KR101223660B1 - ＨＩＦ－２α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

ＨＩＦ－２α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HIF-2α(hypoxia-inducible factor-2α) 유전자의 발현을 억제하거나, 또는 HIF-2α 단백질의 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 HIF-2α은 골관절염이 유도된 연골세포 또는 조직에서 발현이 증가하고, 다양한 연골퇴행 유발인자의 발현 및 MAP(mitogen-activated protien) 키나제의 활성화를 촉발시킨다. 또한, 본 발명의 HIF-2α를 억제하는 경우, 연골퇴행 유발인자의 발현 레벨 및 MAP 키나제의 인산화가 HIF-2α의 억제 정도에 따라 현저하게 감소하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 관절염의 예방 또는 치료에 적용될 수 있으며, 이를 이용하여 관절염 치료제의 개발에도 이용될 수 있다.

Description

ＨＩＦ－２α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Arthritis Comprising HIF-2α Inhibitor as an Active Ingredient}
본 발명은 퇴행성관절염의 유발인자로서 HIF-2α의 신규한 용도에 관한 것이다.
연골조직이 점진적이고 비가역적으로 닳아 없어짐으로써 유발되는 퇴행성관절염(골관절염)은 삶의 질을 떨어뜨리는 대표적 퇴행성 질환이다. 우리나라에서는 방사선 소견상 70세 이상에서는 거의 전인구가 퇴행성관절염을 나타내며 이 중 약 1/4 정도가 임상적 치료를 필요로 한다. 연골조직은 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 관절 연골조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며 만성적 손상은 퇴행성관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업 활동을 방해하게 된다. 발생빈도가 지속적으로 증가하고 있는 관절염의 시장규모는 세계적으로 2000년 약 95억 달러 규모이며 연 평균 14% 가량 성장하고 2005년 200억 달러 및 2010년에는 약 350억 달러의 규모가 예상되며 국내시장의 경우 2008 현재 4000억 원으로 추정된다. 기술적 측면에서 지난 수십 년 동안 퇴행성관절염의 제어를 위해 많은 연구와 노력이 있어 왔지만 수술적 방법 이외에는 항염증제 등을 통한 통증완화 등에 그치고 있으며 아직 그 병리적 원인이나 근본적인 치료방법이 개발되지 않고 있다.
퇴행성관절염에 대한 분자생물학적 및 의학적 연구 결과 세포치료 및 조직공학적 방법 혹은 유전자 치료 등이 실험적으로 시도되고 있으나 임상적용에는 어려움이 있다. 구체적으로 지금까지 개발된 손상 연골의 치료법으로는 연골성형술(chondroplasty), 골연골이식술(osteochondral transplantation), 자가유래연골세포 이식술(autolaugous chondrocyte transplantation) 등을 들 수 있다. 상기 연골성형술은 가장 일반적으로 사용되는 방법으로 직접적인 관절 절개가 필요 없어 환자의 고통 및 부담을 줄일 수 있으며, 관절경을 통해 미세한 조직손상을 관찰 즉시 치료할 수 있다는 장점을 지닌다. 그러나, 연골성형술에서는 실제의 관절에 필요한 초자연골(hyaline cartilage)이 아니라 섬유연골(fibro-cartilage)이 주로 생성되기 때문에, 기능적인 측면에서 볼 때는 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다. 한편, 골연골 이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 연골과 연골하골 부분을 함께 채취하여, 손상된 연골부 위에 적당한 구멍을 파고 이식하여 초자연골을 생성하는 방법으로, 일부 환자에게서 성공을 거두었다. 그러나, 상기 방법은 이식된 부위와 원래 조직 사이에 틈이 남는 문제 등이 있어 완전한 치료 방법이라 하기 어려우며, 그나마 자가이식(autolaugous transplantation)이 가능한 환자만을 대상으로 시행할 수 있어 보편적인 방법이 될 수 없다. 최근 시행되기 시작한 자가 유래 연골세포 이식술은 환자의 정상부위에서 채취한 연골조직으로부터 연골세포를 얻어, 체외에서 필요한 수만큼 배양하고 증식한 후, 이를 연골 손상부위에 골막(periosteum)을 이용하여 공간을 확보하고 배지와 함께 주입하여, 이 세포들의 증식에 의해 손상된 연골 부분을 채우도록 하는 방법이다. 그러나, 자가 유래 연골세포 이식술은 공여 조직이 제한되어 있고, 이식용 조직을 채취하기 위한 수술을 필요로 하기 때문에 시술 과정이 복잡하고 까다롭다.
현재까지 알려진 퇴행성관절염의 병리적 원인은 관절의 기계적 손상, 유전적 요인, 비만 등에 의해 관절연골에 생화학적 변화에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 퇴행성관절염을 유발하는 이러한 생화학적 변화는 연골기질 분해효소인 매트릭스 메탈로프로티나제(matrix metalloprotenase, MMP) 및 ADAMTS(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)의 발현증가 및 활성화에 의한 연골기질의 분해 그리고 연골세포의 사멸 및 특성소실(탈분화)에 의한 연골기질분자의 합성감소에 기인한다. 연골세포에서 생성된 MMP 및 ADAMTS는 연골세포로부터 합성 분비된 다양한 ECM(extracellular matrix) 분자들, 즉 콜라겐, 프로테오글리켄(proteoglycan) 등을 분해하고 결과적으로 연골조직의 파괴와 연골조직 ECM 분자 구성을 변화시킨다. 따라서, MMP 및 ADAMTS의 합성 및 활성 조절은 연골퇴행의 제어에 중요한 표적이 되고 있으나 이데 대한 분자적 조절 기전에 대한 연구는 미흡하다. 연골세포에서 MMP의 발현 조절기작은 아직 명확히 밝혀지지 않았으나, 인터루킨(interleukin, IL)-1β 및 TNF-α 등의 염증성 사이토카인에 의해 생성된다. 또한, 염증성 사이토카인은 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 유도하여 MMP 및 ADAMTS의 합성을 증대시킨다. 예를 들어, 연골세포에서 생성되는 MMP는 MMP-1, -2, -3, -9, -12, -13, -14, -15를 포함하며, 연골세포에서 생성되는 ADAMTS는 ADAMTS-4, -5 등을 포함한다.
한편, 상기 HIF-2α[hypoxia-inducible factor-2α; 또는 EPAS1(endothelial PAS domain protein 1)으로 알려짐]는 전사인자로서 저산소증에 의해 조절되는 유전자이며 표적유전자의 발현을 유도하여 저산소증에 적응할 수 있도록 하는 유전자로 최초 알려져 있다. HIF-2α는 또한 간과 지방세포에서 지방 침착에 관여하는 기능을 한다고 알려져 있다. 하지만, 비대연골세포에서 발현된다는 보고 이외에 연골퇴행에서 HIF-2α 기능에 대해서 아직 정확하게 규명된 게 없다(Tian, H., et al., Genes Dev. 12, 3320-3324, 1998; Stewart, A.J et al., J. Cell. Physiol. 206, 435-440, 2006). 지금까지 보고된 바에 의하면, HIF는 HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α 총 3종류가 존재 하는 것으로 알려져 있으며 이들은 각각 α subunit와 β subunit로 이루어진 이량체로서 DNA와 결합하는 것으로 알려져 있다. HIF-2α는 HIF-1α와 상동체homologue로 저산소 상태에서는 HIF-1β와 이량체를 형성하지만, HIF-2α 유전자 적중 마우스를 이용한 실험결과, HIF-1α와는 달리 정상산소 상태에서도 조혈작용이나 카테콜라민 항상성(catecholamin homeostasis) 등과 같은 특정 생리현상에 관여한다고 알려져 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 관절염(arthritis)을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 생체분자를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 HIF-2α(hypoxia-inducible factor-2α)가 퇴행성관절염이 유도된 연골세포 또는 조직에서 발현이 증가하고, 다양한 연골퇴행 유발인자의 발현 및 MAP(mitogen-activated protien) 키나제의 활성화를 촉발시킴에 따라, 동물(예컨대, 사람, 마우스)의 세포 또는 조직에서 이의 억제를 통해 관절염을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 관절염 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 관절염의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 관절염 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 관절염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 관절염-유발용 유전자 전달 시스템을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 HIF-2α(hypoxia-inducible factor-2α) 유전자의 발현을 억제하거나, 또는 HIF-2α 단백질의 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 HIF-2α 단백질에 특이적인 결합제, HIF-2α 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편을 포함하는 관절염 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 관절염 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 HIF-2α 단백질 또는 HIF-2α 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 관절염 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 관절염(arthritis)을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 생체분자를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 HIF-2α(hypoxia-inducible factor-2α)가 퇴행성관절염이 유도된 연골세포 또는 조직에서 발현이 증가하고, 다양한 연골퇴행 유발인자의 발현 및 MAP(mitogen-activated protien) 키나제의 활성화를 촉발시킴에 따라, 동물(예컨대, 사람, 마우스)의 세포 또는 조직에서 이의 억제를 통해 관절염을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.
관절염(arthritis)은 여러 가지 원인에 의해 관절에 염증이 생긴 질환을 의미한다. 특히, 골관절염(osteoarthritis, OA)은 관절염 질환들 중에서 가장 오래되고 가장 일반적인 질환 중 하나로, 관절 연골(joint’s cartilage)의 파괴로 특징화되는 만성 상태를 의미하며, 퇴행성 경관절 질환(degenerative joint disease), 변형성 관절증(ostoarthrosis), 비대성 관절염(hypertrophic arthritis) 또는 퇴행성관절염(degenerative arthritis)으로도 알려져 있다. 따라서, 본 명세서에서는 언급하는 골관절염은 상술한 다른 명칭들과 상호 호환되어 사용될 수 있다. 연골은 뼈의 끝 부위에 완충 기능(cushion)을 하여 관절이 쉽게 움직일 수 있도록 하는 관절의 한 부위이다. 연골의 파괴는 인접한 뼈들 간의 마모를 야기하고, 관절의 이동의 어려움으로 인한 경직(stiffness) 및 고통을 초래한다. 현재 관절염을 가지고 살아가는 사람의 수가 우리나라에서 약 200만명, 미국에서 약 2,700만명으로 추산될 정도로 관절염은 발생빈도가 매우 높은 질환이다(Helmick, C., et al., Estimates of the Prevalence of Arthritis and Other Rheumatic conditions in the United States. Arthritis & Rheumatism, 58(1): 15-25(2008)). 불행하게도, 아직까지 발병원인에 대한 명확한 이해가 부족하기 때문에 그 치료법 또한 없는 실정이다. 실제로, 관절염은 많은 인자들(예를 들어, 나이, 비만, 상처, 관절의 과도한 사용, 유전적 원인, 등)에 의해 발병할 수 있기 때문에 발병 상황에 따라 그 치료 방법이 다양할 수 있다.
골관절염은 다음과 같은 다양한 단계로 나뉘어진다: (a) 연골이 탄력성을 잃어 상처나 이용에 의해 보다 더 쉽게 상처받는 단계; (b) 연골의 마모가 밑에 있는 뼈에 변화를 야기시키는 단계로, 뼈가 비후화되고 낭종이 발생할 수 있다. 돌기(spurs) 또는 골증식체(osteophytes)로 불리는 뼈의 증식이 영향 받은 관절에 있는 뼈의 말단에서 일어난다 가려움과 고통을 야기한다; (c) 뼈 또는 연골의 조각이 관절강(joint space)에 느슨하게 부유하는 단계; 및 (d) 연골 파괴(breakdown)로 인해 관절막 또는 활액막에 염증을 일으키는 단계로, 연골에 손상을 입히는 사이토카인 및 효소를 추가적으로 야기시킨다.
본 발명은 골관절염 유발인자 및 이를 제어할 수 있는 표적인자로서 HIF-2α의 활성 및 작용기작을 밝히고, 이를 이용하여 관절염을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 최초로 규명한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HIF-2α는 관절염이 유도된, 보다 바람직하게는 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 또는 기계적 결함에 의해 관절염이 유도된 세포 또는 조직에서 mRNA 또는 단백질 레벨에서 발현이 증가한다. 이에 반하여, 본 발명의 HIF-2α는 항-염증성 사이토카인(예컨대, IL-4, IL-10 또는 IL-12)에 의해서는 그 발현양의 변화가 검출되지 않았다(참고: 도 2).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 염증성 사이토카인은 인터루킨(interleukin, IL)-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17, IL-21, TNF(tumor necrosis factor)-α, INF(interferon)-γ, HMG1, PAF(olatelet-activating factor) 또는 MIF(magrophage migration inhibitory factor)를 포함하고, 보다 바람직하게는 IL-1β, IL-17, IL-21 또는 TNF-α를 포함하며, 가장 바람직하게는 IL-1β 또는 IL-17을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용된 기계적인 결함은 세포(예컨대, 연골세포)에 콜라게나제(collagenase)를 주입시키거나 또는 조직(예컨대, 연골조직)에 십자인대 절제술(destabilization of medial meniscus, DMM)을 통해 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HIF-2α는 연골퇴행 유발인자의 발현을 mRNA 또는 단백질 레벨에서 증가시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골퇴행 유발인자는 매트릭스 메탈로프로티나제(matrix metalloprotenase, MMP)-1, MMP-3, MMP-9, MMP-12, MMP-13, ADAMTS(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)-4, ADAMTS-5, PTGS-2(Prostaglandin-endoperoxide synthase-2) 또는 NOS2(nitric oxide synthase 2)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HIF-2α는 MAP(mitogen-activated protein) 키나제를 인산화시켜 시그널 전달 경로(signal transduction pathway)를 활성화시킨다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 MAP 키나제는 ERK(extarcellular-signal regulated kinase), JNK(c-Jun N terminal kinase) 또는 p38 MAP 키나제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 HIF-2α 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대한 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분으로서 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 siRNA를 포함한다.
본 발명에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(HIF-2α mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(HIF-2α mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기, 그리고 가장 바람직하게는 20-30 염기이다.
siRNA 말단 구조는 HIF-2α 유전자의 발현을 RNAi(RNA interference) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA는 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 포함된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 본 발명에 따르면, 사이토카인이 처리된 연골세포(예: 마우스 무릎관절 연골세포)에서 HIF-2α-siRNA를 처리함에 따라 농도-의존적으로 사이토카인-유도된 연골퇴행 유발인자의 발현 레벨이 뚜렷하게 감소하였고, MAP 키나제의 인산화가 현저하게 감소하였다(참조: 도 3 및 도 4).
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 국소 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인체 또는 포유동물로부터 얻어지는 모든 시료, 예컨대, 연골(특히, 관절 연골)의 세포 또는 조직, 오줌, 타액, 혈액, 혈장 또는 혈청 시료를 의미하며, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HIF-2α은 연골, 특히 관절연골 시료에 포함되어 있다. 따라서, 본 발명의 HIF-2α은 관절염의 발생 및 발전에 대한 지표가 될 수 있으며, 관절염의 발생 및 발전의 진단에 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물은 골관절염(osteoarthritis), 퇴행성관절염(degenerative joint disease), 박리성 골연골염(osteochondritis dissecans), 관절 인대손상(ligament injuries), 반월상 연골판 손상(meniscus injuries), 관절의 부정정렬(malalignment of joint), 무혈성 괴사증(osteonecrosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis), 외상(trauma), 염증성 관절염(inflammatory arthritis) 또는 감염(infection)으로 인한 관절염(septic arthritis)을 예측 또는 진단하는데 이용되며, 보다 바람직하게는 골관절염 또는 퇴행성관절염을 예측 또는 진단하는데 이용되고, 가장 바람직하게는 골관절염을 매우 정확하게 예측 또는 진단하는데 이용된다.
본 발명의 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 관절염 상태의 동정, 관절염의 단계 결정 또는 치료에 대한 관절염의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 명세서에서 용어 "예후"는 질병의 진행 가능성 과정, 특히, 질병의 차도, 질병의 재생, 관절염 재발 측면에서의 예측을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 예후는 관절염 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 관절염 마커(예컨대, HIF-2α)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.
본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 관절염을 진단하는 데 이용될 수 있다.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, HIF-2α 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed. Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355 (6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727 (1998) 에 상세하게 개시되어 있다.
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 관절염을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 마커 단백질이 저발현 되어 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 관절연골 세포 또는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 약하게 나오는 경우에는 관절염으로 진단된다. 또한, 본 발명의 마커 단백질에 의해 발현이 조절되는 연골퇴행 유발인자(예를 들어, MMP-1, MMP-3, MMP-9, MMP-12, MMP-13, ADAMTS-4, ADAMTS-5, PTGS-2 또는 NOS2)가 정상 생물학적 시료보다 저발현되거나 또는 MAP 키나제(예를 들어, ERK, JNK 또는 p38 MAP 키나제)의 인산화가 정상 생물학적 시료보다 저해되는 경우에는 관절염으로 진단된다.
본 발명의 조성물은 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 조성물은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 포함된 키트를 제작하는 경우 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 마이크로어레이용 조성물일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물는 유전자 증폭용 조성물이다.
본 발명의 조성물이 마이크로어레이용 조성물인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 조성물이 유전자 증폭용 조성물인 경우에는 프라이머를 포함한다.
본 발명의 진단용 조성물에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 HIF-2α 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어“상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 상술한 HIF-2α의 GenBank 접근번호 NM_010137.3(서열목록 제1서열)에 뉴클레오타이드 서열이 개시되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명의 조성물이 포함된 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물이 포함된 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
본 발명의 관절염 진단용 조성물이 포함된 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.
상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 관절염 여부를 판단할 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 관절 연골(articular cartilage) 조직세포에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethyl benzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 관절염 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 관절염 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 관절연골의 조직 또는 세포)보다 약하게 나오는 경우에는 관절염으로 진단된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 관절염 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 PCR은 실시간(real-time) PCR을 이용하여 실시한다. 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 C T 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 C T 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요하 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트가 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 관절 연골 조직 또는 세포, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.
따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생물학적 시료에서 본 발명 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(예컨대, 정상 관절 연골 세포 또는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 낮게 나오는 경우에는 관절염으로 진단된다.
따라서 본 발명의 관절염 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (ⅰ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 마커는 관절염에서 고발현되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 높은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상세포 또는 조직과 비교하여 2-5배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 관절염이 발병 또는 발생했다고 판정한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) HIF-2α를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 HIF-2α의 발현량을 분석하는 단계를 포함하는 관절염(arthritis) 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 HIF-2α의 발현량을 mRNA 또는 단백질 레벨에서 억제시키면 관절염 치료제로 판단된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) (i) HIF-2α 단백질 및 HIF-2α 단백질이 결합하는 전사조절서열에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 HIF-2α 단백질이 상기 전사조절서열에 결합하는 정도를 분석하는 단계를 포함하는 관절염(arthritis) 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 HIF-2α의 상기 전사조절서열 결합을 억제시키면 관절염 치료제로 판단된다.
본 발명의 방법은 상술한 HIF-2α의 발현량을 분석하는 과정을 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 방법은 염증성 사이토카인의 처리 또는 기계적 결함에 의해 관절염을 유도하는 단계(pre-a)를 상기 단계 (a) 전에 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포는 동물의 연골 조직으로부터 유래한다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 HIF-2α을 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시킨다. 본 발명의 HIF-2α을 포함하는 세포는 HIF-2α을 내인적으로(endogenous) 발현하는 세포 또는 일시적으로(transiently) HIF-2α이 고발현된 세포를 포함하며, 이에 특별히 제한되지 않고, 가장 바람직하게는 연골세포이다. 본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 HIF-2α의 발현에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이어, 시험물질이 처리된 세포에서 본 발명의 HIF-2α-코딩 뉴클레오타이드 서열의 발현 또는 HIF-2α 단백질이 상기 전사조절서열에 결합하는 정도를 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 본 발명의 HIF-2α-코딩 뉴클레오타이드 서열의 발현 또는 HIF-2α 단백질이 상기 전사조절서열에 결합하는 정도를 억제시키는 경우, 상기 시험물질은 관절염 치료제로 판정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HIF-2α 단백질이 결합하는 전사조절서열은 CGTG 보존성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HIF-2α 단백질 및 HIF-2α 단백질이 결합하는 전사조절서열은 세포 내에 존재한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HIF-2α 단백질이 결합하는 전사조절서열은 그의 다운스트림 방향에 리포터 유전자를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 HIF-2α 단백질 및 HIF-2α 단백질이 결합하는 전사조절서열은 프로모터의 활성을 조사하기 위한 것으로서, 상기한 서열을 필수 구성요소로 한다. 필수 서열 중 리포터 유전자는 분석하고자 하는 프로모터의 전사활성에 따라 그 발현의 정도가 차이가 있게 되고, 이에 의해 발현이 되는 단백질의 활성 또는 양을 조사함으로써 프로모터의 전사활성을 용이하게 판단할 수 있게 해준다. 리포터 유전자로서 바람직하게는, 루시퍼라아제의 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제의 유전자, β-갈락토시다아제의 유전자, 사람의 성장 호르몬의 유전자, 녹색 형광단백질(green fluorescent protein), 분비성 태반 알칼린 포스파테이즈(secreted placental alkaline phosphatase) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 루시퍼라제 유전자이다.
리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 양은 루시퍼라아제의 경우에는 de Wet J. et al, Mol. Cell Biol., 7:725-737(1987)에 개시된 방법, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제의 경우에는 Gorman C. et al, Mol. Cell Biol., 2:1044-1051(1982)에 개시된 방법, β-갈락토시다아제의 경우에는 Hall C.V. et al, J. Mol. Appl. Genet., 2:101-109(1983)에 개시된 방법, 사람의 성장 호르몬의 경우에는 Selden R. et al., Mol. Cell Biol., 6:3173-3179(1986)에 개시된 방법, 녹색 형광단백질의 경우에는 Chalfie M. et al, Science, 263:802-805(1994)에 개시된 방법, 그리고 분비성 태반 알칼린 포스파테이즈의 경우에는 Berger, J. et al, Gene, 66:1-10 (1988)에 개시된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 관절염은 골관절염, 퇴행성관절염, 박리성 골연골염, 관절 인대손상, 반월상 연골판 손상, 관절의 부정정렬, 무혈성 괴사증, 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 외상, 염증성 관절염 또는 감염으로 인한 관절염을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포 내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달 시스템에 있어서, 상기 목적 뉴클레오타이드 서열은 HIF-2α 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 관절염-유발용 유전자 전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 유전자 전달 시스템을 제조하기 위해, HIF-2α-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, HIF-2α 유전자는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, HIF-2α 유전자에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 더 바람직하게는 인간 또는 마우스 세포, 가장 바람직하게는 연골세포에서 작동하여 HIF-2α 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, CII 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, CII 프로모터이다.
바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리아네닐화 서열을 포함한다(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 HIF-2α-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 “프로모터-HIF-2α-인코딩 뉴클레오타이드 서열-폴리 아데닐화 서열”의 구조를 갖는다.
본 발명의 유전자 전달 시스템은 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.
HIF-2α-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 HIF-2α-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 아데노 바이러스에 적용하여 제조된다.
ⅰ. 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR(inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역(E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 HIF-2α 유전자는 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템은 “프로모터-HIF-2α 유전자-폴리 A 서열”이 연결된 구조를 갖으며, 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역, 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된 것이다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 HIF-2α 유전자는 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 HIF-2α 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.
ⅱ. 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, HIF-2α 유전자는 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열이 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). HIF-2α 유전자, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.
ⅲ. AAV 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열(HIF-2α 유전자)을 포함하는 플라스미드(McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))를 동시에 형질전환시켜 제조된다.
ⅳ. 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, HIF-2α 유전자를 세포 내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
ⅴ. 리포좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 리포펙타민이 있다. HIF-2α 유전자를 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포 내로 HIF-2α 유전자를 운반한다.
상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 본 발명에서, 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다. 본 발명에서 유전자 전달 시스템은 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 마이크로인젝션법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포 내로 이입시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 마이크로인젝션법에 의해 실시한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 연골퇴행에 대한 조절인자로서 HIF-2α의 신규한 용도에 관한 것이다.
(b) 본 발명에 따르면, 본 발명의 HIF-2α은 골관절염이 유도된 연골세포 또는 조직에서 발현이 증가하고, 다양한 연골퇴행 유발인자의 발현 및 MAP(mitogen-activated protien) 키나제의 활성화를 촉발시킨다.
(c) 또한, 본 발명의 HIF-2α를 억제하는 경우, 연골퇴행 유발인자의 발현 레벨 및 MAP 키나제의 인산화가 HIF-2α의 억제 정도에 따라 현저하게 감소하였다.
(d) 따라서, 본 발명의 조성물은 관절염의 예방 또는 치료에 적용될 수 있으며, 이를 이용하여 관절염 치료제의 개발에도 이용될 수 있다.
도 1은 퇴행성관절염을 유발 혹은 억제할 것으로 예상되는 신규 유전자를 동정하기 위한 인 실리코(in silico) 방법을 요약하고(a, b), 1차 및 2차 스크리닝을 통한 HIF-2α를 선별한 결과이다. Hs.468410 = HIF-2α(c).
도 2는 퇴행성관절염을 유발하는 HIF-2α의 발현을 조절하는 기전을 보여주는 결과로 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 인터루킨(IL)-1β, IL-18, IL-21 및 TNF-α에 의해 HIF-2α의 발현이 증가하고(a, b), 염증성 사이토카인(IL-1β)는 NFκB 및 MAP(mitogen-activated protein) 키나제 시그널 전달 경로를 활성화시키고(c), MAP 키나제 시그널 전달 경로 중 JNK와 NFκB가 HIF-2α의 발현에 관여하며(d, e), 실제 NFκB를 활성화시키는 IκB 및 인산화된 JNK(pJNK)가 사람의 퇴행성 관절연골 조직에서 다량 활성화 되어 있음을 나타낸다(f).
도 3은 HIF-2α가 관절연골세포에서 연골퇴행을 유발하는 인자인 MMP(1, 3, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGS2, NOS2 등의 발현을 조절한다는 것을 나타내는 결과로, HIF-α의 과발현 및 siRNA에 의한 발현 저해를 통해 RT-PCR(a) 및 웨스턴 블럿(b)을 통해 증명하고 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)로 전사체를 정량화한 그래프(c, d)이다.
도 4는 HIF-2α가 관절연골세포에서 연골퇴행을 유발하는 인자인 PTGS2 및 NOS2의 발현을 조절함을 증명한 것으로, HIF-α의 과발현 및 siRNA에 의한 발현 저해를 통해 실시간 RT-PCR로 전사체를 정량화한 그래프(a)와 실제 이들 효소에 의한 대사체인 일산화질소(nitric oxide, NO)와 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)의 생성이 증가함을 보여주는 그래프이다.
도 5는 HIF-2α 표적유전자들의 프로모터 구조(a)와 각 프로모터 리포터 유전자(reporter gene) 분석을 통해 MMP(1, 3, 9, 12, 13), ADAMTS4, NOS2 및 PTGS2의 전사활성이 HIF-2α에 의해 조절됨을 나타내는 결과이다.
도 6은 MMP(1, 3, 9, 12, 13) 및 ADAMTS4의 프로모터에 있는 HIF-2α 결합부위를 돌연변이 시켜 HIF-2α가 이들 유전자를 직접적으로 조절한다는 것을 나타내고(a), 프로모터와 HIF-2α 결합을 증명하기 위해 사용한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 서열(b), 그리고 프로모터와 올리고뉴클레오티드의 결합 여부를 분석한 그래프이다(c).
도 7은 사람의 퇴행성관절염 연골조직에서 HIF-2α의 발현은 증가하고 반대로 제2형 콜라겐(COL2A1)은 감소함을 RT-PCR로 확인하고 연골퇴행 정도를 ICRS 등급으로 나타낸 그림(a), HIF-2α의 퇴행연골조직에서 발현을 전사체 및 단백질 수준에서 확인한 그림(b), 건강한 정상연골조직과 퇴행연골조직에서 연골퇴행을 유발하는 인자들의 유전자 전사체를 RT-PCR 및 실시간 RT-PCR로 정량화한 그래프(c)이다.
도 8은 퇴행성관절염 모델동물인 STR/ort 마우스에서 야생형 마우스와 비교하여 HIF-2α의 발현은 증가하고 반대로 제2형 콜라겐은 감소함을 RT-PCR로 확인하고 연골퇴행 정도를 Mankin score로 나타낸 그래프이고(a), 연골의 파괴정도를 사프라닌-O(Safranin-O)로 염색하여 확인하고 퇴행연골조직에서 HIF-2α의 단백질 발현이 증가함을 나타내며(b), 연골퇴행을 유발하는 인자들의 유전자 전사체를 RT-PCR 및 실시간 RT-PCR로 정량화한 그래프(c)이다.
도 9는 HIF-2α을 코딩하는 아데노바이러스를 마우스의 관절연골에 주사한 경우, HIF-2α가 연골조직에 과발현된다는 것을 나타내며(a), 이에 의해 연골조직이 파괴됨을 사프라닌-O 염색을 통해 확인하고 퇴행 정도를 Mankin score로 정량화한 그림 및 그래프이고(b), 연골퇴행을 유발하는 인자들의 유전자 전사체를 RT-PCR 및 실시간 RT-PCR로 정량화한 그래프(c)이다.
도 10은 연골세포 특이적으로 HIF-2α를 과발현하는 형질전환된 마우스를 제조하고 이 마우스의 관절연골에 HIF-2α 단백질이 과발현된다는 것을 나타내며(a), 생후 12주령 및 45주령 유전자변형 마우스에서 정상인 야생형 마우스(CBA)와 비교하여 퇴행성관절염이 유발됨을 나타내며(b), 정상연골과 비교하여 연골퇴행을 유발하는 인자들의 유전자 전사체를 RT-PCR 및 실시간 RT-PCR로 정량화한 그래프(c)이다.
도 11은 HIF-2α가 결손된 유전자 적중(gene targeting) 마우스에서는 야생형 마우스와 비교하여, 콜라게나제(collagenase)의 주입에 의한 퇴행성관절염이 억제됨을 사프라닌-O 염색으로 확인하고 Mankin score로 정량화한 결과를 보여주고(a), 이때 연골퇴행을 유발하는 인자들의 유전자 전사체를 RT-PCR 및 실시간 RT-PCR로 정량화한 그림(c)이다. 또한, 관절십자인대 절제술(DMM)에 의한 퇴행성관절염이 HIF-2α가 결손된 유전자 적중 마우스에서 억제되는 것을 사프라닌-O 염색으로 확인하고 Mankin score로 정량화한 결과를 보여주고(c), 이때 연골퇴행을 유발하는 인자들의 유전자 전사체를 RT-PCR 및 실시간 RT-PCR로 정량화한 그림(d)이다.
도 12는 도 11의 b와 c에 나타난 유전자 전사체를 실시간 RT-PCR로 정량화한 그래프이다.
도 13은 HIF-2α에 의한 퇴행성관절염의 유발 기전을 나타내는 모식도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 연골퇴행 유발인자 HIF-2α 동정
연골 특이적 조절 유전자를 동정하기 위하여 NCBI(ncbi.nlm.nih.gov)의 UniGene 데이터베이스에 저장된 인간 퇴행연골 라이브러리(#8936)를 분석하였다. 본 발명자들은 라이브러리의 연골 특이적 유전자를 참고문헌의 기준에 따라 분류하였다(Hong, S. et al., J Biol Chem 280, 7685-7693, 2005). 즉, 참고문헌에 기초하여 기능적으로 알려지지 않은 유전자 및 신규 유전자를 선별하였다. 유전자 발현(SAGE)/cDNA 가상 노던(Gene Expression(SAGE)/cDNA Virtual Northern)의 모노크로마틱 시리얼 분석법(cgap.nci.nih.gov/SAGE)을 이용하여 분석된 비-연골 ESTs에 비해 연골 ESTs의 수가 더 많은 유전자를 연골-특이 유전자로서 분류하였다. 선별된 유전자 중, 연골퇴행의 기능적 특징을 나타내는 유전자로서 HIF-2α을 선별하였다(도 1).
마우스(Chales River, Japan) 무릎관절 연골세포에서 연골퇴행의 병리학적 조건을 유도하기 위하여 염증성 사이토카인(pro-inflammatory)으로 알려진 인터루킨 1β(IL-1β, Calbiochem, USA), IL-17(R&D systems, USA), TNF-α(R&D systems, USA) 또는 IL-21(R&D systems, USA)을 처리하였다. HIF-2α의 발현 정도는 RT-PCR, qRT-PCR 및 웨스턴 블롯을 이용하여 조사하였다. 이때, 사용된 마우스 무릎관절 연골세포는 8일된 ICR 마우스(Charles River, Japan) 무릎관절로부터 분리하여 10%(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum, Gibco, USA), 50 μg/ml의 스트렙토마이신(Sigma-Aldrich, USA) 및 50 unit/ml 페니실린(Sigma-Aldrich, USA)이 함유된 DMEM 배지(Gibco, USA)에서 배양하였다. 실험 결과, 염증성 사이토카인에 의해 HIF-2α가 증가되는 반면 항염증성 사이토카인인 IL-4(R&D systems, USA), IL-10(R&D systems, USA) 및 IL-12(R&D systems, USA)에 의해서는 HIF-2α 발현이 변하지 않음을 확인하였다(도 2a 및 도 2b). IL-1β는 연골세포에서 다양한 시그널 전달 경로(signal transduction pathway)를 활성화 시키는데, NFκB를 활성화시킴을 IκB 단백질이 분해됨을 웨스턴 블롯으로 확인하였고, MAP(mitogen-activated protein) 키나제 아형(subtype) 중에서 ERK(extarcellular-signal regulated kinase), JNK(c-Jun N terminal kinase), 및 p38 MAP 키나제의 활성화 여부를 웨스턴 블롯을 통해 조사한 결과, 모두 인산화 되어 활성화되었음을 확인하였(도 2c). IL-1β에 활성화되는 시그널 전달 경로 중에서 NFkB를 BAY 11-7085(BAY, Biomol, USA)로 저해한 경우와 JNK를 SP600125(SP, Biomol, USA)로 저해한 경우 현저하게 HIF-2α의 전사체 및 단백질 발현이 감소한다. 반면 ERK를 PD98059(PD, Tocris Cookson Inc, USA)로 저해한 경우 억제정도가 다소 약하며 p38 MAP kinase를 SB203580(SB, Tocris Cookson Inc, USA)로 저해한 경우 HIF-2α의 발현에는 영향이 없었다. 따라서, NFkB 및 JNK가 HIF-2α의 발현을 조절함을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯(도 2d), 그리고 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)로 HIF-2α 전사체를 정량화하여 확인하였다(도 2e). 실제 NFκB를 활성화시키는 IκB 및 인산화된 JNK(pJNK)가 사람의 퇴행성 관절연골조직(osteoarthritis, OA)에서는 정상연골(Normal)에 비교하여 다량 활성화 되어 있음을 면역조직화학적 염색을 통해 확인하였으며, 이는 이들의 신호전달 경로가 퇴행연골조직에서 활성화된다는 것을 나타낸다(도 2f).
실시예 2: HIF-2α에 의한 연골퇴행 유발인자의 발현조절
HIF-2α에 의해 발현이 조절되는 연골퇴행 유발인자를 확인하기 위해, HIF-2α를 과발현하는 아데노바이러스(Ad-HIF-2α)를 이용하여 마우스의 무릎관절 연골세포에 HIF-2α를 과빌현시켰다. 대조군(mock 바이러스)에 비해 Ad-HIF-2α에 의해 MMP(1, 3, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGS2, NOS2 등의 연골퇴행 유도인자의 발현이 유도됨을 RT-PCR(도 3a) 및 웨스턴 블롯(도 3b)으로 확인하고 발현 정도를 qRT-PCR로 정량화하였다(도 3c와 d). HIF-2α의 과발현은 아데노바이러스를 이용하여 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 마우스 무릎관절 연골세포를 배양 배지에서 72시간 동안 유지시킨 후 대조군(mock 바이러스, 800 MOI) 또는 상기 아데노바이러스의 배양 상등액(200, 400, 800 MOI)으로 90분 동안 감염시키고, 혈청 배지에서 2일간 배양하였다. 상기 세포를 회수하여 연골퇴행 유도인자를 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. GAPDH 및 ERK를 젤 상에서 로딩 대조군으로 사용하였다. HIF-2α, MMP, ADAMTS, PTGS2 및 NOS2의 mRNA 및 단백질 레벨을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 측정하였고, 이때 GAPDH 및 라민 B(Lamin B)를 로딩 대조군으로 사용하였다. PCR에 사용한 프라이머는 표 1에 나타낸 바와 같다.
프라이머 서열.
유전자 프라이머 서열 서열번호 예상크기
Human
HIF-2α		 센스 5'-ACCCAGACGGATTTCAATGAGC-3' 8 293 bp
안티센스 5'-TTGCTTCCGGCATCAAAG AAG-3 9
Mouse
HIF-2α		 센스 5'-CGAGAAGAACGACGTGGTGTTC-3' 10 370 bp
안티센스 5'-GTGAAGGCGGGCAGGCTCC-3 11
Human
MMP1		 센스 5'-GGAGGGGATGCTCATTTTGATG-3' 12 541 bp
안티센스 5'-TAGGGAAGCCAAAGGAGCTGT-3 13
Rabbit
MMP1		 센스 5'-ATGGACCTGAAGGACAGCT-3' 14 534 bp
안티센스 5'-CCTGCACAGTCCAGTACTT-3 15
Human
MMP2		 센스 5'-GCCTGAGCTCCCGGAAAAGATTG-3 16 444 bp
안티센스 5'-CAGCAGCCTAGCCAGTCGGATTT-3 17
Mouse
MMP2		 센스 5'-CCAACTACGATGATGAC-3' 18 233 bp
안티센스 5'-ACCAGTGTCAGTATCAG-3 18
Rabbit
MMP2		 센스 5'-CCGTGTGAAGTATGGCAATGC-3' 20 493 bp
안티센스 5'-GCGGTCATCGTCGTAGTTG-3 21
Human
MMP3		 센스 5'-GATGCGCAAGCCCAGGTGTG-3' 22 406 bp
안티센스 5'-GCCAATTTCATGAGCAGCAACGA-3 23
Mouse
MMP3		 센스 5'-TCCTGATGTTGGTGGCTTCAG-3' 24 102 bp
안티센스 5'-TGTCTTGGCAAATCCGGTGTA-3' 25
Rabbit
MMP3		 센스 5'-TGTACCCAGTCTACAACGC-3' 26 550 bp
안티센스 5'-TCCAGGGACTCTCTCTTCT-3 27
Human
MMP9		 센스 5'-GGCCAACTACGACACCGACGAC-3' 28 424 bp
안티센스 5'-CGCCGCCACGAGGAACAAAC-3 29
Mouse
MMP9		 센스 5'-ACCACATCGAACTTCGA-3' 30 212 bp
안티센스 5'-CGACCATACAGATACTG-3 31
Rabbit
MMP9		 센스 5'-CTCCTCGTGCTGGGCTGTT-3' 32 449 bp
안티센스 5'-TACACGCGGGTGAAGGTGA-3 33
Human
MMP12		 센스 5'-ATATGTTGACATCAACACAT-3 34 286 bp
안티센스 5'-ATAAGCAGCTTCAATGCCAG-3 35
Mouse
MMP12		 센스 5'-CCCAGAGGTCAAGATGGATG-3' 36 482 bp
안티센스 5'-GGCTCCATAGAGGGACTGAA-3 37
Rabbit
MMP12		 센스 5'-GGAGCTCATGGAGACTATG-3' 38 460 bp
안티센스 5'-GGACACTGGTTGAACT-3 39
Human
MMP13		 센스 5'-AGGAGCATGGCGACTTCTACCC-3' 40 341 bp
안티센스 5'-TTTGTCTGGCGTTTTTGGATGTT-3 41
Mouse
MMP13		 센스 5'-TGATGGACCTTCTGGTCTTCTGG-3' 42 473 bp
안티센스 5'-CATCCACATGGTTGGGAAGTTCT-3' 43
Rabbit
MMP13		 센스 5'-CCTACACCGGCAAGAGTCA-3' 44 460 bp
안티센스 5'-TCTTGGGAATCCCAGTTCA-3 45
Human
MMP14		 센스 5'-ATGAGGCGCCCCCGATGTGG-3' 46 369 bp
안티센스 5'-TCCAATGTTGGGGCCTGGGAAGT-3 47
Mouse
MMP14		 센스 5'-GTGCCCTAGGCCTACATCCG-3' 48 580 bp
안티센스 5'-TTGGGTATCCATCCATCACT-3 49
Rabbit
MMP14		 센스 5'-GCGTACGAGAGGAAGGATG-3' 50 396 bp
안티센스 5'-CCAGCACCAGGAGTAGCAG-3 51
Human
MMP15		 센스 5'-GCTTCGCGGGGAGATGTTCGTGT-3' 52 499 bp
안티센스 5'-CTCCATCCGCAGGCGCTCATTGT-3 53
Mouse
MMP15		 센스 5'-GAGAGATGTTTGTGTTCAAGGG-3' 54 260 bp
안티센스 5'-TGTGTCAATGCGGTCATAGGG-3 55
Rabbit
MMP15		 센스 5'-GTACTGGCGCTTCAACGA-3' 56 550 b
안티센스 5'-CCACCTCCTCCATCTGCA-3 57
Human
ADAMTS4		 센스 5'-AGAAGAAGTTTGACAAGTGC-3' 58 225 bp
안티센스 5'-GCGTGTATTCACCATTGAG-3 59
Mouse
ADAMTS4		 센스 5'-CATCCGAAACCCTGTCAACTTG-3' 60 281 bp
안티센스 5'-GCCCATCATCTTCCACAATAGC-3 61
Rabbit
ADAMTS4		 센스 5'-GGATTGCACGAGGCCCGTC-3' 62 305 bp
안티센스 5'-CACCCGGGGCTCCAATACG-3 63
Human
ADAMTS5		 센스 5'-ATCACCCAATGCCAAGG-3' 64 245 bp
안티센스 5'-AGCAGAGTAGGAGACAAC-3 65
Mouse
ADAMTS5		 센스 5'-GCCATTGTAATAACCCTGCACC-3' 66 292 bp
안티센스 5'-TCAGTCCCATCCGTAACCTTTG-3 67
Rabbit
ADAMTS5		 센스 5'-AGGGCAAGTGTGTGGACAAGA CA-3' 68 237 bp
안티센스 5'-GAAAAGATTTACCTTGGCTGG GC-3 69
Human
COX-2		 센스 5'-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAA-3' 70 303 bp
안티센스 5'-AGATCATCTCTGCCTGAGCT-3' 71
Mouse
COX-2		 센스 5'-GGTCTGGTGCCTGGTCTGATGAT-3' 72 724 bp
안티센스 5'-GTC CTTTCAAGGAGAATGGTGC-3 73
Rabbit
COX-2		 센스 5'-TCAGCCACGCAGCAAATCCT-3' 74 279 bp
안티센스 5'-GTCATCTGGATGTCAGCACG-3 75
Human
iNOS		 센스 5'-CCATGGAACATCCCAAATAC-3' 76 357 bp
안티센스 5'-TCTGCATGTACTTCATGAAGG-3 77
Mouse
iNOS		 센스 5'-TCACTGGGACAGCACAGA AT-3' 78 510 bp
안티센스 5'-TGTGTCTGCAGATGTGCTGA-3 79
Rabbit
iNOS		 센스 5'-TCACCATCTTCCAGGAGCG-3' 80 299 bp
안티센스 5'-CACAATGCCGAAGTGGTCG-3 81
Human
Aggrecan		 센스 5'-GCCTTGAGCAGTTCACCTTC-3' 82 395 bp
안티센스 5'-CTCTTCTACGGGGACAGCAG-3 83
Mouse
Aggrecan		 센스 5'-GAAGACGACATCACCATCCAG-3' 84 581 bp
안티센스 5'-CTGTCTTTGTCACCCACACATG-3 85
Rabbit
Aggrecan		 센스 5'-CAACGTCGCCAGAGAAGTT-3' 86 581 bp
안티센스 5'-CTTCGCCCTCAGTGATGTT-3' 87
Human
Coll-II		 센스 5'-CAGTTGGGAGTAATGCAAG-3' 88 300 bp
안티센스 5'-GCCTGGATAACCTCTGTG-3 89
Mouse
Coll-II		 센스 5'-CACACTGGTAAGTGGGGCAAGA-3' 90 173 bp
안티센스 5'-GGATTGTGTTGTTTCAGGGTTCG-3 91
Rabbit
Coll-II		 센스 5'-AGCCGCCATTGATGGTCTC-3' 92 370 bp
안티센스 5'-GACCCCATGCAGTACATG C-3 93
Human
GAPDH		 센스 5'-CGTCTTCACCACCATGGAGA-3' 94 300 bp
안티센스 5'-CGGCCATCACGCCACAGTTT-3 95
Mouse
GAPDH		 센스 5'-TCACTGCCACCCAGAAGAC-3' 96 450 bp
안티센스 5'-TGTAGGCCATGAGGTCCAC-3 97
Rabbit
GAPDH		 센스 5'-TCACCATCTTCCAGGAGCG-3' 98 299 bp
안티센스 5'-CACAATGCCGAAGTGGTCG-3 99
또한, Ad-HIF-2α에 의한 과발현 뿐만 아니라 HIF-2α에 특이적인 siRNA를 이용하여 HIF-2α의 발현을 인위적으로 억제한 후 각각의 연골퇴행 유발인자들의 발현을 상술한 방법과 동일하게 실시하였다. 보다 상세하게는, 마우스 무릎관절 연골세포를 배양 배지에서 72시간 동안 유지시킨 후 대조군(C-siRNA, 100 nM) 또는 상기 HIF-2α siRNA(25, 50, 100 nM)로 7시간 동안 감염시키고 IL-1β가 첨가된 배지에서 1.5일 동안 배양하였다. 상기 세포를 회수하여 연골퇴행 유도인자를 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 확인하였고, GAPDH 및 라민 B를 로딩 대조군으로 사용하였다. 또한, HIF-2α, MMP, ADAMTS, PTGS2 및 NOS2의 mRNA(도 3a) 및 단백질(도 3b) 레벨을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 측정하였고 qRT-PCR로 발현 정도를 정량화하였다(도 3c 및 도 3d). GAPDH 및 라민 B를 로딩 대조군으로 사용하였다. 본 발명의 PCR에 이용된 프라이머는 상술한 표 1에 기재되어 있다. 실험 결과, IL-1β에 의해 발현이 증가된 연골퇴행 유도인자들인 MMP(1, 3, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGs2, NOS2 등은 HIF-2α 발현 억제에 의해 그 발현이 감소됨을 확인하였다.
HIF-2α siRNA 올리고뉴클레오타이드 서열
유전자 HIF-2α siRNA 올리고 서열 서열번호
Rabbit HIF-2α
siRNA		 센스 5'-CUCAGUUACAGCCACAUCGUCACUG-3' 2
안티센스 5'-CAGUGACGAUGUGGCUGUAACUGAG-3' 3
mouse HIF-2α
siRNA		 센스 5'-AGUUGUUGUAGACUUUCACCUGGC -3' 4
안티센스 5'-GGCCAGGUGAAAGUCUACAACAAC-3' 5
Control
siRNA		 센스 5'-CCUACGCCACCAAUUUCG-3' 6
안티센스 5'-ACGAAAUUGGUGGCGUAG -3' 7
도 3a에서 확인할 수 있듯이, 마우스 무릎관절 연골세포에서 Ad-HIF-2α 및 HIF-2α siRNA를 이용하여 HIF-2α의 발현을 인위적으로 조절한 경우, PTGS2 및 NOS2의 발현이 각각 증가 및 감소하고, 이들 전사체의 발현 정도를 qRT-PCR로 정량화한 경우, Ad-HIF-2α에 의해 증가하고 반대로 siRNA에 의해서는 감소함을 확인하였다(도 4a). 실험방법은 상술한 MMP 및 ADAMT의 경우와 동일하다. 또한, NOS2 및 PTGS2는 각각 일산화질소(nitric oxide, NO)와 프로스타글란딘(prostaglandin) E2(PGE2)의 생성을 유도하여 연골퇴행을 조절하는 바 이들 대사체를 측정한 결과, PTGS2 및 NOS2 전사체 발현과 동일하게 Ad-HIF-2α에 의해 증가하고 반대로 siRNA에 의해서는 감소함을 확인하였다(도 4b).
HIF-2α는 전자 조절인자(transcription factor)로서, 상기 결과는 HIF-2α가 연골세포에서 MMP, ADMATS, PTGS2 및 NOS2 등의 연골퇴행 유도인자의 전사활성을 표적유전자로서 직접적으로 조절할 수 있음을 의미한다. 이를 증명하기 위하여 각각의 연골퇴행 유도인자의 프로모터를 이용하여 HIF-2α에 의한 연골퇴행 유도인자(MMP, ADAMTS, PTGS2, NOS2)의 조절 여부를 분석하였다. 또한, 각 프로모터를 변이시켜 HIF-2α의 결합을 억제시키는 방법과 HIF-2α 활성을 억제하는 우성-음성(dominant negative, dn) HIF-2α(ΔHIF-2α)를 이용하여 HIF-2α의 활성을 억제시키는 방법을 이용하여 연골퇴행 유도인자의 조절 여부를 조사하였다(도 5 및 도 6). 이를 위해 사용된 프로모터의 크기와 HIF-2α 결합 부위는 도 5a에 도식적으로 나타냈으며 이를 제조하기 위해 사용된 프라이머는 표 3에 기재되어 있다. HIF-2α에 의한 연골퇴행 유도인자 전사조절 여부는 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 마우스 무릎관절 연골세포를 배양 배지에서 72시간 동안 유지시킨 후 연골퇴행 유도인자에 해당하는 각각의 프로모터(1 ㎍)과 HIF-2α 발현벡터(0.5, 1.0, 1.5 ㎍)으로 리포펙타민 2000(Lipofectamin 2000, Invitrogen, USA)을 이용하여 세포에 도입한 후, 혈청 배지에서 2일간 배양한 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 그 결과, HIF-2α가 과발현 되었을 때 MMP(1, 3, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGS2 및 NOS2가 HIF-2α에 의해 직접적으로 전사 활성이 증가함을 확인할 수 있었고, 동시에 HIF-2α 활성을 억제하는 HIF-2α이 과발현 되었을때 HIF-2α에 의해 조절되는 MMP(1, 3, 9, 12, 13), ADATS4, PTGS2 및 NOS2의 전사 활성이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 5b). 또한, 각각의 프로모터에 HIF-2α 결합부위인 CGTG를 AAAG로 변형시킨 프로모터에서는 HIF-2α에 의해 이들 표적유전자의 전사활성이 증가하지 않음을 확인하였다(도 6a). HIF-2α가 직접적으로 연골퇴행 유도인자의 프로모터에 결합하는지 알아보기 위하여 단백질-DNA 결합을 분석하였다. 각각의 프로모터 부위에 해당하는 이중가닥 올리고뉴크레오티드(double strand oligonucleotide)을 이용한 EPIGENTEK에서 구입한 단백질-DNA 결합분석 키트를 통해 분석하였다. 실험에 사용한 정상 올리고뉴클레오티드 서열과 CGTG를 AAAG로 변형시킨 변이서열(Δ)은 도 6b에 기재된 바와 같다. 분석 결과, HIF-2α가 MMP(1, 3, 9, 12, 13), PTGS2, NOS2 및 ADAMTS4에 직접적으로 결합한다는 것을 형광 측정(fluorescence intensity)를 통해 확인하였다(도 6c). 상술한 결과들을 종합해 보면, 연골퇴행을 유발하는 인자인 MMP(1, 3, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGS2 및 NOS2는 연골세포에서 HIF-2α의 직접적인 표적유전자들로서 HIF-2α에 의해 발현이 조절됨을 알 수 있다.
유전자에 따라 발현벡터 및 프로모터 제작에 이용된 프라이머 서열.
유전자 프라이머 서열 서열번호 예상크기 사용용도
Mouse
HIF-2α		 센스 5'-ATGACAGCTGACAAGGAGAA-3' 100 2,622 bp 발현벡터
안티센스 5'-GGTGGCCTGGTCCAGA-3' 101
Human
HIF-2α		 센스 5'-ATGACAGCTGACAAGGAG-3' 102 1,455 bp 발현벡터
안티센스 5'-AGGGCTATTGGGCGTGGA-3' 103
Human
MMP1		 센스 5'-GGAGTCACTTCAGTGGCAAGTGT-3' 104 -1,770/
+71		 프로모터
안티센스 5'-ACTGGCCTTTGTCTTCTTTCTCA-3' 105
Mouse
MMP2		 센스 5'-CGCCTCATAAGTTGTCCA-3' 106 -2,226/
+302		 프로모터
안티센스 5'-CGTTGCGCTCCCGGGCTC-3 107
Human
MMP3		 센스 5'-CTGTTTGACATTTGCTATGAG-3' 108 -2,262/
+28		 프로모터
안티센스 5'-CCTTGCTGTCTTGCCTGCCTC-3' 109
Mouse
MMP9		 센스 5'-GAGAGTTTTGTAGAGAGCGTAT-3' 110 -1,329/
+19		 프로모터
안티센스 5'-GGTGAGGACCGCAGCTTCTGG-3' 111
Human
MMP12		 센스 5'-GGAGTAGCCTGTAATC-3' 112 -1,433/
+43		 프로모터
안티센스 5'-TAAACTTCTAAACGGATC-3' 113
Human
MMP13		 센스 5'-CACGGTACTGAATGTGTGATGTC-3' 114 -1,135/
+28		 프로모터
안티센스 5'-CTTGAATGGTGATGCCTGGGGAC-3' 115
Human
MMP14		 센스 5'-TTTTTTGGCAAGCATCTG-3' 116 -1,528/
+234		 프로모터
안티센스 5'-GGTCCGAGACCACCGGGT-3 117
Human
MMP15		 센스 5'-CCAAACTTTTTAAAATTGGCTAA-3' 118 -1,030/
+353		 프로모터
안티센스 5'-TCTTAAAGGGCCAGTGTGCTCC-3' 119
Mouse
ADAMTS4		 센스 5'-TGTGCCTTCTCCTTCTGCCAG-3' 120 -1,920/
+427		 프로모터
안티센스 5'-CTGCGGCACCAAAATGCTCCA-3 121
Mouse
ADAMTS5		 센스 5'-TTTGAAAATGAGAGGGCTGAC-3' 122 -998/
+858		 프로모터
안티센스 5'-AGTGCGCTGCCCGCCGGGAGG-3' 123
Mouse
COX-2		 센스 5'-GTGTATAGCTGGCTGTCCTGAAA-3' 124 -1,922/
+100		 프로모터
안티센스 5'-CGCAGAGGTGGCAGCGG-3' 125
Mouse
iNOS		 센스 5'-ATGGAAAGTTATAGTCTC-3' 126 -1,952/
+148		 프로모터
안티센스 5'-CAAGACTCACCTTGCAG-3' 127
실시예 3: 퇴행생관절염 연골조직에서 HIF-2α의 발현 증가
HIF-2α의 퇴행성관절염에서의 기능을 조사함에 있어서, 사람의 퇴행성관절염 연골조직 및 동물모델(마우스)의 퇴행연골 조직에서 HIF-2α의 발현 양상을 먼저 조사하였다. 사람의 퇴행성관절염 연골조직은 인공관절수술 환자(Wonkwang University Hospital, Korea)의 연골조직을 이용하였고, 마우스의 퇴행연골 조직은 자발적 연골퇴행이 유도되는 STR/ort 마우스(Harlan Laboratories, Germany)연골조직을 이용하고 대조군은 정상 CBA 마우스(Charles River, Japan)를 이용하였다. 연골조직의 퇴행을 확인하기 위한 분석 방법은 연골 조직만을 특이적으로 염색하는 사프라닌-O(Safranin-O) 염색방법을 이용하였다. RT-PCR 및 qRT-PCR에 사용한 총 RNA는 RNA STAT-60(Tel-Test, Woodlands, TX)을 이용하여 각각의 조직 및 세포로부터 분리하고 ImProm-IITM 역전사 효소(Promega, Madison, WI)를 이용하여 역전사하였다. 생성된 cDNA를 Taq 중합효소(TaKaRa Bio, Shiga, Japan)로 PCR 증폭하였다. PCR에 사용한 프라이머는 표 1에 나타낸 바와 같다.
실험 결과, 사람의 퇴행성관절염 연골조직 중에서 관절염에 영향을 받지 않은 부위(undamaged)와 많이 손상된 부위(damaged)를 비교하였다. 연골손상은 ICRS 등급이 현저히 증가하고 연골 표지자인 유형2 콜라겐(Col2a1)의 발현이 현저히 감소함을 통해 확인하였고, 이와 더불어 HIF-2α의 발현이 급격히 증가함을 RT-PCR로 확인하였다(도 7a). 또한, 관절염에 의해 손상된 부위(damaged)는 손상되지 않은 부위(undamaged)와 비교하여 현저히 증가된 HIF-2α 전사체(mRNA)가 존재함을 인 시츄 혼성화(in situ hybridization)을 통해 확인하였고, 단백질 양도 증가함을 면역조직화학적 염색을 통해 확인하였다(도 7b). 정상연골조직, 손상되지 않은 부위(undamaged), 그리고 손상된 부위(damaged)에서 HIF-2α 표적유전자로서 연골퇴행을 유발하는 인자들의 발현을 조사한 결과 정상연골에 비해 손상연골에서 MMP(1, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGS2 및 NOS2의 발현이 현저히 증가되어 있음을 RT-PCR로 확인하였다(도 7c).
한편, 퇴행성관절염 동물모델인 STR/ort 마우스 연골조직을 대조군인 정상 CBA 마우스와 비교하였다. 그 결과, STR/ort 마우스의 연골조직에서 연골손상은 Mankin score 결과 현저히 증가하고 연골 표지자인 제2형 콜라겐(Col2a1)의 발현이 현저히 감소함을 통해 확인하였다. 이때, HIF-2α의 발현이 급격히 증가함을 RT-PCR로 확인하였다(도 8a). 또한, STR/ort 마우스의 연골조직은 대조군인 CBA 마우스와 비교하여 현저히 손상되어 있음을 사프라닌-O 염색을 통해 확인하였고, 이때 HIF-2α 단백질 발현이 현저히 증가함을 면역조직화학적 염색을 통해 확인하였다(도 8b). 또한, CBA 마우스와 비교하여 STR/ort 마우스의 퇴행연골 조직에서 HIF-2α 표적유전자로서 연골퇴행을 유발하는 인자들의 발현을 조사한 결과, 정상연골에 비해 손상연골에서 MMP(3, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGS2 및 NOS2의 발현이 현저히 증가되어 있음을 RT-PCR로 확인하였다(도 8c).
상술한 결과들을 토대로, 사람의 퇴행성관절염 연골 조직 및 동물모델의 퇴행성관절염 연골 조직 모두에서 HIF-2α의 발현이 증가하고 HIF-2α의 표적유전자로서 연골퇴행을 유발하는 인자들의 발현 역시 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: HIF-2α 과발현에 의한 퇴행성관절염의 유발
HIF-2α에 의한 연골조직 퇴행 및 퇴행성관절염의 유발을 직접적으로 확인하기 위해 마우스 무릎관절에 대조군(mock 바이러스) 및 Ad-HIF-2α(1 x 109 pfu)를 주입하여 HIF-2α를 과발현시키고, 주입하고 7일 후 연골조직을 분석하였다. 보다 상세하게는, 연골조직에 HIF-2α가 과발현 되었는 지 여부를 면역조직화학법으로 분석하였으며 연골조직을 사프라닌-O로 염색하여 퇴행을 확인하고 Mankin score로 퇴행 정도를 정량화하였다. 또한, 과발현된 HIF-2α에 의해 퇴행성관절염이 유도될 때 연골퇴행 인자들을 RT-PCR 및 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 실험 결과, HIF-2α가 관절연골 조직에 과발현됨을 확인하였으며(도 9a), 동시에 연골조직이 심하게 파괴됨을 사프라닌-O 염색에 의해 증명하였다(도 9b). 또한, 마우스 연골조직에 HIF-2α가 과발현 되었을 때, HIF-2α 표적유전자인 MMP(3, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGS2 및 NOS2의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 9c).
또한, HIF-2α에 의핸 연골퇴행을 확인하기 위해서 연골세포 특이적으로 HIF-2α가 과발현된 트랜스제닉 마우스(HIF-2α transgenic mouse, TG mouse)를 제작하였다. 연골세포 특이적으로 HIF-2α를 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 제조하기 위해, 먼저 이식용 유전자를 제작하였다. 마우스의 HIF-2α 유전자에서 NotI과 NotI 제한효소에 의해 잘려진 조각(2.625 kb)을 4.35 kb 크기의 pNass 베타 벡터(Clontech Laboratories, USA)의 NotI 위치에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터의 NotI 위치에 연골세포 특이적으로 발현을 유도하는 1.0 kb 크기의 제2형 콜라겐(Col2a1)의 인핸서(enhancer) 및 프로모터 부위를 클로닝하였다. 상기 벡터를 NotI 효소로 잘라 총 8.975 kb 크기의 정제된 이식용 유전자를 수득하였다. 상기 이식용 유전자를 C57BL/6(Charles River, Japan) 수정란의 전핵(pronucleuous)에 마이크로인젝션하였다. 상기 이식 유전자가 삽입된 수정란을 대리모 마우스의 자궁에 착상시켜 마우스 200마리 이상을 수득하였고 PCR 유전형검사(genotyping)을 통해 10마리의 원조 마우스를 수득하였다. 실험 결과, 연골세포-특이적 HIF-2α 형질전환된 마우스의 경우, 야생형 마우스와 비교했을 때 HIF-2α 유전자형질전환 마우스의 연골조직에서 HIF-2α가 과발현 됨을 확인하였다(도 10a). 각 12주령 및 45-주령 형질전환 마우스 또는 야생형 마우스의 연골을 4% 파라포름알데하이드(PFA, Sigma-Aldrich, USA) 용액에 24시간 고정시키고, 10% EDTA(Sigma-Aldrich, USA)용액에 2주 동안 반응시킨 다음 알코올 농도를 증가시켜 탈수시켜 파라핀(McCormick, USA)블록을 제조하였다. 제조된 파라핀 블록을 6 μm의 두께로 절단하여 사프라닌-O 염색을 실시하였다. 그 결과, 12-주령 야생형 마우스와 비교해 볼 때 HIF-2α 형질전화 마우스의 연골에서 약간의 비균일화를 확인할 수 있었으며 45-주령 야생형 마우스와 비교해 볼 때 HIF-2α 형질전환 마우스의 연골은 야생형에 비해 연골조직이 얇아지고 피괴되어 있음을 확인할 수 있었다. 연골파괴 정도를 나타내는 Mankin score를 조사한 경우 야생형 마우스와 비교하여 HIF-2α 형질전환 마우스에서 그 수치가 현저하게 높게 나와 퇴행성관절염이 유발되었음을 확인할 수 있었다(도 10b). HIF-2α 표적유전자인 MMP(3, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGS2 및 NOS가 유전자변형 마우스에서 현저히 증가됨을 확인하였다(도 10c).
상술한 결과들을 종합해 보면, 마우스의 무릎관절에 Ad-HIF-2α를 이용하여 연골조직에 HIF-2α를 과발현시키나 또는 연골 특이적 HIF-2α 형질전환 마우스에서 퇴행성관절염이 유도되고 HIF-2α 표적유전자인 MMP(3, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGS2 및 NOS2가 과발현되어 퇴행성관절염이 유도됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5: HIF-2α 발현 억제에 의한 퇴행성관절염의 발병억제
HIF-2α에 의한 퇴행성관절염의 유도를 보다 명확히 규명하기 위해, HIF-2α 유전자가 결손된 유전자 적중 마우스(HIF-2α+/-)를 이용하였다. HIF-2α가 완전히 결손된 마우스(HIF-2α-/-)는 배아상태에서 태어나지 못하기 때문에 본 실험에서 이용된 HIF-2α+/-를 미국 Jackson laboratory에서 구입하여 실험적 퇴행성관절염을 유도하였다. 보다 상세하게는, 야생형 및 HIF-2α+/-에서 콜라게나제(1 unit)를 10-12 주령 마우스에 주입하고 28일후 무릎관절을 분리하여 분석하였다. 또한, 퇴행성관절염을 십자인대 절제술(destabilization of medial meniscus, DMM)을 이용하여 유도하였다. 미세수술을 실시하고 7주 후에 마우스 무릎관절을 분리하여 연골퇴행정도를 분석하였다. 결과적으로, 콜라게나제 처리 및 DMM에 의해 정상 마우스에서 연골이 심하게 파손되었음을 사프라닌-O 염색을 통해 확인할 수 있었으며, 이와 대조적으로, HIF-2α+/- 마우스에서는 콜라게나제 처리 및 DMM에 의해 퇴행성관절염이 뚜렷하게 저해된다는 것을 사프라닌-O 염색 및 Mankin score를 통해 확인하였다(도 11a및 도 11c). 또한, 콜라게나제 처리 및 DMM으로 퇴행성관절염을 유도한 경우 HIF-2α+/- 표적유전자로서 연골퇴행을 유도하는 인자인 MMP(3, 9, 12, 13), ADAMTS4, PTGS2 및 NOS2의 발현이 야생행 마우스에서 증가하지만, HIF-2α+/- 유전자 적중 마우스에서 발현 증가가 현저하게 억제됨을 RT-PCR(도 11a 및 도 11c) 및 qRT-PCR(도 12)로 확인할 수 있었다.
따라서, HIF-2α가 결손되면 콜라게나제 처리 및 DMM에 의한 퇴행성관절염이 일어나지 않으며, 이는 HIF-2α가 연골퇴행 및 퇴행성관절염을 유도하는 중요한 인자라는 것을 의미한다.
실시예 6: HIF-2α의 발현 및 활성억제에 의한 퇴행성관절염의 억제
HIF-2α에 의한 퇴행성관절염이 유도되는 기전을 모식화한 그림이다(도 13). 연골 내에서 염증성 사이토카인의 증가와 같은 생화학적 요인 및 콜라게나제에 의한 연골 기질분자의 파괴나 십자인대 절제와 같은 기계적 자극에 의해 HIF-2α의 발현이 증가하고, 증가한 HIF-2α는 표적유전자인 MMP(1, 3, 9, 12, 13), ADAMTS4, NOS2 및 PTGS2의 발현을 유도한다. 이들 인자들은 궁극적으로 연골 기질분자를 분해하여 연골조직의 퇴행을 유도하여 퇴행성관절염을 유발하게 된다. 따라서, HIF-2α의 발현이나 활성을 억제하면 연골조직의 퇴행과 퇴행성관절염의 발병을 억제할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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ccagcaaatg gataacttgt acctgaaagc cttggagggt ttcattgctg 720 tggtgaccca agacggtgac atgatctttc tgtcggaaaa catcagcaag ttcatgggac 780 ttactcaggt agaactaaca ggacacagca tctttgactt cactcatcct tgcgaccatg 840 aggagatccg tgagaacctg actctcaaaa acggctctgg ttttgggaag aagagcaaag 900 acgtgtccac cgagcgtgac ttcttcatga ggatgaagtg cacggtcacc aacagaggcc 960 ggactgtcaa cctcaagtcg gccacctgga aggtcctgca ctgcaccggg caagtgagag 1020 tctacaacaa ctgcccccct cacagtagcc tctgtggctc caaggagccc ctgctgtcct 1080 gccttatcat catgtgtgag ccaatccagc acccatccca catggacatc cccctggaca 1140 gcaagacttt cctgagccgc cacagcatgg acatgaagtt cacctactgt gacgacagaa 1200 tcttggaact gattggttac caccccgagg agctacttgg acgctctgcc tatgagttct 1260 accatgccct ggattcggag aacatgacca aaagtcacca gaacttgtgc accaaggggc 1320 aggtggtatc tggccagtac cggatgctag ccaaacacgg aggatatgtg tggctggaga 1380 cccaggggac ggtcatctac aacccccgca acctgcagcc tcagtgtatc atgtgtgtca 1440 actatgtgct gagtgagatc gagaagaacg acgtggtgtt ctccatggac cagaccgaat 1500 ccctgttcaa gccacacctg atggccatga acagcatctt tgacagcagt gacgatgtgg 1560 ctgtaactga gaagagcaac tacctgttca ccaaactgaa ggaggagccc gaggaactgg 1620 cccagttggc ccccacccca ggagatgcca ttatttctct cgatttcgga agccagaact 1680 tcgatgaacc ctcagcctat ggcaaggcca tccttccccc gggccagcca tgggtctcgg 1740 ggctgaggag ccacagtgcc cagagcgagt ccgggagcct gccagccttc actgtgcccc 1800 aggcagacac cccagggaac actacaccca gtgcttcaag cagcagtagc tgctccacgc 1860 ccagcagccc tgaggactac tattcatcct tggagaatcc cttgaagatc gaagtgattg 1920 agaagctttt cgccatggac acggagccga gggacccggg cagtacccag acggacttca 1980 gtgaactgga tttggagacc ttggcaccct acatccctat ggacggcgag gacttccagc 2040 tgagccccat ctgcccagag gagccgctca tgccagagag cccccagccc accccccagc 2100 actgcttcag taccatgacc agcatcttcc agccgctcac cccgggggcc acccacggcc 2160 ccttcttcct cgataagtac ccgcagcagt tggaaagcag gaagacagag tctgagcact 2220 ggcccatgtc ttccatcttc tttgatgctg ggagcaaagg gtccctgtct ccatgctgtg 2280 gccaggccag cacccctctc tcttctatgg gaggcagatc caacacgcag tggcccccgg 2340 atccaccatt acatttcggc cctactaagt ggcctgtggg tgatcagagt gctgaatccc 2400 tgggagccct gccggtgggg tcatcgcagt tggaacctcc gagcgccccg cctcatgtct 2460 ccatgttcaa gatgaggtct gcaaaggact tcggggcccg aggtccatac atgatgagcc 2520 cagccatgat cgccctgtcc aacaagctga agctaaagcg gcagctggag tatgaggagc 2580 aagccttcca agacacaagc gggggggacc ctccaggcac cagcagttca cacttgatgt 2640 ggaaacgtat gaagagcctc atgggcggga cctgtccttt gatgcctgac aagaccatca 2700 gtgcgaacat ggcccccgat gaattcaccc aaaaatctat gagaggcctg ggccagccac 2760 tgagacacct gccacctccc cagccaccat ctaccaggag ctcaggggag aacgccaaga 2820 ctgggttccc gccacagtgc tatgcctccc agttccagga ctacggtcct ccaggagctc 2880 aaaaggtgtc aggcgtggcc agtcgactgc tggggccatc gttcgagcct tacctgttgc 2940 cggaactgac cagatatgac tgtgaggtga acgtgcccgt gcctggaagc tccacactcc 3000 tgcaggggag agaccttctc agagctctgg accaggccac ctgagccagg gcctctggcc 3060 gggcatgccc ctgcctgccc cgccgtcttg acctgccagc ttcacttcca tctgtgttgc 3120 tattaggtat ctctaacacc agcacacttc ttacgagatg tactcaacct ggcctactgg 3180 ccaggtcacc aagcagtggc 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cgggtttagt gtttatcata tatatgggta ctctgtaata 4080 tctaaaagct tagaaatggg atcttgctca caagaatcac ttttaagatc ttttagggct 4140 gttaatttta tttttctcag tgttctggac actgtagacc tgtgcagtac tcccacaggc 4200 ctgactaacc gccacagatc tctctttctt tctctctggt gactttttgc ttttgtgata 4260 tggcagcggt gtgacagtcc caggagagaa gtcattaagg gggaacattg caagctatct 4320 tttcgtgttc tcagtgtatt atgtacgtgt gtgctgttgc cgctatgagg gctcggggct 4380 tgcaggctct gagggcatgt cgcaggcgag ctggaaggaa gcgctctcac tttttttcag 4440 gcaatgttgc tagcccttct agcacactga gctacgagac tgccaatctc tctcctgcgg 4500 cacgtttggg ttggcacagc taccatgaaa tgtttttaat gggaattcat aaagcaagtt 4560 aggattcaca aatgtagtga cctagtcctt ggagctaaac tgggagtggg tgccaggtgg 4620 agggtagcag gtctgaccag ccctacaccc tgccacagat cacagcttgc cgggcaaatg 4680 accctgcgaa gccacggtgc agcgccccct gctggcgagc agcgggcaga cctccaagga 4740 cagcctctag ctgaggtctc agtcacatga agtgtgacac tgaacaggta gaaagcactg 4800 aaaatcgtgt tccaagagca ctttgtaact cactgagggg gaggggaagc accttttggg 4860 tttgcgatac caatcaacat 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uggc 24 <210> 5 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse HIF-2a siRNA antisense-oligonucleotide <400> 5 ggccagguga aagucuacaa caac 24 <210> 6 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control siRNA sense-oligonucleotide <400> 6 ccuacgccac caauuucg 18 <210> 7 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control siRNA antisense-oligonucleotide <400> 7 acgaaauugg uggcguag 18

Claims (17)

  1. HIF-2α(hypoxia-inducible factor-2α) 유전자의 발현을 억제하거나, 또는 HIF-2α 단백질의 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 HIF-2α는 연골퇴행 유발인자의 발현을 mRNA 또는 단백질 레벨에서 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 유효성분은 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염, 퇴행성관절염, 박리성 골연골염, 관절 인대손상, 반월상 연골판 손상, 관절의 부정정렬, 무혈성 괴사증, 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 외상, 염증성 관절염 또는 감염으로 인한 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. HIF-2α 단백질에 특이적인 결합제, HIF-2α 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편을 포함하는 관절염 진단 또는 예후 분석용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 HIF-2α 단백질에 특이적인 결합제는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 관절염 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 HIF-2α 단백질 또는 HIF-2α 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 관절염 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법.
  8. (a) HIF-2α를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 HIF-2α의 발현량을 분석하는 단계를 포함하는 관절염(arthritis) 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 HIF-2α의 발현량을 억제시키면 관절염 치료제로 판단된다.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 세포는 동물의 연골 조직으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
  10. (a) (i) HIF-2α 단백질 및 HIF-2α 단백질이 결합하는 전사조절서열에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 HIF-2α 단백질이 상기 전사조절서열에 결합하는 정도를 분석하는 단계를 포함하는 관절염(arthritis) 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 HIF-2α의 상기 전사조절서열 결합을 억제시키면 관절염 치료제로 판단된다.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 HIF-2α 단백질이 결합하는 전사조절서열은 CGTG 보존성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 HIF-2α 단백질 및 HIF-2α 단백질이 결합하는 전사조절서열은 세포 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 HIF-2α 단백질이 결합하는 전사조절서열은 그의 다운스트림 방향에 리포터 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염, 퇴행성관절염, 박리성 골연골염, 관절 인대손상, 반월상 연골판 손상, 관절의 부정정렬, 무혈성 괴사증, 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 외상, 염증성 관절염 또는 감염으로 인한 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 세포 내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달 시스템에 있어서, 상기 목적 뉴클레오타이드 서열은 HIF-2α 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 관절염-유발용 유전자 전달 시스템.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 유전자 전달 시스템은 플라스미드, 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 배시니아 바이러스, 리포좀 또는 니오좀인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 유전자 전달 시스템은 세포 내에서 연골퇴행 유발인자의 발현을 증가시키거나, 또는 MAP 키나제를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
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