JP2013527746A - 多能性幹細胞から骨格筋または骨格筋前駆細胞への分化誘導法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の工程、(1)ヒト多能性幹細胞を浮遊培養する工程、(2)浮遊培養後の細胞集団を接着培養する工程、(3)接着培養後の細胞を解離する工程、および(4)解離させた細胞を接着培養する工程を含む、ヒト多能性幹細胞から人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞を製造する方法、ならびに、この方法によって作製された人工の骨格筋または誘導骨格筋前駆細胞を提供する。
【選択図】図1
Description
[1]以下の工程:
(1)ヒト多能性幹細胞を浮遊培養する工程、
(2)浮遊培養後の細胞集団を接着培養する工程、
(3)接着培養後の細胞を解離する工程、および
(4)解離させた細胞を接着培養する工程、
を含む、ヒト多能性幹細胞から人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞を製造する方法。
[2]前記工程(1)において、ヒト多能性幹細胞が、接着培養により形成された該細胞のコロニーであり、および該コロニーをそのまま浮遊培養する、[1]に記載の方法。
[3]前記工程(2)において、細胞をインシュリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸ナトリウムを含む無血清培地で培養する、[1]または[2]に記載の方法。
[5]前記工程(4)において、細胞をウシ胎児血清およびウマ血清を含む培地で培養する、[1]〜[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6]前記工程(1)において、培養期間が7日間である、[1]〜[5]のいずれか1つに記載の方法。
[8]前記工程(4)において、培養期間が少なくとも21日間である、[1]〜[7]のいずれか1つに記載の方法。
[9]前記工程(4)において、前記ウシ胎児血清およびウマ血清を含む培地での培養後、該培地を、インシュリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸ナトリウムを含む無血清培地に交換してさらに細胞を培養する、[5]に記載の方法。
[10]ヒト多能性幹細胞が、ヒト胚性幹(ES)細胞またはヒト人工多能性幹(iPS)細胞である、[1]〜[9]のいずれか1つに記載の方法。
(1)インシュリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸ナトリウムを含む無血清培地、
(2)ウシ胎児血清およびウマ血清を含む培地、および
(3)細胞解離溶液、
を使用説明書とともに含む、ヒト多能性幹細胞から骨格筋または骨格筋前駆細胞を製造するためのキット。
[12][1]〜[10]のいずれか1つに記載の方法によってヒト多能性幹細胞から作製されたことを特徴とする、人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞。
[13]ヒト正常ジストロフィンをコードするDNAを発現可能に含む、[12]に記載の人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞。
[14]筋原性疾患の治療用医薬の製造における、[1]〜[10]のいずれか1つに記載の方法によりヒト多能性幹細胞から製造された人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞の使用。
[15][1]〜[10]のいずれか1つに記載の方法によりヒト多能性幹細胞から製造された人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞を含む組成物。
本発明は、ヒト多能性幹細胞を浮遊培養、接着培養および解離後の再接着培養することを含む、骨格筋または骨格筋前駆細胞を分化誘導する方法に関する。
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(核移植ES:ntES)細胞、精子幹細胞(「生殖幹細胞:GS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培地で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
人工多能性幹 (iPS) 細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920; M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106; 国際公開WO 2007/069666)。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, EsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。
nt ES(核移植ES)細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
融合幹細胞は、融合させたES細胞と同様な多能性を有するように、体細胞と卵子もしくはES細胞とを融合させることにより作製される。さらに融合幹細胞は、体細胞に特有の遺伝子も有する(Tada M et al. Curr Biol. 11:1553-8, 2001; Cowan CA et al. Science. 2005 Aug 26;309(5739):1369-73)。
本発明によれば、ES細胞、iPS細胞などの多能性細胞から骨格筋または骨格筋前駆細胞への人工的分化誘導に際して、以下の工程を含む方法を用いることができる;
(1)ヒト多能性幹細胞を浮遊培養する工程、
(2)浮遊培養後の細胞集団を接着培養する工程、
(3)接着培養後の細胞を解離する工程、および
(4)解離させた細胞を接着培養する工程。
本工程では、前述のように得られたヒト多能性細胞を、任意の方法でそれぞれの細胞から解離させるか、またはコロニー形態で取得し、浮遊培養を行う。好ましい本発明においては、多能性幹細胞のコロニー形態をそのまま浮遊培養に使用する。解離の方法としては、細胞を力学的に解離するか、もしくはプロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液(例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)が挙げられる)を用いて解離しても良い。好ましくは、多能性を維持するように培養された状態で形成されたコロニーを力学的に剥離し、そのまま、剥離した細胞を浮遊培養に用いる方法である。ここで、剥離前に3日間以上、好ましくは5日間、培養されたコロニーを用いることが好ましい。
本工程では、前述の工程で得られた浮遊培養後の細胞集団をそのままコーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養する。コーティング剤としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、ゼラチンである。
本工程では、前述の工程で得られた接着培養後の細胞集団を解離し、初期低細胞密度でコーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養する。コーティング剤としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンまたはエンタクチン、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。本工程において、好ましくは、タイプIコラーゲンである。
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、好ましくは約2〜5%である。培養時間は、例えば21日から35日間の培養であり、より好ましくは28日である。培地は、2日から5日ごとに交換することが望ましい。
本発明は、多能性幹細胞から骨格筋または骨格筋前駆細胞を分化誘導するためのキットを提供する。本キットには、上述した分化誘導に用いる培地、解離溶液(例えば、トリプシン/EDTAもしくはプロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有するバッファー)、培養ディッシュをコートするためのコーティング剤(例えば、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、あるいはこれらの組み合わせ、など)、などを含んでもよい。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面または使用説明書を含んでもよい。
本発明は、上で説明した分化誘導法によって作製された人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞を提供する。
本発明の骨格筋または骨格筋前駆細胞は、筋原性疾患(例えば、筋ジストロフィー、ミオパチーなどが挙げられる)の治療用化合物(例えば医薬化合物、溶媒、小分子、ペプチド、またはポリヌクレオチド)のスクリーニングに用いることもできる。例えば、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、候補医薬化合物を、上述のように誘導した骨格筋または骨格筋前駆細胞に加えることにより、当該細胞の数の変化により、評価を行うことができる。ここで、骨格筋または骨格筋前駆細胞は、治療対象となる筋原性疾患と同様の表現型を呈する細胞が好ましく、特に好ましくは、疾患の罹患患者由来の体細胞から作製されたiPS細胞もしくは疾患を有する患者由来の体細胞の核を移植されたntES細胞を分化誘導した骨格筋または骨格筋前駆細胞である。
本発明の人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞は、損傷した骨格筋組織の正常化のために再生医療の分野で有効に使用し得る。それゆえ、この細胞は、筋原性疾患の治療に使用することができる。
ES細胞
ヒトES細胞(KhES-1)は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)より受領し、従来の方法で培養した(Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345:926-32, 2006)。ヒトiPS細胞(253G4)は、山中教授より受領し、従来の方法で培養した(Nakagawa M, et al. Nat Biotechnol. 26: 101-6, 2008)。
ヒトES細胞は、フィーダー細胞としてSTO細胞を用いて5日間培養し、ヒトES細胞用解離液[トリプシン、10mg/ml コラゲナーゼIV、KSR(invitrogen)、1M CaCl2/PBSおよびPBSを含む。]を用いてコロニーのまま剥離し、ペトリ皿にてヒト胚性幹細胞維持培地[DMEM/F12(Sigma)+ 20% KSR + 1% NEAA + 2mM L-グルタミン]で7日間浮遊培養(胚様体形成)した。続いて、0.1%ゼラチンコートした細胞培養ディッシュ上で無血清培地(DMEM + 1×ITS-X (Gibco) + 1×Glutamax(Gibco) + 100μM 2-メルカプトエタノール)で接着培養を14日間行った。さらに、トリプシン/EDTAを用いて胚様体を解離した後、タイプIコラーゲンコートディッシュ(BD Bioscience)上にて低密度(約1,000〜3,000 cells/cm2)で播種し、血清培地[DMEM + 10% FCS(ウシ胎児血清;Sigma) + 5% HS(ウマ血清;Sigma) + 1% NEAA + 1×Glutamax + 100μM 2-メルカプトエタノール]を用いて3〜4週間培養した。ここで、細胞移植用に分化誘導を止めてもよいが、さらに、無血清培地(DMEM + 1×ITS-X + 1×Glutamax + 100μM 2-メルカプトエタノール)に培地交換してさらに細胞を2〜3週間培養した。以上の概要は、図1に示す。全ての条件において、培地交換は5日おきに行った。
Claims (15)
- 以下の工程:
(1)ヒト多能性幹細胞を浮遊培養する工程、
(2)浮遊培養後の細胞集団を接着培養する工程、
(3)接着培養後の細胞を解離する工程、および
(4)解離させた細胞を接着培養する工程、
を含む、ヒト多能性幹細胞から人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞を製造する方法。 - 前記工程(1)において、ヒト多能性幹細胞が、接着培養により形成された該細胞のコロニーであり、および該コロニーをそのまま浮遊培養する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(2)において、細胞を、インシュリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸ナトリウムを含む無血清培地で培養する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程(4)において、解離された細胞を1,000〜3,000 cells/cm2の初期密度で培養する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(4)において、細胞を、ウシ胎児血清およびウマ血清を含む培地で培養する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(1)において、培養期間が7日間である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(2)において、培養期間が14日間である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(4)において、培養期間が少なくとも21日間である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(4)において、前記ウシ胎児血清およびウマ血清を含む培地での培養後、該培地を、インシュリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸ナトリウムを含む無血清培地に交換してさらに細胞を培養する、請求項5に記載の方法。
- ヒト多能性幹細胞が、ヒト胚性幹(ES)細胞またはヒト人工多能性幹(iPS)細胞である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の物質:
(1)インシュリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸ナトリウムを含む無血清培地、
(2)ウシ胎児血清およびウマ血清を含む培地、および
(3)細胞解離溶液、
を使用説明書とともに含む、ヒト多能性幹細胞から人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞を製造するためのキット。 - 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法によってヒト多能性幹細胞から作製されたことを特徴とする、人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞。
- ヒト正常ジストロフィンをコードするDNAを発現可能に含む、請求項12に記載の人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞。
- 筋原性疾患の治療用医薬の製造における、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法によりヒト多能性幹細胞から製造された人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞の使用。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法によりヒト多能性幹細胞から製造された人工の骨格筋または骨格筋前駆細胞を含む筋原性疾患の治療用組成物。
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