WO2014129550A1 - 骨分化誘導方法及び骨化促進・抑制分子のスクリーニング方法 - Google Patents

骨分化誘導方法及び骨化促進・抑制分子のスクリーニング方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a molecule that promotes or suppresses ossification using cells that differentiate into osteoblasts, and in particular, bone using cells from an individual suffering from progressive ossifying fibrodysplasia.
  • the present invention relates to a method for screening a molecule that promotes or suppresses crystallization.
  • the invention also relates to a method for inducing bone differentiation of such cells.
  • Bone is a dynamic tissue in which bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts are constantly repeated. It is known that when an abnormality occurs in the functional balance between osteoblasts and osteoclasts, this dynamic equilibrium state is broken and various bone metabolic disorders are caused. In recent years, research has been conducted on the use of bone regeneration ability in bone and cartilage damage and dental treatment. In bone formation, undifferentiated mesenchymal system aggregates and differentiates into chondroblasts, endochondral bone formation in which cartilage is formed as a template for forming bone, and mesenchymal cells aggregate and bone from inside There is membranous bone formation that differentiates into blasts, but in both cases it is said that osteoblasts are responsible for bone formation
  • Runx2 (CBFA1, AML3) is known as a transcription factor for inducing differentiation from stem cells to osteoblasts, and osterix is known as a transcription factor for promoting differentiation.
  • TGF ⁇ family growth factors such as bone morphogenetic protein (BMP) have already been found as regulatory factors for these transcription factors.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • BMP is a bone-inducing cytokine, and its signal is transmitted into cells by type I and type II serine / threonine kinase receptors, and further into the nucleus by phosphorylation of the transcriptional regulator Smad by type I receptors. Is done.
  • BMP signal deficiency has been shown to cause deficits and chondrogenic dysplasia, while excessive BMP signal has been shown to cause progressive ossifying fibrodysplasia (Fibrodysplasia ossificans progressiva; FOP).
  • FOP fibrodysplasia
  • FOP is one of the intractable diseases in which the soft tissues of the whole body become ossified, and it has not been established a treatment method that develops by 10 years old and dies by restrictive breathing disorder by about 40 years old ( Non-patent documents 1 to 3). It has been found that the cause is excessive hyperactivity abnormality caused by a point mutation of the ALK2 kinase gene, which is a BMP1 type receptor (Non-Patent Documents 3 to 9). The most common mutation is R206H, which is thought to alter ALK2 kinase activity, resulting in a constitutive increase in ALK2 kinase activity.
  • Non-Patent Document 10 It has been shown that the kinase activity of ALK2 (G356D) is weaker than that of ALK2 (R206H), and it is suggested that clinical changes are caused by differences in biological activity in ALK2 mutants (Non-patent Document 11). .
  • Non-patent document 12 Non-patent document 13
  • LDN-193189 a specific inhibitor of BMPI receptor kinase, reduces ectopic bone formation and dysfunction, which are the main symptoms of progressive ossification fibrodysplasia, in experiments using pathological model mice It is known to do (Non-Patent Document 14).
  • Non-Patent Documents 15 and 16 a method for efficiently differentiating into osteoblasts using ES cells derived from an individual has been tried but has not been developed yet. Therefore, it is possible to establish an efficient differentiation induction method for osteoblasts by differentiating ES cells into mesenchymal stem cells, then purifying and proliferating mesenchymal stem cells, and then differentiating them into osteoblasts. Attempts have been made (Non-Patent Documents 15 and 16).
  • fibroblasts derived from patients with progressive ossifying fibrodysplasia have four factors (Oct4, Sox2, KLF4, and c) as reprogramming genes.
  • the aspects of the present invention are as follows. 1. Presence of osteoinductive factor BMP-6 from somatic cells derived from individuals suffering from progressive ossifying fibrodysplasia into which an reprogramming gene for the generation of iPS cells has been introduced, or from passaged cells derived therefrom A method for inducing differentiation of somatic cells or cells derived therefrom into osteoblasts, comprising culturing under pressure. 2. 2. The method according to 1 above, wherein the somatic cell is a dermal fibroblast. 3. 3. The method according to 2 above, wherein the cell is a human cell. 4).
  • the cell has the following gene: 1) a gene encoding an amino acid sequence in which the 206th arginine is mutated to histidine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and / or 2) the 356th glycine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is aspartic acid
  • the reprogramming gene includes at least an Oct3 / 4 gene, a Klf4 gene, and a Sox2 gene. 6).
  • 6. The method according to 5 above, wherein the reprogramming gene further comprises a Myc gene. 7). 6.
  • the method according to any one of 1 to 5, wherein the cells are cultured in a medium containing BMP-6 at a concentration of 10 to 100 ng / ml.
  • a cell in which an early gene for producing an iPS cell is introduced into a somatic cell derived from an individual suffering from progressive ossifying fibrodysplasia or a subcultured cell derived therefrom is designated as an osteoinductive factor BMP. Culturing in the presence of ⁇ 6 and the test substance; and b) selecting test substances that inhibit or promote ossification by assessing the ossification of the cells: Screening method for ossification control (promoting or suppressing ossification) molecules.
  • the somatic cell is a dermal fibroblast.
  • the cell is a human cell.
  • the cell has the following gene: 1) a gene encoding an amino acid sequence in which the 206th arginine is mutated to histidine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and / or 2) the 356th glycine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is aspartic acid
  • a gene encoding an amino acid sequence mutated into The method according to any one of 8 to 10, which comprises: 12 The method according to any one of 8 to 11, wherein the reprogramming gene includes at least an Oct3 / 4 gene, a Klf4 gene, and a Sox2 gene. 13. 13. The method according to 12 above, wherein the reprogramming gene further comprises a Myc gene. 14 The method according to any one of 8 to 13, wherein the cells are cultured in a medium containing BMP-6 at a concentration of 10 to 100 ng / ml.
  • the following genes 1) Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, and Sox2 gene, which are reprogramming genes for generating iPS cells, and 2) A gene encoding an amino acid sequence in which the 206th arginine is mutated to histidine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and / or the 356th glycine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is mutated to aspartic acid
  • An ALK2 mutant gene comprising a gene encoding the determined amino acid sequence, Cell-derived cells (somatic cells (preferably dermal fibroblasts) or iPS cells) into which the cells have been introduced are cultured in the presence of the osteoinductive factor BMP-6. Guidance method. 16. 16. 16.
  • the following genes 1) Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, and Sox2 gene, which are reprogramming genes for generation of iPS cells, and 2) A gene encoding an amino acid sequence in which the 206th arginine is mutated to histidine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and / or the 356th glycine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is mutated to aspartic acid
  • An ALK2 mutant gene comprising a gene encoding the determined amino acid sequence, A mammal-derived cell (somatic cell (preferably skin fibroblast) or iPS cell) into which is introduced, Cells that differentiate into osteoblasts by culturing in the presence of osteoinductive factor BMP-6 (preferably at a concentration of 10-100 ng / ml, more preferably about 50 ng / ml). 20. 20. The cell according to 19, wherein the cell derived from the mammal is further introduced with a Myc gene as an reprogramm
  • a kit for screening a substance for controlling ossification (promoting or suppressing ossification), the cell according to any one of the above 19 to 21, the osteoinductive factor BMP-6, and a culture medium for culturing the cell A kit containing a medium.
  • the present invention molecules involved in the control (promotion or suppression) of ossification can be screened with a relatively simple in vitro (cell level) screening system.
  • the present invention also provides a screening method that can be used as a drug screening system that can easily and efficiently obtain drug candidates related to bone diseases.
  • LDN193189 and Dorsomorphin which are ALK2 kinase inhibitors with respect to the osteoblast induction of the skin fibroblast derived from a FOP patient (F206H mutation patient and a G356D mutation patient) in presence and absence of BMP-6. . It is the result of detecting osteoblasts by ALP staining after 2 weeks of culture. It is the result of having measured the influence of ALP activity by each BMP (BMP-4, 6 and 7) process with respect to a healthy person and a skin fibroblast derived from a FOP patient.
  • the control is APL activity without BMP in healthy human dermal fibroblasts.
  • iPS cells of a healthy person were used.
  • the present invention is a cell in which an early gene for producing an iPS cell is introduced into a dermal fibroblast derived from an individual suffering from progressive ossifying fibrodysplasia (or a cell passaged from the cell). Culturing in the presence of the osteoinductive factor BMP-6 and a test substance, and evaluating the ossification of the cells, thereby selecting a test substance that suppresses or promotes ossification
  • the present invention relates to a screening method for a control (promoting or suppressing ossification) substance.
  • osteoblasts can be detected by, for example, alkaline phosphatase (ALP) staining.
  • ALP alkaline phosphatase
  • iPS cell establishment is difficult from skin fibroblasts of patients with progressive ossifying fibrodysplasia (FOP) used in one embodiment of the present invention (non-) Patent Document 17).
  • FOP progressive ossifying fibrodysplasia
  • iPS cell establishment is difficult even if a reprogramming gene described later is introduced into a patient-derived cell (somatic cell) and induced into an induced pluripotent stem cell (iPS cell) by a conventional technique. This means that iPS cells cannot be produced, or induced pluripotent stem cells appear only with extremely low efficiency.
  • iPS cell colonies are completely absent on the media. It does not appear, or it means that the formation frequency of iPS cell colonies on the medium is very low compared to the case where iPS cells are induced from cells derived from healthy solids.
  • reprogramming genes in particular, Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, Sox2 gene, and c-Myc gene
  • reprogramming genes are introduced into cells derived from patients with the disease, and 1-2 ⁇ per 100 mm dish.
  • the number of colonies formed is smaller than that when iPS cells are induced from cells derived from healthy solids. This means that the number of iPS cell colonies to be performed is, for example, 50 or less.
  • ALK2 gene ALK2 gene
  • the nucleotide sequence of human ALK2 gene mRNA Homo sapiens activin A receptor, type I (ACVR1), transcript variant 1, mRNA
  • the base sequence of the CDS region is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • this base mutation causes the 206th arginine to be mutated to histidine (R206H) in the amino acid sequence of the protein encoded by the ALK2 gene.
  • R206H histidine
  • the 1067th base in the nucleotide sequence of the CDS region was mutated from guanine (G) to adenine (A), and the amino acid sequence from the 356th glycine.
  • G356D A case of mutating to asparagine
  • ALK2 kinase functions as a single transmembrane receptor of BMP (Bone morphogenetic protein) known as a growth factor that induces bone tissue, and when activated by binding to BMP in the extracellular region, it activates and generates a bone formation signal in the cell. introduce. In healthy individuals, ALK2 kinase is inactivated “off” in the absence of BMP binding, whereas in FOP patients ALK2 kinase is activated “on” even in the absence of BMP binding. In FOP, since ALK2 kinase is always in an activated state, it is thought that ectopic bone formation proceeds by transmitting a signal that promotes bone formation. .
  • BMP Ben morphogenetic protein
  • “individual” means a mammal, preferably a human.
  • the somatic cell includes all cells other than the inner germ cells of the cells constituting the living body, and may be a differentiated somatic cell or an undifferentiated stem cell.
  • “derived from” means that a cell collected from an individual may be used as it is in the method of the present invention to introduce the reprogramming gene, or a cultured cell line established by culturing the collected cell Means that an reprogramming gene may be introduced into the method of the present invention.
  • the cells When the cells are cryopreserved, they may be cryopreserved before introducing the reprogramming gene, or may be cryopreserved after introducing the reprogramming gene.
  • Specific examples of the cells in the present invention include dermal fibroblasts obtained by culturing skin collected from an individual suffering from a disease.
  • a cell in the present invention a cell containing a gene encoding ALK2 kinase having the mutation of R206H and / or G356D described above can be used.
  • a human cell containing a gene encoding ALK2 kinase having a mutation of R206H and / or G356D in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be used.
  • the gene encoding ALK2 kinase having these mutations can be introduced into any cell by a conventional method, and such a cell can be used in the same manner. By introducing the reprogramming gene into these cells, it can be used in the method of the present invention.
  • the “cell into which the reprogramming gene has been introduced or the cell from which the cell has been passaged” refers to the above-described cell into which the reprogramming gene has been introduced as it is, for example, in the screening method of the present invention.
  • a cultured cell or a cultured cell line obtained by introducing a reprogramming gene and then culturing cells and subcultured may be used in the method of the present invention.
  • a cell into which the reprogramming gene has been introduced or a cell in which the reprogramming gene has been introduced may be cryopreserved, and the cells may be thawed and cultured if necessary and used in the method of the present invention.
  • the iPS cell can be used in the method of the present invention after culturing the cell into which the reprogramming gene has been introduced under conditions capable of generating an iPS cell as described later, and then producing the iPS cell.
  • the reprogramming gene is a gene encoding a reprogramming factor that has the action of reprogramming somatic cells to become iPS cells.
  • Specific examples of the combination of reprogramming genes include the following combinations, but are not limited thereto.
  • (I) Oct gene, Klf gene, Sox gene, Myc gene (ii) Oct gene, Sox gene, NANOG gene, LIN28 gene (iii) Oct gene, Klf gene, Sox gene, Myc gene, hTERT gene, SV40 large T gene (Iv) Oct gene, Klf gene, Sox gene
  • the Oct gene, Klf gene, Sox gene and Myc gene each contain multiple family genes.
  • each family gene those described in pages 11 to 13 of the specification of International Publication No. WO2007 / 069666 can be used. Specifically, it is as follows.
  • Oct3 / 4 is preferable.
  • Oct3 / 4 is a transcription factor belonging to the POU family, is known as an undifferentiated marker, and has been reported to be involved in maintaining pluripotency.
  • genes belonging to the Klf gene include Klf1 (NM_006563), Klf2 (NM_016270), Klf4 (NM_004235), Klf5 (NM_001730), etc. (in parentheses indicate NCBI accession numbers of human genes) ).
  • Klf4 is preferred.
  • Klf4 (Kruppel like factor-4) has been reported as a tumor suppressor.
  • genes belonging to the Sox gene include, for example, Sox1 (NM_005986), Sox2 (NM_003106), Sox3 (NM_005634), Sox7 (NM_031439), Sox15 (NM_006942), Sox17 (NM_0022454), and Sox18 (NM_018419).
  • Sox1 NM_005986
  • Sox2 NM_003106
  • Sox3 NM_005634
  • Sox7 NM_031439
  • Sox15 NM_006942
  • Sox17 NM_0022454
  • Sox18 NM_018419.
  • Sox2 is a gene that is expressed during early development and encodes a transcription factor.
  • genes belonging to the Myc gene include c-Myc (NM_002467), N-Myc (NM_005378), and L-Myc (NM_005376) (in parentheses the NCBI accession number of the human gene). Show).
  • c-MycMy a transcriptional regulator involved in cell differentiation and proliferation, and has been reported to be involved in maintaining pluripotency.
  • genes described above are genes that exist in common in mammals including humans, and genes derived from any mammal (eg, derived from mammals such as humans, mice, rats, monkeys) can be used in the present invention. .
  • genes derived from any mammal eg, derived from mammals such as humans, mice, rats, monkeys
  • the present invention it is particularly preferable to use a combination of the Oct3 / 4 gene, the Klf4 gene, and the Sox2 gene as the reprogramming gene, and more preferably a combination of these three and the c-Myc gene.
  • the method for introducing the reprogramming gene into the cell is not particularly limited as long as the introduced reprogramming gene is expressed to achieve cell reprogramming.
  • the reprogramming gene can be introduced into a cell using an expression vector containing at least one or more reprogramming genes.
  • the expression vector may be introduced into a cell by incorporating two or more kinds of reprogramming genes into one expression vector.
  • Two or more types of expression vectors into which various types of reprogramming genes are incorporated may be prepared and introduced into cells.
  • the type of expression vector is not particularly limited, and may be a viral vector or a plasmid vector, but a viral vector is preferred.
  • virus vectors examples include retrovirus vectors (including lentivirus vectors), adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors, and the like. Of these, Sendai virus vectors are preferred.
  • cells into which the reprogramming gene has been introduced are cultured together with BMP-6 in the presence of a test substance.
  • BMP- is added to any medium that can be used for inducing or maintaining osteoblasts. 6 and the test substance may be added to culture the cells.
  • media capable of maintaining the undifferentiation and pluripotency of ES cells and induced pluripotent stem cells are known in the art, and can be used in combination with appropriate media.
  • ES medium as a medium that can be used for culturing the cells into which the reprogramming gene has been introduced in the method of the present invention together with BMP-6 in the presence of the test substance, ES medium, and 10 ng / ml FGF-2 in ES medium are used.
  • DMEM supplemented with MEF-conditioned ES medium hereinafter referred to as MEF-conditioned ES medium
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • bFGF which is a supernatant obtained by culturing mouse embryonic fibroblasts for 24 hours after addition.
  • a medium etc. can be raised.
  • the medium for culturing the cells into which the reprogramming gene has been introduced includes various growth factors, cytokines, hormones and the like (eg, FGF-2, TGFb-1, activin A, Nanoggin, BDNF, Ingredients involved in the growth and maintenance of human ES cells such as NGF, NT-1, NT-2 and NT-3 may be added.
  • various growth factors eg, FGF-2, TGFb-1, activin A, Nanoggin, BDNF
  • Ingredients involved in the growth and maintenance of human ES cells such as NGF, NT-1, NT-2 and NT-3 may be added.
  • BMP-6 used in the method of the present invention is a naturally occurring BMP-6 protein (including BMP-6 protein and a naturally-provided variant), and an effect of inducing bone differentiation of cells which is the object of the present invention. As long as it has a modified BMP-6 protein.
  • Modified BMP-6 protein includes not only those in which a part of amino acids in a polypeptide is substituted, but also those in which deletion or addition is made, and also those in which some residues of a peptide are modified Including. Furthermore, a polypeptide consisting of a part of the peptide sequence and a chimeric protein are also included. BMP-6 DNA and protein sequences and methods for generating them are described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-073208 and US Pat. No. 5,187,076. Which is incorporated herein by reference and is part of this specification.
  • the concentration of BMP-6 added to the medium in the method of the present invention may be any concentration as long as it induces bone differentiation induction of cells, which is the object of the present invention, but is 10 to 100 ng / ml, preferably about 50 ng. Can be used at a concentration of / ml.
  • feeder cells used in the present invention are not particularly limited as long as they can generally induce and maintain pluripotent stem cells. Specific examples of feeder cells include MEF cells.
  • MEF cells as the supporting cells, those in which cell growth has been lost by mitomycin C treatment or irradiation can be used.
  • MEF cells from ICR mice
  • SCRC-1046 catalog number ATCC # SCRC-1046.
  • MEF cells can be obtained according to the description in the literature (Nagy A, et al. Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Third Edition Cold Spring Harbor Press; 2003).
  • the cells into which the reprogramming gene used in the present invention has been introduced are cultured under conditions that give rise to iPS cells, then the medium is changed, unnecessary components are removed from the medium, and then cultured with BMP-6 in the presence of the test substance.
  • the conditions for generating iPS cells are not particularly limited as long as iPS cells can be generated from the cells into which the reprogramming gene used in the present invention has been introduced. However, fibroblasts derived from FOP patients were used.
  • culture in the presence of dorsomorphin and / or LDN-193189 can be mentioned.
  • dorsomorphin the concentration is, for example, 1 to 4 ⁇ M.
  • LDN-193189 the concentration is, for example, 200 nM to 1 ⁇ M.
  • test substance used in the present invention Any substance can be used as the test substance used in the present invention.
  • the kind of the test substance is not particularly limited, and may be a low molecular compound, a compound present in a natural product extract, or a synthetic peptide.
  • the test substance may also be a compound library, a phage display library or a combinatorial library.
  • the test substance is preferably a low molecular compound, and may be a compound library of low molecular compounds.
  • the construction of a compound library is known to those skilled in the art, and a commercially available compound library can also be used.
  • cells introduced with the initial gene used in the present invention are cultured with BMP-6 to cause cell ossification (bone differentiation).
  • a test substance that controls ossification can be selected.
  • To determine whether to control ossification for example, compare the negative control group in which cells were cultured in a medium to which no test substance was added and the test sample group in which cells were cultured in a medium to which the test substance was added. Then, it can be performed by confirming the ossification (bone differentiation) of the cells.
  • Confirmation of ossification can be performed, for example, by performing alkaline phosphatase (ALP) staining and confirming the state of cells with a microscope, but the method is not particularly limited, and other methods such as ossification or As an index of bone differentiation, there are alizarin red staining, calcium quantification, and measurement of osteocalcin protein concentration in the culture supernatant by ELISA.
  • ALP alkaline phosphatase
  • a somatic cell derived from an individual suffering from progressive ossifying fibrodysplasia into which an reprogramming gene for generating iPS cells has been introduced, or a cell derived from the cell is passaged.
  • the method for inducing differentiation into osteoblasts comprises the reprogramming gene of the present invention. It can be carried out by culturing the cells derived from the introduced progressive ossifying fibrodysplasia individual with BMP-6. As the culture medium for differentiation induction, confirmation of ossification or bone differentiation, and other conditions and methods, the conditions and methods described above with respect to the screening method for ossification (bone differentiation) regulator of the present invention can be used.
  • the following genes (1) reprogramming genes for generating iPS cells (for example, Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, and Sox2 gene (optionally further c-Myc And (2) a gene encoding an amino acid sequence in which the 206th arginine is mutated to histidine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and / or the 356th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • Osteoblast of a cell comprising culturing a cell derived from a mammal into which an ALK2 mutant gene containing a gene encoding an amino acid sequence in which the second glycine is mutated to aspartic acid is introduced in the presence of the osteoinductive factor BMP-6
  • a differentiation induction method is provided.
  • cells from FOP patients have the mutations described above for the ALK2 gene. Therefore, cells having the above-described reprogramming gene and the above-described mutation-containing ALK2 gene can be induced to differentiate into osteoblasts by culturing in the presence of the osteoinductive factor BMP-6.
  • the cell having the above reprogramming gene and ALK2 mutant gene is not particularly limited as long as it is a cell derived from a mammal and can introduce these genes and express those genes, and any cell can be used. Can do. Mammals are not particularly limited, and examples include humans, mice, rats, monkeys, and the like, and humans are particularly preferable.
  • Examples of cells include, for example, fibroblasts, stem cells, established cultured cells and the like collected from a mammal individual, preferably skin fibroblasts and mouse fetal fibroblasts, particularly preferably. Are human dermal fibroblasts.
  • the cell to be used already has an reprogramming gene (for example, established iPS cell), it can be used as the cell of the present invention by introducing the ALK2 mutant gene into the cell.
  • the cells are cultured in the presence of BMP-6 to confirm that the cells differentiate into osteoblasts, and can be used in the present invention.
  • the gene introduction methods described for the screening method for ossification control substances can be used.
  • a method for introducing the ALK2 mutant gene a conventional method can be used. For example, it can be introduced by the lipofectin method.
  • the reprogramming gene and the ALK2 mutant gene can be simultaneously introduced into cells.
  • the terms “differentiation”, “BMP-6”, and “reprogramming gene” As described above with respect to the screening method for the ossification (bone differentiation) controlling substance of the invention, the differentiation inducing method into osteoblasts is carried out by introducing a cell into which the reprogramming gene of the present invention and the ALK2 mutant gene have been introduced into BMP- 6 and culturing together.
  • the culture medium for differentiation induction confirmation of ossification or bone differentiation, and other conditions and methods, those described above for the screening method for the ossification (bone differentiation) controlling substance of the present invention can be used.
  • the following genes (1) Reprogramming genes for generating iPS cells (eg, Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, and Sox2 gene (optionally further c-Myc And (2) a gene encoding an amino acid sequence in which the 206th arginine is mutated to histidine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and / or the 356th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the terms “differentiation”, “mammal”, “cell”, “BMP-6”, and “reprogramming gene” As described above with respect to the method of inducing differentiation of cells into osteoblasts using cells having a gene and an ALK2 mutant gene, the cell into which the reprogramming gene and the ALK2 mutant gene of the present invention have been introduced is used together with BMP-6. Differentiate into osteoblasts by culturing.
  • the above-described conditions and methods can be used as a gene introduction method, a culture medium for differentiation induction, confirmation of ossification or bone differentiation, and other conditions and methods.
  • the following genes (1) reprogramming genes for generating iPS cells (for example, Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, and Sox2 gene (optionally further c- And (2) a gene encoding an amino acid sequence in which the 206th arginine is mutated to histidine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and / or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a cell derived from a mammal into which an ALK2 mutant gene containing a gene encoding an amino acid sequence in which the 356th glycine is mutated to aspartic acid is introduced is cultured in the presence of the osteoinductive factor BMP-6 and a test substance, Control of ossification (promoting ossification or suppressing ossification) including screening for a test substance that suppresses ossification or promotes ossification by evaluating ossification Quality screening methods are provided.
  • “differentiation”, “mammal”, “cell”, “BMP-6”, and “reprogramming gene” are as described above with respect to the method for inducing differentiation of cells into osteoblasts using cells having the reprogramming gene of the present invention and the ALK2 mutant gene, and the reprogramming gene and the ALK2 mutant gene of the present invention.
  • the above-described conditions and methods can be used as a gene introduction method, a culture medium for differentiation induction, confirmation of ossification or bone differentiation, and other conditions and methods.
  • IPS cells were generated from human-derived fibroblasts.
  • 5 ⁇ 10 5 human fibroblasts were seeded per well in a 6-well plate, and then the following Sendai virus (SeV) vector was used at multiplicity of infection (MOI) 3.
  • SeV Sendai virus
  • MOI multiplicity of infection
  • BMP-4, 6, and 7 bone morphogenetic proteins (BMP-4, 6, and 7) on the generation of iPS cells was observed in BMP-4 (10 ng / ml), BMP-6 ( 50 ng / ml) and a medium supplemented with BMP-7 (10 ng / ml) were used, and culture was performed until the 30th day.
  • LDN-193189 (STEMGENT; stemgent), an ALK2 kinase inhibitor, was added to the human iPS medium at a concentration of 200 nM.
  • Sendai virus (SeV) vector SeV vectors containing Oct3 / 4 gene, Sox2 gene, K1f4 gene and c-Myc gene are disclosed in N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009).
  • Nested PCR was performed to detect the SeV genome.
  • One microgram of total RNA extracted from dermal fibroblasts and iPS cells was reverse transcribed into cDNA.
  • cDNA was amplified using a pair of SeV-specific primers, and 1/10 volume of these PCR products was further amplified using a pair of nested primers.
  • Table 1 shows primer sequences and amplification conditions.
  • Alkaline phosphatase staining was performed using a leukocyte Alkaline Phosphatase kit (Sigma).
  • a leukocyte Alkaline Phosphatase kit Sigma.
  • cells were fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde for 30 minutes at 4 ° C.
  • the sample was treated with 0.2% Triton X-100 for 15 minutes at room temperature.
  • Cells were washed 3 times with PBS containing 2% FBS and then incubated overnight at 4 ° C. in PBS containing 2% FBS with primary antibody.
  • Primary antibodies include SSEA4 (1: 500, Millipore), TRA-160 (1: 500, Millipore), Nanog (1: 1000, R & D Systems) and Oct3 / 4 (1: 500, Santa-Cruz).
  • secondary antibody goat anti-mouse IgG bound to Alexa 488 (1: 1000, Invitrogen) and donkey anti-goat IgG bound to Alexa 488 (1: 1000, Invitrogen) were used.
  • Sox17 (1: 200, R & D Systems
  • Foxa2 1: 200, R & D Systems
  • Brachyury 1: 200, R & D Systems
  • DNA isolation and sequencing The mutation of the ALK2 gene (R206H: 617G> A and G356D: 1067G> A) in the FOP-derived iPS cell line was confirmed by sequencing the DNA.
  • IPS cell lines in lysis buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM EDTA (pH 8.0), 0.1 M NaCl, 1% SDS and 0.15 mg / mL proteinase K Incubate overnight at 55 ° C. Genomic DNA was extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol. Then 100 ng of genomic DNA was amplified by PCR.
  • the base sequence of the obtained PCR product was determined by ABI PRISM (trademark) 310 Genetic Analyzer (BigDye (trademark) terminator v1.1 cycle sequencing kit, Applied Biosystems). Table 2 shows the primer sequences used to determine the base sequence.
  • the photograph on the lower left is the result of observing the state of cells cultured under the presence and absence of LDN-193189, BMP-4 and BMP-7 with a microscope 30 days after infection (FIG. 1B). .
  • the lower right photo shows the number and ratio of typical and atypical iPS cell colonies 30 days after infection (FIG. 1C).
  • BMP-6 addition of 50 ng / ml
  • N1 the influence of BMP-6 (addition of 50 ng / ml) on the generation of iPS cells from the fibroblasts derived from the skin of a healthy person (N1) was examined.
  • the results are shown in FIG.
  • the upper graph shows the experimental design
  • the lower left photo shows the results when BMP-6 is not added
  • the right photo shows the results when BMP-6 is added.
  • FIG. 4 shows the results of confirming the appearance of osteoblasts by alkaline phosphatase staining after 2 weeks of culture after conversion to iPS cell culture medium.
  • LDN-193189 or dorsomorphin was added, differentiation into osteoblasts could be significantly suppressed in FOP-derived skin fibroblasts.
  • the effects of LDN-193189 and dorsomorphin were confirmed using skin fibroblasts derived from an F206H mutant FOP patient (F2) and a G356D mutant FOP patient (F4).
  • the addition amounts of LDN-193189, dorsomorphin and BMP-6 are the same as above.
  • FIG. 5 shows the results of confirming the appearance of osteoblasts by alkaline phosphatase staining after 2 weeks of culture after conversion to iPS cell culture medium. It was confirmed that differentiation into osteoblasts was suppressed by ALK2 kinase inhibitors (LDN-193189 and dorsomorphin) in dermal fibroblasts derived from FOP patients of any mutation.
  • ALK2 kinase inhibitors LDN-193189 and dorsomorphin
  • bone differentiation of cells can be induced by culturing cells in which reprogramming genes are introduced into fibroblasts derived from the skin of FOP patients in the presence of BMP-6.
  • reprogramming genes are introduced into fibroblasts derived from the skin of FOP patients in the presence of BMP-6.
  • molecules involved in the control (promotion or suppression) of bone differentiation can be screened with a relatively simple in vitro (cell level) screening system.

Abstract

　本発明の目的は、骨分化を制御（抑制又は促進）する化合物を直接かつ簡易に検索できるスクリーニング方法を提供することである。本発明の目的はまた、そのようなスクリーニング方法に用いることができる細胞及び分化誘導方法を提供することである。　進行性骨化性線維異形成症の患者由来の線維芽細胞に初期化遺伝子を導入した細胞を、ＢＭＰ－６存在下で培養することにより、骨分化を誘導できる。また、そのような細胞を被験物質と共に培養し、該細胞の骨化を評価することにより、骨分化制御物質をスクリーニングする方法が提供される。

Description

骨分化誘導方法及び骨化促進・抑制分子のスクリーニング方法
本発明は、骨芽細胞へ分化する細胞を用いた骨化を促進又は抑制する分子のスクリーニング方法に関し、特には、進行性骨化性線維異形成症に罹患した個体からの細胞を用いた骨化を促進又は抑制する分子のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、そのような細胞の骨分化を誘導する方法に関する。
　骨は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とが絶えず繰り返されている動的組織である。骨芽細胞と破骨細胞の機能バランスに異常が生じると、この動的平衡状態が破綻し様々な骨代謝異常疾患が引き起こされることが知られている。
　また近年、骨や軟骨への損傷、歯科治療などで、骨再生能力を利用することが研究されている。骨形成は、未分化間葉系が凝集して軟骨芽細胞に分化し、骨を形作るための鋳型として軟骨が形成される内軟骨性骨形成と、間葉系細胞が凝集し、内部から骨芽細胞に分化する膜性骨形成があるが、いずれの場合も、骨芽細胞が骨形成を担当としているといわれている
　幹細胞から骨芽細胞への分化を誘導する転写因子として、Runx2（CBFA1，AML3）が、また分化促進に関わる転写因子としてosterixが知られている。また、これらの転写因子に対する制御因子として、骨形成タンパク質 (bone morphogenetic protein, ＢＭＰ)などのTGFβファミリー増殖因子の関与が既に見出されている。ＢＭＰは骨を誘導するサイトカインで、そのシグナルはＩ型およびＩＩ型のセリン・スレオニンキナーゼ型受容体によって細胞内に伝達され、さらにＩ型受容体による転写調節因子Smadのリン酸化によって核内に伝達される。ＢＭＰシグナルの不足は短指症や軟骨形成不全症を引き起こし、一方、過剰なＢＭＰシグナルは進行性骨化性繊維異形成症（Fibrodysplasia ossificans progressiva;ＦＯＰ）などを引き起こすことが明らかとなってきた（非特許文献１）。
　ＦＯＰは、全身の軟部組織が骨化していく難治性疾患の１つで、10歳までに発症し40歳ぐらいまでに拘束性の呼吸障害によって死亡する治療方法が確立されていない疾患である（非特許文献１～３）。ＢＭＰ１型受容体である、ＡＬＫ２キナーゼ遺伝子の点変異によって起こる過剰な活性亢進異常が原因であることが判明している（非特許文献３～９）。最も一般的な突然変異はＲ２０６Ｈであり、ＡＬＫ２のキナーゼ活性を変化させ、その結果、ＡＬＫ２のキナーゼ活性が構成的に高まると考えられている。例えば、ＡＬＫ２におけるＧ３５６Ｄのような幾つかのほかの突然変異がＦＯＰの表現型変異で報告されており、それらもキナーゼ活性に影響を及ぼしてＡＬＫ２の構成的な活性化を引き起こすことが報告されている（非特許文献１０）。ＡＬＫ２（Ｇ３５６Ｄ）のキナーゼ活性がＡＬＫ２（Ｒ２０６Ｈ）よりも弱いことが示されており、臨床上の変化はＡＬＫ２変異体における生物活性の差異に起因することが示唆されている（非特許文献１１）。
　このような背景のもと、ＢＭＰシグナル伝達を阻害することで骨分化を阻害する低分子化合物が探索され、ドルソモルフィン(dorsomorphin)とその誘導体であるLDN-193189が見いだされた。（非特許文献１２、非特許文献１３）。ＢＭＰＩ型受容体キナーゼの特異的阻害剤LDN-193189は、病態モデルマウスを用いた実験で、進行性骨化性線維異形成症の主要な症状である異所性骨形成と機能障害とを軽減することが知られている（非特許文献１４）。
　また従来、ヒト正常間葉系細胞を用いた骨芽細胞への分化システムについては、多くの研究がなされている。しかし、疾患由来の間葉系細胞を用いた研究はほとんど見当たらない。ＦＯＰについては、先行研究として、ＦＯＰ患者の歯から間葉系細胞を単離し、その細胞をＢＭＰ２及びＢＭＰ４で刺激して骨芽細胞へ分化を誘導したとの報告が一つある（非特許文献４）。しかし、患者の歯から細胞を単離しなければならず、一般的な手法としては問題がある。
　そこで、個体に由来するＥＳ細胞を用いて効率よく骨芽細胞へ分化させる方法が試みられているが未だに開発されていない。そのため、ＥＳ細胞を一旦、間葉系幹細胞に分化させ、次いで間葉系幹細胞を純化・増殖させた後に、骨芽細胞に分化させることによって効率のよい骨芽細胞への分化誘導法の確立が試みられている（非特許文献１５、１６）。
　このような背景のもと、骨化を制御（抑制又は促進）する化合物を直接かつ簡易に検索できるツールが望まれていた。すなわち、インビトロでの、効率よく骨化の制御にかかわる化合物をスクリーニングする方法が望まれていた。
F. S. Kaplan et al., Methods Enzymol 484, 357 (2010). E. M. Shore, F. S. Kaplan, Bone 43, 427 (2008). T. Fukuda et al., J Biol Chem 284, 7149 (2009). P. C. Billings et al., J bone Miner Res 23, 305 (2008) J. L. Fiori, P. C. Billings, L. S. de la Pena, F. S. Kaplan, E. M. Shore, J Bone Miner Res 21, 902 (2006). F. S. Kaplan et al., Hum Mutat 30, 379 (2009). A. B. Shafritz et al., N Engl J Med 335, 555 (1996). Q. Shen et al., J Clin Invest 119, 3462 (2009). E. M. Shore et al., Nat Genet 38, 525 (2006). H. Furuya et al., Am J Med Genet A 146A, 459 (2008). T. Fukuda et al., Biochem Biophys Res Commun 377, 905 (2008). Yu PB et al., Nat Chem Biol、4、33-41 (2008). Cuny et al、Bioorg Med Chem Lett、18、4388-4392 (2008). Yu PB et al., Nat Med. Dec; 14(12): 1363-9 (2008). T. Barberi et al., PLOS Medicine, June 2005, Vol. 2, Issue 6, e161, 0554-0560. C. Xu et al., Stem Cells, 2004; 22:972-980. M. Hamasaki et al., Stem Cells, 2012; 30:2439-2449.
　本発明の目的は、インビトロ（細胞レベル）での、比較的簡易な、骨化の制御（促進又は抑制）にかかわる分子をスクリーニングする方法を提供することにある。本発明の目的はまた、このようなスクリーニング方法に用いることができる細胞及び分化誘導方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、進行性骨化性線維異形成症の患者由来の線維芽細胞に初期化遺伝子である４因子（Oct4、Sox2、KLF4、及びc-Myc）を導入した細胞を、ＢＭＰ－６の存在下で培養すると、ＦＯＰの臨床所見である骨化の促進をインビトロで容易に再現できることを見いだし、本発明を完成した。
　すなわち、本発明の態様は以下の通りである。
１．ｉＰＳ細胞の作成のための初期化遺伝子を導入した進行性骨化性繊維異形成症に罹患した個体に由来する体細胞又はその細胞由来の継代された細胞を骨誘導因子ＢＭＰ－６の存在下で培養することを含む体細胞又はそれに由来する細胞の骨芽細胞への分化誘導方法。
２．前記体細胞が皮膚繊維芽細胞である前記１に記載の方法。
３．前記細胞がヒト細胞である、前記２に記載の方法。
４．前記細胞が、以下の遺伝子：
１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、
を有する、前記１～３のいずれか一つに記載の方法。
５．前記初期化遺伝子が、少なくともOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子を含む、前記１～４いずれか一つに記載の方法。
６．前記初期化遺伝子がさらに、Myc遺伝子を含む、前記５に記載の方法。
７．前記細胞の培養を、ＢＭＰ－６を１０～１００ng/mlの濃度で含有する培地で行う、前記１～５のいずれか一つに記載の方法。
８．以下の工程：
ａ）進行性骨化性繊維異形成症に罹患した個体に由来する体細胞にｉＰＳ細胞の作成ための初期遺伝子が導入された細胞又はその細胞由来の継代された細胞を、骨誘導因子ＢＭＰ－６及び被験物質の存在下で培養する；及び
ｂ）前記細胞の骨化を評価することにより、骨化を抑制する又は骨化を促進する被験物質を選別する：
ことを含む骨化制御（骨化促進又は骨化抑制）分子のスクリーニング方法。
９．前記体細胞が皮膚繊維芽細胞である前記８に記載の方法。
１０．前記細胞がヒト細胞である、前記９に記載の方法。
１１．前記細胞が、以下の遺伝子：
１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、
を有する、前記８～１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．前記初期化遺伝子が、少なくともOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子、を含む、前記８～１１のいずれか一つに記載の方法。
１３．前記初期化遺伝子がさらに、Myc遺伝子を含む、前記１２に記載の方法。
１４．前記細胞の培養を、ＢＭＰ－６を１０～１００ng/mlの濃度で含有する培地で行う、前記８～１３のいずれか一つに記載の方法。
１５．以下の遺伝子：
1）ｉＰＳ細胞の作成のための初期化遺伝子であるOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子、並びに
2）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むＡＬＫ２変異遺伝子、
を導入した哺乳動物由来の細胞（体細胞（好ましくは皮膚繊維芽細胞）又はｉＰＳ細胞）を、骨誘導因子ＢＭＰ－６の存在下で培養することを含む、該細胞の骨芽細胞への分化誘導方法。
１６．前記哺乳動物由来の細胞が、初期化遺伝子としてさらにMyc遺伝子が導入された、前記１５に記載の分化誘導方法。
１７．前記哺乳動物由来の細胞が、ヒト細胞である前記１５又は１６に記載の方法。
１８．前記細胞の培養を、ＢＭＰ－６を１０～１００ng/mlの濃度で含有する培地で行う、前記１５～１７のいずれか一つに記載の方法。
１９．以下の遺伝子：
1）ｉＰＳ細胞の作成のための初期化遺伝子であるOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子並びに
2）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子含むＡＬＫ２変異遺伝子、
を導入した哺乳動物由来の細胞（体細胞（好ましくは皮膚繊維芽細胞）又はｉＰＳ細胞）であって、
骨誘導因子ＢＭＰ－６の存在下（好ましくは１０～１００ng/ml、より好ましくは約５０ng/mlの濃度で）で培養することにより骨芽細胞へと分化する細胞。
２０．前記哺乳動物由来の細胞が、初期化遺伝子としてさらにMyc遺伝子が導入された、前記１９に記載の細胞。
２１．前記細胞がヒト細胞である前記１９又は２０に記載の細胞。
２２．以下の工程：
ａ）前記１９～２１のいずれか一つに記載の細胞を、骨誘導因子ＢＭＰ－６及び被験物質の存在下で培養する；及び
ｂ）前記細胞の骨化を評価することにより、骨化を抑制する又は骨化を促進する被験物質を選別する：
ことを含む骨化制御（骨化促進又は骨化抑制）物質のスクリーニング方法。
２３．前記培養を、ＢＭＰ－６を１０～１００ng/mlの濃度で含有する培地で行う、前記２２に記載のスクリーニング方法。
２４．骨化制御（骨化促進又は骨化抑制）物質をスクリーニングするためのキットであって、前記１９～２１のいずれかに記載の細胞、骨誘導因子ＢＭＰ－６、及び該細胞を培養するための培地を含むキット。
　本発明によれば、比較的簡易なインビトロ（細胞レベル）でのスクリーニング系で、骨化の制御（促進又は抑制）にかかわる分子をスクリーニングすることができる。また本発明によれば、骨疾患に関する薬剤候補を簡便かつ効率的に取得できる薬剤スクリーニング系として利用可能なスクリーニング方法が提供される。
健常人皮膚繊維芽細胞からのｉＰＳ細胞形成（及び細胞のリプログラミング）に対するＢＭＰ－４及びＢＭＰ－７の作用を、ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤であるLDN193189の存在及び非存在下で検討した結果である。（Ａ）は、実験計画を示す。左下の写真は、顕微鏡での細胞の状態を観察した結果である（図１Ｂ）。右下の写真は、典型的(typical)な及び異常(atypical)なｉＰＳ細胞コロニーの数及び比率を示した結果である(図１Ｃ)。 健常人皮膚繊維芽細胞からのｉＰＳ細胞形成（及び細胞のリプログラミング）に対するＢＭＰ－６の作用を検討した結果である。上段は、実験計画を示す。 健康人とＦＯＰ患者（Ｆ２０６Ｈ変異患者及びＧ３５６Ｄ変異患者）由来の皮膚線維芽細胞にＢＭＰ－６を添加し骨芽細胞誘導について検定した結果である。左側の写真が一週間後、右側の写真が二週間後の状態である。 ＢＭＰ－６存在及び非存在下における、ＦＯＰ患者由来の皮膚線維芽細胞の骨芽細胞誘導に対するＡＬＫ２キナーゼ阻害剤であるLDN193189とDorsomorphinの作用について検定した結果である。培養２週間後に顕微鏡で観察した結果である。 ＢＭＰ－６存在及び非存在下における、ＦＯＰ患者（Ｆ２０６Ｈ変異患者及びＧ３５６Ｄ変異患者）由来の皮膚線維芽細胞の骨芽細胞誘導に対するＡＬＫ２キナーゼ阻害剤であるLDN193189とDorsomorphinの作用について検定した結果である。培養２週間後に、骨芽細胞をＡＬＰ染色にて検出した結果である。 健常人とＦＯＰ患者由来の皮膚繊維芽細胞に対する各ＢＭＰ（ＢＭＰ－４，６及び７）処理によりＡＬＰ活性の影響を測定した結果である。対照は、健常人の皮膚繊維芽細胞におけるＢＭＰ非添加でのＡＰＬ活性である。なお、ＡＬＰ活性測定のポジティブコントロールとして、健常人のｉＰＳ細胞を用いた。
　本発明は、進行性骨化性繊維異形成症に罹患した個体に由来する皮膚繊維芽細胞にｉＰＳ細胞の作成ための初期遺伝子が導入された細胞（又はその細胞由来の継代された細胞）を、骨誘導因子ＢＭＰ－６及び被験物質の存在下で培養し、前記細胞の骨化を評価することにより、骨化を抑制する又は骨化を促進する被験物質を選別することを含む骨化制御（骨化促進又は骨化抑制）物質のスクリーニング方法に関する。
　本明細書において、「分化」とは、ある細胞が特殊化した細胞になることをいう。また、本明細書において、「骨化」又は「骨分化」とは、細胞が骨の特徴を有する特殊化した細胞、例えば骨芽細胞になることをいう。骨芽細胞は、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色にて検出できる。
　本発明の一態様において用いる進行性骨化性繊維異形成症（ＦＯＰ）の患者の皮膚線維芽細胞から、ｉＰＳ細胞樹立が困難なことを本発明者らは以前に見いだし報告している（非特許文献１７）。ここで、ｉＰＳ細胞樹立が困難とは、患者に由来する細胞（体細胞）に後述の初期化遺伝子を導入し、従来の手法により人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）への誘導を行っても、ｉＰＳ細胞の製造が不可能であるか、或いは極めて低い効率でしか人工多能性幹細胞が出現しないことを意味する。より具体的には、該疾患の患者に由来する細胞に初期化遺伝子を導入し、各種ｉＰＳ培地において培養することにより人工多能性幹細胞の誘導を行っても、培地上にｉＰＳ細胞コロニーが全く出現しないか、或いは、健常な固体に由来する細胞からｉＰＳ細胞の誘導を行った場合と比較して培地上におけるｉＰＳ細胞コロニーの形成頻度が極めて低いことを意味する。さらにより具体的には、該疾患の患者に由来する細胞に初期化遺伝子（特に、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子）を導入し、１００ｍｍシャーレ当たり１～２×１０5個の細胞を播種してｉＰＳ細胞の誘導を行った場合に、健常な固体に由来する細胞からｉＰＳ細胞の誘導を行った場合と比較して形成されるコロニー数がより少なく、かつ形成されるｉＰＳ細胞のコロニーの数が、例えば、５０以下であることを意味する。
　ＦＯＰの責任遺伝子は、ＡＬＫ２遺伝子（ＡＣＶＲ１）であることが知られている。ヒトＡＬＫ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列（Homo sapiens activin A receptor, type I (ACVR1), transcript variant 1, mRNA）はＮＣＢＩアクセション番号：ＮＭ＿００１１０５として公開されている。そのＣＤＳ領域の塩基配列を配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示す。健常者とＦＯＰ患者のＡＬＫ２遺伝子を比較すると、そのＣＤＳ領域の塩基配列において第６１７番目の塩基がグアニン（Ｇ）であるのに対し、ＦＯＰ患者ではその塩基がアデニン（Ａ）に変異していることが知られており、この塩基の変異により、ＡＬＫ２遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異（Ｒ２０６Ｈ）する。さらに、ＦＯＰ患者におけるＡＬＫ２遺伝子の変異の希な事例として、ＣＤＳ領域の塩基配列において第１０６７番目の塩基がグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）へと変異し、アミノ酸配列において第３５６番目のグリシンからアスパラギンへと変異（Ｇ３５６Ｄ）するケースが知られている。ＡＬＫ２キナーゼは、骨組織を誘導する成長因子として知られるＢＭＰ（Bone morphogenetic protein）の１回膜貫通型受容体として機能し、細胞外領域でＢＭＰと結合すると活性化して細胞内に骨形成シグナルを伝達する。健常者では、ＡＬＫ２キナーゼはＢＭＰが結合していない状態では不活性化された「オフ」の状態であるが、ＦＯＰ患者では、ＡＬＫ２キナーゼはＢＭＰが結合していない場合でも活性化された「オン」の状態であることが明らかとされており、ＦＯＰでは常にＡＬＫ２キナーゼが活性化状態にあるため、骨形成を促進するシグナルが伝達されて異所性骨形成が進行するものと考えられている。
　本発明において、「個体」は、哺乳動物を意味し、好ましくはヒトである。また、本発明において体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。加えて、本発明において「由来する」とは、個体から採取した細胞をそのまま本発明の方法に用いて初期化遺伝子を導入してもよいし、採取した細胞を培養して樹立した培養細胞株を本発明の方法に用いて初期化遺伝子を導入してもよいことを意味する。また、細胞を凍結保存する場合は、初期化遺伝子の導入前に凍結保存を行ってもよく、また初期化遺伝子を導入した後に凍結保存してもよい。本発明における細胞の具体例としては、例えば、疾患に罹患した個体から採取した皮膚を培養することにより得られた皮膚線維芽細胞が挙げられる。さらに、本発明における細胞として、上記したＲ２０６Ｈ及び／又はＧ３５６Ｄの突然変異を有するＡＬＫ２キナーゼをコードする遺伝子を含む細胞を用いることができる。具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列においてＲ２０６Ｈ及び／又はＧ３５６Ｄの突然変異を有するＡＬＫ２キナーゼをコードする遺伝子を含むヒトの細胞を用いることができる。これら突然変異を有するＡＬＫ２キナーゼをコードする遺伝子は、常法により、任意の細胞に導入することができ、そのような細胞も同様に用いることができる。これらの細胞に、初期化遺伝子を導入することにより本発明の方法に用いることができる。
　本発明において、「初期化遺伝子が導入された細胞又はその細胞由来の継代された細胞」とは、上記した、初期化遺伝子が導入された細胞をそのまま本発明の、例えばスクリーニング方法に用いても良いし、初期化遺伝子を導入したのち、細胞を培養して継代した培養細胞（又は培養細胞株）を、本発明の本発明の方法に用いてもよい。或いは、初期化遺伝子を導入した細胞又はそれを培養した細胞を凍結保存し、後日、細胞を解凍して必要により培養し本発明の方法に用いても良い。かかる場合には、初期化遺伝子を導入した細胞を後述するようなｉＰＳ細胞を生成できる条件で培養してｉＰＳ細胞を作成したのち、生成されたｉＰＳ細胞を本発明の方法に用いることもできる。
　本発明の方法では、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子
（ii）Oct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子
（iii）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40 large T遺伝子
（iv）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子
　Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子及びMyc遺伝子にはそれぞれ、複数のファミリー遺伝子が含まれている。それぞれのファミリー遺伝子の具体例としては、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報の明細書の第１１頁から第１３頁に記載されているものを用いることができる。具体的には、以下の通りである。
　Oct遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、Oct3/4（NM_002701）、Oct1A(NM_002697)、及びOct6(NM_002699)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはOct3/4である。Oct3/4はPOUファミリーに属する転写因子であり、未分化マーカーとして知られており、また多能性維持に関与しているとの報告もある。
　Klf遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、Klf1(NM_006563)、Klf2(NM_016270)、Klf4(NM_004235)、及びKlf5(NM_001730)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはKlf4である。Klf4（Kruppel like factor-4）は腫瘍抑制因子として報告されている。
　Sox遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、例えば、Sox1(NM_005986)、Sox2(NM_003106)、Sox3(NM_005634)、Sox7(NM_031439)、Sox15(NM_006942)、Sox17(NM_0022454)、及びSox18(NM_018419)を挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはSox2である。Sox2は初期発生過程で発現し、転写因子をコードする遺伝子である。
　Myc遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、c-Myc(NM_002467)、N-Myc(NM_005378)、及びL-Myc(NM_005376)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくは、c-Myc である。c-Mycは細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子であり、多能性維持に関与しているとの報告がある。
　上記した遺伝子は、ヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において任意の哺乳類動物由来（例えばヒト、マウス、ラット、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることができる。また、野生型の遺伝子に対して、数個（例えば１～３０個、好ましくは１～２０、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１から３個）の塩基が置換、挿入及び／又は欠失した変異遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を使用することもできる。
　本発明では特に好ましくは、初期化遺伝子として、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子の組み合わせを、さらに好ましくは、それら３つとc-Myc遺伝子の組合せを用いることができる。
　初期化遺伝子を細胞に導入する方法は、導入された初期化遺伝子が発現して細胞の初期化を達成できる限り特に限定されない。例えば、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を含む発現ベクターを用いて該初期化遺伝子を細胞に導入することができる。ベクターを用いて２種類以上の初期化遺伝子を細胞に導入する場合には、一つの発現ベクターに２種類以上の初期化遺伝子を組み込んで、該発現ベクターを細胞に導入してもよいし、１種類の初期化遺伝子を組み込んだ発現ベクターを２種類以上用意して、それらを細胞に導入してもよい。
　発現ベクターの種類は特に限定されず、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよいが、好ましくはウイルスベクターである。本発明で使用できるウイルスベクターとしては、レトロウィルスベクター（レンチウィルスベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどを挙げることができる。上記の中でも好ましくはセンダイウイルスベクターである。
　本発明の方法では、初期化遺伝子が導入された細胞をＢＭＰ－６と共に被験物質の存在下で培養するが、この工程では、骨芽細胞の誘導又は維持に用いられ得る任意の培地にＢＭＰ－６及び被験物質を添加して当該細胞を培養すればよい。具体的には、ＥＳ細胞や人工多能性幹細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地は当業界で公知であり、適当な培地を組み合わせて用いることができる。即ち、本発明の方法において初期化遺伝子が導入された細胞をＢＭＰ－６と共に被験物質の存在下で培養するために用いられ得る培地としては、ＥＳ培地、ＥＳ培地に10ng/ml FGF-2を添加後にマウス胚性線維芽細胞を24時間培養した上清であるＭＥＦ馴化ＥＳ培地（以下ＭＥＦ馴化ＥＳ培地）、所定量のKnockOut Serum Replacement(KSR)（インビトロジェン社）及び／又はｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ培地などをあげることができる。本発明において初期化遺伝子が導入された細胞を培養するための培地には、各種の成長因子、サイトカイン、ホルモンなど（例えば、FGF-2、TGFb-1、アクチビンA、ノギン（Nanoggin）、BDNF、NGF、NT-1、NT-2、NT-3等のヒトES細胞の増殖・維持に関与する成分）を添加してもよい。
　本発明の方法において用いるＢＭＰ－６は、天然に存在するＢＭＰ－６タンパク質（ＢＭＰ－６タンパク質及び天然に提供される改変体を含む）、及び本発明の目的である細胞の骨分化誘導の作用を有する限り改変されたＢＭＰ－６タンパク質を含む。改変ＢＭＰ－６タンパク質とは、ポリペプチド中のアミノ酸の一部が置換されたものだけでなく、欠失又は付加されたものも含み、また、ペプチドの一部の残基が改変されたものも含む。更には、一部のペプチド配列からなるポリペプチド、及びキメラ型のタンパク質も含む。ＢＭＰ－６のＤＮＡ配列およびタンパク質配列ならびにそれを生成するための方法は、特開２００４－０７３２０８号公報及び米国特許第５，１８７，０７６号に記載されており、これらの開示は、本明細書中に参考として引用され、本明細書の一部である。
　本発明の方法において培地に添加するＢＭＰ－６の濃度は、本発明の目的である細胞の骨分化誘導を引き起こす濃度であればいずれの濃度でも良いが、１０～１００ng/ml、好ましくは約５０ng/mlの濃度で用いることができる。
　本発明において初期化遺伝子が導入された細胞をＢＭＰ－６と共に被験物質の存在下で培養する際には、適切な支持細胞を用いてもよい。本発明で用いられる支持細胞としては、一般に多能性幹細胞を誘導及び維持できる細胞であれば、特に限定されるものではない。支持細胞の具体例としては、ＭＥＦ細胞などが挙げられる。また、支持細胞は、マイトマイシンＣ処理又は放射線照射により細胞増殖を失わせたものを用いることができる。ＭＥＦ細胞（ＩＣＲマウスより）は、ＡＴＣＣにカタログ番号ＡＴＣＣ＃ＳＣＲＣ－１０４６として登録されている。また、ＭＥＦ細胞は、文献（Nagy A, et al. Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Third Edition Cold Spring Harbor Press; 2003）の記載に従って入手可能である。
　本発明で用いる初期化遺伝子が導入された細胞は、ｉＰＳ細胞を生じる条件で培養した後、培地を交換し、培地から不要な成分を除いた後、ＢＭＰ－６と共に被験物質の存在下で培養してもよく、ｉＰＳ細胞を生じる条件は、本発明で用いる初期化遺伝子が導入された細胞からｉＰＳ細胞を生成できる条件であれば特に制限がないが、ＦＯＰ患者由来の繊維芽細胞を用いた場合は、例えば、ドルソモルフィン及び／又はLDN-193189の存在下での培養をあげることができる。ドルソモルフィンを用いる場合は、その濃度は、例えば、１～４μMである。LDN-193189を用いる場合は、その濃度は、例えば、２００nM～１μMである。
　本発明で用いる被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、低分子化合物であってもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験物質はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
　上述のように、本発明に用いる初期遺伝子が導入された細胞はＢＭＰ－６と共に培養することにより細胞の骨化（骨分化）が起こるので、それを被験物質の存在下で培養することにより、骨化を制御する（骨化を抑制又は促進する）被験物質を選別できる。骨化を制御するか否かの判断については、例えば、被験物質が添加されていない培地で細胞を培養した陰性対照群と、被験物質を添加した培地で細胞を培養した被験試料群とを比較し、細胞の骨化（骨分化）を確認することにより行える。骨化の確認は、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色を行い、細胞の状態を顕微鏡により確認することにより行うことができるが、方法は特に限定されず、他の方法として、例えば、骨化又は骨分化の指標として、アリザリンレッド染色、カルシウム定量、および、ELISA法による培養上清中のosteocalcinタンパク濃度の測定があげられる。
　さらに本発明の別の態様によれば、ｉＰＳ細胞の作成のための初期化遺伝子を導入した進行性骨化性繊維異形成症に罹患した個体に由来する体細胞又はその細胞由来の継代された細胞を骨誘導因子ＢＭＰ－６の存在下で培養することを含む体細胞又はそれに由来する細胞の骨芽細胞への分化誘導方法、が提供される。
　本発明の骨芽細胞への分化誘導方法において用いる、「分化」、「個体」、「由来する」、「体細胞」、「その細胞由来の継代された細胞」、「初期化遺伝子」、「ＢＭＰ－６」の各用語は、本発明の骨化（骨分化）制御物質のスクリーニング方法に関し上記に説明した通りであり、骨芽細胞への分化誘導方法は、本発明の初期化遺伝子を導入した進行性骨化性線維異形成症の個体由来の細胞を、ＢＭＰ－６と共に培養することにより行うことができる。分化誘導のための培地、骨化又は骨分化の確認、その他の条件及び方法は、本発明の骨化（骨分化）制御物質のスクリーニング方法に関し上記した条件及び方法を用いることができる。
　また本発明の別の態様によれば、以下の遺伝子：(1)ｉＰＳ細胞の作成のための初期化遺伝子（例えば、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子（場合により、さらにc-Myc遺伝子を含む））、並びに(2)配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むＡＬＫ２変異遺伝子を導入した哺乳動物由来の細胞を、骨誘導因子ＢＭＰ－６の存在下で培養することを含む細胞の骨芽細胞への分化誘導方法、が提供される。
　下記の実施例で示されるように、ＦＯＰ患者由来の細胞は、ＡＬＫ２遺伝子に関して上記した変異を有する。従って、上記した初期化遺伝子及び上記した変異を有するＡＬＫ２遺伝子を有する細胞は、骨誘導因子ＢＭＰ－６の存在下で培養することにより、骨芽細胞へと分化誘導できる。
　上記初期化遺伝子及びＡＬＫ２変異遺伝子を有する細胞は、哺乳動物由来の細胞であって、それらの遺伝子を導入できかつそれらの遺伝子が発現できる細胞であれば特に制限されず、任意の細胞を用いることができる。哺乳動物は特に制限されないが、例えばヒト、マウス、ラット、サルなどをあげることができ、特にヒトが好ましい。また、細胞の例としては、例えば、哺乳動物個体から採取した繊維芽細胞、幹細胞、樹立培養細胞、等をあげることができ、好ましくは皮膚繊維芽細胞、マウス胎児繊維芽細胞であり、特に好ましくはヒト皮膚繊維芽細胞である。また、用いる細胞が既に初期化遺伝子を有する場合（例えば樹立ｉＰＳ細胞）は、細胞に上記ＡＬＫ２変異遺伝子を導入することにより、本発明の細胞として用いることができる。具体的には、それらの遺伝子を有する細胞を調製した後、ＢＭＰ－６存在下で細胞を培養することにより、細胞が骨芽細胞に分化することを確認し、本発明に用いることができる。
　上記の初期化遺伝子を細胞に導入する方法は、骨化制御物質のスクリーニング方法に関して記載した遺伝子の導入方法を用いることができる。また、上記ＡＬＫ２変異遺伝子を導入する方法としては、常法を用いることができるが、例えば、リポフェクチン法により導入できる。さらに、上記初期化遺伝子と上記ＡＬＫ２変異遺伝子を、同時に細胞に導入することもできる。
　本発明の初期化遺伝子及びＡＬＫ２変異遺伝子を有する細胞を用いた細胞の骨芽細胞への分化誘導方法において、「分化」、「ＢＭＰ－６」、及び「初期化遺伝子」の各用語は、本発明の骨化（骨分化）制御物質のスクリーニング方法に関し上記に説明した通りであり、骨芽細胞への分化誘導方法は、本発明の初期化遺伝子及びＡＬＫ２変異遺伝子を導入した細胞を、ＢＭＰ－６と共に培養することにより行うことができる。分化誘導のための培地、骨化又は骨分化の確認、その他の条件及び方法は、本発明の骨化（骨分化）制御物質のスクリーニング方法に関し上記したものを用いることができる。
　さらに本発明の別の態様によれば、以下の遺伝子：(1)ｉＰＳ細胞の作成のための初期化遺伝子（例えば、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子（場合により、さらにc-Myc遺伝子を含む））、並びに(2)配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子含むＡＬＫ２変異遺伝子を導入した哺乳動物由来の細胞であって、骨誘導因子ＢＭＰ－６の存在下で培養することにより骨芽細胞へと分化する細胞、が提供される。
　本発明の初期化遺伝子及びＡＬＫ２変異遺伝子を有する細胞において、「分化」、「哺乳動物」、「細胞」、「ＢＭＰ－６」、及び「初期化遺伝子」の各用語は、本発明の初期化遺伝子及びＡＬＫ２変異遺伝子を有する細胞を用いた細胞の骨芽細胞への分化誘導方法に関し上記に説明した通りであり、本発明の初期化遺伝子及びＡＬＫ２変異遺伝子を導入した細胞は、ＢＭＰ－６と共に培養することにより骨芽細胞へと分化する。遺伝子の導入方法、分化誘導のための培地、骨化又は骨分化の確認、その他の条件及び方法は、既に上記した条件及び方法を用いることができる。
　またさらに本発明の別の態様によれば、以下の遺伝子：(1)ｉＰＳ細胞の作成のための初期化遺伝子（例えば、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子（場合により、さらにc-Myc遺伝子を含む））、並びに(2)配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むＡＬＫ２変異遺伝子を導入した哺乳動物由来の細胞を、骨誘導因子ＢＭＰ－６及び被験物資の存在下で培養し、前記細胞の骨化を評価することにより、骨化を抑制する又は骨化を促進する被験物質を選別することを含む骨化制御（骨化促進又は骨化抑制）物質のスクリーニング方法、が提供される。
　本発明の初期化遺伝子及びＡＬＫ２変異遺伝子を有する細胞を用いた骨化制御物資のスクリーニング方法において、「分化」、「哺乳動物」、「細胞」、「ＢＭＰ－６」、及び「初期化遺伝子」の各用語は、本発明の初期化遺伝子及びＡＬＫ２変異遺伝子を有する細胞を用いた細胞の骨芽細胞への分化誘導方法に関し上記に説明した通りであり、本発明の初期化遺伝子及びＡＬＫ２変異遺伝子を導入した細胞を、ＢＭＰ－６及び被験物資と共に培養することにより行うことができる。遺伝子の導入方法、分化誘導のための培地、骨化又は骨分化の確認、その他の条件及び方法は、既に上記した条件及び方法を用いることができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
（Ａ）材料及び方法
（１）皮膚由来の線維芽細胞の生成
　倫理委員会に承認されたプロトコールにより、インフォームドコンセントの下、ＦＯＰ患者及び健常者の皮膚生検の外植片から線維芽細胞を作出した。患者及び健常者からの皮膚試料を細かく刻み、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。線維芽細胞が出現したことを確認した後、初期化遺伝子を導入するために線維芽細胞を増殖させ、その後、１０％ＤＭＳＯ＋９０％ＦＢＳからなる凍結溶液に入れ、凍結保存した。
（２）ｉＰＳ細胞の維持及び生成
　２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清置換物（ＫＳＲ、インビトロゲン）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１×１０-4Ｍの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ）、１×１０-4Ｍの２－メルカプトエタノール（シグマ）、０．５％のペニシリンとストレプトマイシン（日本、ナカライテスク）、及び５ｎｇ／ｍＬの基本線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、和光、日本）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（シグマ）を含有するヒトｉＰＳ培地において、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理したＭＥＦ支持細胞上でヒトｉＰＳ細胞を維持した。
　N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される方法により、ヒト由来の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を生成した。感染１日前に、６穴プレートにおいてウエル当たり５×１０5個のヒト線維芽細胞を播種し、その後、感染多重度（multiplicity of infection；ＭＯＩ）３にて、下記センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを細胞に感染させた。感染の７日後、トリプシンによって感染させた線維芽細胞を回収し、６０ｍｍのシャーレ当たり５．４×１０4個の細胞、或いは１００ｍｍのシャーレ当たり１～２×１０5個の細胞をＭＭＣ処理したＭＥＦ支持細胞上に播種した。翌日、ヒトｉＰＳ細胞培地に置き換え、感染の３０日後まで培養を継続し、コロニーを観察した。
　ｉＰＳ細胞の生成に対する骨形成タンパク質（ＢＭＰ－４，６，及び７）の影響は、感染８日目に置き換える上記ヒトｉＰＳ細胞培地に、それぞれ、ＢＭＰ－４（１０ng/ml）、ＢＭＰ－６（５０ng/ml）、及びＢＭＰ－７（１０ng/ml）を添加した培地を用い、３０日目まで培養することにより確認した。また、一部の実験では、ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤であるＬＤＮ－１９３１８９（ＳＴＥＭＧＥＮＴ；ステムジェント）を２００nMの濃度で上記ヒトｉＰＳ培地に添加した。
（３）センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターの構築及び検出
　Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋ１ｆ４遺伝子及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子を含むＳｅＶベクターは、N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される通り作成した。ＳｅＶのゲノムを検出するために、ネストＰＣＲを行った。皮膚線維芽細胞及びｉＰＳ細胞から抽出した１マイクログラムのトータルＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次いで、一対のＳｅＶ特異的プライマーを用いてｃＤＮＡを増幅し、これらＰＣＲ産物の１／１０容積をさらに、一対にネストプライマーを用いて増幅させた。プライマーの配列及び増幅条件を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（４）ＦＯＰ患者由来皮膚繊維芽細胞の骨芽細胞への分化誘導
　上記（２）と同様にして行った。ＦＯＰ患者又は健常人から由来する皮膚繊維芽細胞に、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋ１ｆ４遺伝子及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子を含むＳｅＶベクターを感染させ、感染７日後に感染した繊維芽細胞を回収し、ＭＥＦ支持細胞上に播種した。翌日、ＢＭＰ－６を５０ ng/ml添加したヒトｉＰＳ細胞培地に置き換え、感染後３０日目まで培養を続けた。一部の実験では、ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤であるＬＤＮ－１９３１８９（ＳＴＥＭＧＥＮＴ；ステムジェント）及びドルソモルフィン（シグマ）をそれぞれ、２００nM及び１μM添加したヒトｉＰＳ培地を用いた。
（５）アルカリフォスファターゼ染色及び免疫組織化学
　白血球アルカリフォスファターゼキット（Leukocyte Alkaline Phosphatase kit；シグマ）を用いてアルカリフォスファターゼ染色を行った。免疫細胞化学については、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで４℃にて３０分間細胞を固定した。核に局在する分子については、室温にて１５分間、０．２％トリトンＸ－１００にて試料を処理した。２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで細胞を３回洗浄し、次いで一次抗体と共に２％ＦＢＳを含有するＰＢＳにて４℃で一晩インキュベートした。一次抗体には、ＳＳＥＡ４（１：５００、ミリポア）、ＴＲＡ－１６０（１：５００、ミリポア）、Ｎａｎｏｇ（１：１０００、Ｒ＆Ｄシステムズ）及びＯｃｔ３／４（１：５００、Santa-Cruz）が含まれる。二次抗体には、アレクサ４８８が結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１０００、インビトロジェン）及びアレクサ４８８が結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（１：１０００、インビトロジェン）を用いた。分化マーカーの染色については、Ｓｏｘ１７（１：２００、Ｒ＆Ｄシステムズ）、Ｆｏｘａ２（１：２００、Ｒ＆Ｄシステムズ）及びブラキュリ(Brachyury)（1：200、Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いた。核は１μｇ／ｍＬのヘキスト３３２５８（インビトロジェン）で染色した。
（５）ＤＮＡの単離及び塩基配列決定
　ＤＮＡの塩基配列決定によってＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株におけるＡＬＫ２遺伝子の突然変異（Ｒ２０６Ｈ：６１７Ｇ＞Ａ及びＧ３５６Ｄ：１０６７Ｇ＞Ａ）を確認した。５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ及び０．１５ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含有する溶解緩衝液においてｉＰＳ細胞株を５５℃で一晩インキュベートした。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによってゲノムＤＮＡを抽出した。次いでＰＣＲによって１００ｎｇのゲノムＤＮＡを増幅させた。ABI PRISM（商標）310 Genetic Analyzer（ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネータｖ１．１サイクル・シーケンシング・キット、アプライドバイオシステムズ）によって、得られたＰＣＲ産物の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定に使用したプライマーの配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（Ｂ）結果
（１）ＦＯＰ患者及び健常者の情報
　上記材料及び方法に従い、センダイウイルス（ＳｅＶ）法によってＦＯＰ患者（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４）と健常者（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３）の皮膚由来の繊維芽細胞からｉＰＳ細胞の生成し、ＡＬＫ２遺伝子の突然変異を確認した。以下に、本実施例で用いた細胞が由来する患者及び正常者の情報を示す
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（２）骨形成タンパク質のｉＰＳ細胞生成に対する影響
　上記材料及び方法に従い、センダイウイルス（ＳｅＶ）法によって健常人（Ｎ１）の皮膚由来の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を生成することを試みた。ｉＰＳ細胞生成における、ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤であるＬＤＮ－１９３１８９（２００nM添加）、及び骨形成タンパク質ＢＭＰ－４（１０ng/ml添加）及びＢＭＰ－７（１０ng/ml添加）の影響を検討した。結果を図１に示す。（Ａ）は、実験計画を示す。左下の写真は、ＬＤＮ－１９３１８９、ＢＭＰ－４及びＢＭＰ－７の存在下及び非存在下で培養した細胞を、感染後３０日目に顕微鏡で細胞の状態を観察した結果である（図１Ｂ）。右下の写真は、感染後３０日目における、典型的(typical)な及び異常(atypical)なｉＰＳ細胞コロニーの数及び比率を示した結果である(図１Ｃ)。
　また、健常人（Ｎ１）の皮膚由来の線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の生成におけるＢＭＰ－６（５０ng/ml添加）の影響を検討した。結果を図２に示す。上段は、実験計画を示し、下段の左写真は、ＢＭＰ－６を添加しない場合、右写真は、ＢＭＰ－６を添加した場合の結果を示している。
　ＢＭＰ－４添加においては、ｉＰＳ細胞のコロニー数は少量の減少にとどまり、分化型コロニーが増加するのに対して、ＢＭＰ－６添加では、ｉＰＳ細胞コロニーそのものが激減する。この結果はＢＭＰ－４とＢＭＰ－６の下流シグナルが異なることを示唆している。したがって、１）ＦＯＰの原因がＢＭＰの受容体異常であること、２）ＦＯＰからはｉＰＳ細胞樹立が困難なことを合わせ考えると、ＦＯＰの異常は正常細胞へＢＭＰ－６を添加した状態に類似していることが考えられる。
（３）ＦＯＰ患者由来皮膚繊維芽細胞の骨芽細胞への分化誘導
　上記材料及び方法に従い、センダイウイルス（ＳｅＶ）法によって健常人（Ｎ１）及びＦＯＰ患者（Ｆ２０６Ｈ変異患者（Ｆ２）及びＧ３５６Ｄ変異患者（Ｆ４））の皮膚由来の線維芽細胞に初期化遺伝子を導入し、ＢＭＰ－６（５０ng/ml添加）の存在下及び非存在下で培養を行った。ｉＰＳ細胞培地に変換後の培養１週間後及び２週間後における骨芽細胞の出現をアルカリフォスファターゼ染色により確認した。結果を図３に示す。
　健康人由来の皮膚線維芽細胞では骨芽細胞への誘導がほとんど起こらないのに対して、ＦＯＰ患者由来皮膚線維芽細胞ではＢＭＰ－６存在下で効率よく骨芽細胞へ分化を誘導できることが確認された。
（４）ＦＯＰ患者由来皮膚繊維芽細胞を用いた骨分化制御物質のスクリーニング
　ＦＯＰ患者由来皮膚繊維芽細胞を用いた上記の方法では、正常ではほとんど分化が誘導されないのに対して、ＦＯＰ患者由来皮膚線維芽細胞は骨芽細胞への分化が容易に増強される。そこで上記方法に従い、ＦＯＰ患者（Ｆ２）由来皮膚繊維芽細胞を用いた骨芽細胞への分化誘導における、ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤であるＬＤＮ－１９３１８９とドルソモルフィンの影響を確認した。ＬＤＮ－１９３１８９、ドルソモルフィン、及びＢＭＰ－６の添加量は、それぞれ、２００nM、１μM、及び５０ng/mlである。ｉＰＳ細胞培地に変換後の培養２週間後における骨芽細胞の出現をアルカリフォスファターゼ染色により確認した結果を図４に示す。ＬＤＮ－１９３１８９又はドルソモルフィンを添加するとＦＯＰ由来皮膚線維芽細胞では優位に骨芽細胞への分化を抑制することができた。
　同様にして、Ｆ２０６Ｈ変異ＦＯＰ患者（Ｆ２）及びＧ３５６Ｄ変異ＦＯＰ患者（Ｆ４）由来の皮膚繊維芽細胞を用いて、ＬＤＮ－１９３１８９とドルソモルフィンの影響を確認した。ＬＤＮ－１９３１８９、ドルソモルフィン及びＢＭＰ－６の添加量は上記と同様である。ｉＰＳ細胞培地に変換後の培養２週間後における骨芽細胞の出現をアルカリフォスファターゼ染色により確認した結果を図５に示す。いずれの変異のＦＯＰ患者由来の皮膚繊維芽細胞においても、ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤（ＬＤＮ－１９３１８９とドルソモルフィン）により、骨芽細胞への分化が抑制されることが確認された。
（５）健常人及びＦＯＰ患者由来の皮膚繊維芽細胞に対する骨形成タンパク質の影響
　上記材料及び方法に従い、センダイウイルス（ＳｅＶ）法によって健常人（Ｎ１）及びＦＯＰ患者（Ｆ２）の皮膚由来の線維芽細胞に初期化遺伝子を導入し、ＢＭＰ－４（１０ng/ml添加）、ＢＭＰ－６（５０ng/ml添加）又はＢＭＰ－７（１０ng/ml添加）の存在下及び非存在下で培養を行った。ｉＰＳ細胞培地に変換後の培養１週間後及び２週間後におけるアルカリフォスファターゼ活性を測定した。アルカリフォスファターゼ活性は、ラボアッセイTMＡＬＰ（和光純薬工業）を用いて、製造元の手順書に従って測定した。結果を図６に示す。
　上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
　ＦＯＰ患者の皮膚由来の線維芽細胞に初期化遺伝子を導入した細胞を、ＢＭＰ－６の存在下で培養することにより、細胞の骨分化を誘導できることが明らかになった。この骨分化誘導システムを用いて、比較的簡易なインビトロ（細胞レベル）でのスクリーニング系で、骨分化の制御（促進又は抑制）にかかわる分子をスクリーニングすることができる。

Claims (24)

  1. 　ｉＰＳ細胞の作成のための初期化遺伝子を導入した進行性骨化性繊維異形成症に罹患した個体に由来する体細胞又はその細胞由来の継代された細胞を骨誘導因子ＢＭＰ－６の存在下で培養することを含む体細胞又はそれに由来する細胞の骨芽細胞への分化誘導方法。
  2. 　前記体細胞が皮膚繊維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記細胞がヒト細胞である、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記細胞が、以下の遺伝子：
    １）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は
    ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、
    を有する、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記初期化遺伝子が、少なくともOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子を含む、請求項１～４いずれか一つに記載の方法。
  6. 　前記初期化遺伝子が、さらにMyc遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記細胞の培養を、ＢＭＰ－６を１０～１００ng/mlの濃度で含有する培地で行う、請求項１～５のいずれか一つに記載の方法。
  8. 　以下の工程：
    ａ）進行性骨化性繊維異形成症に罹患した個体に由来する体細胞にｉＰＳ細胞の作成ための初期遺伝子が導入された細胞又はその細胞由来の継代された細胞を、骨誘導因子ＢＭＰ－６及び被験物質の存在下で培養する；及び
    ｂ）前記細胞の骨化を評価することにより、骨化を抑制する又は骨化を促進する被験物質を選別する：
    ことを含む骨化制御（骨化促進又は骨化抑制）物質のスクリーニング方法。
  9. 　前記体細胞が皮膚繊維芽細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記細胞がヒト細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記細胞が、以下の遺伝子：
    １）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は
    ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、
    を有する、請求項８～１０のいずれか一つに記載の方法。
  12. 　前記初期化遺伝子が、少なくともOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子を含む、請求項８～１１のいずれか一つに記載の方法。
  13. 　前記初期化遺伝子がさらに、Myc遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記細胞の培養を、ＢＭＰ－６を１０～１００ng/mlの濃度で含有する培地で行う、請求項８～１３のいずれか一つに記載の方法。
  15. 　以下の遺伝子：
    1）ｉＰＳ細胞の作成のための初期化遺伝子であるOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子、並びに
    2）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むＡＬＫ２変異遺伝子、
    を導入した哺乳動物由来の細胞を、骨誘導因子ＢＭＰ－６の存在下で培養することを含む、該細胞の骨芽細胞への分化誘導方法。
  16. 　前記哺乳動物由来の細胞が、初期化遺伝子としてさらにMyc遺伝子が導入された、請求項１５に記載の分化誘導方法。
  17. 　前記哺乳動物由来の細胞が、ヒト細胞である請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 　前記細胞の培養を、ＢＭＰ－６を１０～１００ng/mlの濃度で含有する培地で行う、請求項１５～１７のいずれか一つに記載の方法。
  19. 　以下の遺伝子：
    1）ｉＰＳ細胞の作成のための初期化遺伝子であるOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子、並びに
    2）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むＡＬＫ２変異遺伝子、
    を導入した哺乳動物由来の細胞であって、
    骨誘導因子ＢＭＰ－６の存在下で培養することにより骨芽細胞へと分化する細胞。
  20. 　前記哺乳動物由来の細胞が、初期化遺伝子としてさらにMyc遺伝子が導入された、請求項１９に記載の細胞。
  21. 　前記細胞がヒト細胞である請求項１９又は２０に記載の細胞。
  22. 　以下の工程：
    ａ）請求項１９～２１のいずれか一つに記載の細胞を、骨誘導因子ＢＭＰ－６及び被験物質の存在下で培養する；及び
    ｂ）前記細胞の骨化を評価することにより、骨化を抑制する又は骨化を促進する被験物質を選別する：
    ことを含む骨化制御（骨化促進又は骨化抑制）物質のスクリーニング方法。
  23. 　前記培養を、ＢＭＰ－６を１０～１００ng/mlの濃度で含有する培地で行う、請求項２２に記載のスクリーニング方法。
  24. 　骨化制御（骨化促進又は骨化抑制）物質をスクリーニングするためのキットであって、請求項１９～２１のいずれか一つに記載の細胞、骨誘導因子ＢＭＰ－６、及び該細胞を培養するための培地を含むキット。
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