WO2018124292A1 - 骨格筋細胞及びその誘導方法 - Google Patents

骨格筋細胞及びその誘導方法 Download PDF

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純子 若尾
岸田　綱郎
達郎 田尻
松田　修
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Definitions

  • the present invention mainly relates to a skeletal muscle cell and a method for inducing the same, and more particularly to a method for inducing a skeletal muscle cell by direct reprogramming.
  • Muscle is an essential tissue for animal movement and is composed of fibrous multinucleated cells with contractile ability. In induction of skeletal muscle differentiation, mononuclear myoblasts are fused while being differentiated to form multinucleated myocytes. It is known that differentiation induction of skeletal muscle is controlled by transcription factors such as MyoD family and MEF2 family.
  • myoblast-like cells can be induced by introducing a skeletal muscle-specific transcription factor, MyoD family gene, into mouse fibroblasts.
  • human fibroblasts have a problem in that myoblasts cannot be induced to the same extent as in mice even when a MyoD family gene is introduced.
  • An object of the present invention is to provide a method for inducing skeletal muscle cells that can be applied to treatment of diseases associated with muscle defects.
  • the present inventor introduced a MyoD gene and an L-myc gene in combination into mammalian somatic cells, directly (without direct reprogramming via pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells). ) It was found that skeletal muscle cells can be obtained.
  • the present invention has been completed through further studies based on such findings.
  • the present invention includes the following inventions.
  • Item 1 A method for inducing (preparing) skeletal muscle cells, comprising introducing a MyoD family gene or an expression product thereof and a Myc family gene or an expression product thereof into a mammalian somatic cell.
  • Item 2 The method according to Item 1, wherein the somatic cells are fibroblasts.
  • Item 3 The method according to Item 1, wherein the somatic cell is a human somatic cell.
  • Item 4 The method according to Item 1 or 2, wherein the MyoD family gene is MyoD1 gene and the Myc family gene is L-myc gene.
  • Skeletal muscle cells derived from mammalian somatic cells and having an exogenous MyoD family gene or expression product thereof and Myc family gene or expression product thereof.
  • Item 7 A cell obtained by the method according to any one of Items 1 to 4, or a skeletal muscle cell comprising the skeletal muscle cell according to Item 4, for treating a disease based on a deficiency, deficiency or reduced function of skeletal muscle Of transplant material.
  • Item 8 A composition for inducing (preparing) skeletal muscle cells, comprising a MyoD family gene or an expression product thereof and a Myc family gene or an expression product thereof.
  • skeletal muscle cells can be prepared from somatic cells in a short period of time by direct reprogramming. Since these skeletal muscle cells can be easily derived from the somatic cells of the individual to be transplanted, problems such as immunological rejection response do not occur even when the obtained skeletal muscle cells are transplanted. Moreover, since skeletal muscle cells can be directly induced from somatic cells without going through iPS cells or ES cells, problems caused by pluripotent stem cells such as canceration can be avoided.
  • the mRNA expression measurement result of Myogenin gene and CKM gene is shown.
  • the result of fluorescence-immunity is shown (CKM).
  • the result of the fluorescence immunity is shown (Dystrophin).
  • the result of fluorescence-immunity is shown (Myogenin).
  • the observation result of the appearance of multinucleated myotube cells is shown.
  • the results of evaluating the appearance of multinucleated myotube cells are shown.
  • the mRNA expression measurement result of Myogenin gene, CKM gene, and MHC3 gene is shown.
  • the time-dependent measurement result of mRNA expression of DMD gene is shown.
  • summary of the method of Example 8 is shown.
  • a macroscopic image of the transplanted site and the extracted tissue one week after transplantation is shown.
  • the result of the immunohistochemical staining of the tissue transplanted with fibroblasts is shown.
  • Paraffin section ⁇ 200 magnification.
  • transduced MyoD1 and L-Myc is shown.
  • Paraffin section ⁇ 200 magnification.
  • the measurement result of a desmin positive cell is shown. Values are mean ⁇ standard deviation.
  • Each group N 3 mice. * P ⁇ 0.05 vs. non-transfected cell transplant group.
  • the result of the fluorescence insult of Desmin and CKM is shown.
  • the results of heat map and clustering analysis of genes involved in skeletal muscle development are shown.
  • the results of heat map and clustering analysis of genes involved in skeletal muscle contraction are shown.
  • the results of the heat map and clustering analysis of genes related to myosin filaments are shown.
  • the results of heat map and clustering analysis of genes related to actin filaments are shown.
  • the result of the staining of rBC2LCN-FITC is shown.
  • the mRNA expression measurement result of Myogenin gene and CKM gene is shown.
  • the present invention relates to a method for inducing skeletal muscle cells by converting mammalian differentiated somatic cells into skeletal muscle cells.
  • Convert means the transformation of somatic cells into the desired skeletal muscle cells.
  • One of the preferred embodiments of the method of the present invention is that a somatic cell is transferred to a skeletal muscle without undergoing a cell initialization step represented by the production of iPS cells, which is also called “direct reprogramming” or “direct conversion”. It is a method of converting into cells.
  • Induction into skeletal muscle cells can be performed either in vitro or in vivo.
  • myoblasts fuse to become multinucleated myotubes and mature with muscle fibers.
  • muscle satellite cells that can function as stem cells.
  • myoblasts, muscle satellite cells, myotube cells, myotubes, myofibers, mature myofibers, etc. are collectively referred to as skeletal muscle cells or myocytes.
  • Skeletal muscle refers to muscles other than cardiac muscle and smooth muscle among animal muscles. Skeletal muscle belongs to striated muscle among striated muscle and smooth muscle. Skeletal muscle cells are multinucleated cells, and muscle fibers are made from a large number of myoblasts.
  • Skeletal muscle cells are derived from mesenchymal stem cells. In differentiation in vivo, mesenchymal stem cells differentiate into myoblasts, and myotubes are formed by fusion of many myoblasts.
  • the skeletal muscle cells were obtained from morphological factors such as gene expression, protein expression, multinuclear, and muscle fiber formation of skeletal muscle-specific markers such as Myogenin, creatine kinase muscle (CKM), Myosin heavy chain 3 (MHC3) It can be evaluated by functions such as characteristics and contractility.
  • morphological factors such as gene expression, protein expression, multinuclear, and muscle fiber formation of skeletal muscle-specific markers such as Myogenin, creatine kinase muscle (CKM), Myosin heavy chain 3 (MHC3) It can be evaluated by functions such as characteristics and contractility.
  • Somatic somatic cells may be derived from mammals. When transplanting skeletal muscle cells into a living body, it is preferable to use somatic cells (autologous cells) derived from the transplanted subject in order to reduce the risk of infection, rejection response, and the like.
  • somatic cells autologous cells
  • skeletal muscle cells prepared in advance from somatic cells of another person or another animal can be used for transplantation instead of autologous cells.
  • skeletal muscle cells can be prepared from somatic cells of other people or other animals prepared in advance and used for transplantation. That is, a bank of skeletal muscle cells can be made and used for transplantation purposes.
  • MHC can be typed in advance in order to reduce the risk of a rejection response or the like.
  • the cell characteristics and tumorigenicity of skeletal muscle cells can be confirmed in advance.
  • mammals include mice, rats, hamsters, humans, dogs, cats, monkeys, rabbits, cows, horses, pigs, and the like, and particularly humans.
  • somatic cells to be subjected to the method of the present invention are not particularly limited.
  • somatic cell a somatic cell that can be easily collected from a living body can be used.
  • a MyoD family gene or expression product thereof and a Myc family gene or expression product thereof are introduced into a somatic cell.
  • the “expression product” includes mRNA or protein of MyoD family gene and L-myc gene.
  • microRNA, siRNA, shRNA and DNA expressing them can also be used.
  • Various proteins can also be used in combination. From the viewpoint of the efficiency with which skeletal muscle cells can be obtained and from the viewpoint of convenience, it is preferable to use only two genes, MyoD family gene and Myc family gene, for example, MyoD1 gene and L-myc gene.
  • the MyoD family genes are a group of genes encoding bHLH (basic helix loop helix) transcription factors involved in the control of muscle differentiation.
  • MyoD family genes include MyoD1, Myf5, myogenin, and MRF4.
  • the MyoD family gene is preferably the MyoD1 gene.
  • Myc family genes also encode bHLH (basic helix loop helix) transcription factors.
  • Examples of Myc family genes include c-myc, N-myc, and L-Myc.
  • the Myc family gene is preferably L-Myc.
  • genes are all highly conserved genes in vertebrates, and in this specification, unless the name of an animal is indicated, it means a gene including a homolog. Moreover, even if it is a gene which has a variation
  • the cDNA base sequences of the human (Homo sapiens) MyoD1 gene and the L-myc gene and the amino acid sequence of the protein encoded by them can be found in GenBank provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) as follows: Registered with an accession number of (if multiple revisions are registered, it is understood to refer to the latest revision): Human MyoD1 gene cDNA sequence: NM_002478 (eg, NM_002478.4), Human MyoD1 protein amino acid coordination sequence: NP_002469 (eg, NP_002469.2); Human L-myc gene cDNA sequence: NM_001033081, NM_001033082, NM_005376 (for example, NM_001033081.2, NM_001033082.2, NM_005376.4), Human L-myc protein amino acid coordination sequence: NP_001028253.1, NP_001028254.2, NP_005367.2 (for example
  • the method of the present invention can be carried out in accordance with a known direct reprogramming method except that a specific gene is selected, and can be carried out in accordance with, for example, the method of any of the following documents: 1: Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytesby Defined Factors; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142: 375-386, 2010. 2: Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C.
  • the target gene into one or a plurality of expression vectors, introduce the expression vector into the target somatic cells, and allow expression in the cells.
  • Methods for introducing genes include infecting viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, lentivirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, Sendai virus vectors, and genes and their expression products.
  • viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, lentivirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, Sendai virus vectors, and genes and their expression products.
  • non-viral vectors such as cationic liposomes, cationic polymers, electroporation, etc., plasmid vectors, episomal vectors, and gene transfection products (mRNA, protein) can also be used. it can. It is also possible to introduce mRNA. All these means for gene transfer are comprehensively referred to as a vector in this specification.
  • a viral vector is preferred, and a plasmid is preferred for suppressing the risk of canceration.
  • a gene that serves as a drug selection marker puromycin resistance, blasticidin S resistance, neomycin resistance, hygromycin resistance, etc.
  • a drug selection marker puromycin resistance, blasticidin S resistance, neomycin resistance, hygromycin resistance, etc.
  • the gene of the present invention may be introduced using a plasmid, or a viral vector such as a retroviral vector may be used. From the viewpoint of introduction efficiency and stable retention of the transgene, a viral vector is preferable, and a plasmid is preferable in order to suppress the risk of canceration.
  • a gene introduced into a somatic cell can be transcribed by an LTR promoter, or can be expressed from another promoter in the vector.
  • a constitutive expression promoter such as CMV promoter, EF-1 ⁇ promoter, CAG promoter, or a desired inducible promoter can be used.
  • a chimeric promoter in which a part of the LTR is replaced with another promoter may be used.
  • the transduction factor is a gene expression product (eg protein)
  • eg protein a gene expression product
  • PTD protein-transduction domain
  • mammalian differentiated somatic cells can be cultured in a medium after the introduction of the gene.
  • this is a preferred embodiment when skeletal muscle cells are induced (prepared) in vitro.
  • Culturing can be performed in a suitable container for storing cells and media.
  • suitable culture techniques include a technique of culturing under conditions of about 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of about 5%, but is not limited thereto. Cultivation under the above conditions can be performed using, for example, a known CO 2 incubator.
  • the culture period is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired. For example, it can be about 12 hours to about 1 month, about 1 day to about 3 weeks, and about 3 days to about 2 weeks. If necessary, the medium can be changed.
  • the culture conditions are preferably according to conventional methods.
  • subculture In culture, subculture can be performed as necessary. When subculture is performed, the cells are collected before or immediately after reaching the confluent state, and the cells are seeded in a new medium. In the culture of the present invention, the medium can be changed as appropriate.
  • the medium used in the method of the present invention is not particularly limited.
  • a normal liquid medium such as DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EMEM (Eagle's minimal essential medium), or ⁇ MEM (alpha Modified Minimum Essential Medium) can be used.
  • serum components Fetal Bovine Serum (FBS), Human Serum (HS)
  • antibacterial agents such as streptomycin and penicillin
  • NEAA Non-Essential Amino Acids
  • Growth factors such as IGF-1 can also be added.
  • the “differentiation induction medium for differentiating skeletal muscle cells” refers to a medium containing a component capable of differentiating pluripotent stem cells (ES cells, iPS cells, etc.) into skeletal muscle cells.
  • the differentiation induction medium for differentiating skeletal muscle cells is not particularly limited.
  • myoblast differentiation medium IGF-1 10ng / ml, 100U / mL Penicillin and 100 ⁇ g / ml Streptomycin added 1% Non-Essential Amino Acids (NEAA), 5% Horse Serum added ⁇ MEM medium
  • NEAA Non-Essential Amino Acids
  • Horse Serum added ⁇ MEM medium horse Serum added
  • skeletal muscle cells are derived from somatic cells.
  • the induced skeletal muscle cells have exogenous MyoD family genes and Myc family genes.
  • exogenous refers to an embodiment of a gene or its expression product introduced as a result of the above-described introduction means, which is different from the natural embodiment.
  • a gene whose expression is controlled by a promoter other than a natural promoter, a position on a chromosome other than the natural promoter, or an embodiment of a gene existing outside the chromosome can be mentioned.
  • Skeletal muscle cells may be obtained as a mixture with cells other than skeletal muscle cells (for example, original somatic cells).
  • skeletal muscle cells and cells other than skeletal muscle cells can be separated as necessary.
  • the means for separating is not particularly limited. For example, it can be separated using a cell sorter or magnetic beads.
  • the skeletal muscle cells induced by the present invention can be suitably used, for example, as a transplant material described later.
  • the skeletal muscle cells induced by the present invention can also be used for various researches and technical developments using skeletal muscle cells. For example, it is useful for basic research such as analysis of the effects of skeletal muscle development, differentiation, morphogenesis, mechanical stress on these, nutrition, hormones, and the like.
  • skeletal muscle cells By using the skeletal muscle cells induced by the present invention, skeletal muscle cells can be established easily, quickly and inexpensively from humans and animals having various diseases and genetic backgrounds. Cell abnormalities can be analyzed by biochemical, molecular biological, immunological and other techniques, which can be used for research such as elucidation of the pathogenesis of diseases and development of diagnostic methods. If such skeletal muscle cells are used for drug development, drug toxicity tests, etc., it can be used for the development of new treatments for various diseases.
  • Transplanted material Skeletal muscle cells obtained by the present invention can be used to treat various diseases.
  • the skeletal muscle cells can be provided in the form of a transplant material.
  • the transplant material refers to a material containing skeletal muscle that is introduced into a living body for repair and reconstruction of muscle tissue (particularly muscle fiber).
  • the skeletal muscle cells obtained in the present invention can be used for preparing a transplant material. Skeletal muscle cells themselves can also serve as transplant materials. Therefore, skeletal muscle cells can be transplanted to patients as cell preparations, transplanted with a base material made of artificial material (scaffold (eg, amniotic membrane, biocompatible polymer, etc.)), or transplanted after culturing with scaffold. be able to.
  • treatment intends a treatment performed while a patient is suffering from a particular disease or disorder, whereby the severity of the disease or disorder, or one or It means that a plurality of its symptoms are alleviated or the progression of the disease or disorder is delayed or slowed down.
  • treatment includes “prevention”.
  • the skeletal muscle cells obtained by the present invention can be used not only for treatment of diseases but also for the purpose of beauty and functional enhancement.
  • treatment for humans is also referred to as treatment in this specification for convenience, and “patient” can be read as “healthy person” or “human”, and “disease” can be read as “beauty” or “function”.
  • the present invention can also be used to treat not only humans but also mammals including pets such as dogs and cats and livestock such as cows, horses, pigs, sheep and chickens.
  • pets such as dogs and cats
  • livestock such as cows, horses, pigs, sheep and chickens.
  • “patient” is read as “patient” or “mammal”.
  • compositions As described above, skeletal muscle cells can be induced by introducing a MyoD family gene or an expression product thereof and a Myc family gene or an expression product thereof into a somatic cell. Therefore, the present invention further provides a composition for inducing skeletal muscle cells, which contains a MyoD family gene or an expression product thereof and a Myc family gene or an expression product thereof.
  • the composition for inducing skeletal muscle cells includes a factor used for inducing skeletal muscle cells from somatic cells, and MyoD family gene or its expression product and Myc family gene or its expression product are It is desirable that it be contained in a form that can be introduced into somatic cells. Specific examples of the form in which the gene can be introduced into somatic cells include a vector in which the gene is incorporated.
  • the genes may be incorporated into different vectors, or two or more genes may be incorporated into one vector at the same time.
  • composition can be used, for example, as a medicine (therapeutic agent) in gene therapy.
  • the MyoD family gene or its expression product and the Myc family gene or its expression product By introducing the MyoD family gene or its expression product and the Myc family gene or its expression product into fibroblasts, etc. that exist in the defective site of direct reprogramming skeletal muscle in vivo (in vivo) , Skeletal muscle cells can be induced by direct reprogramming, thereby contributing to the treatment of skeletal muscle damage and skeletal muscle regeneration.
  • the composition of the present invention described above can be preferably used.
  • the induction method of the present invention includes not only in vitro direct reprogramming but also in vivo direct reprogramming as described above.
  • gene therapy for treating various diseases can be performed by such direct reprogramming in vivo .
  • Specific examples of the disease include those described above.
  • Direct reprogramming in vivo is performed in, for example, the following literature, except that the MyoD family gene or its expression product and the Myc family gene or its expression product are introduced into fibroblasts in the damaged part of skeletal muscle. It can be performed in accordance with the described in vivo direct reprogramming to cardiomyocytes.
  • 1 Ieda M. Heart regeneration using reprogramming technology.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2013; 89 (3): 118-28.
  • Review. 2 Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, Bruneau BG, Srivastava D.
  • HDF represents human skin fibroblasts (Human Dermal Fibroblast).
  • FIG. 1 shows an outline of the method.
  • the cDNA coding sequences of MyoD1, L-Myc, c-Myc, Oct4, Klf4, and SOX2 genes were incorporated into the retroviral vector plasmid pMXs.puro using GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kit (Thermo Fisher Scientific).
  • Packaging cells Plat GP cells are suspended in DMEM medium (normal medium) supplemented with 1% NEAA and 10% FBS supplemented with 100 U / mL Penicillin and 100 ⁇ g / ml Streptomycin, and 5 ⁇ 10 6 cells in a gelatin-coated 10 cm culture dish Sowing.
  • the pMXs vector incorporating the above gene was introduced in various combinations with the pCMV VSV vector using X-tremeGENE 9 at the following ratio.
  • aHDF a human normal skin fibroblast cell line
  • the Plat GP culture supernatant was mixed with polybrene (final concentration 4 ⁇ g / mL) after passing through a syringe filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m (virus solution).
  • the culture supernatant of human normal skin fibroblasts was removed by suction, and then a virus solution was added (Day 0).
  • the culture supernatant was removed by aspiration, and myoblast differentiation medium (IGF-1 10ng / ml, 100U / mL Penicillin and 100 ⁇ g / ml Streptomycin added 1% NEAA, 5% Horse Serum-added ⁇ MEM medium) was added. Thereafter, the culture solution was changed once every two days and cultured until Day 14.
  • myoblast differentiation medium IGF-1 10ng / ml, 100U / mL Penicillin and 100 ⁇ g / ml Streptomycin added 1% NEAA, 5% Horse Serum-added ⁇ MEM medium
  • Example 2 ( Figure 2) Measurement of mRNA expression of Myogenin gene and CKM gene in conversion from human normal skin fibroblasts to myoblasts.
  • aHDF Human normal skin fibroblasts
  • Human MyoD1 gene, human Oct4 gene, human Sox2 gene, human Klf gene, human L-Myc gene, and human c-Myc gene were introduced in the combinations described.
  • Rever Tra Ace qPCR RT RT Master Mix 14 days after gene introduction, total RNA was collected, and cDNA was synthesized using Rever Tra Ace qPCR RT RT Master Mix.
  • Real-time PCR Master Mix 14 days after gene introduction, total RNA was collected, and cDNA was synthesized using Rever Tra Ace qPCR RT RT Master Mix.
  • Real-time PCR Master Mix for the purpose of quantifying mRNA levels of Myogenin gene, CKM gene and ⁇ -actin gene, Real-time PCR Master Mix, Taqman pobe, Specific Primer and cDNA are mixed, and AB7300 Real-time PCR sysytem is used. PCR was performed. The values of Myogenin mRNA and CKM mRNA levels relative to the ⁇ -actin mRNA level of each cell were calculated.
  • Example 3 Cells were cultured in a 12-well plate, and the expression of skeletal muscle cell-specific markers (Myogenin, CKM, Dystrophin) was confirmed by fluorescence-immune.
  • Human normal skin fibroblast aHDF was cultured in a 12-well plate and experimented as shown in FIG. 14 days after gene introduction, the culture medium was removed from each well by suction and washed with PBS ( ⁇ ). After fixing with 4% paraformaldehyde and washing 3 times with PBS ( ⁇ ), Blocking One was added and incubated at room temperature for 60 minutes.
  • the primary antibody (anti-CKM antibody, anti-Dystrophin antibody, anti-Myogenin antibody) was reacted at 4 ° C. overnight, and then washed 3 times with Wash buffer.
  • Secondary antibodies Alexa 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody, Alexa 546-conjugated anti-mouse IgG antibody
  • Nuclear staining was performed using fade reagent with DAPI. Images were taken using a fluorescence microscope (Keyence BZ710).
  • Example 4 The cells were cultured in a 12-well plate, and the appearance of multinucleated myotube cells was observed.
  • Human normal dermal fibroblast aHDF was cultured in a 12-well plate and cultured according to the procedure shown in FIG. 14 days after gene introduction, the culture medium was aspirated and removed from each well and washed with PBS ( ⁇ ). After fixing with 4% paraformaldehyde, the plate was washed three times with PBS ( ⁇ ), and nuclear staining was performed using SlowFade Gold anti fade reagent with DAPI manufactured by Life Technology. Images were taken using a fluorescence microscope (Keyence BZ710).
  • Example 5 ( Figure 5) Cells were cultured in 12-well plates and the appearance of multinucleated myotubes was evaluated.
  • Human normal dermal fibroblast aHDF was cultured in a 12-well plate and cultured according to the method shown in FIG. 14 days after gene introduction, the culture medium was aspirated and removed from each well and washed with PBS ( ⁇ ). After fixation with 4% paraformaldehyde, the plate was washed three times with PBS ( ⁇ ), and nuclear staining was performed using SlowFadeGold anti fade reagent with DAPI manufactured by Life Technology. The cells and nuclei were counted by observation with a phase contrast microscope.
  • Example 6 ( Figure 6) Conversion results from normal human skin fibroblasts to myoblasts, measurement results of mRNA expression of Myogenin gene, CKM gene, and MHC3 gene.
  • aHDF Human normal skin fibroblasts
  • Human MyoD1 gene and human L-Myc gene were introduced either alone or simultaneously, and after 14 days, total RNA was recovered, and cDNA was synthesized using Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix.
  • cDNA was synthesized using Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix.
  • Example 7 ( Figure 7) Conversion results from normal human fibroblasts to myoblasts, and DMD mRNA expression over time.
  • aHDF Human normal skin fibroblasts
  • the human MyoD1 gene and the human L-Myc gene were co-introduced, and total RNA was recovered at 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, and 14 days after introduction.
  • CDNA was synthesized using Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix.
  • Real-time RT-PCR is performed using AB7300 Real-time PCR-sysytem with Real-time PCR Master Mix, Taqman pobe, Specific Primer and cDNA mixed for the purpose of quantifying mRNA levels of DMD and ⁇ -actin genes. It was. The value of DMD mRNA level relative to ⁇ -actin mRNA level of each cell was calculated.
  • Example 8 ( Figure 8) Cells into which MyoD1 and L-Myc were introduced were cultured for 7 days, injected and transplanted subcutaneously into the abdomen of mice, sections were prepared from the excised specimens, and immunostaining was performed.
  • Figure 8 shows an overview of the method.
  • the cDNA coding sequence of MyoD1, L-Myc gene was incorporated into the retroviral vector plasmid pMXs.puro using GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kit (Thermo Fisher Scientific).
  • Packaging cells Plat GP cells were suspended in 1% NEAA 10% FBS DMEM (normal medium) containing 100 U / mL Penicillin and 100 ⁇ g / ml Streptomycin, and 5 ⁇ 10 6 cells were seeded on a gelatin-coated 10 cm culture dish.
  • the pMXs vectors containing the above genes were introduced in various combinations with the pCMV VSV vector using X-tremeGENE 9 at the following ratio.
  • human normal dermal fibroblast cell line aHDF was seeded in a 10 cm culture dish at 2.2 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the Plat GP culture supernatant was mixed with polybrene (final concentration 4 ⁇ g / mL) after passing through a syringe filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m (virus solution).
  • the culture supernatant was removed by aspiration, and myoblast differentiation medium (IGF-1 10ng / ml, 100U / mL Penicillin and 100 ⁇ g / ml Streptomycin added 1% NEAA, 5% Horse Serum-added ⁇ MEM medium) was added. Thereafter, the culture solution was changed once every two days and cultured until Day 7.
  • myoblast differentiation medium IGF-1 10ng / ml, 100U / mL Penicillin and 100 ⁇ g / ml Streptomycin added 1% NEAA, 5% Horse Serum-added ⁇ MEM medium
  • the cell solution turbid in Matrigel was injected and transplanted subcutaneously on the right upper abdomen of NOD / SCID mice.
  • Control mice were transplanted with 3 ⁇ 10 5 aHDF cells dissolved in 100 ⁇ L Matrigel (CORNING REF354234) stock solution on ice.
  • the mouse was euthanized, the upper abdominal skin was exfoliated, and the subcutaneous transplanted tissue was removed together with the skin.
  • Fig. 8B shows macroscopic images of the transplanted site and the excised tissue one week after transplantation. Fibrous nodule-like tissue was observed at the site of transplantation of cells into which MyoD1 and L-Myc genes had been introduced.
  • Example 9 (FIG. 9) The tissue extracted in Example 8 was fixed with 4% paraformaldehyde for 24 hours. Then, it was embedded in paraffin over 24 hours to prepare a paraffin block.
  • a thin slice of 3 ⁇ m thickness was prepared from a mouse subcutaneous tissue specimen fixed with paraffin. The section was incubated at 60 ° C. for 15 minutes, then immersed in xylene for 5 minutes, and this was repeated three times. Furthermore, it was immersed in 100% ethanol for 3 minutes, and this was repeated 3 times. Thereafter, it was deparaffinized and washed with distilled water for 5 minutes.
  • BLOXALL was dripped so as to cover the section, and left at room temperature for 10 minutes.
  • the serum was removed by lightly striking the slide on a paper towel.
  • Desmin antibody, anti-CKM antibody, anti-Dystrophin antibody, anti-ACTA antibody, or anti-Myogenin antibody was dropped to cover the section.
  • the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes and washed with PBS for 5 minutes.
  • the PBS was removed by tapping the slide lightly on a paper towel.
  • the ImmPRESS reagent was dropped so as to cover the section, allowed to stand for 30 minutes, washed with PBS twice for 5 minutes, and the slide was lightly struck on a paper towel to remove PBS.
  • ImmPACT DAB Diluent 1ml of ImmPACT DAB Diluent was added, 1 drop of ImmPACT DAB Chromogen Concentrate was added and mixed well by vortexing. The enzyme substrate solution was dropped so as to cover the section, allowed to stand for 30 seconds to 1 minute, and then washed with distilled water for 5 minutes.
  • Washing was further performed twice with distilled water for 5 minutes, and nuclear staining was performed with hematoxylin solution for 5 minutes.
  • the plate was washed with running water for 5 minutes, immersed in a 50 ° C water bath for 2 minutes, and then washed with running water for 2 minutes. After 3 minutes of immersion in 100% ethanol and 3 minutes of immersion in xylene for 3 minutes, dehydration was performed, and then an encapsulant was dropped to cover the section and covered with a cover glass.
  • Example 10 In the same manner as in Examples 8 and 9, both human fibroblasts (aHDFs) into which no gene was introduced or a retroviral vector incorporating the MyoD1 gene and a retroviral vector incorporating the L-Myc gene were infected. After that, the cells cultured for 7 days (dMBs (directly converted myoblasts)) were mixed with Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA) at a volume ratio of 1: 1 and transplanted into the flank of NOG / SCID mice (number of cells). 3-5 ⁇ 10 5 mice / mouse). Seven days later, the tissue at the transplantation site was excised, fixed in 4% paraformaldehyde for 8 h, embedded in paraffin and sliced in the same manner as in Example 9. Immunohistochemistry using an anti-desmin antibody was performed, and observation was performed at 400 times magnification using a fluorescence microscope (Keyence BZ710), and the percentage of desmin-positive cells per visual field was calculated.
  • dMBs directly
  • Example 11 As in Example 1, human fibroblasts were infected with a retroviral vector incorporating the MyoD1 gene (M). Another cell was infected with both a retroviral vector (L) incorporating the L-Myc gene and a retroviral vector (M) incorporating the MyoD1 gene (ML). As a control, cells not infected with the retroviral vector were also prepared (-). These were cultured in a myoblast differentiation medium in the same manner as in Example 1. 14 days after the infection, immunofluorescence staining and nuclear staining using an anti-CKM antibody were performed in the same manner as in Example 3.
  • Example 12 As in Example 1, retrovirus vector (M) incorporating MyoD1 gene, retrovirus vector (L) incorporating L-Myc gene, and retrovirus incorporating c-Myc gene into human fibroblasts. -Vector (C) was infected with the described combination. As a control, cells not infected with the retroviral vector were also prepared (-). These were cultured in a myoblast differentiation medium in the same manner as in Example 1. At 14 days after infection, nuclear staining was performed in the same manner as in Example 3. Images were taken using a fluorescence microscope (Keyence BZ710) (FIG. 12A). The percentage of cells with more than 3 nuclei was also counted (FIG. 12B).
  • Example 13 Similar to Example 12, human fibroblasts were infected with both a retroviral vector incorporating the MyoD1 gene and a retroviral vector incorporating the L-Myc gene (ML). As a control, cells not infected with the retroviral vector were also prepared (-). In some groups, an ERK5 pathway inhibitor, XMD8-92, was added at the indicated concentrations. These were cultured in a myoblast differentiation medium as in Example 12. At 14 days after infection, nuclear staining was performed in the same manner as in Example 3. The image imaged using the fluorescence microscope (Keyence BZ710) is shown (FIG. 13A upper stage). In addition, the percentages of cells having 4 or more nuclei, cells having 2 to 3 nuclei, and cells having 1 nucleus were calculated (bottom of FIG. 13A).
  • fibroblasts without gene transfer were mononuclear cells, but about 40% of the cells infected with ML were cells with 4 or more nuclei, and about 16% were 2-3 cells. It was a cell with a nucleus. However, by adding 2 to 5 ⁇ M of EMD5 inhibitor XMD8-92, cells with 4 or more nuclei are reduced to about 10 to 12%, and cells with 2 to 3 nuclei are about 21 to 23%.
  • Myogenin, CKM, and Dystrophin mRNA were quantified by Real-time RT-PCR.
  • FIG. 13B Induction of the expression of these myoblast-specific genes by ML gene transfer was not suppressed by the addition of XMD8-92. Therefore, it was found that suppression of multinucleation by ERK5 pathway inhibition was not suppression of conversion to myoblasts.
  • Example 14 After the same experiment as in Examples 8 and 9, the tissue section at the transplant site was subjected to immunohistochemistry using an anti-CKM antibody and an anti- ⁇ -actin antibody in the same manner as in Example 10.
  • Example 15 In the same manner as in Example 1, human fibroblasts were infected with both a retroviral vector incorporating the MyoD1 gene and a retroviral vector incorporating the L-Myc gene, and then cultured in a myoblast differentiation medium. Cultured for 10 days (ML). As a control, human fibroblasts without gene transfer were also used (-). The mRNA expression of UCP1 gene and CIDEA gene as brown adipocyte markers, SOX9 gene and aggrecan gene as chondrocyte markers, and Runx2 gene and osteocalcin gene as osteoblast markers were measured by real time RT-PCR.
  • Example 16 In the same manner as in Example 1, retrovirus vector (M) incorporating MyoD1 gene, retrovirus vector (L) incorporating L-Myc, and retrovirus incorporating c-Myc into human fibroblasts.
  • Vector (C) was infected with M alone, a combination of MC and ML as described in the figure.
  • cells not infected with the retroviral vector were also prepared (-). These were cultured in a myoblast differentiation medium in the same manner as in Example 1. 14 days after infection, the cells were stained with 200 nM MitoTracker Red probe (Invitrogen) at 37 ° C. for 15 minutes. Images were taken using a fluorescence microscope (Keyence BZ710).
  • Results are shown in FIG.
  • the upper photo is a phase contrast image
  • the lower photo is a fluorescent image.
  • cells co-introduced with MC have more mitochondria
  • cells co-introduced with ML have more mitochondria. Had.
  • Example 17 Human fibroblasts were infected with both a retroviral vector incorporating the MyoD1 gene and a retroviral vector incorporating the L-Myc gene, and then cultured for 6 days (ML). As a control, human fibroblasts without gene transfer were also used (-). Immunostaining with anti-desmin antibody or anti-CKM antibody and nuclear staining with DAPI were performed as described.
  • Results are shown in FIG.
  • the upper photo is a phase contrast image
  • the lower photo is a fluorescent image. It can be seen that ML-transfected cells express the myoblast-specific genes Desmin and CKM even after a relatively short-term culture of 6 days after gene introduction.
  • Example 18 As in Example 1, human fibroblasts were infected with a retroviral vector incorporating the MyoD1 gene. (M), and both a retroviral vector (L) incorporating the L-Myc gene and a retroviral vector incorporating the MyoD1 gene were infected (ML). These were cultured in myoblast differentiation medium, and RNA was extracted from each cell 14 days after infection. As controls, RNA was also extracted from cells that were not infected with retroviral vectors (-) and primary human skeletal muscle cells (pSKMS). These RNAs were subjected to DNA microarray analysis using GeneChip human Gene 1.0 ST (Affymetrix).
  • FIG. 18A A gene group involved in skeletal muscle development (FIG. 18A), a gene group involved in skeletal muscle contraction (FIG. 18B), a gene group related to myosin filaments (FIG. 18C), and a gene group related to actin filaments (FIG. 18D) Shows the results of heat map and clustering analysis.
  • ML-transfected cells had the highest homology with pSKMS and low homology with fibroblasts.
  • M-introduced cells were more homologous to fibroblasts than pSKMS.
  • Example 19 As in Example 1, human fibroblasts were infected with both a retroviral vector incorporating the MyoD1 gene and a retroviral vector incorporating the L-Myc gene (ML), and myoblast differentiation medium In culture. Every two days after infection, the cells were stained with rBC2LCN-FITC (Wako 180-02991), and the cell nuclei were stained with Hoechst33342. As a control, cells before the retrovirus vector infection (leftmost) were similarly stained. As a positive control, human iPS cells (hiPS235G1) were similarly stained. These cells were imaged using a fluorescence microscope (Keyence BZ710).
  • the results are shown in FIG.
  • the upper photo is a phase contrast image
  • the lower photo is a fluorescent image. Since fibroblasts are not stained with rBC2LCN-FITC even when ML is infected, fibroblast-to-myoblast conversion by ML gene transfer may not go through iPS cell-like stem cells on the way. Recognize.
  • Example 20 The MyoD1 gene and L-Myc gene were each introduced into the plasmid vector pCX to construct an expression vector.
  • Human fibroblasts (HDFs) were transfected with MyoD1 plasmid alone or both MyoD1 plasmid and L-Myc plasmid by electroporation and cultured in myoblast differentiation medium for 14 days.
  • RNA was extracted from these cells and fibroblasts (HDF) into which no gene was introduced as a control, and mRNA of Myogenin gene and CKM gene was quantified by real time RT-PCR. The results are shown in FIG.
  • MyoD1 + L-Myc gene transfer can induce the conversion from fibroblasts to myoblasts even by transfection using a plasmid vector.

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Abstract

哺乳動物の体細胞に、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を導入する工程を含む、骨格筋細胞を誘導する方法を提供する。

Description

骨格筋細胞及びその誘導方法
　本発明は、主に、骨格筋細胞及びその誘導方法に関し、詳しくはダイレクト・リプログラミングによる骨格筋細胞の誘導方法に関する。
　筋肉は動物の運動に必須の組織であり、収縮能をもつ繊維状の多核細胞から構成されている。骨格筋の分化誘導において、単核の筋芽細胞が分化しつつ融合し多核の筋細胞が形成される。骨格筋の分化誘導は、MyoDファミリーやMEF2ファミリーなどの転写因子により制御されていることが知られている。
　横隔膜全欠損などの筋の先天異常、筋ジストロフィなどの筋の遺伝疾患、高度外傷や外科治療にともなう筋の欠損などの疾患に対して、筋を再生して移植できれば有効な新規再生医療になる可能性がある。
　マウス線維芽細胞に、骨格筋特異的な転写因子、MyoDファミリーの遺伝子を導入すると、筋芽細胞様の細胞が誘導できることは以前から知られている。しかし、ヒトの線維芽細胞ではMyoDファミリーの遺伝子を導入してもマウスと同程度に筋芽細胞は誘導できないという問題があった。
Davis RL, Weintraub H, Lassar AB. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.Cell. 1987 Dec 24; 51(6):987-1000.
　本発明は、筋の欠損を伴う疾患などに対する治療に応用可能な骨格筋細胞を誘導する方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、哺乳動物の体細胞にMyoD遺伝子及びL-myc遺伝子を組み合わせて導入することで、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞を経由することなく、直接（ダイレクト・リプログラミングにより）骨格筋細胞が得られることを見出した。本発明は係る斯かる発見に基づき、更なる検討を重ねて完成したものである。
　本発明は、以下の発明を包含する。
　項１、哺乳動物の体細胞に、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を導入する工程を含む、骨格筋細胞を誘導（調製）する方法。
　項２、前記体細胞が線維芽細胞である、項１に記載の方法。
　項３、前記体細胞が、ヒトの体細胞である、項１に記載の方法。
　項４、MyoDファミリー遺伝子がMyoD1遺伝子であり、Mycファミリー遺伝子がL-myc遺伝子である、項１又は２に記載の方法。
　項５、哺乳動物の体細胞に由来し、外来性のMyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を有す骨格筋細胞。
　項６、項１～４のいずれか１項に記載の方法により得られる、請求項５に記載の骨格筋細胞。
　項７、項１～４のいずれか１項に記載の方法で得られる細胞、又は、項４に記載の骨格筋細胞を含む、骨格筋の欠損、不足若しくは機能低下に基づく疾患を治療するための、移植材料。
　項８、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を含む、骨格筋細胞を誘導（調製）するための組成物。
　本発明によれば、ダイレクト・リプログラミングにより体細胞から短期間で骨格筋細胞を調製することができる。この骨格筋細胞は、移植する本人の体細胞から容易に誘導できるので、得られた骨格筋細胞を移植した場合にも免疫学的な拒絶応答などの問題は生じない。また、iPS細胞やES細胞を経由することなく直接体細胞から骨格筋細胞を誘導できるため、癌化などの多能性幹細胞に起因する問題を回避できる。
実験方法の概要を示す。 Myogenin遺伝子およびCKM遺伝子のmRNA発現計測結果を示す。 蛍光免染の結果を示す（CKM）。 蛍光免染の結果を示す（Dystrophin）。 蛍光免染の結果を示す（Myogenin）。 多核の筋管細胞の出現の観察結果を示す。 多核の筋管細胞の出現を評価結果を示す。 Myogenin遺伝子、CKM遺伝子及びMHC3遺伝子のmRNA発現計測結果を示す。 DMD遺伝子のmRNA発現の経時的計測結果を示す。 実施例８の手法の概要を示す。 移植1週間後の移植部位と摘出した組織のmacroscopic imagesを示す。 線維芽細胞を移植した組織の免疫組織化学染色の結果を示す。パラフィン切片、×２００倍拡大。 MyoD1とL-Mycとを導入した細胞を移植した組織の免疫組織化学染色の結果を示す。パラフィン切片、×２００倍拡大。 デスミン陽性細胞の測定結果を示す。値は平均値±標準偏差。各群N=3 mice。＊P<0.05 vs. 非導入細胞移植群。 CKM陽性細胞の測定結果を示す。値は平均値±標準偏差。各群N=3ウェル。＊P<0.05 vs. 非導入細胞。 （Ａ）核染色の結果を示す。（Ｂ）３個よりも多くの核を有する細胞数の総細胞数に対するパーセンテージの測定結果を示す。 （Ａ）多核細胞の出現の測定結果を示す。（Ｂ）Myogenin遺伝子、CKM遺伝子及びDystrophin遺伝子のmRNA発現計測結果を示す。 細胞を移植した組織の免疫組織化学染色の結果を示す。 各種マーカー遺伝子のmRNA発現計測結果を示す。値は平均値±標準偏差。各群N=3。＊P<0.05 vs. 非導入細胞。 ミトコンドリア（MitoTracker Red）の検出結果を示す。 Desmin及びCKMの蛍光免染の結果を示す。 骨格筋の発生に関与する遺伝子群のヒートマップとクラスタリング解析の結果を示す。 骨格筋の収縮に関与する遺伝子群のヒートマップとクラスタリング解析の結果を示す。 ミオシンフィラメントに関する遺伝子群のヒートマップとクラスタリング解析の結果を示す。 アクチンフィラメントに関する遺伝子群のヒートマップとクラスタリング解析の結果を示す。 rBC2LCN-FITCの染色の結果を示す。 Myogenin遺伝子及びCKM遺伝子のmRNA発現計測結果を示す。
　本発明は、哺乳動物の分化した体細胞を骨格筋細胞にコンヴァートすることで、骨格筋細胞を誘導する方法に関する。「コンヴァート」とは、体細胞を目的の骨格筋細胞へと変換することを意味する。本発明の方法の好ましい態様の１つは、「ダイレクトリプログラミング」、「ダイレクトコンヴァージョン」ともよばれる、iPS細胞の作製に代表される細胞の初期化の工程を経ることなく、体細胞を骨格筋細胞にコンヴァートする方法である。
　骨格筋細胞への誘導は、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）のいずれでも行うことができる。
　正常の骨格筋の発生過程においては、筋芽細胞が融合して多核の筋管細胞となり、さらに筋繊維と成熟する。また、正常な骨格筋組織には幹細胞として機能しうる筋サテライト細胞が存在する。本明細書では、筋芽細胞、筋サテライト細胞、筋管細胞、筋管、筋繊維、成熟筋繊維等を総称して骨格筋細胞または筋細胞と呼ぶ。
　骨格筋とは、動物の筋肉のうち心筋と平滑筋以外の筋肉をいう。骨格筋は、横紋筋及び平滑筋のうち、横紋筋に属する。骨格筋細胞は多核細胞であり、多数の筋芽細胞から筋繊維がつくられる。
　骨格筋細胞は間葉系幹細胞に由来する。生体内の分化においては、間葉系幹細胞が筋芽細胞へと分化し、筋芽細胞が多数融合することで筋管細胞が形成される。
　骨格筋細胞が得られたことは、Myogenin、creatine kinase muscle (CKM)、Myosin heavy chain 3（MHC3）などの骨格筋特異的マーカーの遺伝子発現やタンパク質発現、多核、筋繊維の形成などの形態的特徴、収縮能などの機能等により評価することができる。
　体細胞
　体細胞は、哺乳動物由来であればよい。骨格筋細胞を生体に移植する場合には、移植される被験体由来の体細胞(自家細胞)を用いることが、感染や拒絶応答等の危険を低減させるために好ましい。しかしながら、筋の欠損などに対して移植するなどの目的の場合、自家細胞でなく、他人や他の動物の体細胞からあらかじめ準備しておいた骨格筋細胞を移植に用いることができる。またはあらかじめ準備しておいた他人や他の動物の体細胞から骨格筋細胞を作り、移植に用いることができる。すなわち、骨格筋細胞のバンクを作っておき移植目的に供することができる。このような場合、拒絶応答等の危険を低減させるために、あらかじめMHCをタイピングしておくことができる。また、あらかじめ骨格筋細胞の細胞特性や造腫瘍性などを確認しておくことができる。
　本明細書において、哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタなどが挙げられ、特にヒトが挙げられる。
　本発明の方法（ダイレクト・リプログラミング）の対象となる体細胞としては、特に限定されるものではない。
　体細胞は、容易に生体より採取できる体細胞を使用することができる。例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、口腔粘膜上皮細胞、鼻腔粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞、胃粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、歯肉細胞（歯肉線維芽細胞、歯肉上皮細胞）、歯髄細胞、歯根膜細胞、骨髄細胞、骨髄由来間質細胞、白血球、リンパ球、結膜上皮細胞、破骨細胞などが挙げられ、好ましくは線維芽細胞、ケラチノサイト、口腔粘膜上皮細胞、歯肉細胞、白血球、リンパ球などが挙げられる。本発明において、生体から採取した上記の細胞を用いることが好ましい。
　遺伝子若しくはその発現産物
　本発明の方法では、体細胞にMyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を導入する。ここで、「発現産物」としては、MyoDファミリー遺伝子及びL-myc遺伝子のmRNA又はタンパク質が挙げられる。
　本発明の方法において、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物に加えて、マイクロRNA、siRNA、shRNAやそれらを発現するDNAを併せて使用することもできる。また、種々のタンパク質を併せて使用することもできる。骨格筋細胞を得ることができる効率の観点、及び簡便性の観点から、MyoDファミリー遺伝子及びMycファミリー遺伝子の２遺伝子、例えばMyoD1遺伝子及びL-myc遺伝子の２遺伝子のみを使用することが好ましい。
　MyoDファミリー遺伝子は、筋肉の分化の制御に関与するbHLH（basic helix loop helix）型転写因子をコードする一群の遺伝子である。MyoDファミリー遺伝子としては、MyoD1、Myf5、myogenin、MRF4が挙げられる。本発明において、MyoDファミリー遺伝子は好ましくはMyoD1遺伝子である。
　Mycファミリー遺伝子も、bHLH（basic helix loop helix）型転写因子をコードする。Mycファミリー遺伝子としては、c-myc、N-myc、L-Mycが挙げられる。本発明において、Mycファミリー遺伝子は好ましくはL-Mycである。
　上記遺伝子は、いずれも、脊椎動物で高度に保存されている遺伝子であり、本明細書では、特に動物名を示さない限り、ホモログを含めた遺伝子を表すものとする。また、polymorphism（多型）を含め、変異を有する遺伝子であっても、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する遺伝子もまた、含まれるものとする。
　例えば、ヒト（Homo sapiens）のMyoD1遺伝子、L-myc遺伝子のcDNA塩基配列及びこれがコードするタンパク質のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（NCBI; National Center for Biotechnology Information）が提供するGenBankに、下記のアクセッション番号で登録されている（複数のリビジョン（revision）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）：
　ヒトMyoD1遺伝子cDNA配列：NM_002478（例えば、NM_002478.4）、
　ヒトMyoD1タンパク質アミノ酸配位列：NP_002469（例えば、NP_002469.2）；
　ヒトL-myc遺伝子cDNA配列：NM_001033081、NM_001033082、NM_005376（例えば、NM_001033081.2、NM_001033082.2、NM_005376.4）、
　ヒトL-mycタンパク質アミノ酸配位列：NP_001028253.1、NP_001028254.2、NP_005367.2（例えば、NP_001028253、NP_001028254、NP_005367）。
　導入
　本発明の方法は、特定の遺伝子を選択する以外は、公知のダイレクト・リプログラミングの手法に準じて行うことができ、例えば以下のいずれかの文献の方法に準じて行うことができる：
1: Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytesby Defined Factors; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142: 375-386, 2010.
2: Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof& Marius Wernig. Nature 46
3: 1035-1041, 20103: Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476: 220-223, 2011.
4: Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outani, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121: 640-657, 2011.
5: Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui, . Nature 475:386-389, 2011.
6: Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475:390-393, 2011.
7: Direct conversion of human fibroblasts into functional osteoblasts by defined factors. Yamamoto K, Kishida T, Sato Y, Nishioka K, Ejima A, Fujiwara H, Kubo T, Yamamoto T, Kanamura N & Mazda O. Proc Natl Acad Sci USA. 112:6152-6157, 2015.
8: Reprogrammed Functional Brown Adipocytes Ameliorate Insulin Resistance and Dyslipidemia in Diet-Induced Obesity and Type 2 Diabetes. Kishida T, Ejima A, Yamamoto K, Tanaka S, Yamamoto T, Mazda O. Stem Cell Reports. 5: 569-581, 2015.
9: Generation of directly converted human osteoblasts that are free of exogenous gene and xenogenic protein. Yamamoto K., Sato Y., Honjo K., Ichioka H., Oseko F., Sowa Y., Yamamoto T., Kanamura N., Kishida T., Mazda O. J Cell Biochem 117:2538-2545, 2016 .
10: 国際公開公報WO2014/010746号
　上記の文献１～１０の内容は本明細書に参考として援用される。
　具体的には、目的遺伝子を、１又は複数の発現ベクターに組み込み、対象とする体細胞に発現ベクターを導入し、細胞内で発現させることが好ましい。
　遺伝子を導入する方法としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルス性ベクターを感染させる方法のほか、遺伝子とその発現産物の導入の場合には、カチオニック・リポソーム、カチオニック・ポリマー、電気穿孔法等の非ウイルスベクターで、プラスミドベクターやエピゾーマルベクター、遺伝子の発現産物（mRNA、タンパク質）をトランスフェクションする方法も用いることができる。また、mRNAを導入することもできる。これら遺伝子導入に用いる手段をすべて包括して、本明細書ではベクターと呼ぶ。
　導入効率と導入遺伝子の安定保持の観点からはウイルスベクターが好ましく、癌化のリクを抑えるためにはプラスミドが好ましい。
　また、目的の遺伝子とともに薬剤選択マーカーとなる遺伝子（ピューロマイシン耐性、ブラストサイジンS耐性、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性など）を導入し、その後薬剤選択を行うことによって、目的遺伝子を発現する細胞を選択してから用いることができる。
　本発明の遺伝子の導入は、プラスミドで行ってもよく、ウイルスベクター、たとえばレトロウイルスベクターを用いてもよい。導入効率と導入遺伝子の安定保持の観点からはウイルスベクターが好ましく、癌化のリスクを抑えるためにはプラスミドが好ましい。
　体細胞に導入される遺伝子はLTRプロモーターにより転写させることもできるし、ベクター内部の別のプロモーターから発現させてもよい。例えばCMVプロモーター、EF-1αプロモーター、CAGプロモーターなどの構成的発現プロモーター、または所望の誘導性プロモーターを利用することができる。また、LTRの一部を他のプロモーターに置換したキメラプロモーターを利用してもよい。
　また、導入因子が遺伝子の発現産物(例えばタンパク質)の場合には、Protein Transduction Domain（PTD）と呼ばれるペプチドなどを発現産物である蛋白質に結合させ、培地に添加することにより、体細胞内に導入してもよい。
　培養
　本発明の方法において、哺乳動物の分化した体細胞を、遺伝子の導入後、培地中で培養することができる。例えば、インビトロで骨格筋細胞を誘導（調製）する場合の好適な態様である。
　培養は、細胞及び培地を格納するための適切な容器中で行なうことができる。好適な培養を行なう手法として、約37℃程度および二酸化炭素濃度約5％程度の条件下で培養する手法が例示されるが、これに限定されるものではない。上記条件での培養は、例えば公知のCO2インキュベータを用いて行なうことができる。
　培養を行う期間は、本発明の効果を損なわない範囲で、特に限定されるものではない。例えば、12時間～１ヶ月程度、1日～３週間程度、３日間～２週間程度とすることができる。必要に応じて、培地交換を行うことができる。培養条件は、常法に準じることが好ましい。
　培養において、必要において継代を行うことができる。継代を行う場合は、コンフルエント状態に到達する前または直後に細胞を回収し、細胞を新しい培地に播種する。また、本発明の培養において、培地を適宜交換することもできる。
　培地
　本発明の方法で用いる培地は、特に限定されない。DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、EMEM（Eagle's minimal essential medium）、αMEM（alpha Modified Minimum Essential Medium）などの通常の液体培地を用いることができる。必要に応じて、血清成分（Fetal Bovine Serum（FBS）、Human Serum（HS））、ストレプトマイシン、ペニシリンなどの抗菌薬、Non-Essential Amino Acids（NEAA）等の成分を添加することができる。
　IGF-1などの成長因子を添加することもできる。
　本発明の方法により骨格筋細胞を調製できる効率が高いとの観点から、培地として骨格筋細胞を分化させるための分化誘導培地を用いることが好ましい。「骨格筋細胞を分化させるための分化誘導培地」とは、多能性幹細胞（ES細胞、iPS細胞など）を骨格筋細胞へと分化させることができる成分を含む培地を指す。
　骨格筋細胞を分化させるための分化誘導培地としては、特に限定されない。例えば、筋芽細胞分化用培地（IGF-1 10ng/ml、100U/mL Penicillinと100μg/ml Streptomycinを加えた1% Non-Essential Amino Acids（NEAA）、5%Horse Serum添加αMEM培地）が挙げられる。しかしこれらに限定されない。
　誘導（調製）
　かくして、体細胞から骨格筋細胞が誘導される。
　誘導された骨格筋細胞は、ある態様においては、外来性のMyoDファミリー遺伝子及Mycファミリー遺伝子を有する。ここで、「外来性」とは、主に上記の導入手段の結果導入された遺伝子又はその発現産物の態様であって、天然の態様とは異なる態様を指す。例えば、天然のプロモーター以外のプロモーターに発現を制御される遺伝子、天然以外の染色体上の位置、若しくは、染色体外に存在する遺伝子の態様などが挙げられる。
　骨格筋細胞は、骨格筋細胞以外の細胞（例えば、元の体細胞。）との混合物として得られる場合がある。このような場合、骨格筋細胞と骨格筋細胞以外の細胞とを、必要に応じて、分離することができる。分離をするための手段は特に限定されない。例えば、セルソーターやマグネティックビーズを用いて分離することができる。
　本発明により誘導された骨格筋細胞は、例えば、後述の移植材料として好適に用いることができる。
　本発明により誘導された骨格筋細胞はまた、骨格筋細胞を用いたさまざまな研究や技術開発等に用いることができる。例えば、骨格筋の発生、分化、形態形成の機構、これらに対する力学的ストレス、栄養、ホルモンなどの影響の解析などの基礎研究に有用である。
　本発明により誘導された骨格筋細胞を用いれば、さまざまな疾患や遺伝的背景を有するヒトや動物から簡便、迅速、安価に骨格筋細胞を樹立できるので、疾患や遺伝的背景に関連した骨格筋細胞の異常を生化学的、分子生物学的、免疫学的等手法により解析することが可能であり、これにより疾患の発症機序の解明などの研究や診断法の開発に役立てることができる。またこのような骨格筋細胞を用いて、薬剤の開発、薬剤の毒性試験等を行えば、種々の疾患に対する新規治療法の開発に役立てることができる。
　移植材料
　本発明により得られる骨格筋細胞は、種々の疾患を治療するために用いることができる。この場合、骨格筋細胞は移植材料の形態で提供されうる。
　移植材料とは、筋組織（特に、筋繊維）の修復、再建のために生体内に導入する、骨格筋を含有する材料をいう。本発明で得られた骨格筋細胞は、移植材料の作製に使用することができる。骨格筋細胞自体も移植材料になる。したがって、骨格筋細胞を細胞製剤として患者に移植することもできるし、人工材料からなる基材（スキャホルド（例えば、羊膜、生体適合ポリマーなど））とともに移植したり、スキャホルドとともに培養してから移植することができる。
　上記の治療する対象となる疾患としては、
外傷や損傷による筋損傷、サルコペニア、先天性横隔膜ヘルニア、臍帯ヘルニア、腹壁破裂、臍ヘルニア、腹部手術後の腹壁瘢痕ヘルニアなどの骨格筋細胞の欠損、不足に基づく疾患；
プルーンベリー症候群、ポーランド症候群、直腸肛門奇形（鎖肛）、鼠径ヘルニア、長期臥床後の廃用症候群などの骨格筋の機能低下に基づく疾患；
皮膚筋炎・多発筋炎、封入体筋炎、ウイルス感染に伴う筋炎、マイコプラズマ感染に伴う筋炎などの炎症性筋疾患；
糖原病II型（Pompe病）、糖原病III型、糖原病V型（McArdle病）、糖原病VII型（垂井病）などの代謝性筋疾患；
筋ジストロフィ、ミオパチー、重症筋無力症、先天性筋無力症候群、ミトコンドリア病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、その他の筋疾患
などが挙げられる。
　本明細書において、特に明示のない限り、「治療」という用語は、患者が特定の疾患又は障害を患っている間に行う処置を意図し、これによって疾患若しくは障害の重症度、又は１つ若しくは複数のその症状が軽減されるか、又は疾患若しくは障害の進行が遅延又は減速することを意味する。本明細書において、「治療」には「予防」を含むものとする。
　本発明で得られる骨格筋細胞はまた、疾患の治療に限らず、美容や機能増強の目的で用いることもできる。その際、ヒトに対する処置も、本明細書では便宜上治療と呼び、「患者」は「健常者」あるいは「ヒト」、「疾患」は「美容」若しくは「機能」と読み替えることができる。
　本発明はまた、ヒトだけでなく、イヌ、ネコ等の愛玩動物やウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ等の家畜を含む哺乳動物の疾患の治療にも用いることが可能である。その場合、「患者」を「患畜」あるいは「哺乳動物」と読み替えることとする。
　組成物
　前述するように、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を体細胞に導入することにより、骨格筋細胞を誘導できる。従って、本発明は、さらに、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を含む、骨格筋細胞を誘導するための組成物を提供する。当該骨格筋細胞を誘導するための組成物は、体細胞から骨格筋細胞を誘導するために使用される因子を含むものであり、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物が体細胞に導入可能な形態で含まれていることが望ましい。上記遺伝子が体細胞に導入可能な形態として、具体的には、上記遺伝子が組み込まれたベクターが例示される。ここで、上記遺伝子は、各々別のベクターに組み込まれていてもよく、１つのベクターに２種以上の遺伝子が同時に組み込まれていてもよい。
　使用することができるベクターの種類等については、前述の通りである。
　上記組成物は、例えば遺伝子治療における医薬（治療薬）として使用することができる。
　インビボ（in vivo）でのダイレクト・リプログラミング
　骨格筋の欠損部位に存在する線維芽細胞などに、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を導入することで、当該損傷部位において骨格筋細胞をダイレクト・リプログラミングによって誘導し、もって骨格筋損傷の治療や骨格筋の再生に寄与することができる。MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物の導入においては、上記の本発明の組成物を好適に使用することができる。
　本発明の誘導方法は、インビトロ（in vitro）でのダイレクト・リプログラミングに加えて、上記のようなインビボ（in vivo）でのダイレクト・リプログラミングをも包含すると理解される。このようなインビボ（in vivo）でのダイレクト・リプログラミングにより、たとえば種々の疾患を治療するための遺伝子治療を行うことができる。疾患の具体例としては、上記に記載のものが挙げられる。
　インビボ（in vivo）でのダイレクト・リプログラミングは、骨格筋の損傷部の線維芽細胞に、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を導入する以外は、例えば下記の文献に記載のインビボ（in vivo）での心筋細胞へのダイレクト・リプログラミングに準じて行うことができる。
1: Ieda M. Heart regeneration using reprogramming technology. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2013;89(3):118-28. Review.
2: Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, Bruneau BG, Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 2010 Aug 6;142(3):375-86.
3: Qian L, Huang Y, Spencer CI, Foley A, Vedantham V, Liu L, Conway SJ, Fu JD, Srivastava D. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 2012 May 31;485(7400):593-8。
　上記の文献１～３の内容は本明細書に参考として援用される。
　以下に実施例を示すが、本発明はこの実施例だけに限定されるものではない。
　実施例中、HDFはヒト皮膚線維芽細胞（Human Dermal Fibroblast）を示す。
　実施例1（図1）
　図１に手法の概要を示す。レトロウイルスベクタープラスミドpMXs.puroに、MyoD1, L-Myc, c-Myc, Oct4, Klf4, 及びSOX2遺伝子のcDNAコーディング配列を、GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kit(Thermo Fisher Scientific）を用いて組み込んだ。パッケージング細胞 Plat GP細胞を、100U/mL Penicillinと100μg/ml Streptomycinを加えた1% NEAA 、10% FBS添加 DMEM培地（通常培地）に縣濁し、ゼラチンコートした10cm培養ディシュに5×106 個播種した。
　24時間培養後、上記の遺伝子を組み込んだpMXsベクターを、種々の組み合わせで、pCMV VSVベクターと伴に、X-tremeGENE 9を用いて以下の比で導入した。
　すなわち導入遺伝子5μg、pCMV.VSV 2.5μg、Opti-MEM 500μl、X-tremeGENE 9 22.5μlの混和液を10mlの培地入りの10cmディッシュに添加した。
　24時間後、抗生剤を含まない通常培地に交換。同日に、ヒト正常皮膚線維芽細胞株であるaHDFを、2.2×106cells/mLで10cm培養ディッシュに播種した。
　24時間後、Plat GP培養上清を、ポアの直径が0.45μmのシリンジフィルターを通した後、ポリブレン（最終濃度4μg/mL）と混和した（ウイルス液）。
　ヒト正常皮膚線維芽細胞(aHDF)の培養上清を吸引除去した後、ウイルス液を添加した（Day 0）。
　24時間培養して感染させた後、培養上清を吸引除去し、筋芽細胞分化用培地（IGF-1 10ng/ml、100U/mL Penicillinと100μg/ml Streptomycinを加えた1% NEAA、5%Horse Serum添加αMEM培地）を加えた。その後、培養液を2日に1回交換しDay14まで培養した。
　実施例2（図2）
　ヒト正常皮膚線維芽細胞から筋芽細胞へのコンバージョンにおける、Myogenin遺伝子およびCKM遺伝子のmRNA発現計測結果。
　ヒト正常皮膚線維芽細胞(aHDF)を、12wellプレートに播種し、図１の手法に従い培養を行った。
　ヒトMyoD1遺伝子、ヒトOct4遺伝子、ヒトSox2遺伝子、ヒトKlf遺伝子、ヒトL-Myc遺伝子、ヒトc-Myc遺伝子を記載の組み合わせで導入した。
　遺伝子導入14日後にtotal RNAを回収し、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。Myogenin遺伝子、CKM遺伝子とβアクチン遺伝子のmRNAレベルを定量する目的で、Real-time PCR Master Mix、Taqman pobe、Specific PrimerおよびcDNAを混和し、AB7300 Real-time PCR sysytemを用いてReal-time RT-PCRを行った。各細胞のβアクチンmRNAレベルに対するMyogenin mRNAおよびCKM mRNAレベルの値を計算した。
　結果を図２に示す。MyoD1とL-Myc, の2つの遺伝子を導入した細胞は、controlと比較し、遺伝子レベルにおいて骨格筋細胞特異的マーカーであるMyogenin遺伝子、CKM遺伝子をもっとも強力な発現を認めた。またヒトMyoD1遺伝子、ヒトL-Myc遺伝子の両方の遺伝子を導入した群のみ、プライマリーのヒト骨格筋細胞（pSKM）と同等の発現を示した。
　実施例3 (図3)
　12wellプレートで細胞培養し、骨格筋細胞特異的マーカー(Myogenin, CKM、Dystrophin)の発現を蛍光免染で確認した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、図１のように実験した。遺伝子導入14日後に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（－）にて3回洗浄した後、Blocking Oneを加えて、室温で60分間インキュベートした。
　一次抗体（抗CKM抗体、抗Dystrophin抗体、抗Myogenin抗体）を4℃　over nightで反応させた後、Wash bufferにて3回洗浄した。二次抗体（Alexa 488-conjugated anti-rabbit IgG抗体、Alexa 546-conjugated anti-mouse IgG抗体）を室温で1時間反応させた後、Wash bufferにて3回washし、ライフテクノロジー社製のSlowFadeGold anti fade reagent with DAPIを用いて核染色を行った。蛍光顕微鏡（Keyence BZ710）を用いて撮像した。
　結果を図３－１、３－２、３－３に示す。MyoD1のみを導入した細胞よりも、MyoD1とLMycを導入した細胞がCKM、DMD、Myogeninはより強く陽性となった。
　また、MyoD1とLMycを導入した細胞はプライマリーのヒト筋芽細胞よりもCKM,DMD,Myogeninにおいてより強く染まった。
　実施例4 (図4)
　12wellプレートで細胞培養し、多核の筋管細胞の出現を観察した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、図１の手法に従い培養を行った。遺伝子導入14日後、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（－）にて3回洗浄し、ライフテクノロジー社製のSlowFadeGold anti fade reagent with DAPIを用いて核染色を行った。蛍光顕微鏡（Keyence BZ710）を用いて撮像した。MyoD1とL-Mycを共導入した群では、多核の筋管細胞が高頻度に観察された。L-Myc またはc-Myc遺伝子をMyoD1遺伝子と共導入すると、細胞融合が亢進することがわかる。
　実施例5 (図5)
　12wellプレートで細胞培養し、多核の筋管細胞の出現を評価した。
　ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、図１の手法に従い培養を行った。遺伝子導入14日後、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（－）にて3回洗浄し、ライフテクノロジー社製のSlowFadeGold anti fade reagent with DAPIを用いて核染色を行った。位相差顕微鏡で観察し、細胞と核をカウントした。
　結果を図５に示す。MyoD1とL-Mycを導入した群では、３個より多く（４個以上の）核を有する筋管細胞が高頻度に出現した。
　実施例6（図6）
　ヒト正常皮膚線維芽細胞から筋芽細胞へのコンバージョン、Myogenin遺伝子、CKM遺伝子、MHC3遺伝子のmRNA発現計測結果。
　ヒト正常皮膚線維芽細胞(aHDF)を、12wellプレートに培養し、図１と同様の手法より培養を行った。
　ヒトMyoD1遺伝子、ヒトL-Myc遺伝子、を単独あるいは、２遺伝子同時に導入し14日後にtotal RNAを回収し、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。Myogenin遺伝子、CKM遺伝子、MHC3遺伝子とβアクチン遺伝子のmRNAレベルを定量する目的で、Real-time PCR Master Mix、Taqman pobe、Specific PrimerおよびcDNAを混和し、AB7300 Real-time PCR sysytemを用いてReal-time RT-PCRを行った。各細胞のβアクチンmRNAレベルに対するMyogenin mRNAおよびCKM mRNAレベルの値を計算した。
　結果を図6に示す。MyoD1とL-Myc, の2つの遺伝子を導入した細胞は、controlと比較し、遺伝子レベルにおいて骨格筋細胞特異的マーカーであるMyogenin遺伝子、CKM遺伝子、MHC3遺伝子を、プライマリーの骨格筋細胞（pSKM）と同等の強力な発現していた。
　実施例7（図7）
　ヒト正常皮膚線維芽細胞から筋芽細胞へのコンバージョン、DMD遺伝子のmRNA発現の経時的計測結果。
　ヒト正常皮膚線維芽細胞(aHDF)を、12wellプレートに培養し、図１と同様の手法より培養を行った。
　ヒトMyoD1遺伝子とヒトL-Myc遺伝子を共導入し、導入後0、2、4、6、8、10、12、および14日目にtotal RNAを回収した。Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。DMD遺伝子とβアクチン遺伝子のmRNAレベルを定量する目的で、Real-time PCR Master Mix、Taqman pobe、Specific PrimerおよびcDNAを混和し、AB7300 Real-time PCR sysytemを用いてReal-time RT-PCRを行った。各細胞のβアクチンmRNAレベルに対するDMD mRNAレベルの値を計算した。
　結果を図7に示す。MyoD1とL-Mycの2つの遺伝子を導入した細胞は、骨格筋細胞の機能発現に必須のタンパクであるDMDの遺伝子の発現が経時的に強くなり、14日目には、プライマリーの骨格筋細胞（pSKM）と同等の発現を示した。
　実施例8（図8）
　MyoD1とL-Mycを導入した細胞を7日間培養しマウスの腹部皮下に注入移植し、摘出標本から切片を作製し免疫染色を施行した。
　図8に手法の概要を示す。レトロウイルスベクタープラスミドpMXs.puroに、MyoD1、L-Myc遺伝子のcDNAコーディング配列を、GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kit(Thermo Fisher Scientific）を用いて組み込んだ。パッケージング細胞 Plat GP細胞を、100U/mL Penicillinと100μg/ml Streptomycinを含んだ1% NEAA 10% FBS DMEM（通常培地）に縣濁し、ゼラチンコートした10cm培養ディシュに5×106 個播種した。
　24時間培養後、上記の遺伝子を含むpMXsベクターを、種々の組み合わせで、pCMV VSVベクターと伴に、X-tremeGENE 9を用いて以下の比で導入した。
　すなわち導入遺伝子5μg、pCMV.VSV 2.5μg、Opti-MEM 500μl、X-tremeGENE 9　22.5μlの混和液を10mlの培地入りの10cmディッシュに添加した。
　24時間後、抗生剤を含まない通常培地に交換。同日に、ヒト正常皮膚線維芽細胞株aHDFを、2.2×106cells/mLで10cm培養ディッシュに播種した。
　24時間後、Plat GP培養上清を、ポアの直径が0.45μmのシリンジフィルターを通した後、ポリブレン（最終濃度4μg/mL）と混和した（ウイルス液）。
　aHDFの培養上清を吸引除去した後、ウイルス液を添加した（Day 0）。
　24時間培養して感染させた後、培養上清を吸引除去し、筋芽細胞分化用培地（IGF-1 10ng/ml、100U/mL Penicillinと100μg/ml Streptomycinを加えた1% NEAA、5%Horse Serum添加αMEM培地）を加えた。その後、培養液を2日に1回交換しDay7まで培養した。
　Day7にAccutaseを用いてディッシュから細胞を剥がし、3x105個ずつ氷上で100μLのマトリゲル（CORNING REF354234）原液に溶解した。
　NOD/SCIDマウスの右側上腹部皮下にマトリゲルに混濁した細胞液を注入移植した。コントロールのマウスには、aHDFを3x105個ずつ氷上で100μLのマトリゲル（CORNING　REF354234）原液に溶解した細胞を注入移植した。注入移植1週間後、マウスを安楽死させ、上腹部皮下を剥離し、皮下の移植組織を皮膚ごと摘出した。
　移植1週間後の移植部位と摘出した組織のmacroscopic imagesを図８Bに示す。MyoD1とL-Myc遺伝子を導入した細胞の移植部位には線維性の結節様組織が認められた。
　実施例９（図９）
　実施例８で摘出した組織を、4%パラホルムアルデヒドで24時間固定した。その後、24時間かけてパラフィン包埋し、パラフィンブロックを作成した。
　パラフィン固定したマウス皮下組織標本から3μmの厚みの薄切切片を作製した。切片を60°C　で15分インキュベートした後キシレンに5分浸漬し、これを3回繰り返した。さらに100%エタノールに3分浸漬し、これを3回繰り返した。その後脱パラフィンし、蒸留水で5分間洗浄した。
　次に切片を覆うようにBLOXALLを滴下し、10分間室温で静置した。
　PBSで5分洗浄し、切片を覆うように2.5%ウマ血清を滴下し、20分室温間で静置した。
　ペーパータオルの上でスライドを軽く打ち付けて血清を除去した。一次抗体抗として、Desmin抗体、抗CKM抗体、抗Dystrophin抗体、抗ACTA抗体、または抗Myogenin抗体を、切片を覆うように滴下した。30分間室温で静置し、PBSで5分洗浄した。ペーパータオルの上でスライドを軽く打ち付けてPBSを除去した。
　切片を覆うようにImmPRESS試薬を滴下し、30分間静置し、PBSによる5分間の洗浄を2回行い、ペーパータオルの上でスライドを軽く打ち付けてPBSを除去した。
　ImmPACT DAB Diluent 1mlを入れ、ImmPACT DAB Chromogen Concentrateを1滴加えてボルテックスでよく混ぜた。切片を覆うように酵素基質溶液を滴下し、30秒から1分間静置したのち、蒸留水で5分間洗浄した。
　蒸留水でさらに5分間2回洗浄し、ヘマトキシリン液で5分間、核染色を行った。流水で5分間洗浄し、50°Cのウォーターバスに2分間浸した後、流水洗浄を2分間行った。100%エタノールへの3分間の浸漬を3回行い、キシレンへの5分間の浸漬を3回行って脱水した後、切片を覆うように封入剤を滴下し、カバーガラスで覆った。
　組織の観察はKeyence BZ710にて明視野で行った。
　結果を図９に示す。
　線維芽細胞を移植した組織では、皮下組織内に筋繊維様の構造は認められず、多核の細胞は認められず、Desmin陽性の細胞も認められなかった（図９-1）。一方、MyoD1とL-Mycを導入した細胞を移植した組織では、皮下組織内に筋繊維様の構造が認められ、その中にはDesmin陽性、CKM陽性、ACTA陽性の多核の細胞を多数確認できた（図９-2）。これらの結果から、MyoD1とL-Myc 遺伝子で誘導した細胞を移植すると生体内で生着し、筋繊維様の組織を形成することが確認できた。
　実施例１０
　実施例８及び９と同様に、遺伝子導入をしなかったヒト線維芽細胞（aHDFs）またはMyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとL-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとの両方を感染させた後7日間培養した細胞（dMBs（directly converted myoblasts））を、マトリゲル(BD Bioscience, San Jose, CA)と体積比1:1 で混合し、NOG/SCIDマウスの側腹部に移植した（細胞数は３～５ｘ105個／マウス）。7日後に移植部位の組織を摘出し、実施例９と同様に、4% paraformaldehyde で8 h 固定後paraffinで包埋し、薄切した。抗デスミン抗体を用いた免疫組織化学を行い、蛍光顕微鏡（Keyence BZ710）を用いて400倍の倍率で観察し、１視野あたりのデスミン陽性細胞のパーセンテージを算出した。
　結果を図１０に示す。ML導入細胞を移植した群（dMBs（directly converted myoblasts））において、デスミン陽性細胞が有意に多数移植部位の組織に存在したことがわかる。値は平均値±標準偏差。各群N=3 mice。＊P<0.05 vs. 非導入細胞移植群。
　実施例１１
　実施例１と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターを感染させた（M）。また別の細胞に、L-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター（L）とMyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター（M）との両方を感染させた（ML）。コントロールとしてレトロウイルス・ベクターを感染させない細胞も準備した（-）。これらを実施例１と同様に、筋芽細胞分化用培地で培養した。感染14日後に、実施例３と同様に、抗CKM抗体を用いた免疫蛍光染色と核染色を行った。蛍光顕微鏡（Keyence BZ710）を用いて撮像し、総細胞数に対するCKM陽性細胞のパーセンテージを計測した。
　結果を図１１に示す。MyoD1遺伝子を単独導入した細胞は、約26%がCKM陽性であったが、MyoD1遺伝子とL-Myc遺伝子とを共導入した細胞は、約90%がCKM陽性であった。したがって、MyoD1とL-Myc遺伝子を共導入するとヒト線維芽細胞の約90%が筋芽細胞にコンヴァートすることが分かった。値は平均値±標準偏差。N=3ウェル／群。＊P<0.05 vs. 非導入細胞。
　実施例１２
　実施例１と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター（M）、L-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター（L）、c-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター（C）を、記載の組み合わせで感染させた。コントロールとしてレトロウイルス・ベクターを感染させない細胞も準備した（-）。これらを実施例１と同様に、筋芽細胞分化用培地で培養した。感染14日後に、実施例３と同様に核染色を行った。蛍光顕微鏡（Keyence BZ710）を用いて撮像した（図１２Ａ）。また、３個よりも多くの核を有する細胞のパーセンテージを計測した（図１２Ｂ）。
　MyoD1遺伝子を単独導入した細胞は、約6%が３個よりも多くの核を有する細胞であったが、MyoD1遺伝子とL-Myc遺伝子とを共導入した細胞は、約43%が３個よりも多くの核を有する細胞であった。MyoD1遺伝子とc-Myc遺伝子とを共導入した細胞は、約27%が３個よりも多くの核を有する細胞であった。したがって、MyoD1遺伝子とL-Myc遺伝子とを共導入した細胞はもっとも高い効率で多核の細胞になることが分かった。図１２Ｂの値は平均値±標準偏差。各群N=3ウェル。＊P<0.05 vs. 非導入細胞。
　実施例１３
　実施例１２と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとL-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとの両方を感染させた（ML）。コントロールとしてレトロウイルス・ベクターを感染させない細胞も準備した（-）。一部の群ではERK5パスウェイ阻害剤、XMD8-92 を記載の濃度で添加した。これらを実施例１２と同様に、筋芽細胞分化用培地で培養した。感染14日後に、実施例３と同様に核染色を行った。蛍光顕微鏡（Keyence BZ710）を用いて撮像したイメージを示す（図１３Ａ上段）。また、4個以上の核を有する細胞、２～３個の核を有する細胞、1個の核を有する細胞のパーセンテージを算出した（図１３Ａ下段）。
　遺伝子導入しなかった線維芽細胞はすべて単核の細胞であったが、MLを感染させた細胞は約40％が4個以上の核を有する細胞であり、約16％が２～３個の核を有する細胞であった。しかしERK5阻害剤であるXMD8-92を2～5 μM添加することで、4個以上の核を有する細胞は約10～12％に低下し、２～３個の核を有する細胞は約21～23％になった。
　また、感染14日後に細胞からRNAを抽出した。コントロールとして、プライマリーのヒト骨格筋細胞（pSKMs (primary skeletal muscle cells) ）からもRNAを抽出した。Real time RT-PCRにより、Myogenin、CKM、DystrophinのmRNAを定量した。結果を図１３Ｂに示す。ML遺伝子導入によるこれらの筋芽細胞特異的遺伝子の発現誘導は、XMD8-92 の添加によって抑制されなかった。したがって、ERK５パスウェイ阻害による多核化の抑制は、筋芽細胞へのコンヴァージョンの抑制ではないことが分かった。
　これらの結果から、MyoD1遺伝子とL-Myc遺伝子とを共導入した細胞の多核化は、ERK５パスウェイ依存性の細胞融合によるものであることが分かった。
　実施例１４
　実施例８、９と同様の実験後、移植部位の組織切片を、実施例１０と同様の方法で、抗CKM抗体と抗αアクチン抗体をそれぞれ用いた免疫組織化学に供した。
　結果を図１４に示す。MyoD1遺伝子とL-Myc遺伝子とを導入した細胞（dMBs（directly converted myoblasts））を移植した群において、CKM及びαアクチンが陽性の筋繊維様の組織が移植部位に多数形成されたことがわかる。
　実施例１５
　実施例１と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとL-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとの両方を感染させた後、筋芽細胞分化用培地で10日間培養した（ML）。コントロールとして遺伝子導入しないヒト線維芽細胞も用いた（-）。褐色脂肪細胞マーカーであるUCP1遺伝子とCIDEA遺伝子、軟骨細胞マーカーであるSOX9遺伝子とアグリカン遺伝子、骨芽細胞マーカーであるRunx2遺伝子とオステオカルシン遺伝子について、それぞれのmRNA発現をreal time RT-PCRで計測した。
　結果を図１５に示す。MyoD1遺伝子とL-Myc遺伝子とを導入した細胞（ML導入細胞）は、これらの間葉系の細胞のマーカーをいずれも有意に発現上昇しないことがわかる。値は平均値±標準偏差。各群N=3群。＊P<0.05 vs. 非導入細胞。
　実施例１６
　実施例１と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター（M）、L-Mycを組み込んだレトロウイルス・ベクター（L）、及びc-Mycを組み込んだレトロウイルス・ベクター（C）を、図に記載のとおりにM単独、MC及びMLの組み合わせで感染させた。コントロールとしてレトロウイルス・ベクターを感染させない細胞も準備した（-）。これらを実施例１と同様に、筋芽細胞分化用培地で培養した。感染後14日後に、200 nM のMitoTracker Red probe (Invitrogen) で37℃で15分間染色した。蛍光顕微鏡（Keyence BZ710）を用いて撮像した。
　結果を図１６に示す。上の写真は位相差像、下の写真は蛍光像である。遺伝子導入しないヒト線維芽細胞やMyoD1遺伝子を単独導入した細胞に比して、MCを共導入させた細胞は、多くのミトコンドリアを有しており、MLを共導入した細胞はさらに多くのミトコンドリアを有していた。
　実施例１７
　ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとL-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとの両方を感染させた後、６日間培養した（ML）。コントロールとして遺伝子導入しないヒト線維芽細胞も用いた（-）。抗デスミン抗体または抗CKM抗体による免疫染色と、DAPIによる核染色を記載のように行った。
　結果を図１７に示す。上の写真は位相差像、下の写真は蛍光像である。遺伝子導入後6日間という比較的短期の培養の後でも、ML導入細胞は筋芽細胞特異的遺伝子DesminとCKMを発現することがわかる。
　実施例１８
　実施例１と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターを感染させた。（M）、またL-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター（L）とMyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとの両方を感染させた（ML）。これらを筋芽細胞分化用培地で培養し、感染後14日目に各細胞からRNAを抽出した。コントロールとして、レトロウイルス・ベクターを感染させない細胞（-）とプライマリーのヒト骨格筋細胞（pSKMS）からもRNAを抽出した。これらのRNAを、GeneChip human Gene 1.0 ST (Affymetrix)を用いたDNAマイクロアレイ解析に供した。
　骨格筋の発生に関与する遺伝子群（図１８Ａ）、骨格筋の収縮に関与する遺伝子群（図１８Ｂ）、ミオシンフィラメントに関する遺伝子群（図１８Ｃ）、及びアクチンフィラメントに関する遺伝子群（図１８Ｄ）のそれぞれのヒートマップとクラスタリング解析の結果を示す。骨格筋に関するこれらの遺伝子群の発現はいずれも、ML導入細胞はpSKMSとの相同性が最も高く、線維芽細胞との相同性は低かった。M単独導入細胞は、pSKMSよりも線維芽細胞との相同性の方が高かった。
　実施例１９
　実施例１と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとL-Mycを遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターの両方を感染させ（ML）、筋芽細胞分化用培地で培養した。感染後2日おきにrBC2LCN-FITC (Wako 180-02991) で染色し、また細胞核をHoechst33342で染色した。コントロールとして、レトロウイルス・ベクター感染前の細胞（一番左）も同様に染色した。陽性コントロールとして、ヒトiPS細胞（hiPS235G1）も同様に染色した。これらの細胞を、蛍光顕微鏡（Keyence BZ710）を用いて撮像した。
　結果を図１９に示す。上の写真は位相差像、下の写真は蛍光像である。線維芽細胞はMLを感染させてもrBC2LCN-FITCでは染色されないことから、ML遺伝子導入による線維芽細胞から筋芽細胞へのコンヴァージョンにおいては、その途上でiPS細胞様の幹細胞を経由しないことがわかる。
　実施例２０
　MyoD1遺伝子とL-Myc遺伝子とをそれぞれプラスミド・ベクターpCXに導入し、発現ベクターを構築した。ヒト線維芽細胞（HDFs）に、MyoD1プラスミドのみ、またはMyoD1プラスミドとL-Mycプラスミドの両方を、electroporationで導入し、筋芽細胞分化用培地中で14日間培養した。これらの細胞、およびコントロールとして遺伝子導入しなかった線維芽細胞（HDF）からRNAを抽出し、Myogenin遺伝子とCKM遺伝子のmRNAをreal time RT-PCRで定量した。結果を図１９に示す。
　MyoD1遺伝子単独導入細胞に比して、MyoD1とL-Myc遺伝子を共導入した細胞は、MyogeninとCKM遺伝子をより強く発現していた。したがって、プラスミド・ベクターを用いたトランスフェクションによっても、MyoD1＋L-Myc遺伝子導入は線維芽細胞から筋芽細胞へのコンヴァージョンを誘導できることが示された。

Claims (8)

  1. 　哺乳動物の体細胞に、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を導入する工程を含む、骨格筋細胞を誘導する方法。
  2. 　前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記体細胞が、ヒトの体細胞である、請求項１に記載の方法。
  4. 　MyoDファミリー遺伝子がMyoD遺伝子であり、Mycファミリー遺伝子がL-myc遺伝子である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　哺乳動物の体細胞に由来し、外来性のMyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を有す骨格筋細胞。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の方法により得られる、請求項５に記載の骨格筋細胞。
  7. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の方法で得られる細胞、又は、請求項５若しくは６に記載の骨格筋細胞を含む、骨格筋の欠損、不足若しくは機能低下に基づく疾患を治療するための、移植材料。
  8. 　MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を含む、骨格筋細胞を誘導するための組成物。
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