JPWO2017033863A1 - 骨芽細胞及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、さまざまな腫瘍や外傷や手術等にともなう骨欠損の修復や、歯周病に代表される骨吸収、骨折や骨粗しょう症などに対する治療に応用可能で、癌化の危険性が少ない骨芽細胞を調製する方法を提供することを目的とする。斯かる課題を解決する手段として、哺乳動物の体細胞にOct9遺伝子又はその発現産物を導入する工程を含む、前記体細胞から骨芽細胞を調製する方法を提供する。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年８月２１日に出願された、日本国特許出願第2015-163880号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。

本発明は、骨芽細胞及びその調製方法に関し、詳しくはダイレクト・リプログラミングによる骨芽細胞の調製方法に関する。

骨腫瘍、外傷や骨髄炎等にともなう骨欠損、また骨腫瘍等の掻爬後の骨欠損の修復目的で、病変部に骨芽細胞を移植すれば、骨形成を促進し、機能的形態的な予後が向上すると期待できる。実際に、たとえば患者の海綿骨から採取した骨髄細胞を自家移植する治療が行われており、その有効性が知られている。この場合自家骨髄細胞に含まれる間葉系幹細胞から骨芽細胞が分化誘導され、骨形成とリモデリングに寄与していると考えられる。一方、高齢化にともなって骨粗しょう症の罹患率が増加しており、高齢者が骨折すると長期臥床に繋がることもある。骨芽細胞の移植は、骨粗しょう症や外傷等に伴う骨折、難治性骨折や偽骨折の治癒を促進できると考えられる。骨芽細胞の移植はまた、関節リウマチ、突発性大腿骨頭壊死、変形性関節症、腰椎変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、椎間板ヘルニア、脊椎分離症、脊椎分離すべり症、脊椎側弯症、頸椎症性脊髄症、後縦靭帯骨化症、脊髄損傷、変形性股関節症、変形性膝関節症、大腿骨頭すべり症、骨軟化症、手術後の骨の修復（心臓手術後の胸骨の修復など）、人工足関節手術に伴う欠損部の修復、骨髄炎、骨壊死等にも有用な可能性がある。

一方、歯周病は第４の生活習慣病とも呼ばれ、罹患率が極めて高く、またさまざまな全身疾患の原因になっている。歯周病の進行にともなって、歯槽骨の骨吸収が起こるので、骨芽細胞を効率良く局所の骨吸収部に供給出来れば、歯槽骨の再生治療につながると考えられる。

また、骨芽細胞の移植を、骨移植、人工骨移植、人工関節やインプラントと併用すれば、治療効果を高められる可能性がある。

このような移植目的の骨芽細胞として、これまで骨髄間葉系幹細胞や骨髄間葉系幹細胞を含む骨髄細胞などが用いられてきた。しかし骨髄の採取は患者への侵襲が大きく、また十分な数の骨髄細胞が供給できない場合があるなどの問題点がある。一方、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いれば、患者から骨髄を採取する必要はなく、また十分な数の骨芽細胞を供給できる可能性があるが、倫理的問題に加えて移植後に残存ES細胞が腫瘍化する危険性がある。またiPS細胞を用いても、患者から骨髄を採取する必要はなく、また十分な数の骨芽細胞を供給できる可能性があるが、移植後に残存iPS細胞が腫瘍化する危険性がある。

非特許文献１は、ヒトES細胞へのOsterixのLentivirusベクター導入＋Osteogenic培地での骨芽細胞への分化誘導を行っている。
非特許文献２，３は、マウスiPS細胞からMSCを経てOsteogenic培地で分化誘導して骨芽細胞を得ている。

非特許文献４は、マウスiPS細胞にRunx2のAdenovirusベクターを導入し、Osteogenic培地で分化誘導して骨芽細胞を得ている。非特許文献１〜４に示されるように、骨芽細胞はES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞から分化誘導して作製されているため、長期間の培養を要し、また癌化の危険性があった。

体細胞に、組織特異的な転写因子の遺伝子群を導入して、iPS細胞を経ずに直接その組織細胞に分化誘導できること（ダイレクト・リプログラミング（ダイレクト・コンヴァージョン））について、たとえば、以下の報告がある：
マウス線維芽細胞→軟骨細胞（SOX9 ＋ Klf4 ＋ c‐Myc遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→心筋細胞（GATA4 ＋ Mef2c ＋ Tbx5遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→肝細胞（Hnf4α＋（Foxa1またはFoxa2またはFoxa3）遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→神経幹細胞（Sox2 ＋ FoxG1遺伝子を導入など）、
マウス、ヒト細胞→造血幹細胞など。

特許文献１には、体細胞に所定の遺伝子群を導入して、機能性を有する骨芽細胞を効率よく調製（ダイレクト・コンヴァージョン）するための方法が開示されている。しかしながら、さらに優れた方法が依然として求められている。

国際公開公報WO2015/012377

Karner E et al. J Cell Physiol. 2009. Li F et al. J Cell Biochem. 2010. Biloussova G et al. Stem cells. 2011. Tashiro K et al. Stem cells. 2009.

本発明は、さまざまな腫瘍や外傷や手術等にともなう骨欠損の修復や、歯周病に代表される骨吸収、骨折や骨粗しょう症などに対する治療に応用可能で、癌化の危険性が少ない骨芽細胞を調製する方法を提供することを目的とする。

本発明は、哺乳動物の体細胞にOct9遺伝子を導入することで、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞を経由することなく、直接（ダイレクト・リプログラミング）骨芽細胞が得られることを見出した。

項１、哺乳動物の体細胞にOct9遺伝子又はその発現産物を導入する工程を含む、前記体細胞から骨芽細胞を調製する方法。

項２、哺乳動物の体細胞にOct9遺伝子又はその発現産物、並びに、c-Myc遺伝子、L-Myc遺伝子及びN-Myc遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種又はその発現産物を導入することで、前記体細胞から骨芽細胞を調製する方法。

項３、前記体細胞が線維芽細胞である、項１又は２に記載の方法。

項４、遺伝子又はその発現産物を導入した体細胞を、骨芽細胞の誘導培地で培養する工程をさらに含む、項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

項５、哺乳動物の体細胞に由来し、外来性のOct9遺伝子又はその発現産物を有する骨芽細胞。

本発明は、以下の骨芽細胞及びその調製方法を包含する。

本発明では、ダイレクト・リプログラミングにより体細胞から短期間で骨芽細胞を提供できる。この骨芽細胞は、移植する本人の体細胞から容易に誘導できるので、骨芽細胞自体又はそれから作製した骨組織を移植した場合にも免疫学的な拒絶応答などの問題は生じない。また、iPS細胞やES細胞を経由することなく直接体細胞から骨芽細胞を誘導できるため、癌化などの多能性幹細胞に起因する問題を回避できる。

Real-time RT-PCRによるRunx2遺伝子のｍRNA発現量（相対mRNA量）の測定。導入された遺伝子は、「＋」で示される。 Runx2免疫染色。核DNAをDAPIで共染色した。倍率 x100、Scale bar = 200 μm 図２ＡのRunx2免疫染色像の白黒反転図である。 Runx2免疫染色。核DNAをDAPIで共染色した。倍率 x100、Scale bar = 200 μm 図３ＡのRunx2免疫染色像の白黒反転図である。 Real-time RT-PCRによるRunx2遺伝子のｍRNA発現量（相対mRNA量）の測定。導入された遺伝子は、「＋」で示される。 Real-time RT-PCRによるOsteocalcin遺伝子のｍRNA発現量（相対mRNA量）の測定。導入された遺伝子は、「＋」で示される。 （上段）アリザリンレッドS染色の結果を、肉眼像（倍率ｘ１倍）及び位相差顕微鏡像（倍率ｘ４０倍）により示す。（下段）アリザリンレッドS染色の染色強度を示すグラフである。 Osteocalcin免疫染色。核DNAをDAPIで共染色した。倍率 x100 図７ＡのOsteocalcin免疫染色像の白黒反転図である。

本発明は、哺乳動物の分化した体細胞を骨芽細胞にコンヴァートすることで、骨芽細胞を調製する方法に関する。「コンヴァート」とは、体細胞を目的の骨芽細胞へと変換することを意味する。本発明の方法の好ましい態様の１つは、「ダイレクトリプログラミング」、「ダイレクトコンヴァージョン」ともよばれる、iPS細胞の作製に代表される細胞の初期化の工程を経ることなく、体細胞を骨芽細胞にコンヴァートする方法である。

本発明の方法の好ましい態様においては、体細胞は遺伝子の導入なしに、骨芽細胞へとコンヴァートされる。「遺伝子の導入なしに」とは、体細胞の当初のゲノム配列（主として、ＤＮＡの塩基配列を意味する）が変化することなく、骨芽細胞へとコンヴァートされることを意味する。あるいは、「遺伝子の導入なしに」とは、体細胞の当初の内在遺
伝子の機能に基づき、他の体細胞へとコンヴァートされることを意味する。

骨芽細胞
本発明は、骨芽細胞の調製方法を提供する。本発明により、前骨芽細胞、未熟骨芽細胞、成熟骨芽細胞、骨細胞等も調製することができる。本明細書では簡単のためこれらをすべて骨芽細胞と呼ぶ。

骨芽細胞が得られたことは、ALP（アルカリフォスファターゼ）の活性の検出；ALP、オステオカルシン(Osteocalcin、OC)、オステオポンチン(Osteopontin)、Runx2などのマーカー遺伝子の発現を例えばmRNAのリアルタイムPCRなどによる検出；アリザリンレッドＳ染色やvon Kossa染色(ミネラル化した骨基質の産生)などにより確認することができる。

Runx2は骨形成において必須の転写因子である。Runx2は、生体での間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化において必要不可欠な役割を果たしている。間葉系幹細胞へのRunx2の強制発現は、OC（オステオカルシン）、BSP（Bone sialo-protein）、ALP（アルカリフォスファターゼ）、COL1A1等の骨芽細胞特異的遺伝子を増大させる。Runx2 KOマウスは、成熟骨芽細胞の喪失から完全に膜性骨化も軟骨内骨化も示さない。しかし、このマウス由来の間葉系幹細胞は、脂肪細胞と軟骨細胞への誘導能は有している。

ALP（アルカリフォスファターゼ）は、骨芽細胞の早期から中期分化マーカーである。骨芽細胞の膜表面と骨芽細胞より分泌される基質小胞に多く含まれ、石灰化基質産生の開始に関与する。

オステオカルシン(Osteocalcin、OC)は骨芽細胞特異的に発現し、骨形成に寄与すると考えられている。

アリザリンレッドＳによる染色やvon Kossa染色は、骨形成の重要な要素の一つである、ミネラル化した骨基質の産生、すなわちカルシウムの沈着を検出することができる。

本発明により得られる骨芽細胞（移植材料）を用いて治療する対象となる疾患としては、骨腫瘍、外傷や骨髄炎等にともなう骨欠損、また骨腫瘍等の掻爬後の骨欠損、骨折、骨粗しょう症、歯周病、歯槽骨吸収、関節リウマチ、突発性大腿骨頭壊死、変形性関節症、腰椎変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、椎間板ヘルニア、脊椎分離症、脊椎分離すべり症、脊椎側弯症、頸椎症性脊髄症、後縦靭帯骨化症、脊髄損傷、変形性股関節症、変形性膝関節症、大腿骨頭すべり症、骨軟化症、下顎再建術などの複雑骨折により破壊された骨折部位の再建術、手術後の骨の修復（心臓手術後の胸骨の修復など）、人工足関節手術に伴う欠損部の修復、骨髄炎、骨壊死などが挙げられる。また、骨芽細胞を移植すれば、骨移植、人工骨移植、人工関節やインプラントと併用し治療効果を高められる可能性がある。また骨芽細胞を3次元的なスキャホルド等を用いて培養して種々な形態の骨組織を体外で作製し、その骨組織を移植するによって、上記の疾患の治療を行うこともできる。それ以外にも骨芽細胞の欠損、不足もしくは機能低下に関係するさまざまな疾患が対象となる。

本明細書において、特に明示のない限り、「治療」という用語は、患者が特定の疾患又は障害を患っている間に行う処置を意図し、これによって疾患若しくは障害の重症度、又は１つ若しくは複数のその症状が軽減されるか、又は疾患若しくは障害の進行が遅延又は減速することを意味する。本明細書において、「治療」には「予防」を含むものとする。

本発明で得られる骨芽細胞はまた、疾患の治療に限らず、美容目的で用いることもできる。例えば事故や手術などにより欠損した部位に骨芽細胞もしくはそれにより作製された骨組織を移植することで、骨基質を産生させて欠損部位を修復し、ふっくらさせて目立たなくすることができる。その際、ヒトに対する処置も、本明細書では便宜上治療と呼び、「患者」は「健常者」あるいは「ヒト」、「疾患」は「美容」と読み替えることができる。

本発明はまた、ヒトだけでなく、イヌ、ネコ等の愛玩動物やウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ等の家畜を含む哺乳動物の疾患の治療にも用いることが可能である。その場合、「患者」を「患畜」あるいは「哺乳動物」と読み替えることとする。

移植材料とは、骨組織の修復、再建のために生体内に導入する、骨芽細胞を含有する材料をいう。移植材料は、インビトロで部分的もしくは完全に骨組織を再生させて、同一または別の個体に移植する材料を包含する。本発明で得られた骨芽細胞は、移植材料の作製に使用することができる。骨芽細胞自体も移植材料になる。したがって、骨芽細胞を細胞製剤として患者に移植することもできるし、ヒドロキシアパタイトや生体吸収性セラミックなどの人工材料からなる基材（スキャホルド(scaffold)）とともに移植したり、スキャホルドとともに培養してから移植することができる。これらの場合、スキャホルドは移植目的に応じて様々な3次元的な形状を作らせることができる。

体細胞
本発明の方法の対象となる哺乳動物の分化した体細胞としては、哺乳動物由来であって、骨芽細胞そのもの及び生体内で骨芽細胞へと分化する能力を有する細胞でない限り、特に限定されない。

体細胞は、哺乳動物由来であればよい。骨芽細胞を生体に移植する場合には、移植される被験体由来の体細胞(自家細胞)を用いることが、感染や拒絶応答等の危険を低減させるために好ましい。しかしながら、突然の骨折などに対して移植するなどの目的の場合、自家細胞でなく、他人や他の動物の体細胞からあらかじめ準備しておいた骨芽細胞を移植に用いることができる。またはあらかじめ準備しておいた他人や他の動物の体細胞から骨芽細胞を作り、移植に用いることができる。すなわち、骨芽細胞バンク、または骨芽細胞前駆細胞のバンクを作っておき移植目的に供することができる。このような場合、拒絶応答等の危険を低減させるために、あらかじめMHCをタイピングしておくことができる。また、あらかじめ骨芽細胞のキャラクターや造腫瘍性などを確認しておくことができる。

本明細書において、哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタなどが挙げられ、特にヒトが挙げられる。

本発明はまた、骨芽細胞を用いたさまざまな研究や技術開発等に用いることができる。たとえば骨の発生と老化、形態形成、リモデリングの機構、これらに対する力学的ストレス、栄養、免疫、神経、ホルモンの影響の解析などの基礎研究に有用である。またストロンチウム90等の放射性物質の内部被爆における骨への影響の解析と骨からのストロンチウム90の除去技術の開発等にも有用である。

本発明を用いれば、さまざまな疾患や遺伝的背景を有するヒトや動物から簡便、迅速、安価に骨芽細胞を樹立できるので、疾患や遺伝的背景に関連した骨芽細胞の異常を生化学的、分子生物学的、免疫学的等手法により解析することが可能であり、これにより疾患の発症機序の解明などの研究や診断法の開発に役立てることができる。またこのような骨芽細胞を用いて、薬剤の開発、薬剤の毒性試験等を行えば、種々の疾患に対する新規治療法の開発に役立てることができる。

本発明の方法（ダイレクト・リプログラミング）の対象となる体細胞としては、特に限定されないが、例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、口腔粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞、胃粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、歯肉細胞（歯肉線維芽細胞、歯肉上皮細胞）、歯髄細胞、歯根膜細胞、白血球、リンパ球、筋細胞、結膜上皮細胞、破骨細胞などが挙げられ、好ましくは線維芽細胞、ケラチノサイト、口腔粘膜上皮細胞、歯肉細胞、白血球、リンパ球、破骨細胞などが挙げられる。

また、間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell: MSC）、神経幹細胞（Neural stem cell）、肝幹細胞（hepatic stem cell）、腸幹細胞、皮膚幹細胞、毛包幹細胞、色素細胞幹細胞などの体性幹細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて作製した体細胞も挙げられる。また、さまざまな体細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて別の体細胞に誘導した細胞も挙げられる。また、生殖系列の細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。

また、胎性幹細胞（Embryonic stem cell：ES細胞）や人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）から分化誘導し、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。

また、厳密には体細胞ではないが、ES細胞、iPS細胞、あるいは生殖系列の細胞も本発明の「体細胞」に包含される（その際には、「体細胞」を「ES細胞」、「iPS細胞」あるいは「生殖系列の細胞」と読み替えるものとする）。

また、培養細胞も挙げられ、培養細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。

遺伝子
本発明の方法は、体細胞に、Oct9遺伝子又はその発現産物を導入する工程を含む。ここで、「遺伝子」とは、遺伝子情報をコードするものであれば、ゲノムＤＮＡ（通常は、２本鎖ＤＮＡ）、ｃＤＮＡ（正鎖の１本鎖ＤＮＡ、又は、２本鎖ＤＮＡ）を包含する。また、「発現産物」としては、遺伝子のmRNA又はタンパク質が挙げられる。

Oct9（POU class 3 homeobox 4、POU3F4, Brain-specific homeobox/POU domain protein 4 、Brain-4またはBrn-4ともいう）は、POUドメインファミリーのクラス３に属する転写因子である。Octamer motif (ATGCAAAT)と特異的に結合すると考えられている。Oct9は脳（視床下部、海馬）、内耳、膵臓等に発現する。Oct9は神経細胞の分化に関与し，神経幹細胞の分化に必須に関与するといわれている（文献A）。また内耳の発生に重要な役割をしており，Oct9の欠損は難聴を来たすといわれている（文献B）。しかし、骨芽細胞での役割は知られていない。

文献Cには、Runx2、Osterix、Oct3/4とL-mycの４因子を線維芽細胞に導入することにより、骨芽細胞に誘導できること、またOct4とL-mycの2因子を線維芽細胞に導入することによっても、骨芽細胞様の細胞に誘導できることが示されている。従って文献CではOct3/4が望ましい遺伝子であると結論づけている。しかし、Oct3/4はある種のがんで発現していると報告されており（文献D、E），腫瘍形成に関与している可能性がある。

文献CではOct9については何ら言及はしていないが、今回、Oct９もOct3/4と同等またはそれ以上に、単独又はmycファミリーの遺伝子との共導入によって線維芽細胞を骨芽細胞様にコンヴァートさせることを見出した。Oct9はOct3/4と異なって発がんに関与していないので、この点では、Oct3/4よりもOct9の方が望ましい可能性がある。

また、N-myc遺伝子は神経芽細胞腫などのneural originおよびneuroendocrine系の腫瘍の発症に関与することが知られているが、骨腫瘍への関与は知られていない（文献F）ので、Oct9とN-Mycを共導入して誘導した骨芽細胞が腫瘍形成の危険性が低く望ましい可能性がある。

文献A：Tan XF, Qin JB, Jin GH, Tian ML, Li HM, Zhu HX, Zhang XH, Shi JH, Huang Z (2010) Effects of Brn-4 on the neuronal differentiation of neural stem cells derived from rat midbrain. Cell Biol Int 34: 877-882.
文献B：Braunstein EM, Crenshaw EB 3rd, Morrow BE, Adams JC. (2008) Cooperative function of Tbx1 and Brn4 in the periotic mesenchyme is necessary for cochlea formation. J Assoc Res Otolaryngol 9:33-43.
文献C：Direct conversion of human fibroblasts into functional osteoblasts by defined factors.Yamamoto K, Kishida T, Sato Y, Nishioka K, Ejima A, Fujiwara H, Kubo T, Yamamoto T, Kanamura N, Mazda O. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 May 12;112(19):6152-7
文献D：Jin T, Branch DR, Zhang X, Qi S, Youngson B, Goss PE (1999) Examination of POU homeobox gene expression in human breast cancer cells. Int J Cancer 81: 104-112
文献E：Wang P, Branch DR, Bali M, Schultz GA, Goss PE, Jin T (2003) The POU homeodomain protein OCT3 as a potential transcriptional activator for fibroblast growth factor-4 (FGF-4) in human breast cancer cells. Biochem J 375: 199-205文献F：Beltran H (2014) The N-myc Oncogene: Maximizing its Targets, Regulation, and Therapeutic Potential. 12:815-822

体細胞が骨芽細胞へ変換される効率が高いとの観点から、Oct9遺伝子に加えて、c-Myc遺伝子、L-Myc遺伝子及びN-Myc遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種又はその発現産物を導入してもよい。すなわち、本発明の態様の一部として、Oct9とc-Mycの組み合わせ、Oct9とL-Myc遺伝子の組み合わせ及び、Oct9とN-Mycの組み合わせが挙げられる。

本発明の方法において、本発明の効果を損なわない限り、上記遺伝子又はその発現産物に加えて、他の遺伝子を導入してもよい。追加で導入される遺伝子としては、Oct4（Oct3、Oct3/4ともいう）、Oct1A、Oct6、Klfファミリー（KLF1, KLF2, KLF3, KLF4, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF14, KLF15, KLF16, KLF17）、Lin-28、Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、Sox18等のリプログラミング遺伝子が挙げられる。また、Runx2、Osterix、Dlx5等の骨関連遺伝子も挙げられる。これらの遺伝子は、１種単独で又は２種以上を追加で用いることができる。

本発明の方法において体細胞に導入される遺伝子又はその発現産物は、Oct9遺伝子を含めて１種又は２種以上とすることができる。簡便性の観点から、１種（Oct9遺伝子又はその発現産物のみ）〜４種程度（Oct9遺伝子又はその発現産物に加えて３種程度）、好ましくは１種、２種（Oct9遺伝子又はその発現産物に加えて１種）又は３種（Oct9遺伝子又はその発現産物に加えて２種）とすることができる。具体的な態様としては、Oct9遺伝子又はその発現産物のみ；Oct9遺伝子又はその発現産物、並びに、c-Myc遺伝子、L-Myc遺伝子及びN-Myc遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種又はその発現産物の計２種が例示される。

上記遺伝子は、いずれも、脊椎動物で高度に保存されている遺伝子であり、本明細書では、特に動物名を示さない限り、ホモログを含めた遺伝子を表すものとする。また、polymorphismを含め、変異を有する遺伝子であっても、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する遺伝子もまた、含まれるものとする。

例えば、ヒト（Homo sapiens）のOct9遺伝子、c-Myc遺伝子、L-Myc遺伝子及びN-Myc遺伝子のcDNA塩基配列及びこれがコードするタンパク質のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（NCBI; National Center for Biotechnology Information）が提供するGenBankに、下記のアクセッション番号で登録されている（複数のリビジョン（revision）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）：
ヒトOct9遺伝子mRNA配列：NM_000307（例えば、NM_000307.4）、
ヒトOct9タンパク質アミノ酸配位列：NP_000298（例えば、NP_000298.3 ）；NM_002467.4 → NP_002458.2
ヒトc-Myc遺伝子mRNA配列：NM_002467（例えば、NM_002467.4）、
ヒトc-Mycタンパク質アミノ酸配位列：NP_002458（例えば、NP_002458.2）；
ヒトL-Myc遺伝子mRNA配列：NM_001033081、NM_001033082、NM_005376（例えば、NM_001033081.2、NM_001033082.2、NM_005376.4）、
ヒトL-Mycタンパク質アミノ酸配位列：NP_001028253、NP_001028254、NP_005367（NP_001028253.1、NP_001028254.2、NP_005367.2）；
ヒトN-Myc遺伝子mRNA配列：NM_001293228、NM_001293231、NM_001293233、NM_005378（例えば、NM_001293228.1、NM_001293231.1、NM_001293233.1、NM_005378.5）、
ヒトN-Mycタンパク質アミノ酸配位列：NP_001280157、NP_001280160、NP_001280162、NP_005369（例えば、NP_001280157.1、NP_001280160.1、NP_001280162.1、NP_005369.2）。

導入
本発明の方法は、特定の遺伝子を選択する以外は、公知のダイレクト・リプログラミングの手法に準じて行うことができる。例えば以下のいずれかの文献の方法に準じて行うことができる：
文献：１ Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytesby Defined Factors; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142: 375-386, 2010.
2 Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof & Marius Wernig. Nature 463: 1035-1041, 2010
3 Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476: 220-223, 2011.
4 Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outani, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121: 640-657, 2011.
5 Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui, . Nature 475:386-389, 2011.
6 Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475:390-393, 2011.
上記の文献１〜６の内容は本明細書に参考として援用される。

さらに、Runx2、Osterix、Oct3/4とL-mycの４因子を線維芽細胞に導入することにより、骨芽細胞に誘導できること、またはOct3/4とL-mycの2因子を線維芽細胞に導入することによっても、骨芽細胞様の細胞に誘導できることが示されている前述の文献Cの方法に準じて行うこともできる(文献C)。

具体的には、骨芽細胞に変換するための導入遺伝子（骨関連遺伝子とリプログラミング関連遺伝子の組み合わせ、或いはリプログラミング関連遺伝子単独）を発現ベクターに組み込み、対象とする体細胞に発現ベクターを導入し、細胞内で発現させることが好ましい。

遺伝子を導入する方法としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルス性ベクターを感染させる方法のほか、遺伝子とその発現産物の導入の場合には、カチオニック・リポソーム、カチオニック・ポリマー、電気穿孔法等の非ウイルスベクターで、プラスミドベクターやエピゾーマルベクター、遺伝子の発現産物（mRNA、タンパク質）をトランスフェクションする方法も用いることができる。また、mRNAを導入することもできる。これら遺伝子導入に用いる手段をすべて包括して、本明細書ではベクターと呼ぶ。

また、治療目的の遺伝子とともに薬剤選択マーカーとなる遺伝子（ピューロマイシン耐性、ブラストサイジンS耐性、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性など）を導入し、その後薬剤選択を行うことによって、治療用遺伝子を発現する細胞を選択してから用いることができる。

また、導入因子が骨関連遺伝子の発現産物とリプログラミング関連遺伝子の発現産物(例えばタンパク質)の場合には、Protein Transduction Domain（PTD）と呼ばれるペプチドを発現産物である蛋白質に結合させ、培地に添加することにより、体細胞内に導入してもよい。骨芽細胞の原料となる体細胞で、骨関連遺伝子の一部が発現している場合は、その蛋白質に関しては外部から導入する必要がない。また、リプログラミング因子やリプログラミング因子の遺伝子を導入しなくても、小分子で代替して骨芽細胞を誘導することができる。たとえば、”Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. ” Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, Han DW, Lin T, Trauger S, Bien G, Yao S, Zhu Y, Siuzdak G, Scholer HR, Duan L, Ding S. Cell Stem Cell. 2009 May 8;4(5):381-4. や、”Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. ” Kim D, Kim CH, Moon JI, Chung YG, Chang MY, Han BS, Ko S, Yang E, Cha KY, Lanza R, Kim KS. Cell Stem Cell. 2009 Jun 5;4(6):472-6.に記載された方法である。

体細胞に導入される遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等）は、適切なプロモーターの制御下に転写させることができる。例えば、レトロウイルスベクターのLTR(long terminal repeat)プロモーターにより転写させることもできるし、ベクター内部の別のプロモーターから発現させてもよい。例えばCMVプロモーター、EF-1αプロモーター、CAGプロモーターなどの恒常発現プロモーター、または所望の誘導性プロモーターを利用することができる。また、LTRの一部を他のプロモーターに置換したキメラプロモーターを利用してもよい。

培養
本発明の方法において、哺乳動物の分化した体細胞を、遺伝子の導入後、培地中で培養することができる。

培養は、細胞及び培地を格納するための適切な容器中で行なうことができる。好適な培養を行なう手法として、約37℃程度および二酸化炭素濃度約5％程度の条件下で培養する手法が例示されるが、これに限定されるものではない。上記条件での培養は、例えば公知のCO₂インキュベータを用いて行なうことができる。

培養を行う期間は、本発明の効果を損なわない範囲で、特に限定されるものではない。例えば、24時間から60日間程度とすることができる。

培養において、必要において継代を行うことができる。継代を行う場合は、コンフルエント状態に到達する前または直後に細胞を回収し、細胞を新しい培地に播種する。また、本発明の培養において、培地を適宜交換することもできる。

培地
本発明の方法で用いる培地は、特に限定されない。DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、EMEM（Eagle's minimal essential medium）などの通常の液体培地を用いることができる。必要に応じて、血清成分（Fetal Bovine Serum（FBS）、Human Serum（HS））、ストレプトマイシン、ペニシリンなどの抗菌薬、Non-Essential Amino Acids等の成分を添加することができる。

本発明の方法により骨芽細胞を調製できる効率が高いとの観点から、培地として骨芽細胞を分化させるための分化誘導培地を用いることが好ましい。「骨芽細胞を分化させるための分化誘導培地」とは、多能性幹細胞（ES細胞、iPS細胞など）を骨芽細胞へと分化させることができる成分を含む培地を指す。

骨芽細胞を分化させるための分化誘導培地としては、特に限定されない。例えば、通常培地にアスコルビン酸（L-アスコルビン酸）若しくはその塩、β−グリセロリン酸（β-Glycerophosphate）若しくはその塩、デキサメタゾンなどの副腎皮質ホルモンを添加した培地を用いることができる。

具体的には、骨芽細胞を分化させるための分化誘導培地（骨誘導培地）としては、アスコルビン酸（例えば、濃度0.1〜1000μg/ml程度、好ましくは、1〜100μg/ml程度）；β-Glycerophosphate（例えば、濃度0.1〜1000mM程度、好ましくは1〜100mM程度）；デキサメタゾン（1 nM〜10 mM程度、好ましくは10〜1000 mM程度）及びヒドロコルチゾンなどの糖質コルチコイドからなる群から選択される成分（１種又は２種以上）を通常の液体培地に添加したものが例示される。50 μg/ml程度のアスコルビン酸、10 mM程度のβ-Glycerophosphate、100 nM程度のデキサメタゾン（いずれも最終濃度）を、10%FBS若しくは5%HS添加のDMEMなどの通常培地に加えたものが１つの態様として挙げられる。しかしこれらに限定されない。

かくして、体細胞が骨芽細胞に変換され、骨芽細胞が調製される。

骨芽細胞が得られたことは、前述のALPの活性の検出、マーカー遺伝子についてのリアルタイムRT-PCR（Reverse transcription polymerase chain reaction）やRT-PCR、アリザリンレッドＳ染色やvon Kossa染色により確認することができる。

調製された骨芽細胞は、ある態様においては、外来性のOct9遺伝子又はその発現産物を有する。ここで、「外来性」とは、主に上記の導入手段の結果導入された遺伝子又はその発現産物の態様であって、天然の態様とは異なる態様を指す。例えば、天然のプロモーター以外のプロモーターに発現を制御される遺伝子、天然以外の染色体上の位置、若しくは、染色体外に存在する遺伝子の態様などが挙げられる。

以下に実施例を示すが、本発明はこの実施例だけに限定されるものではない。

実施例1
Oct1、Oct2、Oct5/7、Oct6、Oct8、Oct9、Oct11およびN-Mycそれぞれのコーディング配列全長をPCRで増幅し、レトロウイルスベクタープラスミド pMXs（Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA；cat no. RTV-012）のEcoRIサイトに挿入した。Oct3/4、c-Myc、およびL-Mycのコーディング配列をpMXs のEcoRIサイトに挿入したレトロウイルスベクタープラスミドは、日本の京都大学の山中教授より供与を受けた。パッケージング細胞PLAT-GP（Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA；cat no. cat, VPK-305）を10 cm培養ディッシュに5.5 × 10⁶/ディッシュの濃度で播種した。翌日、この細胞に、上記のそれぞれのプラスミドベクターとpCMV-VSV-Gプラスミド（Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA；cat no. RV-110）を、X-treme Gene 9 transfection reagent（Roche AppliedScience, Penzberg, Germany）を用いて共導入した。24時間後に培養上清を吸引除去し、抗菌剤を含まないフレッシュな培地を加えた。そのさらに24時間後に培養上清を回収し、ポアサイズ0.45 μmのフィルターを用いてフィルトレーションし、ウイルス縣濁液とした。

ヒト正常皮膚線維芽細胞（NHDF）を、10% ウシ胎仔血清（FBS）、0.1 mM 非必須アミノ酸、100 μg/mLストレプトマイシン、100 U/mL ペニシリンを添加したDulbecco's minimum essential medium（DMEM）培地（complete medium）に再縣濁し、35 mmディッシュに播種した。5% CO₂/95% humidified air中で、37℃で培養した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載の遺伝子を有するレトロウイルスベクターと4 μg/mLのpolybreneを含む培地を加えた。24時間後、培養上清を吸引除去し、50 μg/mL ascorbic acid, 10 mM β-glycerol phosphate, and 100 nM dexamethasone を添加したcomplete medium （osteogenic medium）を加えた。２〜３日おきに、培地をフレッシュな培地交換して培養した。

遺伝子を導入後、28日目に、細胞からtotal RNAを抽出した。Runx2 遺伝子に特異的なprobeとprimers、およびβアクチン遺伝子に特異的なprobeとprimers (Applied Biosystems)を用いてreal time RT-PCRを行った。βアクチン遺伝子mRNAのレベルに対するRunx2遺伝子mRNAのレベルを算出し、遺伝子非導入群における値を１として、相対的なRunx2 mRNAレベルを計算した。

結果（平均±標準偏差、n=3）を図１に示す。Oct3/4、Oct6、Oct9、Oct1＋L-myc、Oct2＋L-myc、Oct3/4＋L-myc、Oct5/7＋L-myc、Oct6＋L-myc、Oct9＋L-mycを導入した群において、Runx2のmRNA発現が有意に誘導されたことがわかる。［*p < 0.05 vs. non-transduced control; ⁺p < 0.05 vs. L-myc alone］。特にOct3/4＋L-mycとOct9＋L-mycを導入した細胞がRunx2を強く発現した。さらにOct9＋L-mycを導入した細胞が最も強くRunx2を発現した。

実施例２
ヒト正常皮膚線維芽細胞（NHDF）を、10% ウシ胎仔血清（FBS）、0.1 mM非必須アミノ酸、100 μg/mLストレプトマイシン、100 U/mL ペニシリンを添加したDulbecco’s minimum essential medium（DMEM）培地（complete medium）に再縣濁し、35 mmディッシュに播種した。5% CO₂/95% humidified air中で、37℃で培養した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載の遺伝子を有するレトロウイルスベクターと4 μg/mLのpolybreneを含む培地を加えた。24時間後、培養上清を吸引除去し、50 μg/mL ascorbic acid, 10 mM β-glycerol phosphate, and 100 nM dexamethasone を添加したcomplete medium （osteogenic medium）を加えた。２〜３日おきに、培地をフレッシュな培地に交換して培養した。

遺伝子を導入後、28日目に、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定後、抗Runx2抗体（Abnova, Taipei, Taiwan）を加えてインキュベートした。その後Alexa fluor 488でconjugateした二次抗体を加え、また核をDAPIで染色した。コントロールとして、線維芽細胞も同様に染色した。蛍光顕微鏡で倍率100倍で観測した。

結果を図２に示す（Scale bar = 200 μm）。線維芽細胞はRunx2たんぱくを全く発現しないが、Oct3/4＋L-mycおよびOct9＋L-mycを導入した細胞は、Runx2 たんぱくを発現したことがわかる。とくにOct9＋L-mycを導入した細胞が、Oct3/4＋L-mycを導入した細胞よりも強くRunx2を発現したことがわかる。

実施例３
ヒト正常皮膚線維芽細胞（NHDF）を、10% ウシ胎仔血清（FBS）、0.1 mM非必須アミノ酸、100 μg/mLストレプトマイシン、100 U/mL ペニシリンを添加したDulbecco’s minimum essential medium（DMEM）培地（complete medium）に再縣濁し、35 mmディッシュに播種した。5% CO₂/95% humidified air中で、37℃で培養した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載の遺伝子を有するレトロウイルスベクターと4 μg/mLのpolybreneを含む培地を加えた。24時間後、培養上清を吸引除去し、50 μg/mL ascorbic acid, 10 mM β-glycerol phosphate, and 100 nM dexamethasone を添加したcomplete medium （osteogenic medium）を加えた。２〜３日おきに、培地をフレッシュな培地交換して培養した。

遺伝子を導入後、28日目に、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定後、抗Runx2抗体（Abnova, Taipei, Taiwan）を加えてインキュベートした。その後Alexa fluor 488でconjugateした二次抗体を加え、また核をDAPIで染色した。コントロールとして、線維芽細胞も同様に染色した。蛍光顕微鏡で倍率100倍で観測した。

結果を図３に示す（Scale bar = 200 μm）。線維芽細胞はRunx2たんぱくを全く発現しないが、Oct3/4＋N-mycおよびOct9＋N-mycを導入した細胞は、Runx2 たんぱくを発現したことがわかる。とくにOct9＋N-mycを導入した細胞が、Oct3/4＋N-mycを導入した細胞よりも強くRunx2を発現したことがわかる。

実施例４
ヒト正常皮膚線維芽細胞（NHDF）を、10% ウシ胎仔血清（FBS）、0.1 mM非必須アミノ酸、100 μg/mLストレプトマイシン、100 U/mL ペニシリンを添加したDulbecco’s minimum essential medium（DMEM）培地（complete medium）に再縣濁し、35 mmディッシュに播種した。5% CO₂/95% humidified air中で、37℃で培養した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載の遺伝子を有するレトロウイルスベクターと4 μg/mLのpolybreneを含む培地を加えた。24時間後、培養上清を吸引除去し、50 μg/mL ascorbic acid, 10 mM β-glycerol phosphate, and 100 nM dexamethasone を添加したcomplete medium （osteogenic medium）を加えた。２〜３日おきに、培地をフレッシュな培地交換して培養した。

遺伝子を導入後、28日目に、細胞からtotal RNAを抽出した。Runx2 遺伝子に特異的なprobeとprimersおよびβアクチン遺伝子に特異的なprobeとprimers (Applied Biosystems)を用いてreal time RT-PCRを行った。βアクチン遺伝子mRNAに対するRunx2遺伝子mRNAのレベルを算出し、遺伝子非導入群における値を１として、相対的なRunx2のmRNAレベルを計算した。

結果（平均±標準偏差、n=3）を図４に示す。［*p < 0.05 vs. non-transduced control; ⁺p < 0.05 vs. Oct3/4 alone; ^‡p < 0.05 vs. Oct9 alone.］。

Oct3/4、Oct9、c-myc、N-myc、Oct3/4＋c-myc、Oct9＋c-myc、Oct3/4＋N-myc、およびOct9＋N-mycを導入した細胞が、Runx2遺伝子mRNAを有意に高く発現したことがわかる。とくにOct9＋N-mycを導入した細胞が、最も強くRunx2を発現した。

実施例５
ヒト正常皮膚線維芽細胞（NHDF）を、10% ウシ胎仔血清（FBS）、0.1 mM非必須アミノ酸、100 μg/mLストレプトマイシン、100 U/mL ペニシリンを添加したDulbecco’s minimum essential medium（DMEM）培地（complete medium）に再縣濁し、35 mmディッシュに播種した。5% CO₂/95% humidified air中で、37℃で培養した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載の遺伝子を有するレトロウイルスベクターと4 μg/mLのpolybreneを含む培地を加えた。24時間後、培養上清を吸引除去し、50 μg/mL ascorbic acid, 10 mM β-glycerol phosphate, and 100 nM dexamethasone を添加したcomplete medium （osteogenic medium）を加えた。２〜３日おきに、培地をフレッシュな培地交換して培養した。

遺伝子を導入後、28日目に、細胞からtotal RNAを抽出した。Osteocalcin遺伝子に特異的なprobeとprimers、およびβアクチン遺伝子に特異的なprobeとprimers (Applied Biosystems)を用いてreal time RT-PCRを行った。βアクチン遺伝子mRNAに対するOsteocalcin遺伝子mRNAのレベルを算出し、遺伝子非導入群における値を１として、相対的なOsteocalcinのmRNAレベルを計算した。

結果を図５に示す。［*p < 0.05 vs. non-transduced control; ⁺p < 0.05 vs. Oct3/4 alone; ^‡p < 0.05 vs. Oct9 alone.］。

Oct3/4、Oct9、c-myc、N-myc、Oct3/4＋c-myc、Oct9＋c-myc、Oct3/4＋N-myc、およびOct9＋N-mycを導入した細胞が、Osteocalcin遺伝子mRNAを発現したことがわかる。とくにOct9＋N-mycを導入した細胞が、最も強くRunx2を発現した。

実施例６
ヒト正常皮膚線維芽細胞（NHDF）を、10% ウシ胎仔血清（FBS）、0.1 mM非必須アミノ酸、100 μg/mLストレプトマイシン、100 U/mL ペニシリンを添加したDulbecco’s minimum essential medium（DMEM）培地（complete medium）に再縣濁し、35 mmディッシュに播種した。5% CO2/95% humidified air中で、37℃で培養した。翌日、培養上清を吸引除去し、Oct9とN-myc遺伝子を有するレトロウイルスベクターと4 μg/mLのpolybreneを含む培地を加えた。24時間後、培養上清を吸引除去し、50 μg/mL ascorbic acid, 10 mM β-glycerol phosphate, and 100 nM dexamethasone を添加したcomplete medium （osteogenic medium）を加えた。２〜３日おきに、培地をフレッシュな培地交換して培養した。

遺伝子導入28日後、培養ディッシュから培養液を吸引除去し、PBSで2回洗浄を行い、95%エタノールで固定。滅菌蒸留水で洗浄した後、アリザリンレッドS染色液を加え、室温で15分間静置した。コントロールとして、線維芽細胞も同様に染色した。

図６上段に結果をディッシュの肉眼像（倍率ｘ１倍）及び位相差顕微鏡像（倍率ｘ４０倍）(Scale bar= 500 μm)の写真により示す。染まっているのは石灰化骨基質である（実際は、赤色に染色）。

さらにすべてのウェルからアリザリンレッドS染色液を取り除き、滅菌蒸留水で洗浄後、10%Triton Xを加え、室温で1時間反応させた。各ウェルから液を採取し、96 well plateに移した。反応液の吸光度（550nm）をマイクロプレートリーダーを用いて測定した結果を図６下段のグラフに示す。グラフの縦軸は吸光度であり、吸光度が高い程、石灰化骨基質が多量に産生されたことを表している。

これらの結果から、Oct9遺伝子とL-myc遺伝子を共導入した細胞は、多くの石灰化骨基質を産生し、高い効率で機能性骨芽細胞にコンヴァートしたことが分かる。

実施例７
ヒト正常皮膚線維芽細胞（NHDF）を、10% ウシ胎仔血清（FBS）、0.1 mM非必須アミノ酸、100 μg/mLストレプトマイシン、100 U/mL ペニシリンを添加したDulbecco’s minimum essential medium（DMEM）培地（complete medium）に再縣濁し、35 mmディッシュに播種した。5% CO2/95% humidified air中で、37℃で培養した。翌日、培養上清を吸引除去し、Oct9とN-myc遺伝子を有するレトロウイルスベクターと4 μg/mLのpolybreneを含む培地を加えた。24時間後、培養上清を吸引除去し、50 μg/mL ascorbic acid, 10 mM β-glycerol phosphate, and 100 nM dexamethasone を添加したcomplete medium （osteogenic medium）を加えた。２〜３日おきに、培地をフレッシュな培地交換して培養した。

遺伝子導入28日後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定後、抗Osteocalcin抗体（AbD Serotec, Kidlington, UK）を加えてインキュベートした。その後Alexa fluor 488をconjugateした二次抗体を加え、また核をDAPIで染色した。コントロールとして、線維芽細胞も同様に染色した。蛍光顕微鏡で倍率100倍で観測した。

結果を図７に示す。線維芽細胞はOsteocalcinたんぱくを全く発現しないが、Oct9＋N-mycを導入した細胞はOsteocalcinを強く発現したことがわかる。

Claims (5)

1. 哺乳動物の体細胞にOct9遺伝子又はその発現産物を導入する工程を含む、前記体細胞から骨芽細胞を調製する方法。
2. 哺乳動物の体細胞にOct9遺伝子又はその発現産物、並びに、c-Myc遺伝子、L-Myc遺伝子及びN-Myc遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種又はその発現産物を導入することで、前記体細胞から骨芽細胞を調製する方法。
3. 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 遺伝子又はその発現産物を導入した体細胞を、骨芽細胞の誘導培地で培養する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 哺乳動物の体細胞に由来し、外来性のOct9遺伝子又はその発現産物を有する骨芽細胞。
   

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