MXPA06012162A - Metodos, agentes y ensayos de seleccion de compuestos para inducir diferenciacion de celulas de mamifero no diferenciadas, en osteoblastos. - Google Patents

Metodos, agentes y ensayos de seleccion de compuestos para inducir diferenciacion de celulas de mamifero no diferenciadas, en osteoblastos.

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Abstract

La presente invencion se refiere a los metodos, agentes y ensayos de seleccion compuestos para inducir la diferenciacion de celulas de mamifero no diferenciadas, en osteoblastos, la invencion proporciona de este modo un metodo, que comprende poner en contacto un compuesto con un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 194-309; y midiendo una propiedad del compuesto/polipeptido con relacion a la diferenciacion de las celulas. La invencion se refiere ademas a una composicion farmaceutica de aumento de la formacion osea, y al uso de la misma en el tratamiento y/o prevencion de una enfermedad que involucra una disminucion sistemica o local en la densidad osea media en un sujeto. Ademas, la invencion se refiere a un metodo para la produccion in vitro del tejido oseo.

Description

MÉTODOS, AGENTES Y ENSAYOS DE SELECCIÓN DE COMPUESTOS PARA INDUCIR DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS DE MAMÍFERO NO DIFERENCIADAS, EN OSTEOBLASTOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de las enfermedades de mamífero que involucran una disminución sistémica o local en la densidad ósea media. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El hueso contiene dos distintas líneas celulares, por ejemplo, las células formadoras de hueso (por ejemplo, osteoblastos) y las células absorbedoras de hueso (por ejemplo, osteoclastos) . El hueso es un tejido dinámico que está siendo destruido continuamente (resorbido) y reconstruido por una influencia recíproca intrincada entre estos osteoblastos y osteoclastos. Para los osteoclastos, está bien establecida una cascada de factores de transcripción y factores de crecimiento involucrados en la progresión desde la célula progenitura hasta el osteoplasto funcional. En contraste, se sabe poco respecto a la línea de los osteoblastos . Los osteoblastos se derivan de las células progenitoras mesenquimales diferenciadas (MPCs, por sus siglas en inglés) . Durante la diferenciación en osteoblastos, la actividad de la fosfatasa alcalina ósea (BAP, por sus siglas REF: 176101 en inglés) se llega a suprarregular. La formación de hueso in vivo ocurre a través de dos vías distintas durante el desarrollo embrionario: la osificación endocondral o intramembranosa (figura 1) . Como se muestra en la figura 1, las células progenitoras o pluripotenciales mesenquimales representan los puntos iniciales para ambas formas de formación del hueso. Durante la osificación intramembranosa, los huesos planos tales como aquellos del cráneo o de las clavículas, son formados directamente a partir de las condensaciones de células mesenquimales. Durante la formación de huesos largos, tales como los -huesos de las extremidades, las condensaciones mesenquimales conducen primeramente a un cartílago intermediario que es invadido durante el desarrollo posterior por las células endoteliales, los osteoclastos y las células mesenquimales, que se diferenciarán en osteoblastos y osteocitos (Na ashima and de Crombrugghe, 2003) . Son conocidas un número de enfermedades que son provocadas por una perturbación del balance finamente sintonizado entre la resorción ósea y la reconstrucción ósea, cuyas enfermedades esqueléticas representan un gran número de pacientes: hipercalcemia de malignidad, enfermedad de Pager, enfermedades óseas inflamatorias como la artritis reumatoide y enfermedad periodontal, osteogénesis focal que ocurre durante las metástasis esqueléticas, síndrome de Crouzon, raquitismo, opsismodisplasia, picnodisostosis/enfermedad de Toulouse- Lautrec, osteogénesis imperfecta, y la enfermedad ósea simple más importante: la osteoporosis. Actualmente, la osteoporosis afecta a 1 de 5 mujeres sobre 50 y 1 de 20 hombres sobre 50. Para estos pacientes están disponibles un número de tratamientos, los cuales principalmente abordan el incremento neto en la resorción ósea, por ejemplo: terapia con reemplazo de hormonas (HRT, por sus siglas en inglés) - moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMs, por sus siglas en inglés) bisfosfonatos calcitonina Mientras que estos tratamientos retardan la resorción ósea, éstos no suprimen las fracturas, debido a que el hueso perdido no es suficientemente reabastecido. Las fracturas serán detenidas cuando la formación ósea sea suficientemente incrementada. Por lo tanto, existe gran interés en identificar las vías osteogénicas que se prestan a sí mismas a la intervención terapéutica con anabolismo óseo como efecto. Actualmente, únicamente una terapia anabólica ósea ha alcanzado el mercado de la osteoporosis : la hormona paratifoidea (PTH) 1-34. PTH muestra efectos anabólicos óseos cuando se administra intermitentemente. El tratamiento con PTH es, no obstante, muy problemático debido a que este producto biofarmacéutico necesita ser inyectado diariamente por el paciente. Además, ha sido observada la formación de tumores cuando se trata de animales a altas dosis. También, éste es un tratamiento muy caro. Otra clase de anabólicos óseos, proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) , han sido aprobados pero solamente para mercados de nicho, ya que existen desventajas para su uso como agentes terapéuticos para aumentar el sanado óseo. Los receptores para las proteínas morfogenéticas óseas han sido identificados en muchos tejidos, y las BMPs mismas son expresadas en una gran variedad de tejidos en patrones temporales y espaciales específicos. Esto sugiere que las BMPs pueden tener efectos sobre muchos tejidos diferentes al hueso, limitando potencialmente su utilidad como agentes terapéuticos cuando se administrar sistémicamente. En consecuencia, existe una necesidad continua para nuevas estrategias en el tratamiento y compuestos (en particular anabólicos) que evitan uno o más de los inconvenientes de las estrategias de tratamiento actualmente disponibles. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto de la presente invención se refiere a un método para identificar un compuesto que induce diferenciación de las células de mamífero no diferenciadas, en osteoblastos, que comprenden poner en contacto un compuesto con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 194- 309; y la medición de la propiedad del compuesto-polipéptido relacionada a la diferenciación de dichas células. Otro aspecto más de la invención se refiere a un agente para inducir la diferenciación de las células de mamífero no diferenciadas, en osteoblastos, seleccionado del grupo que consiste de un polinucleótido antisentido, una ribozima y un ARN de interferencia pequeño (siRNA) , en donde el agente comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a, o manipulada por ingeniería a partir de, una secuencia polinucleotídica de origen natural que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 194-309. Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica aumentada de la formación de hueso, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del agente en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto más de la invención se refiere a un método para tratar y/o prevenir una enfermedad que involucra una disminución sistémica o local en la densidad ósea media en un sujeto, que comprende administrarle al sujeto la composición farmacéutica aumentadora de la formación ósea.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de los agentes anteriormente descritos eri la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad que involucra una disminución sistémica o local en la densidad ósea media. Otro aspecto más de la invención se refiere a un método para la producción in vitro de tejido óseo, que comprende los pasos de poner en contacto las células de mamífero no diferenciadas por una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 1-77, por un tiempo suficiente para diferenciar las células no diferenciadas en osteoblastos, con lo cual se produce una matriz ósea continua. Definiciones : El término "portador" significa un material no tóxico utilizado en la formulación de las composiciones farmacéuticas, para proporcionar un medio, una forma a granel y/o utilizable para una composición farmacéutica. Un portador puede comprender uno o más de tales materiales, tales como un excipiente, estabilizador, o una solución acuosa amortiguadora del pH. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen ingredientes amortiguadores acuosos o sólidos que incluyen fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos ; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o imunoglobulinas, polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol, iones contrarios formadores de sales tales como sodio, y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN.MR, polietilenglicol (PEG) , y PLURONICS .MR. El término "compuesto" se utiliza en la presente en el contexto de un "compuesto de prueba" o un "compuesto fármaco candidato" descrito en conexión con los ensayos de la presente invención. Como tales, estos compuestos comprenden compuestos orgánicos, inorgánicos, derivados sintéticamente o de fuentes naturales. Los compuestos incluyen compuestos inorgánicos u orgánicos tales como polinucleótidos, lípidos o análogos de hormonas que son caracterizados por pesos moleculares relativamente bajos. Otros compuestos de prueba orgánicos biopoliméricos incluyen péptidos que comprenden de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 aminoácidos y polipéptidos más grandes que comprenden de aproximadamente 40 a aproximadamente 500 aminoácidos, tales como los anticuerpos o los conjugados de anticuerpo.
El término "contacto" o "puesta en contacto" significa poner al menos dos porciones juntas, ya sea en un sistema in vitro o en un sistema in vivo. El término "condición" o "enfermedad" significa la presentación manifiesta de los síntomas (por ejemplo, la enfermedad) o la manifestación de indicadores clínicos anormales (por ejemplo, indicadores bioquímicos) . Alternativamente, el término "enfermedad" se refiere a un riesgo genético o ambiental o propensión para desarrollar tales síntomas o indicadores clínicos anormales . El término "endógenos" significará un material que produce de manera natural un mamífero. En contraste, el término no endógeno en este contexto, significará aquel que no es producido de manera natural por un mamífero (por ejemplo, y sin limitación, un humano) o un virus. El término "expresión" comprende la expresión y sobreexpresión endógena por transducción. El término "ácido nucleico expresable" significa un ácido nucleico que codifica para una molécula proteica, una molécula de ARN o una molécula de ADN. El término "hibridación" significa cualquier proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se enlaza con una hebra complementaria a través de apareamiento de bases . El término "complejo de hibridación" se refiere a un complejo formado entre dos secuencias de ácido nucleico, en virtud de la formación de enlaces de hidrógeno, entre las bases complementarias. Un complejo de hibridación puede ser formado en solución (por ejemplo, el análisis C.sub.Ot o R.sub.Ot) o formado entre una secuencia de ácido nucleico presente en solución y otra secuencia de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido (por ejemplo, papel, membranas, filtros, chips, espigas o portaobjetos de vidrio, o cualquier otro sustrato apropiado al cual hayan sido fijadas las células o sus ácidos nucleicos) . El término "condiciones estrictas o exigentes" se refiere a condiciones que permiten la hibridación entre los polincleótidos y los polinucleótidos reclamados. Las condiciones estrictas pueden ser definidas por la concentración de sal, la concentración del solvente orgánico, por ejemplo, formamida, temperatura y otras condiciones bien conocidas en la técnica. En particular, la reducción de la concentración de sal, el incremento de la concentración de la formamida, o la elevación de la temperatura de hibridación pueden incrementar la exigencia. El término "inhibir" o "inhibición" en relación al término "respuesta" significa que una respuesta es disminuida o prevenida en presencia de un compuesto, en oposición a la ausencia del compuesto . El término "profármacos farmacéuticamente aceptables" como se utiliza en la presente, significan los profármacos de los compuestos útiles en la presente invención, que están dentro del alcance del sano juicio médico, adecuados para el uso en contacto con los tejidos de los pacientes sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica conmensurada con una proporción razonable de beneficio/riesgo, y efectivos para su uso pretendido de los compuestos de la invención. El término "profármaco" significa un compuesto que es transformado in vivo para producir un compuesto efectivo útil en la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable, hidrato o solvato del mismo. La transformación puede ocurrir mediante diversos mecanismos, tales como a través de la hidrólisis en la sangre. Los compuestos que poseen grupos metabólicamente escindibles tienen la ventaja de que éstos muestran biodisponibilidad mejorada como resultado de la solubilidad aumentada y/o la velocidad de absorción conferida sobre el compuesto progenitor, en virtud de la presencia del grupo metabólicamente escindible, de este modo, tales compuestos actúan como profármacos. Una discusión más completa es proporcionada en Design of Prodrugs, H. Bundgaard, ed. , Elsevier (1985); Methods in Enzymology; K. Widder et al., Ed., Acadmic Press, 42, 309-396 (1985); A Texbook of Drug and Devélopment, Krogsgaard-Larsen y H. Bandaged, ed. , Capítulo 5; "Design and Applications of Prodrugs" 113-191 (1991); Advanced Drug Delivery Reviews, H. Bundgard, _8, 1-38, (1992); J. Pharm. Sci., 77, 285 (1988); Chem. Pharm. Bull . , N. Nakeya et al., 32, 692 (1984); Pro-drugs as Novel Delivery Systems, T.
Higuchi y Stella, 14 A.C.S. Symposium Series, y Bioreversible Carriesrs in Drug Design, E.B. Roche, ed. , American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, que son incorporados por referencia en la presente. Un ejemplo de los profármacos es un profármaco de éster. El "profármaco éster" significa un compuesto que es convertible in vivo por medios metabólicos (por ejemplo, por hidrólisis) a un compuesto inhibidor de acuerdo a la presente invención. Por ejemplo, un profármaco éster de un compuesto que contiene un grupo carboxilo puede ser convertible mediante hidrólisis in vivo al grupo carboxilo correspondiente. El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales por adición de ácido orgánico e inorgánico, no tóxicas, y las sales por adición de base, de los compuestos de la presente invención. Estas sales pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos útiles en la presente invención. El término "polinucleótido" significa un ácido polinucleico, en forma de una sola hebra o de doble hebra, y en la orientación en sentido, o antisentido, los ácidos polinucleicos complementarios que se hibridan a un ácido polinucleico particular bajo condiciones estrictas, y los polinucleótidos que son homólogos en al menos aproximadamente 60% de sus pares de bases, y más preferentemente 70 por ciento de sus pares de bases, son en común, más preferentemente 90 por ciento, y en una modalidad especial 100 por ciento de sus pares de bases. Los polinucleótidos incluyen los ácidos polirribonucleicos, los ácidos polidesoxirribonucleicos, y los análogos sintéticos de los mismos . Los polinucleótidos son descritos por secuencias que varían en longitud, que están en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 5000 bases, preferentemente aproximadamente 100 a aproximadamente 4000 bases, más preferentemente aproximadamente 250 a aproximadamente 2500 bases. Una modalidad de polinucleótido preferido comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 bases de longitud. Una modalidad especial del polinucleótido es el polirribonucleótido de aproximadamente 10 a aproximadamente 22 nucleótidos, más comúnmente descritos como ARNs de interferencia pequeños (siRNAs) . Otra modalidad especial son los ácidos nucleicos con cadenas principales modificadas tales como el ácido nucleico peptídico (PNA) , polisiloxano y 2 ' -O- (2-metoxi) etilfosforotioato, o que incluyen los residuos de ácido nucleico de origen no natural, o uno o más sustituyentes de ácido nucleico tales como el metil-, tio-, sulfato, benzoil-, fenil-, amino-, propil-, cloro-, y metanocarbanucleosidos, o una molécula reportera para facilitar su detección. El término "polipéptido" se refiere a las proteínas, moléculas proteicas, fracciones de péptidos proteicos y oligopéptidos .
El término "solvato" significa una asociación física de un compuesto útil en esta invención, con una o más moléculas del solvente. Esta asociación física incluye el enlace de hidrógeno. En ciertos casos, el solvato será capaz de aislamiento, por ejemplo, cuando una o más moléculas de solvente son incorporadas en la red cristalina del sólido cristalino. "Solvato" abarca los solvatos en fase de solución y aislables. Los solvatos representativos incluyen hidratos, etanolatos y metanolatos . El término "sujeto" incluye humanos y otros mamíferos . El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" significa aquella cantidad de un compuesto o agente que promoverá la respuesta biológica o médica de un sujeto que está siendo buscada por un médico u otro clínico. En particular, con respecto al tratamiento de un trastorno relacionado con los huesos, el término "cantidad efectiva" está destinado a significar que aquella cantidad de un compuesto o agente que promoverá la respuesta biológica o médica de un sujeto, que está siendo buscada por un médico u otro químico. En particular, con respecto al tratamiento de una condición que involucra una disminución sistémica o local en la densidad ósea media, el término "cantidad efectiva" está destinada a significar aquella cantidad efectiva de un compuesto o agente que dará a un incremento biológicamente significativo en la densidad ósea media. El término "tratar" o "tratamiento" significa una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de, y con esto aliviar un trastorno-, enfermedad o condición, incluyendo uno o más síntomas de tal trastorno o condición. En consecuencia, "tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y a las medidas profilácticas o preventivas . Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno, así como aquellos en los cuales el trastorno puede ser prevenido. El término relacionado "tratamiento" como se utiliza en la presente, se refiere al acto de tratar un trastorno, síntoma, enfermedad o condición, como el término "tratar" es definido anteriormente . "Células de mamífero no diferenciadas" son las células pluripotenciales que están en una etapa temprana de especialización, por ejemplo, las células que todavía no tienen su función final y pueden ser inducidas a formar casi cualquier tipo de célula. En particular, éstas son células que no han sido todavía diferenciadas a las células óseas específicas, osteoblastos u osteoclastos. Tales células pluripotenciales son especialmente células sanguíneas y células presentes en la médula ósea, así como las células derivadas del tejido adiposo. Además, las células que pueden ser diferenciadas en células precursoras mesenguimales son contempladas en la presente invención, tales como, por ejemplo, las células madres totipotenciales tales como las células madre embrionarias . Un aspecto de la presente invención está relacionado a un método para identificar un compuesto que induce la diferenciación de las células de mamífero no diferenciadas, en osteoblastos, que comprende poner en contacto un compuesto con un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID No.: 194-309; y medir una propiedad del compuesto-polipéptido relacionada a la diferenciación de dichas células. La "propiedad compuesto-polipéptido" es un fenómeno mensurable elegido por la persona de experiencia ordinaria en la técnica. La propiedad mensurable puede ser, por ejemplo, la afinidad de enlace para un dominio peptídico del polipéptido, o el nivel de cualquiera de un número de niveles de marcadores bioquímicos de la diferenciación de osteoblastos . La diferenciación de osteoblastos puede por ejemplo, ser medida por la medición del nivel de enzimas que son inducidas dentro del proceso de diferenciación, tales como la fosfatasa alcalina, colágeno tipo 1, osteocalcina y osteopontina. La actividad de la fosfatasa alcalina puede ser medida mediante la visión de la solución de heptafosfato de metilumbeliferilo (MUP, por sus siglas en inglés) (Sigma) a las células. La fluorescencia generada después de escisión del sustrato MUP por la actividad de AP es medida sobre un lector de placa de fluorescencia (Fluostar, BMG) . En una modalidad preferida de la invención, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste las SEQ ID Nos.: 199, 230, 237, 262 y 281 (tabla 2B) . Dependiendo de la elección del experto en la técnica, el presente método de ensayo puede ser diseñado para funcionar como una serie de mediciones, cada una de las cuales está diseñada para determinar si el compuesto candidato a fármaco está verdaderamente actuando sobre el polipéptido, para inducir con esto la diferenciación de las células no diferenciadas, en osteoblastos. Por ejemplo, un ensayo diseñado para determinar la afinidad de enlace de un compuesto al polipéptido, o el fragmento del mismo, puede ser necesario, pero no suficiente, para averiguar si el compuesto de prueba sería útil para incrementar la densidad ósea media cuando se administra a un sujeto. No obstante, tal información de enlace podría ser útil en la identificación de un grupo de compuestos de prueba para el uso en un ensayo que podría medir una propiedad diferente, además de la vía bioquímica, tal como la mineral!zación ósea, evaluada por la medición de la cantidad de calcio depositado. Tal segundo ensayo puede ser diseñado para confirmar que el compuesto de prueba teniendo afinidad de enlace para el polipéptido, induce efectivamente la diferenciación de las células no diferenciadas en osteoblastos . Deben siempre ser impuestos adecuados para asegurarse contra lecturas falsas positivas. El orden de toma de estas mediciones no se cree que sea crítico para la práctica de la presente invención, que puede ser practicada en cualquier orden. Por ejemplo, se puede realizar primeramente un ensayo de selección de un grupo de compuestos para los cuales no es conocida la información respecto a la afinidad de enlace de los compuestos para el polipéptido. Alternativamente, se puede seleccionar un grupo de compuestos identificados como poseedores de afinidad de enlace para un dominio polipeptídico, o una clase de compuestos identificados como un inhibidor del polipéptido. No obstante, para que el presente ensayo sea significativo para el uso final de los compuestos candidatos a fármacos, es necesaria una medición de los niveles de fosfatasa alcalina ósea, o de la mineralización ósea. Los estudios de validación que incluyen los controles, y las mediciones de la afinidad de enlace a los polipéptidos de la invención son no obstante útiles en la identificación de un compuesto útil en cualquier aplicación terapéutica o de diagnóstico. El presente método de ensayo puede ser practicado en un sistema libre de células in vitro, utilizando uno o más de los polipéptidos, o fragmentos de los mismos. La afinidad de enlace del compuesto con el polipéptido puede ser medida por métodos conocidos en la materia, tales como el uso de biosensores de resonancia de plasmón superficial (Biacore) , mediante análisis de enlace de saturación con un compuesto marcado (por ejemplo, análisis de Stachard y Lindmo) mediante espectrofotometría de UV diferencial, ensayo de polarización de fluorescencia, el sistema lector de placas de formación de imagen fluorométrica (FLIPR®) , transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, y transferencia de energía de resonancia de bioluminíscencia. La afinidad de enlace de los compuestos puede ser también expresada en la constante de disociación (Kd) o como la IC50 o la EC50. La IC50 representa la concentración de un compuesto que es requerido para 50% de inhibición del enlace de otro ligando al polipéptido. La EC50 representa la concentración requerida para obtener 50% del efecto máximo en cualquier ensayo que mida la función del receptor. La constante de disociación, Kd, es una medida de cómo también un ligando se enlaza al polipéptido, es equivalente a la concentración del ligando requerida para saturar exactamente la mitad de los sitios de enlace sobre el polipéptido. Los compuestos con un enlace de alta afinidad tienen bajos valores de kd, IC50 y EC50, por ejemplo, en el intervalo de 100 nM a 1 pM; un enlace de afinidad moderado a bajo se refiere a una kd alta, valores de IC50 y EC50, por ejemplo, en el intervalo micromolar. El presente método de ensayo puede también ser practicado en un ensayo celular. Una célula hospedera que expresa el polipéptido puede ser una célula con expresión endógena o una célula que sobre-expresa el polipéptido mediante transducción. Cuando la expresión endógena del polipéptido no es suficiente para determinar una línea base que pueda ser fácilmente medida, se pueden utilizar células hospederas que sobre-exprésen el polipéptido. En tal ensayo celular, la actividad biológica del polipéptido puede ser medida al seguir la producción de la fosfatasa alcalina ósea (BAP) o la mineralización ósea. La presente invención se refiere además a un método para identificar un compuesto que induce diferenciación de células de mamífero no diferenciadas en osteoblastos, que comprende : (a) poner en contacto un compuesto con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 194-309; (b) determinar la afinidad de enlace del compuesto al polipéptido; (c) poner en contacto una población de las células de mamífero que expresan el polipéptido, con el compuesto que muestra una afinidad de enlace de al menos 10 micromolar; y (d) identificar el compuesto que induce la diferenciación de las células no diferenciadas .
Para fines de alto rendimiento, bibliotecas de compuestos pueden ser utilizadas tales como las bibliotecas de fragmentos de anticuerpo, bibliotecas de visualización de fagos peptídicos, bibliotecas de péptidos (por ejemplo, LOPAR1^, Sigma Aldrich) , bibliotecas de lípidos (BioMol) , bibliotecas de compuestos sintéticos (por ejemplo, LOPAC101, Sigma Aldrich) , o bibliotecas de compuestos naturales (Specs, TimTec) . Los compuestos candidatos a fármaco preferidos son compuestos de bajo peso molecular. Los compuestos de bajo peso molecular, por ejemplo, con un peso molecular de 500 Daltones o menos, es probable que tengan buena absorción y permeación en los sistemas biológicos y en consecuencia, es más probable que sean cambiados a fármacos exitosos que los compuestos con un peso molecular por arriba de 500 Daltones. Los péptidos comprenden otra clase preferida de compuestos candidatos a fármaco . Los péptidos pueden ser excelentes candidatos a fármaco y existen múltiples ejemplos de los péptidos comercialmente valiosos, tales como las hormonas de fertilidad y los inhibidores de la agregación plaquetaria. Los compuestos naturales son otra clase preferida de compuesto candidato a fármaco. Tales compuestos son encontrados en y extraídos de fuentes naturales, en las cuales éstos pueden ser posteriormente sintetizados. Los lípidos son otra clase preferida de compuesto candidato a fármaco .
Otra clase preferida de compuestos candidatos a fármaco es un anticuerpo. La presente invención también proporciona anticuerpos dirigidos contra los dominios extracelulares de los polipéptidos de la invención. Estos anticuerpos deben enlazarse específicamente a uno o más de los dominios extracelulares de los polipéptidos, o como se describe más adelante en la presente, manipulados por ingeniería genética para ser endógenamente producidos para enlazarse para un dominio polipeptídico intracelular. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales . La presente invención incluye los anticuerpos quiméricos, de cadena simple y humanizados, así como los fragmentos FAb y los productos de una biblioteca de expresión de FAb y los fragmentos Fv y los productos de una biblioteca de expresión de Fv. En ciertas modalidades, los anticuerpos policlonales pueden ser utilizados en la práctica de la invención. El experto en la técnica conoce los métodos de preparación de los anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales pueden ser producidos en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente de inmunización y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunización y el adyuvante será inyectado en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales . Los anticuerpos pueden ser también generados contra la proteína intacta o el polipéptido, o contra un fragmento tales como sus péptidos de dominio extracelular, derivados que incluyen conjugados, u otro epitopo de la proteína o polipéptido, tal como el polipéptido incrustado en una membrana celular, o una biblioteca de regiones variables del anticuerpo, tal como una biblioteca de visualización de fago. Puede ser útil conjugar el agente de inmunización a una proteína que se sabe es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Los ejemplos- de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no están limitadas a, hemocianina de lapa en forma de cerradura, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soya. Los ejemplos de adyuvantes que pueden ser empleados incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante de MPL-TDM (monofosforil-lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético) . Un experto en la técnica, sin experimentación indebida, puede seleccionar el protocolo de inmunización. En algunas modalidades, los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados utilizando métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden ser "humanizados" para prevenir que el hospedero monte una respuesta inmune hacia los anticuerpos. Un "anticuerpo humanizado" es uno en el cual las regiones de terminación de la complementariedad (CDRs) , y/o otras porciones de la estructura de dominio variable de cadena ligera y/o pesada son derivadas de una inmunoglobulina no humana, pero las porciones restantes de la molécula son derivadas de una o más inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos humanizados también incluyen los anticuerpos caracterizados por una cadena pesada inmunizada asociada con una cadena ligera no modificada, donadora o aceptora, o una cadena ligera quimérica, o viceversa. La humanización de los anticuerpos puede ser lograda mediante métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Mark y Padlan, (1994) "Chapter 4. Humanization of Monoclonal antobides", The Handbook of Experimental Pharmacology Vol . 113 , Springer-Verlag, Nueva York) . Los animales transgénicos pueden ser utilizados para expresar anticuerpos humanizados. Los anticuerpos humanos pueden ser también producidos utilizando diversas técnicas conocidas en la materia, incluyendo las bibliotecas de visualización de fago (Hoogenboom y Winter, (1991) J. Mol. Biol. 227:381-8; Marks et al. (1991). J. Mol. Biol. 222:581-97). Las técnicas de Colé, et al . , y Boerner, et al., son también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé, et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boerner, et al (1991). J. Immunol . , 147 (1) : 86-95) . Las técnicas conocidas en la materia para la producción de anticuerpos de cadena simple pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena simple para los polipéptidos y las proteínas de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes . Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena pesada modificada. La cadena pesada es truncada en general en cualquier punto en la región Fe para prevenir así la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes son sustituidos con otro residuo de aminoácido o son suprimidos para prevenir la reticulación. Los anticuerpos bioespecífieos son monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, los anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos diferentes antígenos y preferentemente para una proteína o receptor de la superficie celular o una subunidad del receptor. Los métodos para la elaboración de anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de los anticuerpos biespecíficos está basada en la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello (1983) Nature 305:537-9). Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, éstos hibridomas (cuadrotas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales únicamente una tiene la estructura biespecífica correcta. Los pasos de cromatografía de afinidad logran usualmente la purificación de la molécula correcta. Procedimientos similares son descritos en Trauneeker, et al. (1991) EMBO J. 10:3655-9. De acuerdo a otra modalidad preferida, el método de ensayo comprende el uso de un compuesto candidato a fármaco, identificado como poseedor de una afinidad de enlace para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de 194-309. La invención se refiere además a un agente para inducir la diferenciación de las células de mamífero no diferenciadas, en osteoblastos seleccionados del grupo que consiste de un polinucleótido antisentido, una ribozima, y un ARN pequeño de interferencia (siRNA) , en donde el agente comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a, o manipulada por ingeniería genética a partir de una secuencia de polinucleótido de origen natural que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 194-309. En una modalidad preferida, el agente se selecciona del grupo que consiste de un polinucleótido antisentido, una ribozima, y un ARN de interferencia pequeño (siRNA) , en donde el agente comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a, o manipulada por ingeniería a partir de una secuencia polinucleotídica de origen natural que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 199, 230, 237, 262 y 181. Una modalidad del agente es un ácido nucleico que es antisentido a un ácido nucleico que comprende las SEQ ID Nos.: 83-193. Preferentemente, el agente es un ácido nucleico que es antisentido para un ácido nucleico que comprende las SEQ ID Nos.: 83, 114, 121, 146 y 165. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, ADN) puede ser introducido dentro de las células in vi tro, o administrada a un sujeto in vivo, como terapia génica para inhibir la expresión celular de los ácidos nucleicos que comprenden las SEQ ID Nos.: 78-193, que comprende preferentemente las SEQ ID Nos.: 199, 230, 237, 262 y 281. Los oligonucleótidos antisentido comprenden preferentemente una secuencia que contiene de aproximadamente 17 a aproximadamente 100 nucleótidos, y más preferentemente los oligonucleótidos antisentido comprenden de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 nucleótidos. Los ácidos nucleicos antisentido pueden ser preparados a partir de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos seleccionados de las secuencias de la SEQ ID Nos.: 78-193, expresadas en la orientación opuesta. Los ácidos nucleicos antisentido son preferentemente oligonucleótidos y pueden consistir enteramente de desoxirribunucleótidos, desoxirribonucleótidos modificados, o alguna combinación de ambos . Los ácidos nucleicos antisentido pueden ser oligonucleótidos sintéticos. Los oligonucleótidos pueden ser químicamente modificados, si se desea, para mejorar la estabilidad y/o la selectividad. Ya que los oligonucleótidos son susceptibles a la degradación por nucleasas intracelulares, las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, el uso de un grupo azufre para reemplazar el oxígeno del libre enlace fosfodiéster. Esta modificación es llamada a un enlace fosforotioato. Los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato son solubles en agua, polianiónicos y resistentes a las nucleasas endógenas. Además, cuando un oligonucleótido antisentido de fosforotioato se híbrida a su sitio diana u objetivo, el dúplex ARN-ADN activa la enzima ribonucleasa endógena (ARNasa) H, que rompe el componente de mRNA de la molécula híbrida. Además, los oligonucleótidos antisentido .con enlaces fosforamidita y poliamida (péptido) pueden ser sintetizados. Estas moléculas deben ser muy resistentes a la degradación por nucleasa. Además, pueden ser agregados grupos químicos al carbono 2' de la porción azúcar y al carbono 5 (C-5) de las pirimidinas para aumentar estabilidad y facilitar el enlace del oligonucleótido antisentido a su sitio diana. Las modificaciones pueden incluir bases modificadas por 2'-desoxi, O-pentoxi, O-propoxi, O-metoxi, fluoro, metoxietoxi, fosforotioatos, así como otras modificaciones conocidas por aquellos expertos en la técnica. Otro tipo más de agente inhibidor de la expresión que reduce los niveles de los polipéptidos de la invención son las ribozimas . Las ribozimas son moléculas catalíticas de ARN (enzimas de ARN) que tienen dominios de enlace catalíticos y de sustrato, separados. La secuencia de enlace al sustrato se combina por complementariedad de nucleótido y, posiblemente, por interacciones de enlace no hidrógeno con su secuencia objetivo. La porción catalítica rompe el ARN diana en un sitio específico. El dominio del sustrato de una ribozima puede ser manipulado por ingeniería genética para dirigirlo a una secuencia de mRNA específica. La ribozima reconoce y luego se enlaza a un mRNA diana u objetivo a través del apareamiento de bases complementarias. Una vez que está enlazado al sitio objetivo correcto, la ribozima actúa enzimáticamente para cortar el mRNA objetivo. La escisión del ARN por una ribozima destruye su habilidad para dirigir la síntesis del polipéptido correspondiente. Una vez que la ribozima ha escindido su secuencia objetivo, ésta es liberada y puede enlazarse repetidamente y escindir en otros mRNAs . Las formas de ribozima incluyen la porción en forma de cabeza de martillo, la porción en forma de orquilla, el virus de la hepatitis delta, el intrón del grupo I o la porción de ARN a RNaseP (en asociación con una secuencia guía de ARN) de la porción de ARN de Neurospora VS . Las ribozimas que poseen una estructura de cabeza de martillo o de orquilla son fácilmente preparadas, ya que estas moléculas catalíticas de ARN pueden ser expresadas dentro de las células provenientes de promotores eucarióticos (Chen et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:4581-9). Una ribozima de la presente invención puede ser expresada en células eucarióticas provenientes del vector de ADN apropiado. Si se desea, la actividad de la ribozima puede ser aumentada por su liberación desde el transcrito primario por una segunda ribozima (Ventura et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21:3249-55). Las ribozimas pueden ser químicamente sintetizadas al combinar un oligodesoxirribonucleótido con un dominio catalítico de ribozima (20 nucleótidos) flanqueado por secuencias que se hibridan al mRNA objetivo después de la transcripción. El oligodesoxirribonucleótido es amplificado mediante el uso de las secuencias de enlace al sustrato, como cebadores. El producto de amplificación es clonado dentro de un vector de expresión eucariótico . Las ribozimas son expresadas a partir de las unidades de transcripción insertadas dentro del ADN, el ARN o vectores virales . La transcripción de las secuencias de ribozima es impulsada a partir de un promotor para la ARN-polimerasa I eucariótica (pol I) , la ARN-polimerasa II (pol II) , o la ARN-polimerasa III (pol III) . Los transcritos de los promotores pol II o pol III serán expresados a altos niveles en todas las células; los niveles de un promotor pol II dado, en un tipo celular dado, dependerá de las secuencias reguladoras del gen, cercanas. Los promotores de la ARN polimerasa procarióticas son también utilizados, con la condición de que la enzima ARN-polimerasa procariótica sea expresada en las células apropiadas (Gao y Huang, (1993) Nucleic Acids Res. 21:2867-72). Se ha demostrado que las ribozimas expresadas a partir de esos promotores pueden funcionar en células de mamífero (Kashani-Sabet, et al. (1992) Antisense Res. Dev. 2:3-15). Un agente inhibitorio particularmente preferido es un ARN de interferencia pequeño (siRNA) . Los siRNAs son mediadores del proceso post-transcripcional del silenciamiento del gen, por el ARN de doble hebra (dsARN) que es homólogo en secuencia al ARN silenciado. El siRNA de acuerdo a la presente invención comprende una hebra en sentido de 17-25 nucleótidos, complementaria u homologa a una secuencia continua de entre 17-25 nucleótidos, seleccionada del grupo de secuencias descritas en las SEQ ID Nos.: 78-193, preferentemente del grupo de secuencias descritas en las SEQ ID Nos.: 83, 114, 121, 146 y 165 y una hebra antisentido de 17-23 nucleótidos, complementaria a la hebra en sentido. El siRNA más preferido comprende hebras en sentido y antisentido que son 100% complementarias una con la otra y la secuencia polinucleotídica objetivo. Preferentemente, el siRNA comprende además una región de bucle que se enlaza a la hebra en sentido y antisentido. El polinucleótido de la molécula de siRNA de una sola hebra, de autocomplementación, de acuerdo a la presente invención comprende una porción en sentido y una porción antisentido conectada por un ligador de la región de bucle. Preferentemente, la secuencia de la región de bucle es de 4-30 nucleótidos de longitud, más preferentemente de 5-15 nucleótidos de longitud, y lo más preferentemente de 8 nucleótidos de longitud. En una modalidad más preferida, la secuencia ligadora es GTTGCTATAAC como es identificada por la SEQ ID No.: 310. Los siRNAs de una sola hebra, auto-complementarios forman bucles en forma de orquilla y son más estables que el dsARN ordinario. Además, éstos son más fácilmente producidos a partir de los vectores . Análogo al ARN antisentido, el siRNA puede ser modificado para confirmar la resistencia a la degradación nucleolítica, o para aumentar la actividad, o para aumentar la distribución celular, o para aumentar la captación celular, tales modificaciones pueden consistir de enlaces internucleosídicos modificados, bases modificadas de ácidos nucleicos, azúcares modificados y/o enlace químico del siRNA a una o más porciones o conjugados. Las secuencias nucleotídicas se seleccionan de acuerdo a las reglas de diseño del siRNA que dan una reducción mejorada de las secuencias objetivo, en comparación a las secuencias de nucleótidos que no cumplen con estas reglas de diseño del siRNA (para una discusión de estas reglas y ejemplos de preparación del siRNA, WO2004094636, publicado el 4 de noviembre del 2004, y UA20030198627, que se incorporan por referencia en la presente) . La presente invención también se refiere a las composiciones y los métodos de uso de dichas composiciones, que comprende un vector de expresión de ADN capaz de expresar un polinucleótido, capaz de inducir diferenciación de células no diferenciadas en osteoblastos, y descrita anteriormente en la presente, como un agente de inhibición de la expresión. El polinucleótido que expresa el agente de inhibición de la invención, es preferentemente incluido dentro de un vector. El ácido polinucleico es operablemente enlazado a las señales que hacen posible la expresión de la secuencia de ácido nucleico y es introducido en una célula utilizando, preferentemente construcciones del vector recombinante, que expresarán el ácido nucleico antisentido, una vez que el vector es introducido dentro de la célula. Son disponibles una variedad de sistemas basados en virus, incluyendo sistemas vectores adenovirales, retrovirales, virales adenoasociados, lentivirales, virales del herpes simple y un vector sendaviral, y todos pueden ser utilizados para introducir y expresar secuencias de polinucleótidos para los agentes inhibidotes de la expresión, en células diana. Preferentemente, los vectores virales utilizados en los métodos de la presente invención son defectuosos en replicación. Tales vectores defectuosos en replicación usualmente empaquetarán al menos una región que es necesaria para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden ser ya sea eliminadas (total o parcialmente) , pueden ser hechas no funcionales mediante cualquier técnica conocida por una persona experta en la materia. Estas técnicas incluyen la eliminación total, sustitución, supresión parcial o adición de una o más bases a una región esencial (para la replicación) . Tales técnicas pueden ser realizadas in vitro (sobre el ADN aislado) o in situ, utilizando las técnicas de manipulación genética o mediante tratamiento con agentes mutagénicos. Preferentemente, el virus defectuoso en replicación conserva la secuencia de su genoma, que son necesarias para la encapsidación de las partículas virales. En una modalidad preferida, el elemento viral es derivado de un adenovirus. Preferentemente, el vehículo incluye un vector adenoviral empaquetado dentro de una cápside adenoviral, o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo. La biología del adenovirus es también comparativamente bien conocida a nivel molecular. Muchas herramientas para vectores adenovirales han sido y continúan siendo desarrolladas, elaborando de este modo una cápside adenoviral de un vehículo preferido para incorporarse en una biblioteca de la invención. Un adenovirus es capaz de infectar una amplia variedad de células. No obstante, los diferentes serotipos adenovirales tienen diferentes preferencias para las células. Para combinar y ampliar la población de células objetivo que una cápside adenoviral de la invención puede entrar en una modalidad preferida, el vehículo incluye proteínas de fibra adenoviral provenientes de al menos dos adenovirus . En una modalidad preferida, el ácido nucleico derivado de un adenovirus incluye el ácido nucleico que codifica para una proteína tardía adenoviral o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Una proteína tardía adenoviral, por ejemplo, una proteína de fibra adenoviral, puede ser favorablemente .utilizada para dirigir el vehículo a una cierta célula, o para inducir la distribución mejorada del vehículo a la célula. Preferentemente, el ácido nucleico derivado de un adenovirus codifica esencialmente para todas las proteínas tardías adenovirales, haciendo posible la formación de cápsides adenovirales enteras o partes funcionales, análogos y/o derivados de las mismas. Preferentemente, el ácido nucleico derivado de un adenovirus incluye el ácido nucleico que codifica para el adenovirus E2A o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo. Preferentemente, el ácido nucleico derivado de un adenovirus incluye el ácido nucleico que codifica para al menos una proteína de la región E4 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, que facilita, al menos en parte, la replicación de un ácido nucleico derivado de adenovirus, en una célula. Los vectores adenovirales utilizados en los ejemplos de esta solicitud son ejemplares de los vectores útiles en el presente método de tratamiento de la invención. Ciertas modalidades de la presente invención utilizan sistemas vectores retrovirales. Los retrovirus son virus de integración que infectan a las .células en división y su construcción es conocida en la técnica. Los vectores retrovirales pueden ser construidos a partir de diferentes tipos de retrovirus, tales como MoMuLV ("virus de la leucemia murina de Moloney" MSV ("virus del sarcoma murino de Moloney"), HaSV ("virus de sarcoma de Harvey" ) ; SNV ("virus de la necrosis del bazo"); RSV ("virus de sarcoma de Rous") y virus de Friend. Los sistemas vectores lentivirales pueden ser también utilizados en la práctica de la presente invención. Los sistemas retrovirales y los sistemas del virus del herpes pueden ser vehículos preferidos para la transfección de las células neuronales . En otras modalidades de la presente invención, son utilizados los virus adenoasociados ("AAV"). Los virus AAV son virus de ADN de tamaño relativamente pequeño que se integran, de una manera estable y específica del sitio, dentro del genoma de las células infectadas . Estos son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir cualesquiera efectos sobre el crecimiento celular, la morfología y la diferenciación, y no parecen estar involucrados en las patologías humanas . En la construcción del vector, los agentes polinucleotídicos de la presente invención pueden ser ligados a una o más regiones reguladoras . La selección de la región o regiones reguladoras apropiadas es un asunto rutinario; dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. Las regiones reguladoras incluyen promotores, y pueden incluir aumentadores , supresores, etc. Los promotores que pueden ser utilizados en los vectores de expresión de la presente invención incluyen promotores constitutivos y promotores regulados (inducibles) . Los promotores pueden ser procarióticos o eucarióticos dependiendo del hospedero. Entre los promotores procarióticos (incluyendo bacteriófagos) útiles para practicar esta invención están los promotores lac, lacZ, T3 , T7, lamba, P.sub.r, P.sb.l, y trp. Entre los promotores eucarióticos (incluyendo virales) útiles para la práctica de esta invención, están los promotores ubicuos (por ejemplo, HPRT, vicentina, actina, tubulina) , promotores filamentarios intermediarios (por ejemplo, desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP) , promotores de genes terapéuticos (por ejemplo, tipo MDR, CFTR, factor VIII) , promotores específicos de tejidos (por ejemplo, promotor de actina, en células del músculo liso, o promotores Flt y Flk activas en células endoteliales) , incluyendo regiones de control transcripcional animales, que muestran especificidad tisular y han sido utilizados en animales transgénicos : región de control del gen de la elastasa I que es activo en células acinares pancreáticas (S ift, et al. (1984) Cell 38:639-46; Ornitz, et al. (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol. 50:399-409; McDonald, (1987) Hepatology 7:425-515); región de control del gen de la insulina que es activo en células beta pancreáticas (Hanahan, (1985) Nature 315:115-22), región de control del gen de la inmunoglobulina que es activo en células linfoides (Grosschedl, et al. (1984) Cell 38:647-58; Adames, et al. (1985) Nature 318:533-8; Alexander, et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-44), región de control del virus de tumor mamario de ratón, que es activo en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder, et al. (1986) Cell 45:485-95), región de control del gen de albúmina que es activo en hígado (Pinkert, et al. (1987) Genes y Devel . 1:268-76), región de control del gene de la alfa-fetoproteína, que es activo en hígado (Krumlauf, et al. (1985) Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer, et al. (1987) Science 235:53-8), región de control del gen de la alfa 1-antitripsina que es activo en el hígado (Kelsey, et al. (1987) Genes and Devel., 1:161-171), región de control del gen de la beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram, et al. (1985) Nature 315:338-40; Kollias, et al. (1986) Cell 46:89-94), región de control del gen de la proteína básica de mielina, que es activo en células de oligodendrocitos en cerebro (Readhead, et al. (1987) Cell -48:703-12), región de control del gen de la cadena ligera 2 de miosina que es activo en músculo esquelético (Sani, (1985) Nature 314.283-6), y región de control del gen de la hormona de liberación de gonadotropina, que es activo en el hipotálamo (Masón et al. (1986) Science 234:1372-8). Otros promotores que pueden ser utilizados en la práctica de la invención incluyen los promotores que son preferentemente activados en células en división, promotores que responden a un estímulo (por ejemplo, receptor de hormona esferoide, receptor del ácido retinoico) , moduladores transcripcionales regulados por tetraciclina, promotores inmediato-temprano del citomegalovirus, LTR retroviral, metalotioneina, SV-40, Ela, y MLP. Los sistemas vectores adicionales incluyen los sistemas no virales que facilitan la introducción de los agentes polinucleotídicos en un paciente. Por ejemplo, un vector de ADN que codifica para una secuencia deseada, puede ser introducido in vivo mediante lipofección. Los lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar, las dificultades encontradas con la transfección mediada por liposomas, pueden ser utilizados para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica para un marcador (Felgner, et. Al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84:7413-71); ver Mackey, et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:8027-31; Ulmer, et al. (1993) Science 259:1745-8). El uso de los lípidos catiónicos pueden promover el encapsulamiento de ácidos nucleicos negativamente cargados, y también promover la fusión con membranas celulares negativamente cargadas (Felgner y Ringold, (1989) Nature 337:387-8). Los compuestos y composiciones lipidíeos particularmente útiles para la transferencia de los ácidos nucleicos, se describen en las Publicaciones de Patentes Internacionales Nos. WO 95/18863 y WO 96/17823,' y en la Patente de los Estados Unidos No. '5,459,127. El uso de la lipofección para introducir genes exógenos dentro de órganos específicos in vivo, tienen ciertas ventajas prácticas, y la dirección de la transfección a tipos celulares particulares podría ser particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, por ejemplo, el páncreas, el hígado, el riñon, y el cerebro. Los lípidos pueden ser químicamente acoplados a otras moléculas para fines de dirección al objetivo. Los péptidos dirigidos, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y proteínas por ejemplo, anticuerpos, o moléculas no peptídicas podrían ser acoplados a liposomas químicamente. Otras moléculas son también útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, por ejemplo, un oligopéptido catiónico" (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO 95/21931) , péptidos derivados de proteína de enlace al ADN (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO 96/25508) , o un polímero catiónico (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO 95/21931) . Es también posible introducir un vector de ADN in vivo como un plásmido de ADN desnudo (ver Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,693,622, 5,589,466 y 5,580,859). Los vectores de ADN desnudos para fines terapéuticos pueden ser introducidos dentro de las células hospederas deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato de calcio, el uso de una pistola de genes, o el uso de un transportador vector de ADN (ver por ejemplo, Wilson, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-7; Wu y Wu, (1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4; Hartmut, et al., Solicitud de Patente Canadiense No. 2,012,311, presentada el 15 de Marzo de 1990; Williams, et al (1991). Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:2726- 30) . Pueden ser también utilizados procedimientos de distribución de ADN, mediados por receptores (Curiel, et al. (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-54; Wu y Wu, (1987) J. Biol.
Chem. 262:4429-32) . La invención proporciona además una composición farmacéutica aumentadora de la formación de hueso, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente como se describe anteriormente en la presente, en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Otra modalidad preferida es una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de una condición que involucra una disminución sistémica o local en la densidad ósea media, o una susceptibilidad a la condición, que comprende una cantidad aumentadora de la formación ósea, efectiva, de los antagonistas o agonistas inversos de los polipéptidos de la invención, y/o las sales, hidratos, solvatos o profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede ser una composición que puede ser sólida, líquida, en gel o en otra forma, en la cual el compuesto, el polinucleótido, el vector y el anticuerpo de la invención es mantenido en una forma activa, por ejemplo, en una forma capaz de efectuar una actividad biológica. Por ejemplo, un compuesto de la invención tendría actividad de agonista inverso o de antagonista sobre el polipéptido; un ácido nucleico podría ser capaz de replicarse, de traducir un mensaje o de hibridarse a un ácido nucleico complementario del polipéptido mRNA, un vector sería capaz de transfectar una célula diana y de realizar la expresión antisentido, del anticuerpo, de la ribozima o del siRNA como se describe anteriormente; un anticuerpo se podría enlazar a un dominio polipeptídico . Tales composiciones pueden ser formuladas para la administración por las rutas tópica, oral, parenteral, intranasal, subcutánea, e infraocular. Se entiende que la administración parenteral incluye la inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraarterial o técnicas de infusión. La composición puede ser administrada parenteralmente en formulaciones de dosis unitaria que contienen portadores, adyuvantes y vehículos estándares, bien conocidos, no tóxicos, fisiológicamente aceptables, como se desee. Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden ser formuladas utilizando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidas en la técnica, en dosis adecuadas para la administración oral. Tales portadores hacen posible que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y similares, para la ingestión por el paciente. Las composiciones farmacéuticas para el uso oral pueden ser preparadas mediante combinación de los compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente triturando una mezcla resultante, y procesando la mezcla de granulos después de agregar los auxiliares adecuados, si se desea, para obtener núcleos de tabletas o de grageas. Los excipientes adecuados son rellenadores de carbohidratos o de proteína, tales como azúcares incluyendo lactosa, sucrosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, de trigo, de arroz, de papa, o de otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa de sodio; gomas incluyendo goma arábiga y de tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desean pueden ser agregados agentes desintegradores o solubilizadores, tales como la polivinilpirrolidona reticular, agar, ácido algínico, o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio. Pueden ser utilizados núcleos de grageas en conjunto con los recubrimientos adecuados, tales como soluciones de azúcar concentradas, que pueden también contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Pueden ser agregados colorantes o pigmentos a las tabletas o a los recubrimientos de tabletas o de grageas para la identificación de los productos o para caracterizar la cantidad del compuesto activo, por ejemplo, la dosis. Las preparaciones farmacéuticas que pueden ser utilizadas oralmente incluyen cápsulas de ajuste y empuje elaboradas de gelatina, así como cápsulas selladas, suaves, elaboradas de gelatina y un recubrimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste y empuje, pueden contener ingredientes activos mezclados con el rellenador o aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas suaves, los compuestos activos pueden ser disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquidos, polietilenglicol líquido con o sin estabilizadores. Las preparaciones inyectables estériles preferidas pueden ser una solución o suspensión en un solvente diluyente no tóxico, parenteralmente aceptable. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables son solución salina, solución salina amortiguada, solución salina isotónica (por ejemplo, fosfato monosódico o disódico, de sodio o de potasio, cloruro de calcio o de magnesio, o mezclas de tales sales) , solución de Ringer, dextrosa, agua, agua estéril, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos, 1, 3-butanodiol y aceites fijos estériles son convenientemente empleados como solventes o medios suspensores. Cualquier aceite fijo blando puede ser empleado, incluyendo los mono- o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentra también uso en la preparación de inyectables. El medio de composición puede también ser un hidrogel, el cual es preparado a partir de cualquier homo- o heteropolímero biocompatible o no tóxico, tal como un polímero de ácido poliacrílico o hidrofílico que puede actuar como una esponja absorbedora de fármaco. Algunos de ellos, tales como en particular, aquellos obtenidos del óxido de etileno y/o de propileno son comercialmente disponibles . Un hidrogel puede ser depositado directamente sobre la superficie del tejido que va a ser tratado, por ejemplo, durante la intervención quirúrgica. Las modalidades de las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden un vector viral recombinante defectuoso en replicación, que codifica para el agente inhibidor polinucleótido de la presente invención, y un aumentador para transfección tal como un poloxámero. Un ejemplo de un poloxámero es el Poloxamer 407, el cual es comercialmente disponible (BASF, parsippany, N.J.) y es un poliol biocompatible, no tóxico. Un poloxámero impregnado con virus recombinantes puede ser depositado directamente sobre la superficie del tejido que va a ser tratado, por ejemplo, durante una intervención quirúrgica. El poloxámero posee esencialmente las mismas ventajas que el hidrogel, al tiempo que tiene una menor viscosidad. Los agentes activos inhibidores de la expresión pueden ser también atrapados en hidrocápsulas preparadas, por ejemplo, mediante la polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) respectivamente, en sistemas coloidales de distribución de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas . de albúmina, mieroemulsiones, nanopartículas y nano-cápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas son descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed. Pueden ser preparadas preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (alcohol vinílico)), poliáctidos (patente de los Estados Unidos No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT1^. (Microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y el acetato de leuprólido) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el acetato de etilenvinilo y el copolímero de ácido láctico-ácido glicólico hacen posible la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan las proteínas por periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un tiempo prolongado, éstos pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37aC, dando como resultado una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden ser consideradas por la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede ser lograda mediante la modificación de los residuos de sulfhidrilo, la liofilización a partir de soluciones acidas, el control del contenido de humedad, el uso de aditivos apropiados, y el desarrollo de composiciones de matriz polimérica específica. Como se definió anteriormente, la dosis terapéuticamente efectiva significa aquella cantidad de proteína, polinucleótido, péptido o sus anticuerpos, agonistas o antagonistas, que mejoran los síntomas o la condición. La eficacia terapéutica y la toxicidad de tales compuestos pueden ser determinados por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) , y la LD50 (la dosis letal para 50% de la población) . La proporción de dosis de los efectos tóxicos a terapéuticos es el índice terapéutico, y ésta puede ser expresada como la proporción, LD50/ED50. Las composiciones farmacéuticas que muestran índices terapéuticos grandes, son preferidas . Los datos obtenidos a partir de los ensayos en cultivos celulares y estudios en animales se utilizan en la formulación de una gamma de dosis para el uso en humanos . La dosis de tales compuestos cae preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la EC50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis varía dentro de éste intervalo, dependiendo de la forma de dosis empleada, de la sensibilidad del paciente, y de la ruta de administración. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser inicialmente estimada ya sea en ensayos de cultivo o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal es también utilizado para lograr un intervalo de concentración deseable y ruta de administración deseada. Tal información puede ser luego utilizada para determinar las dosis y rutas útiles para la administración en humanos. La dosis exacta es elegida por el médico individual en vista del paciente que va a ser tratado. La dosis y la administración son ajustadas para proporcionar suficientes niveles de la porción activa o para mantener el efecto deseado. Factores adicionales que pueden ser tomados en cuenta incluyen la severidad de la etapa de la enfermedad, la edad, el peso y el género del paciente, la dieta, la duración deseada del tratamiento, el método de administración, el tiempo y la frecuencia de administración, la o las combinaciones del fármaco, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden ser administradas cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y de la velocidad de despejo de la formulación particular. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a esta invención pueden ser administradas a un sujeto mediante una variedad de métodos . Estas pueden ser agregadas directamente a los tejidos objetivo, formados en complejo con lípidos catiónicos, empaquetados dentro de liposomas, o distribuidos a las células diana mediante otros métodos conocidos en la materia. La administración localizada a los tejidos deseados puede ser realizada por catéter, bomba de infusión o stent. El ADN, los complejos de ADN/vehículo, o las partículas virales recombinantes son totalmente administradas al sitio de tratamiento. Las rutas alternativas de administración incluyen, pero no están limitadas a, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inhalación de aerosol, oral (forma de tableta o pildora) , tópica, sistémica, ocular, intraperitoneal y/o intratecal . Los ejemplos de distribución por ribozima, y administración de ribozima se proporcionan en Sullivan et al. WO 94/02595. Los anticuerpos de acuerdo a la invención pueden ser distribuidos como un bolo únicamente, infundidos sobre el tiempo o administrados como un bolo e infundido sobre el tiempo. Aquellos expertos en la técnica pueden emplear diferentes formulaciones para los polinucleótidos que para las proteínas. Similarmente, la distribución de los polinucleótidos o polipéptidos será específica para las células particulares, condiciones, sitios particulares, etc. Como se discutió anteriormente en la presente, los virus recombinantes pueden ser utilizados para introducir el ADN que codifica para agentes polinucleotídicos útiles en la presente invención. Los virus recombinantes de acuerdo a la invención son en general formulados y administrados en la forma de dosis de entre aproximadamente 104 hasta aproximadamente 1014 ufp. En el caso de los aminoácidos y adenovirus, son preferentemente utilizadas dosis de aproximadamente 106 hasta aproximadamente 1011 ufp. El término ufp ("unidad formado de placa") corresponde al poder infeccioso de una suspensión de viriones y es determinada por la infección de un cultivo celular apropiado, y midiendo el número de placas formadas . Las técnicas para determinar el título de ufp de una solución viral están bien documentadas en la técnica anterior. Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad que involucra una enfermedad sistémica o local en densidad ósea media, que comprende la administración al sujeto de una composición farmacéutica aumentadora de la formación ósea, como se describe en la presente. La invención también se refiere al uso de un agente como se describe anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad que involucra una disminución sistémica o local en la densidad ósea media. En una modalidad preferida de la presente invención, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de osteoporosis, hipercalcemia de malignidad, mielomatosis múltiple, hiperparatiroidismo, e hipertiroidismo . Una modalidad especial de esta invención es un método donde la enfermedad es la osteoporosis . Otro aspecto más de la invención se refiere a un método para el diagnóstico de una condición patológica que involucra una disminución sistémica o local en la densidad ósea media o una susceptibilidad a la condición en un sujeto, que comprende determinar la cantidad del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 194-309 en una muestra biológica, y comparando la cantidad con la cantidad de polipéptido en un sujeto saludable, en donde un incremento en la cantidad de polipéptido en comparación al sujeto saludable, es indicadora de la presencia de la condición patológica. Preferentemente, la condición patológica se selecciona del grupo que consiste de osteoporosis , hipercalcemia de malignidad, mielomatosis múltiple, hiperparatiroidismo, e hipertiroidismo. Más preferentemente, la condición patológica es la osteoporosis . Los polipéptidos o los polinucleótidos de la presente invención empleados en los métodos descritos en la presente, pueden estar libres en solución, fijados a un soporte sólido, llevados sobre una superficie celular, o localizados intracelularmente. Para llevar a cabo los métodos, es factible inmovilizar ya sea el polipéptido de la presente invención o el compuesto para facilitar la separación de los complejos a partir de las formas no complejadas del polipéptido, así como para acomodar la automatización del ensayo. La interacción (por ejemplo, el enlace de) el polipéptido de la presente invención, con un compuesto puede ser lograda en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos para microcentrífuga. En una modalidad, una proteína de fusión puede ser proporcionada, la cual agrega un dominio que permite que el polipéptido sea enlazado a una matriz. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención puede estar marcado con "His" y subsecuentemente adsorbido sobre placas de microtitulación de Ni-NTA, o fusiones de ProtA con los polipéptidos de la presente invención pueden ser adsorbidas a IgG, que son luego combinadas con los lisados celulares (por ejemplo, marcados con 35S) y el compuesto candidato, y la mezcla incubada bajo condiciones favorables para la formación del complejo (por ejemplo, a condiciones fisiológicas para la sal y el pH) . Después de la incubación, las placas son lavadas para remover cualquier marcador no enlazado, y la matriz es inmovilizada. La cantidad de radioactividad puede ser determinada directamente, o en el sobrenadante después de la disociación de los complejos. Alternativamente, los complejos pueden ser disociados de la matriz, separados mediante SDS-PAGE, y el nivel del enlace de la proteína a la proteína de la presente invención, se cuantifica a partir del gel utilizando técnicas electroforéticas estándares. Otras técnicas para inmovilizar las proteínas sobre matrices pueden ser también utilizadas en el método de identificación de los compuestos. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención sobre el compuesto pueden ser inmovilizados utilizando conjugación de biotina y estreptavidina. Las moléculas de proteína biotiniladas de la presente invención pueden ser preparadas a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando técnicas bien conocidas en la materia (por ejemplo, el equipo de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, 111.), e inmovilizadas en los pozos de placas de 96 pozos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical) . Alternativamente, los anticuerpos reactivos con los polipéptidos de la presente invención pero que no interfieren con el enlace del polipéptido al compuesto, pueden ser derivatizados a los pozos de la placa, y el polipéptido de la presente invención puede ser atrapado en los pozos mediante conjugación al anticuerpo. Como se describió anteriormente, las preparaciones de un compuesto candidato marcado son incubadas en los pozos de la placa que presenta el polipéptido de la presente invención, y la cantidad de complejo atrapado en el pozo puede ser cuantificada. Los polinucleótidos de la invención de las SEQ ID Nos.: 1-77 han mostrado que incrementan la diferenciación de osteoblastos . En consecuencia, otra - modalidad de la presente invención se refiere a un método para la producción in vitro del tejido óseo, que comprende los pasos de poner en contacto las células de mamífero no diferenciadas con una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 1-77, preferentemente, seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 69-77, por un tiempo suficiente, para diferenciar las células no diferenciadas en osteoblastos, con lo cual se produce una matriz ósea continua. En una modalidad preferida, el método comprende los pasos de: (a) aplicar células de mamífero no diferenciadas sobre un sustrato, para formar un sustrato celular, (b) introducir una secuencia polinucleotídica o un vector que comprende una secuencia de nucleótidos, seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 1-77, preferentemente seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 69-77, por un tiempo suficiente para diferenciar las células no diferenciadas en osteoblastos, con lo cual se produce una matriz ósea continua. La invención proporciona de este modo un método para producir un sustrato con una matriz desarrollada sobre éste, que puede ser utilizada para la provisión de implantes que llevan carga, incluyendo prótesis de articulaciones, tales como articulaciones de cadera artificiales, articulaciones de rodilla, y articulaciones de dedos, e implantes maxilofaciales, tales como implantes dentales. Esta puede ser también utilizada para dispositivos especiales de cirugía, tales como espaciadores, o rellenadores óseos, y para el uso en el aumento, obliteración o reconstitución de defectos óseos, y hueso dañado o perdido. La formación de hueso puede ser optimizada mediante la variación en la mineralización, mediante procesos inductivos y conductivos . Una combinación de la provisión de un implante que soporta carga (preferentemente, recubierto con una matriz como se describe anteriormente) con un rellenador óseo que comprende una matriz como se describe, constituye un método ventajoso de acuerdo a la presente invención. El método de la invención es también muy adecuado en relación a la cirugía de revisión, por ejemplo, cuando tienen que ser reemplazados dispositivos quirúrgicos previos. Las células no diferenciadas adecuadas son células de médula ósea incluyendo células hematopoyéticas y en particular células estromales. Las células de la médula ósea, y especialmente las células estromales son encontradas como muy efectivas en el proceso de producción de hueso, cuando se toman a partir de su ambiente original . Las células no diferenciadas pueden ser directamente aplicadas sobre el sustrato o pueden ser ventajosamente multiplicadas en ausencia del sustrato, antes de ser aplicadas sobre el sustrato. En la última modalidad, las células son todavía no diferenciadas en gran medida, después de la multiplicación y, para fines de la invención, éstas son todavía denominadas como no diferenciadas. Subsecuentemente, se permite que las células se diferencien. La diferenciación puede ser inducida o aumentada por la presencia de inductores adecuados, tales como glucocorticoides y dexametasona. Los inductores de la diferenciación especialmente adecuados son los agentes inhibidores de la expresión, de la presente invención. El uso de las células no diferenciadas proporciona varias ventajas. Primeramente, su menor diferenciación implica una más alta velocidad o proporción de proliferación y permite que la funcionalidad eventual sea mejor dirigida y controlada. Además, el cultivo de estas células no solamente produce la matriz ósea requerida que contiene los componentes orgánicos e inorgánicos, sino también da como resultado la presencia, en el medio de cultivo y en la matriz, de varios factores que son esenciales para el desarrollo del tejido y para la adaptación al tejido vivo existente. También, el medio de cultivo puede ser una fuente de factores activos tales como factores de crecimiento, que van a ser utilizados en conexión con el proceso de implantación. Además, tales células no diferenciadas son frecuentemente disponibles en grandes cantidades y más convenientemente que, por ejemplo, las células óseas maduras, y muestran una menor morbilidad durante la recuperación. Además, las células no diferenciadas pueden ser obtenidas a partir del paciente para quien está destinado al implante. El hueso resultante de estas células es autólogo para el paciente y de este modo no será inducida ninguna respuesta inmune. Las matrices tan gruesas como de 100 µm pueden ser producidas como resultado del uso de las células no diferenciadas . El sustrato sobre el cual pueden ser aplicadas las células no diferenciadas y cultivadas, puede ser un metal, tal como titanio, aleación de cobalto/cromo o acero inoxidable, una superficie bioactiva tal como fosfato de calcio, superficies poliméricas tales como polietileno, y similares. Aunque menos preferido, puede ser también utilizado como un sustrato, el material silicio tal como cerámica de vidrio. Más preferidos son los metales, tales como titanio, y fosfatos de calcio, aún cuando el fosfato de calcio no sea un componente indispensable del sustrato. El sustrato puede ser poroso o no poroso . Las células pueden ser aplicas a una proporción por ejemplo de 103 - 106 por cm2, en particular 104 - x 105 células por cm2. El medio de cultivo que va a ser utilizado en el método de acuerdo a la invención puede ser un medio de cultivo comúnmente conocido tal como MEM (medio esencial mínimo) . Ventajosamente, el medio puede ser un medio condicionado. En este contexto, se entiende que un medio condicionado es un medio en donde células similares han sido previamente incubadas, provocando que el medio contenga factores tales como polipéptidos, secretados por las células que son importantes para el desarrollo celular y la diferenciación celular . Las células son cultivadas por un tiempo suficiente para producir una capa de matriz, por ejemplo, una capa de matriz que tiene un espesor de al menos de 0.5 µm, en particular de 1 hasta 100 µm, más en particular de 10-50 µm. Las células pueden ser puestas en contacto con el medio de cultivo por ejemplo por 2-15 semanas, en particular 4-10 semanas . La producción de la matriz, cuando se aplica sobre un sustrato, da como resultado un recubrimiento continuo o casi continuo que cubre el sustrato por al menos 50%, en particular al menos 80% de su área superficial. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se refiere además a las células osteoblastos obtenibles mediante el método anterior. La invención es además ilustrada en las siguientes figuras y ejemplos. Figura 1. Osificación intravenosa y endocondral . Figura 2. Principio de ensayo de diferenciación de osteoblastos . Figura 3. Disposición de la placa de control desmontada de 96 pozos. Figura 4. Disposición de la placa de control 384 pozos . Figura 5. Funcionamiento de la placa control desmontada en el ensayo AP. Figura 6. Representación gráfica de los datos brutos para una placa de selección SilenceSelect . Figura 7. Análisis de la suprarregulación de BAP-mARN versus PLAP- o IAP-mARN. Figura 8. Resultados del ensayo de mineralización. Figura 9. Esquema de pipeteo utilizado para la selección del Ad-shARNs a MOIs . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN EJEMPLOS Ejemplo 1. Desarrollo de un método de selección de alto rendimiento para la detección de fosfatasa alcalina endógena. Principio del ensayo Se determina que las células progenitoras mesenquimales (MPCs, por sus siglas en inglés) se diferencian en osteoblastos en presencia de factores' apropiados (por ejemplo, BMP2) . Fue desarrollado un ensayo para seleccionar tales factores mediante el monitoreo de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (AP) , un marcador temprano en el programa de diferenciación de osteoblastos. Las MPCs fueron sembradas en placas de 384 pozos y simultáneamente co-infectadas un día después con los adenovirus que codifican para el Virus Coxsakie humano y el receptor adenoviral (hCAR. ; Ad-hCAR) y los adenovirus de siRNA individuales (Ad-siRNA) de la colección SilenceSelect1^. La co-infección de AdCl5-hCAR/AdC20-hCAR incrementa la eficiencia de infección de AdCOl-siRNA. La actividad de AP celular fue determinada 13 días después del inicio de la infección (13 dpi) . La figura 2 ilustra el principio del ensayo. Desarrollo del ensayo Las MPCs fueron aisladas de la médula ósea de voluntarios saludables, obtenidas después del consentimiento informado (Cambrex/Biowhittaker, Verviers, Bélgica).
En una serie de experimentos, llevados a cabo en placas de 384 pozos, fueron optimizados varios parámetros: la densidad de siembra de las células, las multiplicidades de infección MOI de los virus control (ad-BMP2 ó Ad-eGFP) , MOI de Ad- CAR, la duración de la infección, la toxicidad, la eficiencia de la infección (utilizando Ad-eGFP) y el día de la lectura. Utilizando Ad-BMP2 (sobreexpresión de BMP2) como un control positivo para el desarrollo del ensayo, el siguiente protocolo dio como resultado el más alto intervalo dinámico para el ensayo con la menor desviación estándar sobre la señal antecedente: las MPCs fueron sembradas en el día 0 a 500 células por pozo de una placa de 384 pozos, y co-infectadas al siguiente día utilizando una mezcla de Ad-hCAR (5 µl de una solución de Ad-hCAR: mezcla total MOI = 155.7) y µl del virus AD-control (Ad.BMP2 o Ad-eGFP; corresponde a una MOI teórica de 5000) . En el día 5, el medio que contenía el virus fue retirado y reemplazado por medio fresco que no contenía virus . La suprarregulación de la fosfatasa alcalina fue leída a 13 dpi: se agregaron 15 µl de 4-metilumbeliferilfosfato (MUP, Sigma) a cada pozo, las placas fueron incubadas por 15 minutos a 37aC y monitorizadas para la actividad de AP utilizando un lector de placa de fluorescencia (Fluostar, BMG) . Después de la optimización del ensayo, se corrió una selección piloto necesaria (103 diferentes virus de Ad-siRNA) con el uso de robots (surtidor de canal 96/384 Tecan Freedom 200 equipado con TeM096, TeM0384 y RoMa, Tecan AG, Suiza) . Los aciertos de esta selección fueron recolectados y así probados nuevamente en el mismo ensayo . Los dos Ad-siRNAs que calificaron más fuerte (H9=H24-010; H10=H24-011) fueron utilizados para generar una placa control (placa control no desmontada (KD) ) que contenía Ad-siRNAs. La placa control, una placa de 96 pozos que contenía 3 virus control negativos (Ni, N2, N3) y 3 virus control positivos (Pl, P2 , P3 ) se describen en la figura 3. Esta placa control "desmontada" contiene Ad-H9 (H24-010) y Ad-HlO (H24-011) como controles positivos; Ad-eGFP (virus montados) como control de infección; y Ad-eGFP-siRNA, Ad-M6PR-siRNA y Ad-Luc~siRNA (los 3 virus desmontados, como controles negativos) . Los virus control fueron tomados con pipeta de las placas control cadena de 96 pozos dentro de placas de 384 pozos utilizando un robot. La disposición final de la placa de 384 pozos se describe en la figura 4. La figura 5 muestra los resultados del procedimiento de selección automatizado utilizando la placa control KD. Las desviaciones medias y estándar de los controles negativos KD (N1-N3) se utilizaron para calcular un corte para el análisis de acierto o concordancia, que fue ajustado a la media para i, N2 , N3 ("todos negativos") más 3 veces la desviación estándar para "todos negativos". Los controles positivos (Pl y P2) , calificaron en más de 95% de los pozos infectados. Los virus control negativo calificaron en menos de 5% de los pozos . Ejemplo 2 : Selección de los adenovirus 2760 Ad-siRNA en el ensayo de osteogénesis El protocolo optimizado para la selección de las bibliotecas SilenceSelect es el siguiente: en el día 0, se siembran células MPC en placas de 384 pozos negras, con el fondo claro (Costar o Nunc) en 60 µl de medio a una densidad de 500 células por pozo. Un día después, 1 µl del virus Ad-siRNA proveniente de la colección SilenceSelect1111, almacenado en placas de 384 pozos (título estimado de 2.5 x 109 partículas virales por ml) y 5 µl de la solución Ad-hCAR (MOI total = 155) , surtidos en placas de fondo en V de 96 pozos, se transfieren con la ayuda de un surtidor de canal 96/384 (Tecan Freedom 200 equipado con TeM096, TeM0384 y RoMa, Tecan AG, Suiza) a partir de los pozos de una placa de 96 pozos que contiene la solución Ad-hCAR a cada uno de los pozos de las placas de 384 pozos que contienen MPCs. La placa control KD fue corrida bajo las mismas condiciones que las placas de alícuotas provenientes de la colección SilenceSelect. Todos los virus de Ad-siRNA fueron seleccionados por duplicado, con cada singular sobre una placa de MPC diferente. Las placas fueron luego incubadas a 37 aC. Cuatro días después de la infección, el medio que contenía los adenovirus fue reemplazado por medio fresco libre de virus . Trece días después de la infección, la lectura de la actividad de AP fue realizada. Un resultado típico de una placa de selección de 384 se describe en la figura 6, en la cual son trazadas gráficamente las unidades de fluorescencia relativas (RFU) para cada uno de los puntos de datos de la placa de 384 pozos sobre el eje Y; mientras que los números del eje X corresponden a las posiciones a la placa de 384 pozos. Esta selección por duplicado fue realizada dos veces, y los cuatro puntos de datos fueron utilizados para mayor certidumbre (ver ejemplo 3). Ejemplo 3. Identificación de objetivo utilizando el ensayo AP Después de realizar estas 2 selecciones, los datos obtenidos de la medición de la actividad AP fueron analizados como sigue: el antecedente fue calculado al tomar la media de los puntos de datos de todas las placas, excepto la placa control . Un valor de corte para la llamada de acierto fue calculada al agregar tres veces la desviación estándar de todos los puntos de datos, excluyendo la placa control. Cada punto de dato fue analizado para la calificación por arriba y por debajo del corte. Únicamente los Ad-siRNAs inducen niveles de actividad endógena de AP por arriba del corte fueron de mayor interés . Los aciertos fueron clasificados por prioridad de acuerdo a su calificación en simple o dúplex, y una o ambas de las selecciones. Los datos fueron recolectados para las 2688 construcciones de virus Ad-siRNA que representan 2657 construcciones de KD independientes, y se enlistan en la tabla 2. Uno de los aciertos identificados ha sido mostrado como un factor anabólico óseo antes, y por lo tanto valida el ensayo: H24-241: BMP3 BMP3 es un ensayo de la familia de proteínas morfogenéticas óseas de las proteínas secretadas . BMP3 funciona como un antagonista para BMP2 osteogénico. Ratones nulos o inactivados en BMP3 tienen dos veces tanto hueso trabecular como los animales de tipo silvestre indicando que BMP3 es un regulador negativo de la homeostasis ósea in vivo (Daluiski et al., Nature Genetics (2001) 27:84-88). Ejemplo 4. Control de calidad de los Ad-siRNAs objetivo Los insertos de Ad-siRNA fueron sometidos a un control de calidad sobre el inserto de siRNA (o siRNA) . Los Ad-siRNA objetivos fueron preparados utilizando la células PerC6 (Crucell, Leiden, Holanda) a un nivel de placa de 96 pozos, seguido por la reselección de estos virus a diversas MOIs en el ensayo primario (ver ejemplo 1) y por secuenciamiento de los siRNAs codificados por los virus objetivo de Ad-siADN. Las células perC6/E2A fueron sembradas en placas de 96 pozos a una densidad de 40 000 células por pozo en 180 µl del medio PerC6/E2A. Las células fueron luego incubadas toda la noche a 39aC en una incubadora humidificada con 10% de C02. Un día después, las células fueron infectadas con 1 µl del lisado celular crudo proveniente de las reservas de SilcenSelect que contenían los Ad-siRNAs objetivo. Las células fueron incubadas adicionalmente a 34SC, con 10% de C0 hasta la aparición del efecto citopático (como se reveló por el hinchamiento y el redondeo de las células, típicamente 7 días después de la infección) . El sobrenadante fue recolectado y el lisado crudo del virus fue tratado con proteinasa K: 12 µl del lisado crudo fueron agregados a 4 µl del amortiguador de lisis (amortiguador lx Expand High Fidelity con cloruro de magnesio (Roche Molecular Biochemicals, Cat. No. 1332465) suplementado con 1 mg/ml de proteinasa K (Roche Molecular Biochemicals, Cat No. 745 723) y 0.45% de Tween-20 (Roche Molecular Biochemicals, Cat No. 1335465) en tubos de PCR estériles. Estos fueron incubados a 55aC por 2 horas, seguido por un paso de inactivación de 15 minutos a 95aC. Para la reacción de PCR, se agregó 1 µl de lisado a una mezcla maestra de PCR compuesto de 5 µl del amortiguador Expand High Fidelity lOx con cloruro de magnesio, 0.5 µl de mezcla de dNTP (10 mM para cada Dntp) , 1 µl del "cebador delantero" (reserva 10 mM, secuencia 5' CCG TTT ACG TGG AGA CTC GCC, SEQ ID No . : 311), 1 µl del "cebador inverso" (reserva de 10 M, secuencia 5' CCC CCA CCT TAT ATA TAT TCT TTC C, SEQ ID No.: 312), 0.2 µl de la ADN-polimerasa Expand High Fidelity (3.5 U/µl, Roche Molecular Biochemicals) y 41.3 µl de agua. Se realizó la PCR en un sistema 9700 de PCR PE Biosystems GeneAmp como sigue: la mezcla de PCR (50 µl en total) se incubó a 95SC por 5 minutos; cada uno de los 35 ciclos subsiguientes corrieron a 95aC por 15 segundos, 55aC por 30 segundos, 68SC por 4 minutos. Se realizó una incubación final a 68aC por 7 minutos. 5 µl de la mezcla de PCR se mezclaron con 2 µl de 6x amortiguador de carga en gel, cargado sobre un gel de agarosa al 0.8% que contenía 0.5 µg/µl de bromuro de etidio para resolver los productos de amplificación. El tamaño de los fragmentos amplificados fue estimado a partir de una escalera de ADN estándar cargada sobre el mismo gel . El tamaño esperado fue de aproximadamente 500 pares de bases. Para el análisis de secuenciamiento, las construcciones de siRNA expresadas como los adenovirus objetivo fueron amplificadas por PCR utilizando cebadores complementarios a las secuencias vector que flanquean el sitio SapI humano del plásmido pIPspAdapt6-U6. La secuencia de los fragmentos de PCR fue determinada y comparada con la secuencia esperada. Ejemplo 5. Análisis de la suprarregulación del mARN de AP óseo endógeno versus aquel del mARN de AP placentario o intestinal BAP es la AP fisiológicamente relevante involucrada en la formación del hueso. Con el fin de determinar las actividades de AP medidas fueron debidas a la suprarregulación de la expresión de BAP o de otro producto del gen AP, los niveles de mRNA para todos los genes AP fueron analizados para las MPCs analizadas . Los niveles de mRNA fueron determinados como se describen en las secciones previas. La diferencia es en el primer grupo utilizado (ver tabla 1) : un grupo detecta la expresión de mRNA BAP ALPL (fosfatasa alcalina humana hígado/hueso/riñón) . Otro grupo detecta la expresión de otros 3 genes AP (ALPI (fosfatasa alcalina intestinal humana) , ALPP (fosfatasa alcalina humana placentaria (PLAP) ) , y ALPPL2 (fosfatasa alcalina humana similar a la placentaria) . ALPI, ALPP y ALPPL2 son altamente similares al nivel de los nucleótidos y pueden por lo tanto ser amplificadas utilizando un par de cebadores . El par de cebadores fue primeramente validado sobre el ARN aislado de los MPCs infectados con Ad-eGFP y Ad-BMP2. La figura 7 ilustra la fuerte suprarregulación del mRNA de BAP por Ad-BMP2 y la ausencia de suprarregulación de la expresión de cualguiera de los otros genes de AP. Las MPCs fueron infectadas en formato de placa de 24 pozos utilizando Ad-eGFP (control negativo) o Ad-BMP2 osteogénico. Las células fueron cosechadas y el ARN fue preparado y sometido a rtRT-PCR utilizando grupos de cebadores amplificando el mRNA de BAP y el mRNA proveniente de otros 3 genes de PA (PLAT/IAP) . Ad-BMP2 suprarregula fuertemente los niveles de mRNA de BAP pero los niveles de mRNA de los otros 3 genes de AP. Ambos grupos de cebadores fueron luego utilizados para medir los niveles de mRNA para todos los genes de AP en el ARN aislado de las MPCs infectadas con Ad-siRNA Tabla 1: Grupos del cebador AP Ejemplo 6. Mineralización El proceso de osteogénesis consiste de varios eventos sucesivos. Durante las fases iniciales de la osteogénesis, la fosfatasa alcalina ósea (BAP) llega a ser suprarregulada. No obstante, es igualmente importante ver los eventos específicos que ocurren en las etapas tardías de la osteogénesis tales como la mineralización. Establecimiento del ensayo El proceso de osteogénesis consiste de varios eventos sucesivos . Durante las fases iniciales de la osteogénesis, la fosfatasa alcalina ósea (BAP) se llega a suprarregular . Posteriormente, durante la diferenciación, las células depositan hidroxiapatita (de fosfato precipitado Ca2+) sobre una matriz extracelular que consiste principalmente de colágeno tipo I para formar un hueso mineralizado. En el ensayo de mineralización de células óseas (ensayo BM) , las MSCs primarias humanas son diferenciadas in vitro en osteoblastos en mineralización utilizando BMP2 (recombinante o administrado por transducción adenoviral) como un agente osteogénico. La mineralización es luego visualizada mediante la tinción de las MSCs con rojo de alizarina, un colorante con una alta afinidad por el calcio (ver figura 8) . Selección y llamada de acierto Se utilizó el siguiente procedimiento optimizado para la selección de los objetivos de Ad-siRNA y Ad-cDNA identificados en el ensayo primario: 100,000 MPCs fueron sembradas en cada pozo de una placa de 6 pozos en 2 ml de medio MSC, que contenía 10% de FCS. Al siguiente día, después de la incubación a 37SC, 10% de C02 en una incubadora modificada, las células fueron coinfectadas con AdCl6~hCAR (MOI final de 750) y Ad-siRNA, Ad-cDNA o virus control a una MOI final de 1250, 2500 y 5000. Las células fueron incubadas a 37SC, al 10% de C02, en una incubadora humidificada por seis días adicionales. El virus fue removido y reemplazado con 2 ml de medio MSC fresco, 10% de FCS. En los siguientes 22 días, el medio fue refrescado 3 veces en 2 semanas. Cada tercer día, el medio fue reabastecido a la mitad o completamente. A los 28 días después del inicio del experimento, el medio condicionado fue retirado, las células fueron fijadas utilizando paraformaldehído al 10% y las monocapas teñidas con 1 ml de rojo de alizarina ~ 1% (Sigma, #A5533) en agua MilliQ (pH ajustado a 4.2). Ad-eGFP, para evaluar la eficiencia de infección, Ad-BMP2 como fuerte inductor osteogénico y Ad-H4-2 como un factor osteogénico débil fueron incluidos en cada experimento como controles negativo y positivo, respectivamente. Cada experimento donde Ad-H4-2 no indujo la mineralización fue completamente repetido . Los Ad-shRNAs que indujeron mineralización son presentados en la tabla 2. Ejemplo 7. Descubrimiento de fármaco contra los objetivos identificados Los compuestos son seleccionados para el enlace a los polipéptidos de la presente invención. La afinidad de los compuestos a los polipéptidos es determinada en un experimento o desplazamiento. Tales experimentos de desplazamiento son bien conocidos en la técnica y pueden ser considerados como una técnica común entre otras para identificar los compuestos que se enlazan a los polinucleótidos. En resumen, los polipéptidos de la presente invención son incubados con un ligando marcado (radio-marcado, marcado fluorescentemente o marcado con anticuerpo, o cualquier otro marcador detectable) que es conocido por enlazarse al polipéptido y es además incubado con un compuesto no marcado. El desplazamiento del ligando marcado a partir del polipéptido es determinado por la medición de la cantidad de ligando marcado, que está asociado con el polipéptido. La cantidad de ligando marcado asociado con el péptido es una indicación de la afinidad para el compuesto no marcado. La cantidad del ligando marcado asociado con el polipéptido es trazado gráficamente contra la concentración del compuesto no marcado, para calcular los valores de IC50. Este valor refleja la afinidad de enlace del compuesto no marcado a su objetivo, por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención. Los compuestos son considerados fuertes enlaces o aglutinantes, cuando tienen una IC50 en el intervalo nanomolar o incluso picomolar. Los compuestos que tienen una IC50 de al menos 10 micromol o incluso mejor en el intervalo de nmol a pmol son aplicados ya sea en el ensayo de fosfatasa alcalina ósea (BAP) y/o en ensayos para determinar su efecto sobre la inducción de los marcadores de osteoblastos y la función de los osteoblastos. Los compuestos con un IC50 menor son en general considerados como de menor interés . Los polipéptidos de la presente invención pueden ser preparados en un número de formas dependiendo de si el ensayo correrá sobre las células, las fracciones celulares o bioquímicamente, sobre proteínas purificadas. Tales preparaciones son bien conocidas en la técnica, como lo son los diferentes ensayos. Ejemplo 8. Ensayos de osteoclastos: validación de actividad antirresortiva de los objetivos identificados A todo lo largo de la vida, el esqueleto está en un estado constante de remodelación. Las áreas focales del hueso son resorbidas por los osteoclastos y luego reemplazadas por matriz ósea recién formada por los osteoblastos. El desarrollo de la osteoporosis está caracterizado por pérdida ósea severa debida a ' la desregulación del balance entre la actividad de los osteoclastos y los osteoblastos, conduciendo a una resorción ósea mediada por osteoclastos, incrementada. Los osteoclastos emanan de las células de la línea de los monocitos/macrófagos . In vivo, la diferenciación de las células precursoras de osteoclastos hacia los osteoclastos, es controlada por dos factores centrales expresados por las células estromales (MPCs) : el activador del receptor del ligando NFKB (RANKL) y la osteoprotegerina (OPG) . RANKL es un ligando enlazado a la membrana, expresado sobre la superficie de las MPCs que impulsa la diferenciación de los osteoclastos. OPG es un receptor de señuelo soluble para RANKL que inhibe la diferenciación de los osteoclastos al depurar el RANKL activo. El balance entre la expresión de RANKL y OPG por las MPCs determina el nivel de diferenciación de los osteoclastos.
Ya que las MPCs controlan la diferenciación de los osteoclastos, es importante conocer el efecto de los Ad-siRNAs objetivo, identificados, sobre la diferenciación o actividad de los osteoclastos. Los Ad-siRNAs objetivo que disminuyen la diferenciación/actividad de los osteoclastos, son muy valiosos, ya que se espera que éstos incrementen la aposición ósea por dos mecanismos : el incremento de la diferenciación/actividad de los osteoblastos y disminución en la . actividad de los osteoclastos. Como se ilustra por diversos precedentes (Thirunavukkarasu et al., (2000) J Biol Chem 275:25163-72; Yamada et al., (2003) Blood 101:2227-34) tal efecto pleyotrópico de los factores osteogénicos puede ser esperado. Ensayo de diferenciación de osteoclastos El efecto de los factores osteogénicos sobre la osteoclastogénesis es evaluada a través de dos tipos de ensayos . En una primera preparación de ensayo, un cocultivo de las MPCs con células mononucleares humanas primarias es realizado. Es evaluado el efecto de la infección de la monocapa MPC con un virus desensamblado sobre su capacidad para soportar la osteoclastogénesis. El efecto deseado es el siguiente: el desensamble de la expresión del gen objetivo de Ad-siRNA en las MPCs debe inhibir la diferenciación de osteoclastos impulsada por un disparador fisiológico, por ejemplo, una mezcla de 1,25 (OH)2vitD3 y M-CSF 50 nM. Los monolitos utilizados pueden ser derivados de la médula ósea o de la sangre periférica. En el presente ejemplo, un experimento de diferenciación basado en células mononucleares derivadas de sangre periférica (PBMCs, por sus siglas en inglés), es descrito. Las MPCs (obtenidas de Cambrex/Biowhittaker, Verviers, Bélgica) son sembradas en placas de 96 pozos (1000 células por pozo) en el medio a-MEM (GBICO-Life Technologies) suplementado con 10% de FBS y un día después, éstas son infectadas con un Ad-siRNA objetivo. Al menos tres días después, 100 000 PBMCs por pozo son agregadas, así como M-CSF (R&D systems, concentración final de 50 ng/ml) . La mitad del volumen del medio es reabastecida dos veces a la semana por medio + 50 ng/ml de M-CSF y 1, 25 (OH) 2vitD3 10 nM. La lectura es realizada 14 días después de la adición de las PBMCs al cocultivo. La diferenciación espontánea de los osteoclastos impulsada por la mezcla fisiológicamente relevante de disparadores, puede ser evaluada por múltiples lecturas . La evaluación microscópica del número de células multinucleadas "positivas a TRAP" , por pozo, es una medida en general aceptada para el nivel de diferenciación de osteoclastos. "Positiva a TRAP" significa que las células poseen una actividad de fosfatasa acida resistente al tartrato (TRAP) . Para evaluar esto, el cocultivo es sometido a una tinción de TRAP in situ realizada de acuerdo al equipo de detección de fosfatasa acida (SIGMA, 386-A) . Las células positivas adquieren un color púrpura después del tratamiento. Como una lectura alternativa, se mide un marcador específico para los osteoclastos maduros, por ejemplo TRACP5b (fosfatasa acida resistente al tartrato tipo 5b) , receptor de calcitonina (CTR) o catepsina K (CTSK) . La medición de las cantidades de proteína fosfatasa acida resistente al tartrato derivada de osteoclastos (TRACP5b) en el sobrenadante de cocultivo es realizada por un ensayo de ELISA comercialmente disponible (ensayo BoneTRAP, Sba sicences, Turku, Finlandia) . CTR o CTSK son detectados por inmunocitoquímica, después de la aplicación del siguiente protocolo general . El medio es removido y el cocultivo es fijado (4% de paraformaldehído, 0.1% de TritonX-100, 4aC, 30 minutos) , lavado y con amortiguador de bloqueo (PBS + 1% de BSA + 1% de Tween 20) se agrega para una incubación de al menos 4 horas . El amortiguador de bloqueo es eliminado y el anticuerpo primario es dirigido contra CatepsinK (por ejemplo, Oncogene, IM55L) o el receptor de calcitonina (por ejemplo, Serotec, AHP635), disuelta a la concentración deseada en un amortiguador adecuado (por ejemplo, 0.05 M Tris.HCl pH 7.4, 1% de BSA), es agregado a los pozos. La incubación es realizada toda la noche, a 4aC. La mezcla es retirada, la célula es lavada (PBS + 0.1% de Tween 20) y el anticuerpo secundario adecuado, conjugado al HRP, diluido en el mismo amortiguador como el anticuerpo primario, es agregado. Después de una incubación de al menos 4 horas, se realiza un paso de lavado (PBS + 0.1% de Tween 20) y se agrega luminol (un sustrato para HRP que produce una señal luminiscente: sustrato para ELISA de quimioluminiscencia BM [POD] (luminol), Roche Diagnostics, CA No 1582950) es agregado. Después de 5 minutos de incubación, se realiza la lectura con un luminómetro (Luminoskan Ascent, Labsystem) . Los 2 ensayos descritos (evaluación de la cantidad de células multinucleares e inmunoquímica para la detección de los marcadores específicos de osteoclastos) permite evaluar la diferenciación de las células mononucleares hacia los osteoclastos, pero no produce información respecto a la actividad resortiva ósea de los osteoclastos formados. La actividad de los osteoclastos es medida en el ensayo de formación de hoyuelos. Para este propósito, el cocultivo y la infección de las células se realiza como se describen para los ensayos descritos anteriormente, con la diferencia de que está presente un sustrato similar al hueso en el fondo del pozo en el cual se realiza el cocultivo. Este sustrato similar al hueso puede ser una rebanada de dentina (por ejemplo, Kamiya Biomedical Company, Seattle (Cat No. KT018) ) o equivalente (recubrimiento de carbonato de calcio, OAAS1*, Gentaur; Biocoat1®' Osteológicas BD Biosciences) que es comercialmente disponible. El cocultivo es realizado por al menos 14 días sobre el sustrato similar al hueso . Las células son luego removidas por tratamiento con hipoclorito de sodio y el área resorbida por los osteoclastos (el hoyuelo de resorción) puede ser evaluado microscópicamente. Esto puede ser facilitado por el tratamiento de la superficie de la rebanada de dentina con azul de toluidina. En un segundo arreglo de ensayo, se mide en un ensayo de inmunocultivo el efecto de la infección de las células precursoras de los osteoclastos (PMBCs o BMMCs) con un virus de colisión sobre su habilidad para diferenciarse hacia un osteoclasto. Para este propósito, se siembran los monolitos (PBMCs o BMMCs) en una placa de 384 pozos en medio aMEM suplementado con 10% de suero y 25 ng/ml de M-CSF (R&D systems) . Un día después de la siembra, las células son infectadas con los Ad-siRNAs objetivo. Cuatro días después de la infección, se agrega RANKL recombinante a los pozos (25 ng/ml, R&D systems) . El medio es reabastecido dos veces a la semana. Catorce días después de la adición de RANKL, se mide la diferenciación de los monocitos hacia los osteoclastos, utilizando una de las lecturas descritas para el primer arreglo de ensayo. Este ensayo permite la identificación de factores que son indispensables para la respuesta de las células precursoras de osteoclastos para M-CSF o RANKL. Aislamiento de PBMC Las PMBCs son obtenidas de sangre periférica (obtenidas de pacientes después del consentimiento informado) sometidas al siguiente protocolo. La sangre es asépticamente vaciada en tubos Falcon de 50 ml y centrifugada a 3000 g por 10 minutos a 25=C. La capa amarillenta diluida es luego recolectada y diluida con PBS 1:1. La capa amarillenta diluida es vaciada sobre la parte superior de 20 ml del Lymphoprep (Sigma) contenido en un tubo Falcon de 50 ml. Después de la centrifugación (3 5 minutos a 400 g a 25aC) , una capa blanca de células mononucleares sobre la parte superior de Lymphoprep es recolectada lavada dos veces con PBS (centrifugación a 200 g, 10 minutos, 25aC) y rediluida en 7 ml de PBS. Esta solución es transferida con pipeta sobre una capa de 7 ml de gradiente de Percoll hiperosmolar contenido en un tubo Falcon de 15 ml, y centrifugado en 35 minutos a 400 g a 25SC. El gradiente de Percoll hiperosmolar es preparado como sigue: 1 volumen de NaCl 1.5 M y 9 volúmenes de Percoll (Pharmacia, d = 1,130 g/ml) son mezclados. Esta mezcla es agregada 1:1 a un amortiguador de PBS/citrato (NaH2P04 1.49 Mm, Na2HP04 0.15 mM, cloruro de sodio 139.97 mM, citrato de sodio (dihidratado) 13 mM, pH 7.2). Después de la centrifugación, los monocitos forman un anillo discreto sobre la parte superior del gradiente. Los monocitos son recolectados y lavados en el medio de cultivo. Las células están luego listas para utilizarse en los ensayos. Ejemplo 9. Análisis del efecto de desensamble "fuera de objetivo" Los siRNAs ejercen el desensamble de la expresión del gen a través de un mecanismo recientemente descubierto y parcialmente comprendido . Se acepta que en general el recocido específico de las secuencias de siRNA al mRNA es responsable de un desensamble "sobre objetivo" específico del gen. No obstante, no puede ser excluido todavía que el mal acoplamiento limitado entre el siRNA y otro mRNA pueda inducir subregulación "fuera de objetivo" de la expresión del gen. Con el fin de excluir que el desensamble de uno o varios mRNAs "fuera de objetivo" fue responsable del efecto osteogénico observado, se diseñaron siRNAs/shRNAs adicionales para 5 objetivos (tabla 2B) que indujeron mineralización utilizando criterios de diseño exigentes . Los Ad-shRNAs adicionales fueron luego probados en el ensayo de BAP. Galápagos ha desarrollado un algoritmo propietario que incorpora los criterios de diseño publicados y de propietario (los algoritmos de Galápagos incorporan los criterios publicados para el diseño de siRNA tales como las reglas de Tuschl y las reglas de Reynolds et al., Nat. Biotechnol. 2004 Mar; 22 (3 ): 326-30) . Las últimas incluyen los criterios tales como la baja estabilidad interna termodinámica en el extremo antisentido 5 ' de la secuencia de RNAi y el "contenido de GC"). Para dirigirse a la cuestión de los posibles efectos "fuera de objetivo", fueron diseñadas secuencias adicionales de siRNA que: - se alinean perfectamente con el mRNA objetivo por el siRNA original que puede alinearse imperfectamente (máximo de no identidad de 2 pares de bases verificada para cada posición del 19mer) con un mínimo de mRNAs "fuera de objetivo" tal que • los mRNAs putativos "fuera de objetivo" eran diferentes de los mRNAs "fuera de objetivo" putativos identificados para el siRNA original • los mRNAs putativos "fuera de objetivo" eran diferentes de los mRNAs "fuera de objetivo" putativos identificados para todos los siRNA objetivo originales, excepto para los siRNAs adicionales diseñados para PPIA 7 siRNAs adicionales, diseñados para cada uno de los cinco genes objetivo seleccionados fueron procesados para derivar los adenovirus recombinantes. Todos los siRNAs fueron secuenciados después de la clonación, para verificar su identidad y excluir los errores debidos a la síntesis del oligonucleótido . 34 Ad-shRNAS fueron exitosamente generados y probados en el ensayo de BAP a 3 MOIs en 2 experimentos independientes, en paralelo con los 5 Ad-shRNAs originales. Los adenovirus recombinantes que codifican para los shRNAs diseñados (Ad-shRNAs) fueron producidos, titulados, transferidos en alícuotas a placas de 96 pozos y almacenados a -80aC. Estas placas fueron procesadas en el ensayo de BAP primario como sigue.
Células MPC fueron sembradas con un Multidrop 384 (Labsystems) en placas negras de 384 pozos con el fondo claro (Costar o Nunc) en 60 µl de medio MSC que contenía 10% de suero fetal de ternera (FCS) (medio de propietario de progentix, Holanda) , a una densidad de 500 células por pozo.
Un día después, una placa de 96 pozos que contenía Ad-shRNAs en alícuotas y otra que contenía los virus control negativo y positivo (placa control desensamblada, figura 3) se descongelaron y las alícuotas de virus se transfirieron a la placa de MPC utilizando un surtidor de 96 canales (Tecan Freedom 200 equipado con un manejador de placas TeM096 y RoMa, Tecan AG, Suiza) (figura 9) . Para la placa control, 1 µL de la reserva viral (título promedio de 2 x 109 partículas virales por ml) se transfirió a las placas de selección de 384 pozos. Los Ad-shRNAs fueron seleccionados a 3 multiplicidades de infección (MOIs): 12,000, 4.000 y 1,333. Los virus fueron transferidos de la placa de reserva de 96 pozos a tres placas de selección de 384 pozos (figura 9) . En seguida, 5 µl del adenovirus que expresa el receptor de coxsackie human y adenovirus (Hcar) (AdCl5-hCAR/AdC20-hCAR) se transfirió a estos pozos (MOI final de 155) desde una placa de 96 pozos de fondo en V, con la ayuda del surtidor de 96 canales. Las placas fueron luego incubadas a 37SC, con 10% de C02, en una incubadora humidificada por cuatro días. Cuatro días después de la infección, el medio que contenía los adenovirus fue reemplazado por 60 µl de medio MSC fresco que contenía 10% de FCS libre de virus. Después de nueve días adicionales de incubación, el medio se retiró, se agregaron 15 µL de una solución de 4-metilumbeliferilfosfato (Sigma, # M3168) , a cada pozo, y se midió la fluorescencia de la 4- metil-umbeliferona liberada por la actividad de fosfatasa alcalina, después de 15 minutos de incubación a 37 aC utilizando un fluorímetro (excitación: 360 nm; emisión: 440 nM FluoStar, BMG) . Todos los Ad-shRNAs fueron seleccionados por duplicado a 3 MOIs en dos selecciones idénticas pero independientes . Los umbrales fueron calculados para la llamada de acierto utilizando todos los controles negativos presentes en una ronda de selección (análisis "global") o utilizando los controles negativos presentes sobre una placa de selección (análisis "local"). Los aciertos fueron llamados de acuerdo a los siguientes criterios de selección: 1) señales BAP más altas que la media más 3 veces (µ + 3 s) la desviación estándar de los controles negativos. Los dos puntos de datos individuales para cada virus en el lote fueron analizados independientemente. 2) las señales BAP positivas como se definen por el criterio 1 fueron uno donde Ad-shqRNAs califica para al menos una MOI por duplicado, y en al menos una de las dos selecciones.
Un análisis "global" de los datos identificó 8 siRNAs que se dirigen a 5 locus y un "análisis local" identificó 9 siRNAs que se dirigen a 5 locus . La identidad de los 5 genes seleccionados es presentado en la tabla 3 junto con el número final de siRNAs que calificaron en el ensayo BAP . Todos los 5 Ad-shRNAs originales calificados en el ensayo BAP estuvieron basados en el análisis "global" y "local" . Tabla 3 . Identificación de múltiples siRNAs para obj etivo validados , seleccionados , en el ensayo BAP . ID del gen Redundancia de Redundancia de ID del gen Redundancia de Redundancia análisis global análisis local análisis global de análisis local AGTRL1 2 3 GPR39 3 3 DRD5 3 3 PDE11A 3 3 ENSG00OOO172441 2 2 En la tabla 3, los números indican todos los siRNAs que calificaron en el ensayo BAP, incluyendo los 5 siRNAs originales . En conclusión, los Ad-shRNAs adicionales que se dirigen a 5 objetivos seleccionados, fueron diseñados y construidos. Los controles negativos presentes sobre las placas control fueron utilizados por placa (análisis "local") o por lote de placas (análisis "global") para determinar el corte para el acierto (µ + 3 s) . el análisis "global" dio como resultado 8 virus que calificaron positivos en el ensayo BAP, confirmando 5 de los 5 objetivos validados el análisis "local" dio como resultado 9 virus que calificaron positivos en el ensayo BAP, confirmando 5 de los 5 objetivos validados todos los 5 virus Ad-shRNA originales calificados en el ensayo BAP cuando se utiliza el análisis "global" o el análisis "local". La tabla 2A lista los polipéptidos, polinucleótidos y las construcciones desensambladas de la presente invención. SEQ ID No . : 1 Tabla 2B. Adición al resumen de los polinucleótidos, polipéptidos y construcciones desensambladas de la invención VoO 10 15 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para identificar un compuesto que induce la diferenciación de células de mamífero no diferenciadas, en osteoblastos, caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto un compuesto con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 194-309; y (b) medir una propiedad del compuesto-polipéptido relacionada a la diferenciación de las células . 2. El método de conformi ad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es una preparación libre de células in vi tro . 3. El método de conformi ad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido está presente en una célula de mamífero. 4. El método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque la propiedad es una afinidad de enlace del compuesto hacia el polipéptido. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la propiedad es la activación de una vía biológica que produce un marcador bioquímico indicador de la diferenciación de las células. 6. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el marcador biológico es la fosfatasa alcalina ósea. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 199, 230, 237, 262 y 281. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste de los compuestos de una biblioteca de selección comercialmente disponible, y los compuestos que tienen afinidad de enlace por un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 194-309. 9. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto es un péptido y una biblioteca de visualización de fago o una biblioteca de fragmentos de anticuerpo . 10. Un agente para inducir la diferenciación de células de mamífero no diferenciadas, en osteoblastos, seleccionado del grupo que consiste de un polinucleótido antisentido, una ribozima, y un ARN de interferencia pequeña (siRNA) , caracterizado porque el agente comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a, o manipulada por ingeniería genética de, una secuencia polinucleotídica de origen natural que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 194-309. 11. El agente de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 199, 230, 237, 262 y 281. 12. El agente de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque un vector es una célula de mamífero que expresa dicho agente. 13. El agente de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el vector es un vector adenoviral, retroviral, viral, adenoasociado, lentiviral, viral del herpes simple o sendaviral . 14. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el polinucleótido antisentido y el siRNA comprenden una hebra antisentido de 17 a 25 nucleótidos, complementaria a una hebra en sentido, en donde la hebra en sentido se selecciona de 17 a 25 nucleótidos continuos de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 78- 15. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque el siRNA comprende además la hebra en sentido. 16. El agente de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la hebra en sentido se selecciona de 17-25 nucleótidos continuos de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 83, 114, 121, 146 y 165. 17. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, caracterizado porque el siRNA comprende además una región de bucle que conecta la hebra en sentido y antisentido. 18. El agente de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la región de bucle comprende una secuencia de ácido nucleico definida por la SEQ ID No.: 310. 19. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, caracterizado porque el agente es un polinucleótido antisentido, ribozima o siRNA que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 1-77. 20. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19, caracterizado porque el agente es un polinucleótido antisentido, ribozima o siRNA que comprende una secuencia de ARN seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. : 69-77. 21. Una composición farmacéutica de aumento de la formación ósea; caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-20, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. 22. El uso de un agente de conformidad con las reivindicaciones 10 a 20, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad que involucra una disminución en la densidad ósea media. 23. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde la enfermedad se selecciona de un grupo que consiste de osteoporosis, hipercalcemia de malignidad, mielomatosis múltiple, hiperparatiroidismo, e hipertiroidismo. 24. El uso de conformidad con la reivindicación 23 ó 26, en donde la enfermedad es osteoporosis.
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