴＰである。この
例では、停止塩基Ｑ'はＧかＡのいずれかであり、その
相補体ＱはＣかＴのいずれかでなければならない。従っ
て、Ｑが「Ｎでない」セットから選択しなければならない
という要求がいかにして達成されるかが今や明らかであ
る。
【００５８】適当なポリメラーゼの存在下、ＣおよびＴ
の添加によりプローブＡは目的配列を鋳型として用いて
伸長される。しかしながら、鋳型上のＱの位置でポリメ
ラーゼがＣまたはＴと出会うと、反応混合物中にはｄＮ
ＴＰ'ｓとしてＧまたはＡのいずれも添加されていない
のでプローブＡを伸長することはもはやできない。プロ
ーブＡの伸長した３'末端がプローブＢの５'末端と隣接
した状態で、伸長はライゲーション部位にて正確に停止
する。
【００５９】ついで、リガーゼを用いて伸長プローブＡ
の３'水酸基末端をプローブＢの５'リン酸基末端と結合
させ、主プローブと目的配列との間で融合またはライゲ
ートした二本鎖複合体を生成させる。目的配列が二本鎖
であり相補鎖Ｔ'を有している場合には、プローブＡ'お
よびプローブＢ'が目的配列の相補鎖にハイブリダイズ
している場合、リガーゼは該プローブＡ'およびプロー
ブＢ'を最初のサイクルで結合させるであろう。目的配
列の相補鎖ではなく過剰のプローブＡおよびプローブＢ
にハイブリダイズしている場合には、末端は平滑末端で
も粘着末端でもなくライゲーションの基質とはならない
のでライゲーションは抑制される。
【００６０】その後、得られた二本鎖複合体を解離さ
せ、新たなプローブＡ、Ａ'、ＢおよびＢ'を目的配列、
目的配列の相補鎖、および上記第一のサイクルから得た
両融合ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる。上記
と同様に伸長およびライゲーションを行い、この工程を
繰り返す。
【００６１】Ｘn、ＱおよびＱ'の塩基の組み合わせを表
Ｉに示す。本発明はこれらの組み合わせに限定されるも
のではなく、これらの組み合わせは多くの可能な組み合
わせの例示にすぎないことが理解されるであろう。表Ｉ
はまた、Ｎでないセットにより示される塩基からＱを選
択しなければならないという要求をも示している。この
ことは、停止塩基Ｑ'は、その相補体として、Ｘn配列中
には含まれない塩基を有していなければならないことを
意味している。表Ｉ (単一ギャップ法におけるギャップ配列、必要なｄ
ＮＴＰ'ｓ、およびＱとＱ'との可能な組み合わせ) Ｘn／Ｎ Ｘ'ＴＰｓ Ｎでない＊ 停止配列Ｑ' Ａ Ｔ Ｔ、Ｃ、Ｇ Ａ、Ｃ、Ｇ ＧＴ Ｃ、Ａ Ｃ、Ａ Ｇ、Ｔ ＧＣ Ｇ、Ｃ Ａ、Ｔ Ａ、Ｔ ＡＡ Ｔ Ｔ、Ｇ、Ｃ Ａ、Ｃ、Ｇ ＧＣＡ Ｃ、Ｇ、Ｔ Ｔ Ａ ＧＣＡＧ Ｃ、Ｇ、Ｔ Ｔ Ａ ＡＡＡＴＴ Ｔ、Ａ Ｇ、Ｃ Ｃ、Ｇ ＧＣＡＧＣＡ Ｃ、Ｇ、Ｔ Ｔ Ａ ＧＡＣＴ すべて 停止塩基がないので空 (注)＊Ｎでないセットは、停止塩基(Ｑ')の可能な相補
体を与える。実際の停止塩基(Ｑ')の可能性は次の欄に
示してある。
【００６２】すでに記載したように、単一ギャップ法
は、より一般的な二重ギャップ法の特別の場合(ｍ＝０
の場合)である。二重ギャップ法もまた、４つのプロー
ブ、すなわちＡ、Ａ'、ＢおよびＢ'を用いる。この方法
の場合も、上記方法の場合と同様、プローブＢの５'末
端は短くなっていて、主プローブＡおよびＢがハイブリ
ダイズする目的配列の第一の切片と第二の切片の間にＸ
n塩基のギャップを生成する。ギャップＸnの塩基には、
単一ギャップ法の場合と同様の制限が加えられる。
【００６３】さらに、第三プローブＡ'の５'末端もまた
目的配列の相補鎖および第一プローブＡの両方に関して
短くなっており、従プローブ(第三プローブおよび第四
プローブ)の間で第二のギャップＹmを生成する。ギャッ
プＹmはいかなる塩基長であってもよく、Ｘnと同じ長さ
である必要はない(すなわち、ｍはｎと等しい必要はな
い)。実際、ｍは０であってもよく、その場合は、二重
ギャップ法は特別な場合である単一ギャップ法に縮重す
る。
【００６４】本発明の好ましい態様においては、第四プ
ローブＢ'は、目的配列中のＸn配列ギャップと同じ３'
末端配列Ｘnを含んでいる。しかしながら、このこと
は、プローブ間でギャップが生成されればよいので、本
発明にとって必須ではない。それゆえ、第二プローブＢ
に関して３'末端が後退していなければ、第四プローブ
Ｂ'の３'末端は配列Ｘnの３'末端より短く停止していて
よい。伸長は５'末端から３'末端の方向に起こりｄＸ'
ＴＰを添加するので、ちょうど第一プローブＡがＸnギ
ャップ中を伸長されるのと同様に、プローブＢ'はギャ
ップ(ＸnおよびＹmの両方)中を伸長されていくであろ
う。
【００６５】二重ギャップ態様に用いる本発明の方法
は、単一ギャップ態様に用いる方法と非常に類似してい
る。ハイブリダイゼーション、伸長およびライゲーショ
ンの各工程は本質的に同じである。伸長を促進する条件
下、ＡおよびＢ'の両プローブはそれらの３'から伸長し
てそれぞれＸnおよびＹmのギャップを埋めていく。停止
配列Ｑ'は両プローブの伸長をライゲーション部位にて
停止させ、これらプローブは新たに隣接したプローブと
ライゲートされる。
【００６６】しかしながら、Ｙm配列を構成する塩基配
列には幾つかの制限がある。少なくとも１つの停止配列
Ｑ'を残しておかなければならないので、ＸおよびＹの
可能な配列を表すＮとＭとの組み合わせセットは４種の
うちの３種を越える塩基を含んでいてはならない。従っ
て、Ｙは４種の塩基のうちの０からいずれの３種の塩基
であってもよいが、少なくとも１つの塩基は「ＮでもＭ
でもない」セット中に残っていなければならない。セッ
トＮが４種の塩基のうちの３種未満から構成されている
場合は、少なくとも１つの塩基が残っている限りセット
Ｎ中に含まれない塩基であってよい。それらの補集合
が、プローブ伸長停止のための停止塩基Ｑ'として働き
得る。単一の停止塩基が、ＸnとＹmの両ギャップにおい
て伸長を停止させ得る。
【００６７】配列Ｙmの第二の制限は、ｍがｎに等しい
場合に生じる。これらギャップが同じ長さである場合
は、配列Ｙmは配列Ｘnと相補的であってはならない。そ
うでないと、プローブＡの３'末端とプローブＢ'の３'
末端とは「粘着末端」を構成することになる。「粘着末端」
は目的配列に独立して二本鎖複合体を生成させてしま
い、プローブＡはプローブＢ'にハイブリダイズしてラ
イゲーションおよび増幅を起こさせてしまう。そうでは
なく、ｍがｎに等しい場合はＹmがＸnに相補的でないの
が好ましい。言い換えれば、プローブＡおよびプローブ
Ｂ'の末端は、少なくとも、同じ長さであってもよいが
相補的ではない「非粘着(slippery)末端」でなければなら
ない。
【００６８】にもかかわらず、粘着末端(または、一層
起こりにくいことではあるが非粘着末端)などにより目
的配列に独立してライゲーションおよび増幅が起こった
としても、これらの融合生成物は増幅された目的配列か
ら識別することが可能である。ｍがｎに等しい場合に
は、目的配列とは独立してＡ：Ａ'二本鎖複合体がＢ：
Ｂ'二本鎖複合体にライゲートする、小さいが測定可能
な機会がある。これらの複合体は、所望の目的配列より
もｍ(またはｎ)だけ短いので長さに基づいて識別するこ
とができる。さらに、末端が「非粘着性」である場合に
は、塩基ミスマッチを検出および／または破壊すること
のできる多くの試薬により塩基ミスマッチを検出するこ
とができる。たとえば、塩基ミスマッチは、コットン
(Ｃotton)らのＰroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.８５：４３９７
〜４４０１(１９８８)に開示されたヒドロキシルアミン
−オスミウムテトラオキシド法により化学的に決定し、
Ｓ１ヌクレアーゼやヤエナリヌクレアーゼなどの試薬に
より酵素的に決定することができる。Ｘ'とＹ'の幾つか
の組み合わせ、対応ｄＮＴＰおよび可能なＱおよびＱ'
を表ＩＩに示す。
【００６９】表ＩＩ(二重ギャップ法におけるギャップ
配列、必要なｄＮＴＰおよびＱとＱ'の可能な組み合わ
せ)Ｘn／Ｎ Ｙm／Ｍ Ｘ'ＴＰｓ Ｙ'ＴＰｓ Ｎでもなく 停止塩基Ｑ' Ｍでもない＊ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ、Ｃ、Ｇ Ａ、Ｃ、Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｃ、Ａ Ｇ、Ｔ ＡＴ ＡＴ Ｔ、Ａ Ｔ、Ａ Ｃ、Ｇ Ｃ、Ｇ ＡＣ ＧＡ Ｔ、Ｇ Ｃ、Ｔ Ｔ Ａ ＡＴＧ ＡＡＡ Ｔ、Ａ、Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ ＧＧＣＣ ＡＡＡＣＧ Ｃ、Ｇ Ｔ、Ｇ、Ｃ Ｔ Ａ ＡＴＴＧＡ ＡＧＧＴ Ｔ、Ａ、Ｃ Ｔ、Ｃ、Ａ Ｃ Ｇ ＣＧＣ ＧＣＧ 相補的。 認められず。 (注)＊ＮでもなくＭでもないセットは、停止塩基(Ｑ')
の可能な相補体を与える。実際の停止塩基(Ｑ')の可能
性は次の欄に示してある。
【００７０】ギャップＸnおよびＹmの長さは、０(Ｙmの
み)、１または１より大きないかなる整数であってもよ
い。たとえば、１〜２０塩基のギャップが可能である。
しかしながら、実際ははるかに短い長さ、たとえば１〜
３または５塩基のギャップが好ましい。現在のところ最
も好ましいのは、単一の塩基のみからなるギャップであ
る。単一塩基のギャップはバックグラウンドに対する真
のシグナルの比を大きく増大させること、および停止塩
基およびｄＸＴＰ'ｓに対する選択余地が最も大きいこ
とがわかっている。プローブは、実際は、停止塩基を
「選択する」よりも、すでに存在している目的配列に対し
て設計されるので、たいていの場合は単一塩基ギャップ
が一層有用である。
【００７１】その他の特徴 いずれの「後退」法の態様においても、ギャップを埋め
るのに用いるデオキシヌクレオチド三リン酸はマーカー
残基を含むように修飾してよい。マーカーの例として
は、放射性同位体などの直接標識、またはビオチン、ジ
ゴキシンもしくは固相かまたは標識生成系により認識さ
れ得るその他のハプテンなどのフックが挙げられる。同
位体標識の例としては、とりわけ32Ｐおよび重水素など
が挙げられる。
【００７２】ｄＮＴＰ'ｓ中にマーカーを取り込むこと
は、一般に通常の有機化学の問題である。リンカーやス
ペーサーを用いることもできるが、必須のものではな
い。重要なのは、修飾ｄＮＴＰが、その相補体の向かい
側のギャップ中に取り込まれ、隣接する塩基に共有結合
的に結合され得ることのみである。
【００７３】さらに、第一の(目的)配列および単一の塩
基(Ｚ)において異なる第二の(または目的としない)配列
において、該塩基の相違が第二鎖の２つの位置のいずれ
かにあれば、該第一の配列を該第二の配列から識別する
ためにいずれの態様も用いることができる。両方の場合
とも、ただ１種の塩基(長さではなく構成成分)のみを有
するギャップを用いて単一の塩基の相違を識別する。
【００７４】まず、目的としない配列のギャップ領域中
に含まれる相違塩基Ｚは、反応混合物からｄＺ'ＴＰを
省くことにより識別することができる。従って、Ｚはま
たＮでもなくＭでもないセットに属していなければなら
ないともいえる。相違鎖は、適当なヌクレオチド三リン
酸が与えられないのでポリメラーゼにより伸長されるこ
とはない。相違塩基Ｚを識別する最大の可能性があるの
は、単一ギャップがただ１個の塩基の長さであり、Ｎで
もなくＭでもないセットが最も大きくなる場合であるこ
とがわかる。
【００７５】つぎに、相違塩基ＺがＱの位置にある場合
は、伸長が適当に停止することなく、生成する伸長生成
物は余りに長すぎてその関連プローブと目的配列の鎖に
沿ってライゲートできないため、これら鎖を識別するこ
とができる。この態様の場合、識別の最大の可能性があ
るのは、可能な停止塩基がただ１つしかなく、他のすべ
ての塩基では生成物が長すぎるようになる場合である。
【００７６】二重ギャップ態様もまた、単一の塩基相違
をギャップの一方または他方に有する配列を識別するの
に同様に有用である。この態様はまた、停止塩基すなわ
ちＱ'位置に相違塩基を有する配列を識別するのにも有
用であり得る。
【００７７】 ２．別のプローブによるギャップ埋め： この後退態様の観点においては、本発明は、(ａ)修飾プ
ローブを目的配列(および、二本鎖からなっていて目的
配列の相補鎖が存在する場合は、該相補鎖)にハイブリ
ダイズし、(ｂ)第五および第六のギャップ埋めプローブ
を用意して主プローブと従プローブとの間のギャップを
埋め、(ｃ)該ギャップ埋めプローブの両末端を隣接プロ
ーブにライゲートして融合生成物またはライゲート生成
物を生成させ、ついで(ｄ)該融合生成物を目的配列から
解離させ、上記ハイブリダイゼーション、ギャップ埋め
およびライゲーション工程を繰り返して所望の目的配列
を増幅する、という繰り返し工程からなる。この態様に
おいては、上記４つのプローブＡ、Ａ'、ＢおよびＢ'の
代わりにプローブＤ、Ｄ'、ＥおよびＥ'を用いる(図５
参照)。ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ'ｓの代わりに第五
および第六の「ギャップ埋め」プローブＦおよびＦ'を用
い、後退またはプローブ間のギャップを埋める。
【００７８】この態様では３対のプローブを使用する。
第一プローブＤおよび第二プローブＤ'はお互いにハイ
ブリダイズし、第三プローブＥおよび第四プローブＥ'
もまた同様にお互いにハイブリダイズする(この態様で
はプローブの命名が上記態様とは異なること、すなわち
第二プローブはその関連パートナーではなく第一プロー
ブの相補体である。それゆえ、第一プローブと第三プロ
ーブとが主プローブとなる)。主プローブＤおよびＥが
目的配列にハイブリダイズすると、プローブＤの３'水
酸基末端とプローブＥの５'リン酸基末端との間に少な
くとも１塩基、好ましくは数塩基からなるギャップが生
じる。同様に、プローブＤ'およびプローブＥ'が目的配
列の相補鎖Ｔ'にハイブリダイズすると、これらプロー
ブ間に同様に１〜数塩基のギャップが生じる(これらギ
ャップは整列はしないが)。それゆえ、プローブＤと
Ｅ、およびプローブＤ'とＥ'は、隣接せず(non−adjace
nt)平滑末端でもないように修飾されている(その相補体
と二本鎖を生成したときに)。この態様におけるギャッ
プは、主プローブおよび従プローブの両方の間で目的配
列および目的配列の相補鎖に(およびお互いに)ハイブリ
ダイズする第五プローブＦおよび第六プローブＦ'を用
いてギャップを埋めることにより「補正」する。
【００７９】図５からわかるように、これらギャップ埋
めプローブのうちの一方は両方の末端とも他方のギャッ
プ埋めプローブよりも短いのが好ましい。言い換える
と、従プローブＤ'およびＥ'の両方ともがそれぞれの主
プローブを越えて延びているか、または主プローブの両
方ともがそれぞれの従プローブを越えて延びている。さ
らに別の態様では、実施例１３に示すように、一方の主
プローブ(Ｄ)はその従プローブ(Ｄ')を越えて延びてい
るが、他方の主プローブ(Ｅ)はその相補体(Ｅ')よりも
短いところで停止している。しかしながら、この態様で
は、該修飾末端は「間違った」プローブに関して「粘着末
端」であってはならない。たとえば、Ｄ'を越えて延びる
Ｄの３'末端は、Ｆを越えて延びるＦ'の３'末端とのみ
相補的でなければならない。このＤの３'末端は、Ｆ'を
越えて延びるＦの３'末端と相補的であってはならない
し、またＥを越えて延びるＥ'の３'末端とも相補的であ
ってはならない。このことに注意しないと、真の目的配
列の不在下でもプローブ二本鎖の再編成が行われて高い
バックグラウンドシグナルを生じる。
【００８０】この態様のプローブは、前記態様のプロー
ブと同様にして製造することができる。一般に、この態
様のプローブも前記態様のプローブに匹敵する長さを有
する。最後に、この態様では伸長およびポリメラーゼが
不必要であることを除いて、前記態様において有用な反
応条件はこの態様でも有用である。
【００８１】主プローブ間および従プローブ間のギャッ
プがギャップ埋めプローブにより埋められたら、ギャッ
プ埋めプローブの両末端をそれぞれ従プローブまたは主
プローブにライゲートして連続したポリヌクレオチド鎖
を生成させる。主プローブおよび第一のギャップ埋めプ
ローブＦは、目的配列に相補的な主ポリヌクレオチド鎖
を生成し、従プローブおよび第二のギャップ埋めプロー
ブＦ'は、目的配列の相補鎖に相補的な従ポリヌクレオ
チド鎖を生成する。もちろん、この主ポリヌクレオチド
鎖および従ポリヌクレオチド鎖もまたお互いに相補的で
ある。従って、ハイブリダイゼーションおよびライゲー
ションの工程を繰り返すことにより、従来のＬＣＲと全
く同様に目的配列の増幅が得られる。しかしながら、対
照的に、平滑末端ライゲーションに起因する偽陽性シグ
ナルは、この態様では著しく減少する。というのは、二
本鎖複合体ＤおよびＤ'は二本鎖複合体ＥおよびＥ'に平
滑末端ライゲーションができないからである。これは、
従プローブの両方から、または主プローブの両方から１
または２以上の塩基が省かれているからである。
【００８２】もちろん、所望のポリヌクレオチドの他に
他の生成物も生成されるであろうことは理解される。た
とえば、Ｄ：ＦおよびＤ'：Ｆ'、またはＦ：Ｅおよび
Ｆ'：Ｅ'を含む、短い切片(「ダイマー」)が生成すること
が予想される。さらに、これらの副生成物または不完全
生成物は所望の試薬を利用する傾向があるであろうこと
も理解される。しかしながら、過剰の試薬を添加するこ
とによって、および不完全な生成物から所望のポリヌク
レオチドをきれいに分離することにより、この態様は現
在のところ好ましくはないにしても有用ではある。
【００８３】本発明に従ってライゲートしたプローブの
分離および検出は、当該技術分野で知られたいかなる方
法でも行うことができる。好ましい検出方法は、主プロ
ーブまたは従プローブに結合したマーカーを用いること
である。好ましくは、固相により捕捉し得るフックをプ
ローブＤの５'末端に結合させ、プローブＥ'の５'末端
には標識または標識を捕捉し得るフックを結合させる。
ついで、第一のフックを固相で捕捉し、固相を溶液から
分離し、固相に結合した標識を検出することにより所望
のポリヌクレオチド鎖を検出することができる。反応中
に生成した不完全な生成物は、固相で捕捉できないか、
標識で検出できないか、またはその両方である。それゆ
え、分離および検出後、目的配列の不在下では平滑末端
ライゲーションは捕捉フックを標識フックと関連付ける
ことができないので、シグナルはほとんど生じないか、
または全く生じない。
【００８４】 ＩＩ．ＰＣＲ ＰＣＲの原理については文献に詳細な記載がある(たと
えば、米国特許第４,６８３,１９５号および同第４,６
８３,２０２号各明細書参照)。従って、本明細書ではさ
らに詳しく説明する必要はない。基本的に、プライマー
を目的配列にハイブリダイズさせ、ヌクレオチド三リン
酸を組み立てブロックとして用いてポリメラーゼにより
該プライマーを伸長させる。伸長生成物(およびその相
補体)は、さらにハイブリダイゼーションのための鋳型
として働く。一般に、伸長が起こるためにはプライマー
の３'末端は目的配列に完全に相補的でなければならな
い。熱安定ポリメラーゼを含む多くのポリメラーゼが知
られている。
【００８５】本発明では、ＰＣＲプライマーがポリメラ
ーゼ酵素により伸長されないように、該プライマーの
３'末端が修飾されている。これら修飾を鋳型に依存し
た仕方で除去し得る場合には、ポリメラーゼ酵素により
プライマー伸長のためのハイブリダイゼーション要求に
さらに厳重さのレベルが付加される。この付加されたレ
ベルの厳重さは、とりわけ主プライマーおよび従プライ
マーの両方が修飾末端を有している場合、ＰＣＲにおけ
る偽りのシグナル生成を有効に減少させる。
【００８６】ブロッキング基の選択および補正法に関し
てＬＣＲに有用な同じ一般的方法の多くはまた、ＰＣＲ
にも用いることができる。ＬＣＲでは修飾により偽りの
ライゲーションをブロッキングしなければならないが、
ＰＣＲでは修飾により偽りの伸長をブロッキングしなけ
ればならない。それゆえ、修飾またはブロッキングした
３'末端は、目的配列にハイブリダイズしたときにポリ
メラーゼによる伸長を支持してはならない。上記ＬＣＲ
修飾末端態様の記載を適用することができるが、「ライ
ゲーション部位」または「ライゲーションを意図した部
位」なる語の代わりに「伸長開始部位」なる語を用いなけ
ればならない。
【００８７】 Ａ．突出修飾末端： 突出末端については、ＬＣＲ態様の場合に相補的プロー
ブとの関係において記載した。ＰＣＲの場合には、「突
出末端」なる語は匹敵する意味を有しない。ＰＣＲに関
しては、これらの修飾末端は、より適切に「鋳型に依存
したブロッキング基」と記載することができる。にもか
かわらず、ＬＣＲにおける「突出末端」修飾および補正法
はＰＣＲに一般に適用することができる。
【００８８】化学的ブロッキング修飾として、ＬＣＲに
有用なＲ基におけるすべての可能な「Ｚ」残基(−デオキ
シリボースは例外となり得るが)を、ＰＣＲにおける重
合をブロッキングするために用いることができる。さら
に、エンドヌクレアーゼＩＶを用いた同じ補正機構をＰ
ＣＲにも採用することができる。
【００８９】ＬＣＲの「突出修飾」(ライゲーションを意
図した部位を越えた付加核酸からなる)については上記
で記載した。それら修飾は、１．本質的にリボヌクレオ
チドからなる突出、２．非塩基部位を含む突出、および
３．ミスマッチ塩基を含む突出である。これらの修飾は
ＰＣＲには不利であるように思われるが、補正(開裂)す
る突出自体を伸長酵素(たとえば、ポリメラーゼ)の基質
として不活性にすることができれば、上記各クラスの修
飾末端を同様にしてＰＣＲにも用いることができる。突
出を不活化していないと、開裂したときに、その後の不
必要な伸長のプライマーとして働いてしまう。突出を不
活化する一般的な方法は、３'末端が伸長酵素による認
識に適しないようにすることである。プライマーに関連
して上記で記載した修飾は、突出の３'末端をも一般に
不活化するであろう。しかしながら、プライマー修飾の
場合と違って、突出の３'末端の修飾は、プライマー修
飾を補正するのに用いたのと同じ機構により補正されて
しまってはならない。さもないと、両方の修飾が同時に
補正されてしまうからである。容易に補正されない適当
な修飾の例としては、末端ジデオキシヌクレオチド、コ
ルデセピン(cordecepin)、またはプライマーの３'末端
からの伸長を実際に永久に防ぐ公知または発見されるべ
き他のあらゆる化学的修飾が挙げられる。ＬＣＲの場合
のように、これらの修飾は鋳型に依存した仕方で補正す
る。補正法および試薬は、ＬＣＲの場合と同じである。
【００９０】 Ｂ．後退により修飾した末端： ＰＣＲにおいて偽りのシグナル生成を減少させるのに後
退末端修飾が有用であるかどうか、またどのように有用
であるかについては、現在のところまだわかっていな
い。修飾法を選択した後、修飾末端を有する適当なプラ
イマーを調製する。プライマーを目的配列ＤＮＡにハイ
ブリダイズさせる条件は、標準的なＰＣＲ法と同じであ
り、文献に記載されている。その後の伸長、変性、およ
び再ハイブリダイゼーションのサイクルも標準的なＰＣ
Ｒ法と同じであるが、修飾末端を鋳型に依存した仕方で
補正するための酵素または他の試薬が含まれていること
だけが異なっている。
【００９１】つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものでは
ない。特にことわらない限り、実施例中のプローブおよ
び目的配列は５'末端が左にくるように記載してある。実施例１ 簡単にするため、下記目的配列ＤＮＡを一本鎖として
のみ示す。配列中の「−」は、ＬＣＲプローブのライゲー
ションを意図する部位を示す。 ３'−...ＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧ−ＣＣ
ＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＴ...
−５'
【００９２】ＬＣＲにより、バックグラウンドレベルを
減少させて上記目的配列を検出するため下記プローブセ
ットを設計した。 Ａ ５'−ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣｐ Ａ' ３'−ＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧ Ｂ ５'−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣ
ＣＴＧＣＡ Ｂ' ３'−ｐＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴ
Ｇ このプローブセットは、末端３'リン酸基ブロッキング
基(下線を引いてある)を有する２つのプローブ(Ａ＆
Ｂ')を特徴とする。
【００９３】種々の量の目的配列(ｐＵＣ１９)を用い、
ＬＣＲ反応を行う(実質的にＥＰ−Ａ−３２０３０８号
明細書に記載のようにして)。各サイクルのハイブリダ
イゼーション工程の後に、大腸菌から精製したエンドヌ
クレアーゼＩＶを反応混合物に加える。大腸菌エンドヌ
クレアーゼＩＶは、いくらか熱安定性であるので、上記
添加は標準的なＬＣＲ条件下で行うことができる。コン
トロールとして、エンドヌクレアーゼＩＶを添加せずに
同数の目的配列分子を用いてＬＣＲを行う。これらのコ
ントロールにおいて上記と同様のプローブセットを用い
るが、３'末端ヌクレオチド(３'リン酸基含有)だけはプ
ローブＡおよびＢ'に含まれていない。
【００９４】実験反応およびコントロール反応の両方と
も、ライゲート生成物の出現頻度を添加した目的配列分
子の最初の数と関連付ける。これら２つのプロトコール
の異なる点は、第二の場合には、目的配列分子を含有し
ない「ブランク」チューブが１０００個の目的配列分子を
含有するチューブとほぼ同じ速度でシグナルを生成する
のに対して、修飾プローブおよびエンドヌクレアーゼＩ
Ｖを使用した場合には、目的配列分子を含有しない「ブ
ランク」チューブは１０００個の目的配列分子を含有す
るチューブに比べてシグナルの生成が有意に一層ゆっく
りしているということである。このバックグラウンドの
抑制により、アッセイ感度の使用範囲を高める上で有利
となる。
【００９５】ＬＣＲおよびＰＣＲにおいてそれぞれ高度
に熱安定性のリガーゼおよびポリメラーゼが有用で望ま
しいのと同じ理由から、高度に熱安定性のエンドヌクレ
アーゼＩＶを使用することが望ましいことは、当業者に
は直ちに評価されるであろう。さらに、ＤＮＡ鎖の５'
末端または３'末端の修飾を鋳型に依存した仕方で除去
することにより、ブロッキングされていた５'リン酸基
または３'水酸基を完全な形にすることのできる公知ま
たは未知の他の酵素もまた、上記エンドヌクレアーゼＩ
Ｖと全く同様にして用いることができることも当業者に
は評価されるであろう。
【００９６】実施例２ 下記プローブセットを用い、バックグラウンドレベル
を減少させて実施例１の目的配列ＤＮＡを検出すること
ができる。 Ａ ５'−ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ Ａ' ３'−ＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧｒＣｒＣＣＣ Ｂ ５'−ＴＡＣｒＣｒＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ
ＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡ Ｂ' ３'−ＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧ
【００９７】プローブＡ'およびプローブＢは、キメラ
リボ／デオキシリボヌクレオチド伸長(下線を引いてあ
る)を含む。リボヌクレオチド塩基は、その前に小文字
の「ｒ」を付してある。エンドヌクレアーゼＩＶの代わり
にリボヌクレアーゼＨを用い、実施例１と同様にしてＬ
ＣＲ反応を行う。コントロールとしては、実施例１に使
用したものと同じプローブセットを用いることができ
る。結果および解釈は実施例１と同じである。
【００９８】実施例３ バックグラウンドレベルを減少させて実施例１の目的
配列ＤＮＡを検出するため、下記プローブセットをも用
いることができる。 Ａ ５'−ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＪＧ Ａ' ３'−ＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧ Ｂ ５'−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣ
ＣＴＧＣＡ Ｂ' ３'−ＧＪＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣ
ＴＧ
【００９９】プローブＡおよびプローブＢ'は、非塩基
部位(「Ｊ」)のつぎに標準ヌクレオチドが続くことを特徴
とする伸長(下線を引いてある)を含む。実施例１と同様
にしてＬＣＲを行う。結果および解釈は実施例１と同じ
である。
【０１００】実施例４ バックグラウンドレベルを減少させて実施例１の目的
配列ＤＮＡを検出するため、下記プローブセットをも用
いることができる。 Ａ ５'−ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ Ａ' ３'−ＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣ Ｂ ５'−ＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧ
ＡＣＣＴＧＣＡ Ｂ' ３'−ＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧ
【０１０１】プローブＡ'およびプローブＢは、鋳型Ｄ
ＮＡにハイブリダイズしたときに、第一のヌクレオチド
Ａ／Ｇミスマッチおよびハイブリダイズし得る第二のヌ
クレオチドからなることを特徴とするジヌクレオチド伸
長(下線を引いてある)を含む。エンドヌクレアーゼＩＶ
の代わりにＡ／Ｇミスマッチ修復酵素(複合体)を用い、
実施例１と同様にしてＬＣＲ反応を行う。結果および解
釈は実施例１と同じである。
【０１０２】実施例５ ハロタイプ３フェニルケトン尿症(ＰＫＵ)が、あるデ
ンマーク研究群におけるすべてのＰＫＵ対立遺伝子のう
ちの約３８％の原因となっている。これは、フェニルア
ラニンヒドロキシラーゼ(ＰＡＨ)をコードする遺伝子中
のイントロン１２の５'スプライスドナー部位における
単一塩基突然変異(Ｇ＞Ａ)により引き起こされる。実施
例４に記載したバックグラウンド減少のためのミスマッ
チ修復法はまた、この特性を有していると思われる個人
からの血液や他の流体試料において上記遺伝子欠損の存
否を決定するための感度の高いアッセイとしても用いる
ことができる。
【０１０３】ＰＡＨ遺伝子のイントロン１２からの下記
目的ＤＮＡに相補的になるように、下記特定末端部分を
有するプローブを調製する。 (正常ＰＡＨ ＤＮＡ) ３'−...ＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＣＣ
Ｔ...−５' ３'−...ＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣ
Ｔ...−５' (ＰＫＵ ＤＮＡ) Ａ ５'−...ＡＡＡＴＴＡＣＴＴＡ Ａ' ３'−...ＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣ Ｂ ５'−ＣＴＧＴＴＡＡＴＧＧＡ... Ｂ' ３'−ＧＡＣＡＡＴＴＡＣＣＴ... プローブＢおよびプローブＢ'には単一ヌクレオチド伸
長を付加し、標準的なＬＣＲの考察に従いプローブを設
計する(すなわち、１５〜３０量体)。これらの伸長は
(目的ＤＮＡに関して)第一のミスマッチヌクレオチドお
よびそれに続く２つのハイブリダイズし得るヌクレオチ
ドからなっている。
【０１０４】ＰＫＵの存在について試験する患者の血液
からヒトＤＮＡを精製する。ＤＮＡを平均サイズ≦１０
Ｋｂに切断するのが望ましい。上記プローブを用いて、
この試料をＬＣＲに供し、各サイクルのハイブリダイゼ
ーション工程の後にＡＧミスマッチ修復系酵素を加える
(実施例４参照)。試料に野生型の対立遺伝子が含まれて
いないと、ＬＣＲ反応生成物の出現は、もしあったとし
ても、非修飾プローブを用いた標準ＬＣＲ反応に比べて
有意に遅延する。これに対して、野生型の対立遺伝子が
存在していると、ＬＣＲ反応からの融合生成物の出現が
迅速に起こる。
【０１０５】実施例６ 単一ギャップＬＣＲ伸長を８０サイクル行った。各サ
イクルは、コイサーモサイクラー(Ｃoy thermocycler)
[キー・サイエンティフィック(Ｋey Ｓcientific)]を
用い、８５℃で３０秒間のインキュベーションおよび５
０℃で２０秒間のインキュベーションからなっていた。
サイクル数は、平滑末端ライゲーションバックグラウン
ドを最大にするように選択した。０かまたは１０6個の
目的ＤＮＡ分子を用いて反応を開始した。目的ＤＮＡ
は、ＳcrＦ１消化しｐＧＥＭベクター中にクローニング
したＨＰＶ１６ゲノムＤＮＡであった。各反応液にはま
た、１０ｎｇのヒト胎盤バックグラウンドＤＮＡも含ま
れていた。２つの反応は標準平滑末端オリゴヌクレオチ
ドを用いて行い、別の２つの反応は単一のギャップを有
するオリゴヌクレオチドのセットを用いて行った。標準
平滑末端ＬＣＲ反応は、５０ｍＭ ＥＰＰＳ(ｐＨ７.
８)、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、１００μＭ ＮＡ
Ｄ、１０μｇ／ｍｌＢＳＡ、各５×１０11分子のオリゴ
ヌクレオチドＡおよびＢ'(表６ａ)、各７.５×１０11分
子のオリゴヌクレオチドＢおよびＡ"(表６ａ)、および
１×サームス・サーモフィルスＤＮＡリガーゼを含有す
る緩衝液中で行った。オリゴヌクレオチドＡ"の代わり
にオリゴヌクレオチドＡ'を用い、２５ｍＭ ２'−デオ
キシアデノシン５'−三リン酸および１.２５単位のＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼを加えた他は同じ緩衝液中でギャ
ップＬＣＲ反応を行った。これらオリゴヌクレオチド
は、ＨＰＶ１６ゲノムの遺伝子地図の５６９５〜５７４
４位に特異的である。すべての場合において反応液の容
量は５０μｌであり、サイクルを行う前に２５μｌの鉱
油を反応液に被せた。
【０１０６】表６ａ オリコ゛ヌクレオチト゛ Ａ FL- ＡＡＧＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＡ
ＡＴＡＴＧＴ Ａ' ＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴＴＡＣＡ
ＡＣＴ Ａ" ＡＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴＴＡＣＡ
ＡＣＴ Ｂ ＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴＡ
ＴＣＡ-BIO Ｂ' BIO-ＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＧＣＧ
ＴＧＣＡ Ｃ FL- ＡＴＴＴＡＴＡＣＡＴＴＡＡＡＧＧＣＴＣＴＧ
ＧＧＴＣ Ｃ' ＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＴＴＡＡＴＧＴＡＴＡ
ＡＡ-FL Ｄ ＡＣＴＧＣＡＡＡＴＴＴＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡ
Ａ-BIO Ｄ' BIO-ＴＴＴＧＡＡＣＴＧＧＣＴＡＡＡＴＴＴＧＣＡ
ＧＴＡ
【０１０７】増幅後、反応液を滅菌ｄＨ2Ｏで１：１に
希釈し、アボットＩＭｘシステムの原型上で行ったサン
ドイッチイムノアッセイにより二重標識ＬＣＲ増幅生成
物を検出した。その結果は、以下の通りであった。
【０１０８】実施例７ コイサーモサイクラーを用い、二重ギャップＬＣＲ伸
長を３５サイクル行った。インキュベーション時間は上
記実施例６と同じであった。０、１０3または１０6個の
目的分子を用いて反応を開始した。目的ＤＮＡ分子は、
ＳcrＦ１消化しｐＧＥＭベクター中にクローニングした
ＨＰＶ１６ゲノムＤＮＡであった。各反応液にはまた、
１０ｎｇのヒト胎盤バックグラウンドＤＮＡも含まれて
いた。反応条件は、各反応液に各５×１０11分子のオリ
ゴヌクレオチドＣおよびＤ'(上記表６ａ参照)、各７.５
×１０11分子のオリゴヌクレオチドＤおよびＣ'、およ
び各２５ｍＭの２'−デオキシチミジン５'−三リン酸お
よび２'−デオキシグアノシン５'−三リン酸を加えた他
は、上記実施例６に記載した単一ギャップ伸長の場合と
同じであった。これらオリゴヌクレオチドは、ＨＰＶ１
６ゲノムの遺伝子地図の６４５７〜６５０５位に特異的
である。
【０１０９】増幅後、反応液を滅菌ｄＨ2Ｏで１：１に
希釈し、アボットＩＭｘシステムの原型上で行ったサン
ドイッチイムノアッセイにより二重標識ＬＣＲ増幅生成
物を検出した。その結果は、以下の通りであった。
【０１１０】実施例８ １塩基よりも大きいギャップをＬＣＲ伸長に用いるこ
とができる。たとえば、実施例６に記載したＨＰＶ１６
配列の増幅に使用するＬＣＲセット(Ａ、Ａ'、Ｂおよび
Ｂ')において、表６ａのＨＰＶ１６特異的オリゴヌクレ
オチドＡ'の代わりにオリゴヌクレオチドＴＡＴＴＣＡ
ＴＣＣＧＴＧＣＴＴＡＣＡＡＣＴ(オリゴＥと称する)を
用いることができた。適当な一本鎖ＨＰＶ１６目的配列
にハイブリダイズしたときに、オリゴヌクレオチドＢと
オリゴヌクレオチドＥとは３ヌクレオチドギャップを隔
てて分離される。増幅条件は、３ヌクレオチドギャップ
を完全に埋めるためにｄＡＴＰに加えて２'−デオキシ
シチジン５'−三リン酸を加える必要がある他は上記と
同じである。異なるサイズのギャップについても、単一
ギャップ態様および二重ギャップ態様の両方において同
様に行うことができる。
【０１１１】実施例９ 嚢胞性線維症(ＣＦ)遺伝子の突然変異対立遺伝子の約
７０％は、エクソン１０中に単一の３ヌクレオチド欠失
を示す[リオーダン(Ｒiordan,Ｊ.Ｒ.)ら、Ｓcience２４
５：１０６６(１９８９)；ケレム(Ｋerem,Ｂ.)ら、Ｓci
ence２４５：１０７３(１９８９)]。下記表９ａに示す
オリゴヌクレオチドを用い、ＣＦ遺伝子の正常(オリゴ
ヌクレオチドＡ、Ａ'、ＢおよびＢ')対立遺伝子および
突然変異(オリゴヌクレオチドＣ、Ｃ'、ＢおよびＢ')対
立遺伝子の両方の単一ギャップＬＣＲ増幅を行うことが
できた。
【０１１２】表９ａ Ａ FL-ＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡ
ＴＣＴＴ Ａ' ＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧ
ＧＴＧＣ-FL Ｂ ＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡ
ＧＡ-BIO Ｂ' BIO-ＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣ
ＡＣＣＡ Ｃ FL-ＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡ
ＴＣＡＴ Ｃ' ＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧ
ＣＣＡＧ-FL
【０１１３】ＬＣＲオリゴヌクレオチドＡ、Ａ'、Ｂお
よびＢ'を、ヒト胎盤ＤＮＡから嚢胞性線維症遺伝子の
野生型配列を増幅するのに用いた。目的／バックグラウ
ンドＤＮＡを用いずに、または１.５μｇのヒト胎盤Ｄ
ＮＡを用いて反応を開始した。各５×１０11分子のオリ
ゴヌクレオチドＡおよびＢ'、各７.５×１０11分子のオ
リゴヌクレオチドＡ'およびＢ、２５ｍＭの２'−デオキ
シチミジン５'−三リン酸、および１.２５単位のＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを含有する、実施例６に記載のも
のと同じ緩衝液中で３０サイクルの反応を２回行った。
二重標識増幅生成物が下記のように検出された。
【０１１４】実施例１０ オリゴヌクレオチドＡ、Ａ'、ＢおよびＢ'(表６ａ)
は、１７〜３５ヌクレオチドの長さで変えることができ
た。最初の実験は、表１０ａに示す１９量体および３０
量体オリゴヌクレオチドセットに関するものである。オ
リゴヌクレオチドのサイズの実際の上限および下限は実
験的に決定することができる。単一ギャップ伸長のため
の表６ａのプローブを用い、実施例６の手順を繰り返し
た。二重ギャップオリゴヌクレオチドセットについても
同様の研究を行うことができる。
【０１１５】表１０ａ １９量体セット： Ａ： FL-ＴＡＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＡＡＴＡＴＧＴ Ａ'： ＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴＴＡＣ Ｂ： ＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴ-BIO Ｂ'： BIO-ＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＧＣＧＴＧＣＡ ３０量体セット： Ａ： FL-ＴＡＴＣＴＡＡＧＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＧ
ＡＴＧＡＡＴＡＴＧＴ Ａ'： ＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴＴＡＣＡＡＣ
ＴＴＡＧＡＴＡＣ Ｂ： ＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴＡＴ
ＣＡＴＧＣＡＧＧ-BIO Ｂ'： BIO-ＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴ
ＴＧＴＧＣＧＴＧＣＡ
【０１１６】実施例１１ 平滑末端ライゲーションバックグラウンドが非常に減
少しているので、単一および二重ギャップＬＣＲ伸長に
よりサイクル数を増大させることができる。バックグラ
ウンドの減少とともにＬＣＲのサイクル数を増大させる
ことができることから、ＬＣＲ法の感度を顕著に高める
ことができることが期待される。感度向上の程度を決定
するため、オリゴヌクレオチドＡ、Ａ'、Ａ"、Ｂおよび
Ｂ'(表６ａ)を種々のサイクル数の平滑末端および単一
ギャップＬＣＲに用いることができた。反応条件は、２
０、２５、３０、３５、４０、４５および５０サイクル
後に複製陽性または陰性反応を調べる他は実施例６に記
載したものと同じである。所望ならサイクル数をさらに
多くし、および／または実施例７に記載した二重ギャッ
プＬＣＲ伸長セットを用いて同様の実験を行うこともで
きた。
【０１１７】実施例１２ 合成ＨＰＶ１６オリゴヌクレオチド目的配列を用い、
単一ギャップＬＣＲ伸長が単一塩基ミスマッチを識別す
る能力を調べた。増幅に用いるオリゴヌクレオチド
(Ａ、Ａ'、ＢおよびＢ')は実施例６の表６ａに示してあ
る。使用した合成目的配列は、下記表１２ａに示してあ
る。目的配列Ａ(表１２ａ)は、ＨＰＶ１６ゲノムの遺伝
子地図の５６９５〜５７４４位に特異的な野生型ＨＰＶ
配列を示す。目的配列Ｂは、塩基位置２５のチミジン
(ｄＡＴＰでギャップ埋めをする場合の鋳型として働く)
がアデニンに変わっている他は配列Ａと同じである。そ
れゆえ、オリゴヌクレオチドＢ'(表６ａ、実施例６)
は、この目的配列にハイブリダイズしたときに実施例６
に記載の条件下では伸長できない。目的配列Ｃは、停止
配列(目的塩基位置２４)においてＧがＴに唯一変わって
いる他は配列Ａと同じである。この目的配列にハイブリ
ダイズした場合は、オリゴヌクレオチドＢ'は３塩基だ
け伸長するであろう。それゆえ、伸長はギャップ領域を
越えて起こるであろう。
【０１１８】表１２ａ (合成目的配列) Ａ AAGTTGTAAGCACGGATGAATATGTTGCACGCACAAACATATAT
TATCA Ｂ AAGTTGTAAGCACGGATGAATATGATGCACGCACAAACATATAT
TATCA Ｃ AAGTTGTAAGCACGGATGAATATTTTGCACGCACAAACATATAT
TATCA ヒト胎盤バックグラウンドＤＮＡ(目的配列不含のコン
トロール)および１０6分子の所定の合成目的配列を含有
する胎盤ＤＮＡを用い、反応を３回行った。反応条件
は、実施例６に記載したものと同じであった。単一ギャ
ップＬＣＲ伸長は、５０サイクル行った。増幅後、反応
生成物を滅菌ｄＨ2Ｏで１：１に希釈し、アボットＩＭ
ｘシステムの原型上でサンドイッチイムノアッセイを行
うことにより二重標識ＬＣＲ反応生成物を検出したとこ
ろ、下記の結果が得られた。
【０１１９】実施例１３ ギャップ埋め法の他の態様として、ｄＮＴＰｓおよび
ＤＮＡポリメラーゼを使用することなくギャップを埋め
るため別のプローブを用いることができる。使用したプ
ローブは下記表１３ａに示すものであり、ＨＰＶ１６ゲ
ノムの遺伝子地図上の位置５６７０〜５７４３に特異的
である。オリゴヌクレオチドの表示はテキストに従っ
た。表１３ａ Ｄ FL-ＴＡＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴ
ＡＴＣＴＡ Ｄ' ＡＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡ
ＧＧＴＡ-FL Ｆ ＡＡＧＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＡＡ
ＴＡＴＧ Ｆ' ＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴＴＡＣＡＡ
ＣＴＴＴ Ｅ ＴＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡ
ＴＴＡＴＣＡ-BIO Ｅ' BIO-ＴＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＧＣ
ＧＴＧＣＡＡＣ
【０１２０】ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを用い
る必要がなかった他は実施例６に記載のインキュベーシ
ョン時間および反応条件を用い、ＬＣＲを種々のサイク
ル数で行うことができた。種々の長さ(たとえば、１７
〜３５ヌクレオチド)のオリゴヌクレオチドを用いるこ
ともできることに注意すべきである。オリゴヌクレオチ
ドはすべて、反応液中にそれぞれ５.０〜７.５×１０11
にて含まれる。増幅後、上記実施例に記載のようにして
反応生成物を希釈し検出した。
【０１２１】実施例１４ 下記合成オリゴヌクレオチドを調製し、ｐＵＣ１８を
目的ＤＮＡとするＰＣＲ反応のプライマーとして使用す
る。 プライマー ｐＵＣ１８に対する相補性(nt)＊ Ａ 5'-AATTCGAGCTCGGTACCC ４９８〜４８１ Ｂ 5'-CTGAGAATAGTGTATGC ２２３９〜２２５５ 加えて、非塩基部位を含む修飾プライマーＡmodおよび
Ｂmodを調製する。これらのプライマーは、それぞれプ
ライマーＡおよびＢの代わりに用いる。修飾プライマー
の配列およびｐＵＣ１８ ＤＮＡに対する相補性を下記
に示す。 プライマー ｐＵＣ１８に対する相補性(nt)＊ Ａmod 5'-AATTCGAGCTCGGTACCCJGGGATCCX ４９８〜４７３ Ｂmod 5'-CTGAGAATAGTGTATGCJGCGX ２２３９〜２２５９ (注)＊ヌクレオチド(nt)の番号付けは、ＤＮＡスター
(ＤＮＡ Ｓtar Ｉnc.)(マジソン、ＷＩ)により刊行さ
れたものによる。
【０１２２】実験用オリゴヌクレオチドは、本来の配列
(上記ＡまたはＢ)を修飾して単一の非塩基残基(Ｊ)およ
び目的ｐＵＣ１８に相補的な付加ヌクレオチドを含有さ
せたものである。非塩基残基を含有するオリゴヌクレオ
チドの調製方法は、タケシタらの上記文献に記載されて
いる。修飾(突出)の３'末端は、バーガー(Ｂerger)らの
ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング・テクニー
クス(Ｇuide to Ｍolecular Ｃloning Ｔechnique
s)、ｐ１０４(１９８７)に記載されているように末端ト
ランスフェラーゼなどによりジデオキシアデノシン(Ｘ)
残基を含有させることにより不活化する。
【０１２３】ＰＣＲはムリス(Ｍullis)らの方法(たとえ
ば、米国特許第４,６８３,１９５号および同第４,６８
３,２０２号各明細書参照)に従い、ヌクレオチド混合物
中に32Ｐ−ｄＣＴＰを存在させて行う。下記に示すよう
に、各サイクルのハイブリダイゼーション工程の後にエ
ンドヌクレアーゼＩＶ(ＥndoＩＶ)を反応混合物に加え
る。
【０１２４】ＰＣＲ後、増幅生成物をトリクロロ酢酸
(ＴＣＡ)で沈殿させ、洗浄し、シグナルを測定する。各
反応系に関して予期される相対的なシグナル強度を下記
表に示す。プライマー混合物 目的ＤＮＡを含む 目的ＤＮＡを含まない Ａ＋Ｂ ＋＋＋ ＋＋ Ａmod＋Ｂmod＋ＥndoＩＶ ＋＋＋ − Ａmod＋Ｂmod−ＥndoＩＶ − − Ａ＋Ｂ、ポリメラーゼなし − −
【０１２５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 従来のリガーゼ連鎖反応を示す模式図。
【図２】 ブロッキング残基(Ｒ)を用いた場合(図２Ａ)
およびリボヌクレオチド伸長(ｒＢｒＢｒＢ)を用いた場
合(図２Ｂ)の、本発明の突出態様による改良核酸増幅法
を示す模式図。
【図３】 本発明の単一ギャップ態様による改良核酸増
幅法を示す模式図。
【図４】 本発明の二重ギャップ態様による改良核酸増
幅法を示す模式図。
【図５】 ギャップ埋めプローブをさらに用いた本発明
の改良核酸増幅法を示す模式図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キース・シー・バックマン アメリカ合衆国01730マサチューセッツ州 ベッドフォード、カーライル・ロード200 番 (72)発明者 シーラ・ビー・ボンド アメリカ合衆国60045イリノイ州レイク・ フォレスト、リトル・メロディ・レイン96 番 (72)発明者 ジョン・ジェイ・カリノ アメリカ合衆国60031イリノイ州ガーニー、 コンスティテューション4774番 (72)発明者 トーマス・ジー・ラフラー アメリカ合衆国60048イリノイ州リバティ ービル、パインハースト・コート1964番

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 目的核酸配列を酵素的に増幅させて増幅
    生成物を得る方法であって、酵素が、核酸イニシエータ
    ー、核酸イニシエーターが結合する鋳型としての目的配
    列または増幅生成物、酵素的に組み立てて目的配列に相
    補的な増幅生成物を生成し得る、さらに少なくとも１種
    のヌクレオシド含有反応物を利用するものであり、該増
    幅生成物自体がさらに鋳型として働く方法において、 (ａ)目的配列とハイブリダイズし得る必要なイニシエー
    ターであって、該イニシエーターがハイブリダイズした
    ときに該酵素が該酵素の基質としての該イニシエーター
    に実質的に作用し得ず増幅生成物が組み立てられないよ
    うに、少なくとも１種の該イニシエーターを修飾したも
    のを用意し、 (ｂ)該イニシエーターを該目的配列とハイブリダイズさ
    せてイニシエーター−鋳型複合体を生成させ、 (ｃ)鋳型に依存した仕方で該修飾を補正して該酵素が該
    イニシエーター−鋳型複合体に作用し得るようにし、 (ｄ)増幅生成物を酵素的に組み立て、ついで (ｅ)該目的配列から増幅生成物を解離させ、ハイブリダ
    イゼーション、補正および組み立て工程を繰り返して所
    望の目的配列を増幅させることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 少なくとも１種のイニシエーターの修飾
    (工程(ａ))が、工程(ｄ)で必要な化学基をブロックする
    ように該イニシエーターに結合したブロッキング残基か
    らなる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 ブロッキング残基が (式中、Ｚは、−Ｈ、−(ＣＨ2)nＣＨＯ(式中、ｎは１〜
    約３である)、−デオキシリボース、および−ジデオキ
    シリボースよりなる群から選ばれたものである)である
    請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 ブロッキング残基が核酸の突出であり、
    該突出は、工程(ｄ)の酵素的組み立てが伸長による場合
    には伸長不能な３'末端を含むものである、請求項２に
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 突出が、 (ａ)該イニシエーターがデオキシリボヌクレオチドから
    なる場合にリボヌクレオチド、 (ｂ)少なくとも一つの非塩基残基を含むオリゴヌクレオ
    チド、および (ｃ)該修飾イニシエーターが目的鎖とハイブリダイズし
    たときに塩基対のミスマッチが生じるように選択した残
    基を有するオリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれた
    ものである、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 修飾の補正を、 (ａ)ＲＮＡseＨ酵素、 (ｂ)実質的に核酸鎖が相補鎖とハイブリダイズした場合
    にのみ非塩基部位で該核酸鎖を開裂するエンドヌクレア
    ーゼ、 (ｃ)エンドヌクレアーゼＩＶ、および (ｄ)ミスマッチ修復酵素よりなる群から選ばれた薬剤を
    用いて行う、請求項２または４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 酵素がポリメラーゼであり、イニシエー
    ターがプライマーからなり、ヌクレオシド含有反応物が
    個々のヌクレオシド三リン酸からなり、増幅生成物が該
    プライマーとヌクレオシド三リン酸とから生成した伸長
    生成物からなる、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 酵素がリガーゼであり、イニシエーター
    が第一のオリゴヌクレオチドプローブであり、ヌクレオ
    シド含有反応物が第二のオリゴヌクレオチドプローブで
    あり、増幅生成物が該第一のオリゴヌクレオチドプロー
    ブと該第二のオリゴヌクレオチドプローブとが融合した
    ものである、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 工程(ａ)の修飾イニシエーターが、目的
    配列の第一の切片とハイブリダイズし得る第一プロー
    ブ、目的配列の第二の切片とハイブリダイズし得る第二
    プローブ、該第一プローブとハイブリダイズし得る第三
    プローブ、および該第二プローブとハイブリダイズし得
    る第四プローブを含み、修飾として、(i)該目的配列の
    該第一の切片の５'末端は該第二の切片の３'末端からＸ
    n塩基離れた位置にあり、各Ｘは４種の塩基のうちの１
    〜任意の３塩基からなるセットＮから独立に選ばれたも
    のであり、ｎは１以上の整数であり； (ii)該第三プローブの５'末端に相補的な該第一プロー
    ブ上の塩基が該第一プローブの３'末端からＹm塩基離れ
    た位置にあり、各Ｙは４種の塩基のうちの０〜任意の３
    塩基からなるセットＭから独立に選ばれたものであり、
    ｍは０または１以上の整数であるように、該第三プロー
    ブは該第一プローブにハイブリダイズし(ただし、該Ｘn
    およびＹm配列において少なくとも１種の塩基が使用さ
    れないで残ってＮでもＭでもないセットを生成し、Ｘn
    塩基の配列はＹm塩基の配列と相補的ではない)； (iii)Ｘnの５'末端に隣接する塩基およびＹmの５'末端
    に隣接する塩基が、ＮでもなくＭでもないセットＱから
    選ばれたものであり；工程(ｃ)を、過剰のデオキシＸ'
    三リン酸およびデオキシＹ'三リン酸(Ｘ'およびＹ'はそ
    れぞれＸおよびＹの相補体である)を用い、該第一プロ
    ーブを伸長して該Ｘnギャップを埋め、任意に該第四プ
    ローブを伸長して該Ｙmギャップを埋めることにより行
    う、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ｎが１〜約３である請求項９に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 ｍが０である請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 工程(ｃ)で加えるデオキシＸ'三リン
    酸が、標識、フックおよびハプテンよりなる群から選ば
    れたマーカーを含有するように修飾した塩基を含む、請
    求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 工程(ａ)のイニシエーターが、 (i)目的配列の第一の切片とハイブリダイズし得る第一
    プローブＤ、および該第一プローブＤとハイブリダイズ
    し得る第二プローブＤ'であって、該第二プローブＤ'の
    ３'末端は該第一プローブＤの５'末端から少なくとも１
    塩基だけ突出するもの； (ii)目的配列の第二の切片とハイブリダイズし得る第三
    プローブＥ、および該第三プローブＥとハイブリダイズ
    し得る第四プローブＥ'であって、該第四プローブＥ'の
    ５'末端は該第三プローブＥの３'末端から少なくとも１
    塩基だけ突出するもの；および (iii)目的配列の第三の切片とハイブリダイズし得る第
    五プローブＦ、および該第五プローブＦとハイブリダイ
    ズし得る第六プローブＦ'を含む、目的配列および任意
    に目的配列の相補鎖とハイブリダイズする３対の相補的
    プローブを含み、目的配列の第一の切片、第三の切片お
    よび第二の切片は連続的に位置しており、第五プローブ
    が目的配列とハイブリダイズしたときに、第五プローブ
    の３'末端は第一プローブの５'末端と隣接し第五プロー
    ブの５'末端は第三プローブの３'末端と隣接するように
    なり、修飾として、第五プローブＦの３'末端は、第二
    プローブＤ'が第一プローブＤから突出した配列と同じ
    長さで該配列に相補的な塩基配列だけ、第六プローブ
    Ｆ'から突出し、第五プローブの５'末端は、第四プロー
    ブＥ'が第三プローブＥから突出した配列と同じ長さで
    該配列に相補的な塩基配列だけ、第六プローブＦ'から
    突出し、工程(ｃ)を、目的配列に依存した仕方で第五プ
    ローブＦを第一プローブＤと第三プローブＥとの両方に
    ライゲートして単一の融合ポリヌクレオチドを生成さ
    せ、任意に、目的配列に依存した仕方で第六プローブ
    Ｆ'を第二プローブＤ'と第四プローブＥ'との両方にラ
    イゲートして目的配列の相補鎖に相補的な第二の融合ポ
    リヌクレオチドを生成させることにより行う、請求項８
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 第二プローブＤ'および第四プローブ
    Ｅ'の突出が、それぞれ、独立に１〜約３塩基を含む、
    請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 第二プローブおよび第三プローブの
    ５'末端に結合したハプテンマーカーにより増幅目的配
    列の存在を検出する工程をさらに含む、請求項９または
    １３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 (ａ)ＬＣＲにおいてライゲートし得る
    ように目的配列とハイブリダイズし得る２対のプローブ
    か、またはＰＣＲを開始し得るように目的配列とハイブ
    リダイズし得る１対のプライマーのいずれかから選ばれ
    たイニシエーターであって、該プローブまたはプライマ
    ーの少なくとも１種は、イニシエーターがハイブリダイ
    ズしたときにリガーゼまたはポリメラーゼが該イニシエ
    ーターに対して基質として実質的に作用し得ないように
    修飾してあるもの； (ｂ)増幅生成物を組み立てるためのリガーゼかまたはポ
    リメラーゼのいずれかから選ばれた組み立て試薬；およ
    び (ｃ)目的配列に依存した仕方で該修飾プローブ／プライ
    マーを補正して、該プローブ／プライマー−鋳型複合体
    に対して該リガーゼまたはポリメラーゼが作用し得るよ
    うにする補正試薬からなる診断キット。
  17. 【請求項１７】 補正試薬が、 (ａ)ＲＮＡseＨ酵素、 (ｂ)実質的に核酸鎖が相補鎖とハイブリダイズした場合
    にのみ非塩基部位で該核酸鎖を開裂するエンドヌクレア
    ーゼ、 (ｃ)エンドヌクレアーゼＩＶ、および (ｄ)ミスマッチ修復酵素 よりなる群から選ばれた薬剤からなる、請求項１６に記
    載のキット。
  18. 【請求項１８】 イニシエーターが２対のプローブから
    なり、組み立て試薬がリガーゼからなり、補正試薬がポ
    リメラーゼからなる、請求項１６に記載のキット。
  19. 【請求項１９】 第一の目的核酸配列を、少なくとも１
    塩基の同定により該目的配列とは異なる第二の目的でな
    い配列から識別する方法であって、 (ａ)該目的配列の第一の切片に相補的な第一プローブ、
    該目的配列の第二の切片に相補的な第二プローブ、該第
    一プローブに相補的な第三プローブ、および該第二プロ
    ーブに相補的な第四プローブの４種の各プローブを過剰
    に用意し、その際、 (i)該目的配列の該第一の切片の５'末端は該第二の切片
    の３'末端からＸn塩基離れた位置にあり、各Ｘは４種の
    塩基のうちの１〜任意の３塩基からなるセットＮから独
    立に選ばれたものであり、ｎは１以上の整数であり； (ii)該第三プローブの５'末端に相補的な該第一プロー
    ブ上の塩基が該第一プローブの３'末端からＹm塩基離れ
    た位置にあり、各Ｙは４種の塩基のうちの０〜任意の３
    塩基からなるセットＭから独立に選ばれたものであり、
    ｍは０または１以上の整数であるように、該第三プロー
    ブは該第一プローブにハイブリダイズし(ただし、該Ｘn
    およびＹm配列において少なくとも１種の塩基が使用さ
    れないで残り、Ｘn塩基の配列はＹm塩基の配列と相補的
    ではない)； (iii)Ｘnの５'末端に隣接する塩基およびＹmの５'末端
    に隣接する塩基が、ＮでもなくＭでもないセットＱから
    選ばれたものであり； (iv)該目的でない配列は、Ｘn領域またはＹm領域中の少
    なくとも１つの塩基、Ｚの同定により異なり、 (ｂ)該４種のプローブを、一本鎖の目的配列または二本
    鎖の目的配列またはその相補鎖から分離した二本鎖の目
    的配列とハイブリダイズ条件下で混合し、 (ｃ)目的配列にハイブリダイズしている間に、目的でな
    い配列ギャップ中の単一の異なる塩基に相補的なデオキ
    シＺ'三リン酸は省いて、過剰のデオキシＸ'三リン酸お
    よびデオキシＹ'三リン酸(Ｘ'およびＹ'はそれぞれ目的
    配列上のＸおよびＹの相補体である)を用い、該第一プ
    ローブを伸長してＸnギャップを埋め、任意に該第四プ
    ローブを伸長してＹmギャップを埋め、 (ｄ)目的配列にハイブリダイズしている間に、該伸長し
    た第一プローブを該第二プローブにライゲートし、任意
    に、該伸長した第四プローブを該第三プローブにライゲ
    ートして、該目的配列にハイブリダイズしたライゲート
    プローブの少なくとも一つの二本鎖複合体を生成させ、
    ついで (ｅ)適当に伸長しライゲートしたプローブを、不適当に
    伸長しライゲートしなかったプローブから分離し検出す
    ることを特徴とする方法。
  20. 【請求項２０】 第一の目的核酸配列を、少なくとも１
    塩基の同定により該目的配列とは異なる第二の目的でな
    い配列から識別する方法であって、 (ａ)該目的配列の第一の切片に相補的な第一プローブ、
    該目的配列の第二の切片に相補的な第二プローブ、該第
    一プローブに相補的な第三プローブ、および該第二プロ
    ーブに相補的な第四プローブの４種の各プローブを過剰
    に用意し、その際、 (i)該目的配列の該第一の切片の５'末端は該第二の切片
    の３'末端からＸn塩基離れた位置にあり、各Ｘは４種の
    塩基のうちの１〜任意の３塩基からなるセットＮから独
    立に選ばれたものであり、ｎは１以上の整数であり； (ii)該第三プローブの５'末端に相補的な該第一プロー
    ブ上の塩基が該第一プローブの３'末端からＹm塩基離れ
    た位置にあり、各Ｙは４種の塩基のうちの０〜任意の３
    塩基からなるセットＭから独立に選ばれたものであり、
    ｍは０または１以上の整数であるように、該第三プロー
    ブは該第一プローブにハイブリダイズし(ただし、該Ｘn
    およびＹm配列において少なくとも１種の塩基が使用さ
    れないで残り、Ｘn塩基の配列はＹm塩基の配列と相補的
    ではない)； (iii)Ｘnの５'末端に隣接する塩基およびＹmの５'末端
    に隣接する塩基が、ＮでもなくＭでもないセットＱから
    選ばれたものであり； (iv)該目的でない配列は、Ｑ領域中の少なくとも１つの
    塩基、Ｚの同定により異なり、ＺはセットＮ、セットＭ
    またはセットＮとセットＭとの両方に含まれる塩基であ
    り、 (ｂ)該４種のプローブを、一本鎖の目的配列または二本
    鎖の目的配列またはその相補鎖から分離した二本鎖の目
    的配列とハイブリダイズ条件下で混合し、 (ｃ)目的配列にハイブリダイズしている間に、過剰のデ
    オキシＸ'三リン酸およびデオキシＹ'三リン酸(Ｘ'およ
    びＹ'はそれぞれＸおよびＹの相補体である)を用い、該
    第一プローブを伸長してＸnギャップを埋め、任意に該
    第四プローブを伸長してＹmギャップを埋めることによ
    り、Ｚが該第一プローブの伸長および任意に該第四プロ
    ーブの伸長を停止できないようにし、 (ｄ)目的配列にハイブリダイズしている間に、該適当に
    伸長した第一プローブを該第二プローブにライゲート
    し、任意に、該適当に伸長した第四プローブを該第三プ
    ローブにライゲートして、該目的配列にハイブリダイズ
    したライゲートプローブの少なくとも一つの二本鎖複合
    体を生成させ、ついで (ｅ)適当に伸長しライゲートしたプローブを、不適当に
    伸長しライゲートしなかったプローブから分離し検出す
    ることを特徴とする方法。
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Families Citing this family (311)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5242794A (en) * 1984-12-13 1993-09-07 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US7009041B1 (en) 1989-07-11 2006-03-07 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis
US5766849A (en) * 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
US5427930A (en) * 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction
US5573907A (en) * 1990-01-26 1996-11-12 Abbott Laboratories Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity
US5516663A (en) * 1990-01-26 1996-05-14 Abbott Laboratories Ligase chain reaction with endonuclease IV correction and contamination control
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
EP0633944B1 (en) * 1992-03-31 2000-11-08 Abbott Laboratories Method of multiplex ligase chain reaction
US5869252A (en) * 1992-03-31 1999-02-09 Abbott Laboratories Method of multiplex ligase chain reaction
US6100099A (en) 1994-09-06 2000-08-08 Abbott Laboratories Test strip having a diagonal array of capture spots
AU3943093A (en) * 1992-03-31 1993-11-08 Abbott Laboratories Purified thermostable endonuclease
AU4047893A (en) * 1992-04-06 1993-11-08 Abbott Laboratories Method and device for detection of nucleic acid or analyte using total internal reflectance
US6953676B1 (en) 1992-05-01 2005-10-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification device and method
US5304487A (en) * 1992-05-01 1994-04-19 Trustees Of The University Of Pennsylvania Fluid handling in mesoscale analytical devices
US5726026A (en) 1992-05-01 1998-03-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale sample preparation device and systems for determination and processing of analytes
US5296375A (en) * 1992-05-01 1994-03-22 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale sperm handling devices
US5486335A (en) * 1992-05-01 1996-01-23 Trustees Of The University Of Pennsylvania Analysis based on flow restriction
US5498392A (en) * 1992-05-01 1996-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification device and method
US5637469A (en) 1992-05-01 1997-06-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and apparatus for the detection of an analyte utilizing mesoscale flow systems
US5587128A (en) 1992-05-01 1996-12-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification devices
AU4387193A (en) * 1992-05-29 1993-12-30 Abbott Laboratories Ligase chain reaction starting with rna sequences
AU4788493A (en) * 1992-07-21 1994-02-14 Imclone Systems Incorporated Gap-filling nucleic acid amplification and detection
EP0654093B1 (en) * 1992-08-03 2001-01-03 Abbott Laboratories Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity
US6207368B1 (en) 1992-08-04 2001-03-27 Beckman Coulter, Inc. Methods and reagents for controlling chain extension and ligation chain reactions
US6180338B1 (en) 1992-08-04 2001-01-30 Beckman Coulter, Inc. Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences
CA2141430C (en) * 1992-08-04 2009-05-12 Sherrol H. Mcdonough Nucleic acid sequence amplification
EP0688366B1 (en) * 1993-01-15 2002-05-22 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Sensitive nucleic acid sandwich hybridization assays and kits
WO1994016106A1 (en) * 1993-01-15 1994-07-21 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Diagnostic assays and kits for rna using rna binary probes and an rna-directed rna ligase
JPH08508636A (ja) * 1993-01-27 1996-09-17 オンコール インコーポレーテッド 核酸配列の増幅
US5695933A (en) * 1993-05-28 1997-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Direct detection of expanded nucleotide repeats in the human genome
US5601978A (en) * 1993-09-03 1997-02-11 Abbott Laboratories Oligonucleotides and methods for the detection of chlamydia trachomatis
CA2140081C (en) 1994-01-13 2008-04-01 Dean L. Engelhardt Process, construct and conjugate for producing multiple nucleic acid copies
US6986985B1 (en) 1994-01-13 2006-01-17 Enzo Life Sciences, Inc. Process for producing multiple nucleic acid copies in vivo using a protein-nucleic acid construct
CA2182517C (en) * 1994-02-07 2001-08-21 Theo Nikiforov Ligase/polymerase-mediated primer extension of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US6406855B1 (en) 1994-02-17 2002-06-18 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
WO1995031571A2 (en) * 1994-05-13 1995-11-23 Abbott Laboratories Materials and methods for the detection of mycobacteria
US5631130A (en) * 1994-05-13 1997-05-20 Abbott Laboratories Materials and methods for the detection of Mycobacterium tuberculosis
JPH10500572A (ja) * 1994-05-23 1998-01-20 バイオトロニクス コーポレーション 標的核酸を検出する方法
US5605796A (en) * 1994-07-19 1997-02-25 Behringwerke Ag Method for preventing amplification of nucleic acid contaminants in amplification mixtures using nuclease-receptor conjugates
US5622822A (en) 1994-09-13 1997-04-22 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same
US5582988A (en) 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
EP1260593A3 (en) * 1994-12-23 2003-12-03 Dade Behring Inc. Detection of nucleic acids by nuclease-catalyzed product formation
US6787304B1 (en) * 1994-12-28 2004-09-07 Georgetown University Fluorometric assay for detecting nucleic acid cleavage
US20030165908A1 (en) 1994-12-30 2003-09-04 Georgetown University Fluorometric assay for detecting nucleic acid cleavage
US6015660A (en) * 1995-01-06 2000-01-18 The Regents Of The University Of California Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases
US6113905A (en) * 1995-01-06 2000-09-05 The Regents Of The University Of California Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases
US6077510A (en) * 1995-01-06 2000-06-20 Regents Of The University Of California Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases
WO1996040992A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Abbott Laboratories Probe masking method of reducing background in an amplification reaction
US5728526A (en) * 1995-06-07 1998-03-17 Oncor, Inc. Method for analyzing a nucleotide sequence
US5888731A (en) * 1995-08-30 1999-03-30 Visible Genetics Inc. Method for identification of mutations using ligation of multiple oligonucleotide probes
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
JP3974941B2 (ja) 1995-11-21 2007-09-12 イェール ユニバーシティ 単分子セグメントの増幅および検出
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US6764835B2 (en) 1995-12-07 2004-07-20 Diversa Corporation Saturation mutageneis in directed evolution
US5994143A (en) * 1996-02-01 1999-11-30 Abbott Laboratories Polymeric fluorophores enhanced by moieties providing a hydrophobic and conformationally restrictive microenvironment
US5853990A (en) 1996-07-26 1998-12-29 Edward E. Winger Real time homogeneous nucleotide assay
US6225056B1 (en) * 1996-09-13 2001-05-01 Laboratory Of Molecular Biophotonics Solid phases for target nucleic acid detection, process for production thereof, and method of target nucleic acid detection
US5919638A (en) * 1996-10-08 1999-07-06 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting prostate tumors
US20050202499A1 (en) 1996-10-31 2005-09-15 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6495692B1 (en) 1996-12-10 2002-12-17 Abbott Laboratories Helium-neon excitable reticulocyte dyes derivable from halolepidines
US6482590B1 (en) 1996-12-20 2002-11-19 Aventis Behring Gmbh Method for polynucleotide amplification
US6117634A (en) 1997-03-05 2000-09-12 The Reagents Of The University Of Michigan Nucleic acid sequencing and mapping
US6197557B1 (en) 1997-03-05 2001-03-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for analysis of nucleic acids
US6620597B1 (en) 1998-01-09 2003-09-16 University Of Utah Research Foundation Method for in vitro amplification of circular DNA
US6316229B1 (en) 1998-07-20 2001-11-13 Yale University Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers
US7270958B2 (en) 1998-09-10 2007-09-18 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for analysis of nucleic acids
CA2342838A1 (en) 1998-09-15 2000-03-23 Yale University Molecular cloning using rolling circle amplification
CA2342837A1 (en) 1998-09-15 2000-03-23 Yale University Artificial long terminal repeat vectors
DE69905832T2 (de) 1998-09-18 2004-02-05 Massachusetts Institute Of Technology, Cambridge Biologische Verwendungen von halbleitenden Nanokristallen
US6358712B1 (en) * 1999-01-05 2002-03-19 Trustee Of Boston University Ordered gene assembly
JP2002537762A (ja) * 1999-01-05 2002-11-12 トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ 改良型核酸クローニング
US20040005673A1 (en) * 2001-06-29 2004-01-08 Kevin Jarrell System for manipulating nucleic acids
US20030054390A1 (en) * 1999-01-19 2003-03-20 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6200757B1 (en) 1999-01-19 2001-03-13 Dade Behring Inc. Method for controlling the extension of an oligonucleotide
US6395472B1 (en) 1999-02-05 2002-05-28 Abbott Laboratories Methods of utilizing the TT virus
JP2000316587A (ja) * 1999-03-05 2000-11-21 Tosoh Corp 核酸プローブ
US7014994B1 (en) 1999-03-19 2006-03-21 Cornell Research Foundation,Inc. Coupled polymerase chain reaction-restriction-endonuclease digestion-ligase detection reaction process
US6235479B1 (en) 1999-04-13 2001-05-22 Bio Merieux, Inc. Methods and devices for performing analysis of a nucleic acid sample
US20030108867A1 (en) * 1999-04-20 2003-06-12 Chee Mark S Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US20050244870A1 (en) * 1999-04-20 2005-11-03 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US20030207295A1 (en) * 1999-04-20 2003-11-06 Kevin Gunderson Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
EP1923471B1 (en) 1999-04-20 2012-12-19 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
JP4643023B2 (ja) 1999-05-04 2011-03-02 オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド 細胞溶解剤を使用せずに試料からｄｎａを迅速に効率よく捕捉する方法
US8080380B2 (en) 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US8481268B2 (en) 1999-05-21 2013-07-09 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
WO2001006253A2 (en) 1999-07-16 2001-01-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Detection system based on an analyte reactive particle
DE19945964A1 (de) * 1999-09-24 2001-04-05 Biotecon Diagnostics Gmbh Verfahren und Nukleinsäuren zum Nachweis von brauereirelevanten Mikroorganismen
US6958225B2 (en) * 1999-10-27 2005-10-25 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
US6509157B1 (en) 1999-11-05 2003-01-21 Roche Molecular Systems, Inc 3 blocked nucleic acid amplification primers
US7250252B2 (en) * 1999-12-30 2007-07-31 David Aaron Katz Amplification based polymorphism detection
US20050214825A1 (en) * 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
CA2399733C (en) * 2000-02-07 2011-09-20 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US8076063B2 (en) 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
AU2001238389B2 (en) 2000-02-16 2006-09-21 Illumina, Inc. Parallel genotyping of multiple patient samples
US7033763B2 (en) * 2000-02-23 2006-04-25 City Of Hope Pyrophosphorolysis activated polymerization (PAP)
EP2112233B1 (en) * 2000-02-23 2013-10-23 City of Hope Pyrophosphorolysis activated polymerization (PAP): application to allele-specific amplification and nucleic acid sequence determination
US7205129B1 (en) 2000-02-28 2007-04-17 Qiagen Gmbh Method for reducing artifacts in nucleic acid amplification
WO2001075157A1 (fr) * 2000-03-31 2001-10-11 Sanko Junyaku Co., Ltd. Sonde servant a fabriquer un polymere sonde, procede de fabrication d'un polymere sonde et son utilisation
US7262006B1 (en) 2000-05-01 2007-08-28 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Rapid and efficient capture of DNA from sample without using cell lysing reagent
AU7172201A (en) 2000-06-30 2002-01-14 Molecular Staging Inc Signal amplification with lollipop probes
AU2001271816B9 (en) * 2000-07-03 2007-05-24 Applied Biosystems, Llc. Polynucleotide sequence assay
AU2001278517A1 (en) 2000-08-03 2002-02-18 F. Hoffman-La Roche Ag Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo(3,4-d)pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses
EP1366192B8 (en) 2000-10-24 2008-10-29 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Direct multiplex characterization of genomic dna
US20030049731A1 (en) * 2000-12-05 2003-03-13 Bowdish Katherine S. Engineered plasmids and their use for in situ production of genes
US6573051B2 (en) 2001-03-09 2003-06-03 Molecular Staging, Inc. Open circle probes with intramolecular stem structures
AU2003303395A1 (en) 2001-05-22 2004-07-22 Dahl, Gary, A. Target-dependent transcription using deletion mutants of n4 rna polymerase
EP1275735A1 (en) 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Composition and method for hot start nucleic acid amplification
WO2003006677A2 (en) 2001-07-12 2003-01-23 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
IL160229A0 (en) 2001-08-10 2004-07-25 Genset Sa Polynucleotides, polypeptides encoded thereby and their use
US7297485B2 (en) * 2001-10-15 2007-11-20 Qiagen Gmbh Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias
US6617137B2 (en) * 2001-10-15 2003-09-09 Molecular Staging Inc. Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions
US6942972B2 (en) 2001-10-24 2005-09-13 Beckman Coulter, Inc. Efficient synthesis of protein-oligonucleotide conjugates
JP2005517900A (ja) 2001-11-21 2005-06-16 アプレラ コーポレイション デジタルアッセイ
JP4148900B2 (ja) 2002-01-08 2008-09-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 増幅反応におけるシリカ物質の使用
EP1499738B1 (en) * 2002-02-21 2008-07-09 ASM Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US8030000B2 (en) 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7399590B2 (en) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7211382B2 (en) * 2002-04-09 2007-05-01 Orchid Cellmark Inc. Primer extension using modified nucleotides
US6896727B2 (en) * 2002-06-28 2005-05-24 Seh America, Inc. Method of determining nitrogen concentration within a wafer
EP1543154A4 (en) * 2002-08-21 2006-08-16 Epoch Biosciences Inc ENDONUCLEASE TEST IN ABASIC SITE
WO2004026804A1 (en) 2002-09-20 2004-04-01 Integrated Dna Technologies, Inc. Anthraquinone quencher dyes, their methods of preparation and use
CA2505687A1 (en) * 2002-11-19 2004-06-03 Applera Corporation Polynucleotide sequence detection assays and analysis
WO2004046344A2 (en) * 2002-11-19 2004-06-03 Applera Corporation Polynucleotide sequence detection assays
US7560231B2 (en) 2002-12-20 2009-07-14 Roche Molecular Systems, Inc. Mannitol and glucitol derivatives
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
US7955795B2 (en) * 2003-06-06 2011-06-07 Qiagen Gmbh Method of whole genome amplification with reduced artifact production
DE602004009038T3 (de) 2003-01-29 2015-06-25 Roche Diagnostics Gmbh Verbessertes Verfahren zur Behandlung durch Bisulfit
US8043834B2 (en) 2003-03-31 2011-10-25 Qiagen Gmbh Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use
CA2463719A1 (en) 2003-04-05 2004-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleotide analogs with six membered rings
AU2004253882B2 (en) 2003-06-20 2010-06-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US20040259100A1 (en) 2003-06-20 2004-12-23 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
CA2482097C (en) 2003-10-13 2012-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for isolating nucleic acids
WO2005049849A2 (en) 2003-11-14 2005-06-02 Integrated Dna Technologies, Inc. Fluorescence quenching azo dyes, their methods of preparation and use
JP4435174B2 (ja) 2003-12-02 2010-03-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 重亜硫酸塩処理の改良された方法
US7651868B2 (en) 2003-12-11 2010-01-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Method and system for the analysis of saliva using a sensor array
US20050136417A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-23 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
US8101431B2 (en) 2004-02-27 2012-01-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems
JP2007538236A (ja) 2004-05-21 2007-12-27 アトノミックス アクティーゼルスカブ ヒドロゲルを含む表面弾性波センサ
EP1632578A1 (en) 2004-09-03 2006-03-08 Roche Diagnostics GmbH DNA decontamination method
JP5063355B2 (ja) * 2004-10-21 2012-10-31 ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド 増幅を改善するための核酸の修復
US20060134650A1 (en) * 2004-12-21 2006-06-22 Illumina, Inc. Methylation-sensitive restriction enzyme endonuclease method of whole genome methylation analysis
CN101128604A (zh) 2005-02-28 2008-02-20 生物探索公司 用于进行涉及核酸分子的直接酶反应的方法
WO2006095941A1 (en) 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
EP1856257B1 (en) 2005-03-05 2011-10-19 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
EP1700922B1 (en) 2005-03-10 2016-08-24 Roche Diagnostics GmbH 3-Substituted 5-Nitroindole derivatives and labeled oligonucleotide probes containing them
US7759469B2 (en) 2005-03-10 2010-07-20 Roche Diagnostics Operations, Inc. Labeling reagent
EP1863908B1 (de) 2005-04-01 2010-11-17 Qiagen GmbH Reverse transkription und amplifikation von rna bei simultaner degradierung von dna
ATE496996T1 (de) 2005-05-13 2011-02-15 Wako Pure Chem Ind Ltd Primer, sonden, verfahren und verwendungen davon zum nachweis von mycobacterium kansasii
AU2006251637B2 (en) 2005-05-20 2012-06-14 Integrated Dna Technologies, Inc. Compounds and methods for labeling oligonucleotides
CA2610793A1 (en) 2005-05-31 2007-05-10 Labnow, Inc. Methods and compositions related to determination and use of white blood cell counts
US8062850B2 (en) 2005-07-25 2011-11-22 Alere San Diego, Inc. Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
WO2007044671A2 (en) 2005-10-06 2007-04-19 Lucigen Corporation Thermostable viral polymerases and methods of use
US7981606B2 (en) 2005-12-21 2011-07-19 Roche Molecular Systems, Inc. Control for nucleic acid testing
WO2007096182A1 (en) * 2006-02-27 2007-08-30 Roche Diagnostics Gmbh Pcr hot start by magnesium sequestration
JP5239853B2 (ja) 2006-03-13 2013-07-17 和光純薬工業株式会社 変異遺伝子の検出方法
CN101432426B (zh) 2006-05-02 2012-09-19 和光纯药工业株式会社 胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的胞内分枝杆菌的检测方法
WO2008035205A2 (en) 2006-05-04 2008-03-27 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
WO2007133703A2 (en) 2006-05-10 2007-11-22 Dxterity Diagnostics Detection of nucleic acid targets using chemically reactive oligonucleotide probes
CN101200716B (zh) 2006-12-11 2012-08-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 使用聚多卡醇和衍生物的核酸分离
EP1932913B1 (en) 2006-12-11 2013-01-16 Roche Diagnostics GmbH Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
CN104531684A (zh) 2006-12-18 2015-04-22 和光纯药工业株式会社 鸟分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用它们检测鸟分枝杆菌的方法
CA2629589C (en) 2007-04-20 2016-03-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Isolation and purification of nucleic acid molecules with a solid phase
US8008010B1 (en) 2007-06-27 2011-08-30 Applied Biosystems, Llc Chimeric oligonucleotides for ligation-enhanced nucleic acid detection, methods and compositions therefor
KR101376359B1 (ko) * 2007-08-01 2014-03-27 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 표적 서열 강화
EP2913398B1 (en) 2007-08-27 2017-07-12 Life Technologies Corporation Methods for PCR
US7749708B2 (en) * 2007-09-12 2010-07-06 Transgenomic, Inc. Method for identifying the sequence of one or more variant nucleotides in a nucleic acid molecule
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
JP5503552B2 (ja) 2007-12-21 2014-05-28 バイオメリュー・エスエイ メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出
WO2009099037A1 (ja) 2008-02-08 2009-08-13 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法
CA2658520C (en) 2008-03-19 2016-11-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acid amplification in the presence of modified randomers
EP2108699B1 (en) 2008-04-08 2014-06-25 F.Hoffmann-La Roche Ag Analytical processing and detection device
CN102046788B (zh) 2008-05-28 2013-07-10 和光纯药工业株式会社 胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针检测胞内分枝杆菌的方法
EP2402462A1 (en) 2008-06-06 2012-01-04 F. Hoffmann-La Roche AG Internally controlled multiplex detection and quantification of microbial nucleic acids
US7910720B2 (en) 2008-09-09 2011-03-22 Roche Diagnostics Operations, Inc. Polyanion for improved nucleic acid amplification
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
EP2177271B8 (en) 2008-10-15 2019-12-18 F. Hoffmann-La Roche AG Magnetic separation system comprising flexible magnetic pins and corresponding method
EP2189218A1 (en) 2008-11-12 2010-05-26 F. Hoffmann-Roche AG Multiwell plate lid separation
EP2398917B1 (en) 2009-02-17 2016-10-05 Murdoch Childrens Research Institute Assay for determining epigenetic profiles of markers of fragile x alleles
JP5457222B2 (ja) 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
US9347092B2 (en) * 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
EP2765205B1 (en) 2009-04-01 2016-05-18 DxTerity Diagnostics Incorporated Chemical ligation dependent probe amplification (CLPA)
WO2010135310A1 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Biosite Incorporated Dna glycosylase/lyase and ap endonuclease substrates
EP3360974A1 (en) 2009-06-05 2018-08-15 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification reagents
CA2775613C (en) 2009-10-13 2018-06-12 Nanostring Technologies, Inc. Protein detection via nanoreporters
TW201122480A (en) 2009-10-26 2011-07-01 Abbott Lab Diagnostic methods for determining prognosis of non-small cell lung cancer
KR101815184B1 (ko) 2009-10-26 2018-02-05 애보트 모레큘러 인크. 비-소세포 폐암의 예후를 측정하기 위한 진단 방법
US20110151457A1 (en) 2009-12-22 2011-06-23 Elitech Holding B.V. Hypertheromostable endonuclease iv substrate probe
GB201001088D0 (en) 2010-01-23 2010-03-10 Trillion Genomics Ltd Detection
EP2545189B1 (en) 2010-03-08 2018-01-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Full cold-pcr enrichment with reference blocking sequence
WO2011118496A1 (ja) 2010-03-23 2011-09-29 和光純薬工業株式会社 クラミジア・トラコマティス検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミジア・トラコマティスの検出方法
EP2553123B1 (en) 2010-03-26 2016-08-24 Integrated DNA Technologies, Inc. Methods for enhancing nucleic acid hybridization
US9506057B2 (en) 2010-03-26 2016-11-29 Integrated Dna Technologies, Inc. Modifications for antisense compounds
KR101176139B1 (ko) 2010-05-20 2012-08-22 광주과학기술원 관절염 동물모델로서 연골 특이적 ＨＩＦ?２α 형질전환 마우스 및 이의 용도
KR101223660B1 (ko) 2010-05-20 2013-01-17 광주과학기술원 ＨＩＦ－２α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
ES2569220T3 (es) 2010-06-22 2016-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Envase de suspensión para partículas de unión para el aislamiento de material biológico
ES2644797T3 (es) 2010-07-29 2017-11-30 F. Hoffmann-La Roche Ag PCR genérica
JP6169489B2 (ja) 2010-07-29 2017-07-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 一般的な試料調製
ES2605303T3 (es) 2010-07-29 2017-03-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Detección cualitativa y cuantitativa de ácidos nucleicos microbianos
CN107604097A (zh) 2010-07-29 2018-01-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于多种参数的对照核酸
EP2603609B1 (en) 2010-08-11 2017-04-12 Murdoch Childrens Research Institute Diagnosis of epigenetic disorders and conditions
EP2426222A1 (en) 2010-09-07 2012-03-07 F. Hoffmann-La Roche AG Generic buffer for amplification
CA2809457C (en) 2010-09-07 2019-07-30 Integrated Dna Technologies, Inc. Modifications for antisense compounds
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
WO2013082164A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Life Technologies Corporation Enhanced ligation reactions
EP2465945A1 (en) 2010-12-17 2012-06-20 F. Hoffmann-La Roche AG Generic matrix for control nucleic acids
WO2012106385A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 Apprise Bio, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
CA2826131C (en) 2011-02-02 2019-11-05 Jay Ashok Shendure Massively parallel continguity mapping
EP2691541B1 (en) 2011-03-31 2017-10-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Method for enriching in single-stranded mutant sequences from mixture of wild-type and mutant sequences
CN105907846A (zh) 2011-04-07 2016-08-31 美艾利尔圣地亚哥有限公司 重组聚合酶扩增混合物的监测
KR101291668B1 (ko) 2011-04-21 2013-08-01 서울대학교산학협력단 미코박테리아―대장균용 셔틀 벡터 및 이의 용도
EP2710145B1 (en) 2011-05-17 2015-12-09 Dxterity Diagnostics Incorporated Methods and compositions for detecting target nucleic acids
EP2535712A1 (en) 2011-06-15 2012-12-19 F. Hoffmann-La Roche AG Analytical system for the preparation of biological material
CA2840929C (en) 2011-07-08 2020-03-24 Keygene N.V. Sequence based genotyping based on oligonucleotide ligation assays
CA2858284A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Biomerieux Detection of meca variant strains of methicillin-resistant staphylococcus aureus
US9133490B2 (en) 2012-05-16 2015-09-15 Transgenomic, Inc. Step-up method for COLD-PCR enrichment
WO2013176958A1 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
CN105264088B (zh) 2012-08-08 2018-12-28 豪夫迈·罗氏有限公司 提高鉴定细胞中的多个表位的动态范围
MX2015004191A (es) 2012-10-04 2016-04-04 Univ Leland Stanford Junior Metodos y reactivos para la deteccion, cuantificacion y serotipado de virus del dengue.
US9181583B2 (en) 2012-10-23 2015-11-10 Illumina, Inc. HLA typing using selective amplification and sequencing
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
EP2943590A4 (en) 2013-01-13 2017-02-15 Unitaq Bio Methods and compositions for pcr using blocked and universal primers
EP2971115B1 (en) 2013-03-13 2022-07-27 Seegene, Inc. Quantification of target nucleic acid using melting peak analysis
ES2887177T3 (es) 2013-03-13 2021-12-22 Illumina Inc Método de preparación de una biblioteca de secuenciación de ácidos nucleicos
ES2704255T3 (es) 2013-03-13 2019-03-15 Illumina Inc Métodos y sistemas para alinear elementos de ADN repetitivos
CN105189746B (zh) * 2013-03-14 2018-12-04 宝生物工程株式会社 用于使用耐热的错配内切核酸酶的方法
KR101403507B1 (ko) 2013-03-21 2014-06-09 주식회사 현일바이오 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트
KR101507505B1 (ko) 2013-04-18 2015-04-07 사회복지법인 삼성생명공익재단 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법
EP3080268A1 (en) 2013-12-09 2016-10-19 Illumina, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
DK3083994T3 (da) 2013-12-20 2021-09-13 Illumina Inc Bevarelse af genomisk konnektivitetsinformation i fragmenterede genomiske DNA-prøver
US9677132B2 (en) 2014-01-16 2017-06-13 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
WO2015108663A1 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Illumina, Inc. Amplicon preparation and sequencing on solid supports
WO2015147370A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures
US20150353989A1 (en) 2014-06-09 2015-12-10 Illumina Cambridge Limited Sample preparation for nucleic acid amplification
US9757095B2 (en) 2014-06-10 2017-09-12 Dxterity Diagnostics Incorporated Devices and methods for collecting and stabilizing biological samples
GB201410420D0 (en) 2014-06-11 2014-07-23 Illumina Cambridge Ltd Methods for estimating cluster numbers
US10443087B2 (en) 2014-06-13 2019-10-15 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for preparing sequencing libraries
WO2016003814A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Illumina, Inc. Methods and compositions using one-sided transposition
WO2016040602A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Epicentre Technologies Corporation Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv
US20160085910A1 (en) 2014-09-18 2016-03-24 Illumina, Inc. Methods and systems for analyzing nucleic acid sequencing data
SG11201703139VA (en) 2014-10-17 2017-07-28 Illumina Cambridge Ltd Contiguity preserving transposition
GB201419731D0 (en) 2014-11-05 2014-12-17 Illumina Cambridge Ltd Sequencing from multiple primers to increase data rate and density
KR101718800B1 (ko) 2015-01-21 2017-03-24 주식회사 디알나노 약물 및 ｓｉＲＮＡ의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도
EP3277839B1 (en) 2015-03-31 2020-12-02 Illumina Cambridge Limited Surface concatamerization of templates
WO2016164407A2 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Polyskope Labs Detection of one or more pathogens
ES2759477T3 (es) 2015-05-29 2020-05-11 Hoffmann La Roche Un procedimiento de inactivación de microbios por anhídrido citracónico
WO2017006108A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Illumina Cambridge Limited Sample preparation for nucleic acid amplification
KR101651817B1 (ko) 2015-10-28 2016-08-29 대한민국 Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트
ES2899242T3 (es) 2015-11-20 2022-03-10 Seegene Inc Método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana
US11485998B2 (en) 2015-12-15 2022-11-01 Seegene, Inc. Signal extraction for a target nucleic acid sequence
KR102300738B1 (ko) 2016-02-05 2021-09-10 주식회사 씨젠 타겟 분석물질에 대한 데이터 세트의 노이즈 수준 감축 방법
KR101845957B1 (ko) 2016-02-23 2018-04-05 전남대학교기술지주회사(주) 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법
SG11201805665UA (en) 2016-03-28 2018-10-30 Illumina Inc Multi-plane microarrays
SG11201811504PA (en) 2016-07-22 2019-01-30 Univ Oregon Health & Science Single cell whole genome libraries and combinatorial indexing methods of making thereof
US10422012B2 (en) 2016-10-10 2019-09-24 Roche Molecular Systems, Inc. Devices comprising bacteriophage PHI6 internal control compositions
US11031099B2 (en) 2016-11-09 2021-06-08 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of sequence variants
WO2018111835A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for molecular barcoding of dna molecules prior to mutation enrichment and/or mutation detection
US10793901B2 (en) 2016-12-28 2020-10-06 Roche Molecular Systems, Inc. Reversibly protected nucleotide reagents with high thermal stability
KR101936799B1 (ko) 2017-01-09 2019-01-11 주식회사 엠이티라이프사이언스 구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법
WO2018194437A2 (ko) * 2017-04-21 2018-10-25 이화여자대학교 산학협력단 표적 점 돌연변이 유전자 검출을 위한 핵산 분자 템플레이트 및 이를 이용한 유전자 검사방법
ES2882608T3 (es) 2017-04-23 2021-12-02 Illumina Inc Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en bibliotecas de ácidos nucleicos indexados
EP3615671B1 (en) 2017-04-23 2021-07-21 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
AU2018260627A1 (en) 2017-04-23 2019-11-14 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
ES2959047T3 (es) 2017-06-07 2024-02-19 Univ Oregon Health & Science Bibliotecas de genoma completo de célula individual para la secuenciación de metilación
US20180363044A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for improving the thermal stability of nucleic acid amplification reagents
WO2019017680A2 (ko) 2017-07-19 2019-01-24 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miRNA 및 이를 이용한 진단키트
KR101956315B1 (ko) 2017-07-19 2019-03-08 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miR494 및 이를 이용한 진단키트
US11174511B2 (en) 2017-07-24 2021-11-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for selecting and amplifying DNA targets in a single reaction mixture
WO2019027767A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Illumina Inc. SEQUENCING SYSTEM COMPRISING AGGREGATION OF MULTIPLEXED BIOLOGICAL SAMPLES
AU2018312560B2 (en) 2017-08-01 2022-03-10 Illumina, Inc. Hydrogel beads for nucleotide sequencing
CN117504806A (zh) 2017-10-31 2024-02-06 豪夫迈·罗氏有限公司 改进的磁性粒子及其用途
US11078534B2 (en) 2017-11-27 2021-08-03 Roche Molecular Systems, Inc. Photocleavable nucleotide reagents with high stability
CN111094589A (zh) 2018-02-13 2020-05-01 伊鲁米纳公司 使用水凝胶珠的dna测序
US20190292596A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 Roche Molecular Systems, Inc. Modified nucleoside phosphates with high thermal stability
AU2019248635B2 (en) 2018-04-02 2022-01-27 Illumina, Inc. Compositions and methods for making controls for sequence-based genetic testing
EP3781706A1 (en) 2018-04-20 2021-02-24 Illumina, Inc. Methods of encapsulating single cells, the encapsulated cells and uses thereof
US11384376B2 (en) 2018-05-31 2022-07-12 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for post-synthetic modification of nucleic acids
JP6986103B2 (ja) 2018-06-04 2021-12-22 イルミナ インコーポレイテッド 高スループット単一細胞トランスクリプトームライブラリーならびにその作製方法および使用方法
US11085036B2 (en) 2018-10-26 2021-08-10 Illumina, Inc. Modulating polymer beads for DNA processing
DK3887540T3 (da) 2018-11-30 2023-09-18 Illumina Inc Analyse af multiple analytter under anvendelse af et enkelt assay
SG11202102530QA (en) 2019-03-01 2021-04-29 Illumina Inc High-throughput single-nuclei and single-cell libraries and methods of making and of using
CN113226519A (zh) 2019-07-12 2021-08-06 Illumina剑桥有限公司 使用电泳制备核酸文库
KR20220034716A (ko) 2019-07-12 2022-03-18 일루미나 케임브리지 리미티드 고체 지지물 상에 고정된 crispr/cas9를 사용하여 핵산 서열분석 라이브러리를 제조하기 위한 조성물 및 방법
CN114787286A (zh) 2019-12-09 2022-07-22 豪夫迈·罗氏有限公司 双阳离子荧光染料
MX2021011847A (es) 2019-12-19 2021-11-17 Illumina Inc Genotecas de celulas unicas de alto rendimiento y metodos para elaborarlas y usarlas.
WO2021202403A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 Illumina, Inc. Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries
AU2021271637A1 (en) 2020-05-12 2022-12-08 Illumina Singapore Pte. Ltd. Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase
WO2021246820A1 (ko) 2020-06-05 2021-12-09 주식회사 씨젠 호흡기 병원체 검출을 위한 검체수송 키트 및 이를 이용한 호흡기 병원체 검출방법
WO2021252617A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Illumina, Inc. Methods for increasing yield of sequencing libraries
JP2023532231A (ja) 2020-06-30 2023-07-27 イルミナ インコーポレイテッド 傷なしｄｎａを生成するための触媒的に制御された合成による配列決定
CN116171330A (zh) 2020-08-06 2023-05-26 Illumina公司 使用小珠连接的转座体制备rna和dna测序文库
AU2021329302A1 (en) 2020-08-18 2023-02-16 Illumina Cambridge Limited Sequence-specific targeted transposition and selection and sorting of nucleic acids
CN116323970A (zh) 2020-09-11 2023-06-23 伊鲁米纳剑桥有限公司 使用发夹衔接子从测序文库中富集靶序列的方法
CA3208854A1 (en) 2021-02-04 2022-08-11 Illumina, Inc. Long indexed-linked read generation on transposome bound beads
WO2022212280A1 (en) 2021-03-29 2022-10-06 Illumina, Inc. Compositions and methods for assessing dna damage in a library and normalizing amplicon size bias
BR112023019898A2 (pt) 2021-03-29 2023-11-07 Illumina Inc Métodos aprimorados de preparação de biblioteca
WO2022212330A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 Illumina, Inc. Improved methods of isothermal complementary dna and library preparation
BR112023019945A2 (pt) 2021-03-31 2023-11-14 Illumina Cambridge Ltd Métodos para a preparação de bibliotecas de sequenciamento por tagmentação direcional com o uso de tecnologia baseada em transposon com identificadores moleculares exclusivos para correção de erros
WO2022270984A1 (ko) 2021-06-24 2022-12-29 주식회사 씨젠 개별적으로 동작되는 생물학적 장치들을 이용한 자동화 분석 시스템, 분석 방법 및 저장 매체
WO2023003402A1 (ko) 2021-07-21 2023-01-26 주식회사 씨젠 조립형 분석 시스템, 방법 및 컴퓨터 판독가능한 기록 매체
AU2023248405A1 (en) 2022-04-07 2024-01-04 Illumina, Inc. Altered cytidine deaminases and methods of use
WO2024069581A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina Singapore Pte. Ltd. Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use
WO2024073047A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides
WO2024073043A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3301833A1 (de) * 1983-01-20 1984-07-26 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig Verfahren zur simultanen synthese mehrerer oligonocleotide an fester phase
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB8508732D0 (en) * 1985-04-03 1985-05-09 Ti Domestic Appliances Ltd Refrigerating systems
US5011769A (en) * 1985-12-05 1991-04-30 Meiogenics U.S. Limited Partnership Methods for detecting nucleic acid sequences
US4851331A (en) * 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase
GB8612087D0 (en) * 1986-05-19 1986-06-25 Ici Plc Hybridisation probes
CA1323293C (en) * 1987-12-11 1993-10-19 Keith C. Backman Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
CA1341584C (en) * 1988-04-06 2008-11-18 Bruce Wallace Method of amplifying and detecting nucleic acid sequences
WO1989012696A1 (en) * 1988-06-24 1989-12-28 Amgen Inc. Method and reagents for detecting nucleic acid sequences
JP2955759B2 (ja) * 1988-07-20 1999-10-04 セゲブ・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド 核酸配列を増幅及び検出する方法
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
AU5358990A (en) * 1989-03-21 1990-10-22 Collaborative Research Inc. Multiplex dna diagnostic test
US5427930A (en) * 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction

Also Published As

Publication number Publication date
KR960002235B1 (ko) 1996-02-13
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KR950013953B1 (ko) 1995-11-18
AU7000791A (en) 1991-08-01
ES2089038T3 (es) 1996-10-01
DE69118930T2 (de) 1997-01-09

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