JP7437766B2 - 中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法 - Google Patents
中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7437766B2 JP7437766B2 JP2020553984A JP2020553984A JP7437766B2 JP 7437766 B2 JP7437766 B2 JP 7437766B2 JP 2020553984 A JP2020553984 A JP 2020553984A JP 2020553984 A JP2020553984 A JP 2020553984A JP 7437766 B2 JP7437766 B2 JP 7437766B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- pluripotent stem
- stem cells
- differentiation
- laminin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims description 190
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims description 125
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 173
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 55
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims description 51
- 108010038862 laminin 10 Proteins 0.000 claims description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 39
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 33
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 claims description 25
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 claims description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 23
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 19
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 12
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 claims description 9
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 claims description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 9
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 5
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 67
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 67
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 49
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 48
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 41
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 32
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 32
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 19
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 16
- 102100020944 Integrin-linked protein kinase Human genes 0.000 description 14
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 14
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 8
- 230000025611 cell-substrate adhesion Effects 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- -1 Fbx15 Proteins 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000713275 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 3 Proteins 0.000 description 3
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- JCSGFHVFHSKIJH-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-3-indolyl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C)C=C1C(C(NC1=O)=O)=C1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl JCSGFHVFHSKIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 2
- 102000016362 Catenins Human genes 0.000 description 2
- 108010067316 Catenins Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 2
- 102000002297 Laminin Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010000851 Laminin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 2
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000973887 Takayama Species 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000003352 cell adhesion assay Methods 0.000 description 2
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000023895 stem cell maintenance Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- CRDNMYFJWFXOCH-YPKPFQOOSA-N (3z)-3-(3-oxo-1h-indol-2-ylidene)-1h-indol-2-one Chemical class N/1C2=CC=CC=C2C(=O)C\1=C1/C2=CC=CC=C2NC1=O CRDNMYFJWFXOCH-YPKPFQOOSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKJSFKCZZIXQIP-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-1-(4-bromophenyl)ethanone Chemical compound BrCC(=O)C1=CC=C(Br)C=C1 FKJSFKCZZIXQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMYDPQQPEAYXKD-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-n-naphthalen-2-ylnaphthalene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(NC(=O)C3=CC4=CC=CC=C4C=C3O)=CC=C21 PMYDPQQPEAYXKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDLZLOKCJHBUHD-WAVHTBQISA-N 6-bromoindirubin-3'-oxime Chemical compound O=C/1NC2=CC(Br)=CC=C2C\1=C\1/C(=N/O)/C2=CC=CC=C2N/1 DDLZLOKCJHBUHD-WAVHTBQISA-N 0.000 description 1
- 102000029791 ADAM Human genes 0.000 description 1
- 108091022885 ADAM Proteins 0.000 description 1
- 235000009434 Actinidia chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 description 1
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 description 1
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 101100125899 Arabidopsis thaliana ILK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000005528 Arctium lappa Species 0.000 description 1
- 235000003130 Arctium lappa Nutrition 0.000 description 1
- 235000008078 Arctium minus Nutrition 0.000 description 1
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 101100257372 Caenorhabditis elegans sox-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 244000018436 Coriandrum sativum Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101150099612 Esrrb gene Proteins 0.000 description 1
- 101150057663 Foxa2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000195480 Fucus Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 101000785632 Homo sapiens Zinc finger FYVE domain-containing protein 21 Proteins 0.000 description 1
- 101150050155 ILK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050268 ITGB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091006975 Iron transporters Proteins 0.000 description 1
- 101150072501 Klf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100310657 Mus musculus Sox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310648 Mus musculus Sox17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257376 Mus musculus Sox3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 1
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102100030124 N-myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 108010063250 N-myristoyl-glycyl-lysyl-glutamyl-alanyl-prolyl-prolyl-alanyl-prolyl-prolyl-glutaminyl-phosphoseryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 101150072008 NR5A2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229940122907 Phosphatase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 244000178231 Rosmarinus officinalis Species 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150001847 Sox15 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150111019 Tbx3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026462 Zinc finger FYVE domain-containing protein 21 Human genes 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- NMPVEAUIHMEAQP-UHFFFAOYSA-N alpha-bromo-acetaldehyde Natural products BrCC=O NMPVEAUIHMEAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000035289 cell-matrix adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000003570 cell-matrix junction Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940068840 d-biotin Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000002907 exocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 108091056924 miR-124 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091047189 miR-29c stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091054490 miR-29c-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940028444 muse Drugs 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000020939 nutritional additive Nutrition 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 229940082569 selenite Drugs 0.000 description 1
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L selenite(2-) Chemical compound [O-][Se]([O-])=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011655 sodium selenate Substances 0.000 description 1
- 229960001881 sodium selenate Drugs 0.000 description 1
- 235000018716 sodium selenate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法に関する。より詳細には、本発明は、多能性幹細胞を、インテグリンβ1及びβカテニンを介するシグナル伝達経路を活性化する処理に付すことを含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法に関する。
従来より、人工多能性幹細胞（iPS細胞）から血液細胞への分化のし易さ（易分化性）は、iPS細胞株ごとに異なることが知られていたが、その理由は不明であった。iPS細胞から血液細胞への易分化性の違いの要因が、細胞株自身の特性にあるのか、あるいは細胞外の環境にあるのかを検証することが求められていた。
本発明者らは以前、フィーダーフリー培養で細胞外マトリクスとして用いられる種々のラミニン上で多能性幹細胞を培養したところ、ラミニン511上で維持した多能性幹細胞は中内胚葉系への分化抵抗性を示すのに対し、ラミニン421やラミニン121上で維持した多能性幹細胞では、この分化抵抗性が解除され、中内胚葉系、特に血液細胞に分化しやすい傾向を示すことを見出した。また、上記特定のラミニン上で維持され、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路の下流遺伝子群の発現が上昇していることも見出した（特許文献１）。この発見は、Wnt/β-カテニンシグナルの活性化が、ES細胞やエピブラストからの中胚葉、血液分化に重要であるという以前の報告（例えば、非特許文献１～３）と一致する。
しかし、特定のラミニンのみが、なぜ多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除し得るのかについては、依然として不明のままであった。
Liu, P. et al., Nat. Genet., 22: 361-365 (1999)
Huelsken, J. et al., J. Cell. Biol., 148: 567-578 (2000)
Woll, P.S. et al., Blood, 111(1): 122-123 (2008)
従って、本発明の目的は、特定のラミニンが多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するメカニズムを解明し、多能性幹細胞から中内胚葉系、特に血液細胞への、より効率的な分化誘導方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、当該メカニズムを利用して、多能性幹細胞クローンの中内胚葉系への易分化性を評価する手段を提供することである。
本発明者らは、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するには、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を活性化することが重要であると考えた。そこでまず、β-カテニンをリン酸化してユビキチンプロテアソーム系による恒常的分解を促すGSK3βの阻害剤の存在下に、多能性幹細胞を推奨濃度のラミニン511上で維持培養した後、造血前駆細胞へと分化誘導すると、分化能が改善され、造血前駆細胞数が増加することを見出した。
次に、本発明者らは、ラミニンのレセプターとして知られる細胞表面タンパク質であるインテグリンβ1（ITGB1）に着目し、造血前駆細胞への分化誘導能の高い（本明細書において「造血性」ともいう。）ラミニン421やラミニン121上で維持した多能性幹細胞と、造血前駆細胞への分化誘導能の低い（本明細書において「非造血性」ともいう。）ラミニン511上で維持した多能性幹細胞とで、ITGB1の発現量を比較したところ、前者の方がITGB1を高発現していることを見出した。がん細胞において、ITGB1はILK/pGSK3βを介してβ-カテニンの蓄積量を変化させ、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を調節していることが報告されていたので、本発明者らは、ラミニン421及びラミニン121上で維持した多能性幹細胞と、ラミニン511上で維持した多能性幹細胞とで、ILK/pGSK3β/β-カテニン量を比較した。その結果、前者の方がILK/pGSK3β/β-カテニン量が多く、結果的にWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が活性化されていることが明らかとなった。
造血性のラミニン421とラミニン121は、β及びγサブユニットとして、ともにβ2及びγ1を含むが、同じくβ2及びγ1を含むラミニン321上で維持した多能性幹細胞からは、造血前駆細胞が誘導されなかったことから、βγサブユニットの組み合わせ以外の機序が考えられた。また、本発明者らは、多能性幹細胞の維持培養研究の過程で、造血性のラミニン421やラミニン121は、非造血性のラミニン511に比べて、細胞-基質間接着が弱い傾向があることを見出していた。そこで、ラミニン421やラミニン121と、ラミニン511との間における造血前駆細胞への分化誘導能の違いが、ラミニンの種類によるものなのか、それともITGB1とラミニンとの間の接着強度によるものなのかを調べるため、非造血性のラミニン511を段階希釈して、ITGB1との接着強度を低下させたところ、分化抵抗性を示す多能性幹細胞では、細胞-基質間接着が弱くなるに従ってITGB1の発現が上昇することが明らかとなった。さらに、段階希釈したラミニン511上で維持した当該多能性幹細胞を造血前駆細胞へ分化誘導したところ、推奨濃度で維持した多能性幹細胞に比べて分化能が改善され、造血前駆細胞数が増加することを見出した。
一方で、多能性幹細胞クローンによっては、推奨濃度のラミニン511で維持しても分化抵抗性を示さないものも存在することが分かった。このような分化抵抗性を示さない多能性幹細胞では、いずれの希釈系列のラミニン511上でも十分なITGB1の発現があることが明らかとなった。即ち、細胞表面分子であるITGB1の発現量を指標として、多能性幹細胞の中内胚葉系、特に血液細胞への易分化性を評価することができ、分化抵抗性を示すと判定された多能性幹細胞に対しては、ラミニン511濃度を低下させて用いることで、分化抵抗性を解除し得ることが示された。
一方で、多能性幹細胞クローンによっては、推奨濃度のラミニン511で維持しても分化抵抗性を示さないものも存在することが分かった。このような分化抵抗性を示さない多能性幹細胞では、いずれの希釈系列のラミニン511上でも十分なITGB1の発現があることが明らかとなった。即ち、細胞表面分子であるITGB1の発現量を指標として、多能性幹細胞の中内胚葉系、特に血液細胞への易分化性を評価することができ、分化抵抗性を示すと判定された多能性幹細胞に対しては、ラミニン511濃度を低下させて用いることで、分化抵抗性を解除し得ることが示された。
本発明者らはまた、前述のGSK3β阻害剤を用いてWnt/β-カテニンシグナル伝達経路を活性化した場合は、造血前駆細胞への分化誘導を開始する前に、多能性を維持する細胞数が減少してしまうのに対し、ITGB1との接着強度が弱いラミニン421やラミニン121を用いたり、ラミニン511を希釈し接着強度を弱くして用いた場合には、多能性を維持する細胞数を減らすことなく分化能が改善されることを見出した。即ち、ラミニン511を推奨濃度より低い濃度で用いることで、多能性幹細胞の維持培養に要するコストを削減しつつ、多能性の維持と分化抵抗性の解除とを両立させることに成功した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下のものを提供する。
［１］多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すことを含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法。
［２］前記多能性幹細胞は、さらに中胚葉系への分化抵抗性が解除されている、［１］に記載の方法。
［３］前記多能性幹細胞は、さらに血液細胞への分化抵抗性が解除されている、［２］に記載の方法。
［４］前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.03～0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［６］多能性幹細胞の90%以上がOct3/4陽性かつSox2陽性である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記活性化処理が、多能性幹細胞をGSK3β阻害剤に2～5日間接触させることである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［８］多能性幹細胞がヒト由来である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］（１）［１］～［８］のいずれかに記載の方法により中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を作製する工程、及び（２）工程（１）で得られた細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法。
［１０］前記中胚葉系の細胞が、血液細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、心筋細胞又は脂肪細胞である、［９］に記載の方法。
［１１］前記中胚葉系の細胞が血液細胞である、［９］に記載の方法。
［１２］前記内胚葉系の細胞が、膵β細胞、肝細胞、腸管細胞、肺細胞又は甲状腺細胞である、［９］に記載の方法。
［１３］ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされた培養容器を含む、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット。
［１４］前記培養容器が、ラミニン511 E8断片換算で0.03～0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされている、［１３］に記載のキット。
［１５］多能性幹細胞におけるインテグリンβ1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法。
［１］多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すことを含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法。
［２］前記多能性幹細胞は、さらに中胚葉系への分化抵抗性が解除されている、［１］に記載の方法。
［３］前記多能性幹細胞は、さらに血液細胞への分化抵抗性が解除されている、［２］に記載の方法。
［４］前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.03～0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［６］多能性幹細胞の90%以上がOct3/4陽性かつSox2陽性である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記活性化処理が、多能性幹細胞をGSK3β阻害剤に2～5日間接触させることである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［８］多能性幹細胞がヒト由来である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］（１）［１］～［８］のいずれかに記載の方法により中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を作製する工程、及び（２）工程（１）で得られた細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法。
［１０］前記中胚葉系の細胞が、血液細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、心筋細胞又は脂肪細胞である、［９］に記載の方法。
［１１］前記中胚葉系の細胞が血液細胞である、［９］に記載の方法。
［１２］前記内胚葉系の細胞が、膵β細胞、肝細胞、腸管細胞、肺細胞又は甲状腺細胞である、［９］に記載の方法。
［１３］ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされた培養容器を含む、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット。
［１４］前記培養容器が、ラミニン511 E8断片換算で0.03～0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされている、［１３］に記載のキット。
［１５］多能性幹細胞におけるインテグリンβ1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法。
本発明によれば、インテグリンβ1（ITGB1）-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化することで、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、中内胚葉系の細胞への分化誘導に適した多能性幹細胞を提供することができる。特に、ラミニン511又はその断片を推奨濃度より低濃度に希釈して用いることで、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、維持培養のコスト削減と効率的な分化誘導とを同時に達成することができる。また、本発明によれば、多能性幹細胞の多能性を十分に維持したまま中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、中内胚葉系の細胞への分化誘導をより効率的に行うことができる。また、本発明によれば、ITGB1の発現量を指標として、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を簡便に評価することができる。
（Ｉ）分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法
本発明は、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除する方法、即ち、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法（以下、「本発明の製法（Ｉ）」という）を提供する。従って、本発明の製法（Ｉ）に供される多能性幹細胞は、分化抵抗性を有するものであることが好ましい。
ここで「分化抵抗性」とは、多能性幹細胞を所望の細胞に分化誘導した際に、当該所望の細胞に分化しにくい性質を意味する。本発明における「中内胚葉系への分化抵抗性」は、例えば、推奨濃度（ラミニン511 E8断片換算で0.5μg/cm2）のラミニン511もしくはその断片上で維持培養したヒトiPS細胞株AK5 (Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)を、中内胚葉系の細胞へと分化誘導した場合の、当該所望の細胞への分化のしにくさ、あるいはそれと同等もしくはそれ以上の分化しにくさとして表すことができる。多能性幹細胞が分化抵抗性を有するか否かは、後述の「本発明の評価方法」により判定することができる。
また、「分化抵抗性が解除される」とは、解除処理前に比べて、所望の細胞への分化効率が有意に増加することを意味する。好ましくは、解除処理前に比べて2倍以上、より好ましくは4倍以上、さらに好ましくは8倍以上、所望の細胞への分化効率が増加することをいう。
本発明は、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除する方法、即ち、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法（以下、「本発明の製法（Ｉ）」という）を提供する。従って、本発明の製法（Ｉ）に供される多能性幹細胞は、分化抵抗性を有するものであることが好ましい。
ここで「分化抵抗性」とは、多能性幹細胞を所望の細胞に分化誘導した際に、当該所望の細胞に分化しにくい性質を意味する。本発明における「中内胚葉系への分化抵抗性」は、例えば、推奨濃度（ラミニン511 E8断片換算で0.5μg/cm2）のラミニン511もしくはその断片上で維持培養したヒトiPS細胞株AK5 (Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)を、中内胚葉系の細胞へと分化誘導した場合の、当該所望の細胞への分化のしにくさ、あるいはそれと同等もしくはそれ以上の分化しにくさとして表すことができる。多能性幹細胞が分化抵抗性を有するか否かは、後述の「本発明の評価方法」により判定することができる。
また、「分化抵抗性が解除される」とは、解除処理前に比べて、所望の細胞への分化効率が有意に増加することを意味する。好ましくは、解除処理前に比べて2倍以上、より好ましくは4倍以上、さらに好ましくは8倍以上、所望の細胞への分化効率が増加することをいう。
「中内胚葉系」とは、中胚葉系の細胞及び内胚葉系の細胞、並びに両者の共通の前駆体である中内胚葉細胞を包含する意味で用いられる。従って、「中内胚葉系への分化抵抗性を解除する」とは、少なくとも、多能性幹細胞から中内胚葉細胞への分化効率を解除処理前より増加させることを意味する。好ましくは、本発明の製法（Ｉ）によれば、少なくとも、さらに中胚葉系細胞への分化抵抗性、より好ましくは、少なくとも、さらに血液細胞への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞が提供される。
本発明で用いられる多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であれば特に制限されず、例えば、胚性幹（ES）細胞、iPS細胞の他、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（EG）細胞、精巣組織からのGS細胞の樹立培養過程で単離されるmutipotent germline stem（mGS）細胞、骨髄から単離されるmultipotent adult progenitor cell（MAPC）、MUSE細胞等が挙げられる。ES細胞は体細胞から核初期化されて生じたES細胞であってもよい。好ましくはES細胞またはiPS細胞である。多能性幹細胞は哺乳動物に由来するものであってもよく、好ましくはヒト由来の多能性幹細胞である。
ES細胞は、哺乳動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848；Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147；H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
また、ヒトES細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2、KhES-3およびKthES11は、京都大学ウイルス・再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
また、ヒトES細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2、KhES-3およびKthES11は、京都大学ウイルス・再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら, Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。ここで「体細胞」とは、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）を意味し、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。例えば、主たるHLA(例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座、あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる。
初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。
多能性幹細胞は、作製直後から本発明の製法（Ｉ）により中内胚葉系への分化抵抗性が解除された状態で維持培養することもできるが、本発明の製法（Ｉ）に供する前に、自体公知の方法により維持培養することができる。維持培養用の基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS-A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、最小必須培地（MEM）、Eagle MEM培地、αMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、DMEM／F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、市販の多能性幹細胞用の培地（例、StemFit、AK02N、Essential 8等）を用いてもよい。
培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。無血清培地（SFM）とは、未処理又は未精製の血清をいずれも含まない培地を意味し、従って、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する培地が挙げられ得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、ヒト血清など）の濃度は、0～20％、好ましくは0～5％、より好ましくは0～2％、最も好ましくは0％（すなわち、無血清）であり得る。SFMは任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物等）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2－メルカプトエタノール、3’－チオグリセロールあるいはこれらの均等物などを適宜含有する物質が挙げられ得る。かかる血清代替物は、例えば、WO 98／30679に記載の方法により調製できる。また、より簡便にするため、市販のものを利用できる。かかる市販の物質としては、Knockout（商標）Serum Replacement（KSR）、Chemically－defined Lipid concentrated、及びGlutamax（Invitorogen）が挙げられる。
培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。例えば、成長因子（例えば、インスリンなど）、ポリアミン類（例えば、プトレシンなど）、ミネラル（例えば、セレン酸ナトリウムなど）、糖類（例えば、グルコースなど）、有機酸（例えば、ピルビン酸、乳酸など）、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸（NEAA）、L－グルタミンなど）、還元剤（例えば、2－メルカプトエタノールなど）、ビタミン類（例えば、アスコルビン酸、d－ビオチンなど）、ステロイド（例えば、［ベータ］－エストラジオール、プロゲステロンなど）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシンなど）、緩衝剤（例えば、HEPESなど）、栄養添加物（例えば、B27 supplement、N2 supplement、StemPro－Nutrient Supplementなど）を挙げることができる。各添加物は自体公知の濃度範囲で含まれることが好ましい。
多能性幹細胞は、フィーダー細胞の存在下又は非存在下にて培養されてよいが、ESC、iPSCなどの多能性幹細胞の培養に使用することができるフィーダー細胞の多くは、自体、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除し得るので、本発明の製法（Ｉ）に供する必要がない場合が多い。また、ヒトへの臨床応用を考慮すれば、多能性幹細胞はフィーダー細胞の非存在下で培養されることが望ましい。従って、本発明の好ましい実施態様において、多能性幹細胞は無フィーダー条件下で培養される。
多能性幹細胞を維持培養するために使用される培養器は、特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられ得る。培養器は細胞接着性であり得る。細胞接着性の培養器は、培養器表面の細胞への接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ECM）などの任意の細胞接着用基質でコートされたものであり得る。細胞接着用基質は、多能性幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。細胞接着用基質としては、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－L－リジン、ポリ-D-リジン、ポリ-L-オルニチン、及びフィブロネクチン並びにそれらの混合物、例えばマトリゲル、並びに溶解細胞膜調製物（lysed cell membrane preparations）が挙げられる（Klimanskaya I et al 2005. Lancet 365：p1636-1641）。これらの細胞接着用基質は、それらの種類に応じて、通常多能性幹細胞の培養に使用される濃度で培養器にコーティングされる。
この培養において、多能性幹細胞を上記培養器上に播き、例えば、約104～105細胞／cm2の細胞密度とし、1～10％ CO2／99～90％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約30～40℃、好ましくは約37℃で培養することができる。
多能性幹細胞を培養する工程において、培養期間の途中で培地交換を行うことができる。培地交換に用いられる培地は、培地交換前の培地と同じ成分を有する培地であっても、異なる成分を有する培地であってもよい。好ましくは、同じ成分を有する培地が用いられる。培地交換の時期は、特に限定されないが、新鮮な培地での培養を開始してから、例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎に行われる。
本発明の製法（Ｉ）は、多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すことを特徴とする。当該処理により、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができる。
本明細書において「インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路」とは、結合リガンドからの刺激を受けてインテグリンβ1（ITGB1）が、インテグリン結合キナーゼ（ILK）を活性化し、活性化ILKがグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β（GSK3β）の9番目のSerをリン酸化してこれを不活性化し、それによってβ-カテニンのリン酸化が抑制されて細胞内にβ-カテニンが蓄積し、結果的にWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が活性化され、その下流遺伝子の発現が誘導される経路を意味する。
ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理としては、例えば、多能性幹細胞におけるITGB1の発現を上昇させる、及び／又はITGB1を活性化状態に変化させる処理等が挙げられる。そのような処理としては、好ましくは、多能性幹細胞に十分なITGB1の発現を付与し得る濃度のITGB1の結合リガンドを、当該多能性幹細胞に接触させることが挙げられるが、これに限定されない。ITGB1の結合リガンドとしては、ある特定の濃度範囲において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与し得るものであれば、特に制限されないが、例えば、分化抵抗性を有する多能性幹細胞にラミニン511もしくはその断片を用いる場合、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2（推奨濃度0.5μg/cm2の1/100～1/2）、好ましくは、0.025～0.125μg/cm2（推奨濃度の1/20～1/4）、より好ましくは、0.03～0.07μg/cm2（推奨濃度の約1/16～1/7）に相当する濃度で、多能性幹細胞と接触させることにより、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができる。一方、本明細書における「分化抵抗性」を有しない多能性幹細胞の場合には、推奨濃度のラミニン511を好ましく用いることができる。
ラミニン511の断片は、インタクトなラミニン511と同等のITGB1への接着強度を有する限り特に制限はないが、少なくともE8断片の領域を含む断片であることが望ましい。
ラミニン511の断片は、インタクトなラミニン511と同等のITGB1への接着強度を有する限り特に制限はないが、少なくともE8断片の領域を含む断片であることが望ましい。
他のラミニン（例えばラミニン411、ラミニン311、ラミニン111及びそれらの断片）やラミニン以外のITGB1の結合リガンド（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、E-カドヘリン、ADAM等）については、対象の多能性幹細胞におけるITGB1の発現量を指標として、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与する濃度を適宜選択することができる。
ITGB1の結合リガンドと多能性幹細胞との接触は、多能性幹細胞を維持培養するために使用される前記培養器の表面に、該結合リガンドを細胞接着用基質としてコーティングし、該培養器上に多能性幹細胞を播種して、前記と同様に維持培養することにより行うことができる。例えば、ITGB1の結合リガンドとしてラミニン511もしくはその断片を使用して、分化抵抗性を有する多能性幹細胞に適用する場合、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2（推奨濃度0.5μg/cm2の1/100～1/2）、好ましくは、0.025～0.125μg/cm2（推奨濃度の1/20～1/4）、より好ましくは、0.03～0.07μg/cm2（推奨濃度の約1/16～1/7）に相当する濃度となるように、ラミニン511もしくはその断片の溶液を培養器に添加し、一定時間静置することにより、培養器表面上にラミニン511もしくはその断片をコーティングすることができる。
ITGB1の結合リガンドと多能性幹細胞との接触時間は、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分であれば特に制限はないが、例えば2日以上、好ましくは3日以上である。ITGB1の結合リガンドとの接触によりITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する場合、接触の間、即ち、該リガンドを細胞接着用基質としてコーティングした培養器内での培養期間を通じて、多能性幹細胞集団において多能性を保持する細胞数は十分に維持されるので（Oct3/4及びSox2の両陽性の細胞が全体の90%、好ましくは95%以上）、接触時間に特に上限はない。
本発明の別の実施態様においては、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理として、例えば、ITGB1の発現促進剤（例、ヒバマタ、ローズマリー、キウイ、フクリョウ、ゴボウ、ニンジン又はコウソウの抽出液（特開平11-246428）等）、ITGB1の発現を抑制する物質（例、ZFYVE21、miR-29C、miR-124等）の発現・機能を阻害する物質（例、抗体、アンチセンス核酸、siRNA又はshRNA等）、ITGB1をコードする核酸などを、多能性幹細胞に接触させることが挙げられる。これらの処理は、上記の物質を多能性幹細胞の培地に添加することにより行うことができる。該物質が核酸の場合、該核酸の細胞内への導入を促進するための核酸導入試薬をさらに添加することが好ましい。
本発明の別の実施態様においては、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理として、多能性幹細胞におけるILKの発現を上昇させる、及び／又はILKを活性化状態に変化させる処理が挙げられる。そのような処理としては、例えば、ILKをコードする核酸、ILKの恒常的活性化体（例、ILKのN末端にミリストイル化シグナル配列を付加するか、C末端にCaaXモチーフを付加することにより、膜局在性の恒常的活性化体とすることができる）をコードする核酸を多能性幹細胞に導入することが挙げられる。
本発明のさらに別の実施態様においては、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理として、多能性幹細胞におけるGSK3β活性、特にβ-カテニンをリン酸化する活性を阻害することが挙げられる。GSK3βは、β-カテニンをリン酸化してユビキチンプロテアソーム系による恒常的分解を促すので、GSK3βを阻害することにより、細胞内β-カテニンが蓄積し、結果としてWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が活性化される。
GSK3β活性を阻害する方法としては、例えば、多能性幹細胞を低分子GSK3β阻害剤に接触させる方法や、β-カテニンの標的リン酸化部位をミミックしたペプチドを多能性幹細胞に接触させる方法等が挙げられるが、低分子GSK3β阻害剤を用いる方法が好ましい。
本発明において、GSK-3β阻害剤は、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、GSK-3β阻害剤として最初に見出された塩化リチウム (LiCl)、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）及び高い選択性を有するCHIR99021 (6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile) が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されている。GSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
多能性幹細胞とGSK3β阻害剤との接触は、GSK3β阻害剤を添加した培地中で多能性幹細胞を培養することにより行うことができる。培地に添加されるGSK3β阻害剤の濃度は薬剤の種類によって異なるが、例えば、CHIR99021の場合、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM 、45μM、50μM等であるがこれらに限定されない。好ましくは、5μM以上（例えば、5μM～50μM、好ましくは5μM～10μM）である。
多能性幹細胞とGSK3β阻害剤との接触は、2～5日間、好ましくは3～4日間行うことができる。
（ＩＩ）多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット
本発明はまた、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する前記いずれかの物質を含有してなる、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための試薬を提供する。好ましい一実施態様において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する物質は、多能性幹細胞に十分なITGB1の発現量を付与し得る濃度のITGB1の結合リガンドである。当該結合リガンドは、好ましくは、それがコーティングされた培養器の形態で提供される。従って、本発明はまた、当該培養器を構成として含む、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット（以下、「本発明のキット」ともいう）を提供する。
本発明はまた、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する前記いずれかの物質を含有してなる、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための試薬を提供する。好ましい一実施態様において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する物質は、多能性幹細胞に十分なITGB1の発現量を付与し得る濃度のITGB1の結合リガンドである。当該結合リガンドは、好ましくは、それがコーティングされた培養器の形態で提供される。従って、本発明はまた、当該培養器を構成として含む、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット（以下、「本発明のキット」ともいう）を提供する。
本発明のキットに含まれる結合リガンドがコーティングされた培養器として、例えば、結合リガンドがラミニン511もしくはその断片の場合、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2（推奨濃度0.5μg/cm2の1/100～1/2）、好ましくは、0.025～0.125μg/cm2（推奨濃度の1/20～1/4）、より好ましくは、0.03～0.07μg/cm2（推奨濃度の約1/16～1/7）に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされた培養器が挙げられる。培養器としては、多能性幹細胞の維持培養のための培養器として上記したものを、同様に用いることができる。
本発明のキットは、培地や培地添加物、継代や分化誘導培養へ細胞を移すための細胞の培養器からの剥離・細胞間接着の解離のための試薬などをさらに含むことができる。
（ＩＩＩ）中胚葉系又は内胚葉系の細胞への分化誘導法
本発明はまた、上記本発明の製法（Ｉ）で作製した中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法（以下、「本発明の製法（ＩＩ）」ともいう）を提供する。本発明の製法（Ｉ）で作製された多能性幹細胞は、中内胚葉系への分化抵抗性が解除されているので、効率よく中胚葉系又は内胚葉系の細胞へ分化誘導することができる。
本発明はまた、上記本発明の製法（Ｉ）で作製した中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法（以下、「本発明の製法（ＩＩ）」ともいう）を提供する。本発明の製法（Ｉ）で作製された多能性幹細胞は、中内胚葉系への分化抵抗性が解除されているので、効率よく中胚葉系又は内胚葉系の細胞へ分化誘導することができる。
本発明の製法（ＩＩ）により作製され得る中胚葉系の細胞は、多能性幹細胞からの分化誘導系が確立している限り、中胚葉系に属するいかなる細胞であってもよいが、例えば、血液細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、心筋細胞、脂肪細胞などが挙げられる。ここで「血液細胞」とは、造血幹細胞から分化する血液中に含まれる任意の細胞を意味し、赤血球、血小板、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、NK細胞、樹状細胞、T細胞、B細胞、並びにそれらの前駆細胞等が包含される。
本発明の製法（ＩＩ）により作製され得る内胚葉系の細胞は、多能性幹細胞からの分化誘導系が確立している限り、内胚葉系に属するいかなる細胞であってもよいが、例えば、膵β細胞、肝細胞、腸管細胞、肺細胞、甲状腺細胞等の細胞又はそれらの前駆細胞などが挙げられる。
中胚葉系及び内胚葉系は、中内胚葉細胞を共通の前駆体とする。従って、中胚葉系又は内胚葉系の細胞への分化誘導工程の初期において、中内胚葉細胞への分化が誘導される。中内胚葉細胞への分化は、例えば、T、Foxa2、Gsc、Mixl1等の中内胚葉マーカーの発現を調べることにより確認することができる。
多能性幹細胞から上記のいずれかの中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞への分化誘導法は、それぞれ当該技術分野において周知であり、例えば、中辻及び末盛編、「実験医学別冊 ES・iPS細胞実験スタンダード」（羊土社発行、2014年）に種々の中胚葉系細胞又は内胚葉細胞への分化誘導法が記載されており、当業者であれば、これらの成書を参照することにより、多能性幹細胞を各種中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞へと分化誘導することができる。
本発明の製法（Ｉ）により得られる多能性幹細胞は、特に血液細胞への分化効率に優れている。従って、好ましい一実施態様においては、本発明の製法（ＩＩ）において作製される中胚葉系細胞は、血液細胞である。多能性幹細胞から造血前駆細胞への分化誘導法としては、例えば、マウス間質細胞であるC3H10TRとの共培養法であるPSC-Sac法が挙げられる (Takayama and Eto Methods Mol Biol. 2012;788:205-17, Takayama et al. J Exp Med. 2010 207(13): 2817-2830)。本法は必要なサイトカインが血管内皮増殖因子（VEGF）のみとシンプルであり、維持培養していた多能性幹細胞を基質から剥離してマイトマイシンC（MMC）処理したC3H 10T1/2細胞上へ播種すると、4日目には多能性幹細胞のフィーダー細胞への接着が認められ、14日目まで培養を続けると、多能性幹細胞からSac様の構造物が形成される。造血前駆細胞はこのSac用構造物の中に得られる。
上記のようにして得られる造血前駆細胞は、自体公知の方法により各種血液細胞にさらに分化させることができる。例えば、巨核球前駆細胞、さらに血小板への分化誘導法については、WO 2018/038242に詳述されている。
（ＩＶ）多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法
上述のように、多能性幹細胞において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化することにより、中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができる。即ち、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、ITGB1の発現が亢進している。従って、多能性幹細胞におけるITGB1の発現を指標として、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の程度を評価することができる。即ち、本発明はまた、多能性幹細胞におけるITGB1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法（以下、「本発明の評価方法」ともいう。）を提供する。
上述のように、多能性幹細胞において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化することにより、中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができる。即ち、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、ITGB1の発現が亢進している。従って、多能性幹細胞におけるITGB1の発現を指標として、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の程度を評価することができる。即ち、本発明はまた、多能性幹細胞におけるITGB1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法（以下、「本発明の評価方法」ともいう。）を提供する。
本発明の評価方法に供される多能性幹細胞は、中内胚葉系への分化抵抗性が不明なものである。ITGB1の発現量の測定は、例えば、被検多能性幹細胞を蛍光標識した抗ITGB1抗体に接触させ、ITGB1発現細胞を可視化した後、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡を用いた画像解析により行うことができる。得られたITGB1発現量を、対照発現量（例えば、分化抵抗性が解除されていることが既知の相当数の多能性幹細胞クローンにおけるITGB1発現量から設定したカットオフ値）と比較し、対照発現量以上である場合に、被検多能性幹細胞は中内胚葉系への分化抵抗性が解除されていると判定することができる。
別の実施態様において、多能性幹細胞として、ITGB1遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子（例、蛍光タンパク質遺伝子）を発現する細胞から誘導された多能性幹細胞を用い、該多能性幹細胞を、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与し得る濃度が未知の細胞接着用基質でコーティングした培養器内で維持培養し、上記の評価方法を実施することにより、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与し得る、該細胞接着用基質の濃度を決定することができる。従って、本発明はまた、そのようにして決定された濃度で、該細胞接着用基質を多能性幹細胞に接触させることを含む、中内胚葉細胞への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法を提供する。
以下に、実施例によって本発明を更に説明するが、本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない。
（材料及び方法）
１．多能性幹細胞株
分化実験、イメージング、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、細胞内染色、細胞接着アッセイに用いたヒトiPS細胞株AK5 (Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)は、京都大学iPS細胞研究所内で分与されたものである。また、実施例８で使用したヒトiPS細胞株692D2（Okita et al., Stem Cells, 31: 458-466 (2013)）は、京都大学iPS細胞研究所 沖田圭介博士より分与されたものであり、ヒトES細胞株KthES11Sは、京都大学ウイルス・再生医科学研究所 末盛博文博士より分与されたものである。
１．多能性幹細胞株
分化実験、イメージング、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、細胞内染色、細胞接着アッセイに用いたヒトiPS細胞株AK5 (Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)は、京都大学iPS細胞研究所内で分与されたものである。また、実施例８で使用したヒトiPS細胞株692D2（Okita et al., Stem Cells, 31: 458-466 (2013)）は、京都大学iPS細胞研究所 沖田圭介博士より分与されたものであり、ヒトES細胞株KthES11Sは、京都大学ウイルス・再生医科学研究所 末盛博文博士より分与されたものである。
２．多能性幹細胞（PSCs）の維持培養
２－１．マウス胎児線維芽細胞（MEF）フィーダー上での維持培養
マイトマイシンCにて処理を行ったMEFを播種した6cm dish上にて、既報に従ってPSCsの培養を行った (Takayama et al., Blood, 111(11): 5298-5306, 2008)。培地として、MEM non-essential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 20% KnockOut（商標）Serum Replacement (Gibco/ Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), 5 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF; Wako, Osaka, Japan) を添加したDulbecco modified Eagle medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) を使用した。
２－１．マウス胎児線維芽細胞（MEF）フィーダー上での維持培養
マイトマイシンCにて処理を行ったMEFを播種した6cm dish上にて、既報に従ってPSCsの培養を行った (Takayama et al., Blood, 111(11): 5298-5306, 2008)。培地として、MEM non-essential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 20% KnockOut（商標）Serum Replacement (Gibco/ Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), 5 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF; Wako, Osaka, Japan) を添加したDulbecco modified Eagle medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) を使用した。
２－２．ラミニン上での維持培養
既報に従って、各種ラミニンE8断片上にてフィーダーフリー条件下でPSCsを培養した(Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)。使用した組換えラミニンE8断片のうち、LM511 E8はiMatrix-511/iMatrix-511 silk (Nippi, Ibaraki, Japan) を、その他のラミニンE8（LM421/121）断片は 関口清俊博士 (大阪大学 蛋白質研究所) にご提供いただいた。それぞれのラミニン断片を、dish底面積に対して 0.5 μg/cm2となるように添加した。尚、ラミニンの希釈実験では、Laminin 511E8 0.5 μg/cm2条件を[x1]として、[x1/2]、[x1/4]、[x1/8]、[x1/16]の条件で、上記と同様にコーティングを行った。
具体的には、組換えラミニンE8断片をPBS(-)に懸濁し、dish上へ添加、37℃にて1時間以上静置した。AK02N培地(Ajinomoto) を少量添加し馴化させ、ラミニン-PBS溶液を吸引除去した後、Y-27632を添加したAK02N培地へ置換した。これらのdishへPSCsを播種した。翌日以降も、細胞の様子を伺いながら適宜Y-27632を添加したAK02N培地で培地交換し、培養を継続した。
既報に従って、各種ラミニンE8断片上にてフィーダーフリー条件下でPSCsを培養した(Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)。使用した組換えラミニンE8断片のうち、LM511 E8はiMatrix-511/iMatrix-511 silk (Nippi, Ibaraki, Japan) を、その他のラミニンE8（LM421/121）断片は 関口清俊博士 (大阪大学 蛋白質研究所) にご提供いただいた。それぞれのラミニン断片を、dish底面積に対して 0.5 μg/cm2となるように添加した。尚、ラミニンの希釈実験では、Laminin 511E8 0.5 μg/cm2条件を[x1]として、[x1/2]、[x1/4]、[x1/8]、[x1/16]の条件で、上記と同様にコーティングを行った。
具体的には、組換えラミニンE8断片をPBS(-)に懸濁し、dish上へ添加、37℃にて1時間以上静置した。AK02N培地(Ajinomoto) を少量添加し馴化させ、ラミニン-PBS溶液を吸引除去した後、Y-27632を添加したAK02N培地へ置換した。これらのdishへPSCsを播種した。翌日以降も、細胞の様子を伺いながら適宜Y-27632を添加したAK02N培地で培地交換し、培養を継続した。
３．細胞分化実験
PSCsから血球分化を行う方法としては、マウス間質細胞であるC3H10TRとの共培養法であるPSC-Sac法を用いた (Takayama and Eto Methods Mol Biol. 2012;788:205-17, Takaayama et al. J Exp Med. 2010 207(13): 2817-2830)。PSCsは同数を2 wellに分けて培養しておき、1つのwellに対してPBSで洗浄後、TrypLE（商標） Select (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) で曝露した後、37℃で4分間静置し、細胞間接着が剥がれたことを確認の上でCell scraperでdishより細胞を剥離し、Trypan Blueと血球計算板で細胞数を計数した。
他方のwellをDispase I (Wako, Osaka, Japan) で曝露し、37℃で2分間静置した後、細胞をCell scraperで剥離し、培地で穏やかに懸濁した。マイトマイシンCにて処理後、ゼラチンコートを施した10cm dish上に播種し、37℃、5% CO2環境にて一晩静置したC3H10TR（Riken Bio-Resource Center, Tsukuba, Ibaraki, Japan）フィーダー細胞上に、PSCsを0.7-1x10^5の細胞数となるように播種し、分化誘導を開始した。Day0-7までは5% O2環境にて培養を行った。分化誘導開始時より造血細胞分化培地［IMDM media (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) with 15% fetal bovine serum (FBS), insulin/ transferrin/selenite solution (Gibco/Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), Ascorbic acid, 1-thioglycerol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA -Aldrich), 20ng/ml recombinant human VEGF (VEGF-A165; Wako, Osaka, Japan)］にて3-4日に一度培地交換を行い、14日目にdish上の細胞を回収し、Trypan Blueと血球計算板で細胞数を計数した。
CHIR99021 (ADOOQ Bioscience, Irvine, CA, USA) 添加実験は，ラミニン511 E8断片（LM511）上で培養維持されている分化予定のPSCsに対して、分化誘導開始4日前、3日前、2日前又は1日前から分化誘導開始時までの間、それぞれにCHIR99021 6nMを添加した。CHIR99021を添加していない群には、同日にDMSOを同量添加した。
PSCsから血球分化を行う方法としては、マウス間質細胞であるC3H10TRとの共培養法であるPSC-Sac法を用いた (Takayama and Eto Methods Mol Biol. 2012;788:205-17, Takaayama et al. J Exp Med. 2010 207(13): 2817-2830)。PSCsは同数を2 wellに分けて培養しておき、1つのwellに対してPBSで洗浄後、TrypLE（商標） Select (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) で曝露した後、37℃で4分間静置し、細胞間接着が剥がれたことを確認の上でCell scraperでdishより細胞を剥離し、Trypan Blueと血球計算板で細胞数を計数した。
他方のwellをDispase I (Wako, Osaka, Japan) で曝露し、37℃で2分間静置した後、細胞をCell scraperで剥離し、培地で穏やかに懸濁した。マイトマイシンCにて処理後、ゼラチンコートを施した10cm dish上に播種し、37℃、5% CO2環境にて一晩静置したC3H10TR（Riken Bio-Resource Center, Tsukuba, Ibaraki, Japan）フィーダー細胞上に、PSCsを0.7-1x10^5の細胞数となるように播種し、分化誘導を開始した。Day0-7までは5% O2環境にて培養を行った。分化誘導開始時より造血細胞分化培地［IMDM media (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) with 15% fetal bovine serum (FBS), insulin/ transferrin/selenite solution (Gibco/Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), Ascorbic acid, 1-thioglycerol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA -Aldrich), 20ng/ml recombinant human VEGF (VEGF-A165; Wako, Osaka, Japan)］にて3-4日に一度培地交換を行い、14日目にdish上の細胞を回収し、Trypan Blueと血球計算板で細胞数を計数した。
CHIR99021 (ADOOQ Bioscience, Irvine, CA, USA) 添加実験は，ラミニン511 E8断片（LM511）上で培養維持されている分化予定のPSCsに対して、分化誘導開始4日前、3日前、2日前又は1日前から分化誘導開始時までの間、それぞれにCHIR99021 6nMを添加した。CHIR99021を添加していない群には、同日にDMSOを同量添加した。
４．フローサイトメトリー（FCM）
細胞は、Trypan Blueと血球計算板を用いて細胞数を計数した。各サンプルは3％ FBSを含むPBS (Staining Medium) に懸濁し、各種抗体を添加して氷上暗所で30分間静置した後、FACS Verse (BD bioscience) にて測定を行った。hPSCsの測定については，TRA-1-60陽性細胞を計測した。抗体として、Brilliant Violet 421（商標） anti-human CD34 antibody(561), Pacific Blue（商標） Anti-human CD326 antibody (BioLegend, San Diego, CA, USA), APC conjugated CD43 monoclonal antibody(eBio84-3C1)(eBioscience/Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), PE mouse anti-human CD29 antibody (BD, Bedford, MA, USA), Propidium Iodide (Sigma), Alexa Fluor（登録商標） 647 Mouse anti-Human TRA-1-60 Antigen (BD, Bedford, MA, USA)を用いた。
細胞は、Trypan Blueと血球計算板を用いて細胞数を計数した。各サンプルは3％ FBSを含むPBS (Staining Medium) に懸濁し、各種抗体を添加して氷上暗所で30分間静置した後、FACS Verse (BD bioscience) にて測定を行った。hPSCsの測定については，TRA-1-60陽性細胞を計測した。抗体として、Brilliant Violet 421（商標） anti-human CD34 antibody(561), Pacific Blue（商標） Anti-human CD326 antibody (BioLegend, San Diego, CA, USA), APC conjugated CD43 monoclonal antibody(eBio84-3C1)(eBioscience/Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), PE mouse anti-human CD29 antibody (BD, Bedford, MA, USA), Propidium Iodide (Sigma), Alexa Fluor（登録商標） 647 Mouse anti-Human TRA-1-60 Antigen (BD, Bedford, MA, USA)を用いた。
５．イメージング
蛍光顕微鏡写真は、高速多光子共焦点レーザー顕微鏡システム (Nikon A1R system) によって得た。簡潔にいうと、各種ラミニン断片でコーティングを施したμ-Dish 35 mm (ibidi, GmbH, Martinsried, Germany) へiPS細胞を播種し、4日間培養した。コロニー形成が見られたところで、4% PFAで15分間固定し、洗浄した後、3% FBS含有PBSにて希釈したBB515 Mouse Anti-human CD29 (BD bioscience, Bedford, MA, USA)を添加し、30分間静置した。十分に洗浄した後、観察を行った。画像はNIS-Elements software (Nikon) にて解析した。
蛍光顕微鏡写真は、高速多光子共焦点レーザー顕微鏡システム (Nikon A1R system) によって得た。簡潔にいうと、各種ラミニン断片でコーティングを施したμ-Dish 35 mm (ibidi, GmbH, Martinsried, Germany) へiPS細胞を播種し、4日間培養した。コロニー形成が見られたところで、4% PFAで15分間固定し、洗浄した後、3% FBS含有PBSにて希釈したBB515 Mouse Anti-human CD29 (BD bioscience, Bedford, MA, USA)を添加し、30分間静置した。十分に洗浄した後、観察を行った。画像はNIS-Elements software (Nikon) にて解析した。
６．ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングは以前に記載されているように行った (Eto et al., 2007; Nishikii et al., 2008, Nakamura et al., 2014)。 簡潔にいうと、Protease inhibitor cocktail（Roche、Basel、Switzerland）とphosphatase inhibitor cocktail (Nacalai tesque, Kyoto, Japan) を添加したTNE緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 7.8, 150mM NaCl, 1％ NP-40及び1mM EDTA）で、同数の細胞を処理した細胞溶解物の試料15μlを、4-15％Mini-PROTEAN（登録商標） TGX Precast Gels（Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA）上で電気泳動し、分離した。次いで、polyvinylidene difluoride membranes (GE Healthcare Life Sciences,Buckinghamshire,UK）に転写した。ILK1 (4G9), phospho-GSK3β(Ser9)(D85E12), β-catenin (D10A8)(CST, Chicago, USA), β-actin (AC-74)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) にて一次抗体反応を行ない、anti-mouse IgG-HRP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 及びAnti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (CST, Chicago, USA) を2次抗体として用いてSuperSignal（商標） West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA）にて可視化した。
ウェスタンブロッティングは以前に記載されているように行った (Eto et al., 2007; Nishikii et al., 2008, Nakamura et al., 2014)。 簡潔にいうと、Protease inhibitor cocktail（Roche、Basel、Switzerland）とphosphatase inhibitor cocktail (Nacalai tesque, Kyoto, Japan) を添加したTNE緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 7.8, 150mM NaCl, 1％ NP-40及び1mM EDTA）で、同数の細胞を処理した細胞溶解物の試料15μlを、4-15％Mini-PROTEAN（登録商標） TGX Precast Gels（Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA）上で電気泳動し、分離した。次いで、polyvinylidene difluoride membranes (GE Healthcare Life Sciences,Buckinghamshire,UK）に転写した。ILK1 (4G9), phospho-GSK3β(Ser9)(D85E12), β-catenin (D10A8)(CST, Chicago, USA), β-actin (AC-74)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) にて一次抗体反応を行ない、anti-mouse IgG-HRP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 及びAnti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (CST, Chicago, USA) を2次抗体として用いてSuperSignal（商標） West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA）にて可視化した。
７．細胞内染色（ICS）及びフローサイトメトリー（FCM）解析
多能性マーカーであるSOX2とOCT3/4の検出のために、フローサイトメトリーによる細胞内染色を実施した。簡潔にいうと、Zombie（商標） Aqua Fixable Viability Kit (BioLegend, San Diego, CA, USA) にて死細胞染色を実施し、洗浄した後、PerFix-ncキットReagent1にて室温で15分静置し、細胞を固定した。続いて、氷冷した100% メタノールで5分間固定、0.5% サポニンを用いて室温で10分間インキュベートし透過処理を行った。PBS（3% FBS含有）にて洗浄懸濁した後、V450 Mouse anti-Sox2及びAlexa Fluor（登録商標） 488 conjugated Mouse anti-OCT3/4 (BD biosciences, Bedford, MA, USA) を添加し、氷上で30分間インキュベーションした。余剰抗体を洗浄ののち、FACSVerse（商標） (BD Biosciences) にて解析を行った。
多能性マーカーであるSOX2とOCT3/4の検出のために、フローサイトメトリーによる細胞内染色を実施した。簡潔にいうと、Zombie（商標） Aqua Fixable Viability Kit (BioLegend, San Diego, CA, USA) にて死細胞染色を実施し、洗浄した後、PerFix-ncキットReagent1にて室温で15分静置し、細胞を固定した。続いて、氷冷した100% メタノールで5分間固定、0.5% サポニンを用いて室温で10分間インキュベートし透過処理を行った。PBS（3% FBS含有）にて洗浄懸濁した後、V450 Mouse anti-Sox2及びAlexa Fluor（登録商標） 488 conjugated Mouse anti-OCT3/4 (BD biosciences, Bedford, MA, USA) を添加し、氷上で30分間インキュベーションした。余剰抗体を洗浄ののち、FACSVerse（商標） (BD Biosciences) にて解析を行った。
８．細胞接着アッセイ
Stem Cell Reports, Vol. 11. Issue 1, 142-156, 2018を参照し、一部改変して行った。48 well plateに対して、各種ラミニンを0.5 μg/cm2となるようにコーティングし、37℃で1時間以上静置した後、Y-27632を添加したAK02N培地 (Ajinomoto, Japan) へ置換した。継代培養していたヒトiPS細胞に対して、PBSで洗浄後、TrypLE（商標） Select (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) に37℃で10分間曝露した。ピペッティングにてSingle cellとし、各Wellへ0.5x10^5ずつ播種し、37℃、5% CO2で1時間静置した。浮遊細胞をDMEM/F12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) にて2回洗浄、除去した。4% PFA (Wako, Osaka, Japan) を添加し、15分間静置して固定し、100%エタノールを添加して5分間静置した。メタノールに0.4% Crystal Violetを添加したもので置換し、室温で5分間静置した。脱塩水にて3回洗浄し、上清を除去した。1% SDS 250 μlにて洗浄し、上清をNanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) にて、595 nm波長を用い、光学密度を測定した．
Stem Cell Reports, Vol. 11. Issue 1, 142-156, 2018を参照し、一部改変して行った。48 well plateに対して、各種ラミニンを0.5 μg/cm2となるようにコーティングし、37℃で1時間以上静置した後、Y-27632を添加したAK02N培地 (Ajinomoto, Japan) へ置換した。継代培養していたヒトiPS細胞に対して、PBSで洗浄後、TrypLE（商標） Select (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) に37℃で10分間曝露した。ピペッティングにてSingle cellとし、各Wellへ0.5x10^5ずつ播種し、37℃、5% CO2で1時間静置した。浮遊細胞をDMEM/F12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) にて2回洗浄、除去した。4% PFA (Wako, Osaka, Japan) を添加し、15分間静置して固定し、100%エタノールを添加して5分間静置した。メタノールに0.4% Crystal Violetを添加したもので置換し、室温で5分間静置した。脱塩水にて3回洗浄し、上清を除去した。1% SDS 250 μlにて洗浄し、上清をNanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) にて、595 nm波長を用い、光学密度を測定した．
（結果）
参考例１ ラミニン511 E8断片（LM511）上で維持培養したPSCsは造血細胞への分化抵抗性を示す
MEF上で維持培養したPSCsを基質から剥離し、MMC処理したC3H10TR細胞上へ播種すると、4日目にはPSCsはフィーダー細胞への接着が認められ、さらに14日目まで培養を続けると、PSCsからSac様の構造物が形成された。造血前駆細胞はこのSac様構造物の中に得られた。一方、LM511で培養維持したPSCsを同様にC3H10TR細胞へ播種しても、該フィーダー細胞へはほとんど接着せず、14日目になってもSac様構造物はほとんど見られなかった。14日目に細胞を回収し、CD34+CD43+の造血前駆細胞を計数した結果、前記の観察を反映して、LM511で培養維持した多能性幹細胞からは、ほとんど造血前駆細胞が得られなかった（図１）。
参考例１ ラミニン511 E8断片（LM511）上で維持培養したPSCsは造血細胞への分化抵抗性を示す
MEF上で維持培養したPSCsを基質から剥離し、MMC処理したC3H10TR細胞上へ播種すると、4日目にはPSCsはフィーダー細胞への接着が認められ、さらに14日目まで培養を続けると、PSCsからSac様の構造物が形成された。造血前駆細胞はこのSac様構造物の中に得られた。一方、LM511で培養維持したPSCsを同様にC3H10TR細胞へ播種しても、該フィーダー細胞へはほとんど接着せず、14日目になってもSac様構造物はほとんど見られなかった。14日目に細胞を回収し、CD34+CD43+の造血前駆細胞を計数した結果、前記の観察を反映して、LM511で培養維持した多能性幹細胞からは、ほとんど造血前駆細胞が得られなかった（図１）。
実施例１ Wntシグナル作動薬はLM511上で培養維持したPSCsの造血細胞分化抵抗性を解除する
本発明者らは以前、ラミニン511上で維持した多能性幹細胞は中内胚葉系への分化抵抗性を示すのに対し、ラミニン421やラミニン121上で維持した多能性幹細胞では、この分化抵抗性が解除され、中内胚葉系、特に血液細胞に分化しやすい傾向を示すこと、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路の下流遺伝子群の発現が上昇していることを報告している（WO 2018/0378242）。そこで、造血前駆細胞を作ることができなかったLM511で培養維持した細胞に対して、 Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を刺激することによって、造血細胞への分化抵抗性が解除されるかを調べた。該シグナル伝達経路の中間メディエータであるGSK3βを、CHIR99021を用いて阻害することで、細胞内にβ-カテニンの蓄積を促した。GSK3β阻害剤で処理した細胞を用いて、PSC-sac法で分化誘導を行ったところ、LM511上で培養維持したPSCsによる造血細胞への分化誘導が改善され、造血前駆細胞数を増やすことができた（図２）。
これらの結果より、ラミニンによる細胞の足場は、PSCs内部における造血系分化への経路を、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を介して調節していると考えられた。
本発明者らは以前、ラミニン511上で維持した多能性幹細胞は中内胚葉系への分化抵抗性を示すのに対し、ラミニン421やラミニン121上で維持した多能性幹細胞では、この分化抵抗性が解除され、中内胚葉系、特に血液細胞に分化しやすい傾向を示すこと、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路の下流遺伝子群の発現が上昇していることを報告している（WO 2018/0378242）。そこで、造血前駆細胞を作ることができなかったLM511で培養維持した細胞に対して、 Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を刺激することによって、造血細胞への分化抵抗性が解除されるかを調べた。該シグナル伝達経路の中間メディエータであるGSK3βを、CHIR99021を用いて阻害することで、細胞内にβ-カテニンの蓄積を促した。GSK3β阻害剤で処理した細胞を用いて、PSC-sac法で分化誘導を行ったところ、LM511上で培養維持したPSCsによる造血細胞への分化誘導が改善され、造血前駆細胞数を増やすことができた（図２）。
これらの結果より、ラミニンによる細胞の足場は、PSCs内部における造血系分化への経路を、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を介して調節していると考えられた。
実施例２ 造血細胞分化誘導能を有するラミニン上で培養維持したPSCsはインテグリンβ1を高発現する
LM511/LM421/LM121のそれぞれで培養維持されたPSCsにおけるインテグリンβ1（ITGB1）の発現レベルを調べた。ITGB1は、ラミニンのレセプターとして知られる細胞表面タンパク質で、PSCsにおいては細胞の生存と維持に重要であることが報告されている。FCMおよび蛍光顕微鏡を用いた観察において、造血の特徴を持つLM421とLM121で培養維持したPSCsは、非造血の特徴を持つLM511と比較してITGB1の発現が高かった（図３）。
LM511/LM421/LM121のそれぞれで培養維持されたPSCsにおけるインテグリンβ1（ITGB1）の発現レベルを調べた。ITGB1は、ラミニンのレセプターとして知られる細胞表面タンパク質で、PSCsにおいては細胞の生存と維持に重要であることが報告されている。FCMおよび蛍光顕微鏡を用いた観察において、造血の特徴を持つLM421とLM121で培養維持したPSCsは、非造血の特徴を持つLM511と比較してITGB1の発現が高かった（図３）。
実施例３ 造血細胞分化誘導能を有するラミニンはITGB1-β-カテニンシグナリングを活性化する
いくつかのがんに関する報告では、ITGB1がILK/pGSK3βを介してβ-カテニンの蓄積量を変化させ、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を調節していると考えられている。そこで、ラミニンとPSCsの関係においても同様の経路が働いているかを確認するため、ウェスタンブロッティング解析を行った。その結果、MEFで維持したものはILK/pGSK3β/β-カテニンの量が最も多かった。また、LM421とLM121で培養維持したものは、LM511で培養維持したものよりもILK/pGSK3β/β-カテニンの量が多かった（図４）。これらの結果は、細胞表面のITGB1の量が増えることでITGB1以下のシグナルが強くなり、β-カテニンの細胞内蓄積量が増えて、結果的にWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が賦活化されたことを示唆している。
いくつかのがんに関する報告では、ITGB1がILK/pGSK3βを介してβ-カテニンの蓄積量を変化させ、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を調節していると考えられている。そこで、ラミニンとPSCsの関係においても同様の経路が働いているかを確認するため、ウェスタンブロッティング解析を行った。その結果、MEFで維持したものはILK/pGSK3β/β-カテニンの量が最も多かった。また、LM421とLM121で培養維持したものは、LM511で培養維持したものよりもILK/pGSK3β/β-カテニンの量が多かった（図４）。これらの結果は、細胞表面のITGB1の量が増えることでITGB1以下のシグナルが強くなり、β-カテニンの細胞内蓄積量が増えて、結果的にWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が賦活化されたことを示唆している。
実施例４ LM511濃度とITGB1発現の関係
本発明者らは、PSCsの維持培養研究の過程で、LM421/LM121は、LM511に比べて細胞-基質間接着が弱い傾向があることに気づいていた。そこで、上記の結果がラミニンの種類によるものなのか、それともITGB1とラミニンの間の「接着の強さ」に依存したものなのかを確かめた。本実施例では、非造血性のラミニンであるLM511を段階希釈してコーティングしたプレートへPSCsを播種し、培養維持した。これは、LM511を希釈することで、ラミニンとしてのサブユニットを5-1-1のまま変えずに、接着の強さ（=インテグリン-ラミニン結合数）を調節したものである。その結果、FCMおよび蛍光顕微鏡による解析では、弱い細胞-基質間接着の条件ほどITGB1の発現が高く、ITGB1の発現量がラミニンサブユニットの種類ではなく、細胞-基質接着の量、つまり接着の強さに依存したものであることが示された（図５）。
本発明者らは、PSCsの維持培養研究の過程で、LM421/LM121は、LM511に比べて細胞-基質間接着が弱い傾向があることに気づいていた。そこで、上記の結果がラミニンの種類によるものなのか、それともITGB1とラミニンの間の「接着の強さ」に依存したものなのかを確かめた。本実施例では、非造血性のラミニンであるLM511を段階希釈してコーティングしたプレートへPSCsを播種し、培養維持した。これは、LM511を希釈することで、ラミニンとしてのサブユニットを5-1-1のまま変えずに、接着の強さ（=インテグリン-ラミニン結合数）を調節したものである。その結果、FCMおよび蛍光顕微鏡による解析では、弱い細胞-基質間接着の条件ほどITGB1の発現が高く、ITGB1の発現量がラミニンサブユニットの種類ではなく、細胞-基質接着の量、つまり接着の強さに依存したものであることが示された（図５）。
実施例５ 希釈したLM511上で培養維持したPSCsは効率よく造血前駆細胞に誘導される
次に、段階希釈したLM511上で培養維持したPSCsをPSC-sac法で培養したところ、LM511の推奨濃度 (x1) で培養維持したPSCsから分化した造血前駆細胞数よりも、希釈したLM511で培養維持したPSCsから分化した造血前駆細胞数の方が多く、LM511（x1）で培養維持することで起きた血液細胞への分化抵抗性を解除することができた（図６）。また、ITGB1の発現量が高いPSCsの方が，血液細胞へ分化させた時の造血能が高かった（図６）。
以上の結果をまとめると、細胞外基質と細胞の弱い接着は，ITGB1の発現を誘導し，十分な量のITGB1が発現すると下流のシグナルが変化し、β-カテニンが蓄積してWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が賦活化され、造血前駆細胞の分化が促進されると考えられる。
次に、段階希釈したLM511上で培養維持したPSCsをPSC-sac法で培養したところ、LM511の推奨濃度 (x1) で培養維持したPSCsから分化した造血前駆細胞数よりも、希釈したLM511で培養維持したPSCsから分化した造血前駆細胞数の方が多く、LM511（x1）で培養維持することで起きた血液細胞への分化抵抗性を解除することができた（図６）。また、ITGB1の発現量が高いPSCsの方が，血液細胞へ分化させた時の造血能が高かった（図６）。
以上の結果をまとめると、細胞外基質と細胞の弱い接着は，ITGB1の発現を誘導し，十分な量のITGB1が発現すると下流のシグナルが変化し、β-カテニンが蓄積してWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が賦活化され、造血前駆細胞の分化が促進されると考えられる。
実施例６ GSK3β阻害剤による調節はPSCsの多能性維持を妨げる
実施例１において、CHIR99021を添加することで、LM511で培養維持したPSCsの血液細胞への分化抵抗性を解除できたが、C3H10TRフィーダー細胞上へ播種して分化を開始する直前には、該PSCsではOCT3/4・SOX2両陽性の多能性が維持されている細胞数は減少していた。これに対し、LM511を段階希釈する方法を用いた場合や、LM421/121などのその他のラミニンを用いて維持した場合は、OCT3/4・SOX2両陽性の多能性が維持されている細胞の割合が高く、「多能性の維持」と「分化抵抗性の解除」を両立することができた（図７）。
実施例１において、CHIR99021を添加することで、LM511で培養維持したPSCsの血液細胞への分化抵抗性を解除できたが、C3H10TRフィーダー細胞上へ播種して分化を開始する直前には、該PSCsではOCT3/4・SOX2両陽性の多能性が維持されている細胞数は減少していた。これに対し、LM511を段階希釈する方法を用いた場合や、LM421/121などのその他のラミニンを用いて維持した場合は、OCT3/4・SOX2両陽性の多能性が維持されている細胞の割合が高く、「多能性の維持」と「分化抵抗性の解除」を両立することができた（図７）。
実施例７ 各種ラミニンの細胞－基質間接着強度
造血性のLM421及びLM121と、非造血性のLM511とで、細胞-基質間接着強度を比較した。その結果、造血性のLM421やLM121は、非造血性のLM511に比べて、細胞-基質間接着が弱いことが確認された（図８）。
造血性のLM421及びLM121と、非造血性のLM511とで、細胞-基質間接着強度を比較した。その結果、造血性のLM421やLM121は、非造血性のLM511に比べて、細胞-基質間接着が弱いことが確認された（図８）。
実施例８ 分化抵抗性を解除し得るラミニン511濃度は多能性幹細胞クローンごとに異なる
ヒトiPS細胞株AK5（hPSC1）、ヒトiPS細胞株692D2（hPSC2）及びヒトES細胞株KthES11（hPSC3）について、実施例４及び５と同様にして、LM511濃度とITGB1発現の関係、並びにLM511濃度と造血前駆細胞への分化能の関係について調べた。その結果、hPSC1では、推奨濃度 (x1) のLM511で維持培養するよりも、希釈したLM511で維持培養する方が、ITGB1の発現量が高く、造血前駆細胞への分化効率が増すのに対し、hPSC2では、推奨濃度（x1）のLM511上で維持培養した場合でも十分なITGB1発現量を示し、造血前駆細胞への分化抵抗性は認められなかった。また、LM511を段階希釈してもITGB1発現量に大きな変化はなく、造血前駆細胞への分化効率は、推奨濃度か2倍濃度でむしろ高いことがわかった（図９Ａ及びＢ）。hPSC3はLM511の推奨濃度でほとんど造血前駆細胞へ分化せず、高い分化抵抗性を示したが、LM511を段階希釈して用いることにより、ある程度の造血前駆細胞への分化能が得られた（図９Ａ及びＢ）。PSCsのITGB1相対発現量と造血前駆細胞への分化効率との間には、正の相関が認められた（図９Ｃ）。
以上の結果から、ITGB1の発現量を指標として多能性幹細胞クローンの中内胚葉系への易分化性を評価することができ、推奨濃度のLM511で分化抵抗性を有すると判定された多能性幹細胞に対しては、LM511を推奨濃度よりも低濃度に希釈して用いることで、当該分化抵抗性を解除することができることが示された。
ヒトiPS細胞株AK5（hPSC1）、ヒトiPS細胞株692D2（hPSC2）及びヒトES細胞株KthES11（hPSC3）について、実施例４及び５と同様にして、LM511濃度とITGB1発現の関係、並びにLM511濃度と造血前駆細胞への分化能の関係について調べた。その結果、hPSC1では、推奨濃度 (x1) のLM511で維持培養するよりも、希釈したLM511で維持培養する方が、ITGB1の発現量が高く、造血前駆細胞への分化効率が増すのに対し、hPSC2では、推奨濃度（x1）のLM511上で維持培養した場合でも十分なITGB1発現量を示し、造血前駆細胞への分化抵抗性は認められなかった。また、LM511を段階希釈してもITGB1発現量に大きな変化はなく、造血前駆細胞への分化効率は、推奨濃度か2倍濃度でむしろ高いことがわかった（図９Ａ及びＢ）。hPSC3はLM511の推奨濃度でほとんど造血前駆細胞へ分化せず、高い分化抵抗性を示したが、LM511を段階希釈して用いることにより、ある程度の造血前駆細胞への分化能が得られた（図９Ａ及びＢ）。PSCsのITGB1相対発現量と造血前駆細胞への分化効率との間には、正の相関が認められた（図９Ｃ）。
以上の結果から、ITGB1の発現量を指標として多能性幹細胞クローンの中内胚葉系への易分化性を評価することができ、推奨濃度のLM511で分化抵抗性を有すると判定された多能性幹細胞に対しては、LM511を推奨濃度よりも低濃度に希釈して用いることで、当該分化抵抗性を解除することができることが示された。
本発明によれば、ラミニン511又はその断片を推奨濃度より低濃度に希釈して用いることで、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、維持培養のコスト削減と効率的な分化誘導とを同時に達成することができ、中内胚葉系の細胞の製造において、きわめて有用である。
本出願は、2018年10月31日付で日本国に出願された特願2018-205912を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含されるものである。
Claims (15)
- 中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法であって、
（１）中内胚葉系への分化抵抗性を有する多能性幹細胞を提供すること、
（２）該多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すこと（但し、多能性幹細胞を、ラミニン421もしくはその断片及び／又はラミニン121もしくはその断片に接触させることを除く）、並びに
（３）（２）で処理された細胞を、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞として取得すること
を含む、方法。 - 前記多能性幹細胞は、さらに中胚葉系への分化抵抗性が解除されている、請求項１に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、さらに血液細胞への分化抵抗性が解除されている、請求項２に記載の方法。
- 前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.025～0.125μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.03～0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記（３）で取得される多能性幹細胞の90%以上がOct3/4陽性かつSox2陽性である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化処理が、多能性幹細胞をGSK3β阻害剤に接触させることを含まない、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- （１）請求項１～９のいずれか一項に記載の方法により中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を作製する工程、及び
（２）工程（１）で得られた細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程
を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法。 - 前記中胚葉系の細胞が、血液細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、心筋細胞又は脂肪細胞である、請求項１０に記載の方法。
- 前記中胚葉系の細胞が血液細胞である、請求項１０に記載の方法。
- 前記内胚葉系の細胞が、膵β細胞、肝細胞、腸管細胞、肺細胞又は甲状腺細胞である、請求項１０に記載の方法。
- 多能性幹細胞におけるインテグリンβ1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法。
- 前記（１）の中内胚葉系への分化抵抗性を有する多能性幹細胞が、請求項１４に記載の方法により当該分化抵抗性を有すると評価されたものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018205912 | 2018-10-31 | ||
| JP2018205912 | 2018-10-31 | ||
| PCT/JP2019/042608 WO2020090903A1 (ja) | 2018-10-31 | 2019-10-30 | 中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2020090903A1 JPWO2020090903A1 (ja) | 2021-09-30 |
| JP7437766B2 true JP7437766B2 (ja) | 2024-02-26 |
Family
ID=70462273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020553984A Active JP7437766B2 (ja) | 2018-10-31 | 2019-10-30 | 中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220010283A1 (ja) |
| EP (1) | EP3875578A4 (ja) |
| JP (1) | JP7437766B2 (ja) |
| WO (1) | WO2020090903A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4271798A1 (en) | 2020-12-30 | 2023-11-08 | CRISPR Therapeutics AG | Compositions and methods for differentiating stem cells into nk cells |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016010082A1 (ja) | 2014-07-16 | 2016-01-21 | 国立大学法人大阪大学 | ラミニンフラグメントの細胞培養基質活性増強方法 |
| JP2017023019A (ja) | 2015-07-17 | 2017-02-02 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 |
| WO2017164257A1 (ja) | 2016-03-23 | 2017-09-28 | 国立大学法人京都大学 | 血球分化能の高い中胚葉誘導方法 |
| WO2018128177A1 (ja) | 2017-01-05 | 2018-07-12 | 味の素株式会社 | インスリン産生細胞分化誘導促進剤 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
| JP2001508302A (ja) | 1997-01-10 | 2001-06-26 | ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド | 胚性幹細胞血清置換 |
| JP4331282B2 (ja) | 1998-03-04 | 2009-09-16 | 花王株式会社 | インテグリン発現促進剤 |
| EP4223769A3 (en) | 2005-12-13 | 2023-11-01 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor |
| EP2596096B1 (en) * | 2010-07-21 | 2018-01-31 | Kyoto University | Method for inducing differentiation of human pluripotent stem cell into intermediate mesoderm cell |
| WO2013047763A1 (ja) * | 2011-09-29 | 2013-04-04 | オリエンタル酵母工業株式会社 | ラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法 |
| WO2013094771A1 (en) * | 2011-12-19 | 2013-06-27 | Kyoto University | Method for inducing differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm cells |
| JP2015186474A (ja) * | 2014-03-13 | 2015-10-29 | アークレイ株式会社 | 細胞培養方法、細胞培養部材、及び細胞培養装置 |
| WO2015147047A1 (ja) * | 2014-03-26 | 2015-10-01 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞培養用培地 |
| US10894948B2 (en) * | 2014-08-22 | 2021-01-19 | Cambridge Enterprise Limited | Resetting pluripotent stem cells |
| US10563171B2 (en) * | 2015-06-29 | 2020-02-18 | Kyoto University | Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into germ cells |
| CN108138129B (zh) * | 2015-07-17 | 2021-11-16 | 国立大学法人京都大学 | 血管内皮细胞的诱导方法 |
| JP6849957B2 (ja) * | 2015-11-10 | 2021-03-31 | 国立大学法人京都大学 | ラミニンフラグメント含有培地を用いる細胞培養方法 |
| WO2018038242A1 (ja) | 2016-08-25 | 2018-03-01 | 国立大学法人京都大学 | 特定のラミニン上での多能性幹細胞の培養方法 |
| JP6890041B2 (ja) | 2017-05-31 | 2021-06-18 | サンデン・リテールシステム株式会社 | 自動販売機のリーダライタ取付構造 |
-
2019
- 2019-10-30 JP JP2020553984A patent/JP7437766B2/ja active Active
- 2019-10-30 US US17/289,970 patent/US20220010283A1/en active Pending
- 2019-10-30 EP EP19878341.7A patent/EP3875578A4/en active Pending
- 2019-10-30 WO PCT/JP2019/042608 patent/WO2020090903A1/ja unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016010082A1 (ja) | 2014-07-16 | 2016-01-21 | 国立大学法人大阪大学 | ラミニンフラグメントの細胞培養基質活性増強方法 |
| JP2017023019A (ja) | 2015-07-17 | 2017-02-02 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 |
| WO2017164257A1 (ja) | 2016-03-23 | 2017-09-28 | 国立大学法人京都大学 | 血球分化能の高い中胚葉誘導方法 |
| WO2018128177A1 (ja) | 2017-01-05 | 2018-07-12 | 味の素株式会社 | インスリン産生細胞分化誘導促進剤 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 佐藤陽治 et al.，分化プロペンシティを指標とした細胞特性解析法の開発，厚生労働科学研究費補助金 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究事業 細胞・組織加工製品，2014年06月16日，平成２５年度 総括・分担研究報告書，pp. 117-143 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3875578A4 (en) | 2022-08-10 |
| WO2020090903A1 (ja) | 2020-05-07 |
| JPWO2020090903A1 (ja) | 2021-09-30 |
| EP3875578A1 (en) | 2021-09-08 |
| US20220010283A1 (en) | 2022-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7356658B2 (ja) | ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法 | |
| JP6678107B2 (ja) | 膵前駆細胞の増殖方法 | |
| JP5896421B2 (ja) | 多能性幹細胞から骨格筋または骨格筋前駆細胞への分化誘導法 | |
| JPWO2016143803A1 (ja) | 肺胞上皮細胞の分化誘導法 | |
| WO2015020113A1 (ja) | 膵ホルモン産生細胞の製造法 | |
| JP7357369B2 (ja) | 新規腎前駆細胞マーカーおよびそれを利用した腎前駆細胞の濃縮方法 | |
| JP2023093693A (ja) | 細胞の培養方法 | |
| JP6730709B2 (ja) | 気道上皮細胞の分化誘導法 | |
| WO2023106122A1 (ja) | 間葉系譜への分化に特化した神経堤細胞の製造方法 | |
| JP6646311B2 (ja) | 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 | |
| JP7437766B2 (ja) | 中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法 | |
| KR102049211B1 (ko) | 내피세포의 제조 방법 | |
| WO2020218579A1 (ja) | 分化誘導のために馴化された多能性幹細胞の作製方法 | |
| JP7328688B2 (ja) | 副甲状腺細胞の作製方法 | |
| JP7072756B2 (ja) | 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 | |
| WO2022244841A1 (ja) | 脳毛細血管内皮様細胞の製造方法およびその利用 | |
| EA044339B1 (ru) | Способ культивирования клеток | |
| JP2020115771A (ja) | 多能性幹細胞から軟骨組織を製造する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221028 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231003 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231025 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231212 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231219 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240116 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240205 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7437766 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |