JP6646311B2 - 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 - Google Patents
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
人工多能性幹細胞(iPS細胞)など多能性を有する細胞がこれまでに報告されている(特
許文献1または2)。そこで、これらの多能性幹細胞から分化誘導された細胞を移植する再生医療やin vitroでの病態モデルの作製に注目されている。
胚性幹細胞から内皮細胞や血球系細胞を作製するためには、発生を模して、中胚葉前駆細胞を作製し、各細胞へと分化誘導する多段階工程が試みられている(非特許文献1、2または3)。また、この工程において、異種細胞や生物由来原料を用いることでは安定的な収量が得られないことから、限定された成分のみを用いて多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞、さらには、各分化細胞へと誘導する方法が提示されている(特許文献3、非特許文献4)。
[1]多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞を製造する方法であって、
多能性幹細胞を、ラミニン(LM)511またはその断片でコーティングされた培養器材上にて、BMP(Bone Morphogenetic Protein)、VEGF(Vascular Endothelial Gro
wth Factor)およびGSK(Glycogen Synthase Kinase)3β阻害剤を含む培養液中で接着培養する工程を含む方法。
[2]前記ラミニン511の断片がラミニン511E8である、[1]に記載の方法。
[3]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記工程が2日間以上行われる、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の方法。
[5]中胚葉前駆細胞から血液血管前駆細胞を製造する方法であって、
中胚葉前駆細胞をVEGF、SCF(Stem Cell Factor)、bFGF(basic Fibroblast
Growth Factor)およびTGF(Transforming Growth Factor)β阻害剤を含む培養液中で接着培養する工程を含む方法。
[6]前記培養液がTGFβを含有しない培養液である、[5]に記載の方法。
[7]前記中胚葉前駆細胞が、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法で製造された細胞である、[5]または[6]に記載の方法。
[8]前記TGFβ阻害剤がSB431542である、[5]〜[7]のいずれか1項に記載の方法。
[9]前記工程が2日間以上行われる、[5]〜[8]のいずれか1項に記載の方法。
[10]次の工程を含む多能性幹細胞から、血液血管前駆細胞を製造する方法であって、(1)多能性幹細胞を、ラミニン511またはその断片でコーティングされた培養器材上にて、BMP、VEGFおよびGSK3β阻害剤を含む培養液中で接着培養する工程、および
(2)前記工程(1)で得られた細胞をVEGF、SCF、bFGFおよびTGFβ阻害剤を含む培養液中で接着培養する工程。
[11]前記ラミニン511の断片がラミニン511E8である、[10]に記載の方法。
[12]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、[10]または[11]に記載の方法。
[13]前記工程(2)で用いる培養液がTGFβを含有しない培養液である、[10]〜[12]のいずれか1項に記載の方法。
[14]前記TGFβ阻害剤がSB431542である、[10]〜[13]のいずれか1項に記載の方法。
[15]前記工程(1)が2日間以上行われる、[10]〜[14]のいずれか1項に記
載の方法。
[16]前記工程(2)が2日間以上行われる、[10]〜[15]のいずれか1項に記
載の方法。
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、特に限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞(「GS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞、培養線
維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞(Muse細胞)などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され(M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
て行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848;Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147; H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 103:9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585;Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
液を使用し、37℃、2% CO2/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができ
る(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2および20% KSRを含
有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができ
る。
では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で
継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖
細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
人工多能性幹(iPS)細胞は、ある特定の再プログラミング因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.
ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008);国際公開WO 2007/069666)。再プログラム化
因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であれば良く、特に限定されないが、例えばOCT3/4、SOX2及びKLF4; OCT3/4、KLF4及びC-MYC; OCT3/4、SOX2、KLF4及びC-MYC; OCT3/4及
びSOX2; OCT3/4、SOX2及びNANOG; OCT3/4、SOX2及びLIN28; OCT3/4及びKLF4などの組
み合わせである。
、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター(以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007)、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示され
る。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマ
イシン耐性遺伝子など)、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、再プログラミング化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する再
プログラミング化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例、HDAC1 siRNA Smartpool (登録商標:Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば5’-azacytidine)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば
、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等)等の核酸性発現
阻害剤など]、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤(例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling(例えばsoluble Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008))、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、miR-291-3p、miR-294、miR-295などのmiRNA(R.L. Judson
et al., Nat. Biotech., 27:459-461) (2009)等を使用することができる。
きる。)、(2) bFGF又はSCFを含有するES細胞培養用培地、例えばマウスES細胞培養用培
地(例えばTX-WES培地、トロンボX社)又は霊長類ES細胞培養用培地(例えば霊長類(ヒト&サル)ES細胞用培地、リプロセル、京都、日本)、などが含まれる。
ば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10%FBS含有DMEM培地(これにはさら
に、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。)で培養し、約25〜
約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる(Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746)、もしくは細胞外基質(例えば、Laminin-5(WO2009/123349)およびマトリゲル(BD社))を用いる方法が例示される。
ため、低酸素条件(0.1%以上、15%以下の酸素濃度)によりiPS細胞を樹立しても良い(Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845)。
たり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
が初期化された場合に発現する遺伝子(例えば、Oct3/4、Nanog)と連動して発現する薬
剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液(選択培養液)で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マー
カー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)、(2)組織前駆細胞、(3)リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞(皮膚細胞等)、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いる
ことが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有す
る体細胞である。
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵
由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合
わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
本発明において、中胚葉とは、発生の過程で体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓・血管(血管内皮も含む)、血液(血液細胞も含む)、リ
ンパ管や脾臓、腎臓及び尿管、性腺(精巣、子宮、性腺上皮)をつくる能力を有した細胞から構成される胚葉を包含する。本発明において、中胚葉前駆細胞は、例えば、T(Brachyuryと同義)、KDR、FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1及びSDF1から成るマーカー遺伝子から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子が発現する細胞である。中胚葉前駆細胞には、中胚葉細胞と区別されるものではなく、上記マーカー遺伝子の発現が弱いものを中胚葉前駆細胞と称してもよい。本発明において製造される、中胚葉前駆細胞は他の細胞種が含まれる細胞集団として製造されてもよく、例えば、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上または90%以上の中胚葉前駆細胞が含ま
れる細胞集団である。
本発明において、血液血管前駆細胞とは、血液系細胞または血管内皮細胞へ誘導される能力を有した細胞から構成される細胞であり、血管芽細胞またはヘマンジオブラストとも称される。本発明において、血液血管前駆細胞は、CD34及びKDRを発現する細胞として例示される。本発明において製造される、血液血管前駆細胞は他の細胞種が含まれる細胞集団として製造されてもよく、例えば、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上または90%以上の血液血管前駆細胞が含まれる細胞集団である。
本発明は、多能性幹細胞を、ラミニン511またはその断片でコーティングされた培養器材上にて、BMP、GSK3β阻害剤およびVEGFを含む培養液中で接着培養する工程を含む多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞を製造する方法を提供する。
1E8は、例えば、ニッピ社から入手可能である。
カテニンに対するリン酸化能)を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO(別名、GSK-3β阻害剤IX;6-ブロモインジルビン3'-オキシム)、マレイミド誘導体であるSB216763(3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン)、フェニルαブロモメ
チルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII(4-ジブロモアセトフェノン)、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts(別名、GSK-3βペプチド阻害剤;Myr-N-GKEAPPAPPQpSP-NH2(配列番号1))および高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販
されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。本発明で使用されるGSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHI
R99021であり得る。
、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μMまたはこれらの間の濃度であるがこれらに限定されない。好ましくは、2μMである。
る。好ましくは、80 ng/mlである。VEGFはヒト由来のものが好ましい。
、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium(ライフテクノロジーズ)、mTesR1培地(ライフテクノロジーズ)、Essential 8(ライフテクノロジーズ)、Stempr
o34SFM培地(ライフテクノロジーズ)およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum
Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント(Invitrogen)、B27サプリメント(Invitrogen)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んで
もよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax(Invitrogen)、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、mTesR1培地またはEssential 8である。
本発明は、中胚葉前駆細胞をVEGF、SCF、bFGFおよびTGFβ阻害剤を含む培養液中で接着培養する工程を含む中胚葉前駆細胞から血液血管前駆細胞を製造する方法を提供する。
れる。好ましくは、80 ng/mlである。
される。好ましくは、50 ng/mlである。SCFはヒト由来のものが好ましい。
示される。好ましくは、50 ng/mlである。bFGFはヒト由来のものが好ましい。
流シグナルとは、TGFβII型受容体によるTGFβI型受容体をリン酸化、このTGFβI型受容
体によるSmad(R-Smad)のリン酸化などが例示される。TGFβ阻害剤として既に多数のものが知られているが、例えば、SB431542、SB202190(R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer
2:20 (2003))、SB505124 (GlaxoSmithKline)、NPC30345 、SD093、SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01 (WO 2009146408)などが挙げられる。これらの化合物は、例えばSTEMGENT社等から市販されており
容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。本発明で使用されるTGFβ阻害剤は、好ましくは、SB431542であり得る。
μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μMまたはこれらの間の濃度であるがこれらに限定されない。好ましくは、2μMである。
TesR1培地(ライフテクノロジーズ)、Essential 8(ライフテクノロジーズ)、Essential 6(ライフテクノロジーズ)、Stempro34SFM培地(ライフテクノロジーズ)およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント(Invitrogen)、B27サプリメント(Invitrogen)、脂
肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオー
ルグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グル
タミン、Glutamax(Invitrogen)、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得
る。好ましい基礎培地は、TGFβを含有しない基礎培地であり、このような培地として例えば、Essential 6が挙げられる。
は、好ましくは約2〜5%である。培養期間は、2日以上であり、2日〜3日間が好ましい。
本発明での他の実施態様において、多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞を作製するキットおよび/または中胚葉前駆細胞から血液血管前駆細胞を作製するキットが含まれる。当該
キットには、上述した中胚葉前駆細胞を作製する各工程に使用する培養液、添加剤または培養容器等が含まれる。本キットには、さらに製造工程の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
ヒトES細胞(KhES1)は、京都大学再生医科学研究所より受領し、従来の方法で培養した(Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345:926-32, 2006)。ヒトiPS細胞は、臍帯血単核球に4因子をエピソーマルベクター(Okita K, et al, Nat Methods. 8, 409-412, 2011)により導入して作製した(CB-iPSCと言う)。
0.25%トリプシン(Life technologies)、0.1%コラゲナーゼIV(Life technologies),、20%KSR、及び1mMCaCl2)によって約30秒間室温で処理して細胞を解離させ、既存の方法(Suemori, H. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 345, 926932 (2006))により、SNL細胞を除去した。
ヒトES細胞をLM511 (Biolamina)でコーティングしたプレートに5 colonies/cm2の密
度で播種し、mTeSR1で培養した。コロニーの直径が750μmになるまで増殖させた後、2 μM CHIR99021 (Wako), 80 ng/mL BMP4 (R&D Systems(RSD)), 80 ng/mL VEGF (RSD)を含
むEssential 8 (Life technologies)培地に交換し、2日培養し、KDR陽性の中胚葉前駆細
胞を得た。
上記の方法で得られた中胚葉前駆細胞の培地を吸引除去し、2 μM SB431542 (STEMGENT), 80 ng/mL VEGF (RSD), 50 ng/mL bFGF (WAKO)および50 ng/mL SCF (RSD)を含むEssential 6 (Life technologies)培地(TGFβの除去)に交換し、2日培養し、CD34陽性の
血液血管前駆細胞を得た。
上記の方法で得られた血液血管前駆細胞の培地を吸引除去し、20ng/mL VEGF, 50ng/mL SCF, 50ng/mL IL(Interleukin)3 (RSD), 50ng/mL FL(Flt-3 Ligand Protein)(RSD), 50ng/mL IL6 (RSD), 10U/mL EPO(Erythropoietin)(Merk)およびITSX(Insulin-transferrin-sodium selenite-X:Life technologies)を含むStemline II (SIGMA)培地に交換し、2日培養した。
よびITSXを含むStemline II (SIGMA)培地に交換し、4日培養した。培養2日目に同じ培地へ交換を行った。
分化(図2A)およびCD34+CD43+細胞、CD34+CD45+細胞またはCD43+CD45+細胞を示す造血
細胞への分化(図2B)が得られることが確認された。
作製した。この血液血管前駆細胞集団からCD34陽性細胞をMACS(磁気細胞分離装置)(ミルテニー社)を用いて単離し、Matrigel (BD Biosciences)上に播種し、上記と同様の方
法にて分化誘導行ったところ、接着した細胞は、内皮細胞様に分化していることが確認され(図3A)、浮遊した細胞をメイギムザ染色したところ、血球系細胞が存在しているこ
とが確認された(図3B)。
き換えたところ、同様の結果が得られた。
Claims (9)
- 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞を製造する方法であって、多能性幹細胞を、ラミニン511またはラミニン511E8でコーティングされた培養器材上にて、BMP、VEGFおよびGSK3β阻害剤を含む培養液中で接着培養する工程を含む方法。
- 前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程が2日間以上行われる、請求項1または2に記載の方法。
- 次の工程を含む多能性幹細胞から血液血管前駆細胞を製造する方法であって、
(1)多能性幹細胞を、ラミニン511またはラミニン511E8でコーティングされた培養器材上にて、BMP、VEGFおよびGSK3β阻害剤を含む培養液中で接着培養する工程、および
(2)前記工程(1)で得られた細胞をVEGF、SCF、bFGFおよびTGFβ阻害
剤を含む培養液中で接着培養する工程。 - 前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、請求項4に記載の方法。
- 前記工程(2)で用いる培養液がTGFβを含有しない培養液である、請求項4または5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TGFβ阻害剤がSB431542である、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(1)が2日間以上行われる、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(2)が2日間以上行われる、請求項4〜8のいずれか1項に記載の方法。
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