JP5128273B2 - 未分化哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導するための方法、作用物質、及び化合物スクリーニングアッセイ - Google Patents
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Description
本発明は、平均骨密度の全身的又は局所的減少を伴う哺乳動物の疾患の分野に関連する。
骨は2つの異なる細胞系統、すなわち、造骨細胞(例えば骨芽細胞)及び骨吸収細胞(例えば破骨細胞)を含む。骨は、これらの骨芽細胞と破骨細胞との間の複雑な相互作用によって、継続的に破壊(再吸収)及び再構築される動的組織である。破骨細胞において、前駆細胞から機能的な破骨細胞への発達に関与する転写因子及び成長因子のカスケードはかなり確立されている。対照的に、骨芽細胞系統に関してはほとんど知られていない。
−ホルモン入れ替え療法(HRT)
−選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERMs)
−ビスフォスフォネート
−カルシトニン。
したがって、現在使用できる治療戦略の1以上の欠点を未然に防ぐ新たな治療戦略、及び化合物(特定の同化において)への継続的な必要性がある。
本発明のある態様は、未分化の哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導する化合物を同定するための方法に関連し、化合物を、配列番号:194〜309からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させることを含み;かつ前記細胞の分化に関連した化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む。
本発明の別の態様は、未分化の哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導するための作用物質に関連し、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択され、このとき前記作用物質は、配列番号:194〜309からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、自然発生的なポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から作り出された核酸配列を含む。
本発明の別の態様は、対象の平均骨密度における、全身的又は局所的減少を伴う疾患を治療及び/又は予防するための方法に関連し、前記対象に前記骨形成促進医薬組成物を投与することを含む。
本発明のさらなる態様は、平均骨密度の全身的又は局所的減少を伴う疾患の治療及び/又は予防のための薬剤の製造における、先に記載した作用物質の使用に関連する。
(定義)
用語「キャリアー」は、医薬組成物に媒体、体積、及び/又は有効な形体を提供する医薬組成物の製剤において使用される非毒性物質を意味する。キャリアーは、賦形剤、安定剤、又は水性pH緩衝化溶液などの、1以上のそのような物質を含むこともある。生理学的に許容し得るキャリアーの例は、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸;アスコルビン酸を含む抗酸化物質;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのような塩形成対イオン;及び/又はトゥイーン(TWEEN)(商標)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びプルロニクス(PLURONICS)(商標)などの非イオン性界面活性剤を含む、水性又は固体緩衝成分を含む。
用語「接触」又は「接触すること」は、インビトロシステムであれインビボシステムであれ、少なくとも2つの部分を一緒にすることを意味する。
用語「内因性の」は、哺乳動物が天然に産生する物質を意味することとする。対照的に、この文脈における用語「非内因性の」は、哺乳動物(例えば、限定されないが、ヒト)又はウイルスによって天然に産生されないものを意味することとする。
用語「発現」は、形質導入による内因性発現、及び過剰発現の両方を含む。
用語「発現し得る核酸」は、タンパク性分子、RNA分子、又はDNA分子をコードする核酸を意味する。
用語「阻害」又は「阻害すること」は、用語「反応」との関連において、反応が、該化合物の不在下とは反対に、化合物の存在下で減少又は妨げられることを意味する。
用語「ポリヌクレオチド」は、一本又は二本鎖構造のポリヌクレオチド、及びセンス若しくはアンチセンス方向において厳しい条件下で特定のポリ核酸とハイブリダイズする相補的ポリ核酸、並びにその塩基対の少なくとも約60パーセント、及びより好ましくは共通のその塩基対の70パーセント、最も好ましくは90パーセント、及び特別な態様ではその塩基対の100パーセントにおいて相同であるポリヌクレオチドを意味する。ポリデオキシリボ核酸 及びその合成類似体を含む。該ポリヌクレオチドは、約10〜約5000塩基、好ましくは約100〜約4000塩基、より好ましくは約250〜約2500塩基の範囲の長さで変化する配列によって記載される。好ましいポリヌクレオチド態様は、約10〜約30塩基の長さから成る。ポリヌクレオチドの特別な態様は、約10〜約22ヌクレオチドのポリリボヌクレオチド、より一般的には低分子干渉RNA(siRNA)として記載されるものである。別の特別な態様は、ペプチド核酸(PNA)などの修飾された骨格を有する核酸、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチルフォスフォロチオエート、又は非天然に生じる核酸残基を含む、若しくはメチル-、チオ−、硫酸−、ベンゾイル−、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-、及びメタノカルバヌクレオシドなどの1以上の核酸置換基、又はその検出を促進するためのレポーター分子である。
用語「溶媒和物」は、1以上の溶媒分子を有する、本発明において有用な化合物の物理的結合を意味する。この物理的結合は水素結合を含む。場合によって溶媒和物は、例えば1以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子中に組み込まれる場合に単離することができるであろう。「溶媒和物」は、溶液相、及び単離可能な溶媒和物の両方を含む。代表的な溶媒和物は、水和物、エタノレート及びメタノレートを含む。
用語「対象」は、ヒト及び他の哺乳動物を含む。
当業者の選択次第で、本アッセイ法は一連の測定として機能するためにデザインされてもよく、それらのそれぞれは、薬剤候補化合物が該ポリペプチド上で確かに作用して、それによって未分化細胞の分化を骨芽細胞へと誘導するするかどうかを決定するためにデザインされる。例えば、化合物のポリペプチド又はそれらの断片への結合親和性を測定するためにデザインされたアッセイは、テスト化合物が対象に投与された場合、平均骨密度を増加させるために有用であり得るかどうかを確かめるために必要であるかもしれないが、十分ではない。それにもかかわらず、そのような結合情報は、溶着したカルシウムの量を測定することによってアッセイされる骨石灰化などの生化学的経路の更なる先で、異なる特性を測定できるアッセイでの使用のためのテスト化合物のセットを同定することにおいて有用である。そのような第2アッセイは、該ポリペプチドに対して結合親和性を有するテスト化合物が、実際に未分化細胞の分化を骨芽細胞へと誘導するかを確認するためにデザインされてもよい。適切なコントロールは、常に擬陽性の読み込みを防ぐために設けられるべきである。
(a)化合物を、配列番号:194〜309からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること;
(b)該ポリペプチドへの該化合物の結合親和性を決定すること;
(c)前記ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞の集団を、少なくとも10マイクロモラーの結合親和性を示す該化合物に接触させること;及び
(d)前記未分化細胞の分化を誘導する該化合物を同定すること。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なった抗原、及び好ましくは細胞表面タンパク質又は受容体若しくは受容体サブユニットに対する結合特異性を有する、好ましくはヒトの又はヒト化モノクローナル抗体である。
本発明はさらに、アンチセンスポリヌクレオチドからなる群から選択される、未分化哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導する作用物質、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉RNA(siRNA)に関連し、前記作用物質は、配列番号:194〜309からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から設計された核酸配列を含む。好ましい実施態様において、該作用物質は、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択され、前記作用物質は、配列番号:199、230、237、262、及び181からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から設計された核酸配列を含む。
発現阻害作用物質を発現するポリヌクレオチドは、好ましくはベクター内に含まれる。ポリ核酸は、核酸配列の発現を可能にするシグナルに操作可能であるように結合され、またいったんベクターが細胞に導入されると、好ましくはアンチセンス核酸を発現する組換えベクター構築を利用する細胞へと導入される。アデノウイルスベクターシステム、レトロウイルスベクターシステム、アデノ随伴ウイルスベクターシステム、レンチウイルスベクターシステム、ヘルペス単純ウイルスベクターシステム、又はセンダイウイルスベクターシステムを含むウイルスに基礎を置いた様々なシステムが利用でき、かつその全てのシステムを使用して、標的細胞内で発現阻害作用物質に対するポリヌクレオチド配列を導入及び発現させてもよい。
ベクター構築において、本発明のポリヌクレオチド作用物質を1以上の制御領域に結合させてもよい。適切な制御領域の選択は、一般的な当業者のレベル内で決まりきった問題である。制御領域はプロモータを含み、エンハンサー、サプレッサーなどを含んでもよい。
先に議論されたように、組換えウイルスを用いて、本発明において有用なポリヌクレオチド作用物質をコードするDNAを導入してもよい。本発明に従った組換えウイルスは、通常約10.sup.4〜約10.sup.14 pfuの間の用量の形態で処方及び投与する。AAV及びアデノウイルスの場合、約10.sup.6〜約10.sup.11 pfuの用量が好ましく用いられる。用語pfu(「プラーク形成単位」)は、ウイルス粒子の懸濁液の感染力に対応し、適切な培養細胞に感染させ、そして形成されたプラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のpfu力価を決定するための技術は、先行技術おいてかなり報告されている。
本発明はまた、平均骨密度の全身的又は局所的減少を伴う疾患の治療又は予防用薬物の調製のための、先に記載したような薬剤の使用に関連する。
本発明の好ましい実施態様において、疾患は、骨粗鬆症、悪性の高カルシウム血症、多発性骨髄腫症、副甲状腺機能亢進症、及び甲状腺機能亢進症からなる群から選択される。本発明の特別な実施態様は、該疾患が骨粗鬆症である場合の方法である。
好ましくは、該病気は、骨粗鬆症、悪性の高カルシウム血症、多発性骨髄腫症、副甲状腺機能亢進症、及び甲状腺機能亢進症からなる群から選択される。より好ましくは、該病気は、骨粗鬆症である。
したがって、本発明の別の実施態様は骨組織のインビトロ産生に対する方法に関連し、哺乳動物の未分化細胞を骨芽細胞へと分化させるために十分な時間で、配列番号:1〜77からなる群から選択され、好ましくは配列番号:69〜77からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド配列に接触する工程と、それによって継続的に骨マトリクスを産生する工程を含む。
好ましい実施態様において、方法は以下の工程を含む:
(a)未分化哺乳動物細胞を基質上に加えて細胞基質を形成すること、
(b)未分化哺乳動物細胞を骨芽細胞へと分化させるために十分な時間で、配列番号:1〜77からなる群から選択され、好ましくは配列番号:69〜77からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列、又はベクターを導入し、それによって継続的に骨マトリクスを産生すること。
本発明の方法はまた、改正手術、すなわち、以前の外科装置を交換しなければならない場合に関連して非常に適している。
適切な未分化細胞は骨髄細胞であり、造血細胞、及び具体的には間質細胞を含む。骨髄細胞、特に間質細胞は、それらの本来の環境から採られた場合、骨産生過程において非常に効果的であることがわかっている。
前記マトリクスの産生は、マトリクスを基質上に付加した場合、基質の表面積の少なくとも50%、特に少なくとも80%を覆う連続的又は準連続的被覆を生じる。
本発明はさらに上記方法によって得ることができる骨芽細胞に関連する。
本発明はさらに下記の図、及び実施例で説明される。
(実施例1.内因性アルカリフォスファターゼの検出のためのハイスループットスクリーニング法の開発)
(アッセイの原理)
適切な因子(例えばBMP2)の存在下で、間葉系前駆細胞(MPC)を決定し、骨芽細胞へと分化させる。そのような因子をスクリーニングするためのアッセイは、骨芽細胞分化プログラムにおける初期マーカーであるアルカリフォスファターゼ(AP)酵素の活性をモニタリングすることによって発達した。諸MPCを384ウエルプレート中にまき、ヒトコクサッキー受容体及びアデノウイルス受容体(hCAR;Ad−hCAR)並びにSilenceSelect(商標)コレクションからの個々のsiRNAアデノウイルス(Ad−siRNA)をコードするアデノウイルスを用いて、1日後に同時に共感染させた。AdC15−hCAR/AdC20−hCAR共感染は、AdC01−siRNA感染効率を増加させる。細胞性AP活性は、感染の開始後13日目(13dpi)に決定した。図2は、本アッセイの原理を描いている。
MPCを、インフォームドコンセント(Cambrex/Biowhittaker, Verviers, Belgium)後に得られた健康なボランティアの骨髄から単離した。
一連の384ウエルプレートにおいて実行した実験において、いくつかのパラメータ:細胞播種密度、コントロールウイルス(Ad−BMP2又はAd−eGFP)の感染の多重度(MOI)、Ad−hCARのMOI、感染の継続期間、毒性、感染効率(Ad−eGFPを用いて)及び読み出しの日を最適化した
図5は、KDコントロールプレートを用いた、自動化されたスクリーニング手順の結果を示している。KDネガティブコントロール(N1〜N3)の平均及び標準偏差を使用してヒット解析のカットオフを計算し、ヒット解析は、N1、N2、N3の平均(「全ての陰性」)に加えて、「全ての陰性」の標準偏差の3倍に設定した。ポジティブコントロール(P1及びP2)は、感染ウエルの95%より上の成績であった。ネガティブコントロールウイルスは、該ウエルの5%未満の成績であった。
SilenceSelectライブラリーのスクリーニング用に最適化されたプロトコルは次の通りである:0日目に、MPC細胞をウエル毎に、60μlの培地中に500個の細胞密度で、透明な底面(Costar又はNunc)を有する黒い384ウエルプレート中にまく。1日後、384ウエルプレート中に保存されたSilenceSelect(商標)コレクションからの1μlのAd−siRNA(概算された力価は、1ml毎に2.5×109ウイルス粒子)及び96ウエルV−ボトムプレート中に分配した5μlのAd−hCAR溶液(合計MOI=155)を、Ad−hCAR溶液を含む96ウエルプレートのウエルからMPCを含む384ウエルプレートのそれぞれのウエルへと96/384チャンネルディスペンサー(TeMO96、TeMO384及びRoMaを装備したTecan Freedom 200、Tecan AG、Switzerland)の補助で移動させた。KDコントロールプレートは、SilenceSelectコレクションからの一定分量のプレートとして同じ条件下で実行した。全てのAd−siRNAウイルスを、異なったMPCプレート上でそれぞれ1種を二重に選別した。プレートはそれから37℃でインキュベートした。アデノウイルスを含む培地を、感染後4日目にウイルスを含まない未使用培地と交換した。感染後13日目に、AP活性の読み出しを実行した。384ウエルスクリーニングプレートの典型的な結果を図6に示し、ここでY軸上の該384ウエルプレートのそれぞれのデータポイントを相対的蛍光単位(RFU)でプロットした;一方、X軸上の数値は、384ウエルプレートの位置に一致する。
この複製選別は2回行い、かつ4つ全てのデータポイントをヒットの判定に使用した(図3を参照されたい)。
これらの2回の選抜を行った後、該AP活性を測定することから得られたデータを次のとおりに解析した:バックグラウンドを、コントロールプレートを除いた全てのプレートからのデータポイントの平均をとることによって計算した。ヒットの判定に対するカットオフ値を、コントロールプレートを除いた全てのデータポイントの標準偏差の3倍を足すことによって計算した。それぞれのデータポイントを、カットオフの上、又は下を採点することによって解析した。内因性AP活性レベルをカットオフ上に引き上げるAd−siRNAsのみがさらに興味深かった。ヒットは、1つ又は両方の選別において、単一若しくは二重のそれらの採点に従って優先順位をつけた。2657個の独立なKD構成を示している2688個のAd−siRNAウイルス構成に関するデータを集め、表2に記載する。以前から同定されたヒットの1つは骨同化因子であることが示されており、それゆえ本アッセイの正当性を立証する:
(H24−241:BMP3)
BMP3は、分泌されたタンパク質の骨形成タンパク質ファミリーのメンバーである。BMP3は、骨形成BMP2への拮抗薬として機能する。BMP3欠損マウスは、野生型動物に対して2倍の骨梁を有し、BMP3はインビボにおいて骨恒常性の陰性制御因子であることを示した(Daluiskiらの論文、Nature Genetics (2001) 27:84-88)。
Ad−siRNAヒットは、siRNA挿入時に品質管理を受ける。
標的Ad−siRNAを、96ウエルプレートレベルでPerC6細胞(Crucell, Leiden, The Netherlands)を用いて増殖させ、続いて一次アッセイ(実施例1を参照されたい)においていくつかのMOIでこれらのウイルスを再スクリーニングし、標的Ad−siRNAによってコードされるsiRNAの配列決定を行った。
BAPは、骨形成に関与する生理学的に関連性のあるAPである。測定したAP活性がBAP発現の上方調節、又は別のAP遺伝子産物の上方調節に起因していたかどうかを決定するために、全てのAP遺伝子のmRNAレベルを感染MPCについて解析した。mRNAレベルを、前のセクションで記載されたように決定した。違いは、使用したプライマーセットである(表1を参照されたい):あるセットは、BAP ALPL(肝臓/骨/腎臓ヒトアルカリフォスファターゼ)mRNA発現を検出する。別のセットは、他の3つのAP遺伝子(ALPI(腸のヒトアルカリフォスファターゼ)、ALPP(胎盤のヒトアルカリフォスファターゼ(PLAP))及びALPPL2(胎盤様ヒトアルカリフォスファターゼ))の発現を検出する。ALPI、ALPP及びALPPL2は、ヌクレオチドレベルで高度に類似しており、それゆえあるプライマー対を用いて増幅させ得る。
骨形成の過程は、いくつかの連続的な事象からなる。骨形成の初期段階の間、骨アルカリフォスファターゼ(BAP)は上方調節されるようになる。しかしながら、石灰化などの、骨形成の後期において起こる特定の事象を考慮することも同様に重要である。
骨形成の過程は、いくつかの連続的な事象からなる。骨形成の初期段階の間、骨アルカリフォスファターゼ(BAP)は上方調節されるようになる。その後、分化の間、細胞は、ほとんどがコラーゲンタイプIからなる細胞外マトリクス上に(ヒドロキシ)アパタイト(Ca2+−リン酸沈殿物)を堆積し、石灰化した骨を形成する。
骨細胞石灰化アッセイ(BMアッセイ)において、第一のヒトMSCを、骨形成剤としてBMP2(組換え、又はアデノウイルスによる形質導入によって輸送される)を用いて、石灰化骨芽細胞へとインビトロで分化させる。石灰化をそれから、カルシウムに高親和性を有する着色料であるアリザリンレッドを用いてMSCを染色することによって可視化する(図8を参照されたい)。
下記の最適化されたプロトコルは、前記一次アッセイにおいて同定されたAd−siRNA標的及びAd−cDNA標的のスクリーニングに使用した:
100,000個のMCPを、6ウエルプレートのそれぞれのウエルに、10%FCSを含む2mlのMSC培地と共にまいた。その次の日、加湿したインキュベータ内の37℃、10%CO2のインキュベーションの後、細胞をAdC15−hCAR(750の最終MOI)と、1250、2500及び5000の最終MOIのAd−siRNA、Ad−cDNA、又はコントロールウイルスとを共に共感染させた。細胞をさらに6日間、加湿したインキュベータ内において、37℃、10%CO2でインキュベートした。ウイルスを取り除き、2mlの未使用MSC培地、10%FCSで交換した。次の22日にわたり、培地は2週に3回交換した。1回おきに、培地は半分又は完全に交換した。本実験の開始から28日目に馴化培地を取り除き、細胞を10%パラホルムアルデヒドを用いて固定し、単層はMilliQ水(pHを4.2に調整した)中で〜1%のアリザリンレッド(Sigma, # A5533)1mlを用いて染色した。感染効率を評価するためのAd−eGFP、強力な骨形成誘導剤としてのAd−BMP2、及び弱い骨形成因子としてのAd−H4−2は、それぞれ、個々の実験においてネガティブ及びポジティブコントロールとして加えた。Ad−H4−2が石灰化を誘導しない実験はどれも繰り返した。
石灰化を誘導したAd−shRNAは表2に示した。
化合物を、本発明のポリペプチドへの結合によってスクリーニングする。該化合物の該ポリペプチドへの親和性は、置換実験で決定する。そのような置換実験は当業者に周知であり、他のものからポリペプチドに結合する化合物を同定するための一般的な技術として考えることができる。
手短に、本発明のポリペプチドを、該ポリペプチドに結合することが知られているラベルされた(放射性ラベル、蛍光又は抗体ラベル、若しくは任意の他の検出可能なラベル)リガンドを用いてインキュベートし、さらにラベルしていない化合物と共にインキュベートする。
該ポリペプチドからの該ラベルされたリガンドの置換は、まだ該ポリペプチドと結合している、ラベルされたリガンドの量を測定することによって決定する。該ポリペプチドと結合したラベルされたリガンドの量は、ラベルされていない化合物への親和性の表れである。
化合物は、ナノモラー範囲及びさらにピコモラー範囲にIC50を有する場合、強力な結合剤と考えられる。nmol〜pmol範囲に、少なくとも10マイクロモル、又はそれよりもよいIC50を有する化合物を、骨アルカリフォスファターゼアッセイ(BAP)、及び/又は骨芽細胞マーカーの誘導並びに骨芽細胞機能におけるそれらの効果を決定するためのアッセイのどちらかに適用する。より低いIC50を有する化合物は、一般的にあまり重要ではないものと考えられる。本発明のポリペプチドは、本アッセイを、細胞、細胞画分、又は精製されたタンパク質で生化学的に行うかどうかということによって、いくつもの方法で調製できる。そのような調製は、異なったアッセイであるものとして当業者に周知である。
一生を通じて、骨格は絶え間なく再形成を行う。骨の焦点領域は破骨細胞によって再吸収され、それから骨芽細胞によって新規に形成される骨マトリクスによって置換される。骨粗鬆症の進展は、破骨細胞活性と骨芽細胞活性との間のバランスの脱制御による深刻な骨量の減少によって特徴付けられ、破骨細胞介在性骨吸収の増大を引き起こす。
破骨細胞は、単球/マクロファージ系統の細胞から生じる。インビボにおいて、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化は、間質細胞(MPC)によって発現された2つの中心的因子:NFκBリガンド受容体活性化因子(RANKL)及びオステオプロテゲリン(OPG)によって制御される。RANKLは、破骨細胞分化を駆動するMPCの表面上に発現する膜結合リガンドである。OPGは、活性RANKLを取り除くことによって破骨細胞の分化を阻害する、RANKLに対する可溶性のおとり受容体である。MPCによるRANKLとOPGの発現との間のバランスが、破骨細胞分化のレベルを決定する。
破骨細胞形成における骨形成因子の効果は、2つのタイプのアッセイを介して評価する。
最初のアッセイ準備において、初代ヒト単核球とMPCとの共培養を行う。破骨細胞を支持するその能力における、ノックダウンウイルスを用いたMPC単層の感染の効果を評価する。所望の効果は以下の通りである:MPCにおけるAd−siRNA標的遺伝子発現のノックダウンは、例えば、10nMの1,25(OH)2vitD3、及び50nMのM−CSFの混合物のような生理的なトリガーによって駆動される破骨細胞分化を阻害するはずである。使用する単球は、骨髄、又は末梢血から生じ得る。本例では、末梢血由来単核球(PBMC)に基づいた分化実験を記述する。MPC(Cambrex/Biowhittaker, Verviers, Belgiumから得た)を、10%FBSを添加したα−MEM培地(GIBCO-Life Technologies)中で96ウエルプレート内にまき(ウエル当たり1000個の細胞)、1日後、これらを標的Ad−siRNAを用いて感染させる。少なくとも3日後、M−CSF(R&D systems, 終濃度50ng/ml)に加えて、1ウエル当たり100000個のPBMCを添加する。培地の半分容量を、培地+50ng/mlのM−CSF、及び10nMの1,25(OH)2vitD3で、週に2回交換する。読み出しは、該PBMCを共培養に添加した後14日目に行う。生理的に適切なトリガーの混合物によって駆動される自発的な破骨細胞分化は、複合的な読み出しで調査できる。「TRAP陽性」の数の顕微鏡を用いた調査において、1ウエル当たりの多核細胞は、破骨細胞分化のレベルの指標であると一般的に考えられている。「TRAP陽性」は、細胞が酒石酸耐性酸性フォスファターゼ(TRAP)活性を有することを意味する。これを調査するために、共培養は、酸性フォスファターゼ検出キット(SIGMA, 386-A)に従って実行されたインサイチュウTRAP染色の対象とする。陽性細胞は、処理によって紫色になる。選択的な読み出しとして、成熟破骨細胞に特異的なマーカー、例えばTRACP5b(酒石酸耐性酸性フォスファターゼタイプ5b)、カルシトニン受容体(CTR)、又はカテプシンK(CTSK)を測定する。共培養上清中の破骨細胞由来酒石酸耐性酸性フォスファターゼタンパク質(TRACP5b)の量の測定は、市販のELISA(BoneTRAP assay, Sba sciences, Turku, Finland)で実行する。CTR又はCTSKは、以下の一般的なプロトコルの適用によって、免疫細胞化学で検出する。培地を取り除き、該共培養を固定し(4%パラホルムアルデヒド、0.1%TritonX−100、4℃、30分)、洗浄し、そしてブロッキングバッファー(PBS+1%BSA+0.1%Tween20)を加え、少なくとも4時間インキュベートする。該ブロッキングバッファーを取り除き、適切なバッファー(例えば、0.05MトリスHCl pH7.4、1%BSA)中に所望の濃度で溶解された、カテプシンK(例えば、Oncogene, IM55L)、又はカルシトニン受容体(例えば、Serotec, AHP635)に対して指図された一次抗体を、該ウエルに添加する。インキュベーションは4℃、一晩で行う。該混合物を取り除き、該細胞を洗浄(PBS+0.1%Tween20)し、そして該一次抗体と同じバッファー中に希釈した、適切なHRP共役二次抗体を添加する。少なくとも4時間のインキュベーション後、洗浄段階を行い(PBS+0.1%Tween20)、ルミノール(蛍光シグナルを生じるHRPに対する基質:BM化学発光ELISA基質[POD] (luminol), Roche Diagnostics, Cat No 1582950)を加える。5分のインキュベーションの後、読み出しをルミノメーター(Luminoskan Ascent, Labsystem)で行う。記載された2つのアッセイ(多核細胞の数の調査、及び破骨細胞特異的マーカーの検出のための免疫化学)は、単核球から破骨細胞への分化を調査することは可能にするが、形成された破骨細胞の骨吸収活性については情報を与えない。
PBMCは、以下のプロトコルを対象とした末梢血から得られる(インフォームドコンセント後、患者から得られる)。血液を50mlファルコンチューブ内に無菌的に注ぎ、25℃で10分間、3000gで遠心する。軟膜をそれから回収し、PBSを用いて1:1に希釈する。希釈された軟膜を、20mlのリンフォプレップ(Lymphoprep)(Sigma)を含む50mlファルコンチューブ内の上部に注ぐ。遠心分離(25℃、400gで35分)した後、リンフォプレップ上部の単核球の白い層を回収し、PBSで2回洗浄し(200g、10分、25℃で遠心分離)、そして7mlのPBS中に再溶解させた。この溶液を、7mlの高浸透圧性パーコール勾配を含む15mlファルコンチューブ内の層上にピペットで加え、35分、400g、25℃で遠心分離する。高浸透圧性パーコール勾配は、以下のように調製する:1容量の1.5M NaCl、及び9容量のパーコール(Pharmacia, d=1,130 g/ml)を混合する。この混合物を、1:1の割合でPBS/クエン酸バッファー(NaH2PO4 1.49mM、Na2HPO4 9.15mM、NaCl 139.97mM、Na−クエン酸 (二水和物) 13mM、pH 7.2)に加える。遠心分離の後、単球は該勾配の上に分離した環を形成する。単球を回収し、培地中で洗浄する。細胞はそれからアッセイに使用できる。
siRNAは、最近発見され、かつ部分的に理解されている機構を介して遺伝子発現のノックダウンを行使する。siRNA配列がmRNAに特異的にアニーリングすることは、遺伝子特異的「オン−ターゲット(on-target)」ノックダウンに関与することは、一般的に受け入れられている。しかしながら、siRNAと別のmRNAとの間の限定された不一致が遺伝子発現の「オフ−ターゲット」下方調節を誘導できることは、未だ排除することはできない。「オフ−ターゲット」mRNAのノックダウンが、観察された骨形成効果の原因であることを排除するために、さらなるsiRNA/shRNAを、厳しいデザイン基準を用いた石灰化を誘導する5つのターゲット(表2B)に対してデザインした。付加的なAd−shRNAはそれからBAPアッセイでテストした。
−本来のsiRNAによって標的化されたmRNAを完全に並べる
−下記のような「オフ−ターゲット」mRNAの最小数を有して不完全に並べてもよい(19塩基長の各位置についてチェックされた、最大2塩基対の非同一性)
○推定上の「オフ−ターゲット」mRNAは、本来のsiRNAに対して同定された推定上の「オフ−ターゲット」mRNAとは異なっていた
○推定上の「オフ−ターゲット」mRNAは、PPIAに対してデザインされた付加的なsiRNAを除いた、全ての本来の標的siRNAについて同定された推定上の「オフ−ターゲット」mRNAとは異なっていた
34のAd−shRNAをうまく生成させ、同時に5つの独自のAd−shRNAを用いて、2つの独立な実験を3MOIでのBAPアッセイでテストした。デザインしたshRNA(Ad−shRNA)をコードする組換えアデノウイルスを生産し、力価を測定し、96ウエルプレート中に等分し、−80℃で保存した。これらのプレートは、下記の通り一次BAPアッセイで処理した:
全てのAd−shRNAウイルスは、3MOIの、2つの同一な、しかし独立な選別で二重にスクリーニングした。閾値は、あるスクリーニング期間(「グローバル」解析)において存在する全てのネガティブコントロール、又は1つのスクリーニングプレート(「ローカル」解析)上に存在するネガティブコントロールの使用のどちらかを使用して、ヒットの判定のために計算した。ヒットは以下の選択基準に従って判定した:
1)ネガティブコントロールの平均値+標準偏差×3(+3)を超えたBAPシグナル。1回分のそれぞれのウイルスに関する2つの個々のデータポイントは、独立に解析した。
2)2つの選抜の少なくとも1つにおいて、少なくとも重複したうちの1つのMOIでのあるAd−shRNAの基準1によって定義されるような陽性BAPシグナル。
結論として、5種類の選択されたターゲットを標的とするさらなるAd−shRNAをデザインし構築した。コントロールプレートに存在するネガティブコントロールを、プレート毎に(「ローカル」解析)、又はプレート1回分毎に(「グローバル」解析)に使用して、ヒットの判定( + 3)に対するカットオフを決定した。
−該「グローバル」解析は、該BAPアッセイにおいて陽性として得点化された8種類のウイルスを生じ、5種類の有効な標的の5つを確認する
−該「ローカル」解析は、BAPアッセイにおいて陽性として得点化された9種類のウイルスを生じ、有効な標的の5つを確認する。
−全ての独自の5つのAd−shRNAウイルスは全て「グローバル」又は「ローカル」解析のどちらかを用いた場合に、BAPアッセイで得点化する。
Claims (6)
- 未分化の哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導する化合物を同定するための方法であって:
(a)化合物を、配列番号:230(PDE11A)及び配列番号:237(GPR39)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること;
(b)前記ポリペプチドへの前記化合物の結合親和性を測定すること;
(c)前記ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞の集団を、少なくとも10マイクロモラーの結合親和性を示す化合物に接触させること;及び
(d)前記細胞の分化の指標である生化学的マーカーを産生する生物学的経路の活性化を測定することであって、該マーカーがアルカリフォスファターゼ、タイプ−1コラーゲン、オステオカルシン、及びオステオポンチンからなる群から選択されるもの;
を含む、前記方法。 - 前記ポリペプチドが、インビトロで細胞を使用せずに調製されたポリペプチドである、請求項1記載の方法。
- 前記ポリペプチドが哺乳動物細胞中に存在する、請求項1記載の方法。
- 前記生物学的マーカーが骨アルカリフォスファターゼである、請求項1記載の方法。
- 前記化合物が、抗体断片ライブラリー、ペプチドライブラリー、脂質ライブラリー、合成化合物ライブラリー、天然化合物ライブラリー、並びに配列番号:230(PDE11A)及び配列番号:237(GPR39)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも10マイクロモラーの結合親和性を有する化合物からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記化合物が、ファージディスプレーライブラリー又は抗体フラグメントライブラリー中のペプチドである、請求項2記載の方法。
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