JP6811443B2 - シュワン細胞及びその調製方法 - Google Patents
シュワン細胞及びその調製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6811443B2 JP6811443B2 JP2016547808A JP2016547808A JP6811443B2 JP 6811443 B2 JP6811443 B2 JP 6811443B2 JP 2016547808 A JP2016547808 A JP 2016547808A JP 2016547808 A JP2016547808 A JP 2016547808A JP 6811443 B2 JP6811443 B2 JP 6811443B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- gene
- schwann
- cell
- sox10
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 title claims description 172
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 107
- 108010051748 Early Growth Response Protein 2 Proteins 0.000 claims description 58
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 101150077014 sox10 gene Proteins 0.000 claims description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 41
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 34
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 34
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 20
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 7
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 6
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 130
- 108010023918 S100 Calcium Binding Protein beta Subunit Proteins 0.000 description 36
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 21
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 21
- 101000664703 Homo sapiens Transcription factor SOX-10 Proteins 0.000 description 20
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 20
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 20
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 20
- 102100038808 Transcription factor SOX-10 Human genes 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 18
- 101000801254 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Proteins 0.000 description 17
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 17
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 11
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 8
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 7
- 102100023227 E3 SUMO-protein ligase EGR2 Human genes 0.000 description 6
- 101000979249 Homo sapiens Neuromodulin Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 6
- 102100023206 Neuromodulin Human genes 0.000 description 6
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 5
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 5
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 5
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 102000011425 S100 Calcium Binding Protein beta Subunit Human genes 0.000 description 5
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 5
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 4
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 4
- 102000048238 Neuregulin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108090000556 Neuregulin-1 Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 4
- -1 electroporation Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 4
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 4
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 241000483002 Euproctis similis Species 0.000 description 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 101001049692 Homo sapiens E3 SUMO-protein ligase EGR2 Proteins 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 3
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 208000010693 Charcot-Marie-Tooth Disease Diseases 0.000 description 2
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 2
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 2
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 101100065087 Mus musculus Egr2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100149887 Mus musculus Sox10 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 2
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 208000002552 acute disseminated encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 2
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 2
- 210000003897 hepatic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000004966 intestinal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 2
- 208000008795 neuromyelitis optica Diseases 0.000 description 2
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 206010036807 progressive multifocal leukoencephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100421200 Caenorhabditis elegans sep-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 201000008994 Charcot-Marie-Tooth disease type 1D Diseases 0.000 description 1
- 201000009069 Charcot-Marie-Tooth disease type 4E Diseases 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 206010010252 Concentric sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000004986 Diffuse Cerebral Sclerosis of Schilder Diseases 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102100021811 E3 ubiquitin-protein ligase RNF5 Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 206010049020 Encephalitis periaxialis diffusa Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150089574 FOXA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101710087964 Forkhead box protein G1 Proteins 0.000 description 1
- 101150117946 Foxa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150057663 Foxa2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000739876 Homo sapiens Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101000916489 Homo sapiens Chondroitin sulfate proteoglycan 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001107084 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF5 Proteins 0.000 description 1
- 101100444906 Homo sapiens EGR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101100149886 Homo sapiens SOX10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 1
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 101150107475 MEF2C gene Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010050258 Mitochondrial Uncoupling Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000015494 Mitochondrial Uncoupling Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010048654 Muscle fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 102000055325 Myelin P0 Human genes 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 102100030741 Myelin protein P0 Human genes 0.000 description 1
- 108050003852 Myelin protein P0 Proteins 0.000 description 1
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000001068 Neural Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 229920001397 Poly-beta-hydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000021235 Schilder disease Diseases 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000032341 cell morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 230000008717 functional decline Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000051542 human BDNF Human genes 0.000 description 1
- 102000048019 human SOX10 Human genes 0.000 description 1
- 229940077456 human brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004345 peroneal nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 208000000813 polyradiculoneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 108700005467 recombinant KCB-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 101150115978 tbx5 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002972 tibial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/383—Nerve cells, e.g. dendritic cells, Schwann cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
- A61L27/3675—Nerve tissue, e.g. brain, spinal cord, nerves, dura mater
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/32—Materials or treatment for tissue regeneration for nerve reconstruction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/09—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from epidermal cells, from skin cells, from oral mucosa cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
- C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/28—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from vascular endothelial cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
Description
本発明は、主に、シュワン細胞及びその調製方法に関し、詳しくはダイレクト・リプログラミングによるシュワン細胞の調製方法に関する。
シュワン細胞は、神経の再生に決定的に重要な役割を果たしているとされる。神経欠損やシュワン細胞の機能不全に関連する疾患も多く、これらの疾病に対して、自家シュワン細胞を移植することができれば理想的な再生医療になると期待される。実際、外傷や悪性腫瘍切除に起因する神経損傷に対しては、自家神経移植か、もしくは自家神経よりシュワン細胞を分離・培養して移植する治療が効果を上げている。しかし神経の採取は患者への侵襲が大きく、どうしても二次的な神経損傷を回避できない。また供給できるシュワン細胞の数が不十分なことが多い。
非特許文献１及び２には、未分化脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）（脂肪由来間質細胞ともいう）を代表とする間葉系幹細胞を材料として、シュワン細胞様の細胞（ｄＡＤＳＣ）を分化する手法が開示されている。しかしながら、手法の性質上、外部からの感染の危険性があるため品質管理が容易ではなく、コストと手間がかかるとの問題がある。さらに、得られる細胞は、真のシュワン細胞とは形質や機能が異なることも指摘されている。また、これらの方法で作成したシュワン細胞は、ミエリン化能があるとは報告されておらず、跳躍伝導に貢献できない可能性がある。
最近になって、心筋細胞や肝細胞などが、線維芽細胞から直接誘導できることが示された（ダイレクト・リプログラミングまたはダイレクト・コンヴァージョン）。もし、患者から低侵襲に採取できる線維芽細胞などの体細胞から、シュワン細胞を直接作り出すことができれば、侵襲が低く癌化の危険性も低い、新しい移植用自家シュワン細胞を作り出す技術につながると期待できる。
体細胞に、組織特異的な転写因子の遺伝子群を導入して、iPS細胞を経ずに直接その組織細胞に分化誘導できること（ダイレクト・リプログラミング（ダイレクト・コンヴァージョン））について、たとえば、以下の報告がある：
マウス線維芽細胞→軟骨細胞（SOX9 ＋Klf4 ＋c‐Myc遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→心筋細胞（GATA4 ＋Mef2c ＋Tbx5遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→肝細胞（Hnf4α＋（Foxa1またはFoxa2またはFoxa3）遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→神経幹細胞（Sox2 ＋FoxG1遺伝子を導入など）、
マウス、ヒト細胞→造血幹細胞など。
マウス線維芽細胞→軟骨細胞（SOX9 ＋Klf4 ＋c‐Myc遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→心筋細胞（GATA4 ＋Mef2c ＋Tbx5遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→肝細胞（Hnf4α＋（Foxa1またはFoxa2またはFoxa3）遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→神経幹細胞（Sox2 ＋FoxG1遺伝子を導入など）、
マウス、ヒト細胞→造血幹細胞など。
しかし、体細胞をシュワン細胞にダイレクト・コンヴァージョンしたという報告はない。
Kingham PJ, DF Kalbermatten, D Mahay,et al: Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype andpromote neurite outgrowth in vitro. ExpNeurol, 2007; 207:267-274.
Liu Y, Zhang Z, Qin Y, Wu H, Lv Q, Chen X, Deng W: A new method for Schwann-like cell differentiation of adipose derived stem cells. Neurosci Lett. 2013 Sep 13;551:79-83.
本発明は、神経欠損やシュワン細胞の機能不全に関連する疾患などに対する治療に応用可能で、癌化の危険性が少ないシュワン細胞を調製する方法を提供することを目的とする。
本発明は、哺乳動物の体細胞に特定の遺伝子を組み合わせて導入することで、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞を経由することなく、直接（ダイレクト・リプログラミングにより）シュワン細胞が得られることを見出した。
本発明は、以下の発明を包含する。
項１、哺乳動物の体細胞に、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を導入する工程を含む、シュワン細胞を調製する方法。
項２、前記遺伝子が、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせである、項１に記載の方法。
項３、前記体細胞が線維芽細胞、血管内皮細胞又は間葉系幹細胞である、項１又は２に記載の方法。
項４、哺乳動物の体細胞に由来し、外来性のSOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を有するシュワン細胞。
項５、項１〜３のいずれかに記載の方法で得られる細胞、又は、項４に記載のシュワン細胞を含む、神経の欠損、又は、シュワン細胞の欠損、不足若しくは機能低下に基づく疾患を治療するための、移植材料。
項６、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を含む、シュワン細胞を調製するための組成物。
本発明では、ダイレクト・リプログラミングにより体細胞から短期間でシュワン細胞を提供できる。このシュワン細胞は、移植する本人の体細胞から容易に誘導できるので、得られたシュワン細胞を移植した場合にも免疫学的な拒絶応答などの問題は生じない。また、iPS細胞やES細胞を経由することなく直接体細胞からシュワン細胞を誘導できるため、癌化などの多能性幹細胞に起因する問題を回避できる。
なお、図２、図３、図４Ａ、図５Ａ〜Ｄ、図７Ａ、図８、図９Ａ及びＢ、図１０Ａ及びＢ、図１１Ａ及びＢ、並びに、図１２Ｂ〜Ｃは、色反転画像を併せて示している。
本発明は、シュワン細胞の調製方法に関する。本発明の調製方法は、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞を経由することなく、シュワン細胞を調製するための方法である。
シュワン細胞
シュワン細胞は、末梢神経系におけるグリア細胞である。生理条件下では、神経組織の支持、ミエリン（髄鞘）を形成して跳躍伝導の実現などに寄与する。末梢神経での損傷に際しては、神経栄養因子の産出及び放出、再生軸索に対する足場、ミエリン形成などの末梢神経再生における多くの重要な役割を果たす。
シュワン細胞は、末梢神経系におけるグリア細胞である。生理条件下では、神経組織の支持、ミエリン（髄鞘）を形成して跳躍伝導の実現などに寄与する。末梢神経での損傷に際しては、神経栄養因子の産出及び放出、再生軸索に対する足場、ミエリン形成などの末梢神経再生における多くの重要な役割を果たす。
天然のシュワン細胞は、外胚葉に直接由来する神経細胞とは異なり、神経堤に由来する。成熟したシュワン細胞は、シュワン前駆細胞、未成熟シュワン細胞を経て形成される。本明細書では、簡単のために、これらの分化過程の途中の全ての細胞は「シュワン細胞」に包含される。
また、シュワン細胞には、ミエリンを形成するシュワン細胞、ミエリンを形成しない遊走性のシュワン細胞（未分化シュワン細胞）などがあり、本明細書ではこれら全てが「シュワン細胞」に包含される。
本明細書では、天然のシュワン細胞と同一の細胞だけではなく、細胞の機能の一部又は全てが天然のシュワン細胞と同一視しうる細胞（「シュワン細胞様の細胞」と呼ぶこともできる。）を含めて、「シュワン細胞」と呼ぶ。
体細胞
体細胞は、哺乳動物由来であればよい。特に、哺乳動物由来であって、シュワン細胞そのもの及び生体内でシュワン細胞へと分化する能力を有する細胞でない細胞が好ましい。シュワン細胞を生体に移植する場合には、移植される被験体由来の体細胞(自家細胞)を用いることが、感染や拒絶応答等の危険を低減させるために好ましい。しかしながら、突然の神経の損傷などに対して移植するなどの目的の場合、自家細胞でなく、他人や他の動物の体細胞からあらかじめ準備しておいたシュワン細胞を移植に用いることができる。またはあらかじめ準備しておいた他人や他の動物の体細胞からシュワン細胞を作り、移植に用いることができる。すなわち、シュワン細胞バンクのバンク（シュワン細胞前駆細胞のバンクを含む。）を作っておき移植目的に供することができる。このような場合、拒絶応答等の危険を低減させるために、あらかじめMHCをタイピングしておくことができる。また、あらかじめシュワン細胞の細胞特性や造腫瘍性などを確認しておくことができる。
体細胞は、哺乳動物由来であればよい。特に、哺乳動物由来であって、シュワン細胞そのもの及び生体内でシュワン細胞へと分化する能力を有する細胞でない細胞が好ましい。シュワン細胞を生体に移植する場合には、移植される被験体由来の体細胞(自家細胞)を用いることが、感染や拒絶応答等の危険を低減させるために好ましい。しかしながら、突然の神経の損傷などに対して移植するなどの目的の場合、自家細胞でなく、他人や他の動物の体細胞からあらかじめ準備しておいたシュワン細胞を移植に用いることができる。またはあらかじめ準備しておいた他人や他の動物の体細胞からシュワン細胞を作り、移植に用いることができる。すなわち、シュワン細胞バンクのバンク（シュワン細胞前駆細胞のバンクを含む。）を作っておき移植目的に供することができる。このような場合、拒絶応答等の危険を低減させるために、あらかじめMHCをタイピングしておくことができる。また、あらかじめシュワン細胞の細胞特性や造腫瘍性などを確認しておくことができる。
本明細書において、哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタなどが挙げられ、特にヒトが挙げられる。
本発明の方法（ダイレクト・リプログラミング）の対象となる体細胞としては、特に限定されるものではない。
体細胞は、容易に生体より採取できる体細胞を使用することができる。例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、口腔粘膜上皮細胞、鼻腔粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞、胃粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、歯肉細胞（歯肉線維芽細胞、歯肉上皮細胞）、歯髄細胞、歯根膜細胞、骨髄細胞、骨髄由来間質細胞、白血球、リンパ球、筋細胞、結膜上皮細胞、破骨細胞などが挙げられ、好ましくは線維芽細胞、ケラチノサイト、口腔粘膜上皮細胞、歯肉細胞、白血球、リンパ球などが挙げられる。本発明において、生体から採取した上記の細胞を用いることが好ましい。
「生体」とは、胚（胎児）、幼生、幼体、成体のみならず、母体と胎児を連結する胎盤、臍帯をも包含する。臍帯血管内皮細胞などの臍帯由来の細胞や胎盤由来の細胞は、厳密には体細胞ではないが、これらも本発明の「体細胞」に包含される（その際には、「体細胞」を「臍帯血管内皮細胞」、「臍帯由来細胞」、「胎盤由来細胞」等と読み替えるものとする。これらの細胞は、採取の容易さの観点から、好ましい体細胞の一例である。
また、間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell: MSC）、神経幹細胞（Neural stem cell）、肝幹細胞（hepatic stem cell）、腸幹細胞、皮膚幹細胞、毛包幹細胞、色素細胞幹細胞などの体性幹細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて作製した体細胞も挙げられる。また、さまざまな体細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて別の体細胞に誘導した細胞も挙げられる。また、生殖系列の細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。
また、胎性幹細胞（Embryonic stem cell：ES細胞）や人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）から分化誘導し、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。
また、上記の分化をした体細胞以外に、体性幹細胞を用いることもできる。ここで、幹細胞とは、自己複製能及び別の種類の細胞に分化する能力を有する細胞である。具体的には、間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell: MSC）（例えば、脂肪由来間質細胞（ADSC: adipose derived stromal cell））、神経幹細胞（Neural stem cell）、肝幹細胞（hepatic stem cell）、腸幹細胞、皮膚幹細胞、毛包幹細胞、色素細胞幹細胞などの体性幹細胞が例示される。
また、厳密には体細胞ではないが、ES細胞、iPS細胞、あるいは生殖系列の細胞も本発明の「体細胞」に包含される（その際には、「体細胞」を「ES細胞」、「iPS細胞」あるいは「生殖系列の細胞」と読み替えるものとする）。
また、培養細胞も挙げられ、培養細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。また、ES細胞、iPS細胞、あるいは生殖系列の細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。
本発明の好ましい一つの態様において、体細胞は線維芽細胞、血管内皮細胞（特に、臍帯血管内皮細胞）又は間葉系幹細胞（特に、脂肪由来間質細胞）である。
遺伝子若しくはその発現産物
本発明の方法では、体細胞にSOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を導入する。ここで、「発現産物」としては、SOX10遺伝子及び／又はKROX20遺伝子のmRNA又はタンパク質が挙げられる。
本発明の方法では、体細胞にSOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を導入する。ここで、「発現産物」としては、SOX10遺伝子及び／又はKROX20遺伝子のmRNA又はタンパク質が挙げられる。
使用することができる遺伝子の組み合わせとしては、SOX10遺伝子のみ、KROX20遺伝子のみ、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせが包含される。シュワン細胞を得ることができる効率の観点から、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせが好ましい。
本発明の方法において、SOX10遺伝子及び／又はKROX20遺伝子の１種若しくは２種以外の遺伝子を、併せて使用することもできる。また、マイクロRNA、siRNA、shRNAやそれらを発現するDNAを併せて使用することもできる。また、種々のタンパク質を併せて使用することもできる。また、種々の他の遺伝子と共に導入することもできる。シュワン細胞を得ることができる効率の観点、及び簡便性のから、１種又は２種、特にSOX10遺伝子及びはKROX20遺伝子の２遺伝子のみを使用することが好ましい。
SOX10遺伝子は、SOX（SRY-related HMG-box）ファミリーに属する、胚性期の発生における細胞運命の決定の制御に関与する転写因子をコードする。
KROX20遺伝子（別名、EGR2、AT591、CMT1D、CMT4E）は、３つのC2H2型ジンクフィンガー（zinc fingers）を有するタンパク質をコードする。
上記遺伝子は、いずれも、脊椎動物で高度に保存されている遺伝子であり、本明細書では、特に動物名を示さない限り、ホモログを含めた遺伝子を表すものとする。また、polymorphism（多型）を含め、変異を有する遺伝子であっても、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する遺伝子もまた、含まれるものとする。
例えば、ヒト（Homo sapiens）及びマウス（Mus musculus）のSOX10遺伝子及びKROX20遺伝子のcDNA塩基配列及びこれがコードするタンパク質のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（NCBI; National Center for Biotechnology Information）が提供するGenBankに、下記のアクセッション番号で登録されている（複数のリビジョン（revision）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）：
ヒトSOX10遺伝子cDNA配列：NM_006941（例えば、NM_006941.3）、
ヒトSOX10タンパク質アミノ酸配位列：NP_008872（例えば、NP_008872.1）；
マウスSox10遺伝子cDNA配列：NM_011437（例えば、NM_011437.1）、
マウスSOX10タンパク質アミノ酸配位列：NP_035567（例えば、NP_035567.1）；
ヒトKROX20遺伝子cDNA配列：NM_000399、NM_001136177、NM_001136178、NM_001136179（例えば、NM_000399.3、NM_001136177.1、NM_001136178.1、NM_001136179.1）、
ヒトKROX20タンパク質アミノ酸配位列：NP_000390、NP_001129649、NP_001129650、NP_001129651（例えば、NP_000390.2、NP_001129649.1、NP_001129650.1、NP_001129651.1）；
マウスKrox20遺伝子cDNA配列：NM_010118（例えば、NM_010118.3）
マウスKROX20タンパク質アミノ酸配位列：NP_034248（例えば、NP_034248.2）。
ヒトSOX10遺伝子cDNA配列：NM_006941（例えば、NM_006941.3）、
ヒトSOX10タンパク質アミノ酸配位列：NP_008872（例えば、NP_008872.1）；
マウスSox10遺伝子cDNA配列：NM_011437（例えば、NM_011437.1）、
マウスSOX10タンパク質アミノ酸配位列：NP_035567（例えば、NP_035567.1）；
ヒトKROX20遺伝子cDNA配列：NM_000399、NM_001136177、NM_001136178、NM_001136179（例えば、NM_000399.3、NM_001136177.1、NM_001136178.1、NM_001136179.1）、
ヒトKROX20タンパク質アミノ酸配位列：NP_000390、NP_001129649、NP_001129650、NP_001129651（例えば、NP_000390.2、NP_001129649.1、NP_001129650.1、NP_001129651.1）；
マウスKrox20遺伝子cDNA配列：NM_010118（例えば、NM_010118.3）
マウスKROX20タンパク質アミノ酸配位列：NP_034248（例えば、NP_034248.2）。
導入
本発明の方法は、特定の遺伝子を選択することと、シュワン細胞に適した培地を用いること以外は、公知のダイレクト・リプログラミングの手法に準じて行うことができ、例えば以下のいずれかの文献の方法に準じて行うことができる：
1: Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytesby Defined Factors; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142: 375-386, 2010.
2: Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof& Marius Wernig. Nature 463: 1035-1041, 2010
3: Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476: 220-223, 2011.
4: Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outan
i, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121: 640-657, 2011.
5: Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui, . Nature 475:386-389, 2011.
6: Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475:390-393, 2011.
7: 国際公開公報WO2014/010746号
上記の文献１〜７の内容は本明細書に参考として援用される。
本発明の方法は、特定の遺伝子を選択することと、シュワン細胞に適した培地を用いること以外は、公知のダイレクト・リプログラミングの手法に準じて行うことができ、例えば以下のいずれかの文献の方法に準じて行うことができる：
1: Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytesby Defined Factors; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142: 375-386, 2010.
2: Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof& Marius Wernig. Nature 463: 1035-1041, 2010
3: Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476: 220-223, 2011.
4: Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outan
i, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121: 640-657, 2011.
5: Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui, . Nature 475:386-389, 2011.
6: Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475:390-393, 2011.
7: 国際公開公報WO2014/010746号
上記の文献１〜７の内容は本明細書に参考として援用される。
具体的には、目的遺伝子を、１又は複数の発現ベクターに組み込み、対象とする体細胞に発現ベクターを導入し、細胞内で発現させることが好ましい。
遺伝子を導入する方法としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルス性ベクターを感染させる方法が挙げられる。その他に、遺伝子とその発現産物の導入の場合には、カチオニック・リポソーム、カチオニック・ポリマー、電気穿孔法等の非ウイルスベクターで、プラスミドベクターやエピゾーマルベクター、遺伝子の発現産物（mRNA、タンパク質）をトランスフェクションする方法も用いることができる。また、mRNAを導入することもできる。これら遺伝子導入に用いる手段をすべて包括して、本明細書ではベクターと呼ぶ。
導入効率と導入遺伝子の安定保持の観点からはウイルスベクターが好ましく、癌化のリスクを抑えるためにはプラスミドが好ましい。
また、目的の遺伝子とともに薬剤選択マーカーとなる遺伝子（ピューロマイシン耐性、ブラストサイジンS耐性、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性など）を導入し、その後薬剤選択を行うことによって、目的遺伝子を発現する細胞を選択してから用いることができる。
本発明の遺伝子の導入は、プラスミドで行ってもよく、ウイルスベクター、たとえばレトロウイルスベクターを用いてもよい。導入効率と導入遺伝子の安定保持の観点からはウイルスベクターが好ましく、癌化のリスクを抑えるためにはプラスミドが好ましい。
体細胞に導入される遺伝子はLTRプロモーターにより転写させることもできるし、ベクター内部の別のプロモーターから発現させてもよい。例えばCMVプロモーター、EF-1αプロモーター、CAGプロモーターなどの構成的発現プロモーター、または所望の誘導性プロモーターを利用することができる。また、LTRの一部を他のプロモーターに置換したキメラプロモーターを利用してもよい。
また、導入因子が遺伝子の発現産物(例えばタンパク質)の場合には、Protein Transduction Domain（PTD）と呼ばれるペプチドなどを発現産物である蛋白質に結合させ、培地に添加することにより、体細胞内に導入してもよい。
本発明の方法の態様の一つにおいて、体細胞へ遺伝子等を導入後、導入がされた細胞をシュワン細胞の培養に適した培地中で培養することができる。シュワン細胞の培養に適した培地としては公知のものを使用することができる。例えば、10％FBS（fetal bovine serum）を添加したDMEM培地（ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modied Eagle's Medium））などの通常培地に、1〜20 μM程度（特に、5 μM程度）のforskolin；2〜50 ng/ml程度（特に、10 ng/ml程度）のbFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子、basic fibroblast growth factor）；2〜50 ng/ml程度（特に、10 ng/ml程度）のPDGF（Platelet-Derived Growth Factor）；50〜1000 ng/ml程度（特に、200 ng/ml程度）のhuman neuregulin-β1（別名、heregulin、GGF（Glial growth factor））などの成分の１種または２種以上（好ましくは、全て）を含む培地（シュワン細胞誘導培地）を使用することができる（以上の濃度は、いずれも終濃度である）。一例として、非特許文献１又は２に記載の培地（未分化脂肪幹細胞からシュワン細胞を誘導できる培地）を使用することができる。
培養期間は特に限定されるものではないが、例えば、12時間〜１ヶ月程度、1日〜３週間程度、３日間〜２週間程度とすることができる。必要に応じて、培地交換を行うことができる。培養条件は、常法に準じることが好ましい。
調製
かくして、体細胞からシュワン細胞が誘導され、シュワン細胞が調製される。
かくして、体細胞からシュワン細胞が誘導され、シュワン細胞が調製される。
調製されたシュワン細胞は、ある態様においては、外来性のSOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を有する。ここで、「外来性」とは、主に上記の導入手段の結果導入された遺伝子又はその発現産物の態様であって、天然の態様とは異なる態様を指す。例えば、天然のプロモーター以外のプロモーターに発現を制御される遺伝子、天然以外の染色体上の位置、若しくは、染色体外に存在する遺伝子の態様などが挙げられる。
シュワン細胞が得られたことは、形態（例えば、細胞幅と細胞長との比。）の観察と評価；S100β、p75NTR、GFAP、Nestin、NG2などのシュワン細胞特異的マーカーの発現の検出（例えば、RT-PCR法などによるマーカーの遺伝子発現の検出、免疫染色などによるマーカータンパク質の発現の検出などが挙げられる。）；神経栄養因子の産生；共培養した神経細胞に対する神経突起伸長の効果やミエリン形成能などのシュワン細胞としての機能の評価等が例示される。
シュワン細胞は、典型的には、比較的小型の核を有する双極、もしくは多極性の細胞形態を有する。
シュワン細胞特異的マーカーのうち、p75NTRは未分化シュワン細胞のマーカーである。
ミエリンが形成されたことは、Myelin Protein Zero（MPZ、P0）、ミエリン塩基性タンパク質（MBP: Myelin Basic protein）などのミエリン細胞のマーカーの検出、ミエリンの形態の観察などにより確認をすることができる。
シュワン細胞は、シュワン細胞以外の細胞（例えば、元の体細胞。）との混合物として得られる場合がある。このような場合、シュワン細胞とシュワン細胞以外の細胞とを、必要に応じて、分離することができる。分離をするための手段は特に限定されない。例えば、得られたシュワン細胞と元の細胞である線維芽細胞とを分離する場合、足場（例えば、コラーゲンなど。）に対する細胞の接着性の差に基づいて分離をすることができる。一般に、シュワン細胞は線維芽細胞に比して、足場に対する接着性が弱い。また、ソーティングによってシュワン細胞とシュワン細胞以外の細胞とを分離することもできる。
本発明により調製されたシュワン細胞は、例えば、後述の移植材料として好適に用いる
ことができる。
ことができる。
本発明により調製されたシュワン細胞はまた、シュワン細胞を用いたさまざまな研究や技術開発等に用いることができる。たとえばシュワン細胞の発生、分化、形態形成の機構、これらに対する力学的ストレス、栄養、ホルモンなどの影響の解析などの基礎研究に有用である。
本発明により調製されたシュワン細胞を用いれば、さまざまな疾患や遺伝的背景を有するヒトや動物から簡便、迅速、安価にシュワン細胞を樹立できるので、疾患や遺伝的背景に関連したシュワン細胞の異常を生化学的、分子生物学的、免疫学的等手法により解析することが可能であり、これにより疾患の発症機序の解明などの研究や診断法の開発に役立てることができる。またこのようなシュワン細胞を用いて、薬剤の開発、薬剤の毒性試験等を行えば、種々の疾患に対する新規治療法の開発に役立てることができる。
移植材料
本発明により得られるシュワン細胞は、種々の疾患を治療するために用いることができる。この場合、シュワン細胞は移植材料の形態で提供されうる。
本発明により得られるシュワン細胞は、種々の疾患を治療するために用いることができる。この場合、シュワン細胞は移植材料の形態で提供されうる。
移植材料とは、神経線維の修復、再建のために生体内に導入する、シュワン細胞を含有する材料をいう。本発明で得られたシュワン細胞は、移植材料の作製に使用することができる。シュワン細胞自体も移植材料になる。したがって、シュワン細胞を細胞製剤として患者に移植することもできるし、人工材料からなる基材（スキャホルド）とともに移植したり、スキャホルドとともに培養してから移植することができる。基材（スキャホルド）は、例えば、神経架橋として働く。これらの場合、スキャホルドは移植目的に応じて様々な3次元的な形状を作らせることができる。
本発明の移植材料は、前述のシュワン細胞の調製方法を工程として含む方法により、製造することができる。
基材（スキャホルド）の具体例として、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）チューブ、コラーゲンチューブ、フィブリン朔(Fibrin glue) 、ポリマーフォームチューブ、ゼラチンチューブ、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）とコラーゲンを組み合わせたチューブなどが挙げられる。ポリグリコール酸（ＰＧＡ）とコラーゲンを組み合わせたチューブとして、「ナーブブリッジ」（東洋紡株式会社製）などの市販品を使用することもできる。
移植材料は、自家神経移植、又は、自家神経よりシュワン細胞を分離培養して移植する治療に準じて使用することができる。このような方法は、下記の文献に記載されている：
1: Hadlock T, Sundback C, Hunter D, Cheney M, Vacanti JP. A polymer foam conduit seeded with Schwann cells promotes guided peripheral nerve regeneration. Tissue Eng 2000;6:119-127.
2: Jesuraj NJ, Santosa KB, Macewan MR, Moore AM, Kasukurthi R, Ray WZ, Flagg ER, Hunter DA, Borschel GH, Johnson PJ, Mackinnon SE, Sakiyama-Elbert SE. Schwann cells seeded in acellular nerve grafts improve functional recovery. Muscle Nerve.2014 Feb;49(2):267-76.
3: Tabesh H, Amoabediny G, Nik NS, Heydari M, Yosefifard M, Siadat SO, Mottaghy K. The role of biodegradable engineered scaffolds seeded with Schwann cells for spinal cord regeneration. Neurochem Int. 2009 Feb;54(2):73-83.
4: Novikova LN, Pettersson J, Brohlin M, Wiberg M, Novikov LN. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 2008 Mar;29(9):1198-206.
5: Guest J, Santamaria AJ, Benavides FD. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 2013 Dec;18(6):682-9.
6: Brook GA, Lawrence JM, Shah B, Raisman G. Extrusion transplantation of Schwann cells into the adult rat thalamus induces directional host axon growth. Exp Neurol. 1994 Mar;126(1):31-43.
7: Vaudano E, Campbell G, Hunt SP. Change in the molecular phenotype of Schwann cells upon transplantation into the central nervous system: down-regulation of c-jun. Neuroscience. 1996 Sep;74(2):553-65.
8: Keirstead HS, Ben-Hur T, Rogister B, O'Leary MT, Dubois-Dalcq M, Blakemore WF. Polysialylated neural cell adhesion molecule-positive CNS precursors generate both oligodendrocytes and Schwann cells to remyelinate the CNS after transplantation. J Neurosci. 1999 Sep 1;19(17):7529-36.
9: Wan H, An YH, Sun MZ, Zhang YZ, Wang ZC. Schwann cells transplantation promoted and the repair of brain stem injury in rats. Biomed Environ Sci. 2003 Sep;16(3):212-8.
10: Chen L, Fan X, Jin G, Wan X, Qiu R, Yi G, You Y, Xu Q. Treatment of rat with traumatic brain injury and MR tracing in vivo via combined transplantation of bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic iron oxide and Schwann cells. J Biomed Nanotechnol. 2014 Feb;10(2):205-15.
11: Shields SA, Blakemore WF, Franklin RJ. Schwann cell remyelination is restricted to astrocyte-deficient areas after transplantation into demyelinated adult rat brain. J Neurosci Res. 2000 Jun 1;60(5):571-8.。
1: Hadlock T, Sundback C, Hunter D, Cheney M, Vacanti JP. A polymer foam conduit seeded with Schwann cells promotes guided peripheral nerve regeneration. Tissue Eng 2000;6:119-127.
2: Jesuraj NJ, Santosa KB, Macewan MR, Moore AM, Kasukurthi R, Ray WZ, Flagg ER, Hunter DA, Borschel GH, Johnson PJ, Mackinnon SE, Sakiyama-Elbert SE. Schwann cells seeded in acellular nerve grafts improve functional recovery. Muscle Nerve.2014 Feb;49(2):267-76.
3: Tabesh H, Amoabediny G, Nik NS, Heydari M, Yosefifard M, Siadat SO, Mottaghy K. The role of biodegradable engineered scaffolds seeded with Schwann cells for spinal cord regeneration. Neurochem Int. 2009 Feb;54(2):73-83.
4: Novikova LN, Pettersson J, Brohlin M, Wiberg M, Novikov LN. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 2008 Mar;29(9):1198-206.
5: Guest J, Santamaria AJ, Benavides FD. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 2013 Dec;18(6):682-9.
6: Brook GA, Lawrence JM, Shah B, Raisman G. Extrusion transplantation of Schwann cells into the adult rat thalamus induces directional host axon growth. Exp Neurol. 1994 Mar;126(1):31-43.
7: Vaudano E, Campbell G, Hunt SP. Change in the molecular phenotype of Schwann cells upon transplantation into the central nervous system: down-regulation of c-jun. Neuroscience. 1996 Sep;74(2):553-65.
8: Keirstead HS, Ben-Hur T, Rogister B, O'Leary MT, Dubois-Dalcq M, Blakemore WF. Polysialylated neural cell adhesion molecule-positive CNS precursors generate both oligodendrocytes and Schwann cells to remyelinate the CNS after transplantation. J Neurosci. 1999 Sep 1;19(17):7529-36.
9: Wan H, An YH, Sun MZ, Zhang YZ, Wang ZC. Schwann cells transplantation promoted and the repair of brain stem injury in rats. Biomed Environ Sci. 2003 Sep;16(3):212-8.
10: Chen L, Fan X, Jin G, Wan X, Qiu R, Yi G, You Y, Xu Q. Treatment of rat with traumatic brain injury and MR tracing in vivo via combined transplantation of bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic iron oxide and Schwann cells. J Biomed Nanotechnol. 2014 Feb;10(2):205-15.
11: Shields SA, Blakemore WF, Franklin RJ. Schwann cell remyelination is restricted to astrocyte-deficient areas after transplantation into demyelinated adult rat brain. J Neurosci Res. 2000 Jun 1;60(5):571-8.。
上記の文献１〜１１の内容は本明細書に参考として援用される。
上記の治療する対象となる疾患としては、脳梗塞、脊椎損傷などによる中枢神経の欠損若しくは損傷、外傷や神経炎や腫瘍の切除等に伴う末梢神経の欠損若しくは損傷；多発性硬化症 視神経脊髄炎（Devic症候群）、同心円硬化症（Balo病）、急性散在性脳脊髄炎（acute disseminated encephalomyelitis、ADEM）、炎症性広汎性硬化症（Schilder病）、感染性 亜急性硬化症全脳炎（subacute sclerosing panencephalitis、SSPE）、進行性多巣性白質脳症（progressive multifocal leukoencephalopathy、PML）などの中枢神経系の疾患；ギラン・バレー症候群、フィッシャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎などの末梢神経系の疾患；Charcot-Marie-Tooth disease（CMT）などのシュワン細胞欠損、不足もしくは機能低下に基づく疾患などが挙げられる。
本明細書において、特に明示のない限り、「治療」という用語は、患者が特定の疾患又は障害を患っている間に行う処置を意図し、これによって疾患若しくは障害の重症度、又は１つ若しくは複数のその症状が軽減されるか、又は疾患若しくは障害の進行が遅延又は減速することを意味する。本明細書において、「治療」には「予防」を含むものとする。
本発明で得られるシュワン細胞はまた、疾患の治療に限らず、美容や機能増強の目的でで用いることもできる。その際、ヒトに対する処置も、本明細書では便宜上治療と呼び、「患者」は「健常者」あるいは「ヒト」、「疾患」は「美容」若しくは「機能」と読み替えることができる。
本発明はまた、ヒトだけでなく、イヌ、ネコ等の愛玩動物やウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ等の家畜を含む哺乳動物の疾患の治療にも用いることが可能である。その場合、「患者」を「患畜」あるいは「哺乳動物」と読み替えることとする。
組成物
前述するように、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を体細胞に導入することにより、シュワン細胞を調製できる。従って、本発明は、さらに、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を含む、シュワン細胞を調製するための組成物を提供する。当該シュワン細胞を調製するための組成物は、体細胞からシュワン細胞を誘導するために使用される因子を含むものであり、上記遺伝子又はその発現産物が体細胞に導入可能な形態で含まれていることが望ましい。上記遺伝子が体細胞に導入可能な形態として、具体的には、上記遺伝子が組み込まれたベクターが例示される。ここで、上記遺伝子は、各々別のベクターに組み込まれていてもよく、１つのベクターに２種以上の遺伝子が同時に組み込まれていてもよい。
前述するように、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を体細胞に導入することにより、シュワン細胞を調製できる。従って、本発明は、さらに、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を含む、シュワン細胞を調製するための組成物を提供する。当該シュワン細胞を調製するための組成物は、体細胞からシュワン細胞を誘導するために使用される因子を含むものであり、上記遺伝子又はその発現産物が体細胞に導入可能な形態で含まれていることが望ましい。上記遺伝子が体細胞に導入可能な形態として、具体的には、上記遺伝子が組み込まれたベクターが例示される。ここで、上記遺伝子は、各々別のベクターに組み込まれていてもよく、１つのベクターに２種以上の遺伝子が同時に組み込まれていてもよい。
使用することができるベクターの種類等については、前述の通りである。
インビボ（in vivo）でのダイレクト・リプログラミング
前述するように、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を体細胞に導入することにより、シュワン細胞を調製できる。
前述するように、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を体細胞に導入することにより、シュワン細胞を調製できる。
ここで、神経の損傷時には、損傷部には線維芽細胞が集積する。集積した線維芽細胞は、その後線維性の瘢痕を形成する。
従って、本発明の調製方法を応用して、神経の損傷部の線維芽細胞に、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を導入することで、当該損傷部においてシュワン細胞をダイレクト・リプログラミングによって誘導し、もって神経損傷の治療や神経の再生に寄与することができる。SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物の導入においては、上記の本発明の組成物を好適に使用することができる。
本発明の調製方法は、インビトロ（in vitro）でのダイレクト・リプログラミングに加えて、上記のようなインビボ（in vivo）でのダイレクト・リプログラミングをも包含すると理解される。
インビボ（in vivo）でのダイレクト・リプログラミングは、神経の損傷部の線維芽細胞に、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を導入する以外は、例えば下記の文献に記載のインビボ（in vivo）での心筋細胞へのダイレクト・リプログラミングに準じて行うことができる。
1: Ieda M. Heart regeneration using reprogramming technology. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2013;89(3):118-28. Review.
2: Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, Bruneau BG,Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 2010 Aug 6;142(3):375-86.
3: Qian L, Huang Y, Spencer CI, Foley A, Vedantham V, Liu L, Conway SJ, Fu JD, Srivastava D. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 2012 May 31;485(7400):593-8.
上記の文献１〜３の内容は本明細書に参考として援用される。
1: Ieda M. Heart regeneration using reprogramming technology. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2013;89(3):118-28. Review.
2: Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, Bruneau BG,Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 2010 Aug 6;142(3):375-86.
3: Qian L, Huang Y, Spencer CI, Foley A, Vedantham V, Liu L, Conway SJ, Fu JD, Srivastava D. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 2012 May 31;485(7400):593-8.
上記の文献１〜３の内容は本明細書に参考として援用される。
以下に実施例を示すが、本発明はこの実施例だけに限定されるものではない。
実施例中、HDFはヒト皮膚線維芽細胞（Human Dermal Fibroblast）を示す。cSCは、対照の生体から採取した培養シュワン細胞（cultured Schwann cells）を示す。dSCは、本発明の方法により得たシュワン細胞（directly reprogrammed Schwann cells）を示す。
Contは、対照（Control）を示す。
実施例１ 方法の概略（図１）
図１に、本発明のシュワン細胞（図中、「directly reprogrammed Schwann cell: dSC」）を調製するための方法の概略を示す。
図１に、本発明のシュワン細胞（図中、「directly reprogrammed Schwann cell: dSC」）を調製するための方法の概略を示す。
レトロウイルスベクタープラスミドpMXs.puroに、SOX10等の種々の遺伝子のcDNAコーディング配列をGene artシステムを用いて組み込んだ。パッケージング細胞 Plat GP細胞を、100U/mL Penicillinと100μg/ml Streptomycinを含んだ1% NEAA 10% FBS DMEM（通常培地）に縣濁し、ゼラチンコートした10cm培養ディシュにディシュあたり5×106 個の濃度で播種した（第-3日）。24時間培養後、種々の遺伝子を含むpMXsベクターを、種々の組み合わせで、pCMV VSVベクターと伴に、X-tremeGENE 9を用いて以下の比で導入した。すなわち導入遺伝子5μg、pCMV.VSV 2.5μg、Opti-MEM 500μl、X-tremeGENE 9 22.5μlの混和液を10mlの培地入りの10cmディシュに添加した（第-2日）。24時間後、抗生剤を含まない通常培地に交換（第-1日）。同日（第-1日）に、ヒト正常皮膚線維芽細胞株（aHDF）（図中、「fibroblast」）を、1.5×104〜2×104cells/mLで培養ディッシュまたは12 wellプレートに播種した。24時間後（第0日）、Plat GP培養上清を、ポアの直径が0.45μmのシリンジフィルターを通した後、ポリブレン（最終濃度4μg/mL）と混和した（ウイルス液）。aHDFの培養上清を吸引除去した後、すばやく上記のウイルス液を1mL加え24時間培養した（感染；図中、「transfection」）。コントロール群として、ウイルス感染を行わない細胞も準備した。1日後（第1日）、培養上清を吸引除去し、シュワン細胞誘導培地（通常培地に5 mM forskolin,10 ng/ml recombinant human basic fibroblast growthfactor (bFGF), 5 ng/ml recombinant human platelet-derived growth factor (PDGF) and 200ng/ml recombinant human heregulin1-b1(GGF)（いずれも最終濃度）を加えたもの）を加えその後2日おきに同じ組成の新しい培養液に交換した。第 12-22日に、得られた細胞について、シュワン細胞の代表的なマーカーであるS100β染色を行った。レトロウイルスクターを感染させずに、同じ培養を行った細胞をControlとした。
実施例２ ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのコンバージョン、S100β蛍光免疫染色像（表１）（図２)
ヒト正常皮膚線維芽細胞（aHDF）を、12 wellプレートに培養し、実施例１に記載の操作を行った。第14日に各ウェルから培養液を吸引除去し、PBSで１回洗浄を行った後、４％PFAで固定。ブロッキング溶液を加え、37℃で15分間静置した。抗S100β抗体（１次抗体）とAlexaFluor566標識抗ウサギIgG抗体（2次抗体）で染色した細胞である。プレートの各ウェルには異なる遺伝子の組み合わせが導入されており、どのナンバーのウェルにどの遺伝子の組み合わせが導入されたかは、表１に記載する（表中で、各遺伝子の欄に「1」と記載があるものは、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させたことを、空欄は、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させていないことを表す）。導入した遺伝子候補は、シュワン細胞関連遺伝子としてSOX10、Krox20、Oct6を、リプログラミング関連遺伝子としてSOX2、C-myc、KLF4、Oct3/4の7因子である。たとえば、表１のNo. 43は、SOX10、Krox20、Oct6、KLF4の遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させた細胞である。
ヒト正常皮膚線維芽細胞（aHDF）を、12 wellプレートに培養し、実施例１に記載の操作を行った。第14日に各ウェルから培養液を吸引除去し、PBSで１回洗浄を行った後、４％PFAで固定。ブロッキング溶液を加え、37℃で15分間静置した。抗S100β抗体（１次抗体）とAlexaFluor566標識抗ウサギIgG抗体（2次抗体）で染色した細胞である。プレートの各ウェルには異なる遺伝子の組み合わせが導入されており、どのナンバーのウェルにどの遺伝子の組み合わせが導入されたかは、表１に記載する（表中で、各遺伝子の欄に「1」と記載があるものは、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させたことを、空欄は、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させていないことを表す）。導入した遺伝子候補は、シュワン細胞関連遺伝子としてSOX10、Krox20、Oct6を、リプログラミング関連遺伝子としてSOX2、C-myc、KLF4、Oct3/4の7因子である。たとえば、表１のNo. 43は、SOX10、Krox20、Oct6、KLF4の遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させた細胞である。
代表的なS100βの染色性像として、Sox10とKrox20の２因子の遺伝子を導入した細胞を図２に示す。図２は、DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色との共染色である。
実施例３ ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのコンバージョン、S100β染色の半定量（図３）
図２と同じ実験において、その他の組み合わせの染色性を確認するために、プレートを蛍光顕微鏡(オリンパス製)で観察し、S100βの染色性を4段階で評価した（S100β陽性細胞が多いものから順に、＋＋＋、＋＋、＋、−）。
図２と同じ実験において、その他の組み合わせの染色性を確認するために、プレートを蛍光顕微鏡(オリンパス製)で観察し、S100βの染色性を4段階で評価した（S100β陽性細胞が多いものから順に、＋＋＋、＋＋、＋、−）。
それぞれの評価の典型像を図３で示す。またその評価結果を表１中に併せて示す。たとえば、No.4のSOX10とKROX20の２遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させた細胞は＋＋＋の評価となり、もっとも多くのS100β陽性細胞を含むことが分かる。SOX10単独、またはKROX20単独の導入でも、低い効率でシュワン細胞が誘導できるが、SOX10とKROX20の共導入がより効率高く誘導できる。またOct6は、シュワン細胞の誘導にほとんど効果がないことがわかる。
実施例４ ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのコンバージョン、細胞形態評価（図４）
実施例１において、Sox10とKrox20の２因子の遺伝子を導入した細胞について、ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのコンバージョンにおける細胞形態変化をシュワン細胞に特徴的なバイポーラ型の細胞長の増加を細胞長/細胞幅比で評価した。
実施例１において、Sox10とKrox20の２因子の遺伝子を導入した細胞について、ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのコンバージョンにおける細胞形態変化をシュワン細胞に特徴的なバイポーラ型の細胞長の増加を細胞長/細胞幅比で評価した。
評価の結果を、図４に示す。コンバージョンすることで細胞長/細胞幅比の増大つまりシュワン細胞に特徴的な細胞形態に変化することが示された。
実施例５ ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのコンバージョン、その他のシュワン細胞関連マーカーを用いた免疫細胞蛍光染色像（図５）
ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、実施例１の操作を行った。SOX10及びKrox20の２つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から12日後、免疫染色を行った。
ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、実施例１の操作を行った。SOX10及びKrox20の２つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から12日後、免疫染色を行った。
結果を図５に示す。抗p75NTR抗体（１次抗体）、抗GFAP抗体（１次抗体）、抗NG2抗体（１次抗体）は宿主がウサギであり、抗Nestin抗体（１次抗体）は宿主がマウスである。2次抗体は、AlexaFluor488,566標識抗ウサギIgG抗体又はAlexaFluor488標識抗マウスIgG抗体を使用した。S100βに比べて陽性率は下がるもののそれぞれの発現が確認される。
実施例６
A. ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのコンバージョン、S100βとp75NTR遺伝子のmRNA発現量の測定（図６）
ヒト正常皮膚線維芽細胞（aHDF）を、12wellプレートに培養し、実施例１の操作をした。ウェルNo. 1〜6の細胞にはSox10とKrox20の２因子の遺伝子を導入し、ウェルNo. 7〜12の細胞にはコントロールとして遺伝子は導入しなかった。遺伝子導入12日後、各ウェルからISOGEN IIにてtotal RNAを回収し、ReverTra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。UCP1とβアクチン遺伝子のmRNAレベルを定量する目的で、Real-time PCR Master Mix、Taqman probe、Specific PrimerおよびcDNAを混和し、AB7300 Real-time PCR systemを用いてReal-time RT-PCRを行った。各細胞のβアクチンmRNAレベルに対する目的遺伝子のmRNAレベルの値を計算した。
A. ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのコンバージョン、S100βとp75NTR遺伝子のmRNA発現量の測定（図６）
ヒト正常皮膚線維芽細胞（aHDF）を、12wellプレートに培養し、実施例１の操作をした。ウェルNo. 1〜6の細胞にはSox10とKrox20の２因子の遺伝子を導入し、ウェルNo. 7〜12の細胞にはコントロールとして遺伝子は導入しなかった。遺伝子導入12日後、各ウェルからISOGEN IIにてtotal RNAを回収し、ReverTra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。UCP1とβアクチン遺伝子のmRNAレベルを定量する目的で、Real-time PCR Master Mix、Taqman probe、Specific PrimerおよびcDNAを混和し、AB7300 Real-time PCR systemを用いてReal-time RT-PCRを行った。各細胞のβアクチンmRNAレベルに対する目的遺伝子のmRNAレベルの値を計算した。
結果を図６に示す。グラフの縦軸は、ウェルNo. 1の値を「１」として、各ウェルの値を算出した相対値を、relative mRNA levelとして示す。SOX10とKROX20の2つの遺伝子を導入した細胞（No.1〜6）は、control（No. 7〜12）と比較し、シュワン細胞特異的マーカーであるS100βとp75NTR遺伝子の強力な発現を認めた。
B. RT-PCR産物のアガロースゲルを用いた電気泳動
Aで得られたReal-time RT-PCR産物をアガロースゲルを用いた電気泳動を行った。結果、SOX10とKrox20の2因子の遺伝子を導入した細胞群において、S100βとp75NTR遺伝子のmRNAの強い発現が確認された。
Aで得られたReal-time RT-PCR産物をアガロースゲルを用いた電気泳動を行った。結果、SOX10とKrox20の2因子の遺伝子を導入した細胞群において、S100βとp75NTR遺伝子のmRNAの強い発現が確認された。
C. 因子導入なし、SOX10のみ、Krox20のみ、SOX10＋Krox20のそれぞれの組み合わせによるヒト線維芽細胞からシュワン細胞へのダイレクト・リプログラミング効率のRTPCRを用いた検討。
ヒト正常皮膚線維芽細胞であるaHDFを、12wellプレートに培養し、実施例１の操作を行った。遺伝子導入しなかった細胞（コントロール）、SOX10遺伝子のみ導入、Krox20遺伝子導入のみ、SOX10遺伝子＋Krox20遺伝子を導入した細胞それぞれの、S100βとp75NTRのmRNAの発現を、Aと同様の方法で比較した。mRNAの相対値を、relative mRNA levelとして示す。各群のβアクチンmRNAレベルに対する目的遺伝子のmRNAレベルの値を計算した。非導入細胞のうちの１群の値を「１」として、各群の値を算出した相対値の平均を、relative mRNA levelとして示す。結果、SOX10＋Krox20の2因子を導入した群では、S100βとp75NTRのmRNAの発現量が大きく上昇していた。また、Sox10のみを導入した細胞でも、Sox10とKrox20の両方を導入した細胞に比べると低いが、S100βとp75NTRのmRNA発現量が上昇していた。また、Krox20のみを導入した細胞でも、Sox10とKrox20の両方を導入した細胞に比べると低いが、S100βのmRNA発現量が上昇していた。S100βのrelative mRNA levelは、非導入細胞では4.4、Sox10単独導入細胞では1712.3 、Krox20単独導入細胞では25.1、Sox10＋Krox20を導入した細胞では127615.0であった。p75NTRのrelative mRNA levelは、非導入細胞では3.1、Sox10単独導入細胞では74.3 、Krox20単独導入細胞では0.4、Sox10＋Krox20を導入した細胞では35397.6であった。したがって、SOX10単独やKrox20単独でも、効率が低いながら、ヒト線維芽細胞からシュワン細胞へのダイレクト・リプログラミングが生じている可能性がある。
以上より、ヒト線維芽細胞からシュワン細胞へのダイレクト・リプログラミングは、SOX10とKrox20の2因子を用いる場合に効率が高いことが確認された。また、SOX10またはKrox20のいずれか１因子でも効率は低いがヒト線維芽細胞からシュワン細胞へのダイレクト・リプログラミングが可能であることが示された。
実施例７ dSCの神経細胞に対する神経突起伸長効果についての検討（図７）
NG108-15を12時間培養し、その後36時間、HDF、cSC、または、dSC （Sox10とKrox20の２因子の遺伝子を導入して誘導したdSC）と、共培養を行った。コントロールとして、NG108-15を1% FBS 添加DMEMのみで培養した。I．神経突起を有する細胞（neurite-bearing cell）の割合（percent of neurite-bearing-cells）、II．細胞体から直接伸長する一次神経突起数（number of primary neurites）、III．最長神経突起の長さ（Longest neurite length）を文献：Tomita K, Madura T, Sakai Y, et al: Glialdifferentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience.2013; 236:55-65.の方法により比較検討した。NG108-15のみを抗Tuj-1抗体（１次抗体）と2次抗体はAlexaFluor566標識抗ウサギIgG抗体を用いて蛍光染色した。
NG108-15を12時間培養し、その後36時間、HDF、cSC、または、dSC （Sox10とKrox20の２因子の遺伝子を導入して誘導したdSC）と、共培養を行った。コントロールとして、NG108-15を1% FBS 添加DMEMのみで培養した。I．神経突起を有する細胞（neurite-bearing cell）の割合（percent of neurite-bearing-cells）、II．細胞体から直接伸長する一次神経突起数（number of primary neurites）、III．最長神経突起の長さ（Longest neurite length）を文献：Tomita K, Madura T, Sakai Y, et al: Glialdifferentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience.2013; 236:55-65.の方法により比較検討した。NG108-15のみを抗Tuj-1抗体（１次抗体）と2次抗体はAlexaFluor566標識抗ウサギIgG抗体を用いて蛍光染色した。
図７に結果を示す。コントロール群との比較ではcSC、dSCの両者とも検討したパラメーター(I-III)すべてにおいて高い神経突起伸長促進効果を示し、dSCの成績はcSCに匹敵するものであった。以上よりdSC培養上清は神経細胞に対して突起伸長を促進させることが確認された。
実施例８ ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのウィルスフリーPlasmid導入（エレクトロポーション）によるコンバージョン（図８）
ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、実施例１の操作を行った。SOX10及びKrox20の２つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から14日後、免疫染色を行った。
ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、実施例１の操作を行った。SOX10及びKrox20の２つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から14日後、免疫染色を行った。
結果を図８に示す。抗S100β抗体（１次抗体）、抗p75NTR抗体（１次抗体）、抗GAP43抗体（１次抗体）は宿主がウサギであり、2次抗体は、AlexaFluor566標識抗ウサギIgG抗体を使用した。レトロウィルスベクターを用いた場合に比較して陽性率は下がるものの、S100β、p75NTR及びGAP43それぞれの発現が確認でき、線維芽細胞aHDFからシュワン細胞へのコンバージョンが確認できた。
実施例９ ヒト正常脂肪由来幹細胞からシュワン細胞へのコンバージョン、その他のシュワン細胞関連マーカーを用いた免疫細胞蛍光染色像（図９）
脂肪由来間質細胞からdSCへのコンバージョンを検証した。
脂肪由来間質細胞からdSCへのコンバージョンを検証した。
〈方法〉
ヒト正常脂肪由来間質細胞（ADSC: adipose rerived stromal cell）を、12wellプレートに培養し、実施例１の操作を行った。SOX10及びKrox20の２つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から14日後、免疫染色を行った。
ヒト正常脂肪由来間質細胞（ADSC: adipose rerived stromal cell）を、12wellプレートに培養し、実施例１の操作を行った。SOX10及びKrox20の２つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から14日後、免疫染色を行った。
〈結果〉
結果を図９に示す。抗S100β抗体（１次抗体）、抗p75NTR抗体（１次抗体）、抗GAP43抗体（１次抗体）、抗Protein Zero抗体（１次抗体）は宿主がウサギであり、2次抗体は、AlexaFluor566標識抗ウサギIgG抗体を使用した。S100βによる染色では、約40%の細胞が陽性を示した。他のシュワン細胞マーカーについてもS100βに比べて陽性率は下がるもののそれぞれの発現が確認される。ミエリンマーカーであるProtein Zeroも陽性を示した。
結果を図９に示す。抗S100β抗体（１次抗体）、抗p75NTR抗体（１次抗体）、抗GAP43抗体（１次抗体）、抗Protein Zero抗体（１次抗体）は宿主がウサギであり、2次抗体は、AlexaFluor566標識抗ウサギIgG抗体を使用した。S100βによる染色では、約40%の細胞が陽性を示した。他のシュワン細胞マーカーについてもS100βに比べて陽性率は下がるもののそれぞれの発現が確認される。ミエリンマーカーであるProtein Zeroも陽性を示した。
具体的には、線維芽細胞（Fibroblast）と同様の方法でシュワン細胞誘導を行った結果、細胞の形態が、ヒト正常脂肪由来間質細胞の形態から、シュワン細胞に典型的な比較的小型の核を有する双極、もしくは多極性の細胞形態へと変化した。さらに、シュワン細胞に典型的な細胞形態に変化した細胞は、シュワン細胞マーカー（S100β）陽性であった(約40-50%)（図９Ａ）。
また、誘導後の細胞はシュワン細胞マーカー（S100β、GAP43)、未分化シュワン細胞マーカー(p75NTR)、ミエリンマーカー(P0)が陽性であった（図９Ｂ）。
実施例１０ 臍帯血管内皮細胞からシュワン細胞へのコンバージョン、その他のシュワン細胞関連マーカーを用いた免疫細胞蛍光染色像（図１０）
血管内皮細胞からdSCへのコンバージョンを検証した。
血管内皮細胞からdSCへのコンバージョンを検証した。
〈方法〉
臍帯血管内皮細胞（Huvec: Human Umbilical Vein Endothelial Cells）を、12wellプレートに培養し、実施例１の操作を行った。SOX10及びKrox20の２つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から14日後、免疫染色を行った。
臍帯血管内皮細胞（Huvec: Human Umbilical Vein Endothelial Cells）を、12wellプレートに培養し、実施例１の操作を行った。SOX10及びKrox20の２つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から14日後、免疫染色を行った。
〈結果〉
結果を図１０に示す。抗S100β抗体（１次抗体）、抗p75NTR抗体（１次抗体）、抗GAP43抗体（１次抗体）、抗Protein Zero抗体（１次抗体）は宿主がウサギであり、2次抗体は、566標識抗ウサギIgG抗体を使用した。S100βによる染色では、約30%の細胞が陽性を示した。他のシュワン細胞マーカーについてもS100βに比べて陽性率は下がるもののそれぞれの発現が確認される。ミエリンマーカーであるProtein Zeroも陽性を示した。
結果を図１０に示す。抗S100β抗体（１次抗体）、抗p75NTR抗体（１次抗体）、抗GAP43抗体（１次抗体）、抗Protein Zero抗体（１次抗体）は宿主がウサギであり、2次抗体は、566標識抗ウサギIgG抗体を使用した。S100βによる染色では、約30%の細胞が陽性を示した。他のシュワン細胞マーカーについてもS100βに比べて陽性率は下がるもののそれぞれの発現が確認される。ミエリンマーカーであるProtein Zeroも陽性を示した。
具体的には、線維芽細胞（Fibroblast）と同様の方法でシュワン細胞誘導を行った結果、細胞の形態が、臍帯血管内皮細胞の形態から、シュワン細胞に典型的な比較的小型の核を有する双極、もしくは多極性の細胞形態へと変化した。さらに、シュワン細胞に典型的な細胞形態に変化した細胞は、シュワン細胞マーカー（S100β）陽性であった(約50-60%)（図１０Ａ）。
また、誘導後の細胞はシュワン細胞マーカー（S100β、GAP43）、未分化シュワン細胞マーカー（p75NTR）が陽性であった（図１０Ｂ）。
実施例１１ GFPでマーキングしたdSC（Sox10とKrox20の２因子の遺伝子を導入して誘導したdSC）とDRGnとの共培養によるdSCのin vitroでのミエリン化形成。シュワン細胞関連マーカーを用いた免疫細胞蛍光染色像（図１１）
GFPでマーキングしたdSCとDRGnとの共培養によるdSCのin vitroでのミエリン化能を評価した。
GFPでマーキングしたdSCとDRGnとの共培養によるdSCのin vitroでのミエリン化能を評価した。
〈方法〉
dSCをレトロウィルスベクターを用いてGFPで細胞マーキングした。
dSCをレトロウィルスベクターを用いてGFPで細胞マーキングした。
具体的手法は、文献：Yoshioka T, Ageyama N, Shibata H, Yasu T, Misawa Y, Takeuchi K, Matsui K, Yamamoto K, Terao K, Shimada K, Ikeda U, Ozawa K, Hanazono Y. Repair of infarctedmyocardium mediated by transplanted bone marrow-derived CD34+ stem cells in anonhuman primate model. Stem Cells. 2005 Mar;23(3):355-64.及び文献：Hirschmann F, Verhoeyen E, Wirth D, Bauwens S, Hauser H, Rudert M. Vital marking of articular chondrocytes by retroviral infection using green fluorescence protein. Osteoarthritis Cartilage. 2002 Feb;10(2):109-18.に記載の方法に準じた。
生後5日目のマウスより採取した後根神経節細胞（DRGn: dorsal root ganglion neuron）を2日間12 wellにて培養し、GFPでマーキングしたdSCとNerve Growth Factorsとアスコルビン酸とcAMPを含むミエリン分化誘導培地で共培養した。共培養遺伝子開始から14日後、免疫染色を行った。
用いた培地の組成は以下の通りである：
DMEM containing N2 supplement (Invitrogen), 50 ng/ml ascorbic acid (Wako, Osaka, Japan), and 50 ng/ml recombinant rat b-nerve growth factor (NGF) (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA),0.5μM cAMP(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)。
DMEM containing N2 supplement (Invitrogen), 50 ng/ml ascorbic acid (Wako, Osaka, Japan), and 50 ng/ml recombinant rat b-nerve growth factor (NGF) (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA),0.5μM cAMP(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)。
培地は、文献：Sango K, Kawakami E, Yanagisawa H, Takaku S, Tsukamoto M, Utsunomiya K, Watabe K. Myelination in coculture of established neuronal and Schwann cell lines. Histochem Cell Biol. 2012 Jun;137(6):829-39.の記載に準じて作製した。
抗Neurofilament抗体（１次抗体）、抗MBP（Myelin Basic Protein）抗体（１次抗体）は宿主がマウスであり、抗Tuj-1抗体（１次抗体）、抗Protein Zero抗体（１次抗体）は宿主がウサギであり、2次抗体は、AlexaFluor566標識抗マウスとウサギのIgG抗体を、Cy5標識標識抗マウスとウサギのIgG抗体を使用した。ミエリンマーカー抗体である抗MBP抗体と抗Protein Zero抗体は赤色で標識し、神経軸索マーカーである抗Neurofilament抗体と抗Tuj-1抗体はGrayで標識している。
〈結果〉
結果を図１１に示す。DRGの神経突起に沿ってミエリン化したシュワン細胞がみられるが、一部のミエリン化シュワン細胞とGFPでマーキングされたdSC細胞がOverlapしている。
結果を図１１に示す。DRGの神経突起に沿ってミエリン化したシュワン細胞がみられるが、一部のミエリン化シュワン細胞とGFPでマーキングされたdSC細胞がOverlapしている。
実施例１２ 坐骨神経crushモデルに対するGFPでマーキングしたdSC（Sox10とKrox20の２因子の遺伝子を導入して誘導したdSC）移植によるin vitroでのミエリン化形成。ミエリン関連マーカーを用いた免疫細胞蛍光染色像（図１２）
dSCのin vivoでのミエリン化能の検討をした。
dSCのin vivoでのミエリン化能の検討をした。
〈方法〉
dSCをウィルスベクターを用いてGFPで細胞マーキングした。
dSCをウィルスベクターを用いてGFPで細胞マーキングした。
免疫不全マウスの坐骨神経を露出させ、中央部分を手術用ペアンで約1分間把持し、約5mmの範囲で神経を挫滅させた。その末梢側にGFPでマーキングしたdSCを約5万個注入した。移植開始から1か月後、挫滅させた部位の修復神経を採取し免疫染色を行った。方法の概要を図１２に示す。
抗Neurofilament抗体（１次抗体）、抗MBP抗体（１次抗体）は宿主がマウスであり、抗Tuj-1抗体（１次抗体）、抗Protein Zero抗体（１次抗体）は宿主がウサギであり、2次抗体は、AlexaFluor566標識抗マウスとウサギのIgG抗体を、Cy5標識標識抗マウスとウサギのIgG抗体を使用した。ミエリンマーカー抗体である抗MBP抗体と抗Protein Zero抗体は赤色で標識し、神経軸索マーカーである抗Neurofilament抗体と抗Tuj-1抗体はGrayで標識している。
〈結果〉
結果を図１２に示す。再生神経に沿うようにGFP+細胞が並んでおり、これらはミエリンマーカー＋細胞とOverlapしている(図１２Ｂ及びＣ)。
結果を図１２に示す。再生神経に沿うようにGFP+細胞が並んでおり、これらはミエリンマーカー＋細胞とOverlapしている(図１２Ｂ及びＣ)。
再生神経に迷入したGFP+細胞はミエリンマーカーも発現している(図１２Ｂ及びＣ、矢印)。
実施例１３ 免疫不全マウス坐骨欠損（5mm）モデルへのdSCの移植（図１３）
〈方法〉
培養シュワン細胞（SC：比較対照群）を坐骨神経より分離培養した。これらの細胞をあらかじめゼラチンチューブに播種させ、マウスの坐骨神経幹に約5mmのgapを作成した。得られたハイブリッド型チューブを神経欠損部に移植した。ShamマウスおよびPBSのみを含有させたチューブ移植群（Cont）をコントロールに、神経再生促進効果を評価した(図１３Ａ)。
〈方法〉
培養シュワン細胞（SC：比較対照群）を坐骨神経より分離培養した。これらの細胞をあらかじめゼラチンチューブに播種させ、マウスの坐骨神経幹に約5mmのgapを作成した。得られたハイブリッド型チューブを神経欠損部に移植した。ShamマウスおよびPBSのみを含有させたチューブ移植群（Cont）をコントロールに、神経再生促進効果を評価した(図１３Ａ)。
架橋神経はマクロ像と再生神経組織横軸切片のルクソール・ファーストブルーによるミエリン染色像を示す。坐骨神経機能は移植後６週（6W）と１２週（12W）後の結果を示し、支配筋の委縮は湿筋重量で評価を行った。
坐骨神経機能インデックス（SFI: Sciatic functional Index）は、文献：Inserra MM, Bloch DA, Terris DJ. Functional indices for sciatic, peroneal, and posteriortibial nerve lesions in the mouse. Microsurgery. 1998;18:119-124.の記載に準じて求めた。
Innervated muscleの萎縮及び線維化は、文献：Clavijo-Alvarez JA, Nguyen VT, Santiago LY, Doctor JS, Lee WP, Marra KG. Comparison of biodegradable conduits within aged rat sciatic nerve defects. Plast Reconstr Surg. 2007;119:1839-1851.の記載に準じて評価した。
〈結果〉
架橋された神経のマクロ像では、cSC群とdSCの両者ともcontrolに比較して優れており、両者間で明らかな差異はみられなかった（図１３Ｂ）。
架橋された神経のマクロ像では、cSC群とdSCの両者ともcontrolに比較して優れており、両者間で明らかな差異はみられなかった（図１３Ｂ）。
再生神経組織横軸切片のミエリン染色像ではdSC群はcSC群に匹敵している(図１３Ｃ)。
坐骨神経機能インデックス（SFI: Sciatic functional Index）では、12Wの時点でdSC群はcSCに匹敵する坐骨神経機能の回復がみられた（図１３Ｄ）。
Innervated muscleの萎縮及び線維化でも、両群についてもコントロールとの有意差はみられたが、cSCとdSC間での有意差はみられなかった（図１３E）。
実施例１４ シュワン細胞へのコンバージョン（表２）
表２に示す遺伝子の組み合わせについて、実施例２と同様の実験を行った。
表２に示す遺伝子の組み合わせについて、実施例２と同様の実験を行った。
どのナンバーのウェルにどの遺伝子の組み合わせが導入されたかは、表２に記載する（表中で、各遺伝子の欄に「1」と記載があるものは、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させたことを、空欄は、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させていないことを表す）。
実施例３と同様に、プレートを蛍光顕微鏡(オリンパス製)で観察し、S100βの染色性を4段階で評価した（S100β陽性細胞が多いものから順に、＋＋＋、＋＋、＋、−）。
評価結果を表２中に併せて示す。
この結果から、Oct6はシュワン細胞の分化において重要な機能を果たすことが知られている因子であるが、体細胞からシュワン細胞へのダイレクト・リプログラミングはほとんど誘導できないことが分かる。また、Oct6は、Sox10単独、Krox20単独、またはSox10＋Krox20による体細胞からシュワン細胞へのダイレクト・リプログラミングの効率を上げないことが分かる。
実施例１５ 神経栄養因子の産生（図１４）
HDF、cSC、及びdSCを4 x 104 cells/cm2の条件で細胞培養用ディッシュに播種し、80%コンフルエントを確認後、48時間細胞上清採取用培地で培養した。その後、各群の培養上清を40-μmフィルターに通した後、採取した。 Brain-derived Neurotrophic Factor （BDNF）、glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF）、Nerve Growth Factor （NGF）について、それぞれの培養細胞の培養上清中に含まれる蛋白量をELISA kits human BDNF ,GDNF, NGF（Promega, Madison, WI）を用いて測定した。
HDF、cSC、及びdSCを4 x 104 cells/cm2の条件で細胞培養用ディッシュに播種し、80%コンフルエントを確認後、48時間細胞上清採取用培地で培養した。その後、各群の培養上清を40-μmフィルターに通した後、採取した。 Brain-derived Neurotrophic Factor （BDNF）、glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF）、Nerve Growth Factor （NGF）について、それぞれの培養細胞の培養上清中に含まれる蛋白量をELISA kits human BDNF ,GDNF, NGF（Promega, Madison, WI）を用いて測定した。
その結果、cSCとdSCは、いずれもBDNF ,GDNF, NGFのすべてを、コントロール（HDF）に比して強く産生していた。またBDNFの産生が最も高い点でもcSCとdSCは類似していた。
Claims (6)
- SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を含む、哺乳動物の体細胞を、多能性幹細胞を経由することなくシュワン細胞にコンバートする為の剤であって、
前記遺伝子が、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせであり、
前記体細胞が線維芽細胞、血管内皮細胞又はヒト正常脂肪由来間質細胞である、剤。 - SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を含む、哺乳動物の体細胞を、多能性幹細胞を経由することなくシュワン細胞にコンバートする為のベクターであって、
前記遺伝子が、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせであり、
前記体細胞が線維芽細胞、血管内皮細胞又はヒト正常脂肪由来間質細胞である、ベクター。 - 哺乳動物の神経の欠損、又は、シュワン細胞の欠損、不足若しくは機能低下に基づく疾患を治療するためのベクターである、請求項２に記載のベクター。
- 哺乳動物（但し、ヒトを除く）の体細胞に、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を導入する工程を含む、多能性幹細胞を経由することなく体細胞からシュワン細胞を調製する方法であって、
前記遺伝子が、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせであり、
前記体細胞が線維芽細胞、血管内皮細胞又はヒト正常脂肪由来間質細胞である、方法。 - 遺伝子又はその発現産物を導入した哺乳動物の体細胞を３日間から２週間培養することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
- SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はその発現産物を含む、多能性幹細胞を経由することなく体細胞からシュワン細胞を調製するための組成物であって、
前記遺伝子が、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせであり、
前記体細胞が線維芽細胞、血管内皮細胞又はヒト正常脂肪由来間質細胞である、組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014186210 | 2014-09-12 | ||
| JP2014186210 | 2014-09-12 | ||
| PCT/JP2015/075921 WO2016039462A1 (ja) | 2014-09-12 | 2015-09-11 | シュワン細胞及びその調製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2016039462A1 JPWO2016039462A1 (ja) | 2017-06-29 |
| JP6811443B2 true JP6811443B2 (ja) | 2021-01-13 |
Family
ID=55459205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016547808A Active JP6811443B2 (ja) | 2014-09-12 | 2015-09-11 | シュワン細胞及びその調製方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10675382B2 (ja) |
| EP (1) | EP3196305B1 (ja) |
| JP (1) | JP6811443B2 (ja) |
| KR (1) | KR102499913B1 (ja) |
| CN (2) | CN114657141A (ja) |
| ES (1) | ES2875315T3 (ja) |
| WO (1) | WO2016039462A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110691601A (zh) * | 2016-11-14 | 2020-01-14 | 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 | 源自干细胞的施旺细胞 |
| KR102167548B1 (ko) * | 2017-09-21 | 2020-10-19 | 한국생명공학연구원 | 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도 |
| KR20190063792A (ko) | 2017-11-30 | 2019-06-10 | (주)셀라토즈테라퓨틱스 | 슈반세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 슈반세포로의 분화 방법 |
| CN109609456B (zh) * | 2018-12-21 | 2022-06-21 | 首都医科大学附属北京潞河医院 | 一种雪旺细胞来源外泌体的用途、诱导剂和试剂盒 |
| KR102450790B1 (ko) | 2019-01-02 | 2022-10-06 | 주식회사 셀라퓨틱스바이오 | 체세포로부터 분화된 신규한 유사신경교세포, 이의 제조 방법, 이의 제조용 칵테일 조성물, 이를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 세포 치료제 및 이를 투여하여 신경 질환을 예방 및 치료하는 방법 |
| EP4023248A4 (en) | 2019-08-30 | 2023-10-11 | Cellaxia Inc. | UROTHELIAL CELL INDUCTION AGENT AND METHOD FOR INDUCING UROTHELIAL CELLS |
| EP3929281A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-29 | Fachhochschule Technikum Wien | Cell construct comprising schwann cells or schwann cell-like cells and a biocompatible matrix |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3886346B2 (ja) * | 2001-06-22 | 2007-02-28 | サンバイオ，インコーポレイティド | 骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神経再生用医薬組成物 |
| CN101318031A (zh) * | 2008-07-15 | 2008-12-10 | 中国人民解放军第二军医大学 | 神经元性组织工程化周围神经的制备方法 |
| US9487757B2 (en) * | 2010-10-26 | 2016-11-08 | Case Western Reserve University | Glial cells and oligodendrocytes produced by reprogramming somatic cells with Sox10, Olig2 and Nkx6.2 |
-
2015
- 2015-09-11 KR KR1020177009607A patent/KR102499913B1/ko active IP Right Grant
- 2015-09-11 CN CN202210086740.6A patent/CN114657141A/zh active Pending
- 2015-09-11 EP EP15839728.1A patent/EP3196305B1/en active Active
- 2015-09-11 JP JP2016547808A patent/JP6811443B2/ja active Active
- 2015-09-11 ES ES15839728T patent/ES2875315T3/es active Active
- 2015-09-11 WO PCT/JP2015/075921 patent/WO2016039462A1/ja active Application Filing
- 2015-09-11 US US15/509,912 patent/US10675382B2/en active Active
- 2015-09-11 CN CN201580049009.4A patent/CN107075504B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3196305A4 (en) | 2018-04-25 |
| CN107075504B (zh) | 2022-02-15 |
| EP3196305B1 (en) | 2021-04-07 |
| US10675382B2 (en) | 2020-06-09 |
| JPWO2016039462A1 (ja) | 2017-06-29 |
| KR20170045356A (ko) | 2017-04-26 |
| CN114657141A (zh) | 2022-06-24 |
| ES2875315T3 (es) | 2021-11-10 |
| WO2016039462A1 (ja) | 2016-03-17 |
| EP3196305A1 (en) | 2017-07-26 |
| KR102499913B1 (ko) | 2023-02-14 |
| US20170252484A1 (en) | 2017-09-07 |
| CN107075504A (zh) | 2017-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6811443B2 (ja) | シュワン細胞及びその調製方法 | |
| Sugimura-Wakayama et al. | Peripheral nerve regeneration by secretomes of stem cells from human exfoliated deciduous teeth | |
| Chau et al. | iPSC transplantation increases regeneration and functional recovery after ischemic stroke in neonatal rats | |
| AU2014250190B2 (en) | Method for producing reprogrammed derivative neuronal stem cell from non-neuronal cell by using HMGA2 | |
| Zhao et al. | Effects of IGF-1 on neural differentiation of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells | |
| JP6889107B2 (ja) | アデノウイルスｅ４ｏｒｆ１を発現する神経系細胞、並びに、その製造および使用方法 | |
| Kitada et al. | Direct conversion of adult human skin fibroblasts into functional Schwann cells that achieve robust recovery of the severed peripheral nerve in rats | |
| US11242541B2 (en) | Skeletal muscle cells and method for inducing same | |
| US20140162366A1 (en) | Generation of vascular progenitor cells | |
| Lu et al. | Retrovirus delivered neurotrophin-3 promotes survival, proliferation and neuronal differentiation of human fetal neural stem cells in vitro | |
| Zhang et al. | Rat Nasal Respiratory Mucosa‐Derived Ectomesenchymal Stem Cells Differentiate into Schwann‐Like Cells Promoting the Differentiation of PC12 Cells and Forming Myelin In Vitro | |
| CN108350433B (zh) | 成骨细胞及其制备方法 | |
| KR20220054315A (ko) | 요로 상피 세포로의 유도제 및 요로 상피 세포의 유도 방법 | |
| Gao et al. | Identification of rat respiratory Mucosa stem cells and comparison of the early neural differentiation potential with the bone marrow mesenchymal stem cells in vitro | |
| TWI769410B (zh) | 新穎誘導性多能幹細胞(ipscs)及其應用 | |
| Tsai et al. | Differentiation of blood T cells: reprogramming human induced pluripotent stem cells into neuronal cells | |
| Yang et al. | Application of human umbilical cord mesenchymal stem cells in spinal cord injury | |
| Simeonova | Generation of Defined Astrocytic Phenotypes from Human Pluripotent Stem Cells for Transplantation after Spinal Cord Injury | |
| Tammia | NANOPARTICLE-MEDIATED TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF STEM AND PROGENITOR CELLS FOR PERIPHERAL NERVE REGENERATION | |
| Vosough | Abstracts of Royan International Twin Congress |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20180323 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20180403 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180910 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180910 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190709 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190909 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191107 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200421 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200622 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20201104 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20201201 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6811443 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |