KR20220054315A - 요로 상피 세포로의 유도제 및 요로 상피 세포의 유도 방법 - Google Patents

요로 상피 세포로의 유도제 및 요로 상피 세포의 유도 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 비뇨기계 질환, 특히 요로 상피 세포의 손상에 기인하는 질환이나 요로 상피 세포의 손실이나 기능 장애에 기인하는 질환 등에 대한 치료에 응용 가능한 요로 상피 세포를 조제하는 방법, 및 이 방법에 의해 조제되는 요로 상피 세포 및 요로 상피 세포 유도(조제)용 배지를 제공하는 것을 목적으로 한다. 포유 동물의 체세포에 외인성 인자로서, FOXA1(Forkhead box A1) 유전자 또는 그 발현 산물, TP63(tumor protein P63) 유전자 또는 그 발현 산물, MYCL (L-Myc) 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 (Kruppel-like factor 4) 유전자 또는 그 발현 산물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 도입하는 공정을 포함하는, 요로 상피 세포를 유도하는 방법에 의해 조제되는 요로 상피 세포는 비뇨기계 질환에 대한 치료에 적용 가능하다.

Description

요로 상피 세포로의 유도제 및 요로 상피 세포의 유도 방법
본 발명은 주로 요로 상피 세포의 유도 방법에 관한 것으로, 특히 다이렉트 리프로그래밍에 의한 요로 상피 세포의 유도 방법, 및 체세포로부터 요로 상피 세포로 전환하기 위한 제제에 관한 것이다.
신우, 요관, 방광 및 근위 요도로 이루어지는 요로의 표면에서 요로 상피 세포는 요로 상피를 구성한다. 요로 상피는 소변 저장량에 따라 수축되거나 확장되며 소변 삼출이나 세균 침입에 대한 강력한 장벽이 된다. 방광암, 과활동 방광, 방광의 선천성 이상, 방광 손상, 간질성 방광염, 신경인성 방광, 위축 방광과 같은 요로 질환에서는 요로 상피 세포의 손실과 기능 장애의 양쪽 또는 한쪽이 관련되어 있다. 요로 상피에 장애가 있는 환자는, 자가의 장이나 대장 조직의 세그먼트를 이식하는 치료(예, 장관 상피를 벗겨내 방광 상피로서 이식하는 외과적 수법)가 이루어지지만, 이들 소화기 조직은 간단히 소변을 재흡수하여 발암, 대사성 산증, 감염, 결석 등을 포함한 많은 문제의 원인이 된다.
또, 간질성 방광염의 하나인 한나형 간질성 방광염의 현재의 치료로서 방광 내에 DMSO나 자일로카인을 주입하는 방법, 방광을 억지로 확장시키는 방법(방광 확장술)이 실시되고 있다. 그러나 단기적인 성적은 있지만 장기적인 성적은 부족하고 근본적인 치료법이 없는 것이 현실이다.
이러한 문제점을 감안하여, 소화관 조직의 세그먼트 대신에 이식에 적용 가능한 세포의 다른 공급원을 찾기 위해 많은 노력을 기울여 왔다. 콜라겐-폴리글리콜산의 스캐폴드를 사용한 배양으로 확장된 방광 조직의 자가 이식이 보고되어 있다. 이 방법은 이식 후의 단기간에는 충분한 결과를 달성하였으나, 장기간의 경과 관찰에서는 자가 방광 조직이 기능 부전이 될 가능성이 있었기 때문에 범용되어 있지 않다. 비요로 상피의 미숙한 줄기 세포로부터 요로 상피를 유도하는 방법이 보고되어 있다. 인간 태아 골수 유래의 간엽계 줄기 세포를 환자의 요로 상피 세포와 공배양하는 방법(비특허문헌 1)이나 인간 지방 유래의 줄기 세포를 요로 상피 세포의 배양 상청을 더하여 배양하는 방법(비특허문헌 2)이 보고되어 있다. 그러나, 이들 세포는 그 방법이 자가 요로 상피 세포를 필요로 하기 때문에 임상에는 거의 사용되지 않는다. 또한, 인간의 ES 세포 및 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)로부터 요로 상피 세포를 조제하는 방법이 보고되어 있다(비특허문헌 3, 4), 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포 이식은 기형종(테라토마) 형성을 일으킬 가능성이 있다.
한편, 다능성 상태를 경유하지 않고 다른 체세포 계열로부터 분화된 조직 세포를 유도하는 직접 전환(다이렉트 리프로그래밍) 기술이 알려져 있다. 본 발명자들은, 지금까지 체세포(예, 섬유 아세포)로부터 골아 세포(특허문헌 1, 비특허문헌 5), 갈색 지방 세포(특허문헌 2, 비특허문헌 6), 슈완 세포(특허문헌 3, 비특허문헌 7) 및 근아 세포(특허문헌 4, 비특허문헌 8)로의 다이렉트 리프로그래밍의 기술을 확립하고 보고하고 있지만, 체세포로부터 요로 상피 세포로 전환시킨 예는 보고되지 않았다.
WO2015/012377 WO2014/010746 WO2016/039462 WO2018/124292
Ning J, et al., (2011) Cytotechnology 63(5):531-539. Shi JG, et al., (2012) Cell Tissue Res 347(3):737-746. Osborn SL, et al., (2014) Stem Cell Transl Med 3(5):610-619. Kang M, et al., (2014) Int J Mol Sci 15(5):7139-7157. Yamamoto K, et al., (2015) Proc Natl Acad Sci USA 112(19):6152-6157. Kishida T, et al., (2015) Stem Cell Reports 5(4):569-581. Sowa Y, et al., (2017) Stem Cells Transl Med 6(4):1207-1216. Wakao J, et al., (2017) Biochem Biophys Res Commun 488(2):368-373.
본 발명은, 비뇨기계 질환, 특히 요로 상피 세포의 손상에 기인하는 질환이나 요로 상피 세포의 손실이나 기능 장애에 기인하는 질환 등에 대한 치료에 응용 가능한 요로 상피 세포를 조제하는 방법, 및 이 방법에 의해 조제된 요로 상피 세포 및 이 방법에 적합한 요로 상피 세포 유도용 배지를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 감안하여, 지금까지의 발견에 기초하여 예의 연구를 거듭하였다. 구체적으로, 다이렉트 리프로그래밍 기술에 의해 체세포로부터 다능성 상태를 경유하지 않고 요로 상피 세포를 조제하는 것을 시도하였다. 다이렉트 리프로그래밍은 표적으로 하는 세포의 분화 단계에서 중요한 역할을 하는 전사 인자를 코딩하는 유전자나 체세포의 초기화를 촉진하는 유전자를 형질 도입함으로써 달성할 수 있다. 본 발명자들은 일부 유전자를 도입함으로써 인간 섬유 아세포를 요로 상피 세포로 직접 전환할 수 있다는 것을 발견하고, 그 전환 절차를 확립하고, 그리고 얻어진 직접 전환된 요로 상피 세포(dUC)의 표현형 및 기능을 분석하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 다음과 같다.
[1] 포유 동물의 체세포에, 외인성 인자로서,
FOXA1(Forkhead box A1) 유전자 또는 그 발현 산물,
TP63(tumor protein P63) 유전자 또는 그 발현 산물,
MYCL (L-Myc) 유전자 또는 그의 발현 산물 및
KLF4 (Kruppel-like factor 4) 유전자 또는 그 발현 산물
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 도입하는 공정을 포함하는 요로 상피 세포를 유도하는 방법.
[2] 외인성 인자가 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물을 포함하는 상기 [1]에 기재된 방법.
[3] 외인성 인자가 하기로부터 선택되는 상기 [1]에 기재된 방법;
(i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
[4] 상기 체세포가 인간 섬유 아세포인 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 것에 기재된 방법.
[5] 포유 동물의 체세포에서 유래하고, 외인성 인자로서,
FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물,
TP63 유전자 또는 그 발현 산물,
MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및
KLF4 유전자 또는 그 발현 산물
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 갖는 요로 상피 세포.
[6] 외인성 인자가 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물을 포함하는 상기 [5]에 기재된 세포.
[7] 외인성 인자가 하기로부터 선택되는 상기 [5]에 기재된 세포;
(i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
[8] 상기 체세포가 인간 섬유 아세포인 상기 [5] 내지 [7] 중 어느 것에 기재된 세포.
[9] 외인성 인자로서,
FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물,
TP63 유전자 또는 그 발현 산물,
MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및
KLF4 유전자 또는 그 발현 산물
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 포유 동물의 체세포를 요로 상피 세포로 전환하기 위한 제제.
[10] 외인성 인자가 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물을 포함하는 상기 [9]에 기재된 제제.
[11] 외인성 인자가 하기로부터 선택되는 상기 [9]에 기재된 제제;
(i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
[12] 상기 체세포가 인간 섬유 아세포인 상기 [9] 내지 [11] 중 어느 것에 기재된 제제.
[13] 외인성 인자로서,
FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물,
TP63 유전자 또는 그 발현 산물,
MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및
KLF4 유전자 또는 그 발현 산물
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 포유 동물의 체세포를 요로 상피 세포로 전환하기 위한 벡터.
[14] 외인성 인자가 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물을 포함하는 상기 [13]에 기재된 벡터.
[15] 외인성 인자가 하기로부터 선택되는 상기 [13]에 기재된 벡터;
(i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
[16] 상기 체세포가 인간 섬유 아세포인 상기 [13] 내지 [15] 중 어느 것에 기재된 벡터.
[17] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 것에 기재된 방법으로 얻어지는 세포, 상기 [5] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 요로 상피 세포, 상기 [9] 내지 [12] 중 어느 것에 기재된 제제 또는 상기 [13] 내지 [16] 중 어느 것에 기재된 벡터를 포함하는, 비뇨기계 질환의 치료제.
[18] 비뇨기 계통의 질환이 요로 질환인 상기 [17]에 기재된 치료제.
[19] 요로 질환이 방광암, 과활동 방광, 방광의 선천 이상, 방광 손상, 간질성 방광염, 신경인성 방광 및 위축 방광으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 상기 [18]에 기재된 치료제.
[20] 3-이소부틸 1-메틸크산틴(IBMX) 및 상피 성장 인자(EGF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 요로 상피 세포 유도용 배지.
본 발명에 의하면, 다이렉트 리프로그래밍에 의해 체세포로부터 단기간에 요로 상피 세포를 조제할 수 있다. 이 요로 상피 세포는 이식하는 본인의 체세포로부터 용이하게 유도할 수 있으므로, 얻어진 요로 상피 세포를 이식한 경우에도 면역학적인 거부 반응 등의 문제는 발생하지 않는다. 또한, iPS 세포나 ES 세포와 같은 다능성 상태를 경유하지 않고 직접 체세포로부터 요로 상피 세포를 유도할 수 있기 때문에, 암화 등의 다능성 줄기 세포에 기인하는 문제를 회피할 수 있다.
도 1은 세포의 전환 방법을 나타내는 도면이다. aHDFs를 12-well 플레이트에 3x104cells/well의 농도로 파종하고, 표준 배지에서 배양하였다. 다음날(day 0), 레트로바이러스 벡터로 목적으로 하는 유전자를 도입하였다. 달리 명시하지 않는 한, 도입 4일째까지는 표준 배지에서 배양하고, 그 후, CnT-Prime 배지로 바꾸어, 3-4일에 1회 배지를 교체하면서 배양하였다. 실시간 RT-PCR, 위상차 현미경 관찰, 면역 세포 화학 분석을 21일째(day 21)에 실시하였다.
도 2는 요로 상피 세포와 관련된 전사 인자를 이용한 유전자 도입에 의해 섬유 아세포가 요로 상피 세포로 전환되는지 여부를 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 코팅되지 않은 12-well 플레이트에 aHDFs를 파종하고, FOXA1(F), IRF1(I), TP63(T) 및/또는 소닉 헤지호그(SHH)(H) 유전자를 도입하였다(A의 하부, 흑색 부분은 각 레트로바이러스 벡터로 감염시킨 것을 나타낸다). 세포를 day 1-3 기간은 표준 배지에서 day 4-21 기간은 CnT-Prime 배지에서 배양하였다. (A) 세포로부터 RNA를 추출하고, 실시간 RT-PCR에 의해 UPK1b 유전자의 mRNA 발현 레벨을 측정하였다. 평균±SD로 나타낸 값은 β-actin의 mRNA 발현에 의해 정규화되고, 유전자 도입되지 않은 대조군의 값을 1.0으로 하여 상대적으로 나타냈다(N=3). (B) 대표적인 세포의 위상차 현미경 촬영 영상. 촬영 배율: 10배. FITH (FOXA1, IRF1, TP63, SHH), FIT (FOXA1, IRF1, TP63), FIH (FOXA1, IRF1, SHH), FTH (FOXA1, TP63, SHH) 및 ITH (IRF1, TP63, SHH).
도 3은 요로 상피 세포와 관련된 전사 인자와 초기화 유전자를 조합하여 사용한 유전자 도입에 의해, 섬유 아세포가 요로 상피 세포로 전환되는지 여부를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다. aHDFs를 라미닌으로 코팅된 12-well 플레이트에 파종하고, F, I, T, H, POU5F1(P), KLF4(K) 및/또는 MYCL(L) 유전자를 도입하였다(도면 하단, 흑색 내지 회색 부분은 각각 대응하는 레트로바이러스 벡터로 감염시킨 것을 나타낸다). 세포를 day 1-3 기간은 표준 배지에서 day 4-21 기간은 CnT-Prime 배지에서 배양하였다. 21일째에, 각 well로부터 총 RNA를 추출하고, UPK1b mRNA 레벨을 실시간 RT-PCR로 측정하였다. 값은 β-actin의 mRNA 발현에 의해 정규화되고, 유전자 도입되지 않은 대조군의 값을 1.0으로 하여 상대적으로 나타냈다(N=1). 일부 전사 인자의 조합은 aHDFs에서의 UPK1b 발현을 촉진하였다.
도 4는 요로 상피 세포와 관련된 전사 인자와 초기화 유전자를 조합하여 사용한 유전자 도입에 의해 섬유 아세포가 요로 상피 세포로 전환되는지 여부를 조사한 결과를 나타내는 도면이다. F, T, P, K, L의 유전자 도입에 의해 UPK1b를 발현하는 요로 상피 세포 콜로니가 형성되었다. aHDFs를 라미닌으로 코팅된 12-well 플레이트에 파종하고, (A)의 하부, 흑색 내지 회색 부분으로 나타낸 유전자군을 도입하였다. 세포를 day 1-3 기간은 표준 배지에서 day 4-21 기간은 CnT-Prime 배지에서 배양하였다. (A) 세포로부터 RNA를 추출하고, 실시간 RT-PCR에 의해 UPK1b 유전자 발현 레벨을 측정하였다. HUCs로부터 추출한 mRNA도 동일하게 측정하였다. 평균±SD로 나타낸 값은 β-actin의 mRNA 발현에 의해 정규화되고, 유전자 도입되지 않은 대조군의 값을 1.0으로 하여 상대적으로 나타냈다(N=3). (B) 대표적인 세포의 위상차 현미경 촬영 화상을 나타낸다. 촬영 배율: 20배. FIPKL (FOXA1, IRF1, POU5F1, KLF4, MYCL), FTPKL (FOXA1, TP63, POU5F1, KLF4, MYCL), FHPKL (FOXA1, SHH, POU5F1, KLF4, MYCL) 및 FPKL (FOXA1, POU5F1, KLF4, MYCL).
도 5는 요로 상피 세포와 관련된 전사 인자와 초기화 유전자를 조합하여 사용한 유전자 도입에 의해 섬유 아세포가 요로 상피 세포로 전환되는지 여부를 조사한 결과를 나타내는 도면이다. aHDFs를 라미닌으로 코팅된 12-well 플레이트에 파종하고, (A)의 하부, 흑색 내지 회색 부분으로 나타낸 유전자군을 도입하였다. 세포를 day 1-3의 기간은 표준 배지에서, day 4-21의 기간은 CnT-Prime 배지에서 배양하였다. (A) 세포로부터 RNA를 추출하고, 실시간 RT-PCR에 의해 UPK1b 유전자 및 UPK2 유전자의 mRNA 발현 레벨을 측정하였다. HUCs로부터 추출한 mRNA도 마찬가지로 측정하였다. 평균±SD로 나타낸 값은 β-actin의 mRNA 발현에 의해 정규화되고, 유전자 도입되지 않은 대조군의 값을 1.0으로 하여 상대적으로 나타냈다(N=3). *P<0.05, ***P<0.001로 군간 유의차 있음. (B) 대표적인 세포의 위상차 현미경 촬영 영상. 촬영 배율: 10배. F, T, K, L의 유전자 도입은 UPK1b, UPK2를 발현하는 요로 상피 세포로의 전환에 충분하였다. FTPKL (FOXA1, TP63, POU5F1, KLF4, MYCL), FTPK (FOXA1, TP63, POU5F1, KLF4), FTLK (FOXA1, TP63, MYCL, KLF4) 및 FTPL (FOXA1, TP63, POU5F1, MYCL).
도 6은 요로 상피 세포와 관련된 전사 인자와 초기화 유전자를 조합하여 사용한 유전자 도입에 의해 섬유 아세포가 요로 상피 세포로 전환되는지 여부를 조사한 결과를 나타내는 도면이다. (A) aHDFs를 라미닌으로 코팅된 12-well 플레이트에 파종하였다. 다음날 (day 0), FOXA1 (F), TP63 (T), MYCL (L), KLF4 (K) 유전자 중 어느 것을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 세포에 도입하였다. 도입된 유전자는 "+"로 나타냈다. 세포를 day 1-3의 기간은 표준 배지에서, day 4-21의 기간은 CnT-Prime 배지에서 배양하였다. RNA를 세포로부터 추출하고 실시간 RT-PCR로 UPK1b와 UPK2의 mRNA 레벨을 측정하였다. *P<0.05, ***P<0.001(유전자 도입되지 않은 aHDFs에 대하여). #P<0.05, ###P<0.001(HUCs에 대하여). 대조군으로서, HUCs로부터 추출된 RNA도 분석하였다. (B, C) aHDF를 코팅 없음(N), 또는 콜라겐(C), 폴리-L-리신(P), 라미닌(L)으로 코팅된 플레이트에서 배양하였다. 레트로바이러스로 F, T, L, K 유전자를 도입 후(day 0), 세포를 (A)와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 21일 후에 공초점 현미경 화상 취득(B)과 실시간 RT-PCR 해석(C)을 행하였다. *P<0.05, ***P<0.001(N에 대하여). ##P<0.01, ###P<0.001(HUCs에 대하여). (D, E) aHDFs를 라미닌으로 코팅한 플레이트에 파종하고, 레트로바이러스 벡터로 F, T, L, K 유전자를 도입 후, 1-3일간 표준 배지에서 배양하였다. 그 후, 세포를 표준 배지(S) 또는 CnT-Prime(C)에서 day 21까지 배양하고, 공초점 현미경 촬영(D) 및 실시간 RT-PCR 분석(E)을 행하였다. ***P<0.001(유전자 도입되지 않은 표준 배지에서 배양된 aHDFs에 대하여). ##P<0.01, ###P<0.001(HUCs에 대하여). 값은 평균±SD(n=3)를 나타낸다.
도 7은 배지의 차이가 dUCs의 계대에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. F, T, L, K의 유전자를 도입한 aHDFs를 day 1-3의 기간은 표준 배지에서 배양하고, day 4-21의 기간은 도면에 나타낸 각 배지에서 배양하였다. 위상차 현미경의 촬영 화상을 나타낸다. 바는 100㎛. 배지의 차이로 인해 dUCs의 계대에 성공하였다.
도 8은 F, T, L, K를 도입한 세포가 요로 상피 세포와 같은 형태를 나타낸 것을 나타내는 도면이다. aHDFs를 라미닌으로 코팅된 12-well 플레이트에 파종하고, FTLK를 도입한 후, 세포를 day 1-3의 기간은 표준 배지에서, day 4-21의 기간은 CnT-Prime 배지에서 배양하였다. (a) 도면에 나타낸 날에 RNA를 추출하고, UPK1b와 UPK2의 mRNA를 실시간 RT-PCR로 측정하였다. HUCs의 mRNA도 측정하였다. **P<0.01, ***P<0.001(day 0에 대하여). ###P<0.001(HUCs에 대하여). (b) 공초점 현미경 화상. (c, d) day 0과 day 21에, 세포를 도면에 기재된 항체와 헥스트(Hoechst) 33342로 염색하였다. 형광 현미경 화상 (c)와 양성 세포의 비율 (d)를 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01(day 0에 대하여). 각 데이터는 평균±SD로 나타냈다 (N = 3). 도 d에서, 각 컬럼은 왼쪽에서 UPK1b, UPK2, E-캐드헤린(E-cadherin; CDH1) 및 케라틴 8/18 (Keratin 8/18; KRT8/18)의 결과를 각각 나타낸다.
도 9는 dUCs의 특성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. iPSCs를 내배엽성 세포로 분화시킨 후, iUCs로 분화시켰다. 도면 중의 dUCs는 유전자 도입 21일 후의 것이다. (A) 도면에 나타낸 세포의 대표적인 위상차 현미경 촬영 화상. 바는 100㎛. (B) 각 세포로부터 총 RNA를 추출하고 실시간 RT-PCR로 측정하였다. HUCs로부터 추출한 총 mRNA도 측정하였다. ##P<0.01(iUCs에 대하여). 평균±SD로 표시된 값은 β-actin의 mRNA 발현에 의해 정규화되었고 HUCs의 값을 1.0으로 하여 상대적으로 나타냈다 (N = 3). dUCs는 iUCs보다도 미성숙한 요로 상피 세포와 유사하였다. 도 B에서, 각 컬럼은 왼쪽으로부터 UPK1a, UPK1b, UPK2, UPK3a 및 UPK3b의 결과를 각각 나타낸다.
도 10은 dUCs에서의 다능성 마커의 발현에 대하여 조사한 결과를 나타내는 도면이다. aHDFs를 라미닌으로 코팅된 플레이트에 파종하고, F, T, L, K의 유전자 도입을 행하고, 세포를 day 1-3의 기간은 표준 배지에서, day 4-21의 기간은 CnT-Prime 배지에서 배양하였다. (A) 도면에 나타낸 날에 aHDFs와 iPS 세포로부터 RNA를 추출하였다. 도면에 나타낸 유전자의 발현을 실시간 RT-PCR로 측정하였다. HUCs의 유전자 발현도 측정하였다. 평균±SD로 나타낸 값은 β-actin의 mRNA 발현에 의해 정규화되고, iPS 세포에서의 값을 1.0으로 하여 상대적으로 나타냈다(N = 3). N. S. :day 0에 비해 통계적 유의차 없음. *** P<0.001(iPS 세포에 대하여). (B) 세포를 항NANOG 항체로 염색하고, 핵을 헥스트 33342로 염색하였다. 인간 iPS 세포도 대조군으로 염색하였다(가장 왼쪽 열). 바는 100㎛. aHDFs에서 dUCs로의 전환 과정에서 다능성 마커의 발현은 검출되지 않았다. 도 A에서, 각 컬럼은 왼쪽으로부터 LIN28, POU5F1, SOX2 및 NANOG의 결과를 각각 나타낸다.
도 11은 dUCs에서의 CDX2 및 알부민 (ALB), AQP5 및 CD31의 발현에 대해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. aHDFs를 라미닌으로 코팅된 플레이트에 파종하고, F, T, L, K로 유전자 도입을 행하고, 세포를 day 1-3의 기간은 표준 배지에서 day 4-21의 기간은 CnT-Prime 배지에서 배양하였다. 도면에 나타낸 날에 RNA를 추출하고 실시간 RT-PCR을 이용하여 유전자 발현 레벨을 측정하였다. 인간 소장, 간, 타액선, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC), HUCs의 mRNA도 양성 대조군으로서 측정하였다. 평균±SD로 표시된 값은 β-actin의 mRNA 발현에 의해 정규화되며, 소장(CDX2), 간(알부민; ALB), 타액선(AQP5) 또는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)(CD31)에서의 값을 1.0으로 하여 상대적으로 나타냈다(N=3). N. S. : Day 0과 비교하여 통계적 유의차 없음. ***P<0.001(양성 대조군에 대하여).
도 12는 dUCs의 계대에 있어서의 배지 조성의 영향을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. F, T, L, K를 도입한 aHDFs를 CnT-Prime 배지, "Uromedium" 배지, 또는 "UCM" 배지에서 day 4-21까지 배양하여, P0의 dUCs를 작성하였다. 세포를 플레이트로부터 박리하여 새로운 플레이트에 파종하고, 도면에 도시된 배지에서 14일(D14), 또는 21일(D21) 배양하였다. 각 세포의 위상차 현미경 촬영 화상을 나타냈다. 바는 100㎛. E, 상피 세포 콜로니 형성의 유무; N, 비상피 세포의 증식의 유무; dUCs는 UCM 배지에 의해 성공적으로 계대할 수 있었다.
도 13은 dUCs의 선택적인 증식에 적합한 "UCM" 배지 성분을 검토한 결과를 나타내는 도면이다. (A) F, T, L, K를 도입한 aHDF를, 인슐린, 하이드로코르티손, EGF, IBMX의 농도를 변경한 "Uromedium"배지에서 배양하였다. Day 21에 aHDFs와 유전자 도입되지 않은 대조군의 aHDFs로부터 총 RNA를 추출하고, UPK2의 유전자 발현 레벨을 실시간 RT-PCR을 사용하여 측정하였다. 평균±SD로 나타낸 값은 β-actin의 mRNA 발현에 의해 정규화되고, 유전자 도입되지 않은 aHDFs에서의 값을 1.0으로 하여 상대적으로 나타냈다(N=3). (B) F, T, L, K를 도입한 aHDFs를, 하이드로코르티손의 농도를 0배, IBMX의 농도를 10배로 개변한 "Uromedium"배지에서 21일간 배양했을 때의 위상차 현미경 촬영 화상. 촬영 배율: 10배. (C) F, T, L, K를 도입한 aHDFs를, 1μM의 트라닐시프로민을 첨가하거나, 첨가하지 않은 "Uromedium" 배지에서 21일간 배양했을 때의 위상차 현미경 촬영 화상. 바는 100㎛. (D) F, T, L, K를 도입하거나 도입하지 않은 aHDFs를 "Uromedium"배지 또는 "UCM"배지에서 21일간 배양하였다. 위상차 현미경의 촬영 이미지. 바는 100㎛.
도 14는 계대한 dUCs의 UPK1b와 UPK2의 발현에 대해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. F, T, L, K를 도입한 aHDFs를, 선택 배지에서 배양하고(P0) 그 후 계대하였다(P1~P4). (a) 도 14 내지 도 17에서 행해진 실험에 있어서, 세포의 전환과 계대의 개념도. (b, c) P0의 dUCs와 P4의 dUCs를 UPK1b, UPK2, E-캐드헤린(CDH1) 및 케라틴 8/18(KRT8/18)로 염색한 면역 화학 염색상(b)과 HDFs, P0의 dUCs, P4의 dUCs에서의 UPK1b, UPK2, E-캐드헤린(CDH1)과 케라틴 8/18 (KRT8/18) 양성 세포의 비율 (c). 바는 100㎛. **P<0.01, ***P<0.001(aHDFs에 대하여). †P<0.05, †††P<0.001(P0의 dUCs에 대하여). 각 데이터는 평균±SD로 나타냈다 (N = 3). P0 및 P4의 dUCs는 UPK1b와 UPK2를 발현하는 것을 알 수 있었다.
도 15는 계대한 dUCs의 형태, 유전자 발현과 기능에 대해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. aHDFs에 F, T, L, K를 도입하였고, day 1-3은 표준 배지에서, day 4-21은 UCM 배지에서 배양하였다. 얻어진 P0 dUCs를 박리하고, UCM 배지에 재현탁하고, 라미닌으로 코팅된 새로운 플레이트에 파종하여 P1 dUCs를 얻었다. 계대를 반복하여 P2에서 P4까지의 dUCs를 얻었다. (a) P1에서 P4까지의 dUCs의 공초점 현미경 촬영 화상. 바는 100㎛. (b, c) RNA를 추출하고 표기된 유전자의 mRNA를 실시간 RT-PCR로 측정하였다. *P＜0.05, **P<0.01, ***P<0.001(aHDFs에 비해). ##P<0.01, ###P<0.001(HUCs에 대하여). †P<0.05, †††P<0.001(P0의 dUCs에 대하여). (d, e) P4 dUCs와 aHDFs를 트랜스웰의 inner chamber 내에서 배양하고, FITC 표지된 덱스트란을 사용하여 투과성 검정을 행하였다. inner chamber 내의 공초점 현미경 화상을 나타낸다(d). 또한, outer chamber에 누출된 FITC 표지 덱스트란의 비율을, 세포를 파종하지 않은 대조군을 100%로 하여 계산한 상대값 %(e)를 나타냈다. 값은 평균±SD(N=3)이다. *P<0.001, 군간 비교. dUCs는 UCM의 배지에서 매 계대마다 증식하여 수를 늘렸다. 도 b에서, 각 컬럼은 좌측부터 UPK1b와 UPK2, 도 c에서, 각 컬럼은 좌측부터 UPK1a, UPK3a, UPK3b 및 E-캐드헤린(CDH1)의 결과를 각각 나타낸다.
도 16은 P2 dUCs의 전사체 해석을 나타내는 도면이다. P2 dUCs(n=3), aHDFs(N=3) 및 HUCs(N=1)로부터 총 RNA를 추출하고, Illumina Novaseq 6000(Illumina)을 이용한 RNA 시퀀스 해석을 행하였다. (A) 계층 클러스터링 해석에 의한 발현량 상위 75%의 유전자. (B) 발현 변동이 높은 상위 50개의 유전자의 계층 클러스터링 히트맵 도면. (C) dUCs와 aHDFs를 비교한 Volcano Plot에 의한 유전자 발현 변동 해석. 다수의 요관 상피 세포 및 섬유 아세포 특이적 유전자를 각각 표기하였다.
도 17a는 P2 dUCs, aHDFs 및 HUCs에서의 RNA 시퀀싱 해석의 결과를 나타내는 도면이다. 전사체 해석에 의해 P2 dUCs와 HUCs의 높은 유사성이 나타났다. P2 dUCs(N=3), aHDFs(N=3), HUCs(N=1)의 총 RNA를, 도 16과 마찬가지로 Illumina Novaseq 6000으로 RNA 시퀀스를 행하였다. iDEP8.1을 사용하여 Gene Set Enrichment Analysis (GESA)에 의한 패스웨이 해석을 행하였다. P2 dUCs와 aHDFs를 비교한 GO genesets의 히트맵.
도 17b는 dUCs와 aHDFs를 비교한 KEGG 패스웨이 해석 다이어그램. dUCs에서 높게 발현되는 유전자가 나타났다.
도 18a는 방광 내에 이식된 dUCs의 방광 조직에 있어서의 분포에 대해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. (a, b) F, T, L, K 및 GFP를 레트로바이러스 벡터로 aHDFs에 도입하고, CnT-Prime 배지에서 21일간 배양하였다. 도시된 유전자의 mRNA 발현 레벨을 실시간 RT-PCR로 정량하고 (a), 대표적인 위상차 현미경 및 형광 현미경 화상을 나타냈다 (b). *** P<0.001(유전자 도입을 하지 않은 aHDFs에 대하여). ###P<0.001(HUCs에 대하여). N. S. : 그룹간에 통계적 유의차 없음. 바는 100㎛.
도 18b는 방광 내에 이식된 dUCs의 방광 조직에서의 분포에 대해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. (c, d) F, T, L, K, G를 도입한 aHDFs를 표준 배지에서 4일간 배양하고, 간질성 방광염의 NOG/SCID 마우스의 방광강 내에 카테터로 경뇨도적으로 이식하였다 (c). 이식 1주일 후, 마우스를 안락사시켰다. 방광의 상피 조직을 도면에 나타낸 항체로 염색하였다 (1단째, UPK1b; 2단째, UPK2; 3단째, KRT8/18; 4단째, CDH1; 5단째, CDH1; 6단째, CDH1). 핵은 DAPI로 염색하였다. 또한, 조직 연속 절편의 HE 염색을 행하였다(d)(N=4 마우스/각 그룹). M과 L은 각각 근육과 방광의 루멘을 나타낸다. 애로우 헤드는 GFP로 표지된 dUCs를 나타낸다. 바는 100㎛. 요로 상피 점막에 이식된 F, T, L, K, G를 도입한 GFP 라벨 표지된 dUCs는 손상된 마우스의 방광 조직의 점막 상피 내에 분포하였다.
도 19는 dUCs의 조종양성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. F, T, L, K를 도입한 aHDFs(도입으로부터 4일 후)(+FTLK군), 비도입 aHDFs(-FTLK군), 마트리겔(Corning)과 혼합한 T24 세포를 NOG/SCID 마우스의 피하에 1x107cells/100 μL/마우스의 양을 투여하였다(각 군 N=4). (A) 마우스의 전체 이미지. 빨간 삼각 표시는 피하 팽창 또는 투여 부위에서의 종양을 나타낸다. (B) 팽창한 피하 조직 또는 종양의 부피를 1주일마다 측정하였다. 값±SD로 표시된 부피는 투여 0주의 데이터로 정규화되었다 (N = 4). **P<0.01(-FTLK 군에 대하여); #P<0.001(-FTLK 군과 + FTLK 군 모두에 비해 유의차가 있음). dUCs는 생체 내에서 종양을 형성하지 않았다. 한편, 방광암 세포주 T24는 종양을 형성하였다.
도 20은 요로 상피 세포와 관련된 전사 인자와 초기화 유전자를 조합하여 사용한 유전자 도입에 의해 섬유 아세포가 요로 상피 세포로 전환되는지 여부를 조사한 결과를 나타내는 도면이다. aHDFs를 라미닌으로 코팅된 12-well 플레이트에 파종하였다. 다음날 (day 0), FOXA1 (F), TP63 (T), MYCL (L), KLF4 (K) 유전자 중 어느 것 또는 이들의 조합을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 세포에 도입하였다. 세포를 day 1-3의 기간은 표준 배지에서, day 4-14의 기간은 CnT-Prime 배지에서 배양하였다. RNA를 세포로부터 추출하고 실시간 RT-PCR로 UPK1b와 UPK2의 mRNA 레벨을 측정하였다. 대조군으로서, HUCs로부터 추출된 RNA도 분석하였다. 값은 평균(n=3)을 나타낸다.
도 21은 시험관 내 투과성 검정에서 HUCs의 장벽 기능을 나타내는 도면이다. (A) 챔버 내의 공초점 현미경 화상. (B) outer chamber에 누출된 FITC 표지 덱스트란의 비율을, 세포를 파종하지 않은 대조군을 100%로 하여 계산한 상대값%를 나타냈다. 값은 평균±SD(N=3)이다. **P<0.01, ***P<0.001(aHDFs에 대하여). #P<0.05는 그룹간에 통계적 유의차 있음.
본 발명은 포유 동물의 분화된 체세포를 요로 상피 세포로 전환함으로써 요로 상피 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. "전환"이란 체세포를 목적으로 하는 요로 상피 세포로 전환시키는 것을 의미한다. 본 발명의 방법의 바람직한 양태의 하나는 "다이렉트 리프로그래밍", "직접 전환"으로도 지칭되는 iPS 세포의 제작으로 대표되는 세포의 초기화 단계를 거치지 않고 체세포를 요로 상피 세포로 전환하는 방법이다.
요로 상피 세포로의 유도는 생체 외 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo) 중 어느 것으로도 행할 수 있다.
요로 상피 세포
요로 상피 세포 (이행 상피 세포라고도 함)는 신배, 신우로부터 요관 및 방광을 거쳐 요도에 이르기까지의 요로의 내측을 덮고 있는 세포이며, 일 실시 형태에서는 요로 상피 세포는 방광 유래의 상피 세포일 수 있다.
체세포
본 발명에 있어서, 다이렉트 리프로그래밍의 대상이 되는 체세포로서는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 포유 동물 유래이면 된다. 요로 상피 세포를 생체에 이식하는 경우에는, 이식되는 대상체 유래의 체세포(자가 세포)를 사용하는 것이 감염이나 거부 반응 등의 위험을 저감시키기 때문에 바람직하다. 그러나 목적에 따라서는 자가 세포가 아닌 타인이나 다른 동물의 체세포로부터 미리 준비해 둔 요로 상피 세포를 이식에 사용할 수 있다. 또는 미리 준비해 둔 타인이나 다른 동물의 체세포로부터 요로 상피 세포를 만들어 이식에 사용할 수 있다. 즉, 요로 상피 세포의 뱅크를 만들어 두고 이식 목적으로 사용할 수 있다. 이러한 경우, 거부 반응 등의 위험을 줄이기 위해 미리 MHC를 타이핑해 둘 수 있다. 또, 미리 요로 상피 세포의 세포 특성이나 조종양성 등을 확인해 둘 수 있다.
본 명세서에 있어서, 포유 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터, 인간, 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 소, 말, 돼지 등을 들 수 있고, 특히 인간을 들 수 있다.
체세포는 용이하게 생체로부터 채취할 수 있는 체세포를 사용할 수 있다. 예를 들어 섬유 아세포, 각질 형성 세포, 구강 점막 상피 세포, 비강 점막 상피 세포, 기도 점막 상피 세포, 위 점막 상피 세포, 장관 점막 상피 세포, 혈관 내피 세포, 평활근 세포(방광 평활근 세포, 혈관 평활근 세포 등), 지방 세포, 치은세포(치은 섬유 아세포, 치은 상피 세포), 치수 세포, 치근막 세포, 골수 세포, 골수 유래 간질 세포, 백혈구, 림프구, 결막 상피 세포, 파골 세포 등을 들 수 있고, 바람직하게는 섬유 아세포, 각질 형성 세포, 구강 점막 상피 세포, 치은 세포, 백혈구, 림프구 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는 섬유 아세포이다. 본 발명에서 생체로부터 채취한 상기 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
체세포로부터 요로 상피 세포로의 유도가 생체 내에서 이루어지는 경우에는, 대상이 되는 체세포는 요로 상피 세포의 공급이 요망되는 부위에 존재하는 세포인 것이 바람직하다. 예를 들어 대상 질환이 간질성 방광염인 경우에는 요로 상피 세포의 공급이 요구되는 부위는 방광내 표면이며, 따라서 출발 원료가 되는 체세포는 방광 내 표면에 존재하는 세포인 것이 바람직하다. 출발 원료가 되는 체세포로서는, 섬유 아세포, 방광 평활근 세포, 혈관 내피 세포, 혈관 평활근 세포, 방광 내에 존재하는 림프구 등을 들 수 있다.
유전자 또는 그 발현 산물
본 발명의 방법에서는 체세포에 외인성 인자로서 FOXA1 (Forkhead box A1) 유전자 또는 그 발현 산물, TP63 (tumor protein P63) 유전자 또는 그 발현 산물, MYCL (L-Myc) 유전자 또는 그 발현 산물 및 KLF4 (Kruppel-like factor 4) 유전자 또는 그의 발현 산물로 이루어진 적어도 1종, 바람직하게는 2종, 보다 바람직하게는 3 종, 한층 바람직하게는 4종 모두를 도입한다. 여기서, "발현 산물"로서는 FOXA1 유전자, TP63 유전자, MYCL 유전자 및 KLF4 유전자의 mRNA 또는 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 방법에서, 체세포에 도입되는 외인성 인자의 바람직한 조합의 일 실시 양태는 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물의 조합을 포함한다.
외인성 인자가 하기로부터 선택되는 본 발명의 방법 또한 바람직한 일 실시 양태이다.
(i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
모두 UPK2 mRNA의 발현을 증강시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서, FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물에 더하여, 마이크로 RNA, siRNA, shRNA나 이들을 발현하는 DNA를 함께 사용할 수도 있다. 또한 다양한 단백질을 함께 사용할 수 있다.
상기 유전자는, 모두 척추 동물에 고도로 보존되어 있는 유전자이며, 본 명세서에서는, 특별히 동물명을 나타내지 않는 한, 동족체를 포함한 유전자를 나타내는 것으로 한다. 또한 polymorphism (다형)을 포함하여 변이를 가진 유전자라도 야생형 유전자 산물과 동등한 기능을 가진 유전자 또한 포함되는 것으로 한다.
예를 들어 인간(Homo sapiens)의 FOXA1 유전자, TP63 유전자, MYCL 유전자 및 KLF4 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이것이 코딩하는 단백질의 아미노산 서열은 미국 생물 공학 정보 센터(NCBI; National Center for Biotechnology Information)가 제공하는 GenBank에, 하기의 수탁 번호로 등록되어 있다(복수의 리비전(revision)이 등록되어 있는 경우, 최신의 리비전을 가리키는 것으로 이해된다.)：
인간 FOXA1 유전자 cDNA 서열：BC_033890, NM_004496（예를 들어 BC_033890.1, NM_004496.5）,
인간 FOXA1 단백질 아미노산 서열：NP_004487（예를 들어 NP_004487.2）,
인간 TP63 유전자 cDNA 서열：BC_039815, NM_003722（예를 들어 BC_039815.1, NM003722.5）,
인간 TP63 단백질 아미노산 서열：NP_003713（예를 들어 NP_003713.3）,
인간 MYCL 유전자 cDNA 서열：NM_001033081, NM_001033082, NM_005376（예를 들어 NM_001033081.2, NM_001033082.2, NM_005376.4）,
인간 MYCL 단백질 아미노산 서열：NP_001028253.1, NP_001028254.2, NP_005367.2（예를 들어 NP_001028253, NP_001028254, NP_005367）,
인간 KLF4 유전자 cDNA 서열：BC_029923, NM_001314052（예를 들어 BC_029923.1, NM_001314052.2）,
인간 KLF4 단백질 아미노산 서열：NP_001300981（예를 들어 NP_001300981.1）.
도입
본 발명의 방법은, 특정 유전자를 선택하는 것 이외에는, 공지의 다이렉트 리프로그래밍의 수법에 준하여 실시할 수 있고, 예를 들어 이하의 어느 문헌의 방법에 준하여 행할 수 있다.：
1: Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytesby Defined Factors; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142: 375-386, 2010.
2: Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof& Marius Wernig. Nature 46.
3: 1035-1041, 20103: Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476: 220-223, 2011.
4: Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outani, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121: 640-657, 2011.
5: Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui,. Nature 475:386-389, 2011.
6: Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475:390-393, 2011.
7: Direct conversion of human fibroblasts into functional osteoblasts by defined factors. Yamamoto K, Kishida T, Sato Y, Nishioka K, Ejima A, Fujiwara H, Kubo T, Yamamoto T, Kanamura N & Mazda O. Proc Natl Acad Sci USA. 112:6152-6157, 2015.
8: Reprogrammed Functional Brown Adipocytes Ameliorate Insulin Resistance and Dyslipidemia in Diet-Induced Obesity and Type 2 Diabetes. Kishida T, Ejima A, Yamamoto K, Tanaka S, Yamamoto T, Mazda O. Stem Cell Reports. 5: 569-581, 2015.
9: Generation of directly converted human osteoblasts that are free of exogenous gene and xenogenic protein. Yamamoto K., Sato Y., Honjo K., Ichioka H., Oseko F., Sowa Y., Yamamoto T., Kanamura N., Kishida T., Mazda O. J Cell Biochem 117:2538-2545, 2016.
10: 국제 공개 공보 WO2014/010746
상기 문헌 1 내지 10의 내용은 본 명세서에 참고로서 원용된다.
구체적으로는, 외인성 인자가 되는 목적의 유전자를, 1 또는 복수의 발현 벡터에 넣고, 대상으로 하는 체세포에 발현 벡터를 도입하고, 세포 내에서 발현시키는 것이 바람직하다.
유전자를 도입하는 방법으로서는, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터 등의 바이러스성 벡터를 감염시키는 방법 외에 유전자와 그 발현 산물의 도입의 경우에는, 카티오닉·리포솜, 카티오닉·폴리머, 전기 천공법 등의 비바이러스 벡터로, 플라스미드 벡터나 에피조말 벡터, 유전자의 발현 산물(mRNA, 단백질)을 트랜스펙션하는 방법도 사용할 수 있다. 또한, mRNA를 도입할 수도 있다. 이들 유전자 도입에 사용되는 수단을 모두 포괄하여 본 명세서에서 벡터라고 부른다.
도입 효율과 도입 유전자의 안정 유지의 관점에서는 바이러스 벡터가 바람직하고, 암화의 위험을 억제하기 위해서는 플라스미드가 바람직하다.
또, 목적으로 하는 유전자와 함께 약제 선택 마커가 되는 유전자(퓨로마이신 내성, 블라스트사이딘 S 내성, 네오마이신 내성, 하이그로마이신 내성 등)를 도입하고, 그 후 약제 선택을 행함으로써, 목적 유전자를 발현하는 세포를 선택 후 사용할 수 있다.
본 발명의 유전자의 도입은 플라스미드로 실시해도 되고, 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터를 사용해도 된다. 도입 효율과 도입 유전자의 안정 유지의 관점에서는 바이러스 벡터가 바람직하고, 암화의 위험을 억제하기 위해서는 플라스미드가 바람직하다.
체세포에 도입되는 유전자는 LTR 프로모터에 의해 전사시킬 수도 있고, 벡터 내부의 다른 프로모터로부터 발현시킬 수도 있다. 예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, CAG 프로모터 등의 구성적 발현 프로모터, 또는 원하는 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, LTR의 일부를 다른 프로모터로 치환한 키메라 프로모터를 이용해도 된다.
또한, 도입 인자가 유전자의 발현 산물(예를 들어 단백질)인 경우에는, Protein Transduction Domain(PTD)으로 불리는 펩티드 등을 발현 산물인 단백질에 결합시켜 배지에 첨가함으로써, 체세포 내에 도입할 수 있다.
배양
본 발명의 방법에 있어서, 포유 동물의 분화된 체세포를 유전자의 도입 후, 배지 중에서 배양할 수 있다. 예를 들어 생체 외에서 요로 상피 세포를 유도(조제)하는 경우의 바람직한 양태이다.
배양은 세포 및 배지를 저장하기 위한 적절한 용기 중에서 행할 수 있다. 적합한 배양을 행하는 수법으로서, 약 37℃정도 및 이산화 탄소 농도 약 5% 정도의 조건 하에서 배양하는 수법이 예시되는데, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 상기 조건에서의 배양은, 예를 들어 공지된 CO2 인큐베이터를 사용하여 행할 수 있다.
배양을 행하는 기간은, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위에서, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 12시간 내지 1개월 정도, 1일 내지 3주일 정도, 3일간 내지 2주일 정도로 할 수 있다. 필요에 따라 배지 교체를 행할 수 있다. 배양 조건은 통상의 방법에 준하는 것이 바람직하다.
배양에 있어서, 필요에 있어서 계대를 행할 수 있다. 계대를 행하는 경우, 컨플루언트 상태에 도달하기 전 또는 직후에 세포를 회수하고, 세포를 새로운 배지에 파종한다. 또한, 본 발명의 배양에 있어서, 배지를 적절히 교체할 수도 있다.
배지
본 발명의 방법에서 사용하는 배지는, 특별히 한정되지 않는다。MEM（Modified Minimum Essential Medium ）, DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）, EMEM（Eagle's minimal essential medium）, αMEM（alpha Modified Minimum Essential Medium）등의 통상의 액체 배지를 사용할 수 있다. 필요에 따라 혈청 성분(Fetal Bovine Serum(FBS), Human Serum(HS)), 스트렙토마이신, 페니실린 등의 항균제, 비필수 아미노산(Non-Essential Amino Acids; NEAA) 등의 성분을 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 요로 상피 세포를 조제할 수 있는 효율이 높다는 관점에서, 배지로서 요로 상피 세포를 분화시키기 위해 통상 사용되는 분화 유도 배지를 사용하는 것이 바람직하다. "요로 상피 세포를 분화시키기 위한 분화 유도 배지"란, 다능성 줄기 세포(ES 세포, iPS 세포 등)를 요로 상피 세포로 분화시킬 수 있는 성분을 포함하는 배지를 말한다(이하, 본 발명의 요로 상피 세포 유도 배지라고도 한다).
요로 상피 세포 유도 배지로서는 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어 Osborn SL et al., Stem Cells Transl Med. 2014; 3(5): 610-619.나 Kang M. et al., Int. J. Mol. Sci. 2014, 15(5), 7139-7157에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명의 요로 상피 세포 유도 배지는 3-이소부틸 1-메틸크산틴 (IBMX) 및 상피 성장 인자 (EGF)를 포함한다. 배지 중의 IBMX의 농도는 통상 1μM 내지 10mM인데, 요로 상피 세포의 선택적인 유지 증식을 위해서는 1mM 내지 10mM의 IBMX가 배지 중에 포함되어 있는 것이 바람직하다. 배지 중의 EGF의 농도는 통상 0.001 내지 1ng/mL, 바람직하게는 0.01 내지 1ng/mL이다. 이들 성분을 함유함으로써 실시예에 나타낸 바와 같이, 섬유 아세포로부터 요로 상피 세포로의 전환 및 그것으로 이어지는 요로 상피 세포의 선택적인 유지 증식이 보다 효율적이 된다.
본 발명의 요로 상피 세포 유도 배지의 바람직한 일례로서, 하기 조성의 배지를 들 수 있다(본 명세서 중, "UCM 배지"라고도 한다).
60μM 칼슘,
60㎍/mL 소 뇌하수체 추출액,
5㎍/mL 인간 유전자 재조합 인슐린,
겐타마이신·암포테리신,
2% FBS,
0.01ng/mL의 인간 유전자 재조합 EGF,
1mM IBMX 및
1μM 트라닐시프로민
을 첨가한 EpiLifeTM 배지.
(EpiLifeTM 배지: 각질 형성 세포 배양용 배지)
유도(조제)
이렇게 하여 체세포로부터 요로 상피 세포가 유도된다. 요로 상피 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 유로플라킨(Uroplakin1b; UPK1), Uroplakin2(UPK2), CK5, CK17의 유전자 발현, Asymmetric Unit Membrane의 형성 등에 따라 검출할 수 있다.
유도된 요로 상피 세포는 외인성 인자로서 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 2종, 보다 바람직하게는 3종, 한층 바람직하게는 4종 모두를 갖는다. 도입되는 유전자의 유형이나 수에 따라서도 다르지만, 다른 일 실시 양태에서는, 외인성 인자는 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물을 포함한다. 또 다른 일 실시 양태에서는, 이하의 유전자 또는 그의 발현 산물 또는 이들의 조합을 갖는다.
(i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
여기서, "외인성"이란, 주로 상기의 도입 수단의 결과 도입된 유전자 또는 그의 발현 산물의 양태로서, 천연의 양태와는 다른 양태를 가리킨다. 예를 들어 천연 프로모터 이외의 프로모터에 발현을 제어되는 유전자, 천연 이외의 염색체 상의 위치, 또는 염색체 밖에 존재하는 유전자의 양태 등을 들 수 있다.
요로 상피 세포는 요로 상피 세포 이외의 세포 (예를 들어 원래 체세포)와의 혼합물로서 얻어지는 경우도 있다. 이 경우, 요로 상피 세포와 요로 상피 세포 이외의 세포를 필요에 따라 분리할 수 있다. 분리를 위한 수단은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 셀 분류기나 마그네틱 비드를 이용하여 분리할 수 있다.
본 발명에 의해 유도된 요로 상피 세포는, 예를 들어 이식 재료로서 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 유도된 요로 상피 세포는 또한 요로 상피 세포를 이용한 다양한 연구나 기술 개발 등에 사용할 수 있다. 예를 들어 비뇨기의 발생, 분화, 형태 형성의 기구, 이들에 대한 역학적 스트레스, 영양, 호르몬 등의 영향의 해석 등의 기초 연구에 유용하다.
본 발명에 의해 유도된 요로 상피 세포를 사용하면 다양한 질환이나 유전적 배경을 갖는 인간이나 동물로부터 간편, 신속, 저렴하게 요로 상피 세포를 수립할 수 있으므로, 질환이나 유전적 배경에 관련한 요로 상피 세포의 이상을 생화학적, 분자 생물학적, 면역학적 등 수법에 의해 해석하는 것이 가능하고, 이것에 의해 질환의 발병 기전의 해명 등의 연구나 진단법의 개발에 도움이 될 수 있다. 또한, 이러한 요로 상피 세포를 이용하여, 약제의 개발, 약제의 독성 시험 등을 행하면, 다양한 질환에 대한 신규 치료법의 개발에 도움이 될 수 있다.
본 발명에 의해 얻어지는 요로 상피 세포는 다양한 질환, 특히 비뇨기계 질환을 치료하기 위해서 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명에 의해 유도된 요로 상피 세포는 방광암에서, 방광 전적한 증례에서의 대용 방광의 형성, 방광 질루로 요로 상피가 결손된 부위로의 패치의 구축, 신경인성 방광으로 방광이 섬유화되고 위축된 증례에 대해 방광 확대술을 실시할 때, 부분적으로 보충하기 위한 요로 상피의 형성, 고도의 간질성 방광염(요로 상피의 기능 이상)에 대한 요로 상피 재생 등에 유용하다.
치료할 대상이 되는 구체적인 질환으로는 방광암, 과활동 방광, 방광의 선천 이상(예, 방광 외반증, 방광 게실, 요막관의 이상), 방광 손상, 간질성 방광염 (한나형 및 비한나형), 신경인성 방광, 위축 방광 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, 달리 명시되지 않는 한, "치료"라는 용어는 환자가 특정 질환 또는 장애를 앓고 있는 동안에 수행되는 처치를 의도하며, 이로써 질환 또는 장애의 중증도, 또는 하나 또는 복수의 증상이 완화되거나 질병 또는 장애 진행이 지연 또는 감속되는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서, "치료"에는 "예방"을 포함하는 것으로 한다.
본 발명에서 얻어지는 요로 상피 세포는, 또한 질환의 치료로 한정되지 않고, 미용이나 기능 증강의 목적으로 사용할 수도 있다. 그 때, 인간에 대한 처치도, 본 명세서에서는 편의상 치료라고 하며, "환자"는 "건강자" 혹은 "인간", "질환"은 "미용" 혹은 "기능"으로 대체하여 적용할 수 있다.
본 발명은 또한 인간뿐만 아니라, 개, 고양이 등의 애완 동물이나 소, 말, 돼지, 양, 닭 등의 가축을 포함한 포유 동물의 질환의 치료에도 사용할 수 있다. 이 경우 "환자"를 "환축" 또는 "포유 동물"로 대체하여 적용하는 것으로 한다.
조성물
전술한 바와 같이, 외인성 인자로서 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 2종, 보다 바람직하게는 3종, 한층 바람직하게는 4종 모두를 체세포에 도입함으로써, 요로 상피 세포를 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 2종, 한층 바람직하게는 3종, 한층 바람직하게는 4종 모두를 포함하는 요로 상피 세포를 유도하기 위한 조성물을 제공한다. 당해 요로 상피 세포를 유도하기 위한 조성물은, 체세포로부터 요로 상피 세포를 유도하기 위해서 사용되는 인자를 포함하는 것이며, FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물, TP63 유전자 또는 그 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그 발현 산물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 2종, 보다 바람직하게는 3종, 한층 바람직하게는 4종 모두가 체세포에 도입 가능한 형태로 포함되는 것이 바람직하다. 도입되는 유전자의 유형 및 수에 따라서도 다르지만, 또 다른 실시 양태에서, 외인성 인자는 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서는, 이하의 유전자 또는 그의 발현 산물 또는 이들의 조합을 포함한다.
(i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
(vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
상기 유전자가 체세포에 도입 가능한 형태로서, 구체적으로는, 상기 유전자가 혼입된 벡터가 예시된다. 여기서, 상기 유전자는 각각 다른 벡터에 혼입되어 있어도 되고, 하나의 벡터에 2종 이상의 유전자가 동시에 혼입되어 있어도 된다.
사용할 수 있는 벡터의 종류 등에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 조성물은, 예를 들어 유전자 치료에 있어서의 의약(치료약)으로서 사용할 수 있다.
생체 내(in vivo)에서의 다이렉트 리프로그래밍
요로 상피 세포의 결핍 부위에 존재하는 체세포 (예 : 섬유 아세포)에 FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물, TP63 유전자 또는 그 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그 발현 산물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 2종, 보다 바람직하게는 3종, 한층 바람직하게는 4종 모두를 도입함으로써, 당해 손상 부위에서 요로 상피 세포를 다이렉트 리프로그래밍에 의해 유도하고, 이로써 요로 상피 세포의 치료나 요로 상세포의 재생에 기여할 수 있다. FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물의 도입에 있어서는, 상기 본 발명의 조성물을 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 유도 방법은 시험관 내(in vitro)에서의 다이렉트 리프로그래밍에 더하여, 상기와 같은 생체 내(in vivo)에서의 다이렉트 리프로그래밍을 포함하는 것으로 이해된다. 이러한 생체 내(in vivo)에서의 직접 재프로그램에 의해 예를 들어 다양한 질병을 치료하기 위한 유전자 요법을 행할 수 있다. 질환의 구체예로서는, 상기에 기재된 것을 들 수 있다.
생체 내(in vivo) 다이렉트 리프로그래밍은 요로 상피 세포의 손상 부위의 체세포 (예 : 섬유 아세포)에 FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물, TP63 유전자 또는 그 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그 발현 산물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 2종, 보다 바람직하게는 3종, 한층 바람직하게는 4종 모두를 도입하는 것 이외에는, 예를 들어 하기 문헌에 기재된 생체 내(in vivo)에서 심근 세포로의 다이렉트 리프로그래밍에 준하여 행할 수 있다.
1: Ieda M. Heart regeneration using reprogramming technology. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2013;89(3):118-28. Review.
2: Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, Bruneau BG, Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 2010 Aug 6;142(3):375-86.
3: Qian L, Huang Y, Spencer CI, Foley A, Vedantham V, Liu L, Conway SJ, Fu JD, Srivastava D. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 2012 May 31;485(7400):593-8.
또한, 방광이나 신우 내 등의 내강 내에 FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물, TP63 유전자 또는 그 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그 발현 산물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 2종, 보다 바람직하게는 3종, 한층 바람직하게는 4종 모두를 주입함으로써 행할 수 있다. 요도 카테터 등으로 방광 내나 신우 내에 상기 유전자 또는 그 발현 산물 또는 이들의 조합을 주입하고, 방광 내나 신우 내에 존재하는 체세포와 상기 유전자 또는 그 발현 산물 또는 이들의 조합을 접촉시켜 체세포를 요로 상피 세포로 유도한다.
상기 문헌 1 내지 3의 내용은 본 명세서에 참고로서 원용된다.
실시예
이하에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
<<약어 일람>>
aHDF(adult Human Dermal Fibroblast; 성인 인간 피부 섬유 아세포)
UC(urothelial cell)
HUC(Human urothelial cell)
HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell)
dUC(직접 전환된 UC)
FOXA1 (Forkhead box A1; 본 명세서에서 "F"라고도 함)
TP63 (tumor protein P63; 본 명세서에서 "T"라고도 함)
MYCL(L-Myc; 본 명세서에서 "L"이라고도 함)
KLF4 (Kruppel-like factor 4; 본 명세서에서 "K"라고도 함)
IRF1 (Interferon regulatory factor 1; 본 명세서에서 "I"라고도 함)
GFP(green fluorescent protein)
<< 재료와 방법 >>
1. 세포 배양
aHDFs를 라미닌 코팅한 12-well 플레이트, 또는 라미닌 코팅하지 않은 12-well의 플레이트에 파종하고, 레트로바이러스 벡터로 유전자 도입을 행하였다. 세포를 CnT-Prime 배지 또는 다른 배지에서 배양하고, 21일 후에 위상차 현미경으로 관찰, 실시간 PCR, 면역 세포 화학의 분석을 행하였다. 세포를 신선한 배양 플레이트로 계대하고 RNA 시퀀스 및 침투 분석에 사용하였다. In vivo 실험에서는, F, T, L, K가 도입된 세포를 간질성 방광염 마우스의 손상된 방광강 내에 카테터를 통해 경뇨도적으로 이식하였다.
2. 배지
"표준 배지"로서, MEM 비필수 아미노산, 100mM 피루브산 나트륨, 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 10% FBS(Gibco) 첨가 고글루코스 DMEM을 사용하였다.
"CnT-Prime (등록 상표)"배지는 CeLLnTEC로부터 구입하였다.
"Uromedium"배지는 오스본 등의 방법(Osborn SL, (2014) Stem Cell Transl Med 3(5):610-619.)에 따라 작성하였다. 요약하면, "Uromedium"배지는 60μM 칼슘 (Gibco; MEP1500CA)과 60μg/mL 소 뇌하수체 추출액(Gibco), 5μg/mL 인간 유전자 변형 인슐린 (Diagnocine), 500ng/mL 하이드로코르티손 (도쿄화성공업), 겐타마이신·암포테리신(Gibco), 2% FBS, 0.1ng/mL 인간 유전자 재조합 상피 성장 인자(EGF)(RSD), 100μM 3-이소부틸 1-메틸크산틴(IBMX)(Sigma-Aldrich)을 첨가한 EpiLifeTM 배지로 이루어진다.
"UCM" 배지는 60 μM 칼슘과 60 μg/mL 소 뇌하수체 추출액, 5 μg/mL 인간 유전자 재조합 인슐린, 겐타마이신·암포테리신, 2% FBS, 0.01 ng/mL 인간 유전자 재조합 EGF, 1 mM IBMX 및 1μM의 트라닐시프로민(Abcam)을 첨가한 EpiLifeTM 배지로 이루어진다.
3. 세포
aHDFs와 Plat-GP 세포는 ScienCell Research Laboratories와 Cell Biolab로부터 각각 구입하여 표준 배지에서 배양하였다. 계대수 10세대 이하의 aHDFs가 실험에서 사용되었다. HUCs는 구라시키 방적 주식회사로부터 구입하였다(KP-4309; Lot04101). 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)는 JCRB Cell Bank로부터 구입하여 기보고된 바(Nakagawa M, et al., (2014) Sci Rep 4(3594):10.1038/srep03594.1)에 따라 유지되었다. 요컨대, iPS 세포는 Easy iMatrix-511 silk (니피; 0.25 ㎍/㎠; 사전에 37℃에서 1시간 동안 처리됨)로 코팅된 플레이트 상에서 StemFit 배지(아지노모토; AK02N) 중에서 배양하였다. 계대를 위해, iPS 세포를 해리하고 Rock 억제제(나카라이테스크; Y-27632)를 포함하는 StemFit 배지에서 단일 세포의 현탁액으로 하고, 새로운 배양 플레이트에 재파종하였다. 다음날, Rock 억제제를 포함하지 않는 새로운 StemFit 배지로 교체하고, 2일마다 배지를 교체하였다. 계대는 iPS 세포가 80-90%의 합류에 도달했을 때 행하었다. 인간 방광암화 세포인 T24는 아시하라 교수(교토약과대학, 교토, 일본)로부터 제공되며, 10% FBS, MEM 비필수 아미노산, 100mM의 피루브산 나트륨과 100U/mL의 페니실린·스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
4. 항체
면역 항체 염색의 1차 항체로서, 토끼 폴리클로날 항유로플라킨 1b IgG(abcam; #ab102961; dilution 1:100), 토끼 폴리클로날 항유로플라킨 2 IgG(Proteintech; #21149-1-AP; 1:100), 마우스 모노클로날 항-E-캐드헤린 IgG(BD Biosciences; #610181; 1:50), 토끼 폴리클로날 항-Nanog IgG(Reprocell; #09-0020; 1:200), 및 마우스 모노클로날 항케라틴 8/18 IgG(CST Japan; #4546S; 1:50), 및 토끼 모노클로날 항케라틴 20 IgG(CST Japan; #13063; 1:100) 항체를 사용하였다. 2차 항체는 이하의 항체를 사용하였다. 염소 Alexa Fluor 488 표지 항 토끼 IgG와 항 마우스 IgG 항체 (Life technologies; #A11034 and #11029; 1:500), 및 염소 Alexa Fluor 594 표지 항 토끼 IgG와 항 마우스 IgG 항체 (Life technologies; #A11037 and #11032; 1:500).
5. 레트로바이러스 벡터
FOXA1, IRF1, TP63, 소닉 헤지호그 유전자의 전장 cDNA 클론은 DNAFORM Library로부터 구입하고, KOD-Plus-Neo DNA 폴리머라제(도요보)를 이용하여 RT-PCR에 의해 코딩 영역을 증폭하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다.
FOXA1
5'-CAGCAGTGTGGTGGTACGGGATGTTAGGAACTGTGAAGATG-3'（서열 번호１）
5'-ACCGGCGCTCAGCTGGCTAGGAAGTGTTTAGGACGGG-3'（서열 번호２）
IRF1
5'-CAGTGTGGTGGTACGGGATGCCCATCACTCGGATGCGC-3'（서열 번호３）
5'-ACCGGCGCTCAGCTGGACCGGCGCTCAGCTGG-3'（서열 번호４）
TP63
5'-CAGTGTGGTGGTACGGGATGAATTTTGAAACTTCACGG-3'（서열 번호５）
5'-ACCGGCGCTCAGCTGGCTATCACTCCCCCTCCTCTTT-3'（서열 번호６)
소닉 헤지호그
5'-CAGTGTGGTGGTACGGGATGCTGCTGCTGGCGAGATGT-3'（서열 번호７）
5'-ACCGGC GCTCAGCTGGCTAGCTGGACTTGACCGCCAT-3'（서열 번호８）
증폭된 DNA 단편을 Gene Art System (Invitrogen)을 사용하여 PMxs 레트로바이러스 벡터 (Cell Biolabs)로 클로닝하였다. 인간 POU5F1, KLF4, MYCL, GFP 유전자가 도입되어 있는 pMxs 플라스미드는 야마나카 교수(CiRA, 교토 대학, 교토, 일본)로부터 공여 받았다. Plat-GP 세포를 3x106 cells/dish의 밀도로 100mm 플레이트에 파종하고 24시간 동안 배양하였다. 전술한 5.0㎍의 pMxs와 2.5㎍의 pCMV-VSV-G를 XtremeGENE 9 DNA Transfection Reagent (Sigma-Aldrich)를 사용하여 세포에 도입하였다. 24시간 후, 항생 물질을 포함하지 않는 표준 배지로 교체하였다. 배양액의 상청을 배양하고, 레트로바이러스의 현탁액으로서 사용하였다.
6. 섬유 아세포에서 dUCs로의 전환
aHDFs를 아테로콜라겐(KOKEN; I-PC30) 혹은 폴리-L-리신(ScienCell) 혹은 라미닌(Easy iMatrix-511 silk)으로 코팅한 12-well 플레이트에 3x104cells/well의 밀도로 파종하였다. 24시간 후, 0.45 ㎛ 기공 필터(도요 여과지, ADVANTEC)로 필터링된 레트로바이러스 현탁액과 배지를 교체하고, 4 ㎍/mL의 폴리블렌을 첨가하였다. 다음날 배양 상청액을 바이러스를 포함하지 않는 표준 배지로 교체하고 3일 후 CnT-Prime 또는 "UCM"배지로 교체하였다. 배지는 3일 또는 4일마다 교체하였다.
7. dUCs의 계대
dUCs가 60-80%의 컨플루언트가 되거나 전회의 계대로부터 14일 경과했을 때에 dUCs를 계대하였다. 트립신/EDTA(나카라이테스크) 및 Cell Scraper(이와키)를 사용하여 dUCs를 박리하고, 1x104cells/well의 밀도로 라미닌으로 코팅된 12-well 플레이트에 파종하고, "UCM"배지에서 배양하였다.
8. iPS 세포에서 요로 상피 세포의 분화 유도
iPS 세포를 기보고된(Osborn SL, et al., (2014) Stem Cell Transl Med 3(5):610-619.) 방법에 약간의 개변을 더해 요로 상피 세포로 전환하였다. 요컨대, 라미닌으로 코팅된 6-well 플레이트에, 2x104cells/well의 밀도로 iPS 세포를 파종하고, 60-70% 컨플루언트가 될 때까지 배양하고, 배지를, 2% FBS, GlutaMAX (Gibco), 100U/mL 페니실린 스트렙토마이신, 5μMIDE1 (Cayman)을 첨가한 RPMI1640으로 교체하였다. 배지는 1-2일 간격으로 새로운 것으로 교체하였다. 내배엽 세포(DE)로 분화 유도한 9일 후에, 배지를 "Uromedium"으로 교체하고, DE 세포를 요로 상피 세포로 분화시켰다. 18일의 배양 기간 동안, 배지를 2-3일에 1회 교체하고, 10 mM 로지글리타존(Sigma-Aldrich)을 함유하고 EGF를 함유하지 않는 배지에서 3일 동안 배양하였다.
9. 실시간 RT-PCR
RNeasy Mini Kit (Qigen)를 사용하여 제조원의 프로토콜에 따라 총 RNA를 추출하였다. 인간 요로 상피 세포(HUC)의 총 RNA는 ScienCell Research Laboratories로부터 구입하였다(#4325, Lot 4740). 인간 소장, 간의 총 RNA는 Clontech Laboratories로부터 구입하였다 (#636539, Lot 1611206A; #636531, Lot 1703002). 인간 타액선의 총 RNA는 BioChain (R1234212-10, Lot B111155)에서 구입하였다. 내피 세포의 총 RNA를 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC; PromoCell; C-12200)로부터 추출하였다. cDNA를 ReverTra Ace qPCR(도요보 라이프사이언스)을 사용하여 합성하고 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 실시간 RT-PCR을 행하였다. 반응 혼합물은 Taqman 프로브 (Applied Biosystems)와 Taqman Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems)를 포함한다. 상대적인 mRNA 발현 레벨은 하기 식에 의해 구하였다.
상대적 mRNA 레벨 (fold) = (샘플 중의 표적 유전자 mRNA/샘플 중의 β-actin 유전자 mRNA 레벨)/(대조 표본 중의 표적 유전자 mRNA 레벨/대조 표본 중의 β-actin 유전자 mRNA 레벨)
10. 면역 세포 화학 해석
12-well 플레이트에서 배양한 세포를 PBS(-)로 세정하고, 4% 파라포름알데히드(PFA)로 30분간 고정 후, 0.2% Triton-X 100(나카라이테스크)로 15분간, 실온에서 막 투과 처리를 행하였다. Blocking One Histo(나카라이테스크)를 실온 30분간 첨가하고 백그라운드의 블로킹을 행하고, 1차 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 세정 후, 2차 항체를 세포에 첨가하고, 차광하고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 세포를 세정하고 핵을 헥스트(Hoechst) 33342(DOJINDO)로 5분 염색하였다. 관찰은 BZ-X (Keyence)로 행하였다. 각 신호의 양성, 음성 세포를 BZ-X Analyzer software (Keyence)로 카운트하였다. 시그널 양성 세포의 비율은 하기 식에 의해 산출하였다.
% of 시그널 양성 세포 = (시그널 양성이며 헥스트 양성 세포/전체 헥스트 33342 양성 세포) x 100
11. RNA 시퀀싱
aHDFs와 P2 dUCs (UCM에서 배양)로부터 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 사용하여 제조원의 프로토콜에 따라 총 RNA를 추출하였다. 인간 요로 상피 세포(HUCs)의 총 RNA는 ScienCell Research Laboratories로부터 구입하였다. 각 RNA 샘플의 질은 아가로스 겔 전기 영동(겔 농도: 1%, 전압: 180V: 영동 시간: 16분)과 Agilent 2100의 해석으로 확인하였다. 라이브러리의 작성과 시퀀스는 Novogen Inc.에서 행하였다. 간단하게는, Ribo-Zero kit를 사용하여 리보솜 RNA를 제거하였다. mRNA를 단편화 완충액을 첨가하여 무작위로 단편화하고 cDNA 합성을 행하였다. 품질 검사된 라이브러리를 Illumina Novaseq 6000 (Illumina; paired-end, 150 bp)으로 시퀀싱하였다. 필터링된 서열 데이터를 HISAT2 버전 2.1.0 (https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)을 사용하여 Reference genome (GRCh38)상에 매핑하였다. Bedtools (https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/)에서 동정된 서열 결과로부터 잔존 리보솜 RNA를 제거한 후에 매핑된 서열을 featurecounts (http://bioinf.wehi.edu. au/featureCounts/)(Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics 30, 923-930 (2014))를 사용하여 카운트하고, GENCODE (GENCODE 29; https://www.gencodegenes.org/)의 아노테이션 GTF 파일과 연결하였다. 해석은 iDEP8.1(Ge, SX, Son, EW & Yao, R. iDEP: an integrated web application for differential expression and pathway analysis of RNA-Seq data. BMC Bioinformatics 19, 10.1186/s12859-018-2486 (2018))을 사용하여 행하였다. 리드 카운트 데이터는 CPM (counts per million) 함수에 의해 edgeR로 정규화되고, 적어도 샘플 당 0.5 카운트 이상/million이 아닌 유전자는 배제하였다. 변환된 데이터는 탐색 해석(계층 클러스터링 해석과 유전자 발현 변동 해석)에 이용되고, 변환하지 않은 데이터는 DESeq2에서 반환된 fold-change 값으로서 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)의 패스웨이 해석에 이용하였다. 유전자 발현 데이터는 Pathview(Luo, W. & Brouwer, C. Pathview: an R/Bioconductor package for pathway-based data integration and visualization. Bioinformatics 29, 1830-1831 (2013))를 이용한 KEGG 패스웨이 다이어그램(Kanehisa, M., Furumichi, M., Tanabe, M., Sato, Y. & Morishima, K. KEGG: new perspectives on genomes, pathways, diseases and drugs. Nucleic Acids Res 45, D353-D361 (2017)) 상에서 시각화되었다.
12. 시험관 내 투과성 분석
안쪽 챔버에 직경 12mm의 구멍 직경 0.4μm의 폴리카보네이트막을 가지는 HTS Transwell clear 12-well 플레이트를 코닝으로부터 구입하고, Easy iMatrix-511 silk (니피; 0.25μg/cm2, 1시간 37℃에서 프리인큐베이션)로 코팅하였다. P4 dUCs 또는 aHDFs를 UCM 배지에 현탁하고 inner chamber에 1x105cells/well의 밀도로 파종하였다. HUCs는 UrolifeTMD Cpmplete Medium (Urolife)에 재현탁하고 inner chamber에 1x105cells/well의 밀도로 파종하였다. 최종 분화시키기 위해, 일부 HUCs를 1μM 로지글리타존 (PPARγ 활성화제; Sigma-Aldrich) 및 1μM PD153035 (EGFR 억제제; TCI)를 첨가한 Urolife 중에서 4일 동안 배양하였다. 세포를 5일 동안 배양하고 PBS(-)로 세정하였다. 분자량 약 4kDa의 FITC 표지된 덱스트란 (이와이 화학)을 inner chamber 내부에 2mg/mL의 농도로 첨가하였다. 20분간 차광하에서 배양하고, outer chamber 내의 상청액을 96-well 플레이트에 옮기고, 각 well의 형광 강도를 SectraMax M2(Molecular Devices)를 이용하여 형광 533nm, 여기 485nm로 형광 강도를 측정하였다. outer chamber에 누출된 FITC 표지 덱스트란의 비율의, 세포를 파종하지 않은 컨트롤을 100%로 한 상대값(%)을 하기 식에 의해 산출하였다.
%=(각 well의 형광 강도/FITC 표지 덱스트란 비첨가의 형광 강도)/(컨트롤 well의 형광 강도/FITC 표지 덱스트란 비첨가의 형광 강도)Х100
13. 마우스 방광으로의 dUCs 이식
모든 동물 실험은 대학의 동물 실험 위원회(M30-281)에서 승인되었다. 동물 취급은 대학 가이드라인에 따랐다. 암컷의 NOG/BALB-Rag2nullIL-2Rγnull/NSG (NOG/SCID) (NOG/SCID) 마우스는 일본 클레어로부터 구입하였다. 간질성 방광염 마우스 모델과 방광 내 세포 이식 방법은 기보고된(Homan T, et al., (2013) J Pharmacol Sci 121(4):327-337. 7(5):e1424671.) 방법에 기재되어 있는 방법에 약간의 수정을 가하였다. 6-8 주령의 마취하의 마우스에게 항asialo GM1 항체를 100 mg/마우스의 용량으로 복강 내 투여하였다. 동시에, 24 게이지 카테터를 방광 내에 경요도적으로 삽관하고, 1.5 % H2O2액 50μL를 방광 내에 주입하였다. 1시간 후, 방광을 PBS(-)로 세정하고, 12,000PU의 dispase II(후지 필름 와코 순약 주식회사) 50μL를 포함하는 용액을 방광 내에 주입하고, Easy iMatrix 511 silk를 1시간 투여하였다. F, T, L, K를 도입한 aHDFs를 표준 배지에서 4일간 배양하고, PBS(-)에 3x106/100μL의 농도로 현탁 후 방광 내에 이식하였다(각각 n=4). 다른 그룹은 유전자가 도입되지 않은 aHDF (3x106 세포/100μL PBS) 또는 PBS (-) 만을 방광 내에 주입하였다. 요도를 봉합하고, 3시간 후에 발사하고, 자발적인 배뇨가 가능하도록 처리하였다.
14. 시험관 내 조종양성 검토
6-8 주령의 암컷 NOG/SCID 마우스를 마취시키고 100mg의 항asialo GM1 항체를 복강 내 투여하였다. F, T, L, K를 도입한 aHDFs를 표준 배지에서 4일간 배양한 후, Matrigel(Corning)과 혼합하고, 1x107/100μL의 농도로 마우스 피하에 투여하였다. T24 세포와 유전자 도입되지 않은 aHDFs는 각각 양성, 음성 대조군으로 사용하였다. 투여 부위의 조직 팽창의 직경, 또는 종양이 생긴 경우에는, 종양의 직경을 캘리퍼스로 매주 10주 동안 측정하여 부피를 계산하였다.
15. 면역 조직 화학
세포 이식 후 7일째에 마우스의 방광을 적출하였다. 포름알데히드로 고정한 후, 일부 장기는 30% 수크로스/PBS(-)로 대체하였다. 다른 부위는 파라핀으로 포매하였다. 샘플을 5-10μm 두께로 얇게 썰었다. 내인성의 퍼옥시다아제 활성을 3% H2O2로 5분 동안 차단하고 Protein Block (Dako)으로 30분 동안 배양하였다. 세정 후, 조직 절편을 1차 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 조직을 세정하고 염소 Alexa Fluor 594 표지 항토끼 IgG2차 항체 또는 항마우스 IgG2차 항체와 실온에서 60분 동안 반응시켰다. 3회 세정 후, 조직 절편을 DAPI가 들어 있는 VECTASHIELD mounting medium (Vector Laboratories)로 봉입하였다. 형광 관찰은 BZ-X (Keyence)를 사용하여 행하였다.
16. 통계 해석
각 데이터는 평균±SD로 표기하였다. 통계적 유의한 차이는 Student's t-test 또는 one-way ANOVA와 포스트 혹(post-hoc)의 Tukey-Kramer 테스트로 검정하였다. 통계적 유의차는 P<0.05로 설정하였다. 모든 분석은 EZR (Kanda, Y. Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics. Bone. Marrow. Transplant. 48, 452-458 (2013))로 해석하였다.
실시예 1
성인 인간 피부 섬유 아세포 (aHDFs)는 특정 인자를 도입함으로써 요로 상피 세포양의 표현형을 발현하도록 유도되었다.
최초로, 3개의 전사 인자에 주목하였다. FOXA1 (F), IRF1 (I)는 요로 상피 세포의 발생에서 중요하다. 한편, TP63 (T)는 상피 줄기 세포에서 발현되며 요로 상피 세포의 발생 및 분화와 관련된 전사 인자이다. 또한 요로 상피 세포의 기저막 세포에서 발현하고 재생 과정에서 세포 증식에 중요한 시그널을 조절하는 소닉 헤지호그 (SHH) 유전자 (H)를 첨가하였다. 이들 유전자를 레트로바이러스 벡터를 사용하여 성인 인간 피부 섬유 아세포(aHDFs)에 도입하고, 이 세포를 세포의 유지에 적절하다고 생각되는 기간(21일간), CnT-Prime 배지에서 배양하였다(도 1). FIT 또는 FIH를 도입한 세포에서는 요로 상피 세포의 발생 마커인 유로플라킨(UPK1b)이 약간 발현되었다(도 2A). 두 세포 모두 요로 상피 세포 형태와 같은 콜로니가 형성되지 않았다 (도 2B). 이어서, 초기화 유전자인 3개의 유전자, 즉 POU5F1(P), KLF4(K) 및 MYCL(L)을 첨가하였다. 요로 상피 세포와 관련된 유전자와 초기화 유전자를 조합한 일부 세포에서는 UPK1b의 mRNA가 높은 수준으로 발현되었다. 이것은 FOXA1이 유전자 조합에 포함되는 것이 필수적임을 시사하였다 (도 3). 다음으로 I, T 및 H 유전자의 필요성을 확인하였다. 그 결과, I가 아닌 T 또는 H가 상피 세포 콜로니 형성을 촉진시키는 것을 알 수 있었다(도 4). P, K 및 L의 필요성은 FT와의 조합에 의해 결정하였다. FTLK의 조합은 UPK1b의 mRNA 발현과 상피 세포 콜로니의 형성을 유도하였다 (도 5A, B). 추가로 FTLK를 도입한 세포는 다른 요로 상피 특이적 마커인 유로플라킨 2(UPK2) mRNA를 발현하였다(도 5A). UPK1b는 요로 상피 세포 외에도 각막 상피나 결막 상피에도 발현되지만, UPK2는 보다 요로 상피 세포에 특이성이 강하다고 보고되었다 (Habuka, M. et al., PLoS. One. 10, e0145301 (2015)).
F, T, L, K가 UPK1b와 UPK2의 발현 유도에 필요 충분한지 여부를 검증하였다. UPK1b의 mRNA 발현량은 F, L, K로 전환된 세포에서는 상승한 반면, T, L, K의 조합에서는 UPK2의 mRNA 발현량은 매우 높았다. L, K의 조합 및 F, L, K의 조합에서도 유의하게 UPK2의 mRNA 발현량이 증가하였다. F, T, L, K의 조합은 UPK1b와 UPK2 둘 다의 mRNA 발현 상승을 유도하였다 (도 6A). 이것으로부터 F, T, L, K가 aHDF에 요로 상피 세포의 형질을 유도하는 최적의 유전자의 조합이라고 결론지었다.
배양 플레이트의 코팅이 세포의 전환 효율에 미치는 영향을 조사하였다. aHDFs의 파종 전에 배양 플레이트를 콜라겐, 폴리-L-리신 또는 라미닌으로 코팅하였다. 상피 세포 콜로니는 라미닌으로 코팅된 배양 플레이트에서만 형성되었고(도 6B), UPK1b와 UPK2 mRNA의 발현은 가장 높았다 (도 6C).
F, T, L, K를 도입한 세포와 도입하지 않는 세포를 다양한 배지에서 배양하였다. 도 6D, E 및 도 7에 나타낸 바와 같이, F, T, L, K로 전환된 세포는 CnT-Prime 배지에서 가장 잘 요로 상피 세포 콜로니를 형성하고, UPK1b, UPK2의 mRNA 발현 양도 현저히 높았다. 요로 상피 세포의 배양에 적합한 것으로 많이 보고된 "Uromedium" 배지는 상피 세포 콜로니 형성뿐만 아니라 섬유 아세포 유사 세포의 증식을 지원하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 CnT-Prime 배지가 요로 상피 세포양으로의 전환이 우수함을 시사하였다. 대조적으로, CnT-Prime 배지에서는 유전자 도입을 하지 않은 세포의 요로 상피 세포로의 전환은 일어나지 않았다.
실시예 2
직접 전환된 요로 상피 세포 (dUCs)의 특징.
실시예 1의 방법으로 전환된 세포는 직접 전환된 요로 상피 세포(dUC)로 나타낸다. 다음으로, 세포의 상세한 특징을 조사하였다. 시간 경과에 따른 해석에서는, F, T, L, K로 전환된 세포는 유전자 도입 8일 후에 UPK1b를 현저하게 발현하고, 발현은 15일 후에 피크에 도달하였다(도 8a). UPK2의 mRNA 발현은 FTLK로 전환된 세포에서 11일 후부터 상승하기 시작하였고, 21일 후에 피크에 도달하였다. 상피 세포 콜로니의 형성은 11일 후에 관찰되고, 이후 증가하였다(도 8b).
UPK1b와 UPK2의 발현에 더하여, 일반적인 상피 세포에서 발현되는 막관통형 단백질인 E-캐드헤린과 세포 골격인 케라틴 8/18의 발현을 확인하였다. 면역 세포 화학적 해석에 의해, 약 42%의 세포가 UPK1b를 발현하는 한편, UPK2 양성, E-캐드헤린 양성, 케라틴 8/12 양성 세포는 각각 23%, 26%, 26%였다(도 8c, d). 이 결과는 전환율이 약 25%임을 시사하였다.
오스본 등은 iPS 세포로부터 내배엽을 거쳐 요로 상피 세포로 분화시키는 방법을 보고하고 있다(Osborn SL, et al., (2014) Stem Cell Transl Med 3(5):610-619.). 따라서 직접 전환으로 작성한 dUCs와 오스본 등의 방법에 다소의 수정을 넣어 유도한 iPS 세포 유래의 요로 상피 세포(iUCs)를 비교하였다(도 9A). dUCs는 UPK1b와 UPK2 유전자의 발현을 강하게 발현하였지만, iUCs는 UPK1a와 UPK3a의 유전자를 강하게 발현하였다(도 9B). 이것은 iUCs에 비해 dUCs가 더 미성숙한 요로 상피 세포와 유사하다는 것을 강력하게 시사하였다.
실시예 3
다능성, 간, 소장 마커는 dUCs에서 발현되지 않았다.
섬유 아세포가 일시적으로 iPS 세포 또는 내배엽 전구 세포로 전환되고 거기에서 요로 상피 세포가 발생했을 가능성을 배제하기 위해 전환 과정에서 F, T, L, K 도입 세포에서의 다능성 마커의 발현과 비요로 상피성 내배엽 마커의 발현을 조사하였다. 그 결과, F, T, L, K 도입 세포에서는 배양 기간 동안 NANOG, POU5F1, LIN28, SOX2의 유전자 발현이 관찰되지 않았다. NANOG의 단백질도 동일하게 관찰되지 않았다 (도 10). 마찬가지로, F, T, L, K 도입 세포는 소장 상피 세포 마커인 CDX2 및 간세포 마커인 알부민(ALB)의 mRNA 등의 관찰 시점에서도 발현되지 않았다(도 11). 또한, F, T, L, K 도입 세포는 간엽계 유래 내피 세포 마커인 CD31 및 외배엽 유래 타액선의 마커인 AQP5의 mRNA를 발현하지도 않았다(도 11). 따라서 F, T, L, K 도입 세포는 dUCs로의 전환 과정에서 다능성 단계를 거치지 않았으며 다른 내배엽 유래 세포로 전환하지 않았음을 확인하였다. 또한 간엽계나 외배엽계의 세포로도 전환하지 않았음을 확인하였다.
실시예 4
dUCs는 계대 배양에 의해 선택적으로 증식시킬 수 있다.
유전자 도입 21일 후까지 형성된 dUC 콜로니는 동일한 배지 상에서 그 후 계속해서 배양되어도 활발하게 성장하지 않았다. dUCs를 고순도로 대량으로 확보하기 위하여, 세포를 초기 배지(세대수 0, P0)에서 배양을 개시하고, 그 후 새로운 배지로 계대하였다(세대수 1, P1). 그러나, CnT-Prime 배지에서 만들어진 P0의 dUCs를 같은 배지에서 새롭게 배양해도, 상피 세포 콜로니는 거의 형성되지 않고, 상피 세포가 아닌 세포가 약간 증식할 뿐이었다. "Uromedium"은 다음 세대에서도 조약돌 모양의 콜로니를 형성하지 않았다(도 12). 그래서, dUCs에 적합한 배지로 하기 위해, "Uromedium"에 포함되는 배지 성분의 농도를 개량하여 조성을 결정하였다. 도 13A에 나타낸 바와 같이, 인슐린과 하이드로코르티손의 농도는 결정적이지 않았다. 한편, F, L, T, K 도입 세포가 UPK2 mRNA를 발현하는 것을 포함하여, 1-10 mM의 IBMX가 유익한 역할을 하고 있었다. 하이드로코르티손을 포함하지 않는 배지와 10 mM의 IBMX를 포함하는 배지에서는, F, L, T, K 도입 세포가 상피 세포 콜로니를 형성하였다(도 13B). EGF는 요로 상피 세포의 증식, 분화에는 필요하지 않다고 보고되었지만, 0.01-1 ng/mL의 EGF를 첨가함으로써 UPK2의 mRNA의 발현은 상승하였다 (도 13A). iPS 세포로부터 섬유 아세포로의 리프로그래밍 효율을 증가시키는 것으로 알려진 모노아민 산화 효소의 비가역적 억제제인 트라닐시프로민을 첨가함으로써 요로 상피 세포 콜로니의 형성이 촉진되었다 (도 13C).
이러한 결과에 기초하여, dUCs의 계대에 최적인 배지 성분을 결정하였다. 요로 상피 세포 전환/유지 배지 (UCM)라고 명명된 이 배지는 다음과 같은 조성을 갖는다.
60μM 칼슘,
60㎍/mL 소 뇌하수체 추출액,
5㎍/mL 인간 유전자 재조합 인슐린,
30㎍/mL 겐타마이신,
15ng/mL 암포테리신,
2% FBS,
0.01ng/mL의 인간 유전자 재조합 EGF,
1mM IBMX 및
1μM 트라닐시프로민
를 첨가한 EpiLifeTM 배지.
(EpiLifeTM 배지: 각질 형성 세포 배양용 배지)
UCM은 F, L, T, K 도입세포의 상피 세포 콜로니 형성을 지원하고, 섬유 아세포양 세포의 성장을 억제하였다 (도 12, 도 13D). 이어서, 이 특징적인 배지를 사용하여 dUCs의 계대 배양과 선택적인 성장이 지원되는지를 조사하였다(도 14a). 도 15a에 나타낸 바와 같이, 적어도 dUCs의 4세대 계대 배양에 성공하였다. P4에서는, dUCs는 UPK1b, UPK2 및 E-캐드헤린을 강하게 발현시켰다(도 15b, c 및 도 14b, c). 이러한 결과는 UCM 배지에서는 dUCs가 섬유아양 세포보다 효율적으로 증식하고, 계대 과정에서 안정적으로 요로 상피양의 세포에 머물렀다는 것을 시사한다.
실시예 5
dUCs는 시험관 내에서 현저한 배리어 기능을 발휘한다.
다음으로, P4 dUCs의 배리어 기능을 트랜스웰을 이용한 시험관 내 투과성 검정을 사용하여 확인하였다. P4의 dUC를 라미닌으로 코팅된 inner chamber의 저부 멤브레인 상에서 합류될 때까지 배양하였다(도 15d). 그 후, FITC로 표지된 덱스트란(FITC-덱스트란)을 inner chamber 내에 첨가하고 outer chamber로의 누출을 검출하였다. 세포를 넣지 않는 대조군 및 aHDFs를 배양한 또 하나의 대조군과 비교하면, FITC-덱스트란의 투과성은 dUCs를 배양한 트랜스웰에서는 현저하게 낮았다(도 15e). HUCs 및 최종 분화된 HUCs에 대해서도 FITC-덱스트란의 누출이 감소되었다 (도 21). 이것은 본 발명의 방법으로 제조된 P4 dUCs가 시험 관내에서 상피 장벽을 형성함을 시사한다.
실시예 6
RNA 시퀀스에 의해 P2 dUCs의 요로 상피 세포로서의 특징을 추가로 확인하였다.
RNA 시퀀스에 의해 P2 dUCs와 요로 상피 세포의 유사성을 해석하였다. 게놈 전장의 계층 클러스터링에 의한 유전자 발현 프로파일링 해석에 의해 dUCs는 aHDF보다도 HUCs에 의해 유사하다는 것이 밝혀졌다(도 16A). 도 16B는 가장 변동하는 50개의 유전자 데이터를 나타낸다. 이 결과는, 섬유 아세포에서는 거의 발현되지 않는 케라틴(KRT8, 18, 5, 17, 6A, 14)과 유로플라킨의 세포 상부로의 수송에 관여하는 RAB27B를 포함하는 요로 상피 세포와 관련된 유전자를, dUCs와 HUCs는 모두 특징적으로 발현한다는 것을 보여준다. 한편, 섬유 아세포와 관련된 유전자(FAP, COL16A1, COL1A2, DPT, PTX3 등)는 dUCs와 HUCs에서 발현이 감소하였다(도 16B). 유전자 발현 해석은 또한 dUCs가 섬유 아세포가 아닌 요로 상피 세포와 연관된 유전자를 강하게 발현하는 것을 더 확실한 것으로 하였다(도 16C, 도 17A). 케라틴 필라멘트 및 콜라겐 섬유 조직과 관련된 유전자에 관해서는, HUCs 및 dUCs는 유사한 발현 패턴을 나타냈다 (도 17A). 특히, dUCs는 방광 상피 세포의 발생과 관련된 중요한 인자 중 하나인 KLF5를 발현한다는 것이다 (도 16C). dUCs는 또한 KEGG 패스웨이 해석에 의해 상피간의 세포간 접착 타이트 정션(tight junction) 형성에 관련된 유전자를 강하게 발현하는 것을 알 수 있었다 (도 17B). 이들 유전자도 섬유 아세포에서는 거의 발현되지 않는다.
실시예 7
dUCs는 생체 내에서 손상된 요로 상피 세포의 재생에 기여할 가능성이 있다.
F, T, L, K를 도입한 aHDFs가 생체 내에서 dUCs로 전환되어 요로 상피 세포의 재생에 기여하는지 여부를 조사하였다. F, T, L, K 및 GFP 유전자가 도입된 aHDFs는 CnT-Prime 배지에서 21일 동안 배양할 때 GFP로 표지된 dUCs로 전환되었다(도 18a, b). 생체 내 실험에서, aHDFs를 F, T, L, K, G 유전자 도입 4일 후에 간질성 방광염으로 손상된 마우스의 방광에 이식하였다. 이식 후 1주일만에, GFP로 표지된 세포는 방광의 점막 상피 내에 존재하고, UPK1b, UPK2, E-캐드헤린, 케라틴 8/18을 발현하였다(도 18d). 또한, 최종 분화된 엄브렐러 세포에서 발현되는 것으로 알려진 KRT20도 발현하고 있었다. 대조적으로, GFP로 표지된 aHDFs를 방광 내로 이식하더라도, GFP-양성 및 E-캐드헤린-양성 세포는 관찰되지 않았다(도 18d). 따라서 F, L, T, K, G를 도입한 aHDF는 in vivo에서 dUCs로 전환되어 손상된 방광의 상피에 국재하여 조직의 재생에 관여하고 있었다.
실시예 8
dUCs의 조종양성 유무의 검토
dUCs의 잠재적인 조종양성을 조사하였다. 지금까지 시험한 결과, F, L, T, K를 도입한 aHDFs는 면역결핍 마우스의 피하에 접종된 후에도 종양을 형성하지 않았다(도 19). 한편 T24 방광암 세포는 종양을 형성하였다.
실시예 9
실시예 1과 동일하게 하여, aHDFs에, 특정 인자를 도입함으로써 요로 상피 세포와 같은 표현형을 발현하는 것을 확인하였다. 결과를 도 20에 나타낸다. F, T, L, K 또는 이들의 조합이 UPK1b와 UPK2의 발현 유도에 효과적인 것으로 나타났다.
[산업상의 이용 가능성]
본 발명에 의하면, 다이렉트 리프로그래밍에 의해 체세포로부터 단기간에 요로 상피 세포를 조제할 수 있다. 이 요로 상피 세포는 이식하는 본인의 체세포로부터 용이하게 유도할 수 있으므로, 얻어진 요로 상피 세포를 이식한 경우에도 면역학적 거부 반응 등의 문제는 발생하지 않는다. 또한, iPS 세포나 ES 세포를 경유하지 않고 직접 체세포로부터 요로 상피 세포를 유도할 수 있기 때문에, 암화 등의 다능성 줄기 세포에 기인하는 문제를 회피할 수 있다.
본 출원은 일본에서 출원된 일본 특허 출원 2019-159070(출원일: 2019년 8월 30일)을 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CellAxia Inc. <120> Inducing agent for urothelial cell and Induction method of urothelial cell <130> 093046 <150> JP2019-159070 <151> 2019-08-30 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer specific for FOXA1 <400> 1 cagcagtgtg gtggtacggg atgttaggaa ctgtgaagat g 41 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer specific for FOXA1 <400> 2 accggcgctc agctggctag gaagtgttta ggacggg 37 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer specific for IRF1 <400> 3 cagtgtggtg gtacgggatg cccatcactc ggatgcgc 38 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer specific for IRF1 <400> 4 accggcgctc agctggaccg gcgctcagct gg 32 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer specific for TP63 <400> 5 cagtgtggtg gtacgggatg aattttgaaa cttcacgg 38 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer specific for TP63 <400> 6 accggcgctc agctggctat cactccccct cctcttt 37 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer specific for Sonic hedgehog <400> 7 cagtgtggtg gtacgggatg ctgctgctgg cgagatgt 38 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer specific for Sonic hedgehog <400> 8 accggcgctc agctggctag ctggacttga ccgccat 37

Claims (20)

  1. 포유 동물의 체세포에, 외인성 인자로서,
    FOXA1(Forkhead box A1) 유전자 또는 그 발현 산물,
    TP63(tumor protein P63) 유전자 또는 그 발현 산물,
    MYCL (L-Myc) 유전자 또는 그의 발현 산물 및
    KLF4 (Kruppel-like factor 4) 유전자 또는 그 발현 산물
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 도입하는 공정을 포함하는, 요로 상피 세포를 유도하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 외인성 인자가 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 외인성 인자가 다음으로부터 선택되는 방법;
    (i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 체세포가 인간 섬유 아세포인 방법.
  5. 포유 동물의 체세포에서 유래하고, 외인성 인자로서,
    FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물,
    TP63 유전자 또는 그 발현 산물,
    MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및
    KLF4 유전자 또는 그 발현 산물
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 갖는, 요로 상피 세포.
  6. 제5항에 있어서, 외인성 인자가 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물을 포함하는 세포.
  7. 제5항에 있어서, 외인성 인자가 하기로부터 선택되는 세포;
    (i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체세포가 인간 섬유 아세포인 세포.
  9. 외인성 인자로서,
    FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물,
    TP63 유전자 또는 그 발현 산물,
    MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및
    KLF4 유전자 또는 그 발현 산물
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 포유 동물의 체세포를 요로 상피 세포로 전환하기 위한 제제.
  10. 제9항에 있어서, 외인성 인자가 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물을 포함하는 제제.
  11. 제9항에 있어서, 외인성 인자가 하기로부터 선택되는 제제:
    (i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체세포가 인간 섬유 아세포인 제제.
  13. 외인성 인자로서,
    FOXA1 유전자 또는 그 발현 산물,
    TP63 유전자 또는 그 발현 산물,
    MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및
    KLF4 유전자 또는 그 발현 산물
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 포유 동물 체세포를 요로 상피 세포로 전환하기 위한 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 외인성 인자가 FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물 및 TP63 유전자 또는 그의 발현 산물을 포함하는 벡터.
  15. 제13항에 있어서, 외인성 인자가 다음으로부터 선택되는 벡터;
    (i) KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (ii) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (iii) MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (iv) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (v) TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (vi) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물
    (vii) FOXA1 유전자 또는 그의 발현 산물, TP63 유전자 또는 그의 발현 산물, MYCL 유전자 또는 그의 발현 산물, 및 KLF4 유전자 또는 그의 발현 산물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체세포가 인간 섬유 아세포인 벡터.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 얻어지는 세포, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 요로 상피 세포, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 제제 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 포함하는 비뇨기계 질환의 치료제.
  18. 제17항에 있어서, 비뇨기계 질환이 요로 질환인 치료제.
  19. 제18항에 있어서, 요로 질환이 방광암, 과활동 방광, 방광의 선천성 이상, 방광 손상, 간질성 방광염, 신경인성 방광 및 위축 방광으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 치료제.
  20. 3-이소부틸 1-메틸크산틴(IBMX) 및 상피 성장 인자(EGF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 요로 상피 세포 유도용 배지.
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